原位修復富氮地熱水效果的模擬實驗裝置及其實驗方法與流程
2023-05-11 08:09:11
本發明涉及一種採用反硝化菌菌株原位修復富氮地熱水效果的模擬實驗裝置及其實驗方法。
背景技術：
地下水硝酸鹽原位微生物處理技術是指將受到硝酸鹽汙染的地下水體依賴反硝化細菌和人為創造的促進反硝化反應的條件直接在原地進行處理。反硝化細菌原位修復技術作為地下水脫氮的一種方式，具有方法簡單、費用低廉、反應迅速，受外界環境影響較小等特點，該技術在處理富氮地下水中具有重要的地位和廣闊的應用前景。獲得有效的反硝化細菌是原位微生物修復地下水中硝酸鹽汙染的關鍵。環境不同，適合的反硝化細菌也不盡相同，因此通過實驗室模擬研究選擇適合的反硝化菌能有效的提高反硝化效率。
現有的實驗裝置採用SY-3005QB發酵罐，該發酵罐是帶攪拌的夾套式加熱的SY-3000系列生物發酵罐的一種。罐體體積為5L，發酵罐罐體採用硼矽玻璃組成，蓋板採用不鏽鋼316L組成。其控制系統是基於工業乙太網控制技術的新一代生物發酵成套系統，代表了目前國內發酵罐自動控制系統的最高水平。SY-3005QB發酵罐主要由罐體、攪拌器和擋板、消泡器、聯軸器和軸承、變速裝置、空氣分布裝置、軸封以及換熱裝置組成。罐頂裝有視鏡及燈鏡，進料管，補料管、排氣管、接種管和壓力表接管。罐身上設有冷卻水進出管，進空氣管、溫度計管和檢測儀表接口，其側壁設置有取樣口。攪拌器的主要作用是使通入的空氣分散成氣泡並與發酵液充分混合，使氣泡細碎以增大氣——液界面，來獲得所需要的溶解氧速率，並使生物細胞懸浮分散於發酵體系中，以維持適當的氣——液——固（細胞）三相的混合與質量傳遞，同時強化傳熱過程。現有實驗方法為：使用硝酸鹽和亞硝酸鹽配置所需模擬地熱水，121℃滅菌20min後裝入發酵罐中，按5%（v/v）的比例接入標準種子液，每隔2h檢測混合液的NO3--N、NO2--N、TN的濃度。為模擬反硝化細菌原位修復富氮地熱水的真實情況，儘可能還原取水熱儲層的原始環境，設置初始pH值為8.16、溫度為38.9℃、溶解氧為2.57 mg/L。相同條件下以未接種的模擬地熱水（罐體滅菌，培養基不滅菌）作為空白對照。由於深層地熱水水溫普遍較高，因此篩選耐高溫的高效反硝化菌很有必要，菌種應在高溫條件下進行長期馴化，方能使其更好地適應地熱水的偏高溫環境。但是現有的實驗儀器相對簡單且環境還原能力不強，難以反映複雜的現場地熱水文地質特徵，因此現有的原位修復富氮地熱水室內模擬並不能完全代表實際情況。
技術實現要素：
本發明為了解決現有技術中的不足之處，提供一種模擬效果佳、實驗數據精準的原位修復富氮地熱水效果的模擬實驗裝置及其實驗方法。
為解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案：原位修復富氮地熱水效果的模擬實驗裝置，包括電腦、試驗臺和位於試驗臺一側的實驗反應器，電腦放置在試驗臺上表面，實驗反應器包括支撐框架、保溫桶和漏桶，支撐框架外型呈圓柱形，支撐框架頂部外緣設有環形的連接法蘭；
