核酸擴增檢測方法

2023-04-27 09:13:31 2

專利名稱：核酸擴增檢測方法
技術領域：
本發明涉及核酸檢測領域，更具體地說，涉及一種在體外通過核酸雜交和恆溫擴增來特異性檢測樣品中的靶核酸是否存在及確定其濃度的方法。
特異性核酸擴增的方法有若干種，可根據其是否需要溫度循環分為兩類。一類需要溫度循環，如多聚酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)、連接酶鏈反應(Ligase chain reaction，LCR)；另一類不需要溫度循環而在恆溫下進行擴增，如依賴轉錄的複製系統(transcription-based amplification system，TAS)、核酸序列自主複製系統(self-sustained sequence replication，3SR)、Qβ複製酶系統等。這些方法雖然都能將核酸進行高倍擴增，但在實際臨床檢測上都存在各自的缺點和局限性，諸如定量性差、複合度(multiplicity)低、易發生產物交叉汙染、只適用於檢測DNA或RNA中的一種，或需多種酶、多步操作等；而且溫度循環方法與恆溫方法相比有一個明顯缺點在於需要使用特殊、昂貴的溫度循環儀器。上述各種原因影響了這些方法在臨床上的應用和推廣。於是，如何找到一種能克服上述缺陷的、更為理想的體外核酸擴增和檢測的方法就成為迫切需要解決的問題。
目前有一種新的、很有發展前途的核酸擴增方法稱為滾環擴增法(Rolling-circle amplification，RCA)。滾環擴增是一種在恆溫條件下、利用DNA聚合酶和單鏈環狀DNA模板，將與環狀模板雜交的引物以線性方式連續不斷延伸的DNA擴增方式。這種擴增又被稱為線性滾環擴增(LRCA)，其擴增產物是一條極長的由環狀模板互補序列拷貝串聯成的單鏈DNA(Fire and Xu，1995，PNAS美國科學院學報924641-45；Liu et al.1996 J.Am.Chem.Soc.美國化學社刊1181587-94)。當有兩種引物存在，其中一種引物與環狀模板上一段序列互補，第二種引物與環狀模板的另一片段序列相同時，可引起自發、連續的雙向多重分支狀鏈取代反應，稱為超分支滾環擴增(Hyperbranched Rolling-circle amplifoication，HRCA)。HRCA呈指數(級數)方式連續擴增DNA，可在一個多小時內擴增109-12倍，擴增速度超過多聚酶鏈反應(PCR)。最終擴增產物是長度以環狀模板為單位呈整數倍第增的雙鏈DNA(Lizardi et al.1998 Nature Genet.自然遺傳學雜誌19225-32)。
由於RCA反應具有簡單、靈敏、定量、複合度高、無產物交叉汙染等優點，因而在分子檢測領域極有發展前途。然而在目前階段，RCA在體外核酸檢測中的應用還比較有限，主要用於原位信號放大和使用開環探針探測單核酸多樣性(Single-nucleotide polymorphism，SNP)。在用於原位信號放大時，一般先用一線狀核酸探針的一端與附著在固相載體上的靶核酸形成穩定雜交，然後將未雜交的探針洗去，加入環狀DNA模板，與線狀探針的另一端形成穩定雜交，引發線性滾環擴增；擴增後的單鏈DNA產物再與帶有標記的探針雜交，直接或間接地檢測擴增信號。該方法的不足之處在於1)只使用一個識別靶核酸的探針，因而特異性不高；2)需要多步操作，比較繁瑣；3)洗滌不徹底會造成較高本底。
由此可見，需要有更加新穎、完善的設計來克服現有方法的缺陷，充分發揮滾環擴增原理的優勢，擴大其在核酸檢測中的應用範圍。

發明內容
本發明的目的是針對上述存在的問題，提供一種只使用一種酶、在同一反應管內、只須通過一步恆溫反應便能使樣品溶液中的靶核酸(包括DNA和RNA)迅速地擴增，從而可以在很短時間內利用儀器較精確地測出該靶核酸的濃度的方法。
本發明的另一個目的是提供一個用於實現上述方法的專用試劑盒。
本發明人為了實現上述目的而進行了深入研究，結果發現，在上述現有滾環擴增技術的基礎上，把只使用一種探針與靶核酸雜交、衝洗後再進行擴增的步驟改變為同時使用一種線狀探針和一種環狀探針與靶核酸片段雜交並將二探針的濃度比限定在一定的範圍內，同時限定二者相互間具有一定長度的配對序列，即可達到上述目的，至此便完成了本發明。也就是說，本發明的技術方案如下1.一種核酸擴增檢測方法，該方法包括向被檢測樣品中加入核酸探針及其他公知的必要輔助成分，在設定溫度下進行擴增反應，在反應進行中或完成後用儀器檢測擴增信號並定量分析靶核酸，據分析結果判斷樣品中是否存在靶核酸並確定其濃度，其特徵在於，上述的核酸探針是至少包括一種線狀探針和一種環狀探針的探針組，其中，線狀探針與環狀探針的摩爾濃度比在1∶100至100∶1的範圍內；其中，線狀探針至少包含如下兩個部分(1)5』端與靶核酸配對的序列，其長度在15-35個核苷酸的範圍內；(2)3』端與環狀探針配對的短序列，其長度在2-10個核苷酸的範圍內；並且上述(1)和(2)兩部分之間的間隔在0-5個核苷酸的範圍內。
