促甲狀腺素受體的抗體及其用途的製作方法

2023-04-27 22:46:46

專利名稱：促甲狀腺素受體的抗體及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及促甲狀腺素受體(TSH受體或TSHR)的結合配偶體(例如單克隆或重組抗體)及其用途。
背景技術：
促甲狀腺素或促甲狀腺激素(TSH)是一種垂體激素，它在調節甲狀腺的功能中起關鍵作用。它的釋放被在下丘腦中形成的TRH激素(促甲狀腺素釋放激素)所刺激，且TSH控制重要的甲狀腺激素甲狀腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)的形成和釋放。基於反饋機制，血清中的甲狀腺激素含量控制TSH的釋放。T3與T4通過甲狀腺細胞的形成被TSH通過以下過程所刺激，在該過程中由垂體釋放的TSH結合到甲狀腺細胞膜的TSH受體上。
在突眼性甲狀腺腫(一種常見的自身免疫病)中，形成了TSH受體抗體(TRAb)，並且這些自身抗體以模擬TSH的作用方式結合到TSH受體上，從而刺激甲狀腺產生高水平的甲狀腺激素。這些自身抗體據稱具有刺激活性。在一些患者中，自身抗體與TSH受體結合但不刺激甲狀腺激素的產生，並被描述為具有阻斷活性(J Sanders，Y Oda，S-A Roberts，M Maruyama，J Furmaniak，B Rees Smith；「理解促甲狀腺素受體的結構與功能間的相互關係(Understanding the thyrotrophin receptorfunction-structure relationship)」，Ballière’s Clinical Endocrinology andMetabolism；TF Davies編輯1997；11(3)451～479；Ballière Tindall出版，倫敦)。
TSH受體抗體的測定在對突眼性甲狀腺腫及其它甲狀腺病症的診斷和控制中非常重要。目前使用三種類型的分析方法來測定TSH受體抗體
(a)競爭性結合分析，它測定TSH受體抗體抑制TSH結合於TSH受體製備物的能力；(b)生物分析，它測定TSH受體抗體刺激細胞在培養物中表達TSH受體的能力；和(c)TSH受體製備物與TSH受體抗體的免疫沉澱。
用這樣的分析方法測定TSH受體抗體在參考文獻中已有描述J Sanders，Y Oda，S-A Roberts，M Maruyama，J Furmaniak，B ReesSmith；「理解促甲狀腺素受體結構與功能間的相互關係」，Ballière’sClinical Endocrinology and Metabolism；TF Davies編輯1997；11(3)451～479；Ballière Tindall出版，倫敦；J Sanders，Y Oda，S Roberts，A Kiddie，T Richards，J Bolton，VMcGrath，S Walters，D Jaskólski，J Furmaniak，B Rees Smith；TSH受體自身抗體與125I標記的TSH受體間的相互作用(The interaction of TSHreceptor autoantibodies with125I-labelled TSH receptor)；Journal of ClinicalEndocrinology and Metabolism；1999；84(10)3797～3802。
多年以來一直認為源自患者淋巴細胞的TSH受體的人單克隆抗體，對於理解突眼性甲狀腺腫的發病機理和發展新的測定TSH受體抗體的方法例如在競爭性結合測定中替代TSH，將成為有價值的製劑。並且因為患者的血清TSH受體抗體通常是有效的甲狀腺刺激物(TSH激動劑)，所以當包含TSH受體的組織(如甲狀腺組織或甲狀腺癌組織)需要刺激的時候，刺激人單克隆TSH受體抗體對於體內應用將是有價值的。此外，由於一些患者的血清TSH受體抗體是有效的TSH拮抗物(阻斷抗體)，所以當包含TSH受體的組織(如甲狀腺組織或甲狀腺癌組織)的活性需要失活或要使其對TSH、TSH受體抗體或其它刺激物無應答性的時候，作為TSH拮抗物的人單克隆TSH受體抗體對於體內應用將是有價值的。
也認為在這樣的體外和/或體內應用中，人單克隆TSH受體抗體相對於TSH的一個主要優點將是抗體可被相對容易地操縱。例如，可對單克隆抗體的TSH受體結合區進行操縱來改變它們的特性，例如親和力和生物學特性，包括它們的TSH激動劑或拮抗物活性程度。此外，單克隆抗體較TSH在體內的半衰期將長得多，這可以在某些體內應用中具有相當大的優勢。此外，抗體的半衰期可以容易地被操縱，例如抗體Fab片段的半衰期較完整IgG的半衰期短得多。這些TSH受體抗體的一般特性在出版物中被描述，如B Rees Smith，SM Mclachlan，J Furmaniak，「促甲狀腺素受體的自身抗體(Autoantibodies to the thyrotropin receptor)」，Endocrine Reviews 1988，9106～121；B Rees Smith，KJ Dorrington，DSMunro，「長效甲狀腺刺激物γG-球蛋白亞基的甲狀腺刺激特性(Thethyroid stimulating properties of long-acting thyroid stimulator γG-globulinsubunits)」，Biochimica et Biophysica Acta 1969，192277～285；KJDorrington，DS Munro，「長效甲狀腺刺激物(The long acting thyroidstimulator)」；Clinical Pharmacology and Therapeutics 1966，7788～806。
人單克隆TSH受體抗體更進一步的一個優勢是它們在鑑定或提供新型的TSH受體抗體結合位點方面的用途。例如，通過產生針對結合TSH受體的人單克隆TSH受體抗體區的抗體。以這種方式產生的一些抗獨特型抗體有可能作為新的配體用於TSH受體抗體、TSH和相關化合物的分析。此外它們可能是體內調節TSH受體抗體、TSH和相關化合物的作用的有效試劑。
用單克隆抗體來鑑定和提供新型的抗體結合位點的其它方法是熟知的。例如如下述文獻所描述的那樣，通過噬菌體展示的隨機肽文庫的抗體篩選的方法JC Scott與GP Smith「用表位文庫尋找多肽配體(Searchingfor peptide ligands with an epitope library)」，Science，1990，249(4967)386～390和MA Myers、JM Davies、JC Tong、J Whisstock、M Scealy、IR MacKay、MJ Rowley，「通過多肽噬菌體展示和分子模建來鑑定的糖尿病自身抗原GAD65上的構象性表位(Conformational epitopes on thediabetes autoantigen GAD65identified by peptide phage display andmolecular modelling)」，免疫學雜誌(Journal of Immunology)，2000，1653830～3838。也可進行非肽化合物和非肽化合物文庫的抗體篩選。
用這些程序鑑定和提供的新型TSH受體抗體結合位點也可在TSH受體抗體、TSH及相關化合物的分析中，作為新的配體發揮作用。此外，它們可以是體內調節TSH受體抗體、TSH及相關化合物的作用的有效試劑。
考慮到人單克隆TSH受體抗體的潛在價值，多年來已付出大量努力來產生這樣的抗體(參見，例如B Rees Smith，SM McLachlan，J Furmaniak，「促甲狀腺素受體的自身抗體」，Endocrine Reviews 1988，9106～121)。然而到目前為止，這些努力都是不成功的(參見，例如SM McLachlan，BRapoport，「TSH受體的人單克隆自身抗體—我們尋找的目標及為何我們要尋找它(Monoclonal，human autoantibodies to the TSH receptor-TheHoly Grail and why are we looking for it)」，臨床內分泌學與代謝雜誌(Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism)，1996，813152～3154和JHW van der Heijden，TWA de Bruin，KAFM Gludemans，J de Kruif，JP Banga，T Logtenberg，「半合成文庫方法用於獲得突眼性甲狀腺腫的促甲狀腺素受體的人單克隆自身抗體的局限性」(Limitations of thesemisynthetic library approach for obtaining human monoclonalautoantibodies to the thyrotropin receptor of graves』disease)，臨床與試驗免疫學(Clinical and Experimental Immunology)，1999，118205～212)。

發明內容
本發明的一個目的是提供TSH受體的結合配偶體，它能夠以與TSH受體自身抗體與TSH受體間的相互作用相當的方式與TSH受體發生相互作用，特別是本發明的目的是提供TSH受體的人單克隆抗體，它們之間所顯示出的相互作用可以與存在於甲狀腺機能亢進性突眼性甲狀腺腫患者血清中的所見到的TSH受體抗體與TSH受體的相互作用相比擬；以及還提供了其重組體製備物。本文描述的發明中已克服了生產人單克隆TSH受體抗體的相當大的困難。尤其是描述了具有在甲狀腺機能亢進性突眼性甲狀腺腫患者血清中所發現的自身抗體的特性的人單克隆TSH受體抗體的成功生產。我們已生產的人TSH受體單克隆抗體(本文稱為hMAb TSHR 1)以高親和力結合到TSH受體上，通過這樣的方式以致於少量的抗體抑制標記的TSH結合到TSH受體上，且少量可充當有效的甲狀腺刺激物。抗體的Fab片段與重組體Fab製備物如同完整IgG一樣，是類似的有效的甲狀腺刺激物及標記的TSH結合的抑制劑。單克隆Fab和/或完整IgG可以用125I或生物素標記，並顯示其結合到TSH受體上。這樣的結合被患者血清中的TSH受體自身抗體所抑制。
因此，本發明提供了一種TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體包含或源自人單克隆或重組抗體或其一個或多個片段，所述抗體或片段與TSH受體反應。
特別地，本發明提供了一種TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體包含或源自人單克隆抗體或其一個或多個片段，所述抗體或片段與TSH受體反應。
特別地，本發明提供了一種TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體包含或源自人重組抗體或其一個或多個片段，所述抗體或片段與TSH受體反應。
特別地，本發明提供了一種人單克隆抗體或其一個或多個片段，所述抗體或片段與TSH受體反應。
特別地，本發明提供了一種人重組抗體或其一個或多個片段，所述抗體或片段與TSH受體反應。特別是本發明提供了與TSH受體反應的人重組抗體的一個或多個片段。
根據本發明的結合配偶體，尤其是根據本發明的與TSH受體反應的人單克隆或重組抗體，可以通過其抑制TSH結合到TSH受體上的能力和/或其刺激TSH受體的能力而被進一步地表徵，已顯示兩者分別與得自突眼性甲狀腺腫患者血清中所存在的TSH受體自身抗體的抑制和刺激特性相當。
更特別地，根據本發明的結合配偶體，尤其是根據本發明的人單克隆或重組抗體，可以通過對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性來表徵，所述抑制活性至少為國際標準NIBSC 90/672的約15個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約60個單位/mg，或更優選至少為國際標準NIBSC90/672的約120個單位/mg，或該單克隆或重組抗體的一個或多個片段。
更特別地，根據本發明的結合配偶體，尤其是根據本發明的人單克隆或重組抗體，可以進一步通過對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性而進行表徵，所述刺激活性至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約60個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg，或更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約240個單位/mg，或這樣的單克隆或重組抗體的一個或多個片段。
在本發明的一個優選實施方案中，根據本發明的結合配偶體，尤其是根據本發明的人單克隆或重組抗體，可以通過以下來表徵(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約15個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672約的30個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約60個單位/mg，或更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約60個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg，或更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約240個單位/mg；或該單克隆或重組抗體的一個或多個片段。
在根據本發明的結合配偶體包含或源自與TSH受體反應的單克隆或重組抗體的一個或多個片段，尤其是在例如與TSH受體反應的單克隆或重組抗體的一個或多個Fab片段的情況下，優選這樣的結合配偶體可以用對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性來表徵，所述抑制活性至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約60個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg，或更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約240個單位/mg。
在根據本發明的結合配偶體包含或源自與TSH受體反應的單克隆或重組抗體的一個或多個片段，尤其是在例如與TSH受體反應的單克隆或重組抗體的一個或多個Fab片段的情況下，還優選該結合配偶體可以用對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性來表徵，所述刺激活性至少為國際標準NIBSC 90/672的約50個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約100個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC90/672的約200個單位/mg，或更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約400個單位/mg。
在根據本發明的結合配偶體包含或源自與TSH受體反應的單克隆或重組抗體的一個或多個片段，尤其是在例如與TSH受體反應的單克隆或重組抗體的一個或多個Fab片段的情況下，仍優選採用以下方式來表徵該結合配偶體(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約60個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg，或更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約240個單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約50個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約100個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約200個單位/mg，或更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約400個單位/mg。
在一個優選方案中，本發明提供了一種TSH受體的結合配偶體(典型的是人單克隆抗體)，該結合配偶體優選能與TSH受體相結合從而刺激TSH受體，且它包含抗體VH區，該抗體VH區選自如SEQ ID NO.1所示的VH區(重鏈可變區)，和包含一個或多個VHCDR的VH區，所述VHCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
因此，在本發明的第一實施方案中，提供了一種TSH受體的結合配偶體(典型的是人單克隆抗體)，該結合配偶體優選能與TSH受體相結合從而刺激TSH受體，且它包含如SEQ ID NO.1所示的抗體VH區。
因此，在本發明的第二實施方案中，提供了一種TSH受體的結合配偶體(典型的是人單克隆抗體)，該結合配偶體優選能與TSH受體相結合從而刺激TSH受體，且它包含抗體VH區，該抗體VH區含有一個或多個VHCDR，該VHCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
可以理解根據本發明的結合配偶體可以基本上如前所述那樣包含抗體VH區，而不包含抗體VL區(輕鏈可變區)。已知單免疫球蛋白區，尤其是VH區，能以特殊的方式結合靶抗原。可選地，根據本發明的結合配偶體可以包含與抗體VL區配對的抗體VH區，以使用現有技術中熟知的的技術(Biochim.Biophys.Acta，192(1969)277～285；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第89卷，第10026～10030頁，1992年11月)來提供抗體結合位點，該抗體結合位點包含針對TSH受體的VH和VL區。
然而在本發明的優選方案中，提供了一種TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體優選能與TSH受體相結合從而刺激TSH受體，並且它包含抗體VH區，選自由以下組成的組如SEQ ID NO.1所示的VH區和含有一個或多個VHCDR的VH區，所述VHCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；和/或抗體VL區，選自由以下組成的組如SEQ ID NO.6所示的VL區和含有一個或多個VLCDR的VL區，所述VLCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。
根據本發明，優選基本上如前所述的結合配偶體包含與基本上如前所述的抗體VL區配對的基本上如前所述的抗體VH區，來提供同時含有針對TSH受體的VH和VL區的抗體結合位點，儘管當進一步討論時，抗體VH區或抗體VL區可能是獨立地用於結合TSH受體。因此，可以理解，基本上如前所述的結合配偶體可包含基本上如前所述的抗體VH區而不包含抗體VL區。因此，還可理解，基本上如前所述的結合配偶體可包含基本上如前所述的抗體VL區而不包含抗體VH區。可選地，基本上如前所述的結合配偶體可以包含與基本上如前所述的抗體VL區配對的抗體VH區，來提供同時含有針對TSH受體的VH和VL區的抗體結合位點。
因此，根據本發明的優選實施方案可包括基本上如前所述的結合配偶體，該結合配偶體包含如SEQ ID NO.1所示的抗體VH區，該抗體VH區與SEQ ID NO.6所示的VL區配對，來提供同時包含針對TSH受體的VH和VL區的抗體結合位點。
根據本發明進一步設想，基本上如前所述的VH區可以與除文中特別提到的VL區以外的VL區配對。也可以根據本發明進一步地設想，基本上如前所述的VL區可以與除文中特別提到的VH區以外的VH區配對。
根據本發明的另一個實施方案，提供了TSH受體的基本上如前所述的結合配偶體，該結合配偶體能結合到TSH受體上從而刺激TSH受體，且它可包含抗體VH區，該抗體VH區包含含有一個或多個VHCDR的VH區，所述VHCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；和/或抗體VL區，該抗體VL區包含含有一個或多個VLCDR的VL區，該VLCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。
上述的一個或多個CDR可獲自前述的VH和VL區並可被插入到合適的閱讀框內。例如，基本上如前所述的一個或多個CDR的胺基酸序列可以被插入到與文中特別揭示的hMAb TSHR 1不同的抗體的閱讀框區域內，這些抗體因此插入了一個或多個CDR並能結合到TSH受體上，優選基本上如前所述來刺激TSH受體。可選地，本發明可以提供能與TSH受體結合的多肽，從而基本上如前所述來刺激TSH受體；並且所述多肽包含文中特別揭示的一個或多個CDR所表示的胺基酸以及任選地連同另外的胺基酸的一級結構構象，這些另外的胺基酸可以加強文中所述的一個或多個CDR對TSH受體的結合親和力或可以基本上不影響多肽對TSH受體的結合特性。
本發明還包括文中所述的特異性人單克隆抗體、VH區、CDR和文中所揭示的多肽的變異體、類似物、衍生物和片段，該變異體，類似物、衍生物和片段基本上如前所述保留了與TSH受體發生相互作用的能力(例如刺激TSH受體)。
文中所用術語「變異體」、「類似物」、「衍生物」和「片段」可以被表徵為抗體、抗體片段或多肽，它們基本上保留了與具有如SEQ ID NO.1所示的VH區和如SEQ ID NO.6所示的VL區的人單克隆抗體相同的生活學功能和活性，尤其是其對於TSH受體的結合特性。適宜地，文中所述的變異體、類似物、衍生物和片段，及所述片段的變異體、類似物和衍生物具有胺基酸的一級結構構象，其中具有如SEQ ID NO.1所示的VH區和如SEQ ID NO.6所示的VL區的人單克隆抗體的許多或幾個胺基酸殘基(例如5～10、1～5或1～3)被取代，缺失或添加，或它們的任意組合。在這些中優選沉默取代、添加和缺失，它們不改變或者基本上不改變具有如SEQ ID NO.1所示的VH區和如SEQ ID NO.6所示的VL區的人單克隆抗體的生物學活性或功能。可優選保守性取代，這在下文中有更詳細的介紹。
更為特別地，根據本發明的具有如SEQ ID NO.1所示的VH區和如SEQ ID NO.6所示的VL區的人單克隆抗體的變異體、類似物、衍生物可以是那些其中一個或多個胺基酸殘基被保守或非保守胺基酸殘基(優選保守胺基酸殘基)所取代的變異體、類似物、衍生物，或那些其中一個或多個胺基酸殘基包含取代基或其類似物的變異體、類似物、衍生物。這樣的變異體、類似物，衍生物據認為是在本領域技術人員通過本文的教導所能獲知的範圍內。
最典型地，變異體、類似物、衍生物是通過保守胺基酸取代而不同於具有如SEQ ID NO.1所示的VH區和如SEQ ID NO.6所示的VL區的基準人單克隆抗體的變異體、類似物、衍生物。這樣的取代是用另外的具有類似特性的胺基酸取代給定的胺基酸。在以下胺基酸中進行相互的替換被視為典型的保守取代在脂肪族胺基酸A(丙氨酸)、V(纈氨酸)、L(亮氨酸)和I(異亮氨酸)中；在羥基殘基S(絲氨酸)和T(蘇氨酸)中；在酸性殘基D(天冬氨酸)和E(穀氨酸)中；在醯胺殘基N(天冬醯胺)和Q(穀氨醯胺)中；在鹼性殘基K(賴氨酸)和R(精氨酸)中；及在芳香族殘基F(苯丙氨酸)和Y(酪氨酸)中。
應意識到，文中所用術語「片段」尤其涉及文中特別所述的抗體片段，並形成本發明的一個重要方面。這樣，如本發明所提供的人單克隆或重組抗體可以作為以下任意片段而被提供(i)由VL、VH、CL和CH1區組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1區組成的Fd片段；(iii)由VL和VH區組成的Fv片段；(iv)由VH區組成的dAb(域抗體)片段；(v)獨立的CDR區；(vi)F(ab′)2片段，其為含有兩個連接的Fab片段的二價片段；和(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH區和VL區通過連接肽連接起來，這使得這兩個區聯合起來形成抗原結合位點。
可選地，根據本發明的人單克隆或重組抗體可以包含完整的IgG抗體，由此抗體包括可變區和恆定區。
本發明還提供了能與TSH受體結合的另外的結合配偶體，它能與TSH受體的基本上如上所述的結合配偶體(典型地是人單克隆抗體)競爭性地結合到TSH受體上，所述另外的結合配偶體不包含TSH。優選地，該另外的結合配偶體可以包含另外的具有針對TSH受體表位區的結合位點的抗體，且它能與基本上如上所述的TSH受體的結合配偶體(典型地是人單克隆抗體)競爭性地結合到TSH受體上。合適的所述另外的結合配偶體可以包含鼠單克隆抗體，優選它可基本上由實施例中所述的技術生產出來，所述技術通過本領域中已知的技術用TSH受體對鼠進行免疫。
本發明還可以提供能結合到TSH受體上的另外的結合配偶體，它可以包含或源自與TSH受體反應的人單克隆或重組抗體或其一個或多個片段。尤其是，該另外的結合配偶體可以包含另外的具有針對TSH受體表位區的結合位點的抗體，該另外的抗體能與TSH受體相結合，且它可與TSH受體的基本上如上所述的結合配偶體(典型地是人單克隆抗體)競爭性地結合到TSH受體上。合適的所述另外的結合配偶體可以通過合適的誘變技術，如點突變或類似技術，源自如文中所述的特異性結合配偶體hMAb TSHR 1，來獲得TSH受體的另外的結合配偶體，它可以與如上所述的結合配偶體(例如hMAb TSHR 1)競爭性地與TSH受體相互作用。
優選地，TSH受體的另外的結合配偶體可以包含單克隆或重組抗體，且能用對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性來表徵，所述抑制活性至少為國際標準NIBSC 90/672的約15個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約60個單位/mg，或更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg，或抗體的一個或多個片段。還優選本發明的另外的結合配偶體，也可以通過對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性來表徵，所述刺激活性至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約60個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg，或更優選至少為國際標準NIBSC90/672的約240個單位/mg，或抗體的一個或多個片段。
更優選本發明的所述的另外的結合配偶體可以通過以下來表徵(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約15個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約60個單位/mg，或更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約60個單位/mg，更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg，或更優選至少為國際標準NIBSC 90/672的約240個單位/mg；或其一個或多個片段。
提供根據本發明的另外的結合配偶體的優選的鼠單克隆抗體包含在實施例進一步製備的9D33，9D33具有如圖9～12和序列19～38所示的胺基酸和多核苷酸序列。因此根據本發明，提供了TSH受體的另外的結合配偶體(典型地是鼠單克隆抗體)，它包含如SEQ ID NO.19所示的抗體VH區。
本發明所提供的另外的結合配偶體也可以被表徵為包含抗體VH區，所述抗體VH區含有一個或多個VHCDR，所述VHCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22。
應意識到，根據本發明的另外的結合配偶體可以包含基本上如前所述的抗體VH區而不含有抗體VL區。已知單免疫球蛋白區，尤其是VH區，能以特殊的方式結合靶抗原。可選地，根據本發明的另外的結合配偶體採用現有技術中公知的技術(Biochim.Biophys.Acta，192(1969)277～285；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第89卷，10026～10030，1992年11月)可以包含與抗體VL區配對的抗體VH區，來提供同時包含針對TSH受體的VH和VL區的抗體結合位點。
然而在本發明的優選方案中，還提供了TSH受體的另外的結合配偶體，該另外的結合配偶體包含抗體VH區，該抗體VH區選自由以下組成的組如SEQ ID NO.19所示的VH區和含有一個或多個VHCDR的VH區，所述VHCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.21或SEQ ID NO.22；和/或抗體VL區，該抗體VL區選自由以下組成的組如SEQ ID NO.24所示的VL區和含有一個或多個VLCDR的VL區，所述VLCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.26或SEQ ID NO.27。
根據本發明，優選基本上如前所述的另外的結合配偶體包含與基本上如前所述的抗體VL區配對的基本上如前所述的抗體VH區，來提供同時含有針對TSH受體的VH和VL區的抗體結合位點，儘管如進一步討論的那樣，抗體VH區或抗體VL區，可以獨立地用於結合TSH受體。因此，應意識到，基本上如前所述的另外的結合配偶體可以包含基本上如前所述的抗體VH區而不包含抗體VL區。因此，還應意識到，基本上如前所述的另外的結合配偶體可以包含基本上如前所述的抗體VL區而不包含抗體VH區。可選地，基本上如前所述的另外的結合配偶體可以包含與基本上如上所述的抗體VL區配對的抗體VH區，來提供同時含有針對TSH受體的VH和VL區的抗體結合位點。
因此根據本發明的優選實施方案可以包括基本上如前所述的另外的結合配偶體，該結合配偶體包含與SEQ ID NO.24所示的抗體VL區配對的如SEQ ID NO.19所示的抗體VH區，來提供同時包含針對TSH受體的VH和VL區的抗體結合位點。
根據本發明進一步設想，基本上如前所述的VH區可以與除文中特別提到的VL區以外的VL區配對。也可以根據本發明進一步地設想，基本上如前所述的VL區可以與除文中特別提到的VH區以外的VH區配對。
根據本發明的另一個實施方案，提供了TSH受體的基本上如前所述的另外的結合配偶體，該另外的結合配偶體能結合到TSH受體上從而抑制對TSH受體的刺激，且它可包含抗體VH區，該抗體VH區包含含有一個或多個VHCDR的VH區，所述VHCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；和/或抗體VL區，該抗體VL區包含
含有一個或多個VLCDR的VL區，所述VLCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27。
上述的一個或多個CDR可獲自前述的VH和VL區並被插入到合適的閱讀框內。例如，基本上如前所述的一個或多個CDR的胺基酸序列可以被插入到與文中特別揭示的9D33不同的抗體的閱讀框區域內，這些抗體因此插入了一個或多個CDR並能結合到TSH受體上。可選地，本發明可以提供能與TSH受體結合的多肽，其包含如本發明特別揭示的一個或多個CDR所表示的胺基酸以及任選地連同另外的胺基酸的一級結構構象，所述另外的胺基酸可以加強文中所述的一個或多個CDR對TSH受體的結合親和力或可以基本不影響多肽對TSH受體的結合特性。
應意識到，此處所用術語「片段」尤其涉及文中特別所述的抗體的片段，並形成本發明的一個重要方面。這樣，根據本發明的另外的結合配偶體可以作為以下任意片段來提供(i)由VL、VH、CL和CH1區組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1區組成的Fd片段；(iii)由VL和VH區組成的Fv片段；(iv)由VH區組成的dAb片段；(v)獨立的CDR區；(vi)F(ab′)2片段，其為含有兩個連接的Fab片段的二價片段；和(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH區和VL區通過連接肽連接起來，這使得這兩個區聯合起來形成抗原結合位點。
可選地，根據本發明的鼠單克隆或重組抗體，例如9D33，可以包含整個IgG抗體，由此抗體包括可變區和恆定區。
本發明還提供了多核苷酸，該多核苷酸包含(i)如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列，其編碼如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQID NO.9所示的抗體VH區、VL區或CDR的胺基酸序列；(ii)編碼TSH受體的基本上如前所述的結合配偶體(典型地是人單克隆抗體)，或編碼TSH受體的基本上如前所述的結合配偶體(典型地是人單克隆抗體)的抗體VH區、VL區或CDR的胺基酸序列的核苷酸序列；
(iii)由於遺傳密碼的簡併性而編碼序列與(i)中任意序列不同的核苷酸序列；(iv)包含(i)中任意序列的等位突變的核苷酸序列；(v)包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)中任意序列的片段的核苷酸序列，尤其是包含(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)中任意序列的片段並編碼基本上如前所述的人單克隆抗體的Fab片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、獨立的CDR區、F(ab′)2片段或scFv片段的核苷酸序列；(vi)由於核苷酸鹼基的突變、缺失或取代而不同於(i)中任意序列並編碼TSH受體的基本上如前所述的結合配偶體(典型地是人單克隆抗體)，或編碼TSH受體的基本上如前所述的結合配偶體(典型地是人單克隆抗體)的抗體VH區、VL區或CDR的胺基酸序列的核苷酸序列。
本發明還提供了多核苷酸，該多核苷酸包含(i)如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列，其編碼如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27所示的抗體VH區、VL區或CDR的胺基酸序列；(ii)編碼基本上如前所述的TSH受體的另外的結合配偶體(典型地是鼠單克隆抗體)，或編碼基本上如前所述的TSH受體的另外的結合配偶體(典型地是鼠單克隆抗體)的抗體VH區、VL區或CDR的胺基酸序列的核苷酸序列；(iii)由於遺傳密碼的簡併性而編碼序列不同於(i)中任意序列的核苷酸序列；(iv)包含(i)中任意序列的等位突變的核苷酸序列；(v)包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)中任意序列的片段的核苷酸序列，尤其是包含(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)中任意序列的片段並編碼基本上如前所述的鼠單克隆抗體的Fab片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、獨立的CDR區、F(ab′)2片段或scFv片段的核苷酸序列；(vi)由於核苷酸鹼基的突變、缺失或取代而與(i)中任意序列不同並編碼TSH受體的基本上如前所述的另外的結合配偶體(典型地是鼠單克隆抗體)，或編碼TSH受體的基本上如前所述的另外的結合配偶體(典型地是鼠單克隆抗體)的抗體VH區、VL區或CDR的胺基酸序列的核苷酸序列。
根據本發明的變異體多核苷酸，在其全長內與相應的(i)中任意多核苷酸序列適合有至少70％的同一性，最優選的是在其全長內包含與(i)中任意多核苷酸序列具有至少80％同一性的區域的多核苷酸，尤其優選的是在其全長內與(i)中任意多核苷酸序列有至少90％同一性的多核苷酸，在這些特別優選的多核苷酸中，格外優選那些具有至少95％同一性的多核苷酸。
本發明還提供了具有生物學功能的載體系統，它攜帶有基本上如前所述的多核苷酸，且它能將多核苷酸引入宿主微生物的基因組中。
本發明還涉及用本發明的多核苷酸轉化的宿主細胞，及通過重組技術生產本發明的TSH受體的結合配偶體。宿主細胞可進行遺傳工程改造而插入多核苷酸並表達本發明的TSH受體的結合配偶體。
hMAb TSHR 1的胺基酸序列，hMAb TSHR 1為本發明的人單克隆抗體；及編碼hMAb TSHR 1的胺基酸序列的核苷酸序列；9D33的胺基酸序列，9D33為鼠單克隆抗體，它代表本發明的另外的結合配偶體；及編碼9D33的胺基酸序列的核苷酸序列；均顯示於下述的序列表中並可按以下分配。
序列描述和


