力達黴素與單克隆抗體及其Fab'片段的偶聯物以及在結腸癌等腫瘤靶向治療中的應用的製作方法

2023-04-27 18:02:41

專利名稱：力達黴素與單克隆抗體及其Fab'片段的偶聯物以及在結腸癌等腫瘤靶向治療中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種由力達黴素與單克隆抗體及其片段組成的免疫偶聯物以及製備方法和在結腸癌等腫瘤靶向治療中的應用。
研製單抗靶向藥物需要有明確的、與腫瘤治療高度相關的分子靶點。在此基礎上要考慮單抗藥物的人源化、小型化和高效化。人源化是指對抗體分子特別是其Fc片段進行改造，以降低在人體使用時產生的人抗鼠抗體反應(HAMA)。小型化是使用抗體的片段(Fab、Fab』或scFv)與「彈頭」物質構建偶聯物。小型化的單抗藥物較易通過毛細血管內皮層和腫瘤細胞外間隙，可能到達實體瘤深部；而由於除去了Fc片段，小型化的單抗藥物還可降低HAMA反應。高效化是構建對腫瘤細胞有極強殺傷力的單抗藥物。由於使用小劑量和短療程即可顯示療效，高效化單抗藥物也可能降低HAMA反應。完整的單抗分子含有Fc片段，有利於調動機體免疫系統攻擊腫瘤細胞的效應功能；如果利用完整的單抗分子與高效「彈頭」藥物構建高效化的偶聯物，有可能既降低HAMA反應又能保留Fc片段的效應功能。因此，研製以完整單抗為基礎的免疫偶聯物在腫瘤靶向治療中仍具有重要意義。
力達黴素(LDM，又名C-1027)是中國醫學科學院醫藥生物技術研究所利用本單位建立的抗腫瘤藥物篩選方法—精原細胞法，經過篩選大量的發酵液樣品發現的。LDM的產生菌是從我國湖北省潛江縣的土壤中分離得到的，定名為Streptomyces globisporus C-1027(此前已提交「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」保藏，保藏編號為CGMCC No.0704)。LDM分子是由一個發色團(Chromophore)和一個酸性蛋白構成的新化合物。發色團含有一個九元環烯二炔核心結構，分子量為843Da，蛋白部分由110個胺基酸組成，分子量為10506Da。LDM對癌細胞有強烈的殺傷活性，動物體內試驗表明，對小鼠移植性腫瘤和在裸鼠移植的人肝癌等腫瘤的生長有顯著抑制作用(中國抗生素雜誌1994，192164)。以LDM為「彈頭」藥物分別與抗肝癌單抗3A5的Fab片段(藥學學報1993，284260-265)或Fab』片段(中國醫學科學院學報2001，236)563)構成的偶聯物在動物試驗顯示較強的抗腫瘤作用。關於LDM與完整單抗構建的偶聯物，至今尚無報導。以上報導的3A5是以BEL-7402肝癌細胞免疫大鼠並經雜交瘤技術製備的大鼠單抗，與本發明以IV型膠原酶為抗原製備的小鼠單抗3(11完全不同。
基質金屬蛋白酶(MMPs)與惡性腫瘤的生長、侵襲、轉移存在著密切的關係。癌細胞或其鄰近的間質細胞通過分泌多種基質金屬蛋白酶來降解基底膜和細胞外基質組分，從而有利於腫瘤的侵襲和轉移過程。研究表明，MMPs的表達及活性的高低與腫瘤的惡性程度相關，而且MMPs在腫瘤的血管生成中也有重要影響。因此，MMPs成為引人注目的腫瘤治療的分子靶點。IV型膠原酶，又稱為明膠酶，包括MMP-2和MMP-9兩個組分，是MMPs家族中的重要成員，它可以降解基底膜中作為其它組分構建支架的IV型膠原，從而有利於腫瘤細胞破壞和穿透基底膜，進行侵襲和轉移。據報導，抑制IV型膠原酶或其它MMPs的分泌及其活性的小分子藥物在體內具有抑制腫瘤生長和轉移的作用(J Natl Cancer Inst 2001，93178)。本發明人實驗室曾利用IV型膠原酶單抗3D6與平陽黴素製成偶聯物，並在動物體內試驗證明偶聯物比平陽黴素有更強的抑瘤作用(中國抗生素雜誌2002，278496)。利用IV型膠原酶單抗與高效「彈頭」藥物力達黴素製成偶聯物，至今尚無報導。
