口蹄疫病毒雙效疫苗載體、其製備方法及應用的製作方法

2023-04-27 12:05:01

專利名稱：口蹄疫病毒雙效疫苗載體、其製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組疫苗載體，尤其涉及一種具有基因治療及基因免
疫作用的o型口蹄疫病毒雙效疫苗載體，其製備方法以及該雙效疫苗載體
在防治口蹄疫病毒中的用途，屬於基因工程領域。
背景技術：
目前所有疫苗幾乎都存在著時間長短不一的有效抗體產生期，即免疫
空白期，動物在這一時期遇到病原微生物的入侵往往會造成疫病流行；另 外，疫苗接種隱性感染的動物後還可能引起嚴重的臨床反應甚至引起少數 動物死亡；如何使動物在免疫空白期免受病原的攻擊、防止隱性感染期的 動物接種疫苗後發生嚴重的臨床反應甚至死亡是亟需要解決的一個問題。

發明內容
本發明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，構建一種 具有基因治療及基因免疫口蹄疫病毒雙重作用的0型口蹄疫病毒(FMDV) 雙效疫苗載體。
本發明首先所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的 一種具有基因治療及基因免疫口蹄疫病毒雙重作用的0型口蹄疫病
毒(FMDV)雙效疫苗載體，主要由雙順反子表達載體序列組成，其中含有 能夠與口蹄疫病毒基因組5'非編碼區(UTR) RNA結合的反義基因序列和 完整的口蹄疫病毒VP1結構蛋白基因序列。
作為優選的，所述的雙順反子表達載體為pIRES，所述的能夠與口蹄 疫病毒基因組5'非編碼區RNA結合的反義基因序列是口蹄疫病毒基因片 段AsN。
更優選的，本發明0型口蹄疫病毒(FMDV)雙效疫苗載體是pAsN-IR-VP1。
本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種構建上述0型口蹄疫 病毒(FMDV)雙效疫苗載體的方法。
本發明所要解決的另一個技術問題是通過以下技術方案來實現的
一種上述O型口蹄疫病毒(FMDV)雙效疫苗載體的構建方法，包括 將針對FMDV 5' UTR的基因片段反向插入雙順反子表達載體的一個多克隆 位點上，將完整的VP1結構蛋白基因正向插入該雙順反子表達載體的另一 個多克隆位點上。
優選的， 一種上述O型口蹄疫病毒(FMDV)雙效疫苗載體的構建方 法，包括將針對FMDV5' UTR的基因片段AsN反向插入雙順反子表達載 體pIRES的多克隆位點A，將完整的VP1結構蛋白基因正向插入雙順反子 表達載體pIRES多克隆位點B中。
本發明依據反義RNA能夠通過結合正義的mRNA而阻止mRNA翻譯成 蛋白質，從而抑制病毒複製，而核酸疫苗能誘導有效的細胞及體液免疫從 而保護動物免於特異性病原攻擊的原理，構建了具有基因治療及基因免疫 雙重作用的0型口蹄疫(FMD)雙效疫苗載體。在核酸疫苗產生有效的抗 體之前，利用反義核酸對病原的抑制作用，抵禦在注苗前已隱性感染及外 侵的少量特異性病原對動物的危害，解決疫苗免疫空白期的問題。另外， 在特異性抗體產生以後，利用特異性抗體對病原的中和作用及反義核酸對 病原的抑制作用的雙重功效達到增強疫苗免疫效力目的，通過雙效載體轉 染細胞，篩選穩定克隆及擴繁後試製疫苗及疫苗免疫動物後的抗體測定、 動物強毒攻擊等試驗，獲得了較為理想的效果。