對於hMAb TSHR 1胺基酸序列SEQ ID NO.1 VHSEQ ID NO.2 VHCDRISEQ ID NO.3 VHCDRIISEQ ID NO.4 VHCDRIIISEQ ID NO.5 重鏈可變區和相鄰恆定區SEQ ID NO.6 VLSEQ ID NO.7 VLCDRI
SEQ ID NO.8VLCDRIISEQ ID NO.9VLCDRIII核苷酸序列SEQ ID NO.10 VHSEQ ID NO.11 VHCDRISEQ ID NO.12 VHCDRIISEQ ID NO.13 VHCDRIIISEQ ID NO.14 重鏈可變區和相鄰恆定區SEQ ID NO.15 VLSEQ ID NO.16 VLCDRISEQ ID NO.17 VLCDRIISEQ ID NO.18 VLCDRIII對於9D33胺基酸序列SEQ ID NO.19 VHSEQ ID NO.20 VHCDRISEQ ID NO.21 VHCDRIISEQ ID NO.22 VHCDRIIISEQ ID NO.23 重鏈可變區和相鄰恆定區SEQ ID NO.24 VLSEQ ID NO.25 VLCDRISEQ ID NO.26 VLCDRIISEQ ID NO.27 VLCDRIIISEQ ID NO.28 輕鏈可變區和相鄰恆定區核苷酸序列SEQ ID NO.29 VHSEQ ID NO.30 VHCDRISEQ ID NO.31 VHCDRIISEQ ID NO.32 VHCDRIII
SEQ ID NO.33 重鏈可變區和相鄰恆定區SEQ ID NO.34 VLSEQ ID NO.35 VLCDRISEQ ID NO.36 VLCDRIISEQ ID NO.37 VLCDRIIISEQ ID NO.38 輕鏈可變區和相鄰恆定區圖1顯示了hMAb TSHR1 IgG和Fab對標記的TSH結合到TSHR包被的試管上的抑制；對照IgG為GAD65的人單克隆自身抗體；圖2顯示hMAb TSHR1 IgG和Fab、豬TSH(70個單位/mg；pTSH)、重組人TSH(6.7個單位/mg；hTSH)和對照單克隆抗體((MAb甲狀腺過氧化物酶的人單克隆自身抗體(2G4))的甲狀腺刺激活性；基底＝只在不含NaCl的Hanks緩衝鹽溶液存在下產生的cAMP；圖3顯示淋巴細胞供體血清對TSH結合到TSHR上的抑制的影響和對TSHR轉染的CHO細胞中的環腺苷酸的刺激的影響。在結合抑制測定中，將血清在健康獻血者血清池中稀釋；對於刺激測定，將血清在不含NaCl的Hanks緩衝鹽溶液中稀釋；健康獻血者血清(n＝3)給出的應答範圍為1.1×基底～1.3×基底；圖3a表示對根據本發明的TSHR自身抗體的ELISA與以前的測定進行比較；尤其是基於TSH-生物素的ELISA，如J Bolton、J Sanders、YOda、C Chapman、R Konno、J Furmaniak、B Rees Smith所述，「通過ELISA測定甲狀腺刺激激素受體自身抗體」，臨床化學，1999，第45卷，第2285～2287頁；和原始RIA，如K Southgate、FM Creagh、M Teece、C Kingswood、B Rees Smith所述「用於測定未提取的血清中的TSH受體抗體的受體測定(A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies inunextracted serum)」，1984，臨床內分泌學(Clinical Endocrinology)，第20卷，第539～543頁；圖3b表示對根據本發明的TSHR自身抗體的ELISA與基於TSH-生物素的ELISA進行比較，所述基於TSH-生物素的ELISA如J Bolton、JSanders、Y Oda、C Chapman、R Konno、J Furmaniak、B Rees Smith所述，「通過ELISA測定甲狀腺刺激激素受體自身抗體」，臨床化學，1999，第45卷，第2285～2287頁；比較了來自72位突眼性甲狀腺腫患者的血清；y＝1.1154×-13.032，r＝0.99；參考圖4、5、6和7，也可以看出上述hMAb TSHR1的序列，其中圖4顯示了hMAb TSHR1重鏈的核苷酸序列，以及相鄰的恆定區，其中圖4a給出了核苷酸序列本身；圖4b給出了標註了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恆定區的核苷酸序列；圖5顯示了hMAb TSHR1重鏈的胺基酸序列，以及相鄰的恆定區，其中圖5a給出了胺基酸序列本身；圖5b給出了標註了CDRI、CDRII、CDRIII和恆定區的胺基酸序列；圖6顯示了hMAb TSHR1輕鏈的核苷酸序列，其中圖6a顯示了核苷酸序列本身；圖6b給出了標註了PCR引物、CDRI、CDRII和CDRIII區的核苷酸序列；圖7顯示了hMAb TSHR1輕鏈的胺基酸序列，其中圖7a給出了胺基酸序列本身；圖7b給出了標註了CDRI、CDRII、CDRIII區的胺基酸序列。
從以上可以意識到，對於hMAb TSHR1的VH鏈，如圖4b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區的核苷酸序列分別相應於SEQ ID NO.11、12和13所示的VHCDRI、VHCDRII和VHCDRIII序列；如圖5b所示的CDRI，CDRII和CDRIII區的胺基酸序列分別相應於SEQ ID NO.2、3和4所示的VHCDRI，VHCDRII和VHCDRIII序列。從以上還可以意識到，對於hMAb TSHR1的VL鏈，如圖6b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區的核苷酸序列分別相應於SEQ ID NO.16、17和18所示的VLCDRI、VLCDRII和VLCDRIII序列；如圖7b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區的胺基酸序列分別相應於SEQ ID NO.7、8和9所示的VLCDRI、VLCDRII和VLCDRIII序列。
分析hMAb TSHR1 Fab的晶體結構(通過本領域的現有技術測定)使得用簡併的PCR引物測定的HC和LC核苷酸序列能夠被改進。具體地，鑑定了核苷酸115～120的HC測序人工產物。測序顯示為cacgtg(轉錄成胺基酸His Val)，但是晶體結構更可靠地顯示為胺基酸Gln Leu(相應的鹼基為cagctg)，改進序列如附圖和序列表所示。晶體結構分析還使得尤其是在簡併PCR引物區域中的HC和LC衍生胺基酸序列能被改進。當通過RT-PCR發現LC aa 2為Pro的情況下，而從晶體結構發現為Thr。當通過RT-PCR發現HC aa 2為Met的情況在，而從晶體結構發現為Val。此外，這些改進的序列由附圖和序列表所示。
上述9D33序列還可參見圖9、10、11和12，其中圖9表示9D33的重鏈核苷酸序列，以及相鄰的恆定區，其中圖9a給出了核苷酸序列本身；圖9b給出了標註了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恆定區的核苷酸序列；圖10顯示了9D33重鏈的胺基酸序列，以及相鄰的恆定區，其中圖10a給出了胺基酸序列本身；圖10b給出了標註了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恆定區的胺基酸序列；圖11顯示了9D33輕鏈的核苷酸序列，其中圖11a給出了核苷酸序列本身；圖11b給出了注釋了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恆定區的核苷酸序列；圖12表示9D33輕鏈的胺基酸序列，其中圖12a給出了胺基酸序列本身；圖12b給出了注釋了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恆定區的胺基酸序列。
從以上可以意識到，對於9D33的VH鏈，如圖9b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區的核苷酸序列分別相應於SEQ ID NO.30、31和32所示的VHCDRI、VHCDRII和VHCDRIII序列；如圖10b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區的胺基酸序列分別相應於SEQ ID NO.20、21和22所示的VHCDRI、VHCDRII和VHCDRIII序列。從以上還可以意識到，對於9D33的VL鏈，如圖11b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區的核苷酸序列分別相應於SEQ ID NO.35、36和37所示的VLCDRI、VLCDRII和VLCDRIII序列；圖12b所示的CDRI、CDRII和CDRIII區的胺基酸序列分別相應於SEQ ID NO.25、26和27所示的VLCDRI、VLCDRII和VLCDRIII序列。
本發明還提供了一種方法，該方法提供基本上如前所述的TSH受體的人單克隆抗體，該方法包括(i)由受試者提供淋巴細胞源，關於對TSH結合到TSH受體上的抑制，該受試者具有大於約0.04個NIBSC 90/672單位/mL血清的TSH受體抗體活性；(ii)從所述(i)的淋巴細胞源分離淋巴細胞；(iii)無限增殖所分離的淋巴細胞；和(iv)克隆該無限增殖的淋巴細胞，從而產生無限增殖化克隆，該無限增殖化克隆分泌基本上如前所述的TSH受體的人單克隆抗體。
可選地，可將提供基本上如前所述的TSH受體的人單克隆抗體的方法定義為包括以下步驟的方法(i)由受試者提供淋巴細胞源，關於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，該受試者具有大於約0.1個NIBSC 90/672單位/mL血清的TSH受體抗體活性；(ii)從所述(i)的淋巴細胞源分離淋巴細胞；(iii)無限增殖所分離的淋巴細胞；和(iv)克隆該無限增殖的淋巴細胞，從而產生無限增殖化克隆，該無限增殖化克隆分泌基本上如前所述的TSH受體的人單克隆抗體。
優選根據本發明的方法包括從外周血、甲狀腺組織、脾臟組織、淋巴結或骨髓，最典型地是從外周血分離淋巴細胞。典型地，用於根據本發明的方法的淋巴細胞源可以進一步地表徵為其得自這樣的受試者，該受試者的血清TSH受體抗體水平關於TSH結合到TSH受體上的抑制，為高於約0.1個NIBSC 90/672單位/mL；或更典型地關於TSH結合到TSH受體上的抑制，為高於約0.2個NIBSC 90/672單位/mL；或關於TSH結合到TSH受體上的抑制，更典型地為高於約0.3個NIBSC 90/672單位/mL；優選關於TSH結合到TSH受體上的抑制，處於約0.3～0.5個NIBSC90/672單位/mL的範圍或更大。可選地或此外，用於根據本發明的方法的淋巴細胞源可以典型地進一步地表徵為其得自這樣的受試者，該受試者的血清TSH受體抗體水平關於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，為高於約0.2個NIBSC 90/672單位/mL；或更典型地關於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，為高於約0.5個NIBSC90/672單位/mL；優選關於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，處於約0.5～1.0個NIBSC 90/672單位/mL的範圍或更大。從上述可意識到，從其中分離淋巴細胞的受試者的對TSH受體的免疫反應優選應處於高活性階段。
優選根據本發明的方法包括用EB病毒感染所分離的淋巴細胞，和適當地將這樣無限增殖化的淋巴細胞與鼠/人細胞系融合。適當地，根據本發明的方法還包括例如在分析系統中通過對125ITSH結合到TSH受體上的抑制，篩選所得到的TSH受體抗體克隆，該系統具有至少約1個NIBSC 90/672單位/L的靈敏度。
本發明還提供了製備TSH受體的人重組抗體或其一個或多個片段的方法，該方法包括通過基本上如前所述的方法克隆和表達如本發明提供的TSH受體的人單克隆抗體，或由其衍生的一個或多個片段。
本發明還提供了獲自基本上如前所述的方法的TSH受體的人單克隆或重組抗體。優選這樣獲得的本發明的TSH受體的人單克隆或重組抗體，可用對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性來表徵，所述抑制活性至少為約15個國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約30個國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約60個國際標準NIBSC90/672單位/mg，或更優選至少為約120個國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或這樣的人單克隆或重組抗體的一個或多個片段。
更特別地，優選根據本發明的這樣的人單克隆或重組抗體，可用對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性來進一步表徵，所述刺激活性至少為約30個國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約60個國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約120個國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或更優選至少為約240個國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或這樣的人單克隆或重組抗體的一個或多個片段。
在本發明的一個優選實施例中，根據本發明的這樣的人單克隆或重組抗體，可以通過以下來表徵(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為約15個國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約30個國際標準NIBSC90/672單位/mg，更優選至少為約60國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或更優選至少為約120國際標準NIBSC 90/672單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為約30國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約60國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約120國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或更優選至少為約240國際標準NIBSC 90/672單位/mg；或這樣的人單克隆或重組抗體的一個或多個片段。
還優選本發明的這樣獲得的人單克隆或重組抗體的一個或多個片段，尤其例如其一個或多個Fab片段，可以用對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性來表徵，所述抑制活性至少為約30國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約60國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約120國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或更優選至少為約240國際標準NIBSC 90/672單位/mg。還優選這樣的一個或多個片段可用對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性表徵，所述刺激活性至少為約50國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或更優選至少為約100國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為200單位國際標準NIBSC90/672約/mg，或更優選至少為約400國際標準NIBSC 90/672單位/mg。
更優選，這樣的一個或多個Fab片段可由以下來表徵(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為約30國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約60國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約120國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或更優選至少為約240國際標準NIBSC 90/672單位/mg；和
(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為約50國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或更優選至少為約100國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約200國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或更優選至少為約400國際標準NIBSC 90/672單位/mg。
基本上如前所述的方法可以進一步包括另外的步驟，藉此可將所獲得的人單克隆或重組抗體經由合適的進一步的操作技術(如適當的誘變技術，例如點突變或類似技術)，來進一步獲得TSH受體的另外的結合偶聯物，所述偶聯物能與基本上如文中所述的結合配偶體(例如hMAbTSHR 1)競爭性地與TSH受體發生相互作用。這樣的進一步的操作技術是本領域的普通技術人員所熟知的。本發明進一步提供了通過這樣的進一步操作技術所獲得的TSH受體的另外的結合配偶體。
優選這樣的另外的TSH受體的結合配偶體可以包含單克隆或重組抗體，且可用對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性來表徵，所述抑制活性至少為約15國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約30國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約60國際標準NIBSC90/672單位/mg，或更優選至少為約120國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或其一個或多個片段。也還可以優選本發明的這樣的另外的結合配偶體可用對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性來表徵，所述刺激活性至少為約30國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約60國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約120國際標準NIBSC90/672單位/mg，或更優選至少為約240國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或其一個或多個片段。
還更優選本發明的這樣的另外的結合配偶體，可通過以下來表徵(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為約15國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約30國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約60國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或更優選至少為約120國際標準NIBSC 90/672單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為約30國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約60國際標準NIBSC 90/672單位/mg，更優選至少為約120國際標準NIBSC 90/672單位/mg，或甚至更優選至少為約240國際標準NIBSC 90/672單位/mg；或其一個或多個片段。
根據本發明的TSH受體的結合配偶體(典型的是人單克隆或重組抗體)可以用於診斷或治療。
相應地，根據本發明的TSH受體的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)可被應用於篩選方法中來檢測患者血清中的TSH受體的自身抗體，也可被應用於診斷方法中。這樣，根據本發明的TSH受體的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)可被用於替代或補充至今所描述的競爭劑以用於篩選方法中來檢測TSH受體的自身抗體，也可被用於診斷方法中。相似地，根據本發明的TSH受體的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)可被用於替代或補充至今所描述的競爭劑以用於試劑盒中來用以檢測TSH受體的自身抗體。
因此，本發明還提供了一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述結合配偶體或另外的結合配偶體相互作用；(c)將所述樣品與所述一對或多對結合分子接觸，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)TSH受體的的所述結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)；和(d)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發明的用於檢測上述自身抗體的方法在靈敏性水平上尤其有利，所述靈敏性水平可以通過使用該方法來實現。這可以參考實施例和附圖得以進一步說明，其中附圖3a表示基於hMAb TSHR1-生物素的TSH自身抗體的檢測與以前的檢測之間的比較曲線圖。根據國際標準NIBSC90/672的可檢測濃度，基於hMAb TSHR1-生物素的檢測的靈敏度明顯優異。這在對72個突眼性甲狀腺腫患者血清的研究中被確認，如圖3b所示。
因此，本發明還進一步提供了在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述結合配偶體或另外的結合配偶體相互作用；其中所述結合分子的相互作用為所述樣品中的自身抗體滴度基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L。
(c)將所述樣品與所述一對或多對結合分子接觸，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)本發明的TSH受體的所述結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)；和(d)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
上述靈敏度還可以根據本發明檢測方法或試劑盒獲得，所述檢測方法和試劑盒使用TSH受體的人或非人多克隆抗體、TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段，或對TSH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結合配偶體，這些通常顯示出對TSH受體足夠的親和力以便提供規定的靈敏度的方法或試劑盒。這樣的多克隆抗體、TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段在本領域中已熟知。例如，TSH的超活性類似物在自然(Nature)，生物技術(Biotechnology)，第14卷，1995年10月，第1257～1263頁有描述，儘管該文章沒有像本發明現在所提供的一樣披露這樣的超活性TSH在方法或試劑盒中的用途。