本發明涉及的單抗3G11(其雜交瘤3G11細胞株已提交「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」保藏，保藏編號為CGMCC No.0831)，是採用淋巴細胞雜交瘤技術製備的。以IV型膠原酶免疫BALB/c小鼠後，取其脾細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細胞融合，經克隆篩選後所獲得的雜交瘤細胞株分泌的抗體。該抗體分子量為150kDa左右，可以與IV型膠原酶特異性結合併中和其活性，本實驗室研究發現，用抗IV型膠原酶單抗3G11進行免疫組織化學染色，人的肺癌、結腸癌、食管癌、胃癌和乳腺癌等腫瘤組織染色結果呈陽性。對人結腸癌組織及其鄰近正常組織進行比較觀察時發現，正常組織包括腸腺細胞與間質細胞與單抗3G11的免疫組織化學染色為陰性，而結腸癌組織則呈現不同程度的陽性染色，表明IV型膠原酶在結腸癌細胞呈特異性表達。經ELISA檢測表明，單抗3G11與人肺癌PG細胞、人結腸癌HT-29細胞、小鼠肝癌H22細胞和小鼠結腸癌C26細胞呈陽性反應。在裸鼠移植的人肺癌PG腫瘤模型，用131碘標記的單抗3G11靜脈注射可見清晰的腫瘤顯像。最近研究還表明，LDM對移植於裸鼠的人肺癌PG腫瘤的生長有明顯抑制作用。本發明是以抗腫瘤抗生素力達黴素(LDM)作為彈頭藥物，分別與單抗3G11及其Fab』片段製成3G11-LDM偶聯物和Fab』-LDM偶聯物，並觀察了其在動物體內試驗的抗腫瘤作用。結果顯示，與同等劑量的游離LDM相比，3G11-LDM偶聯物和Fab』-LDM偶聯物的抗腫瘤作用顯著增強。因此，3G11-LDM偶聯物和Fab』-LDM偶聯物有可能成為治療腫瘤的新型抗腫瘤靶向藥物。
本發明的目的是以合適的方法製備單抗3G11-LDM偶聯物和單抗片段Fab』-LDM偶聯物，並將此偶聯物應用於腫瘤的治療。
1.2以2-IT和MBS作為交聯分子的單抗3G11-LDM偶聯物的製備利用抗IV型膠原酶單抗3G11作為攜帶抗腫瘤藥物的導向載體(1)經辛酸硫酸銨沉澱及羥基磷灰石柱純化後的單抗3G11，置截留分子量為10kDa的透析袋中，用0.05M硼酸緩衝液(pH8.0)進行透析，調節其濃度為5mg/ml。取溶於0.05M硼酸緩衝液(pH8.0)濃度為4mg/ml的2-IT溶液10μl加入上述5mg/ml的3G11溶液中，在充氮氣的條件下於室溫反應40min。反應結束後，置截留分子量為30kDa的離心濃縮管中，以0.05M磷酸鹽緩衝液(PB)(pH6.8)進行緩衝液交換，並離心除去未反應的2-IT。(2)取力達黴素溶解於0.05M PB(pH6.8)中配成5mg/ml的濃度，攪拌下加入溶於二甲基甲醯胺的濃度為10mg/ml的MBS，室溫反應40min。反應結束後，置截留分子量為10kDa的透析袋中，以0.05MPB(pH6.8)充分透析16h。透析完畢後立即與經2-IT修飾的單抗3G11進行偶聯反應，室溫反應6h或過夜。反應液置截留分子量為30kDa的超濾離心濃縮管中，離心超濾3-4次，去除未反應的MBS修飾的力達黴素，得到3G11-LDM的偶聯物。
1.3以SPDP或長鏈的N-羥基琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酶酯(LC-SPDP)作為交聯分子的3G11-LDM偶聯物的製備(1)取LDM 2mg溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)(pH7.4)中，配成4mg/ml的濃度，然後加入摩爾數為10倍過量的SPDP或LC-SPDP(15mg/ml，溶於二甲基甲醯胺中)，室溫反應30min。反應結束後置濃度為0.1mol/L醋酸緩衝液(pH4.5)中充分透析。取透析內液，加入二巰基蘇糖醇(DTT)至終濃度為10mmol/L，室溫反應30min，然後置PBS中充分透析。(2)另取單抗3G11 2mg溶於0.2mol/L磷酸鹽緩衝液(pH6.8)中，加入摩爾數為10倍過量的SPDP或LC-SPDP，室溫反應30min，於PBS液中充分透析。(3)合併(1)和(2)中的透析內液，室溫反應過夜。然後經SephadexG-75柱分離，收集第一峰，得到3G11-LDM的偶聯物。