環狀探針的總長度在35-200個核苷酸的範圍內，其中至少包含如下3個部分(1)與靶核酸配對的序列，其長度在15-35個核苷酸的範圍內；(2)與線狀探針3』端配對的序列，其長度在2-10個核苷酸的範圍內；(3)用於調節環狀探針總長度的填充序列；並且上述(1)和(2)兩部分之間的間隔在0-5個核苷酸的範圍內。
2.如技術方案1所述的方法，其特徵在於，其中所說線狀探針與環狀探針的摩爾濃度比在1∶10-10∶1的範圍內。
3.如技術方案1所述的方法，其特徵在於，其中所說線狀探針5』端與靶核酸配對的序列的長度在18-32個核苷酸的範圍內。
4.如技術方案1所述的方法，其特徵在於，其中所說環狀探針中與靶核酸配對的序列的長度在18-32個核苷酸的範圍內。
5.如技術方案1所述的方法，其特徵在於，其中所說線狀探針可呈下列3種狀態中的任一種(a)自由態；(b)附著於載體上；(c)部分呈自由態，部分附著於載體上；組成上還可包括任何修飾的核苷酸或其它成分。
6.如技術方案1所述的方法，其特徵在於，其中所說探針組中還包括至少一種線狀擴增引物，其長度在15-35個核苷酸的範圍內；其序列的全部或部分與環狀探針填充序列中一片段相同。
7.如技術方案1所述的方法，其特徵在於，其中所說擴增反應成分中包括DNA產物檢測試劑。
8.如技術方案1所述的方法，其特徵在於，其中所說用儀器檢測核酸擴增信號的方法可以是檢測單鏈或雙鏈DNA使用的任何方法。
9.如技術方案1-8中的任一項所述的方法，其特徵在於，整個核酸擴增檢測過程在同一反應容器中進行。
10.一種專用試劑盒，用於實施技術方案1-9中的任一項所述的方法，其特徵在於，其中裝有用於檢測樣品中可能存在的靶核酸種類及相對數量所需的試劑。
下面對本發明進行詳細描述。
本發明所提出的方法的作用機理大致如下當線狀探針和環狀探針與靶核酸雜交後，線狀探針的3』端作引物以環狀探針為模板，在DNA多聚酶催化下進行線性滾環擴增；反應溶液中的鏈取代擴增引物不斷跟滾環擴增產生的單鏈DNA產物雜交並以其為模板，以鏈取代反應的方式進行二級擴增，連續產生不同長度的單鏈DNA；這些二級單鏈DNA產物的3』端與溶液中自由的線狀探針雜交併合成最終的雙鏈DNA產物；在此過程中，靶核酸不斷地跟前一組雜交的線狀探針和環狀探針脫離，再與新一組線狀探針和環狀探針雜交，引起新一輪擴增，如此不斷循環，直到原料來盡為止(見

圖1-3)。
本發明設計了一種由一線狀探針和一環狀探針組成的新型探針組合(圖1)。組合中線狀探針和環狀探針的各一部分能分別與靶核酸上兩相鄰(無間隔)或相近(間隔一至數個核苷酸)片段配對。每一配對片段的較適宜長度通常為15-35個核苷酸，更適宜長度為18-32個核苷酸。具體長度根據擴增反應溫度和寡聚核苷酸的組成而定，一般配對片段的溶解溫度(Tm)比擴增反應溫度高3-6攝氏度。線狀探針的3』端短片段不與靶核酸配對；只是當線狀探針和環狀探針同時與靶核酸上的正確部位雜交後，該片段才可能與環狀探針上鄰近和對應的短片段配對(見圖1)。配對片段的適宜長度為2-10個核苷酸，具體長度因該片段的核苷酸組成而定，選擇原則是在無靶核酸存在時，在同樣反應條件和溫度下該片段不足以與環狀探針雜交而引起滾環式複製。線狀探針的兩部分之間一般無間隔，但也可以間隔一至數個核甘酸或填充以其它成分，在某些情況下這樣做也許有助於提高反應的特異性。線狀探針的5』端沒有特殊限制，可以附加其它序列及修飾基團，也可以與各種載體和表面基團相連接。
探針組中的環狀探針大致由三部分組成第一部分與靶核酸上的一個片段配對。如上所述，該片段較適宜長度通常為15-35個核苷酸，更適宜長度為18-32個核苷酸，具體長度根據擴增反應溫度和寡聚核苷酸的組成而定，一般配對片段的溶解溫度(Tm)比擴增反應溫度高3-6攝氏度；第二部分含有可與線狀探針的3』端相配對的短片段，配對短片段較適宜長度為2-10個核苷酸，該部分一般在第一部分的上遊(5』端)並靠近第一部分；餘下的第三部分可以有多種機動功能，例如1)該部分可包含與一個或多個用於二級擴增的線狀引物相同的序列；2)該部分可包含有一段序列，其在複製產物中的對應部分可與帶有標記的探針雜交，作為檢測擴增產物的一種方法；3)該部分可包含用做其它任何用途的序列，如可作為填充，來調節環狀探針的總長度等，通常，環狀探針的適宜總長度在35-200個核苷酸的範圍內。太短不利於滾環擴增反應進行；太長會增加環狀探針製作的難度和成本。