保溫桶設在支撐框架內，保溫桶包括上下通透的外桶體和內桶體，外桶體的中心線沿垂直方向設置，內桶體的半徑小於外桶體的半徑，內桶體同軸線設置在外桶體內，外桶體的底部與內桶體的底部之間固定設有環形的連接板，外桶體的內壁與內桶體的外壁之間形成保溫腔室，連接板上設有位於保溫腔室內的電阻加熱器，外桶體頂部的外緣固定設有環形的外法蘭盤，內桶體頂部的外緣固定設有環形的內法蘭盤，內桶體頂部的內側壁上設有環形的臺階，保溫桶的外法蘭盤設置在支撐框架的連接法蘭上，保溫桶頂部設有蓋體，蓋體、外法蘭盤和連接法蘭之間穿設有外螺栓，蓋體與內法蘭盤之間穿設有內螺栓；內桶體內滑動密封連接有活塞，活塞的上表面上固定設有擾動泵，活塞底部連接有電動絲槓升降機，活塞上穿設有上端凸出於活塞上表面的蒸汽接入管，蒸汽接入管上端設有頂部呈球形的端蓋，端蓋上設有通氣孔，蒸汽接入管上設有單向閥，活塞上穿設有出料管，出料管下端設有位於活塞下方的三通接頭，三通接頭的第二個接口通過水樣管連接有水樣檢測儀，三通接頭的第三個接口通過廢液管連接有廢液處理桶，水樣管上設有第三閥門，廢液管上設有第四閥門，廢液處理桶上設有水泵；
漏桶位於保溫桶內，漏桶的頂部外緣設有環形的壓接板，漏桶底部開設有漏孔，壓接板位於內桶體頂部的臺階上；
蓋體頂面設有pH檢測儀和壓力檢測儀，蓋體上穿設有下端伸入到內桶體內的投料管和循環進料管，投料管上設有梯度加熱裝置和第一閥門，循環進料管上設有第二閥門，循環進料管的另一端與水泵的出水口連接，蓋體底面上設有位於漏桶內的溫度傳感器和pH傳感器，pH傳感器通過信號線與pH檢測儀連接，溫度傳感器、pH檢測儀和壓力檢測儀分別通過信號線與電腦連接。
漏桶的外壁上沿軸向方向開設有直線型的縫隙。
漏桶頂面與蓋體底面之間設有橡膠密封圈。
原位修復富氮地熱水效果的模擬實驗裝置的實驗方法，包括以下步驟：
（1）、製備與實際熱儲條件相似的模擬地熱水樣、介質巖樣以及菌株；
（2）、檢查保溫桶是否漏水，接著採用蒸汽滅菌鍋對步驟（1）中製備的介質巖樣進行滅菌，滅菌時間為30min；
（3）、開始進行修復富氮地熱水的模擬實驗，對模擬反應後的混合液進行NO3--N、NO2--N、TN濃度檢測。
步驟（1）中模擬地熱水樣的配製方法是：溫度為38 ℃，總活潑陽離子為273.28 mg/L，總活潑陰離子為659.37 mg/L，總有機碳（TOC)為3.8 %，選取琥珀酸鈉2.36g、KNO30.361 g、KNO2 0.304g、MgSO4·7H2O 0.2 g、KH2PO4 1.0g、K2HPO4 5.0g、NaCl 0.5g和微量元素溶液，進行混合併用取自現場的地熱水定容至1000 mL的混合液，調節混合液的pH值為8.0；其中微量元素溶液的成分配比為：Na2SeO3 0.005g，CoCl2·6H2O 0.1 g，NiCl2 0.05 g Na2MoO4 0.005 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CaCl2 0.1 g，BaCl2 0.002g ，CuSO4·5H2O 0.01 g, MnSO4·H2O 0.5 g, FeSO4 0.02 g, MgSO4·7H2O 3 g，H3BO3 0.01 g，NTA 1.5 g和水溶液混合。
步驟（1）中介質巖樣製備的具體過程為：實驗填充的巖樣採用擾動細砂土，從距地表深度約60 m的巖層中採集巖樣，然後將採集的巖樣在室溫下自然風乾，然後去除巖樣中的雜質，最後經篩孔半徑為2 mm的篩網過濾後備用；
步驟（1）中菌株製備的具體方法包括以下步驟：