用脂質體介導法將本發明雙效重組質粒轉染入BHK-21細胞中，經 RT-PCR等檢測表明本發明雙效重組質粒反義RNA在細胞中得到了轉錄，病 毒抑制試驗、蝕斑減少試驗表明5' AsN轉錄子對同源病毒的複製能產生 有效的阻抑作用，轉染24h後接毒，抑制率達60%以上。經夾心ELISA及 間接免疫螢光等試驗表明本發明雙效重組質粒VP1結構蛋白基因在BHK-21 細胞中得到了穩定表達，且有一定的生物學活性。
對經本發明雙效質粒轉染的細胞克隆經G418多次篩選後得到了穩
定抗性細胞株，經RT-PCR檢測表明重組質粒能在BHK-21細胞中能穩定傳 代。
大量提取本發明雙效疫苗載體試製雙效疫苗免疫小鼠後採血經 LBP-ELISA檢測表明本發明雙效疫苗能刺激機體產生抗體，二免三周時不 同批次小鼠的抗體效價為1: 32-1: 64; MTT法表明本發明雙效疫苗載體
能誘導機體產生脾臟T淋巴細胞的增殖反應；免疫小鼠有效抗體的產生及
T淋巴細胞的增殖反應，證實了本發明雙效疫苗載體具有基因免疫作用。 用本發明雙效疫苗載體免疫乳鼠後6-12h，以20-100TCID5。強毒攻擊，結果 該雙效質粒能夠保護乳鼠免於FMDV強毒攻擊感染，保護率達到50%-83%， 說明本發明雙效疫苗載體具有基因治療作用。


圖l 5'AsNPCR產物。
圖2 VP1PCR產物。
圖3 為重組質粒pAsN-IR的酶切及PCR鑑定圖。
圖4 為重組質粒pAsN-IR-VP1的酶切及PCR鑑定圖。
圖5為雙效疫苗載體RT-PCR檢測RNA的轉錄圖。 1， 2:轉染後24及48 h細胞液RT-PCR擴增5， AsN; 3: DL2000 Marker
圖6為雙效疫苗載體RT-PCR檢測RNA的轉錄圖。
1: DL2000 Marker.
2:穩定細胞液體擴VP1;
3:提取朋K細胞DNA擴 VP1;
4:陰性對照。
圖7轉染的BHK-21細胞間接免疫螢光染色結果。
A轉染雙效質粒；B:未轉染細胞。
圖8 SDS-PAGE及Western-blot檢測結果。
1:細胞培養液上清；
2:經轉染的細胞裂解液上清；
3， 10:低分子蛋 白Marker; 4， 5， 6， 7, 9經轉染的細胞裂解液；8， BHK-21對照。
圖9病毒抑制試驗的細胞病變圖及蝕斑減少試驗結果 (A)第一排，IBRS-2細胞按100 TCIDs。的量接種FMDV OMIII毒:1. IBRS-2 對照；2，3，4及5:分別為IBRS-2細胞接毒後12，24，36， 48h;第二排
轉染雙效質粒後24h時按100 TCIDs。的量接種FMDV OMIII毒1. IBRS-2對 照；2,3，4及5:分別為轉染細胞接毒後12，24，36, 48h; (B)蝕斑減少情況1. IBRS-2細胞對照；2.轉染雙效質粒後24h時按10TCID5。 的量接種FMDV OMIII毒的蝕斑形成情況；3及4:分別是以100TCID5。和 lOTCIDs。的量接毒後的蝕斑形成情況。
圖IO小鼠脾淋巴細胞的增殖圖。
圖ll本發明雙效疫苗載體的構建示意圖。
具體實施例方式
以下通過具體實施方式
對本發明進行進一步說明。這裡想要指出的 是，下面的具體實施方式
僅用來說明本發明，本領域技術人員在理解本發 明精神的前提下，可以根據本技術領域的現有技術和公知知識對本發明進 行相應變換，這些技術方案均落入本發明的範圍之內。
實施例1
雙效疫苗載體pAsN-IR-VPl的構建
一、製備目的基因
所設計的5' AsN片段及VPl結構蛋白基因的擴增引物為
AsNl :5，-gcgaattcatgccagcacggcaactttac-3'; (856-873 ) EcoRI
AsN2: 5 ，-ctagctagcgttgggcctggagtagaatg—3; (1200-1219) Nhel
XP1:5，-gcgt2gi^Ccaccatgcacgcagaccacctccac-3'; (3247-3264) Sail