上述探針組還可以包括一個或多個人工合成的線狀引物。線狀引物的作用是跟一級擴增產物上的配對序列雜交並以其為模板，以鏈取代反應的方式進行二級擴增。線狀引物的較適宜長度通常為15-35個核苷酸，更適宜長度為18-32個核苷酸，具體長度根據擴增反應溫度和寡聚核苷酸的組成而定，一般配對片段的溶解溫度(Tm)比擴增反應溫度高3-6攝氏度。
本發明所提供的探針組合與通常RCA中使用的引物和環狀模板對的主要不同在於1)本發明中的線狀探針和環狀探針均要與靶核酸雜交；而通常RCA中，只有複製引物和環狀模板兩者之一跟靶核酸雜交，引物和環狀模板不同時跟靶核酸雜交；2)本發明中的線狀探針的3』端跟環狀探針配對的序列長度較短，一般不超過10個核苷酸，在無靶核酸存在時相互並不形成穩定雜交；通常RCA中使用的複製引物和環狀模板上配對片段的長度一般長於16個核苷酸，至少不短於10個核苷酸。兩者之間預先便可形成穩定的雜交，無需靶核酸的幫助。
本發明中涉及的核酸雜交的穩定性可由文獻中發表的方法計算，如Lesnick and Freier，1995，Biochemistry生物化學3410807-10815；McGraw et al.，1990，Biotechniques生物技術8674-678；Rychliket al.，1990 Nucleic Acids Res.核酸研究186409-6412。
由於使用了新型探針組合，本發明方法的反應機制和反應動力學跟HRCA反應不同(見圖2、3)。反應機制上的區別有1)在HRCA反應中，自由的線狀探針可以跟鏈取代反應產生的單鏈DNA產物上每一個環狀模板的拷貝雜交而引發又一級鏈取代反應；在本發明反應中，線狀探針只跟鏈取代反應產生的完整單鏈DNA產物的3』端，也就是線狀探針的自身拷貝形成穩定雜交併合成雙鏈DNA形式的最終產物；2)在HRCA反應中，每一個靶核酸分子一般只引起一次滾環擴增；在本發明反應中，每一個靶核酸分子循環不斷地與探針對雜交、引發滾環擴增反應、然後脫離，再跟新一對探針雜交(圖3)。從反應機理上可以推斷，該方法擴增反應動力學比HRCA要緩和，可以避免HRCA過於靈敏的缺陷。另外，靶核酸濃度與螢光達到一定強度所用時間呈可預計關係，因而該方法很有潛力發展成為一種定量核酸檢測的方法。
本發明中的線狀探針和線狀引物可以呈下列兩種狀態之一或兩種狀態的混合態1)自由態，指線狀探針和線狀引物溶解於溶液中，並可以帶有任何已知的標記或修飾；2)固定於載體上，指線狀探針或線狀引物的一端(多數指5』端部分)在反應前或反應後直接或間接固定或附著在載體上。較適宜的固著形式為探針或線狀引物的一端(多數指5』端部分)固定，另一端(一般指3』端)自由伸展。載體可以由任何材料製作，經過任何表面處理，呈任何形狀，如微珠、微顆粒、微孔、鏈狀多聚物、平面(晶片表面)等。
本發明中所用的線狀探針在呈不同狀態時有不同的特性和用途。當處自由態時，探針與溶液中靶核酸雜交的機率高，因而探測的速度快、靈敏度高。將探針固定在載體上，可以把跟其雜交的靶核酸從溶液中捕獲和分離出來，然後再進行擴增。這樣可避免樣品中某些成分對擴增反應的抑制。同時，滾環擴增的反應產物可以由固定在載體上探針或引物延伸而產生，被原位固定在載體上。利用該原理可將多種不同的線狀探針或引物固定在載體上，平行探測多個靶核酸。在DNA晶片上使用自由探針和固定探針的混合態有利於加快擴增反應速度和增加檢測的靈敏度。
使用本發明方法可以檢測的靶核酸包括RNA和DNA、鏈狀或環狀、單鏈或雙鏈、自由的或固定於載體上的。當靶核酸與探針組雜交部分呈雙鏈時，一般先要加熱或加其它解鏈劑使雙鏈解為單鏈，然後退火讓探針跟靶核酸雜交。
本發明方法中使用的DNA多聚酶可有多種選擇，原則上能催化DNA滾環複製的DNA多聚酶均可。這些酶一般有如下特性1)有解鏈活性；2)不易從模板DNA上脫落；3)無5』至3』DNA外切酶活性。一些較適用於本發明的、符合上述條件的酶有DNA多聚酶I的Klenow片段、phi-29 DNA多聚酶、噬菌體M2 DNA多聚酶、噬菌體PRD1 DNA多聚酶、BST大片段DNA多聚酶、Vent DNA多聚酶、T5 DNA多聚酶、T4 DNA多聚酶以及某些酶的突變或改造體等。更適用的酶包括phi-29 DNA多聚酶、Vent DNA多聚酶和BST DNA多聚酶等。其中Vent DNA多聚酶和BST DNA多聚酶為嗜熱型DNA多聚酶，可讓反應在較高溫度下進行，有利於提高檢測的特異性。
另外，在反應中加入DNA解旋因子有助於解鏈，如DNA解旋酶和單鏈DNA附著蛋白等。