①反硝化細菌的富集培養：從實驗所在地深地熱井中抽取出地熱水，接著量取10ml地熱水作為樣品並放入到250ml的三角瓶中，然後向三角瓶中加入經滅菌過的100ml的LB液體培養基，把三角瓶放置在溫度為35℃、轉速為60 r/min的恆溫震蕩培養皿中培養，待三角瓶中的培養液渾濁後，取出10ml的培養液並轉接到滅菌後的液體反硝化細菌富集培養基中，之後每隔12h分別用二苯胺試劑和格利斯試劑定性檢測液體反硝化細菌富集培養基上培養液中NO3-和NO2-的含量，當液體反硝化細菌富集培養基上培養液中的NO3-含量明顯下降且有NO2-產生時，取出10ml的培養液並轉接到新鮮的富集培養液中，繼續震蕩培養，富集四代後備用；
②反硝化細菌的分離純化：用十倍稀釋法，採用移液槍吸取100 μL菌懸液，加入900 μL無菌水中，充分混勻，此為10-1倍稀釋液，以此類推逐步稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6菌懸液，分別取200 μL各梯度菌懸液用塗布棒均勻塗布於溴百裡酚藍（BTB）培養基的平板培養基上，然後將平板培養基倒置在溫度為35℃恆溫培養箱內培養2-3d，之後用接種環挑取周圍出現藍色光暈的單菌落進行分離，此為初篩菌株，將初篩菌株分別挑取接種於新鮮的平板培養基上，於35℃恆溫培養箱倒置培養，待菌落長出後，再次挑取單菌落劃線分離，重複三次之後，將細胞塗片染色，用顯微鏡檢查菌株是否為單一菌種，若發現有雜菌，須再次重複分離、純化，直到獲得純菌落，把純化的菌株進行編號，斜面培養後置4℃的冰箱內保存備用；
③反硝化性能測定：在試管中加入10 mL反硝化性能測定培養液，並將德漢氏小管傾斜倒置放入試管底部，將步驟②中純化好的菌株經平板劃線活化，然後用接種環挑接於培養液中，接著在溫度為35℃、轉速為60 r/min的恆溫震蕩培養器中培養，定時觀察德漢氏小管中產氣速度的快慢和產氣量的多少，用以定量判定菌株反硝化性能的強弱，篩選出高效菌株，以備實驗所用。
步驟（2）中檢查保溫桶是否漏水的過程為：向保溫桶的內桶體內加入適量的水，檢查內桶體是否漏水，確認不漏水後蓋上蓋體，重新將外螺栓和內螺栓擰緊；
步驟（2）中介質巖樣的滅菌過程為：將製備的巖樣放入蒸汽滅菌鍋內，經蒸汽滅菌鍋滅菌30分鐘後，再將滅菌後的巖樣裝填在漏桶內。
步驟（3）的具體方法為：
Ⅰ、打開外螺栓和內螺栓，取下蓋體，將厚度為10μm的尼龍濾布放置在漏桶的底部，然後依次向漏桶內填裝厚度為2cm的粗粒石英砂、土柱、2cm的粗粒石英砂，其中土柱是由製備的介質巖樣製成；
Ⅱ、打開第一閥門，通過操控電腦控制電動絲槓升降機，以驅動活塞沿內桶體的內壁向下運動，使保溫桶的內部空間達到最大，然後通過蒸汽接入管向保溫桶內通入蒸汽，通入蒸汽時間為30分鐘，結束後關閉第一閥門；
Ⅲ、通過電腦設定實驗溫度和投料溫度，啟動電阻加熱器和梯度加熱裝置，當實驗溫度達到設定值後，打開第一閥門，通過投料管向保溫桶內注入接種反硝化菌A1的模擬地熱水，注入完畢後關閉第一閥門，電腦設定實驗壓力，啟動電動絲槓升降機，電動絲槓升降機驅動活塞移動，使內桶體內的氣壓達到設定壓力值後，再通過電腦啟動擾動泵；
Ⅳ、經過K分鐘後，打開第三閥門，將適量的保溫桶內的水樣通過水樣管送至水樣檢測儀，關閉第三閥門，利用水樣檢測儀檢測水樣中氮元素含量，電腦記錄氮元素含量值，以後每隔K分鐘測試水樣中的氮含量，並繪製出水樣中的氮含量隨時間變化的曲線圖；
Ⅴ、得到氮含量隨時間變化的關係圖後結束試驗，打開第四閥門和第二閥門，實驗反應後的模擬混合液流入到廢液處理桶內進行處理，然後啟動水泵，將處理後的模擬混合液經循環進料管再次注入到漏桶內循環利用。
採用以上技術方案，本發明具有以下有益效果：