XP2: 5，-gcgcggccgcttcacaggcgccacaatc -3， (3865-3882) Notl
其中，在AsNl及XP1上遊引入起始密碼子ATG，在其下遊引物的3' 端引入終止密碼子，同時在XP1上遊加入Kozak序列等元件。以口蹄疫病 毒OMIII毒株(為中國農業科學院蘭州獸醫研究所分離、保存並經 BHK-21細胞傳代增殖的細胞毒；該口蹄疫病毒OMIII毒株也可由其它
的口蹄疫病毒毒株來代替，本領域技術人員按照現有技術或文獻所公開 的方法均可以分離或獲得類似的口蹄疫病毒毒株，這些毒株均可替代口
蹄疫病毒OMIII毒株)為模板進行擴增(AsN基因片段的擴增程序94°C 預變性5min; 94°C， lrain; 58°C， 45s; 72°C 50s; 30個循環後，72 °C 延伸8 min。 VPl基因的擴增程序94"C預變性5 min; 94°C， lmin; 60 °C， lmin; 72°C lmin; 30個循環後，72 °C延伸8 min)。擴增後所得到 的PCR產物分別見圖l和圖2。
二、雙效疫苗載體的構建
將5， AsN基因片段及VPl結構蛋白基因分別亞克隆到雙順反子表達 載體pIRES (購自Invitrogen生物公司)(雙順反子載體啟動子為CMV; 終止子為polyA)的多克隆位點A及B中，構建成了 FMDV雙效載體 pAsN-IR-VP1。
所述的雙順反子表達載體的構建包括以下操作
1) 將回收得到的目的基因5， AsN經EcoRI及Nhel雙酶切，並純化 回收目的片段；
2) 將雙順反子載體pIRES經EcoRI及Nhel雙酶切，得到線性化的載
體；
3) 用T4 DNA連接酶對上述產物進行粘端連接；
4) 按常規方法將連接產物轉化大腸埃希氏菌(JM109)，在氨苄抗性 的瓊脂平板上篩選，挑選克隆後，提取質粒；
5) 採用酶切、PCR擴增方法鑑定(圖3)，得到陽性重組質粒pAsN-IR。
6) 目的基因VPl經Sal I及Not I雙酶切後，形成帶有粘性末端的目 的基因；
7) 將前面得到的pAsN-IR質粒經EcoRI及Nhel雙酶切，得到線性化 的載體；
8) 連接、轉化、挑選克隆、提取質粒，採用酶切、PCR擴增及DNA測 序等方法鑑定(圖4)，得到雙效疫苗載體pAsN-IR-VPl。
試驗例1雙效疫苗載體pAsN-IR-VP1體外表達的檢測 一、用雙效疫苗載體pAsN-IR-VPl轉染BHK-21細胞 1)轉染質粒的製備按照超純質粒DNA製備試劑盒的操作步驟，無
菌提取質粒pAsN-IR-VPl。經瓊脂糖凝膠電泳檢測後鑑定質粒正確，分光光
度計確定DNA的含量及純度；
2 )細胞轉染BHK-21細胞用含6X小牛血清的DMEM培養液在37。C、
5%C02的培養箱中培養，待細胞長滿時挑取生長狀況良好的細胞經胰酶消
化，血細胞記數板記數後接種於6孔細胞培養板，用不含抗生素的完全培
養液37X:培養過夜；
3) 將脂質體(Lipofectamine 2000)懸液加至DMEM培養液中， 充分將二者混勻，室溫下溫育；在此期間吸棄細胞原培養液，用DMEM培
養液洗細胞一次；
4) 待細胞融合達50%-80%時，在Lipofectamine 2000介導下進行 轉染，往每平皿加DNA/脂質體複合物，在5%(]02培養箱中溫育後吸棄含 DNA/脂質體複合物的培養液，轉染4 h後補加含5%血清無抗生素的DMEM 以維持細胞的正常生長。細胞對照孔內加入含相同濃度Lipofectamine1" 2000的MEM培養液。