2.單抗片段Fab』-LDM偶聯物2.1本發明所涉及的單抗片段Fab』-LDM偶聯物為抗IV型膠原酶單抗3G11的Fab』片段與抗腫瘤抗生素LDM以1∶1的分子比，通過小分子的交聯劑進行連接所形成的化學免疫偶聯物。單抗3G11的Fab』片段通過其分子鉸鏈區的巰基與經過異型雙功能交聯劑MBS修飾的LDM偶聯，可以得到Fab』-LDM偶聯物。SDS-PAGE電泳結果顯示，Fab』-LDM偶聯物的分子量約為65000Da，與Fab』片段相比恰好增加了一個LDM分子的分子量(11345Da)，推測偶聯物中Fab』與LDM的分子比為1∶1。
2.2單抗3G11 Fab』片段的製備純化的單抗3G11用0.05mol/LTris·HCl緩衝液(含濃度為2mmol/L的EDTA)(pH7.4)充分透析，以相同緩衝液調整其濃度為4mg/ml。37℃預溫30min後，加入預先用相同緩衝液溶解並在37℃預溫30min的無花果蛋白酶(0.06U/mg抗體)，並加入1/9體積濃度為10mmol/L的半胱氨酸激活反應，置37℃緩慢攪拌反應5h。然後，以1/10體積濃度為100mmol/L的NEM終止反應。反應液以Sephadex G-150柱層析純化，收集F(ab』)2片段。純化的F(ab』)2片段以0.1mol/L Tris·HCl緩衝液(含10mmol/L EDTA)(pH7.5)透析，並經超濾濃縮成6～10mg/ml。然後以10～15mmol/L的β-巰基乙醇37℃還原1h或10mmol/L半胱氨酸37℃還原2h，還原產物以0.05mol/L磷酸緩衝液(PB)(pH6.8)在充氮氣的條件下，充分透析得到Fab』片段，立即用於與力達黴素交聯。
2.3單抗片段Fab』-LDM偶聯物的製備 力達黴素20mg以0.05mol/L PB(pH6.8)溶解，配製成5mg/ml的濃度，然後加入摩爾數為10倍過量的MBS，室溫避光反應40min，反應液置截留分子量為10kDa的透析袋中，於0.05mol/LPB(pH6.8)中充分透析16h，除去過量的MBS。透析完畢，立即與巰基化的Fab』片段混合，避光條件下室溫反應過夜，以NEM終止反應。反應液置截留分子量為30kDa的超濾離心濃縮管中，離心超濾3-4次，去除未反應的MBS修飾的LDM，得到單抗片段Fab』-LDM偶聯物。
3.單抗3G11-LDM偶聯物與單抗片段Fab』-LDM偶聯物的免疫活性與抗腫瘤效果本發明所說的單抗3G11在不同人體腫瘤組織的免疫組織化學染色實驗結果顯示，結腸癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌等惡性腫瘤組織對單抗3G11呈現陽性染色，而在結腸癌周圍的正常組織為陰性染色，說明IV型膠原酶在多種惡性腫瘤組織中的表達具有特異性。ELISA檢測表明，單抗3G11及其Fab』片段對結腸癌、肺癌、肝癌細胞顯示免疫反應性。實驗證明，本發明所說的單抗3G11-LDM偶聯物和單抗片段Fab』-LDM偶聯物保留了與IV型膠原酶和上述各種腫瘤細胞的結合能力。本發明所說的3G11-LDM偶聯物和Fab』-LDM偶聯物對腫瘤細胞的殺傷作用實驗顯示，偶聯物比單獨使用LDM對腫瘤細胞的細胞毒性更強，且與偶聯物的濃度成依賴關係。動物體內試驗證明，本發明所說的3G11-LDM偶聯物和Fab』-LDM偶聯物靜脈注射給藥時，對小鼠肝癌、結腸癌有顯著的治療效果，其抑瘤率明顯高於單獨使用LDM。
以下所舉3G11-LDM偶聯物的抗腫瘤活性的實施例，對本發明而言只是說明性的，而非限制性的。實施例1單抗3G11在不同人腫瘤組織的免疫組織化學染色 石蠟切片常規脫蠟入水，3％H2O2滅活內源性過氧化酶，浸入0.01M枸櫞酸緩衝液(pH6.0)微波抗原修復，I抗為單抗3G11，室溫孵育1小時，採用鏈黴卵白素—生物素—酶聯複合物(SABC)方法進行染色，再以DAB試劑盒室溫顯色約30秒至5分鐘，常規蘇木素輕度復染，脫水透明封片。