1、採用電腦作為整個系統的控制端和數據反饋端，使得整個系統的智能化程度大大提高，內部程序會根據事先設定好的壓力和溫度參數控制相應執行器進行工作，基於各種傳感器的實驗反應器運行狀況監測，使得其監測結果更為精確，減少了人工操作的誤差；
2、投料管上安裝梯度加熱裝置可以很好的模擬將菌株從正常溫度投遞至工作溫度的狀態，這對檢驗菌株的耐熱衝擊能力和環境適應能力有很大的幫助；
3、恆溫水浴下的保溫桶能根據實驗條件維持不同的溫度，設置在漏桶外的擾動泵能夠激勵被水浴加熱的模擬水，從而很好模擬熱儲環境中地下水的運動；
4、電動絲槓升降機用於使保溫桶內的壓力恆定不變，能夠合理模擬出深埋地熱水的高壓環境，有益於篩選菌株和強化還原環境；
5、水樣檢測儀可以檢測保溫桶內除氮效果，如果除氮效果不明顯，則將反應後的模擬水注入廢液處理桶進行處理，然後再經循環進料管重新注入到漏桶內，節約了實驗藥品，減少了配製模擬水的時間，大大提高了試驗效率；
6、步驟（3）中第Ⅱ步向保溫桶內通入30min蒸汽，目的是對保溫桶進行消毒以及提升保溫桶內部空間的溫度，用以模擬地溫梯度。
綜上所述，本發明設計合理，控制電腦作為整個系統的控制端和數據反饋端，使得整個系統的智能化程度大大提高，梯度加熱裝置可以很好的模擬菌株使用前的投料狀態，擾動泵和電動絲槓升降機可以很好的模擬地熱水的熱儲環境，克服了以往實驗儀器的不足，提高了實驗的準確性。
附圖說明
圖1是本發明的結構示意圖；
圖2是圖1中活塞以下機構的結構示意圖；
圖3是實驗反應器的結構示意圖；
圖4是蓋體的結構示意圖。
具體實施方式
如圖1-4所示，本發明的原位修復富氮地熱水效果的模擬實驗裝置，包括電腦1、試驗臺2和位於試驗臺2一側的實驗反應器，電腦1放置在試驗臺2上表面，實驗反應器包括支撐框架14、保溫桶35和漏桶34，支撐框架14外型呈圓柱形，支撐框架14頂部外緣設有環形的連接法蘭40；
保溫桶35設在支撐框架14內，保溫桶35包括上下通透的外桶體41和內桶體42，外桶體41的中心線沿垂直方向設置，內桶體42的半徑小於外桶體41的半徑，內桶體42同軸線設置在外桶體41內，外桶體41的底部與內桶體42的底部之間固定設有環形的連接板43，外桶體41的內壁與內桶體42的外壁之間形成保溫腔室44，連接板43上設有位於保溫腔室44內的電阻加熱器32，外桶體41頂部的外緣固定設有環形的外法蘭盤45，內桶體42頂部的外緣固定設有環形的內法蘭盤46，內桶體42頂部的內側壁上設有環形的臺階47；
內桶體42內滑動密封連接有活塞24，活塞24的上表面上固定設有擾動泵23，活塞24底部連接有電動絲槓升降機25，活塞24上穿設有上端凸出於活塞24上表面的蒸汽接入管21，蒸汽接入管21上端設有頂部呈球形的端蓋48，端蓋48上設有通氣孔49，蒸汽接入管21上設有單向閥，活塞24上穿設有出料管26，出料管26下端設有位於活塞24下方的三通接頭17，三通接頭17的第二個接口通過水樣管30連接有水樣檢測儀15，三通接頭17的第三個接口通過廢液管31連接有廢液處理桶19，水樣管30上設有第三閥門16，廢液管31上設有第四閥門18，廢液處理桶19上設有水泵22；
漏桶34位於保溫桶35內，漏桶34的頂部外緣設有環形的壓接板50，漏桶34底部開設有漏孔51，壓接板50位於內桶體42頂部的臺階47上；
保溫桶35的外法蘭盤45設置在支撐框架14的連接法蘭40上，保溫桶35頂部設有蓋體27，蓋體27、外法蘭盤45和連接法蘭40之間穿設有外螺栓11，蓋體27與內法蘭盤46之間穿設有內螺栓12；