因此，本發明還進一步提供了在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含TSH受體的人或非人多克隆抗體，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述多克隆抗體相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測到的自身抗體的滴度基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L；(c)將所述樣品與所述一對或多對結合分子接觸，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述多克隆抗體；和(d)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發明還進一步提供了在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測到的自身抗體的滴度基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L；(c)將所述樣品與所述一對或多對結合分子接觸，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段；和(d)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發明還進一步提供了在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含對TSH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結合配偶體，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述結合配偶體相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測到的自身抗體的滴度基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L；(c)將所述樣品與所述一對或多對結合分子接觸，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述TSH的結合配偶體；和(d)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發明還提供了根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的用途，以用於在獲自受試者的體液樣品中檢測TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，其中所述結合配偶體或另外的結合配偶體與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中可檢測到的自身抗體的滴度基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L。
本發明還提供了TSH受體的人或非人多克隆抗體的用途，以用於在獲自受試者的體液樣品中檢測TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，其中所述多克隆抗體與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中可檢測到的自身抗體的滴度基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L。
本發明還提供了TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段的用途，以用於在獲自受試者的體液樣品中檢測TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，其中所述TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中可檢測到的自身抗體的滴度基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L。
本發明還更提供了對TSH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結合配偶體的用途，以用於在獲自受試者的體液樣品中檢測TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，其中所述結合配偶體與TSH受體間相互作用是使在所述樣品中可檢測到的自身抗體的滴度基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L。
可以意識到，一個或多個結合對的結合分子可以是抗原-抗體(例如，[TSH受體或表位]-[單克隆或重組TSH受體抗體])、抗獨特型抗體-單克隆或重組TSH受體抗體、或新TSH受體抗體結合成員-單克隆或重組TSH受體抗體。優選該結合對的結合分子是抗原-抗體，也就是，[TSH受體或其一個或多個表位]-[單克隆或重組TSH受體抗體]，其中表位可以是「獨立式」或存在於大量的支架多肽或其類似物中。
優選地，本發明提供一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來自所述受試者的所述體液樣品；(b)將所述樣品與以下接觸(i)全長TSH受體，或其一個或多個表位，或含有一個或多個TSH受體表位的多肽，和(ii)根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述接觸在允許TSH受體與針對TSH受體進行應答而產生的自身抗體相互作用的條件下，以允許所述TSH受體或其所述一個或多個表位或所述多肽，與存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體或所述TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)相互作用；和
(c)監測所述TSH受體，或其所述一個或多個表位或所述多肽與存在於所述樣品中的所述的自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
在一些實施方案中，根據本發明的方法也可以使用一種或多種競爭劑，該競爭劑與以下兩類物質之間的相互作用發生競爭，其中一類物質為多克隆抗體、TSH或其一種或多種變異體、類似物、衍生物或片段、或如本發明提供的具體方法實施方案中基本上如上所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體；另一類物質為結合對的第二分子、或TSH受體、或其一個或多個表位或該多肽。這樣的競爭劑可以包含TSH、或與該TSH受體反應的一個或多個單克隆，例如與TSH受體反應的鼠單克隆。
優選地，上面提及的根據本發明的方法，進一步包括為根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是單克隆或重組抗體)和上述適當的一種或多種競爭劑提供標記方法，合適的標記方法包括酶標記、同位素標記、化學發光標記、螢光標記、染色或類似方法。
本發明還提供了一種試劑盒，以用於在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述結合配偶體或另外的結合配偶體相互作用；(b)用於將來自所述受試者的所述體液樣品與所述一對或多對結合分子接觸的單元，從而允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)TSH受體的所述結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)；和(c)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發明還提供了一種試劑盒，以用於在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述結合配偶體或另外的結合配偶體相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測到的自身抗體的滴度基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L；(b)用於將來自所述受試者的所述體液樣品與所述一對或多對結合分子接觸的單元，從而允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)根據本發明的所述TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)；和(c)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發明還提供了一種試劑盒，以用於在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含TSH受體的人或非人多克隆抗體，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述多克隆抗體相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測到的自身抗體的滴度基本上相當於國際標準NIBSC90/672的0.4U/L；(b)用於將來自所述受試者的所述體液樣品與所述一對或多對結合分子接觸的單元，從而允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述多克隆抗體；和(c)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發明還提供了一種試劑盒，以用於在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含TSH或其一種或多種變異體、類似物、衍生物或片段，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測到的自身抗體的滴度基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L；(b)用於將來自所述受試者的所述體液樣品與所述一對或多對結合分子接觸的單元，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段；和(c)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
本發明還提供了一種試劑盒，以用於在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含對TSH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結合配偶體，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述結合配偶體相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中可檢測到的自身抗體的滴度基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L；(b)用於將來自所述受試者的所述體液樣品與所述一對或多對結合分子接觸的單元，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述TSH受體的結合配偶體；和(c)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
可意識到，一個或多個結合對的結合分子可以是抗原-抗體(例如，[TSH受體或表位]-[單克隆或重組TSH受體抗體])，抗獨特型抗體-單克隆或重組TSH受體抗體，或新TSH受體抗體結合成員-單克隆或重組TSH受體抗體。優選該結合對的結合分子是抗原-抗體，也就是，[TSH受體或其一個或多個表位]-[單克隆或重組TSH受體抗體]，其中表位可以是「獨立式」或存在於大量的支架多肽或其類似物中。
本發明優選提供一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與對於TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)全長TSH受體，或其一個或多個表位，或含有一個或多個TSH受體表位的多肽；(b)根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地人單克隆或重組抗體)；(c)用於將來自所述受試者的所述體液樣品、所述TSH受體或所述其一個或多個表位或所述多肽，與所述TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)接觸的單元，所述接觸在允許TSH受體與針對TSH受體的應答而產生的自身抗體相互作用的條件下，以允許所述TSH受體或其所述一個或多個表位或所述多肽，與存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或TSH受體的所述結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的相互作用；和(d)監測所述TSH受體或其所述一個或多個表位或所述多肽與存在於所述樣品中的所述的自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
在一些實施方案中，根據本發明的試劑盒可以進一步包含一種或多種競爭劑，該競爭劑在兩類物質的相互作用發生競爭，所述一類物質為分別如上所述的多克隆抗體、TSH或其一種或多種突變體、類似物、衍生物或片段、或TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，另一類物質為結合對的第二分子、或TSH受體、或其一個或多個表位或該多肽。這樣的競爭劑可以包含TSH，或與TSH受體反應的一個或多個單克隆，例如與TSH受體反應的鼠單克隆。
適當地，上面提及的根據本發明的試劑盒還包含根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的標記單元，其中合適的一種或多種競爭劑如上所述，恰當的標記方法基本上如前所述。
在存在TSH受體的自身抗體的情形下，在如前述的一種方法或試劑盒中，TSH受體與TSH受體的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的結合將會降低。
根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)還可以被用於基本上如前所述的關於TSH和相關配基的檢測方法和試劑盒中。
因此，本發明還提供了一種檢測TSH和相關配基的方法，所述方法包括(a)提供被懷疑含有或含有TSH或相關配基的樣品；(b)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子含有根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述結合對的第二分子含有結合區，該結合區與所述結合配偶體或另外的結合配偶體相互作用；(c)將所述樣品與所述一對或多對結合分子接觸，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH或相關配基，或(ii)所述TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)；和(d)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的TSH或相關配基的相互作用，從而提供在所述樣品中存在TSH或相關配基的指示。
本發明還提供了一種用於測定TSH或相關配基的試劑盒，所述試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子含有根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)，所述結合對的第二分子含有結合區，該結合區與所述結合配偶體或另外的結合配偶體相互作用；(b)用於將被懷疑含有或含有TSH或相關配基的樣品與所述一對或多對結合分子接觸的單元，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH或相關配基，或(ii)所述TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)；和(c)檢測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的TSH或相關配基的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在TSH或相關配基的指示。
本發明還進一步提供了一種鑑定TSH受體的另外的結合配偶體的方法，該TSH受體的另外的結合配偶體能結合到TSH受體上並與基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體競爭性地結合到TSH受體上，該另外的結合配偶體不包含TSH，該方法包括(a)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子含有基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體，所述結合對的第二分子含有結合區，該結合區與所述結合配偶體相互作用；(b)提供待測定的另外的結合分子，該結合分子作為TSH受體的潛在的另外的結合配偶體，所述結合分子與(a)的所述結合對的第一分子競爭性地結合到TSH受體上；(c)將(b)的所述另外的結合分子與(a)的所述的一對或多對結合分子接觸，從而允許(a)的所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)(b)的所述另外的結合分子，或(ii)(a)的所述結合對的所述第一分子；和(d)監測(a)的所述結合對的所述第二分子與(b)的所述另外的結合分子的相互作用，從而評估(b)的所述另外的結合分子是否與(a)的所述結合對的所述第一分子競爭性結合到TSH受體上。
本發明還提供一種鑑定TSH受體的另外的結合配偶體的試劑盒，該另外的結合配偶體能結合到TSH受體上並與基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體競爭性地結合到TSH受體上，該另外的結合配偶體不包含TSH，該試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子含有基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體，所述結合對的第二分子含有結合區，該結合區與所述結合配偶體相互作用；(b)用於將(a)的所述一對或多對結合分子與待測定的另外的結合分子接觸的單元，所述另外的結合分子用作TSH受體的潛在的另外的結合配偶體，其與(a)的所述結合對的所述第一分子競爭性地結合到TSH受體上，以允許(a)的所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)所述的另外的結合分子，或(ii)(a)的所述結合對的所述第一分子；和(c)監測(a)的所述結合對的所述第二分子與所述另外的結合分子的相互作用的單元，從而評估所述另外的結合分子是否與(a)的所述結合對的所述第一分子競爭性地結合到TSH受體上。
根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的進一步的應用是用於鑑定和提供新類型的TSH受體的抗體結合位點。因此，本發明還進一步提供了一種鑑定TSH受體的一個或多個表位區的方法，該方法包括將基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)與全長TSH受體或其一個或多個片段接觸，以使所述TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體與所述全長TSH受體或所述其一個或多個片段相互作用，並鑑定與所述結合配偶體或另外的結合配偶體相互作用的所述全長TSH受體或所述其一個或多個片段的胺基酸。適當地，對結合配偶體或另外的結合配偶體與TSH受體的選擇片段和全長TSH受體之間的相互作用進行分析，以鑑定與結合配偶體相互作用的TSH受體的胺基酸。
此外，本發明允許針對本發明的單克隆TSH受體抗體的結合TSH受體區域的抗體的產生。以這種方式產生的這樣的抗獨特型抗體可作為潛在的新配基用於測定TSH受體自身抗體、TSH和相關化合物。同樣它們也可以是有效的用於調節TSH受體自身抗體、TSH和相關化合物的作用的體內試劑。因此，本發明還進一步提供了針對基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的結合區而產生的一種或多種抗獨特型抗體，其製備方法在實施例中進行進一步的描述。
其它用單克隆抗體來鑑定和提供新類型的抗體結合位點的方法是已知的。例如，採用如下述文獻所描述的噬菌體展示的隨機肽文庫的抗體篩選，JC Scott和GP Smith「用表位文庫尋找肽配基」，Science，1990，249(4967)386～390和MA Myers，JM Davies，JC Tong，J Whisstock，M Scealy，IR MacKay，MJ Rowley，「通過肽噬菌體展示和分子模建鑑定的糖尿病自身抗原GAD65上的構象性表位」(Conformational epitopes onthe diabetes autoantigen GAD65identified by peptide phage display andmolecular modelling)，免疫學雜誌(Journal of Immunology)，2000，1653830～3838。也可進行非肽化合物和非肽化合物文庫的抗體篩選。
用這些方法鑑定和提供的新類型的TSH受體的抗體結合位點還可以在TSH受體自身抗體、TSH和相關化合物的測定中用作有用的新配基。此外，它們還可以是用於調節TSH受體自身抗體、TSH和相關化合物的作用的有效的體內試劑。
基本上如前所述的根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)也被可效地用於治療中。因此，本發明還進一步提供了治療方法，該治療方法包括施用基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)、包含基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的藥物組合物(同時含有一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑)；以及還涉及基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)在製備藥物或組合物中的用途。
TSH受體的結合配偶體，尤其是獲自患者淋巴細胞的根據本發明的TSH受體的人單克隆抗體，對於理解突眼性甲狀腺腫疾病的發病機理和發展測定TSH受體自身抗體的新方法是有價值的試劑，例如基本上如前所述那樣，在競爭性結合實驗中用作TSH的替代物。同樣，當含有TSH受體的組織(例如甲狀腺組織或甲狀腺癌組織)需要刺激時，根據本發明的刺激性結合配偶體具有體內應用價值。因此，本發明提供了一種用於刺激甲狀腺組織和/或含有TSH受體的組織的藥物或組合物。尤其是，根據本發明的TSH受體的刺激性結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)可用於腫瘤學，尤其是用於甲狀腺癌的診斷、控制和治療。
可替換地，根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體可以是有效的TSH或自身抗體的拮抗劑(阻斷性抗體)且當含有TSH受體的組織(例如甲狀腺組織或甲狀腺癌組織)的活性需要失活或需要使其對TSH、TSH受體自身抗體或其他刺激物沒有反應性的時候，根據本發明的這樣的阻斷性TSH受體抗體對體內應用很有價值。
本發明還提供了基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，以及一種或多種另外的試劑的組合，所述另外的試劑使含有TSH受體的組織對TSH、TSH受體自身抗體或其他刺激物失活或不具有反應性。典型地，該一種或多種另外的試劑獨立於TSH受體而發生作用。