檢測擴增信號的方法有多種，用來檢測單鏈或雙鏈DNA的方法基本都可以使用。例如，但不限於1)在擴增反應中使用帶標記的核苷酸或核苷酸類似物，將標記物直接整合到擴增產物中去。標記可以是螢光標記、半抗原、或放射性標記等。其中較合適的螢光標記有Cyanine Dyes(Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7)、Fluorescein(FITC)、Rhodamine、Texas red、nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl(NBD)、coumarin和dansyl chloride等；較合適的半抗原有生物素(biotin)、地谷新(digoxigenin)等；較合適的放射性標記有32P，33P，35S，125I等；較合適的帶有探測標記的核苷酸類似物有BrdUrd和BrUTP等。
2)使用對單鏈或雙鏈DNA有特異性的螢光染料，這些螢光染料的一個共同特性是跟核酸嵌合後發光強度明顯增強。較合適的探測單鏈DNA產物的螢光染料有SYBR Green II等；較合適的探測雙鏈DNA產物的螢光染料有SYBR Green I等。
3)使用聯有標記或信號發生物質的核酸探針與單鏈DNA產物雜交，檢測標記產生的信號。標記可以是但不限於螢光基團、色素基團、化學發光基團、半抗原、抗體、或酶標記等。較常用的酶標記有礆性磷酸酶和辣根過氧化物酶等。
4)使用分子信標(Molecular Beacon)、擴增熒標(Amplifluor)以及其它各種利用螢光淬滅技術或能量轉移技術設計的探針，如螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)、後滯螢光能量轉移(Delayed Fluorescence Energy Transfer，DEFRET)等。
較適用於信號檢測與擴增反應同步進行的檢測試劑有，但不限於分子信標、擴增熒標和嵌合螢光染料(如SYBR Green)等。其它檢測方法可由具有一般專業知識和技能的人員根據需要來選擇和使用，如電泳法等。
本發明範圍還包括了根據上述原理而設計出的形式和用途不同的各種生物檢測試劑盒和檢測晶片。這些試劑盒都至少直接或間接地使用了本說明書前面所述的探針組合，反應混合液中一般還包括等濃度的4種脫氧核糖核酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、pH緩衝成分、適當濃度的各種離子、核酸檢測試劑，還可以包括適當的核酸提取方法，具體搭配可由使用者根據需要進行選擇。
與現有體外核酸檢測方法相比，本發明提供的方法顯示了如下優越性和有益效果本發明實現了在恆溫條件下，在同一反應管內，只使用一種DNA聚合酶，通過一步反應完成核酸雜交、擴增、和信號檢測等多項操作。全部過程可以在大約一小時內完成，沒有產物交叉汙染，同樣適用於檢測RNA和DNA。
本發明方法可以在約一個小時內將DNA量擴增1010倍以上，檢測靈敏度達到單拷貝水平。在反應動力學上較HRCA緩和，更適用於定量檢測。
本發明提供的雙探針組合在原理和實際效果上都比PCR和RCA等方法具有更高的特異性。原因在於本發明使用的探針組合不但使用兩個探針，而且對兩個探針在靶核酸上雜交的相對位置有嚴格控制，即兩個探針必需雜交在靶核酸上兩個相鄰或非常相近的位置上才能引起擴增。當兩個探針或其中之一偶爾與靶核酸發生非特異性雜交時，會由於距離不合適而無法擴增。相比之下，RCA只有一個探針與靶核酸雜交，所以非特異性雜交的機率大。另外洗滌不徹底也會造成假陽性。其它一些使用DNA連接酶的RCA形式會因為非依賴於靶核酸的自發性連接而出現假陽性。PCR雖使用兩個引物，但當兩個引物中的任何一個與靶核酸非特異性雜交時，擴增反應便有可能發生。本發明方法實際檢測的準確率可接近和達到100％。
本發明可用來檢測各種生物樣品中是否有指定的核酸序列存在及定量地測出其濃度，可用於多種類型的快速基因檢測。例如檢測血清或其它生物樣品中是否有各種病毒存在及其濃度；快速確定細菌、真菌或其它微生物感染或汙染的染源等。在醫療衛生、檢疫、食品、環保和科研等領域用途廣泛。
圖2顯示了當一對探針分別與靶核酸上兩個相鄰部位雜交後，線狀探針的3』端利用環狀探針為模板在DNA聚合催化下進行滾環式複製，產生單鏈DNA產物。環狀探針在DNA聚合酶作用下與靶核酸脫離；滾環複製產生的單鏈DNA產物與二級鏈取代擴增引物雜交。
圖3為一例反應過程示意圖，顯示了反應溶液中的鏈取代擴增引物不斷跟滾環擴增產生的單鏈DNA產物雜交並以其為模板，以鏈取代反應的方式進行二級擴增，連續產生不同長度的單鏈DNA；這些二級單鏈DNA產物的3』端與溶液中自由的線狀探針雜交併合成最終的雙鏈DNA產物(過程C、D)；同時，靶核酸不斷地跟前一組雜交的線狀探針和環狀探針脫離，再與新一組線狀探針和環狀探針雜交，引起新一輪擴增(過程A、B)；上述過程連續不斷地重複，直至反應終止或因原料耗盡而停止。