蓋體27頂面設有pH檢測儀8和壓力檢測儀11，蓋體27上穿設有下端伸入到內桶體42內的投料管4和循環進料管5，投料管4上設有梯度加熱裝置6和第一閥門9，循環進料管5上設有第二閥門7，蓋體27底面上設有位於漏桶34內的溫度傳感器28和pH傳感器29，pH傳感器29通過信號線與pH檢測儀8連接，溫度傳感器28、pH檢測儀8和壓力檢測儀11分別通過信號線與電腦1連接；循環進料管5的另一端與水泵22的出水口連接。
漏桶34的外壁上沿軸向方向開設有直線型的縫隙52。
漏桶34頂面與蓋體27底面之間設有橡膠密封圈。
原位修復富氮地熱水效果的模擬實驗裝置的實驗方法，包括以下步驟：
（1）、製備與實際熱儲條件相似的模擬地熱水樣、介質巖樣以及菌株；
（2）、檢查保溫桶是否漏水，接著採用蒸汽滅菌鍋對步驟（1）中製備的介質巖樣進行滅菌，滅菌時間為30min；
（3）、開始進行修復富氮地熱水的模擬實驗，對模擬反應後的混合液進行NO3--N、NO2--N、TN濃度檢測。
步驟（1）中模擬地熱水樣的配製方法是：溫度為38 ℃，總活潑陽離子為273.28 mg/L，總活潑陰離子為659.37 mg/L，總有機碳（TOC)為3.8 %，選取琥珀酸鈉2.36g、KNO30.361 g、KNO2 0.304g、MgSO4·7H2O 0.2 g、KH2PO4 1.0g、K2HPO4 5.0g、NaCl 0.5g和微量元素溶液，進行混合併用取自現場的地熱水定容至1000 mL的混合液，調節混合液的pH值為8.0；其中微量元素溶液的成分配比為：Na2SeO3 0.005g，CoCl2·6H2O 0.1 g，NiCl2 0.05 g Na2MoO4 0.005 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CaCl2 0.1 g，BaCl2 0.002g ，CuSO4·5H2O 0.01 g, MnSO4·H2O 0.5 g, FeSO4 0.02 g, MgSO4·7H2O 3 g，H3BO3 0.01 g，NTA 1.5 g和水溶液混合。
步驟（1）介質巖樣的製備的具體過程為：實驗填充的巖樣採用擾動細砂土，從距地表深度約60 m的巖層中採集巖樣，然後將採集的巖樣在室溫下自然風乾，然後去除巖樣中的雜質，最後經篩孔半徑為2 mm的篩網過濾後備用；
步驟（1）中菌株製備的具體方法包括以下步驟：
a、反硝化細菌的富集培養：從實驗所在地深地熱井中抽取出地熱水，接著量取10ml地熱水作為樣品並放入到250ml的三角瓶中，然後向三角瓶中加入經滅菌過的100ml的LB液體培養基，把三角瓶放置在溫度為35℃、轉速為60 r/min的恆溫震蕩培養皿中培養，待三角瓶中的培養液渾濁後，取出10ml的培養液並轉接到滅菌後的液體反硝化細菌富集培養基中，之後每隔12h分別用二苯胺試劑和格利斯試劑定性檢測液體反硝化細菌富集培養基上培養液中NO3-和NO2-的含量，當液體反硝化細菌富集培養基上培養液中的NO3-含量明顯下降且有NO2-產生時，取出10ml的培養液並轉接到新鮮的富集培養液中，繼續震蕩培養，富集四代後備用；