染色結果觀察 判斷標準為IV型膠原酶染色為細胞胞漿著色，胞漿內有棕黃色深染顆粒為陽性細胞。採用半定量法分析，人工分級標準以細胞染色深淺程度分為0陰性(-)、1弱陽性(+)、2陽性(++)、3強陽性(+++)、4極強陽性(++++)。
圖像定量分析 染色切片經顯微攝像掃描存入計算機內，並以LEICAQ500IW型圖像分析系統進行定量分析。每張切片分別選取20個視野，自動檢測並計算出每一視野中的平均陽性細胞百分率、陽性面積百分率及陽性染色強度＝255-平均灰度值(灰度值範圍在0-255之間，0代表最黑處，255代表最亮處)。
單抗3G11在對人體大腸癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、腎癌等惡性腫瘤組織顯示較高的陽性反應率(表1)(

圖1，圖2)。實驗中的組織切片均設有空白對照(以PBS替代單抗3G11)、陰性對照(以無關的單抗F9替代單抗3G11)，染色結果均為陰性。證明單抗3G11與腫瘤的免疫組織化學染色具有特異性。
表1單抗3G11在不同人體腫瘤組織中的免疫組織化學染色腫瘤樣本 陽性染色例數 陰性染色例數 染色陽性率(％)大腸癌 30 878.9(30/38)胃癌7558.3(7/12)食管癌 4266.7(4/6)乳腺癌 7943.8(7/16)肺癌20(2/2)腎癌30(3/3)膀胱癌 03(0/3)另外，觀察5例結腸癌及其鄰近正常組織的免疫組織化學染色，正常組織(包括腸腺細胞和間質細胞的染色為陰性，而癌細胞則顯示不同程度的陽性染色(表2)。在細胞內棕色深染顆粒位於腺體樣排列的腫瘤細胞的頂端，個別病例見於周圍間質內(圖3)。結果顯示了IV型膠原酶在結腸癌組織中表達的特異性。
表2單抗3G11在結腸癌及其鄰近正常組織的免疫組織化學染色病例序號 癌細胞染色情況 鄰近正常腺體細胞染色情況1 ++++ -2 +++-3 + -4 ++++ -5 ++ -實施例2單抗3G11與腫瘤細胞的免疫反應性以ELISA方法進行檢測，單抗3G11與人肺癌PG細胞、人結腸癌HT-29細胞、人口腔鱗癌KB細胞、小鼠肝癌H22細胞一以及小鼠結腸癌26細胞呈現良好的免疫結合活性(圖4)。在裸鼠腋窩皮下接種人肺癌PG腫瘤組織小塊(直徑約1mm)，待腫瘤生長至直徑約1cm時，靜脈注射採用Iodogen法標記的單抗3G11(131I-3G11，約200μCi)，於不同時間點進行免疫顯像。結果可見，在PG肺癌的部位有清晰的顯像(圖5)。實施例3用ELISA進行檢測，單抗3G11與LDM連接後的偶聯物3G11-LDM保留了與各種腫瘤細胞結合的能力(圖6)。
用四氮唑藍(MTT)法測定，3G11-LDM偶聯物或Fab』-LDM偶聯物顯示對腫瘤細胞更強的殺傷作用(圖7，圖8)。3G11-LDM偶聯物及游離LDM對體外培養的肝癌H22細胞的IC50(50％抑制濃度)分別為5.1×10-12mol/L和6.2×10-11mol/L。Fab』-LDM偶聯物的IC50為9.3×10-12mol/L，游離LDM的IC50為2.5×10-11mol/L，Fab』-LDM偶聯物對H22細胞的增殖抑制作用強於游離LDM，兩者IC50之比為2.7。實施例43G11-LDM偶聯物靜脈注射對小鼠結腸癌C26的療效 取動物皮下傳代的小鼠結腸癌C26瘤組織，以生理鹽水按1∶3的比例稀釋製成懸液，按0.2ml/只接種於BALB/c小鼠腋窩皮下。接種72小時後靜脈注射給藥，共給藥一次。對照組給予生理鹽水。實驗第10天測量各組動物的腫瘤體積，並按腫瘤體積計算抑瘤率。結果表明(表3)，3G11-LDM偶聯物0.025mg/kg，0.05mg/kg和0.10mg/kg劑量的抑瘤率分別為54.5％，70.3％和81.2％；而游離LDM劑量0.05mg/kg的抑瘤率為56.4％，單抗3G11劑量0.75mg/kg的抑瘤率為25.7％，偶聯物與單抗混合組(3G11+LDM)的抑瘤率為38.6％。3G11-LDM偶聯物的抑瘤率顯著高於等劑量的游離LDM。