圖4顯示了滾環式複製產生的單鏈DNA可與標記探針雜交，從而定量指示靶核酸濃度。
圖5為實施例1結果。1)為無靶核酸的陰性對照；2)為實驗樣品的相對螢光強度。
圖6顯示了實施例2中反應結果的1％DNA電泳圖譜。1)無靶核酸的陰性對照；2)實驗樣品；M)DNA分子量標準。
圖7為實施例3實驗結果。
圖8為實施例4實驗結果。1)無靶核酸的陰性對照平均值；2)B肝病毒序列組；3)C肝病毒序列組；4)人巨噬細胞病毒序列組。
下面結合實例及圖示對本發明及其用途作進一步闡述。實例中使用的具體方法、操作步驟、試劑、設備等均可以根據需要而進行適當改變和替換，在任何意義上所舉實例和附圖並不限制本發明的範圍。實施例1.檢測樣品中的靶RNA(C型肝炎病毒RNA序列)該例描述了一種利用本專利所述原理和探針組合特異性探測溶液中靶RNA序列的方法。該例中選擇使用BST DNA聚合酶在恆溫下擴增核酸，並使用SYBR Green I螢光染料檢測雙鏈DNA擴增產物濃度。整個過程，包括核酸恆溫擴增反應和檢測在同一管內進行，約1小時完成。
反應總體積為20微升，反應液組成為106拷貝靶RNA，0.5μM環狀探針，0.5μM線狀探針(比例1∶1)，0.5μM線狀引物，20mM Tris-Cl(pH8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，0.5mM dNTP，0.5U/μl BST DNA聚合酶，SYBR green I(1X)。零對照組中不加靶核酸。
操作過程如下將探針組與靶核酸溶液在微管中混合後，將微管放入螢光分析儀中讀取初始螢光強度，螢光激發波長為487nm，發射波長為525nm。然後95℃加熱3分鐘，冷卻至65℃，加入適量BST DNA聚合酶，65℃繼續保溫60分鐘。反應完畢後可立即讀取反應後螢光強度，計算反應前後螢光強度的變化。圖5比較了含有106拷貝靶RNA的實驗組(2)和零對照組(1)反應前後螢光強度的相對變化。該例中實驗組的螢光強度的相對變化(0.97)比零對照組(0.005)高193倍，顯示了該方法可在短時間內將靶核酸信號高倍擴增，而且用普通螢光檢測儀即可檢測。
該例中所用核酸序列(5』-3』)如下，具體特徵見序列表靶核酸RNA序列GCCACCAUAGAUCACUCCCCUGUGAGGAACUACUGUCUUCACGCAGAAAGCGUCUAGCCAUGGCGUUAGU(SEQ ID NO1)RNA是使用T7 RNA聚合酶由體外反應合成，DNA模板的序列為CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGCCACCATAGATCACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT(SEQ ID NO2)環狀探針序列GATATACAACCACATCAGCTAGACAGTAGTTCCTCACAGGGGAGTGATATCAGCATAGCAGTAGACTTGCGTACCTAAG(SEQ ID NO3)線狀探針序列TGGCTAGACGCTTTCTGCGTGAATAGCTGAT(SEQ ID NO4)擴增引物序列TCAGCATAGCAGTAGACTTGCG(SEQ ID NO5)實施例2.檢測樣品中靶DNA(人巨噬細胞病毒DNA序列)該例描述了一種利用本專利所述原理和探針組合特異性探測溶液中靶DNA序列的方法。該例中選擇使用BST DNA聚合酶在恆溫下擴增核酸，反應後用瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增產物。
操作過程如下在微管中加入總體積為18微升的反應混合物，包括0.5μM環狀探針，0.5μM線狀探針(比例1∶1)，0.5μM線狀引物，20mMTris-Cl(pH8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，0.5mM dNTP，實驗組中含104拷貝靶DNA；零對照組中不加靶核酸。95℃加熱3分鐘，冷卻至65℃，然後加入2微升(16U)BST DNA聚合酶，65℃繼續保溫60分鐘。反應完畢後取10微升反應液用1％瓊脂糖凝膠電泳分析。
從圖6顯示的凝膠電泳圖譜可以明顯看出，擴增反應後實驗組(2)中產生了大量雙鏈DNA產物，其長度以環狀探針的長度為單位遞增，形成一DNA「階梯」，跟反應機理所預測的結果相符；零對照組(1)中則探測不到任何擴增產物。M為DNA分子量標記。