一種特別的治療性應用，是在於治療與對TSH受體的自體免疫相關的眼眶後組織(retro orbital tissue of eye)疾病，其中TSH受體自身抗體結合需要失活或抑制，及應用與TSH受體相互作用的阻斷性抗體，例如9D33，來抑制TSH受體自身抗體結合，因而在這類疾病的治療中有著重要治療應用。需要抑制TSH受體自身抗體結合的自體免疫疾病的治療，所述自體免疫疾病例如上面討論的與對TSH受體的自體免疫相關的眼眶後組織疾病，可以選擇性地使用針對如本發明所提供的結合配偶體或另外的結合配偶體的抗獨特型抗體，如這裡所述，所述的這樣的抗獨特型抗體形成本發明的一個重要方面且其進一步的製備細節由實施例提供。
因此，更具體地，本發明提供了TSH受體的另外的結合配偶體在與對TSH受體的自體免疫相關的眼眶後組織疾病的治療中的用途，該另外的結合配偶體基本上抑制基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)結合到TSH受體上。本發明進一步提供了另外的TSH受體的結合配偶體在製備治療與TSH受體的激活和/或刺激相關的眼眶後組織疾病的藥物中的用途，該另外的結合配偶體基本上抑制基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)結合到TSH受體上。還提供了一種治療與對TSH受體的自體免疫相關的眼眶後組織疾病的方法，該方法包括對患有或易感這樣的疾病的患者施用治療有效量的TSH受體的另外的結合配偶體，該另外的結合配偶體基本上抑制基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)結合到TSH受體上。用於本發明的實施方案中的另外的結合配偶體優選含有阻斷性抗體，該阻斷性抗體可基本上抑制本發明所提供的結合配偶體，就像該TSH受體自身抗體結合一樣，結合到TSH受體上，並且優選這樣的抗體可以包含文中所述的9D33。
本發明還提供了針對本發明的結合配偶體和另外的結合配偶體的結合區而產生的抗獨特型抗體在與對TSH受體的自體免疫相關的眼眶後組織疾病的治療中的用途。本發明還進一步提供了針對本發明的結合配偶體和另外的結合配偶體的結合區而產生的抗獨特型抗體在製備治療與TSH受體的激活和/或刺激相關的眼眶後組織疾病的藥物中的用途。還提供了一種治療與對TSH受體的自體免疫相關的眼眶後組織疾病的方法，該方法包括對患有或易感這樣的疾病的患者施用治療有效量的抗獨特型抗體，該抗獨特型抗體是針對本發明的結合配偶體和另外的結合配偶體的結合區而產生的。
如本發明所提供的單克隆抗體相對於TSH在所述體外和/或體內應用中的一個主要優勢是這樣的抗體可以被相對容易地操縱。例如對根據本發明的單克隆抗體的TSH受體結合區進行操縱，來改變其特性，例如親和力和生物學特性，包括TSH激動劑或拮抗劑的活性程度。此外，根據本發明的單克隆抗體相對於TSH在體內具有長得多的半衰期，這將在體內應用中具有相當大的優勢。另外，抗體的半衰期能夠被操縱，例如抗體Fab片段相對於完整IgG具有短得多的半衰期。
根據本發明的藥物組合物包括那些適於口服、非腸道注射和局部施用的藥物組合物，儘管最佳的途逕取決於患者的狀況和正在治療的具體疾病。待施用給患者的基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)的精確施用量將由主治醫生來決定，儘管使用的劑量將取決於很多的因素，包括患者的年齡和性別、正在治療的具體病情和基本上如前所述的給藥途徑。
本發明還進一步提供了一種刺激甲狀腺組織，和/或含有TSH受體的組織的方法，該方法包括對需要這種刺激的患者施用診斷有效量或治療有效量的基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)。
本發明還同時提供了基本上如前所述的TSH受體的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)與一種或多種另外試劑的組合以同時、獨立、或順序使用以用於刺激甲狀腺組織和/或含有TSH受體的組織，所述另外的試劑能刺激甲狀腺組織，和/或含有TSH受體的組織。優選這樣的一種或多種另外的試劑包含重組人TSH和/或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段，或該片段的變異體、類似物或衍生物。可選地，這樣的一種或多種另外的試劑可以獨立地結合到TSH受體上。
根據本發明的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)也可以被用作需要含有TSH受體抗體的患者血清的替代源，來用於商業性試劑盒中。此外，TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體(典型地是人單克隆或重組抗體)也可以根據本發明被提供在需要含有規定濃度的TSH受體的一種或多種抗體的製備物中，以這種方式，可以提供具有規定活性例如對TSH受體的刺激活性的製備物。任選地，這樣的製備物還可以進一步含有一種或多種另外的人單克隆抗體，例如對GAD、TPO等的單克隆抗體。
提供以下示例性解釋用以幫助理解文中所用的某些術語。提供這些解釋是為了方便，不是對本發明的限制。
TSH受體的結合配偶體，描述的是一種具有對TSH受體的結合特異性的分子。文中所說的結合配偶體可以天然來源的，或全部或部分合成產生的。這樣的結合配偶體具有結構域或區，它特異性地結合到TSH受體的一個或多個表位區，並因此與其互補。尤其是，文中所述的結合配偶體可以是TSH受體的單克隆或重組抗體，更具體地，可以是TSH受體的人單克隆或重組抗體。
C區，表示在抗體分子中胺基酸序列相對恆定的區域。
CDR，表示互補決定區，其同時存在於抗體分子的重鏈和輕鏈上並代表序列變異性最大的區域。CDR代表可變區的約15％～20％並代表抗體的抗原結合位點。
FR，表示閱讀框區域，並代表不存在於CDR中的其它輕鏈可變區和重鏈可變區。
HC，表示抗體分子的部分重鏈，該部分重鏈含有重鏈可變區和IgG恆定區的第一區。
宿主細胞，是指已被外源多核苷酸序列轉化或轉染或能被其轉化或轉染的細胞。
同一性，如本領域所已知，通過對序列進行比較所決定兩個或多個多肽序列之間，或兩個或多個多核苷酸序列之間的關係。
LC，表示抗體分子的輕鏈序列。
NIBSC 90/672，是針對甲狀腺刺激抗體的一個國際標準。該針對甲狀腺刺激活性抗體的國際標準由包含來自單個病人的一批凍乾血漿蛋白質的安瓿組成，所述患者具有高水平的TSH受體自身抗體。已經在國際合作研究中評估了該製備物，並顯示出其同時擁有甲狀腺刺激活性和甲狀腺受體結合活性。在1995年的第46界會議中，WHO(世界衛生組織)的生物學標準專家委員會確定代碼為90/672的製備物作為甲狀腺刺激抗體的國際標準。每安瓿包含含有0.02M磷酸鹽緩衝液和透析的人血漿蛋白質的1.0ml溶液的凍幹殘餘物，根據定義每安瓿為0.1個國際單位(100/1000國際單位)。
文中所述用人單克隆抗體「刺激TSH受體」，是指它能結合到TSH受體上的能力及因此發揮作用的能力，例如作為上述結合到TSH受體上的結果而產生環狀AMP。這樣的刺激與所見到的TSH或TSH受體自身抗體結合到TSH受體上的反應是類似的，並且以這種方式，文中所述人單克隆抗體基本上提供與所見到的TSH或TSH受體自身抗體結合到TSH受體上的相同或相似的結合反應。
V區，表示抗體分子中胺基酸序列的高度可變的區域。
VH區，表示抗體分子重鏈中的可變區或結構域。
VL區，表示抗體分子輕鏈中的可變區或結構域。
具體實施例方式
現在將通過以下附圖和實施例來說明本發明，但這不以任何方式限制本發明的範圍。
實施例材料與方法淋巴細胞的分離和人單克隆TSH受體自身抗體的克隆血液獲自突眼性甲狀腺腫病和I型糖尿病患者，所述患者具有高水平的TSH受體的血清自身抗體(TRAb)。該研究已經獲得倫理委員會的同意。在Ficoll-Paque(Amersham Biosciences，chalfont St Giles，HP8 4SP，UK)上從20mL血樣中分離外周血淋巴細胞，然後用EB病毒(EBV)(歐洲細胞培養物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)-ECACC；Porton Down，SP4 0JG，UK)感染，並如以前描述的那樣，在鼠巨噬細胞飼養層上培養(N Hayakawa、LDKE Premawardhana、MPowell、M Masuda、C Arnold、J Sanders、M Evans、S Chen、JC Jaume、S Baekkeskov、B Rees Smith、J Furmaniak；「穀氨酸脫羧酶的人單克隆抗體的分離和表徵(Isolation and characterization of human monoclonalautoantibodies to glutamic acid decarboxylase)」；自體免疫(Autoimmunity)2002；35343～355)。隨後將由EBV無限增殖的B淋巴細胞與鼠/人雜交細胞系K6H6/B5融合(WL Carroll，K Thilemans，J Dilley，R Levy；「鼠人異種雜交瘤作為融合配偶體與人B細胞瘤融合(Mouse×humanheterohybridomas as fusion partners with human B cell tumors)」；免疫學方法雜誌(Journal of Immunological Methods)1986；8961～72)，並以5個細胞/孔有限稀釋進行克隆兩次，最後以0.5個細胞/孔有限稀釋克隆一次，以獲得單克隆(BJ Bolton，NK Spurr.「B淋巴細胞(B-lymphocytes)」，RI Freshney，MG Freshney(編輯)；無限增殖細胞的培養(Culture of immortalized cells)，Wiley-Liss，New York 1996；283～297)。原始細胞及隨後的克隆通過對125I-TSH結合到溶液化的TSH受體上的抑制來篩選TSH受體自身抗體(參見下文)。生產TSH受體自身抗體的單克隆在組織培養瓶中生長。
單克隆TSH受體抗體製備物的生產、純化和標記鼠TSH受體MAb如以前所述進行生產(Y Oda、J Sanders、M Evans、A Kiddie、A Munkley、C James、T Richards、J Wills、J Furmaniak、B ReesSmith；「用單克隆抗體對人促甲狀腺素受體進行表位分析(Epitopeanalysis of the human thyrotropin(TSH)receptor using monoclonalantibodies)」；甲狀腺(Thyroid)2000；101051～1059)，也可以用克隆到pcDNA3.1中的全長TSHR cDNA來免疫鼠而製備(UA Hasan、AMAbai、DR Harper、BW Wren、WJW Morrow；「核酸免疫與第三代疫苗相關的概念和技術(Nucleic acid immunizationConcepts and techniquesassociated with third generation vaccines)」免疫學方法雜誌(Journal ofImmunological Methods)1999；2291～22)。
將IgG在Prosep A(Millipore UK Ltd.；Watford，WD18 8YH，UK)上，依照生產商的使用說明用親和層析法從組織培養物上清液中純化出來，並用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)測定其純度。
人重鏈同種型用徑向擴散法確定(The Binding Site，Birmingham，B29 6AT，UK)。人輕鏈同種型通過用抗人kappa(κ)鏈和抗人lambda(λ)鏈特異性鼠單克隆抗體(Sigma-Aldrich有限公司；Gillingham，SP84XT，UK)進行蛋白質印跡來確認。
經純化的IgG製備物用汞合木瓜蛋白酶(Sigma-Aldrich)處理，酶/蛋白質比例界於1∶10到1∶100之間(取決於特定的單克隆抗體)，並通過Prosep A柱以從Fab製備物中除去任何完整的IgG或Fc片段(Y Oda、J Sanders、S Roberts、M Maruyama、R Kato、M Perez、VB Petersen、NWedlock、J Furmaniak、B Rees Smith；「TSH受體抗體的結合特性(Bindingcharacteristics of antibodies to the TSH receptor)」，分子內分泌學雜誌(Journal of Molecular Endocrinology)1998；20233～244)。完整的IgG在Fab製備物中用SDS-PAGE是不可檢測的。單克隆抗體的IgG和Fab製備物如以前所述用125I標記(Y Oda、J Sanders、S Roberts、M Maruyama、R Kato、M Perez、VB Petersen、N Wedlock、J Furmaniak、B Rees Smith；「TSH受體抗體的結合特性」，分子內分泌學雜誌1998；20233～244)。根據生產商的使用說明，IgG製備物用生物素醯肼(Pierce RockfordIL61105 USA)進行標記。獲得人單克隆TSH受體自身抗體的Fab片段的晶體，且採用標準技術確定它們的晶體結構。
患者對來自突眼性甲狀腺腫患者不同疾病時期的血清進行了研究。所研究的患者血清顯示出對125I標記的TSH結合到TSH受體上的抑制(參見下文)。此外，研究了來自兩名阿狄森氏病患者的血清(A1和A2)，所述患者具有高水平21-OH的自身抗體(113和1970個單位/mL，RSR試劑盒)；和來自兩名1型糖尿病患者的血清(D1和D2)，所述患者具有高水平的GAD65(3700和37.5單位/mL，RSR試劑盒)。該研究得到了患者的同意。還研究了來自健康獻血者的血清(購自Golden WestBiologicals，Vista，CA 92083，USA)。TRAb第一國際標準製備物(90/672)獲自國家生物標準與控制學會(National Institute for Biological Standardsand Control，NIBSC；Potters Bar，EN6 3QH，UK)。
對125I-TSH和125I-鼠TSHR MAb結合到TSH受體上的抑制如以前所述，用TSH受體包被的試管進行結合抑制實驗(J Sanders、Y Oda、S Roberts、A Kiddie、T Richards、J Bolton、V McGrath、S Walters、D Jaskolski、J Furmaniak、B Rees Smith；TSH受體自身抗體與125I標記的TSH受體間的相互作用(The interaction of TSH receptor autoantibodieswith125I-labeled TSH receptor)；Journal of Clinical Endocrinology andMetabolism(臨床內分泌學和代謝雜誌)1999；843797～3802)(試劑來自RSR Ltd.)。簡而言之，將100μL樣品(組織培養物上清液、經純化的IgG或Fab片段、患者血清或NIBSC 90/672標準)在TSH受體包被的試管中，於室溫下輕搖孵育兩小時。抽吸後，將試管用1mL測定緩衝液(50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl PH7.8、0.1％ Triton X-100)洗滌兩次，然後添加100μL的125I-TSH或125I-MAb(5×104cpm)，並於室溫下振蕩孵育1小時。然後將試管用1mL測定緩衝液洗滌兩次，抽吸並在gamma(γ)計數器中計數。
結合的抑制通過下式計算 所用對照物質是培養基、健康鮮血者血清池或其它指出的物質。
甲狀腺刺激活性的分析單克隆自身抗體製備物和患者血清對表達hTSH受體的CHO細胞(大約50,000個受體/每個細胞)中環腺苷酸(或cAMP)產生的刺激能力(Y Oda、J Sanders、S Roberts、M Maruyama、R Kato、M Perez、VBPetersen、N Wedlock、J Furmaniak、B Rees Smith；「TSH受體抗體的結合特性」，分子內分泌學雜誌1998；20233～244)，根據文獻「R Latif，P Graves，TF Davies，人促甲狀腺素受體的寡聚化作用(Oligomerizationof the human thyrotropin receptor)，生物化學雜誌(Journal of BiologicalChemistry)2001；27645217～45224」中所述的方法實施。簡而言之，將CHO細胞接種到96孔板中(30,000細胞/孔)，並在含10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen Ltd；Paisley PA4 9RF，UK)中孵育24小時。隨後將培養物在不含有胎牛血清的DMEM中繼續孵育24小時。然後移走DMEM，加入待測TSH、IgG、Fab和血清(100μL稀釋在不含NaCl的含1g/L葡萄糖、20mmol/L Hepes、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤pH7.4的Hank’s緩衝鹽溶液中)並在37℃孵育1小時。移走待測溶劑後，將細胞溶解並用Biotrak酶免疫測定系統(Amersham Bioscience；Chalfont St Giles，HP84SP，UK)測定環腺苷酸。在一些實驗中，測定患者血清和TSHR的鼠單克隆抗體對TSH或hMAb TSHR1的刺激活性的抑制能力。這通過將(a)TSH或hMAb TSHR1獨自的刺激效應與(b)在患者血清或鼠單克隆抗體存在下的TSH或hMAb TSHR1的刺激效應進行比較來完成。
可變區基因分析總RNA是由產生克隆的TSH受體自身抗體的1×107個細胞，用酸性苯酚胍法(P Chomczynski，N Sacchi；「採用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取的RNA分離的一步法(Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)」；AnalyticalBiochemistry(分析生物化學)1987；162156～159)製備；用寡脫氧胸苷酸(dT)磁珠製備mRNA(Dynal Biotech Ltd.；Wirral，CH62 3QL，UK)。用來自Invitrogen Ltd.；Paisley PA4 9RF，UK的試劑進行RT-PCR反應(反轉錄—聚合酶鏈式反應)。
用醫學研究委員會的V-base資料庫(www.mrccpe.cam.ac.uk)推薦的序列設計正義鏈寡核苷酸引物。對人IgG1重鏈和lambda輕鏈具有特異性的反義引物是基於編碼DNA序列的恆定區。正義引物和反義引物兩者都包括額外的5』限制性內切酶位點序列來促進PCR產物的克隆。IgG1重鏈和lambda輕鏈用成套的合適引物進行RT-PCR發應。所有的引物都由Invitrogen Ltd.合成。RT反應在50℃進行10分鐘，隨後馬上進行40個循環的PCR(15秒94℃，30秒55℃，30秒72℃)。將RT-PCR產物克隆到pUC18和用Promega UK Ltd.；Southampton SO16 7NS，UK的Wizard試劑盒製備的DNA中，通過Sanger-Coulson法(F Sanger、SNicklen、AR Coulsen；「用鏈終止抑制劑進行DNA測序(DNA sequencingwith chain terminating inhibiors)」，美國國家科學研究院年報(Preceedingsof the National Academy of sciences of the USA，1977；745463～5467)進行測序。用Ig blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi)將V區序列與人Ig基因的可得到序列進行比較。
免疫沉澱測定(IPA)將編碼全長TSH受體的cDNA置於pYES2(Invitrogen)中T7啟動子的下遊，並用於體外TnT系統(Promega UK Ltd.)中以生產如前所述的用35S-甲硫氨酸標記的TSH受體(L Prentice、J Sanders、M Perez、RKato、J Sawicka、Y Oda、D Jaskolski、J Furmaniak、B Rees Smith；「促甲狀腺素(TSH)自身抗體不顯示出結合到在體外轉錄/翻譯系統中產生的TSH受體上(Thyrotropin(TSH)receptor autoantibodies do not appear tobind to the TSH receptor produced in an in vitro transcription/translationsystem)」；臨床內分泌學和代謝雜誌(Journal of Clinical Endocrinology andMetabolism)1997；821288～1292)。簡而言之，加入稀釋在HSB(150mmol/L Tris-HCL pH8.3，200mmol/L NaCl和10mg/ml含有1％Tween 20的牛血清白蛋白)中的50μL的35S標記的TSH受體(25,000～30,000cpm)以使50μL的等份的經稀釋待測樣品加倍，並在室溫孵育2小時。然後免疫複合物通過添加蛋白A瓊脂糖(Sigma-Aldtich)而沉澱並在閃爍計數器中計數。
TSH受體製備物與蛋白質印跡在CHO-K1細胞中表達全長人TSH受體，將其用1％ Triton X-100提取，如以前所述用TSH受體單克隆抗體親和層析法純化(Y Oda、JSanders、M Evans、A Kiddie、A Munkley、C James、T Richards、J Wills、J Furmaniak、B Rees Smith；「用單克隆抗體對人促甲狀腺素(TSH)受體進行表位分析」；甲狀腺2000；101051～1059)。
將純化的CHO細胞產生的TSH受體在9％SDS-PAGE凝膠上進行電泳，將其印跡雜交到硝酸纖維素上，如以前所述與待測抗體反應(YOda、J Sanders、M Evans、A Kiddie、A Munkley、C James、T Richards、J Wills、J Furmaniak、B Rees Smith；「用單克隆抗體對人促甲狀腺素(TSH)受體進行表位分析」；甲狀腺2000；101051～1059)。
用TSH受體肽進行表位分析各自長度為25個胺基酸的覆蓋了人TSH受體的整個胞外區的26個肽由J Morris博士惠贈(JC Morris、ER Bergert、DJ McCormik，「人促甲狀腺素受體的結構-功能研究，用合成的人TSH受體肽抑制標記的促甲狀腺素(TSH)的結合(Structure-fuction studies of the human thyrotropinreceptor.Inhibition of binding of labeled thyrotropin(TSH)by synthetichuman TSH receptor peptides」；生物化學雜誌1993；26810900～10905)。將結合到M21-OH5Mab(S Chen、J Sawicka、L Prentice、JF Sanders、HTanaka、V Petersen、C Betterle、M Volpato、S Roberts、M Powell、B ReesSmith、J Furmaniak；「用一組單克隆抗體分析類固醇21-羥化酶上的自身抗體表位(Analysis of autoantibody epitopes on steroid 21-hydroxylase usinga panal of monoclonal antibodies)」；臨床內分泌學和代謝雜誌(Journal ofClinical Endocrinology and Metabolism)1998；832977～2986)上的人21-OH肽(C1，SSSRVPYKDRARLPL)用作陽性對照，將GAD65的人單克隆抗體(N Hayakawa、LDKE Premawardhana、M Powell、M Masuda、C Arnold、J Sanders、M Evans、S Chen、JC Jaume、S Baekkeskov、B ReesSmith、J Furmaniak；「穀氨酸脫羧酶的人單克隆抗體的分離和表徵」；自體免疫2002；35343～355)用作陰性對照。如以前所述，進行肽ELISA(Y Oda、J Sanders、M Evans、A Kiddie、A Munkley、C James、T Richards、J Wills、J Furmaniak、B Rees Smith；「用單克隆抗體對人促甲狀腺素(TSH)受體進行表位分析」；甲狀腺2000；101051～1059)。