表3 3G11-LDM偶聯物與游離LDM對小鼠移植性結腸癌C26的生長抑制作用

皮下接種腫瘤，第3天靜脈注射給藥一次；*P＜0.01與對照組比較，**P＜0.01與力達黴素組比較實施例53G11-LDM偶聯物靜脈注射對小鼠肝癌H22的療效實驗用體重為18-22g的昆明種雌性小鼠120隻，隨機分組，每組10隻。取小鼠肝癌H22腹水，以生理鹽水稀釋製成細胞數為7.5×106/ml的懸液，按0.2ml/只接種於小鼠腋窩皮下。接種腫瘤24h後靜脈給藥，一周後再給藥一次，共2次。對照組靜脈注射生理鹽水0.2ml/只。實驗期間，每3～4天測量一次腫瘤的長徑a和與之垂直的短徑b，並記錄動物體重和動物死亡情況。按公式V＝1/2ab2計算腫瘤體積，繪製腫瘤生長曲線，並計算抑瘤率。觀察偶聯物不同給藥方案對小鼠移植性肝癌的治療作用。結果顯示(圖9)，3G11-LDM偶聯物0.025mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg三個劑量均能顯著地抑制小鼠移植性肝癌H22的生長，3G11-LDM偶聯物比游離LDM顯示更強的腫瘤生長抑制作用。按腫瘤體積進行比較，實驗第11天，0.025mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg劑量的3G11-LDM偶聯物的抑瘤率分別為66.3％，87.8％和97.2％；而0.05mg/kg劑量的游離LDM的抑瘤率為67.1％。3G11-LDM偶聯物0.05mg/kg劑量與同等劑量的游離LDM相比較，抑瘤作用顯著增強(P＜0.05)。實施例6Fab』-LDM偶聯物靜脈注射對小鼠肝癌H22的療效實驗用體重為18-22g的昆明種雌性小鼠120隻，隨機分組，每組10隻。取小鼠肝癌H22腹水，以生理鹽水稀釋製成細胞數為7.5×106/ml的懸液，按0.2ml/只接種於小鼠腋窩皮下。接種腫瘤24h後靜脈給藥，一周後再給藥一次，共2次。對照組靜脈注射生理鹽水0.2ml/只。實驗期間，每3～4天測量一次腫瘤的長徑a和與之垂直的短徑b，並記錄動物體重和動物死亡情況。按公式V＝1/2ab2計算腫瘤體積，繪製腫瘤生長曲線，並計算抑瘤率。觀察偶聯物不同給藥方案對小鼠移植性肝癌的治療作用。結果顯示(圖10)，Fab』-LDM偶聯物治療組小鼠的腫瘤生長受到顯著抑制)。實驗第15天，按腫瘤體積計算抑瘤率，Fab』-LDM偶聯物0.025mg/kg、0.05mg/kg和0.1mg/kg劑量組的抑瘤率分別為84.5％、93.9％和96.0％，而游離LDM劑量0.05mg/kg的抑瘤率為78.3％。至實驗第21天，Fab』-LDM偶聯物0.025mg/kg，0.05mg/kg和0.1mg/kg三個劑量組的抑瘤率分別為76.7％，93.3％和94.8％；而游離LDM劑量0.05mg/kg的抑瘤率為76.1％。與同等劑量的游離LDM相比，Fab』-LDM偶聯物顯示更強的腫瘤生長抑制作用(P＜0.01)。
發明效果本發明利用抗IV型膠原酶單抗3G11與結腸癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌等惡性腫瘤組織的免疫反應性及其在體內的特異性分布的特點，與高活力「彈頭」藥物力達黴素分別製成3G11-LDM偶聯物和Fab』-LDM偶聯物；確定了3G11-LDM偶聯物和Fab』-LDM偶聯物的製備方法；體外試驗確定，3G11-LDM偶聯物或Fab』-LDM偶聯物與游離LDM相比，對腫瘤細胞顯示更強的殺傷作用；動物體內試驗證明，3G11-LDM偶聯物或Fab』-LDM偶聯物對腫瘤生長有很強的抑制作用，其抗腫瘤效果明顯高於游離的LDM或抗體本身。因此，預期單抗3G11-LDM偶聯物及其片段Fab』-LDM偶聯物可能開發成為新型的抗腫瘤靶向藥物用於臨床腫瘤治療，並取得良好的效果。