5) 脂質體轉染後用轉染細胞進行穩定抗性細胞系的篩選及雙效質 粒體外表達的檢測等工作。
二、體外表達的檢測
1、 用RT-PCR法檢測重組質粒pAsN-IR-VP1中反義RNA部分在細胞中 的轉錄情況結果見圖5;
2、 用pAsN-IR-VP1瞬時轉染的BHK-21或篩選出的穩定細胞系進行病 毒抑制試驗，以評價反義RNA轉錄子對病毒產生的抑制效果，主要包括以 下操作
①pAsN-IR-VPl轉染細胞後24h按100 TCID50/0. lmL接種FMDV OMIII， 吸附lh後棄去細胞上清液，用DMEM洗滌細胞2次後加入含4 % FBS的DMEM繼 續培養；
8
②於感染的不同時間取細胞上清，用BHK-21細胞檢測不同時間所收 集細胞的病毒毒價(Bigeriego et al. ， 1999; Gutie'rrez et al. ， 1993)。 計算3次獨立的病毒抑制試驗抑制率的平均值，以空質粒轉染細胞克隆作 為空白對照，計算病毒產生抑制率PI。
3、用pAsN-IR-VPl瞬時轉染的BHK-21或用所篩選出的穩定細胞系進 行蝕斑減少試驗，更直觀地了解反義RNA轉錄子對病毒產生的抑制效果。 主要包括以下操作
① 按常規方法培養IBRS-2細胞；
② 無菌PBS洗滌細胞，按100 TCID50/0. lmL接種FMDV OMIII (200uL/ 孔，6孔板)，置於二氧化碳培養箱；
③ lh之後按2mL/孔加入overlay培養液(一份2XMEM， 一份1.2% agar)靜置培養24-48h;
④ 吸棄培養液，加入冰冷的固定液(50%丙酮+50%甲醇)，-2(TC固定 lOminj
⑤ 加入結晶紫染色液約2mL，室溫染色30min;
⑥ 蒸餾水衝洗，自然乾燥後計數蝕斑數，獲得病毒毒價。試驗結果見 圖9。
4、用雙抗體夾心ELISA檢測VP1結構蛋白基因在BHK-21細胞中的表 達情況主要包括以下操作
① 用重組雙效質粒pAsN-IR-VPl轉染BHK-21細胞，繼續培養；
② 分別於24及48h時收取細胞，用0. 01M PBS液(pH7. 4)洗滌後胰 酶消化，離心後棄上清；細胞沉澱經裂解液裂解並離心，上清用於ELISA 檢測。
③雙抗體夾心ELISA法檢測抗原96孔酶標板用FMDV兔陽性血清 (1:1000)包埋，4。C過夜，馬血清封閉後，將FMDV抗原、轉染質粒 pAsN-IR-VP1的細胞裂解液及未轉染的空白對照細胞裂解液以2倍梯度稀 釋，每個稀釋度設兩復孔，37°C溫育lh後，洗滌後加入口蹄疫豚鼠陽性
抗血清(1:800) ， 37°C作用lh，洗滌後加入服P-兔抗豚鼠IgG (1:2000)， 37°C作用lh，加入底物0PD-HA於37°C作用15min，用終止液結束反應， 於入492nm處測定0D值。
5、間接免疫螢光試驗檢測VP1結構蛋白基因在BHK-21細胞中的表達 主要包括以下操作
① 收取培養皿中轉染細胞生長密度達90%以上的蓋玻片，0.01 mol/L PBS液(pH7. 4 )漂洗，固定30 min後PBS液漂洗；
② 滴加FMDV兔陽性血清(1:1000)，溼盒孵化30 min後加FITC-羊抗兔 IgG (1:40);
③ 染色30 min後PBS液漂洗，自然乾燥後甘油封片於螢光顯微鏡下 觀察，拍照。試驗結果見圖7。
試驗例2穩定抗性細胞株的篩選與鑑定