單克隆TSHR自身抗體製備物與包被到塑料試管上或ELISA板的孔上的TSH受體的相互作用(a)125I標記的自身抗體將包括患者血清的待測樣品(100μl)在TSH受體包被的試管(RSRLtd.)中，於室溫輕搖孵育2小時。抽吸後，將試管用1mL測定緩衝液洗滌兩次，然後加入100μL的已標記的自身抗體製備物(30,000cpm)，並於室溫下振蕩孵育1小時。然後將試管用1mL測定緩衝液洗滌兩次，抽吸並在gamma計數器中計數。對125I標記的自身抗體結合的抑制用對TSH結合的抑制的公式計算(見上)。
(b)生物素標記的單克隆自身抗體和生物素標記的TSH使用以前描述的方法(J Bolton、J Sanders、Y Oda、C Chapman、RKonno、J Furmaniak和B Rees Smith；「通過ELISA測定甲狀腺刺激激素受體自身抗體(Measurement of thyroid-stimulating hormone receptorautoantibodies by ELISA)」；臨床化學(Clinical Chemistry)1999；452285～2287)。簡而言之，在ELISA板振蕩器上，將包括患者血清的待測樣品(75μl)在TSH受體包被的ELISA板的孔(RSR Ltd.)中，振蕩(振蕩200次/每分鐘)孵育2小時。然後移走待測樣品，並用測定緩衝液洗滌所述孔兩次。然後加入生物素標記的單克隆TSH受體自身抗體(100μl中1ng)或生物素標記的豬TSH(RSR Ltd.；100μl中5ng)並將其於室溫下繼續孵育25分鐘但不振蕩。將所述孔洗滌一次，並加入100μl的鏈親和素-過氧化物酶(RSR Ltd.；100μl中10ng)並於室溫下繼續孵育20分鐘但不振蕩。然後，將所述孔洗滌三次，加入過氧化物酶底物四甲基聯苯胺(RSR Ltd.；100μl)。於室溫下不振蕩地孵育30分鐘後，加入50μl的0.5M H2SO4以終止底物的反應，在ELISA平板讀數器上讀取每孔在450nm處的吸光度。對生物素醯化的MAb或TSH結合的抑制用如下計算的指標表示
單克隆自身抗體結合到TSH受體包被的試管的斯卡查德分析將50μl測定緩衝液中的非標記IgG或Fab，和50μl的125I標記的hMAb IgG或Fab(測定緩衝液中30,000cpm)在室溫下輕搖孵育2小時，用1mL的測定緩衝液洗滌兩次，並在gamma計數器中計數。對結合的IgG或Fab的濃度相對於結合的/游離的IgG或Fab的濃度進行製圖(GScatchard；「蛋白質對小分子和離子的吸引(The attraction of proteins forsmall molecules and ions)」，紐約科學研究院年報(Annals of the New YorkAcademy of Sciences)1949；51660～672)以得出締合常數。
TSH受體結合到用單克隆TSH受體自身抗體包被的試管上將包括患者血清的待測樣品(100μl)和去汙劑溶解的TSH受體(20μl)在室溫孵育1小時。然後將50μl(兩等份)的孵育混合物加入塑料試管(Nunc Maxisorp)中，該試管已經用單克隆TSH受體自身抗體Fab所包被(200μl的10μg/mL Fab，4℃過夜，隨後進行洗滌和後包被)。在室溫輕搖孵育1小時後，洗滌試管，加入100μl(40,000cpm)125I標記的TSH受體C末端單克隆抗體4E31(J Sanders、Y Oda、A Kiddie、TRichards、J Bolton、V McGrath、S Walters、D Jaskolski、J Furmaniak、BRees Smith；TSH受體自身抗體與125I標記的TSH受體間的相互作用；臨床內分泌學和代謝雜誌1999；843797～3802)，並繼續再輕搖孵育1小時。然後，洗滌試管並對125I進行計數。
在E Coli(大腸桿菌)中克隆和表達重組hMAb TSHR1 Fab將hMAb TSHR1重鏈的RT-PCR產物(參見可變區基因分析部分)用XhoI和SpeI限制性內切酶進行酶切，將hMAb TSHR1輕鏈的PCR產物用ScaI和XbaI限制性內切酶進行酶切，將重鏈和輕鏈cDNA均克隆到Immunozap H/L載體中(Stratagene Europe；Amsterdam，Netherlands)(I Matthews，G Sims，S Ledwidge，D Stott，D Beeson，N Willcox，AVincent；「患有肌無力的經產婦女中的乙醯膽鹼受體抗體被胎兒抗原免疫的證據(Antibodies to acetylcholine receptor in parous women withmyastheniaevidence for immunization by fetal antigen)」，LaboratoryInvestigation(實驗室研究)2002；821～11)，並位於lacZ啟動子的控制下。將質粒DNA用Qiagen midi質粒純化試劑盒(Qiagen Ltd.；Crawley，RH10 9AX，UK)製備，hMAb TSHR1重鏈和輕鏈cDNA的存在通過Sanger-Coulson法(F Sanger、S Nicklen、AR Coulsen；「用鏈終止抑制劑進行DNA測序」，美國國家科學研究院年報1977；745463～5467)測序進行確認。將質粒DNA轉化到2個不同的E Coli菌株中(a)XL1-BlueMRF』(Stratagene)和(b)HB2151(Amersham Biosciences)，並在LB氨苄青黴素(胰蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，100μg/ml的終濃度氨苄青黴素)瓊脂平板(15g/L瓊脂)上於37℃培養過夜。將預培養物(於3mL的LB氨苄青黴素+1％葡萄糖中的一個菌落)在37℃振蕩過夜培養。在葡萄糖的存在下，重組Fab的產生受到抑制。將過夜孵育後的預培養以1/100(50ml LB氨苄青黴素中0.5mL)稀釋，並於37℃培養直至OD600為0.4～0.6。將這些培養物置於30℃振蕩20分鐘。然後，加入異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)直至終濃度為1mmol/L，將培養物繼續於30℃振蕩孵育過夜(16小時)。然後，將培養物於4℃、3000rpm離心30分鐘，並回收培養物上清液和沉澱。將沉澱通過渦旋而重懸在1mL冰浴TES緩衝液(0.2mol/L Tris-HCl pH8.0，0.5mol/LEDTA和0.5mol/L蔗糖)中。再加入1.5mL在水中稀釋5倍的冰浴TES緩衝液，將混合物再次渦旋並在冰上孵育30分鐘，隨後再次離心以提供第二次上清液或周質成分(PF)。將培養物上清液和PF通過0.45μm的過濾器過濾，並過夜滲析到pH為7.5的10mmol/L Tris和50mmol/L NaCl中。還製備來自以下細胞的上清液和PF未轉化的XL-1 Blue MRF』和HB2151細胞，用培養時含葡萄糖但不含IPTG(即，未誘導的)的hMAbTSHR1質粒轉化的XL1-Blue MRF』(XL-1 Blue MRF』/hMAb TSHR1)和用hMAb TSHR1質粒轉化的HB2151(HB2151/hMAb TSHR1)。對培養物上清液和PF進行以下分析(a)它們抑制TSH結合到TSHR上的能力，(b)它們在表達TSHR的CHO細胞中刺激環腺苷酸生產的能力，和(c)通過放射性免疫測定的總重組Fab濃度。在該分析中，將稀釋在測定緩衝液(50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl Ph7.8、0.1％ TritonX-100)中的校準物和包括培養物上清液和PF(100μL，兩份)的待測物質於室溫在用Fab特異性羊抗人IgG(來自Sigma Aldrich，Poole，BH124QH，UK)包被的塑料試管中孵育1小時。然後將試管用測定緩衝液(2×1mL)洗滌兩次，加入100μL的125I標記的hMAb TSHR1 Fab(30,000cpm)，然後在室溫孵育。1小時後，再次洗滌(2×1mL)試管並對125I進行計數。將結合的計數針對校準物(5ng/mL～500ng/mL)中的Fab(雜交瘤產生的hMAb TSHR1 Fab)的濃度進行製圖且從該校準曲線讀出各種待測物質中的重組Fab的濃度。該分析的檢測限是5ng/mL～10ng/mL的Fab。
重組4B4(穀氨酸脫羧酶或GAD的人MAb)和重組雜交Fab(混合的hMAb TSHR1和4B4的HC和LC)的克隆和表達重組4B4 Fab(N Hayakawa、LDKE Premawardhana、M Powell、MMasuda、C Arnold、J Sanders、M Evans、S Chen、JC Jaume、S Baekkeskov、B Rees Smith、J Furmaniak，穀氨酸脫羧酶的人單克隆抗體的分離和表徵，自體免疫2002；第35卷，第343～355頁中詳細描述了4B4)且通過將各自的HC和LC克隆到Immunozap H/L載體中並如上述重組體hMAbTSHR1 Fab那樣在HB2151細胞中被表達來生產重組雜交Fab。對培養物上清液和周質成分進行以下分析(a)它們抑制TSH結合到TSHR上的能力，(b)它們在表達TSHR的CHO細胞中刺激環腺苷酸產生的能力，和(c)如上述的總重組體Fab濃度。此外，按照如下所述測定GAD Ab活性。
培養物上清液和周質成分中的重組GAD Ab Fab活性的測定使用基於以下情況的測定GAD Ab Fab製備物抑制125I標記的GAD(來自RSR Ltd.，Cardiff，CF23 8HE，UK)結合到GAD的人單克隆抗體(4B4)上的能力。在該測定中，將稀釋在GAD Ab測定緩衝液(150mmol/L NaCl、50mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.1體積％Tween 20、1g/L牛血清白蛋白和0.5g/L NaN3)中的待測樣品(50μL，兩份)與125I標記的GAD(50μL GAD Ab測定緩衝液中30,000cpm)於室溫孵育1小時。然後，加入50μL的4B4 IgG(在GAD Ab測定緩衝液中為0.1μg/mL)，並繼續在室溫孵育24小時。然後，將固相蛋白A(在GAD Ab測定緩衝液中，為50μL；來自RSR Ltd.)加入到4B4 IgG-125I標記的GAD的沉澱複合物中(蛋白A不與Fab和125I標記的GAD的複合物反應)。在使與蛋白A的反應在室溫下進行1小時後，通過離心使沉澱物沉澱(4℃，1500g離心30分鐘)，用1mL的GAD Ab測定緩衝液洗滌並對125I進行計數。在沒有4B4 IgG的情況下，125I標記的GAD結合是所加入的總cpm的4％～5％。
hMAb TSHR1的抗獨特型抗體的生產將6～8周齡BALB/c鼠用完全弗氏佐劑中的50μg hMAb TSHR1 Fab進行腹膜內免疫，隨後在25天後用不完全弗氏佐劑中的50μg hMAbTSHR1 Fab進行第二次腹膜內免疫，並在移走脾臟前4天進行再一次的50μg hMAb TSHR1 Fab注射。將來自抗體陽性鼠的脾臟細胞(見下述)與鼠骨髓瘤細胞系融合併如上述分離的TSHR MAb的方法分離單克隆抗體。通過對125I-hMAb TSHR1 Fab結合到TSHR包被的試管上的抑制來測定鼠血清和培養孔中的抗獨特型抗體的水平。尤其是，將60μL待測樣品(兩等份，在測定緩衝液中稀釋，所述測定緩衝液為50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl pH7.8、0.1％ Triton X-100)與60μL125I-hMAb TSHR1Fab(稀釋在測定緩衝液中，為30,000cpm)於室溫下孵育1小時。將100μL的混合物轉移到具有20μL起始緩衝液(見上)的兩個同樣的由TSHR包被的試管(RSR Ltd.)中，並於室溫繼續再振蕩孵育兩小時。然後，將試管用2×1mL測定緩衝液洗滌並對125I進行計數。從待測樣品對標記的hMAb TSHR1 Fab結合到TSHR包被的試管上的抑制能力明顯看出與hMAb TSHR1反應的抗獨特型抗體的存在。
結果獲自20mL患者血液的淋巴細胞(30×106)以1×106個細胞/孔鋪在48孔平板上，所述孔中具有在鼠巨噬細胞飼養層上的200μL EBV上清液。在EBV感染後第11天，監測上清液對125I-TSH結合的抑制。發現一個孔的結合抑制呈陽性，到第16天抑制水平升高至超過90％並維持這一水平直到第24天，此後，該水平下降。使培養物展平並在EBV感染後第21、23、26和27天與K6H6/B5細胞融合；總共進行了7個融合實驗。每一融合在3塊96孔板(即，總共21塊板)間鋪板，並獲得一個孔，該孔穩定生產具有125I-TSH結合抑制活性的抗體。隨後進行3輪的再克隆以獲得生產人單克隆抗體的單克隆，該抗體抑制被標記的TSH結合到TSH受體上。將該人單克隆TSH受體自身抗體稱為hMAb TSHR1，且屬於具有lambda輕鏈的IgG1亞型。
不同濃度的hMAb TSHR1 IgG和Fab抑制被標記的TSH結合到TSH受體上的能力如圖1所示。如圖1所示，低至1ng/mL的這些製備物對TSH結合的抑制超過用1000ng/mL所獲得的抑制的90％。如圖2所示，TSMAb TSHR1 IgG和Fab同樣刺激用TSH受體轉染的CHO細胞中的環腺苷酸的產生。低至1ng/mL的hMAb TSHR1 IgG或Fab引起對環腺苷酸的強烈刺激。用0.1ng/mL的豬TSH和10ng/mL的人TSH也觀察到了相似的抑制水平。對於來自最初淋巴細胞供體的血清(在獲取用於淋巴細胞分離的血樣的同時獲取的)抑制被標記的TSH結合到TSH受體上的能力，和刺激TSH受體轉染的CHO細胞中的環腺苷酸產生的能力的比較如圖3所示。TSH結合的抑制可以用稀釋500倍的血清檢測到，然而對環腺苷酸的刺激可以用稀釋5000倍的血清檢測到。
125I-標記的hMAb TSHR1 IgG結合到TSH受體包被的試管上，斯卡查德分析顯示締合常數為5×1010/mol。該結合被來自突眼性甲狀腺腫患者的血清所抑制，該患者具有TSH受體自身抗體(可以通過對TSH受體結合的抑制來檢測)(表1)。125I-標記的hMAb TSHR1 Fab也結合到TSH受體包被的試管上(進行斯卡查德分析，締合常數＝4.5×1010/mol)，且該結合被TSH受體自身抗體陽性的突眼性甲狀腺腫患者的血清所抑制(表2)。此外，去汙劑溶解的製備物能夠結合到用hMAb TSHR1包被的塑料試管上，且該結合可以被含有TSH受體自身抗體的血清所抑制(表3)。
如表4所示，hMAb TSHR1-生物素結合到TSH受體包被的ELISA板上且該結合被國際參考製備物NIBSC 90/672和來自突眼性甲狀腺腫患者的血清所抑制。在來自健康獻血者的血清中沒有觀察到對結合的抑制。圖3a表示基於hMAb TSHR1-生物素的TSHR自身抗體的檢測與以前的檢測之間的比較曲線圖。基於hMAb TSHR1-生物素的測定靈敏度明顯超過根據國際標準NIBSC 90/672可檢測的濃度。這在對來自72個突眼性甲狀腺腫患者的血清進行的研究中得以確認，如圖3b所示。在該研究中，健康獻血者血清(n＝100)和來自非甲狀腺疾病的患者的血清(n＝43)分別給出了達10％的對hMAb TSHR1結合的抑制和達11％的對TSH結合的抑制。
hMAb TSHR1 IgG既沒有在蛋白質印跡分析中與全長TSH受體製備物反應，也沒有在免疫沉澱反應或TSH受體肽ELISA中與125S標記的全長TSH受體反應。該反應性的缺乏表明hMAb TSHR1與TSH受體上的構象表位而不是線性表位發生反應。
對編碼hMAb TSHR1的基因進行序列分析，表明重鏈V區基因屬於VH5家族，D基因屬於D6-13家族，J基因屬於JH5家族；對於輕鏈，V基因區來自VL1-11種系，J基因區來自JL3b種系。重鏈核苷酸和胺基酸序列分別如圖4和圖5所示，輕鏈核苷酸和胺基酸序列分別如圖6和圖7所示。這些序列是用簡併PCR引物測定的HC和LC核苷酸序列的改進。具體地，鑑定了核苷酸115～120的HC測序人工構造體。測序顯示為cacgtg(轉錄成胺基酸His Val)，而其晶體結構更可靠地顯示胺基酸為GlnLeu(相應的鹼基為cagctg)。晶體結構分析還使得HC和LC來源的胺基酸序列，尤其是在簡併PCR引物區中的胺基酸序列得以改進。在通過RT-PCR發現LC的胺基酸2為Pro的情況下，但通過晶體結構發現為Thr。在通過RT-PCR發現HC的胺基酸2為Met的情況下，但通過晶體結構發現為Val。
在抑制被標記的TSH結合方面對hMAb TSHR1 IgG製備物和TSH受體自身抗體的國際標準進行的比較如表5所示。這使得當在血清中進行測定時，hMAb TSHR1 IgG的特異性活性估測為NIBSC 90/672的138個單位/mg蛋白質；當在測定緩衝液中進行測定時，估測為NIBSC 90/672的163個單位/mg(兩者的平均值＝150個單位/mg)。hMAb TSHR1 Fab製備物在血清和測定緩衝液中分別為288和309個單位/mg(二者的平均值＝300個單位/mg)。表6顯示了對淋巴細胞供體血清和供體血清IgG進行的相似的分析。可見供體血清含有的平均值為NIBSC 90/672的0.38個單位/mL(在血清和測定緩衝液中分別為0.36和0.4)，供體血清IgG具有的特異性活性的平均值為0.059個單位/mg蛋白質。將這些結果總結在表7中，與hMAb TSHR1 IgG的特異性活性(150個單位/mg)進行比較，表明單克隆抗體IgG在抑制TSH結合方面的活性比淋巴細胞供體血清IgG的活性高於2500倍。
關於不同IgG和血清製備物在被TSH受體轉染的CHO細胞中刺激環腺苷酸的活性方面的最初評價也在表7中示出。對環腺苷酸的刺激測定的特徵在於，測定中和測定間的變化性相當大。這涉及幾個因素，包括在最初接種到96孔板中的細胞的數目和質量的不同，及接種的細胞在隨後48小時期間生長率的不同。因此，對hMAb TSHR1 IgG和Fab、淋巴細胞供體血清、血清IgG和NIBSC 90/672的測定重複進行，結果概括在表8中。在刺激測定中hMAb TSHR1 IgG的特異性活性為318個單位/mg，與之相比，淋巴細胞供體血清IgG的特異性活性為0.1個單位/mg；即單克隆自身抗體IgG在刺激環腺苷酸生產方面大約是供體血清IgG的3000倍。該值與對TSH結合的抑制測定所觀測到值為2500倍合理吻合(參見上述表5和表6)。表9表示hMAb TSHR1 IgG和Fab和淋巴細胞供體血清IgG的TSH受體刺激效應的進一步分析。
豬TSH和hMAb TSHR1 IgG在表達TSH受體的CHO細胞中對環腺苷酸生產的刺激可以另外參見表10所示的結果。
用參考製備物NIBSC 90/672刺激環腺苷酸生產測定中所觀察到的典型結果如表11所示。
表12和13表示不同的E.Coli培養物上清液分別在抑制被標記的TSH結合和刺激環腺苷酸生產方面的效應。轉化的(用hMAb TSHR1質粒)和IPTG誘導的兩個E.Col菌株培養物產生的重組hMAb TSHR Fab量足以用作TSH結合的有效抑制劑(表12)和環腺苷酸生產的有效刺激劑(表13)。對照培養物上清液(來自未轉化的細胞和被轉化但未被誘導的細胞)不產生可檢測水平的結合抑制(表12)或刺激(表13)活性。
在其它的對照組實驗中，對重組人抗體Fab進行分析，所述重組人抗體Fab通過克隆和表達GAD的人單克隆抗體(4B4)的HC和LC而產生。對培養物上清液和周質成分進行測定，表明重組4B4 Fab不具有可檢測的對TSH結合的抑制活性(表14和15)或TSHR刺激活性(表16和17)。此外，由(a)hMAb TSHR1 HC和4B4 LC(b)hMAb TSHR1LC和4B4 HC組成的雜合Fab在任何測定中都不顯示與TSHR的相互作用(表14～17)。在這些不同的重組Fab製備物中GAD Ab活性的測定僅能夠在用4B4 HC和4B4 LC轉化的細胞中檢測到GAD Ab的表達(表18和19)。重組hMAb TSHR1 Fab不顯示可檢測到的GAD Ab活性，由4B4和hMAb TSHR1 HC和LC組成的混合物構成的重組Fab雜合體也不顯示可檢測到的GAD Ab活性(表18和19)。
hMAb TSHR1對用TSHR轉染的CHO細胞中的環腺苷酸生成的刺激能力被含有TSHR自身抗體的患者血清所抑制，所述TSHR自身抗體擔當TSH拮抗劑(圖8)。此外，TSHR的鼠單克隆抗體(9D33)能阻斷hMAb TSHR1刺激活性(表20)，然而另一TSHR鼠MAb(2B4)是無效的(表20)。然而，2B4能夠如9D33那樣阻斷TSH的刺激活性(表21)。表22顯示2B4和9D33抑制125I標記的TSH和125I標記的hMAbTSHR1結合到TSHR塑料試管上的能力。9D33能夠非常有效地抑制標記的TSH的結合和標記的hMAb TSHR1的結合(10μg/mL時高於50％的抑制)。2B4是標記的TSH結合到TSHR上的有效的抑制劑(1μg/mL時高於80％的抑制)，但對hMAb TSHR1結合(1μg/mL時11％的抑制)或對9D33結合(1μg/mL時22％的抑制)僅有較小的效應。標記的9D33與TSHR包被的試管的結合被來自突眼性甲狀腺腫患者的含有TSHR自身抗體的血清所抑制(通過對標記的TSH結合到TSHR上的抑制來測定)，但是健康獻血者血清和來自其它自體免疫疾病患者的血清幾乎沒有效應或沒有效應(表23)。標記的9D33與TSHR的結合被具有TSH激動劑或拮抗劑特性的TSHR自身抗體(表24)和國際標準NIBSC 90/672(表25)所抑制。斯卡查德分析表明9D33和2B4對包被到塑料試管上的TSH受體分別具有2×1010/mol和1×1010/mol的親和力。
用hMAb TSHR1 Fab免疫鼠導致在鼠的血清中產生抗體(多克隆抗體)，該抗體能夠以這樣的方式結合到hMAb TSHR1 Fab上從而抑制Fab結合到TSHR上的能力(表26)。此外，從用hMAb TSHR1 Fab免疫的鼠的脾臟細胞產生的單克隆抗體也能抑制Fab結合到TSHR上(表27)。
我們所有的分析表明人單克隆自身抗體hMAb TSHR1具有存在於淋巴細胞供體血清中的TSH受體自身抗體的TSH受體結合和甲狀腺刺激特性。如上詳述那樣，單克隆抗體也能被製備為重組Fab製備物。
結論(a)我們已經製備了TSH受體的人單克隆自身抗體，它與供體患者的血清中的TSH受體自身抗體具有相似的特性。該單克隆抗體也被製備為重組Fab製備物。
(b)單克隆抗體IgG和Fab和重組Fab製備物是有效的甲狀腺刺激物和標記的TSH結合到TSH受體上的有效抑制劑。
(c)標記的MAb IgG、Fab製備物與TSH受體的結合被來自突眼性甲狀腺腫患者的TSH受體自身抗體陽性血清所抑制，但未被健康獻血者血清或來自其它自體免疫疾病患者的血清所抑制。基於對標記的hMAb TSHR1結合到TSH受體上的抑制的用於TSHR自身抗體的測定系統比迄今為止所描述的其它測定的靈敏度更高。
(d)用作TSH拮抗劑的TSH受體自身抗體和用作TSH激動劑的TSH受體自身抗體抑制標記的hMAb TSHR1結合到TSH受體上。
(e)包被到塑料試管上的hMAb TSHR1製備物結合TSH受體，且這種結合被在不同患者血清中的TSH受體自身抗體所抑制。
(f)還發現抑制hMAb TSHR1結合到TSHR上的鼠單克隆抗體(9D33)也阻斷hMAb TSHR1和TSH的刺激活性。
(g)已製備了hMAb TSHR1的鼠多克隆和單克隆抗體，該多克隆和單克隆抗體以這樣的方式結合hMAb TSHR1以阻止其結合到TSHR受體上。因此這些抗獨特型抗體與TSHR競爭hMAb TSHR1，這樣，它們在需要TSHR自身抗體的結合配偶體的應用中可以是TSHR的有用替代物。
(h)這些結果表明hMAb TSHR1和/或其衍生物和/或其競爭劑可在以下情況中用作TSH的替代物(i)對TSH受體自身抗體、TSH和相關配基的測定。
(ii)各種體內應用，包括提供TSH激動劑和拮抗劑活性。
(iii)鑑定和提供新類型的TSH受體自身抗體結合位點。
表1 患者血清對125I-標記的hMAb TSHR1 IgG結合到TSH受體上的影響及其與對125I-標記的TSH結合到TSH受體上的影響的比較