該例中所用核酸序列(5』-3』)如下，具體特徵見序列表靶DNA序列(取自人巨噬細胞病毒序列)CCTAATCGCATCCTGCATCAAAGCGTCAATCAGACTTTCGACGTGCGCCAG(SEQ ID NO6)環狀探針序列GATATACAACCACATCAGCTAACGCTTTGATGCAGGATGCGATTTATCAGCATAGCAGTAGACTTGCGTACCTAAG(SEQ ID NO7)線狀探針序列GCGCACGTCGAAAGTCTGATTGATAGCTGAT(SEQ ID NO8)擴增引物序列TCAGCATAGCAGTAGACTTGCG(SEQ ID NO5)實施例3.用實時螢光PCR儀記錄擴增反應曲線實時螢光PCR儀目前被用來定量測定樣品中靶DNA含量。本發明所提供方法無需溫度循環，只利用儀器的快速螢光掃描部分實時記錄反應釋放的螢光強度，從而對樣品中靶核酸進行相對定量探測。
該例中操作方法與例1基本相同，使用BST大片段DNA聚合酶和SYBRGREEN I螢光染料，核酸恆溫擴增反應和檢測在同一管內進行。反應溶液總體積為20微升。多個反應可在8、12管條或96孔板內進行。
將探針組與靶核酸溶液在微管中混合後，95℃加熱3分鐘，冷卻至65℃，加入少量BST DNA聚合酶等的混合液，這時反應溶液總體積為20微升，反應溶液的最終組成與例1中的相同，靶DNA總量約為105和102拷貝，另加入500ng人基因組DNA作背景。陰性對照中只有500ng人基因組DNA，無靶核酸。將0.2ml PCR管放入ABI 7700(Perkin Elmer)序列探測儀的96孔反應槽內，65℃保溫80分鐘(2分鐘×40循環)。螢光激發波長為487nm，發射波長為525nm。
圖7記錄了擴增反應過程中螢光強度變化的曲線。可以看出，反應中靶核酸量越多，螢光出現和達到一定強度所需要的時間越短，因而可作為相對定量檢測核酸的基礎。該例中所用核酸序列與例2中相同。實施例4.在一個反應內同時檢測多種靶核酸該例描述了一種利用本專利所述原理和多種不同的探針組合檢測溶液中可能存在的多種靶核酸序列的方法。在同一試管內用一個反應同時檢測多種靶核酸可以減少核酸樣品用量，降低檢測費用，增加檢測通量。
該例中要檢測的靶核酸序列分別取自B型肝炎病毒、C型肝炎病毒和人巨噬細胞病毒基因組。反應溶液中相應混合了三種不同的探針組，每個探針組中的線性探針帶有不同波長的擴增熒標，螢光激發波長(EX)/發射波長(EM)分別為B型肝炎病毒，FAM 495/519nm；C型肝炎病毒，HEX 530/553nm；人巨噬細胞病毒，TAMRA 560/583nm。在反應結束後根據螢光顏色和強度可以判斷有何種靶核酸存在及其相對濃度。反應使用BST DNA聚合酶在恆溫下擴增核酸。整個過程，包括核酸恆溫擴增反應和檢測在同一管內進行，約1小時完成。
操作過程如下將探針組與靶核酸溶液在96孔板微管中混合，將微管放入螢光分析儀中讀取各個波長的初始螢光值，然後95℃加熱3分鐘，冷卻至65℃，加入適量BST DNA聚合酶，65℃繼續保溫75分鐘。反應完畢後可立即在各相應波長讀取反應後螢光值。計算反應前後螢光變化值。
反應總體積為40微升，反應液組成為0或106拷貝靶核酸，0.5μg人基因組DNA，0.5μM每種環狀探針(共3種)，0.5μM每種擴增熒標線狀探針(共3種)，1μM共用線狀引物，20mM Tris-Cl(pH8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，0.5mMdNTP，0.5U/μl BST DNA聚合酶。
從圖8中可以看出，擴增後實驗組的螢光強度均比零對照組高近200倍。證明通過使用不同的探針組和螢光標記，本發明方法可用於在同一反應中同時檢測多種不同的靶核酸。
該例中所用核酸序列(5』-3』)如下，具體特徵見序列表B型肝炎病毒靶序列ACCACATCATCCATATAACTGAAAGCCAGACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTAGTAAACTGAGCCA(SEQ ID NO9)環狀探針序列GATATACAACCACATCAGCTAGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTTATCAGCATAGCAGTAGACTTGCGTACCTAAG(SEQ ID NO10)擴增熒標線狀探針序列5′FAM-TCGATGACTGACGGTCATCG(DABCYL-dT)ACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGTAGCTGAT(SEQ ID NO11)C型肝炎病毒靶核酸RNA序列同(SEQ ID NO1)，環狀探針序列同(SEQ IDNO3)，擴增熒標線狀探針序列5′HEX-TCGATGACTGACGGTCATCG(DABCYL-dT)ACTTGGCTAGACGCTTTCTGCGTGAATAGCTGAT(SEQ ID NO12)人巨噬細胞病毒靶序列同(SEQ ID NO6)，環狀探針序列同(SEQ ID NO7)擴增熒標線狀探針序列5′TAMRA-TCGATGACTGACGGTCATCG(DABCYL-dT)ACTGCGCACGTCGAAAGTCTGATTGATAGCTGAT(SEQ ID NO13)通用擴增引物序列同(SEQ ID NO5)