b、反硝化細菌的分離純化：用十倍稀釋法，採用移液槍吸取100 μL菌懸液，加入900 μL無菌水中，充分混勻，此為10-1倍稀釋液，以此類推逐步稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6菌懸液，分別取200 μL各梯度菌懸液用塗布棒均勻塗布於溴百裡酚藍（BTB）培養基的平板培養基上，然後將平板培養基倒置在溫度為35℃恆溫培養箱內培養2-3d，之後用接種環挑取周圍出現藍色光暈的單菌落進行分離，此為初篩菌株，將初篩菌株分別挑取接種於新鮮的平板培養基上，於35℃恆溫培養箱倒置培養，待菌落長出後，再次挑取單菌落劃線分離，重複三次之後，將細胞塗片染色，用顯微鏡檢查菌株是否為單一菌種，若發現有雜菌，須再次重複分離、純化，直到獲得純菌落，把純化的菌株進行編號，斜面培養後置4℃的冰箱內保存備用；
c、反硝化性能測定：
在試管中加入10 mL反硝化性能測定培養液，並將德漢氏小管傾斜倒置放入試管底部，然後將步驟（b）中純化好的菌株經平板劃線活化，然後用接種環挑接於培養液中，接著在溫度為35℃、轉速為60 r/min的恆溫震蕩培養器中培養，定時觀察德漢氏小管中產氣速度的快慢和產氣量的多少，用以定量判定菌株反硝化性能的強弱，篩選出高效菌株，以備實驗所用。
步驟（2）中檢查保溫桶35是否漏水的過程為：向保溫桶35的內桶體42內加入適量的水，檢查內桶體42是否漏水，確認不漏水後蓋上蓋體27，重新將外螺栓11和內螺栓12擰緊；
巖樣的滅菌過程為：將製備的巖樣放入蒸汽滅菌鍋內，經蒸汽滅菌鍋滅菌30分鐘後，再將滅菌後的巖樣裝填在漏桶34內。
步驟（3）的具體方法為：
Ⅰ、打開外螺栓11和內螺栓12，取下蓋體27，首先將厚度為10μm的尼龍濾布放置在漏桶34的底部，然後依次向漏桶34內填裝厚度為2cm的粗粒石英砂、土柱、2cm的粗粒石英砂；
Ⅱ、打開第一閥門9，通過操控電腦1控制電動絲槓升降機25，以驅動活塞24沿內桶體42的內壁向下運動，使保溫桶35的內部空間達到最大，然後通過蒸汽接入管21向保溫桶35內通入蒸汽，通入蒸汽時間為30分鐘，結束後關閉第一閥門9；
Ⅲ、通過電腦1設定實驗溫度和投料溫度，啟動電阻加熱器32和梯度加熱裝置6，當實驗溫度達到設定值後，打開第一閥門9，通過投料管4向保溫桶35內注入接種反硝化菌A1的模擬地熱水，注入完畢後關閉第一閥門9，電腦1設定實驗壓力，啟動電動絲槓升降機25，電動絲槓升降機25驅動活塞24移動，使內桶體42內的氣壓達到設定壓力值後，再通過電腦1啟動擾動泵23；
Ⅳ、經過K分鐘後，打開第三閥門16，將適量的保溫桶35內的水樣通過水樣管30送至水樣檢測儀15，關閉第三閥門16，利用水樣檢測儀15檢測水樣中氮元素含量，然後電腦1記錄氮元素含量值，然後每隔K分鐘後，打開第三閥門16，採集水樣並分析水樣中的元素含量，電腦1記錄氮元素含量值，由此電腦1繪製出水樣中的氮含量隨時間變化的曲線圖；
Ⅴ、得出氮含量隨時間變化的關係圖後結束試驗，打開第四閥門18和第二閥門7，實驗反應後的模擬混合液流入到廢液處理桶19內進行處理，然後啟動水泵22，將處理後的模擬混合液經循環進料管5再次注入到漏桶34內循環利用。
以上實施例僅用以說明而非限制本發明的技術方案，儘管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解：依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和範圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。