G1～G11是來自具有突眼性甲狀腺腫病史的患者的血清。
G9血清具有高水平的TSH阻斷(即TSH拮抗劑活性)。
G10和G11具有高水平的甲狀腺刺激活性。
G10是淋巴細胞供體血清。
/10、/20等表示在健康獻血者血清的池中的稀釋因子。
N1～N10是來自健康獻血者的血清。
D1來自1型糖尿病患者(穀氨酸脫羧酶抗體呈陽性)。
A1和A2來自阿狄森氏病的患者(類固醇21-羥化酶自身抗體呈陽性)。
在存在健康獻血者血清池時，大約25％的125I-標記的MAb IgG結合到TSHR包被的試管上。
表2 患者血清對125I-標記的hMAb TSHR1 Fab結合到TSH受體上的影響及其與對125I-標記的TSH結合到TSH受體上的影響的比較

表3 TSHR與用hMAb TSHR1 Fab包被的塑料試管的結合和用含有TSHR自身抗體的血清抑制TSHR結合

1用TSHR C-末端的125I-標記的鼠單克隆抗體來檢測TSHR結合；總cpm＝39,000/試管表4 患者血清樣品對生物素標記的hMAb TSHR1和生物素標記的TSH結合到用TSHR包被的ELISA板孔上的影響

HBD＝健康獻血者血清U/mL是NIBSC 90/672的單位血清P1～P7來自突眼性甲狀腺腫患者表5 用WHO參考製備物NIBSC 90/672和hMAB TSHR1 IgG和Fab製備物抑制TSH結合

1健康獻血者血清池，在僅有該血清池存在的條件下，14.9％的總cpm結合到TSHR上；在僅有緩衝液存在的條件下，14.7％的總cpm結合到TSHR上。
22G4是甲狀腺過氧化物酶的人單克隆自身抗體。
表6 用淋巴細胞供體血清和供體血清IgG抑制TSH結合

1健康獻血者血清池血清，在僅有該血清池存在的條件下，14.7％的總cpm結合到TSHR上；在僅有緩衝液存在的條件下，16.3％的總cpm結合到TSHR上。
2所示單位是NIBSC 90/672國際TSHR自身抗體參考製備物。
表7 hMAb TSHR1、淋巴細胞供體血清和IgG製備物的特異性活性

1所示單位是NCBSC 90/672。
2該值是在血清和測定緩衝液中所獲得的結果的平均值(參見表5和6)。
表8 在多個對環腺苷酸的刺激的測定中確定的hMAb TSHR1、淋巴細胞供體血清和血清IgG的特異性活性的概要


表9 在環腺苷酸刺激測定中對hMAb TSHR1 IgG和Fab及淋巴細胞供體血清IgG的影響的進一步分析

12G4是甲狀腺過氧化物酶的人單克隆自身抗體。
表10 TSH和hMAb TSHR1 IgG在對環腺苷酸的刺激的測定中的加和效應

1所顯示的值是非常相符的重複測定的平均值表11 NCBSC 90/672在環腺苷酸刺激測定中的效應

表12 在兩個不同的大腸桿菌菌株(XL-1 Blue MRF』和HB2151細胞)中表達的重組hMAb TSHR1 Fab對125I-TSH結合到TSHR包被的試管上的抑制

1測定緩衝液＝50mmol/L Nacl、10mmol/L Tris-HCl pH7.82所有稀釋都在測定緩衝液中3對結合的抑制用以下公式計算 其中，A＝在待測樣品存在下的結合B＝在測定緩衝液存在下的結合表13 表達在兩個不同的大腸桿菌菌株(XL-1 Blue MRF』和HB2151細胞)中的重組hMAb TSHR1 Fab對由TSHR轉染的CHO細胞中的cAMP產生的刺激

1測定緩衝液＝含有1g/L葡萄糖、20mmol/L HEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/L 2-異丁基-1-甲基-黃嘌呤的Hank’s緩衝鹽溶液(不含NaCl)，pH7.42在測定緩衝液中稀釋3基底＝在僅有測定緩衝液的條件下產生的cAMP
表14 重組hMAb TSHR1 Fab、重組4B4 Fab(一種GAD的人MAb)和重組雜合Fabs(兩種Fab的混合HC和LC)對125I-TSH結合到TSHR包被的試管上的抑制。在大腸桿菌HB2151細胞中表達。
周質成分的測定

1對結合的抑制用以下公式計算 其中，A＝在待測樣品存在下的125I-TSH結合百分比B＝在測定緩衝液存在下的125I-TSH結合百分比a在未誘導的細胞中的TSHR Ab活性的檢測是由於啟動子的組成活性，它在沒有IPTG的條件下提供低水平的Fab表達。
ud＝不可檢測表15 重組hMAb TSHR1 Fab、重組4B4 Fab(一種GAD的人MAb)和重組雜合Fab(兩種Fab的混合HC和LC)對125I-TSH結合到TSHR包被的試管上的抑制。在大腸桿菌HB2151細胞中表達。
培養物上清液的測定

1參見表14的腳註ud＝不可檢測表16 重組hMAb TSHR1 Fab、重組4B4 Fab(一種GAD的人MAb)和重組雜合Fab(兩種Fab的混合HC和LC)對在由TSHR轉染的CHO細胞中的環腺苷酸產生的刺激。在大腸桿菌HB2151細胞中表達。
培養物上清液的測定

1測定緩衝液＝含有1g/L葡萄糖、20mmol/L HEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/L 2-異丁基-1-甲基-黃嘌呤的Hank’s緩衝鹽溶液(不含NaCl)，pH7.42在測定緩衝液中稀釋3基底＝在僅有測定緩衝液的條件下產生的環腺苷酸a在未誘導的細胞中的環腺苷酸刺激活性的檢測是由於啟動子的組成活性，它在沒有IPTG的條件下提供低水平的Fab表達。總重組Fab水平是不能檢測到的(檢測限＝5ng/mL～10ng/mL)，而對環腺苷酸的刺激的測定可以檢測到低至0.3ng/mL的hMAb TSHR1 Fab。
ud＝不可檢測表17 重組hMAb TSHR1 Fab、重組4B4 Fab(一種GAD的人MAb)和重組雜合Fab(兩種Fab的混合HC和LC)對在由TSHR轉染的CHO細胞中的環腺苷酸產生的刺激。在大腸桿菌HB2151細胞中表達。
周質成分的測定

ud＝不可檢測；1，2，3參見表16的腳註。
a在未誘導的細胞中的TSHR Ab活性的檢測是由於啟動子的組成活性，它在沒有IPTG的條件下提供了低水平的表達。
表18 重組hMAb TSHR1 Fab、重組4B4 Fab和重組雜合Fab(兩種Fab的混合HC和LC)對4B4 IgG(一種由雜交瘤產生的GAD的人MAb)結合到125I-GAD上的抑制。在大腸桿菌HB2151細胞中表達。
周質成分的測定

1對結合的抑制用以下公式計算 其中，A＝在待測樣品存在下的125I-GAD結合B＝在測定緩衝液存在下的125I-GAD結合ud＝不可檢測表19 重組hMAb TSHR1 Fab、重組4B4 Fab和重組雜合Fab(兩種Fab的混合HC和LC)對4B4 IgG(一種由雜交瘤產生的GAD的人MAb)結合到125I-GAD上的抑制。在大腸桿菌HB2151細胞中表達。
培養物上清液的測定

1參見表18腳註ud＝不可檢測表20 TSHR的鼠單克隆抗體對表達TSHR的CHO細胞中的對環腺苷酸生產的刺激的影響，所述刺激由hMAb TSHR1所誘導

1全部稀釋都在測定緩衝液中完成(該測定緩衝液＝含有1g/L葡萄糖、20mmol/L HEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/L 2-異丁基-1-甲基-黃嘌呤的Hank’s緩衝鹽溶液(不含NaCl)，pH7.4)2基底＝在僅有測定緩衝液的條件下的環腺苷酸產生32G2是甲狀腺球蛋白的鼠單克隆抗體(100μg/mL的IgG製備物)42B4和9D33是TSHR的鼠單克隆抗體(100μg/mL的IgG製備物)
表21 TSHR的鼠單克隆抗體對表達TSHR的CHO細胞中的對cAMP產生的刺激的影響，所述刺激由pTSH所誘導