序列表110田敬東龔啟洪120核酸擴增檢測方法130PFO30007，Deng Dingji，Zhongzi Law Office14014116014170Patent In Version 3.1210121170212RNA213C型肝炎病毒223靶RNA400SEQUENCE1gccaccauag aucacucccc ugugaggaac uacugucuuc acgcagaaag 50cgucuagcca uggcguuagu 70210221195212DNA213重組序列220223人工合成雙鏈DNA模板400SEQUENCE2cgaaattaat acgactcact atagggccac catagatcac tcccctgtga 50ggaactactg tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagt 95210321179212DNA213重組序列220223環狀探針221222(14)..(21)223與線狀探針雜交片段221222(22)..(47)223與靶核酸雜交片段221222(49)..(71)223與擴增引物相同序列400SEQUENCE3gatatacaac cacatcagct agacagtagt tcctcacagg ggagtgatat 50cagcatagca gtagacttgc gtacctaag79210421131212DNA213重組序列220223線狀探針221222(1)..(23)223與靶核酸雜交片段221222(24)..(31)223與環狀探針雜交片段400SEQUENCE4tggctagacg ctttctgcgt gaatagctga t 31210521122212DNA213重組序列220223擴增引物400SEQUENCE5tcagcatagc agtagacttg cg 22210621151212DNA213人巨噬細胞病毒220223人工合成靶DNA400SEQUENCE6cctaatcgca tcctgcatca aagcgtcaat cagactttcg acgtgcgcca g 51210721176212DNA213重組序列220223環狀探針221222(14)..(21)223與線狀探針雜交片段221222(22)..(44)223與靶核酸雜交片段221222(47)..(68)223與擴增引物相同序列400SEQUENCE7gatatacaac cacatcagct aacgctttga tgcaggatgc gatttatcag 50catagcagta gacttgcgta cctaag 76210821131212DNA213重組序列220223線狀探針221222(1)..(23)223與靶核酸雜交片段221222(24)..(31)223與環狀探針雜交片段400SEQUENCE8gcgcacgtcg aaagtctgat tgatagctga t 31210921185212DNA213B型肝炎病毒220223人工合成靶DNA400SEQUENCE9accacatcat ccatataact gaaagccagac agtggggga aagccctacg 50aaccactgaa caaatggcac tagtaaactg agcca 852101021176212DNA213重組序列220223環狀探針221222(14)..(21)223與線狀探針雜交片段221222(22)..(44)223與靶核酸雜交片段221222(47)..(68)223與擴增引物相同序列400SEQUENCE10gatatacaac cacatcagct agctttcccc cactgtctgg cttttatcag 50catagcagta gacttgcgta cctaag 762101121159212DNA213重組序列220223擴增熒標線狀探針221222(1)223FAM修飾221222(21)223DABCYL修飾221222(25)..(52)223與靶核酸雜交片段221222(53)..