穩定抗性細胞株的篩選過程包括以下操作DG418的濃度確定G418 的最適用量通過建立細胞死亡曲線獲得，即將細胞稀釋至1000 cell/mL， 每孔按100pL加入含有培養基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0， 100， 200， 300， 400， 500， 600， 700， 800， 900， 1000， 1100pg/mL等 12個級別，繼續培養3-4周，每3-4d換一次培養液，以最低細胞全部死亡 濃度為基準，建立細胞死亡曲線， 一般為400-800嗎/mL左右，篩選時比 該濃度再高一個級別。選取B服-21細胞全部死亡孔G418的濃度為篩選 穩定抗性B服-21細胞的最適用量，最後篩選濃度確定為500|ig/mL，維持時 使用篩選濃度的一半即可。
2)穩定抗性細胞系的篩選:轉染BHK-21細胞後待細胞生長接近融合 時按1:4密度傳代，繼續培養至細胞密度至50%-70%時棄培養液，更換為 500y g/mL的G418培養液進行篩選，同時用未經轉染的正常細胞作對照， 當對照細胞大部分死亡時再更換一次篩選液，G418濃度可以降至 250 u g/mL，以維持篩選作用。約10-20d後，可見有抗性克隆形成，待其逐 漸增大後在鏡下計數細胞，以細胞套管套住單克隆細胞島後進行消化，將
消化下的細胞轉移入96孔板培養細胞，每孔加100 u L完全培養液置C02 培養箱中孵育24 h後，每孔加入100uL工作濃度的G418選擇培養液。 按此條件，每隔3-4d換液培養，14 21d後， 一些孔內可見細胞集落形 成。挑取集落轉移至6孔板中培養，生長良好後，再轉移至培養瓶中培 養。
3)穩定抗性細胞系的RT-PCR鑑定對經G418多次篩選後的BHK-21 細胞用胰酶消化後4000 r/min離心5min，棄上清後沉澱用細胞裂解液裂解 後反覆凍融，再次離心後取上清進行PCR擴增，同時提取BHK-21細胞的DNA 也進行PCR擴增，看是否有目的基因的存在。對擴增得到的基因經純化後 與Teasy載體連接，轉化後挑斑提取質粒，經PCR及酶切鑑定後陽性克隆 測序，分析序列變異情況。
試驗結果對用雙效質粒pAsN-IR-VPl轉染的細胞克隆經G418多 次篩選後得到了穩定抗性細胞株，經RT-PCR及蝕斑減少試驗等檢測表明 雙效質粒能在BHK-21細胞中能穩定傳代。對轉染雙效質粒pAsN-IR-VP1 的BHK-21細胞克隆經G418多次篩選後得到了穩定抗性細胞株，經RT-PCR 檢測表明雙效質粒能在BHK-21細胞中穩定傳代。
試驗例3動物免疫試驗
1) 用0MEGA公司的E. Z. N. AFastfilterEndo-freePlasmidMaxi Kit 大量提取質粒pAsN-IR-VPl，方法參見試劑盒的操作步驟，分光光度計確 定DNA的含量及純度。
2) 將24隻5-6日齡小鼠隨機分為4組(6隻/組)，分為雙效質粒 pAsN-IR-VPl免疫組、雙效質粒pAsN-IR-VPl+利多卡因組、滅活疫苗組及 緩衝液對照組。第一次免疫後第四周加強免疫一次，第二次免疫後四周處 死小鼠。利多卡因組為注射質粒前一周注射利多卡因(4rag/Kg體重)，以 提高細胞對質粒DNA的攝取量，免疫後不同時間經尾靜脈採血。
3)分離血清後以LBP-ELISA法檢測小鼠血清抗體的產生情況，結果 見表l。
表l VP1特異性抗體的檢測組別21天28 天14天(二21天(二28天(二
(一免)(一免)免)免)免)
本發明雙效質1:2 1:21:41:8<1:4
粒
本發明雙效質1:4 1:41:161:321:16
粒+
利多卡因
0型滅活疫苗1:4 1:12l:卯1:60<1:16
組
PBS<1:2 <1:2<1:2<1:2<1:2
4)於小鼠免疫前、 一免後28d及二免後21d採集小鼠脾臟淋巴細胞， 按MTT法進行T淋巴細胞增殖試驗。