1，2，4參見表20的腳註。在一個單獨的實驗中，作為對照的甲狀腺球蛋白的鼠MAb(2G2 IgG 100μg/mL)顯示對pTSH(0.5ng/mL)刺激環腺苷酸產生沒有影響(pTSH加上測定緩衝液＝12.7×基底；pTSH加上2G2＝11.7×基底)。
表22 不同MAb對125I-TSH、125I-hMAb TSHR1或125I-9D33結合到TSHR包被的試管上的抑制

1所有稀釋均在健康獻血者血清池中(HBD池)2對結合的抑制用以下公式計算

其中，A＝在待測樣品存在下的結合百分比B＝在HBD池存在下的結合百分比作為對照的甲狀腺球蛋白的鼠MAb(2G2 0.001μg/mL～100μg/mL)對標記的TSH、hMAb TSHR1或9D33的結合沒有影響表23 患者血清對125I-9D33和125I-TSH結合到TSHR包被的試管上的影響

1HBD池＝健康獻血者血清池G1～G20是來自突眼性甲狀腺腫患者的血清D1和D2來自1型糖尿病患者(對穀氨酸脫羧酶自身抗體呈陽性)A1和A2來自阿狄森氏病患者(對類固醇21-羥化酶自身抗體呈陽性)N1～N9來自單個健康獻血者2對結合的抑制用以下公式計算 其中，A＝在測試血清存在下的結合百分比B＝在健康獻血者血清池存在下的結合百分比表24 具有TSH激動劑和TSH拮抗劑活性的患者血清對125I-9D33結合到TSHR包被的試管上的影響

1HBD池＝健康獻血者血清池，待測血清在該池中稀釋血清A和B具有TSH拮抗劑活性血清C和D具有TSH激動劑活性2對結合的抑制利用表23中所用的公式進行計算表25 NIBSC90/672對125I-9D33和125I-TSH結合到TSHR包被的試管上的影響

190/672稀釋在健康獻血者血清池中2對結合的抑制利用表23中所用的公式進行計算表26 來自用hMAb TSHR1 Fab免疫的鼠的血清中的多克隆hMAbTSHR1抗獨特型抗體對125I-hMAb TSHR1 Fab結合到TSHR包被的試管上的抑制

1待測樣品稀釋在測定緩衝液中。在測定緩衝液存在下的結合為43％2對結合的抑制用以下公式計算

其中，A＝在待測樣品存在下的125I-hMAb TSHR1結合百分比B＝在測定緩衝液存在下的125I-hMAb TSHR1結合百分比表27 鼠單克隆抗特異型抗體7E51 IgG對125I-hMAb TSHR1 Fab結合到TSHR包被的試管上的抑制