□--3G11+LDM(0.75+0.05) ◆--3G11-LDM(0.025)●--3G11-LDM(0.05) ▲--3G11-LDM(0.10)(括號內數字表示所用劑量mg/kg)圖10單抗片段Fab』-LDM偶聯物對肝癌H22腫瘤生長的抑制作用其中○--對照 ■--Fab』(0.25) △--LDM(0.05)●--Fab』-LDM(0.025)□--Fab』-LDM(0.05) ▲--Fab』-LDM(0.10)(括號內數字表示所用劑量mg/kg)本發明的細胞株保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏地址北京市海澱區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所保藏日期2002年11月7日保藏編號0831分類名雜交瘤3G11細胞株
權利要求
1.力達黴素(LDM)與抗IV型膠原酶單克隆抗體3G11及其Fab』片段構成的免疫偶聯物，其特徵在於單抗3G11-LDM偶聯物或Fab』-LDM偶聯物是分別由單抗3G11蛋白分子上的氨基或Fab』片段上的巰基與LDM輔基蛋白分子上的氨基之間通過小分子交聯劑作為接頭形成的，單抗3G11或Fab』與LDM免疫偶聯物的分子比為1∶1，其中用於連接LDM與單抗3G11或Fab』的小分子接頭可以是2-亞胺基四氫噻吩(2-IT)和N-羥基琥珀醯亞胺基-間-(N-馬來醯亞胺基)苯甲酸酯(MBS)，也可以是N-羥基琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)等其它小分子異型雙功能交聯劑。
2.如權利要求1所述免疫偶聯物的製備方法，其特徵是將力達黴素先以異型雙功能交聯劑如N-羥基琥珀醯亞胺基-間-(N-馬來醯亞胺基)苯甲酸酯(MBS)修飾，然後加入經2-亞胺基四氫噻吩(2-IT)巰基化的單抗3G11，或加入巰基化的Fab』片段，反應後經純化得到產物分別為3G11-LDM偶聯物或Fab』-LDM偶聯物；或者是將力達黴素以其它異型雙功能交聯劑如N-羥基琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)或長鏈的N-羥基琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(LC-SPDP)等異型雙功能交聯劑作為中介體與單抗3G11進行偶聯反應，反應後經純化得到產物。
3.力達黴素(LDM)與抗IV型膠原酶單克隆抗體3G11及其Fab』片段構成的免疫偶聯物3G11-LDM和Fab』-LDM在製備結腸癌等惡性腫瘤靶向治療劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及力達黴素與單克隆抗體及其Fab』片段的偶聯物以及在結腸癌等腫瘤靶向治療中的應用，抗IV型膠原酶單抗3G11及其Fab』片段，以2－亞胺基四氫噻吩(2－IT)和N－羥基琥珀醯亞胺基－間－(N－馬來醯亞胺基)苯甲酸酯(MBS)或其它交聯劑分子作為中介體，分別與力達黴素(LDM)偶聯，獲得了單抗3G11－LDM偶聯物和Fab』－LDM偶聯物，以單抗3G11對人的結腸癌、肺癌、食管癌、胃癌和乳腺癌惡性腫瘤進行免疫組織化學染色，顯示IV型膠原酶在上述消化道腫瘤中的表達和活性增加，間接ELISA方法測定單抗3G11及其Fab』片段與人結腸癌HT－29、肺癌PG、鱗癌KB、鼠結腸癌26(C26)和肝癌22(H22)均有較強的免疫結合能力，單抗3G11對移植於裸鼠的人FG肺癌可產生清晰的免疫顯像，體內實驗用於治療小鼠結腸癌與肝癌，單抗3G11－LDM偶聯物和Fab』－LDM偶聯物均顯示出比同等劑量的游離LDM更強的腫瘤生長抑制作用，因此，3G11－LDM偶聯物和Fab』－LDM偶聯物可能用於結腸癌等惡性腫瘤的靶向治療。
文檔編號C07K16/44GK1421460SQ0215365
公開日2003年6月4日 申請日期2002年12月3日 優先權日2002年12月3日
發明者甄永蘇, 王風強, 李亮, 劉秀均, 尚伯楊, 戴垚 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所