(59)223與環狀探針雜交片段400SEQUENCE11tcgatgactg acggtcatcg tactagtgcc atttgttcag tggttcgtag 50gtagctgat 592101221155212DNA213重組序列220223擴增熒標線狀探針221222(1)223HEX修飾221222(21)223DABCYL修飾221222(25)..(48)223與靶核酸雜交片段221222(49)..(55)223與環狀探針雜交片段400SEQUENCE12tcgatgactg acggtcatcg tacttggcta gacgctttct gcgtgaatag 50ctgat 552101321155212DNA213重組序列220223擴增熒標線狀探針221222(1)223TAMRA修飾221222(21)223DABCYL修飾221222(25)..(48)223與靶核酸雜交片段221222(49)..(55)223與環狀探針雜交片段400SEQUENCE13tcgatgactg acggtcatcg tactgcgcac gtcgaaagtc tgattgatag 50ctgat 5權利要求
1.一種核酸擴增檢測方法，該方法包括向被檢測樣品中加入核酸探針及其他公知的必要輔助成分，在設定溫度下進行擴增反應，在反應進行中或完成後用儀器檢測擴增信號並定量分析靶核酸，據分析結果判斷樣品中是否存在靶核酸並確定其濃度，其特徵在於，上述的核酸探針是至少包括一種線狀探針和一種環狀探針的探針組，其中，線狀探針與環狀探針的摩爾濃度比在1∶100至100∶1的範圍內；其中，線狀探針至少包含如下兩個部分(1)5』端與靶核酸配對的序列，其長度在15-35個核苷酸的範圍內；(2)3』端與環狀探針配對的短序列，其長度在2-10個核苷酸的範圍內；並且上述(1)和(2)兩部分之間的間隔在0-5個核苷酸的範圍內；環狀探針的總長度在35-200個核苷酸的範圍內，其中至少包含如下3個部分(1)與靶核酸配對的序列，其長度在15-35個核苷酸的範圍內；(2)與線狀探針3』端配對的序列，其長度在2-10個核苷酸的範圍內；(3)用於調節環狀探針總長度的填充序列；並且上述(1)和(2)兩部分之間的間隔在0-5個核苷酸的範圍內。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中所說線狀探針與環狀探針的摩爾濃度比在1∶10-10∶1的範圍內。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中所說線狀探針5』端與靶核酸配對的序列的長度在18-32個核苷酸的範圍內。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中所說環狀探針中與靶核酸配對的序列的長度在18-32個核苷酸的範圍內。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中所說線狀探針可呈下列3種狀態中的任一種(a)自由態；(b)附著於載體上；(c)部分呈自由態，部分附著於載體上；組成上還可包括任何修飾的核苷酸或其它成分。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中所說探針組中還包括至少一種線狀擴增引物，其長度在15-35個核苷酸的範圍內；其序列的全部或部分與環狀探針填充序列中一片段相同。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中所說擴增反應成分中包括DNA產物檢測試劑。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，其中所說用儀器檢測核酸擴增信號的方法可以是檢測單鏈或雙鏈DNA使用的任何方法。
9.根據權利要求1-8中的任一項所述的方法，其特徵在於，整個核酸擴增檢測過程在同一反應容器中進行。
10.一種專用試劑盒，用於實施權利要求1-9中的任一項所述的方法，其特徵在於，其中裝有用於檢測樣品中可能存在的靶核酸種類及相對數量所需的試劑。
全文摘要
核酸擴增檢測方法，包括向檢測樣品中加入至少一種線狀探針和至少一種環狀探針，二者的摩爾濃度比在1∶100至100∶1的範圍內；其中，線狀探針至少包含(1)5』端與靶核酸配對的序列；(2)3』端與環狀探針配對的短序列；環狀探針至少包含(1)與靶核酸配對的序列；(2)與線狀探針3』端配對的序列；(3)用於調節環狀探針總長度的填充序列。本發明方法可在同一反應管內，只用一種DNA聚合酶，通過一步恆溫反應完成核酸雜交、擴增、檢測等多項操作，可在約一小時內將DNA量擴增10
文檔編號C12Q1/68GK1460722SQ0312359
公開日2003年12月10日 申請日期2003年5月19日 優先權日2003年5月19日
發明者田敬東, 龔啟洪 申請人:田敬東, 龔啟洪