1參見表26的腳註序列表110RSR有限公司120促甲狀腺素受體的抗體及其用途130FCI05GB0399150GB 0227964.41512002-11-29150GB 0302140.91512003-01-29150GB 0315147.91512003-06-2716038170PatentIn version 3.12101211121212PRT213人(human)4001Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Arg Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Lys Gly His Val Thr Val Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Leu Glu Pro Gly Tyr Ser Ser Thr Trp Ser Val Asn Trp Gly100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 12021022115212PRT213人4002Ser Tyr Trp Ile Asn1 5210321117212PRT213人4003Arg Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Lys1 5 10 15Gly210421112212PRT213人4004Leu Glu Pro Gly Tyr Ser Ser Thr Trp Ser Val Asn1 5 102105211131212PRT213人4005Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Arg Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Lys Gly His Val Thr Val Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Leu Glu Pro Gly Tyr Ser Ser Thr Trp Ser Val Asn Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser115 120 125Val Phe Pro1302106211111212PRT213人4006Leu Thr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Arg Gln1 5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn20 25 30Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Arg Gly Leu Gln65 70 75 80Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95Asp Ser Gln Leu Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly100 105 110210721113212PRT213人4007Ser Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn1 5 1021082117212PRT213人4008Tyr Asp Asp Gln Leu Pro Ser1 5210921111212PRT213人4009Thr Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asp Ser Gln Leu1 5 1021010211363212DNA213人40010caaatgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60tcctgtaggg gttctggata caggtttacc agctactgga tcaactgggt gcgccagctg120cccgggaaag gcctagagtg gatgggcagg attgatccta ctgactctta taccaactac180agtccatcct tcaaaggcca cgtcaccgtc tcagctgaca agtccatcaa cactgcctac240ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accggcatgt attactgtgc gaggctcgaa300
ccgggctata gcagcacctg gtccgtaaat tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc360tca 3632101121115212DNA213人40011agctactgga tcaac 152101221151212DNA213人40012aggattgatc ctactgactc ttataccaac tacagtccat ccttcaaagg c 512101321136212DNA213人40013ctcgaaccgg gctatagcag cacctggtcc gtaaat 3621014211394212DNA213人40014caaatgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60tcctgtaggg gttctggata caggtttacc agctactgga tcaactgggt gcgccagctg120cccgggaaag gcctagagtg gatgggcagg attgatccta ctgactctta taccaactac180agtccatcct tcaaaggcca cgtcaccgtc tcagctgaca agtccatcaa cactgcctac240ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accggcatgt attactgtgc gaggctcgaa300ccgggctata gcagcacctg gtccgtaaat tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc360tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccc39421015211333212DNA
213人40015ctgcctgtgc tgactcagcc accctcggtg tctggagccc ccaggcagag ggtcaccatc 60tcctgttctg gaaacagctc caacatcgga aataatgctg taaactggta ccagcagctc120ccaggaaagg ctcccaaact cctcatttat tatgatgatc aactgccctc aggggtctct180gaccgattct ctggctccag gtctggcacc tccgcctccc tggccatccg tgggctccag240tctgaggatg aggctgatta ttactgtaca tcatgggatg acagcctgga tagtcaactg300ttcggcggag ggaccaggct gaccgtccta ggt 3332101621139212DNA213人40016tctggaaaca gctccaacat cggaaataat gctgtaaac392101721121212DNA213人40017tatgatgatc aactgccctc a 212101821133212DNA213人40018acatcatggg atgacagcct ggatagtcaa ctg 3321019211119212PRT213鼠(mouse)40019Asp Val Gln Ile Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ser Arg Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser115210202115212PRT213鼠40020Thr Tyr Trp Met His1 52102121117212PRT213鼠40021Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Gly2102221110212PRT213鼠
40022Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr1 5 1021023211124212PRT213鼠40023Asp Val Gln Ile Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr20 25 30Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ser Arg Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro115 12021024211106212PRT213鼠40024Gly Val Glu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 1052102521110212PRT213鼠40025Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His1 5 10210262117212PRT213鼠40026Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser1 5210272119212PRT213鼠40027Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr1 5
21028211110212PRT213鼠40028Gly Val Glu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Leu Met Leu100 105 11021029211357212DNA213鼠40029gacgtccaga tccagcagcc tgggactgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgagactg 60tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc acctactgga tgcactgggt gaagcagagg120cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactat180aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac240atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aagaaactac300ggtagtggct actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357
2103021115212DNA213鼠40030acctactgga tgcac 152103121151212DNA213鼠40031gagattgatc cttctgatag ttatactaac tataatcaaa agttcaaggg c 512103221130212DNA213鼠40032aactacggta gtggctacta ctttgactac 3021033211373212DNA213鼠40033gacgtccaga tccagcagcc tgggactgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgagactg 60tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc acctactgga tgcactgggt gaagcagagg120cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactat180aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac240atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aagaaactac300ggtagtggct actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc360aaaacaacac ccc 37321034211318212DNA213鼠40034ggcgttgaga tgacacagtc gccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc120acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc180ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggagactgaa240gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgtggacgtt cggtggaggc300accaaactgg aaatcaaa 3182103521130212DNA213鼠40035agtgccagct caagtgtaag ttacatgcac 302103621121212DNA213鼠40036gacacatcca aactggcttc t 212103721127212DNA213鼠40037cagcagtgga gtagtaaccc gtggacg 2721038211331212DNA213鼠40038ggcgttgaga tgacacagtc gccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc120acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc180ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggagactgaa240gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgtggacgtt cggtggaggc300accaaactgg aaatcaaacg gctgatgctg c 33權利要求
1.一種TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體包含或源自人單克隆或重組抗體或其一個或多個片段，所述抗體或片段與TSH受體反應。
2.一種TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體包含或源自人單克隆抗體或其一個或多個片段，所述抗體或片段與TSH受體反應。
3.一種TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體包含或源自人重組抗體或其一個或多個片段，所述抗體或片段與TSH受體反應。
4.一種人單克隆抗體或其一個或多個片段，該抗體或片段與TSH受體反應。
5.一種人重組抗體或其一個或多個片段，所述抗體或片段與TSH受體反應。
6.一種TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體包含或源自與TSH受體反應的人重組抗體的一個或多個片段。
7.如權利要求1～6中任一項所述的TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體在對TSH結合到TSH受體上的抑制方面，具有患者血清TSH受體自身抗體的特性。
8.如權利要求1～6中任一項所述的TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體在對表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激方面，具有患者血清TSH受體自身抗體的特性。
9.如權利要求1～6中任一項所述的TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體在對TSH結合到TSH受體上的抑制方面和對表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激方面，具有患者血清TSH受體自身抗體的特性。
10.如權利要求1～9中任一項所述的結合配偶體或其一個或多個片段，其特徵在於所述結合配偶體對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性至少為國際標準NIBSC 90/672的約15個單位/mg。
11.如權利要求10所述的結合配偶體或其一個或多個片段，其特徵在於所述結合配偶體對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg。
12.如權利要求1～11中任一項所述的結合配偶體或其一個或多個片段，其特徵在於所述結合配偶體對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg。
13.如權利要求12所述的結合配偶體或其一個或多個片段，其特徵在於所述結合配偶體對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性至少為國際標準NIBSC 90/672的約240個單位/mg。
14.如權利要求1～13中任一項所述的結合配偶體或其一個或多個片段，所述結合配偶體的特徵在於(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約15個單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg。
15.如權利要求14所述的結合配偶體或其一個或多個片段，所述結合配偶體的特徵在於(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約240個單位/mg。
16.如權利要求1～15中任一項所述的結合配偶體，該結合配偶體包含或源自與TSH受體反應的單克隆或重組抗體的一個或多個片段，其特徵在於，對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg。
17.如權利要求16所述的結合配偶體，其特徵在於，該結合配偶體對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約240個單位/mg。
18.如權利要求1～17中任一項所述的結合配偶體，該結合配偶體包含或源自與TSH受體反應的單克隆或重組抗體的一個或多個片段，其特徵在於，對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約50個單位/mg。
19.如權利要求18所述的結合配偶體，其特徵在於，該結合配偶體對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約400個單位/mg。
20.如權利要求1～19中任一項所述的結合配偶體，該結合配偶體包含或源自與TSH受體反應的單克隆或重組抗體的一個或多個片段，其特徵在於(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約50個單位/mg。
21.如權利要求20所述的結合配偶體，其特徵在於(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約240個單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約400個單位/mg。
22.一種TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體包含抗體VH區，該抗體抗體VH區選自如SEQ ID NO.1所示的VH區或包含一個或多個VHCDR的VH區，所述VHCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4。
23.一種TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體包含如SEQ ID NO.1所示的抗體VH區。
24.一種TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體包含抗體VH區，該抗體VH區含有一個或多個VHCDR，該VHCDR的胺基酸序列選自SEQID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。
25.一種TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體包含抗體VH區，該抗體VH區選自由以下組成的組如SEQ ID NO.1所示的VH區和含有一個或多個VHCDR的VH區，所述VHCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；和/或抗體VL區，該抗體VL區選自由以下組成的組如SEQ ID NO.6所示的VL區和含有一個或多個VLCDR的VL區，所述VLCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。
26.如權利要求25的結合配偶體，該結合配偶體包含與SEQ ID NO.6所示的抗體VL區配對的如SEQ ID NO.1所示的抗體VH區，以提供抗體結合位點；該結合配偶體同時包含針對TSH受體的所述VH和VL區。
27.如權利要求25的結合配偶體，該結合配偶體包含抗體VH區，該抗體VH區包含含有一個或多個VHCDR的VH區，所述VHCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；和/或抗體VL區，該抗體VL區包含含有一個或多個VLCDR的VL區，所述VLCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。
28.一種能結合到TSH受體上的另外的結合配偶體，該另外的結合配偶體與如權利要求1～27中任一項所述的TSH受體的結合配偶體競爭性地結合到TSH受體上，所述另外的結合配偶體不包含TSH。
29.如權利要求28所述的另外的結合配偶體，其包含另外的抗體，該另外的抗體具有針對TSH受體表位區的結合位點，且該另外的結合配偶體與如權利要求1～27中任一項所述的結合配偶體競爭性地結合到TSH受體上。
30.如權利要求29所述的另外的結合配偶體，其包含或源自人單克隆或重組抗體或其一個或多個片段，所述抗體或片段與TSH受體反應。
31.如權利要求29所述的另外的結合配偶體，其包含或源自鼠單克隆或重組抗體或其一個或多個片段，所述抗體或片段與TSH受體反應。
32.如權利要求28～31中任一項所述的另外的結合配偶體或其一個或多個片段，所述另外的結合配偶體的特徵在於，對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約15個單位/mg。
33.如權利要求32所述的另外的結合配偶體或其一個或多個片段，所述另外的結合配偶體的特徵在於，對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg。
34.如權利要求28～33中任一項所述的另外的結合配偶體或其一個或多個片段，所述另外的結合配偶體的特徵在於，對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg。
35.如權利要求34所述的另外的結合配偶體或其一個或多個片段，所述另外的結合配偶體的特徵在於，對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672約240單位/mg。
36.如權利要求28～35中任一項所述的另外的結合配偶體或其一個或多個片段，所述另外的結合配偶體的特徵在於(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約15個單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg。
37.如權利要求36所述的另外的結合配偶體或其一個或多個片段，所述另外的結合配偶體的特徵在於(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672約240單位/mg。
38.一種能結合到TSH受體上的另外的結合配偶體，該另外的結合配偶體與如權利要求1～27中任一項所述的TSH受體的結合配偶體競爭性地結合到TSH受體上，所述另外的結合配偶體含有如SEQ ID NO.19所示的抗體VH區。
39.一種能結合到TSH受體上的另外的結合配偶體，該另外的結合配偶體與如權利要求1～27中任一項所述的TSH受體的結合配偶體競爭性地結合到TSH受體上，所述另外的結合配偶體包含抗體，該抗體VH區含有一個或多個VHCDR，該VHCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22。
40.一種能結合到TSH受體上的另外的結合配偶體，該另外的結合配偶體與如權利要求1～27中任一項所述的TSH受體的結合配偶體競爭性地結合到TSH受體上，所述另外的結合配偶體包含抗體VH區，該抗體VH區選自由以下組成的組如SEQ ID NO.19所示的VH區和含有一個或多個VHCDR的VH區，所述VHCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.21或SEQ ID NO.22；和/或抗體VL區，該抗體VL區選自由以下組成的組如SEQ ID NO.24所示的VL區和含有一個或多個VLCDR的VL區，所述VLCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.26或SEQ ID NO.27。
41.如權利要求40所述的另外的結合配偶體，所述另外的結合配偶體包含與如SEQ ID NO.24所示的抗體VL區配對的如SEQ ID NO.19所示的抗體VH區，以提供抗體結合位點；所述另外的結合配偶體同時包含針對TSH受體的所述VH和VL區。
42.如權利要求40所述的另外的結合配偶體，該另外的結合配偶體包含抗體VH區，該抗體VH區包含含有一個或多個VHCDR的VH區，所述VHCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22；和/或抗體VL區，該抗體VL區包含含有一個或多個VLCDR的VL區，該VLCDR的胺基酸序列選自SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27。
43.一種多核苷酸，該多核苷酸包含(i)如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8或SEQ ID NO.9所示的抗體VH區、VL區或CDR的胺基酸序列；(ii)編碼如權利要求22～27中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或編碼如權利要求22～27中任一項所述的TSH受體的結合配偶體的抗體VH區、VL區或CDR的胺基酸序列的核苷酸序列；(iii)由於遺傳密碼的簡併性而編碼序列不同於(i)的任意序列的核苷酸序列；(iv)包含(i)的任意序列的等位變異的核苷酸序列；(v)包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)的任意序列的片段的核苷酸序列，尤其是包含(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的任意序列的片段並編碼權利要求22～27中任一項所述的TSH受體的結合配偶體的Fab片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、獨立的CDR區、F(ab′)2片段或scFv片段的核苷酸序列；(vi)由核苷酸鹼基的突變、缺失或取代而不同於(i)的任意序列並編碼如權利要求22～27中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或編碼如權利要求22～27中任一項所述的TSH受體的結合配偶體的抗體VH區、VL區或CDR的胺基酸序列的核苷酸序列。
44.一種多核苷酸，該多核苷酸包含(i)如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27所示的抗體VH區、VL區或CDR的胺基酸序列；(ii)編碼如權利要求38～42中任一項所述的TSH受體的另外的結合配偶體或編碼如權利要求38～42中任一項所述的TSH受體的另外的結合配偶體的抗體VH區、VL區或CDR的胺基酸序列的核苷酸序列；(iii)由於遺傳密碼的簡併性而編碼序列不同於(i)的任意序列的核苷酸序列；(iv)包含(i)的任意序列的等位變異的核苷酸序列；(v)包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)的任意序列的片段的核苷酸序列，尤其是包含(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的任意序列的片段並編碼如權利要求38～42中任一項所述的另外的結合配偶體的Fab片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、獨立的CDR區、F(ab′)2片段或scFv片段的核苷酸序列；(vi)由核苷酸鹼基的突變、缺失或取代而不同於(i)的任意序列並編碼如權利要求38～42中任一項所述的另外的結合配偶體或編碼如權利要求38～42中任一項所述的TSH受體的另外的結合配偶體的抗體VH區、VL區或CDR的胺基酸序列的核苷酸序列。
45.一種具有生物學功能的載體系統，該載體系統攜帶有權利要求43或44所述的多核苷酸且能將該多核苷酸引入到宿主生物體的基因組中。
46.一種宿主細胞，該宿主細胞用如權利要求43或44所述的多核苷酸轉化。
47.一種提供TSH受體的人單克隆抗體的方法，該方法包括如下步驟(i)提供來自受試者的淋巴細胞源，所述受試者具有TSH受體抗體活性，在對TSH結合到TSH受體上的抑制方面，所述TSH受體活性大於NIBSC 90/672的約0.04個單位/mL血清；(ii)從所述(i)的淋巴細胞源分離淋巴細胞；(iii)使所分離的淋巴細胞無限增殖；和(iv)克隆該無限增殖的淋巴細胞，從而產生分泌TSH受體的人單克隆抗體的無限增殖化克隆，所述TSH受體的人單克隆抗體如權利要求1、2、4、7～27中任一項所述。
48.一種提供TSH受體的人單克隆抗體的方法，該方法包括如下步驟(i)提供來自受試者的淋巴細胞源，該受試者具有TSH受體抗體活性，在對表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性方面，所述TSH受體抗體活性大於NIBSC 90/672的約0.1個單位/mL血清；(ii)從所述(i)的淋巴細胞源分離淋巴細胞；(iii)使所分離的淋巴細胞無限增殖；和(iv)克隆該無限增殖的淋巴細胞，從而產生分泌TSH受體的人單克隆抗體的無限增殖化克隆，所述TSH受體的人單克隆抗體如權利要求1、2、4、7～27中任一項所述。
49.如權利要求47或48所述的方法，該方法包括從外周血、甲狀腺組織、脾臟組織、淋巴結或者骨髓分離淋巴細胞。
50.如權利要求47所述的方法，其中，所述的淋巴細胞源以獲自具有TSH受體抗體水平的受試者為特徵，在對TSH結合到TSH受體上的抑制方面，所述TSH受體抗體水平高於NIBSC 90/672的約0.1個單位/mL血清。
51.如權利要求50所述的方法，其中，所述的淋巴細胞源以獲自具有TSH受體抗體水平的受試者為特徵，在對TSH結合到TSH受體上的抑制方面，所述TSH受體抗體水平高於NIBSC 90/672的約0.2個單位/mL血清。
52.如權利要求51所述的方法，其中，所述的淋巴細胞源以獲自具有TSH受體抗體水平的受試者為特徵，在對TSH結合到TSH受體上的抑制方面，所述TSH受體抗體水平在NIBSC 90/672的約0.3個單位/mL血清～0.5個單位/mL血清的範圍內。
53.如權利要求48所述的方法，其中，所述的淋巴細胞源以獲自具有TSH受體抗體水平的受試者為特徵，在對表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性方面，所述TSH受體抗體水平高於NIBSC 90/672的約0.3個單位/mL血清。
54.如權利要求53所述的方法，其中，所述的淋巴細胞源以獲自具有TSH受體抗體水平的受試者為特徵，在對表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性方面，所述TSH受體抗體水平高於NIBSC 90/672的約0.5個單位/mL血清。
55.如權利要求54所述的方法，其中，所述淋巴細胞源以獲自具有TSH受體抗體水平的受試者為特徵，在對表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性方面，所述TSH受體抗體水平在NIBSC 90/672的約0.5個單位/mL血清～1.0個單位/mL血清的範圍內。
56.如權利要求47～55中任一項所述的方法，該方法包括用EB病毒感染分離的淋巴細胞，並將由此無限增殖化的淋巴細胞與鼠或人細胞系融合。
57.一種製備TSH受體的人重組抗體或其一個或多個片段的方法，該方法包括克隆和表達TSH受體的人單克隆抗體或來自其的一個或多個片段。
58.如權利要求57所述的方法，其中，所述TSH受體的人單克隆抗體通過權利要求47～56中任一項所述的方法製備。
59.一種TSH受體的人單克隆或重組抗體，該人單克隆或重組抗體分別獲自如權利要求47～58中任一項所述的方法。
60.如權利要求59所述的人單克隆或重組抗體或其一個或多個片段，所述人單克隆或重組抗體的特徵在於，對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約15個單位/mg。
61.如權利要求60的人單克隆或重組抗體或其一個或多個片段，所述人單克隆或重組抗體的特徵在於，對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg。
62.如權利要求59～61中任一項所述的人單克隆或重組抗體或其一個或多個片段，所述人單克隆或重組抗體的特徵在於，表達對於TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg。
63.如權利要求62的人單克隆或重組抗體或其一個或多個片段，所述人單克隆或重組抗體的特徵在於，對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約240個單位/mg。
64.如權利要求59～63中任一項所述的人單克隆或重組抗體或其一個或多個片段，所述人單克隆或重組抗體的特徵在於(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約15個單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg。
65.如權利要求64的人單克隆或重組抗體或其一個或多個片段，所述人單克隆或重組抗體的特徵在於(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約120個單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約240個單位/mg。
66.如權利要求59～65中任一項所述的人單克隆或重組抗體的一個或多個片段，其特徵在於，對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg。
67.如權利要求66所述的一個或多個片段，其特徵在於，對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約240個單位/mg。
68.如權利要求59～67中任一項所述的人單克隆或重組抗體的一個或多個片段，其特徵在於，對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約50個單位/mg。
69.如權利要求68所述的一個或多個片段，其特徵在於，對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC90/672的約400個單位/mg。
70.如權利要求66～69中任一項所述的一個或多個片段，其特徵在於(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約30個單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約50個單位/mg。
71.如權利要求70所述的一個或多個片段，其特徵在於(i)對於TSH結合到TSH受體上的抑制活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約240個單位/mg；和(ii)對於表達TSH受體的細胞的cAMP生產的刺激活性，至少為國際標準NIBSC 90/672的約400個單位/mg。
72.如權利要求47～58中任一項所述的方法，該方法還包括另外的操作步驟，藉此使所獲得的人單克隆或重組抗體經過另外的操作技術來獲得如權利要求28～37中任一項所述的另外的結合配偶體。
73.如權利要求28～37中任一項所述的另外的結合配偶體，該另外的配偶體由權利要求72所述的方法獲得。
74.一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子含有如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，所述結合對的第二分子含有結合區，該結合區與所述結合配偶體或另外的結合配偶體發生相互作用；(c)將所述樣品與所述一對或多對結合分子接觸，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體；和(d)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
75.一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子含有如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，所述結合對的第二分子含有結合區，該結合區與所述結合配偶體或另外的結合配偶體發生相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測到基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(c)將所述樣品與所述一對或多對結合分子接觸，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體；和(d)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
76.一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子含有TSH受體的人或非人多克隆抗體，所述結合對的第二分子含有結合區，該結合區與所述多克隆抗體發生相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測到基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(c)將所述樣品與所述一對或多對結合分子接觸，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述多克隆抗體；和(d)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
77.一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子含有TSH或其一個或多個突變體、類似物、衍生物或片段，所述結合對的第二分子含有結合區，該結合區與所述TSH或其一個或多個突變體、類似物、衍生物或片段發生相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測到基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(c)將所述樣品與所述一對或多對結合分子接觸，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述TSH或其一個或多個突變體、類似物、衍生物或片段；和(d)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
78.一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來自所述受試者的所述體液樣品；(b)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含對TSH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結合配偶體，所述結合對的第二分子含有結合區，該結合區與所述結合配偶體發生相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測到基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(c)將所述樣品與所述一對或多對結合分子接觸，以允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述TSH的配偶體；和(d)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
79.如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體在檢測獲自受試者的體液樣品中的TSH受體的自身抗體中的用途，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，其中所述結合配偶體或另外的結合配偶體與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測到基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度。
80.TSH受體的人或非人多克隆抗體在檢測獲自受試者的體液樣品中的TSH受體的自身抗體中的用途，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，其中所述多克隆抗體與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測到基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度。
81.TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段在檢測獲自受試者的體液樣品中的TSH受體的自身抗體中的用途，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，其中所述TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測到基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度。
82.對TSH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結合配偶體在檢測獲自受試者的體液樣品中的TSH受體的自身抗體中的用途，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，其中所述結合配偶體與TSH受體間的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測到基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度。
83.一種在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的方法，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述方法包括(a)提供來自所述受試者的所述體液樣品；(b)在允許TSH受體與針對TSH受體進行應答而產生的自身抗體相互作用的條件下，將所述樣品與以下接觸(i)全長TSH受體，或其一個或多個表位，或含有一個或多個TSH受體的表位的多肽，和(ii)如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或TSH受體的另外的結合配偶體，從而允許所述TSH受體或所述其一個或多個表位或所述多肽，與存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體或如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體相互作用；和(c)監測所述TSH受體或所述其一個或多個表位或所述多肽與存在於所述樣品中的所述自身抗體間的相互作用，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
84.如權利要求74～78、83中任一項所述的方法，該方法還應用了在以下相互作用中進行競爭的一種或多種競爭劑，所述相互作用為分別由上述權利要求所限定的所述多克隆抗體，TSH或其一個或多個突變體、類似物、衍生物或片段，或所述TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體與如權利要求74～78中任一項所定義的所述結合對的第二分子，或權利要求83中所述的TSH受體或其一個或多個表位，或所述多肽之間的相互作用。
85.一種用於在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述結合配偶體或另外的結合配偶體發生相互作用；(b)用於將來自所述受試者的所述體液樣品與所述一對或多對結合分子接觸的單元，從而允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的TSH受體的結合配偶體；和(c)用於監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
86.一種用於在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述結合配偶體或另外的結合配偶體發生相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測到基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(b)用於將來自所述受試者的所述體液樣品與所述一對或多對結合分子接觸的單元，從而允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或TSH受體的另外的結合配偶體；和(c)用於檢測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
87.一種用於在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含TSH受體的人或非人多克隆抗體，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述多克隆抗體發生相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測到基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(b)用於將來自所述受試者的所述體液樣品與所述一對或多對結合分子接觸的單元，從而允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述多克隆抗體；和(c)用於監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
88.一種用於在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段發生相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測到基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(b)用於將來自所述受試者的所述體液樣品與所述一對或多對結合分子接觸的單元，從而允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)TSH或其一個或多個變異體、類似物、衍生物或片段；和(c)用於監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
89.一種用於在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子包含對TSH受體的親和力為1010/摩爾或更大的TSH受體的結合配偶體，所述結合對的第二分子包含結合區，該結合區與所述結合配偶體發生相互作用，其中所述結合分子的相互作用是使在所述樣品中能夠檢測到基本上相當於國際標準NIBSC 90/672的0.4U/L的自身抗體滴度；(b)用於將來自所述受試者的所述體液樣品與所述一對或多對結合分子接觸的單元，從而允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH受體的自身抗體，或(ii)所述TSH受體的結合配偶體；和(c)用於監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的所述自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
90.一種用於在獲自受試者的體液樣品中篩選TSH受體的自身抗體的試劑盒，所述受試者被懷疑患有、易感、具有或恢復自與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病，所述試劑盒包含(a)全長TSH受體，或其一個或多個表位，或含有TSH受體的一個或多個表位的多肽；(b)如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或TSH受體的另外的結合配偶體；(c)用於在允許TSH受體與針對TSH受體進行應答而產生的自身抗體發生相互作用的條件下，將來自所述受試者的所述體液樣品、所述TSH受體或所述其一個或多個表位或所述多肽，與如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或TSH受體的另外的結合配偶體接觸的單元，從而允許所述TSH受體或所述其一個或多個表位或所述多肽，與存在於樣品中的TSH受體的自身抗體，或與如權利要求1～42中任一項所述的TSH結合配偶體或TSH受體的另外的結合配偶體發生相互作用；和(d)用於監測所述TSH受體或所述其一個或多個表位或所述多肽，與存在於所述樣品中的所述的自身抗體的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在所述TSH受體的自身抗體的指示。
91.如權利要求85～90中任一項所述的試劑盒，該試劑盒還包含在以下相互作用中進行競爭的一種或多種競爭劑，所述相互作用為分別由所述權利要求所限定的所述多克隆抗體，TSH或其一個或多個突變體、類似物、衍生物或片段，或所述TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體與如權利要求85～89中任一項所定義的結合對的第二分子，或如權利要求90的所述TSH受體或其一個或多個表位，或所述多肽之間的相互作用。
92.一種測定TSH和相關配基的方法，所述方法包括(a)提供被懷疑含有或含有TSH或相關配基的樣品；(b)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子含有如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，所述結合對的第二分子含有結合區，該結合區與所述結合配偶體發生相互作用；(c)將所述樣品與所述一對或多對結合分子接觸，從而允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH或相關配基，或(ii)如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體；和(d)監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的TSH或相關配基的相互作用，從而提供在所述樣品中存在TSH或相關配基的指示。
93.一種用於檢測TSH或相關配基的試劑盒，該試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子含有如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，所述結合對的第二分子含有結合區，該結合區與所述結合配偶體發生相互作用；(b)用於將被懷疑含有或含有TSH或相關配基的樣品與所述一對或多對結合分子接觸的單元，從而允許所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)存在於所述樣品中的TSH或相關配基，或(ii)如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體；和(c)用於監測所述結合對的所述第二分子與存在於所述樣品中的TSH或相關配基的相互作用的單元，從而提供在所述樣品中存在TSH或相關配基的指示。
94.一種鑑定TSH受體的另外的結合配偶體的方法，該另外的結合配偶體能結合到TSH受體上並與如權利要求1～27中任一項所述的TSH受體的結合配偶體競爭性地結合到TSH受體上，該另外的結合配偶體不包含TSH，該方法包括(a)提供一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子含有如權利要求1～27中任一項所述的TSH受體的結合配偶體，所述結合對的第二分子含有結合區，該結合區與所述結合配偶體發生相互作用；(b)提供待測的另外的結合分子，該另外的結合分子作為TSH受體的潛在的另外的結合配偶體，該另外的結合配偶體與(a)的所述結合對的第一分子競爭性地結合到TSH受體上；(c)將(b)的所述的另外的結合分子與(a)的所述的一對或多對結合分子相接觸，從而允許(a)的所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)(b)的所述另外的結合分子，或(ii)(a)的所述結合對的所述第一分子；和(d)監測(a)的所述結合對的所述第二分子與(b)的所述另外的結合分子的相互作用，從而評估(b)的所述另外的結合分子是否與(a)的所述結合對的所述第一分子競爭性地結合到TSH受體上。
95.一種用於鑑定TSH受體的另外的結合配偶體的試劑盒，該另外的結合配偶體能結合到TSH受體上並與如權利要求1～27中任一項所述的TSH受體的結合配偶體競爭性地結合到TSH受體上，該另外的結合配偶體不包含TSH，該試劑盒包含(a)一對或多對結合分子，其中所述結合對的第一分子含有如權利要求1～27中任一項所述的TSH受體的結合配偶體，所述結合對的第二分子含有結合區，該結合區與所述結合配偶體發生相互作用；(b)用於將(a)的所述的一對或多對結合分子與待測的另外的結合分子接觸的單元，所述另外的結合分子作為TSH受體的潛在的另外的結合配偶體，該另外的結合配偶體與(a)的所述結合對的所述第一分子競爭性地結合到TSH受體上；從而允許(a)的所述結合對的所述第二分子與以下相互作用(i)所述另外的結合分子，或(ii)(a)的所述結合對的所述第一分子；和(c)用於監測(a)的所述結合對的所述第二分子與所述另外的結合分子的相互作用的單元，從而評估所述另外的結合分子是否與(a)的所述結合對的所述第一分子競爭性地結合到TSH受體上。
96.一種鑑定TSH受體的一個或多個表位區的方法，該方法包括將權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體與全長TSH受體或其一個或多個片段接觸，從而允許所述TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體與所述全長TSH受體或所述其一個或多個片段相互作用；並鑑定與所述權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體相互作用的所述全長TSH受體或所述其一個或多個片段的胺基酸。
97.一種或多種抗獨特型抗體，該抗獨特型抗體是針對權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體的結合區而產生的。
98.一種抗獨特型抗體，該抗獨特型抗體是根據實施例製備的7E51IgG。
99.一種鑑定抗體結合位點的方法，該方法包括用權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體來篩選噬菌體展示隨機文庫。
100.如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，該結合配偶體或另外的結合配偶體用於治療中。
101.一種在受試者中治療與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體。
1 02.一種藥物組合物，該藥物組合物含有權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，同時含有一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
103.一種治療受試者中與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，該TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體刺激TSH受體。
104.如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體在製備用於刺激甲狀腺組織或含有TSH受體的組織的藥物中的用途。
105.如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體在製備用於治療甲狀腺癌的藥物中的用途。
106.一種刺激甲狀腺組織和/或含有TSH受體的組織的方法，該方法包括給需要這種刺激的患者施用診斷有效量或治療有效量的如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體。
107.如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體與能刺激甲狀腺組織和/或含有TSH受體的組織的一種或更多種另外的試劑的組合，該組合用於在刺激甲狀腺組織和/或含有TSH受體的組織中同時、單獨或順序使用。
108.如權利要求107所述的組合，其中所述一種或更多種另外的試劑包含重組人TSH和/或其一個或多個突變體、類似物、衍生物或片段，或這樣的片段的突變體、類似物、衍生物。
109.如權利要求108所述的組合，其中所述一種或更多種另外的試劑與結合到TSH受體上無關地發揮作用。
110.一種治療受試者中與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病的方法，包括給所述受試者施用治療有效量的如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，該TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體使TSH受體對TSH、TSH受體自身抗體或其它刺激物失活或無應答。
111.如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體與能使含有TSH受體的組織對TSH、TSH受體自身抗體或其它刺激物失活或無應答的一種或更多種另外的試劑的組合。
112.如權利要求111的組合，其中所述一種或更多種另外的試劑與TSH受體無關地發揮作用。
113.一種治療受試者中與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的如權利要求28～42中任一項所述的TSH受體的另外的結合配偶體，藉此所述另外的結合配偶體的施用基本上抑制TSH受體與存在於患者的循環中的自身抗體之間的相互作用，其中所述自身抗體與TSH受體的相互作用造成所述自體免疫疾病或與所述自體免疫疾病相關。
114.一種治療受試者中與TSH受體的免疫反應相關的自體免疫疾病的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的如權利要求97或98所述的抗獨特型抗體，藉此所述抗獨特型抗體的施用基本上抑制TSH受體與存在於患者的循環中的自身抗體之間的相互作用，其中所述自身抗體與TSH受體的相互作用造成所述自體免疫疾病或與所述自體免疫疾病相關。
115.一種治療與對TSH受體的自體免疫相關的眼眶後組織疾病的方法，該方法包括給患有或被懷疑患有這種疾病的患者施用治療有效量的如權利要求28～42中任一項所述的TSH受體的另外的結合配偶體。
116.一種治療與對TSH受體的自體免疫相關的眼眶後組織疾病的方法，該方法包括給患有或被懷疑患有這種疾病的患者施用治療有效量的如權利要求97或98所述的抗獨特型抗體。
117.如權利要求28～42中任一項所述的TSH受體的另外的結合配偶體在製備用於治療與TSH受體的激活和/或刺激相關的眼眶後組織疾病的藥物中的用途。
118.如權利要求97或98所述的抗獨特型抗體在製備用於治療與TSH受體的激活和/或刺激相關的眼眶後組織疾病的藥物中的用途。
119.如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，該結合配偶體或另外的配偶體用作要求含有一種或多種TSH受體抗體的患者血清的替代源。
120.如權利要求1～42中任一項所述的TSH受體的結合配偶體或另外的結合配偶體，該結合配偶體或另外的配偶體用於要求含有規定濃度的一種或多種TSH受體抗體的製備物中。
全文摘要
本發明提供了TSH受體的結合配偶體，該結合配偶體包含或源自人單克隆或重組抗體，或其一個或多個片段，所述抗體或片段與TSH受體反應；以及所述TSH受體的結合配偶體的用途、應用它的診斷和治療方法和針對其的抗獨特型抗體。
文檔編號C12N5/10GK1717418SQ200380104118
公開日2006年1月4日 申請日期2003年11月28日 優先權日2002年11月29日
發明者簡·桑德斯, 雅德維加·富爾馬尼亞克, 伯納德·裡斯·史密斯 申請人:Rsr有限公司