無菌製備小鼠淋巴細胞懸液，將細胞稀釋成2xl(y個/mL的單細胞懸 液，加入96孔細胞培養板中，每孔加入50uL。然後加入50uLPHA溶液 (濃度500y g/mL)，設三復孔，另設對照孔，對照孔中不加單細胞懸液， 只加入RPMI 1640培養液，其餘同單細胞懸液孔。細胞置40。C、 5% C02飽 和溼度條件下培養45h，然後每孔加MTT溶液(5 mg/mL) 10uL，繼續培 養3h。取出後每孔加入10% SDS-O. Olmol/L HC1溶液100 yL，混勻後置 細胞培養箱中2h後取出，以對照孔調零，在X570nm處，測定每孔OD值， 結果以三個孔平均值表示，結果見圖IO。
試驗結果大量提取質粒pAsN-IR-VPl試製雙效疫苗免疫小鼠後採血 經LBP-ELISA檢測表明本發明雙效疫苗pAsN-IR-VPl能剌激機體產生抗體， 二免3周時不同批次的抗體效價達1: 32-1: 64; MTT法檢測表明本發明 雙效質粒pAsN-IR-VP1能誘導機體產生脾臟T淋巴細胞的增殖反應；免疫 小鼠有效抗體的產生及T淋巴細胞的增殖反應，證實了本發明雙效質粒pAsN-IR-VPl的基因免疫作用。
試驗例3 乳鼠攻毒試驗
用重組菌大量提取雙效質粒pAsN-IR-VPl製成疫苗免疫動物或用 篩選出的穩定含有雙效質粒pAsN-IR-VPl的BHK-21細胞製成疫苗進行動 物免疫。
先用3-4日齡的清潔級的乳鼠測定FMDV OM III毒的LD5。隨後 選用24隻乳鼠進行攻毒試驗，將乳鼠隨機分為4組，本發明雙效質粒 pAsN-IR-VPl免疫組及PBS對照組，按20LDso及1000)5兩個劑量攻毒。 對雙效質粒pAsN-IR-VPl免疫組乳鼠先背部肌肉100pg/只的雙效質粒 pAsN-IR-VPl， 6-12h後按20LD5及100 LD5q的量經乳鼠背部皮下接種 lOOpL的OM III株細胞毒(g卩104及l(T3的病毒)，對照組也按兩個攻毒劑 量攻毒，觀察10天，計算乳鼠的保護率，試驗結果見表2。
_表2乳鼠攻毒試驗結果
組別 攻毒劑量(100pL)
率
緩衝液 10—3 本發明雙效質粒免疫組 10—3
50%
緩衝液 10—4
本發明雙效質粒免疫組 10—4 83%_
試驗結果表明本發明雙效質粒pAsN-IR-VP1對乳鼠的保護率達到50 %-83%，表明本發明雙效疫苗對口蹄疫病毒具有顯著的基因治療作用。
死亡比率 保護
權利要求
1、O型口蹄疫病毒雙效疫苗載體，主要由雙順反子表達載體序列組成，其特徵在於含有能夠與口蹄疫病毒基因組5』非編碼區RNA結合的反義基因序列和完整的口蹄疫病毒VP1結構蛋白基因序列。
2、 按照權利要求l的O型口蹄疫病毒雙效疫苗載體，其特徵在於所述的雙 順反子表達載體為pIRES;所述的能夠與口蹄疫病毒基因組5'非編碼區RNA結合 的反義基因序列是口蹄疫病毒基因片段AsN。
3、 按照權利要求l的O型口蹄疫病毒雙效疫苗載體，其特徵在於所述的雙 順反子表達載體是pAsN-IR-VPl。
4、 權利要求l的O型口蹄疫病毒雙效疫苗載體的構建方法，包括將針對口 蹄疫病毒5'非編碼區RNA的基因片段反向插入雙順反子表達載體的一個多克隆位 點上，將完整的VP1結構蛋白基因正向插入該雙順反子表達載體的另一個多克隆位 點上。
5、 權利要求3的0型口蹄疫病毒雙效疫苗載體pAsN-IR-VPl的構建方法，包 括將針對口蹄疫病毒5'非編碼區RNA的基因片段AsN反向插入雙順反子表達載 體pIRES的多克隆位點A，將完整的VP1結構蛋白基因正向插入雙順反子表達載體 pIRES多克隆位點B中。
6、 一種治療和預防口蹄疫病毒的分子疫苗，含有免疫或治療上有效量的權利 要求1的0型口蹄疫病毒雙效疫苗載體和藥學上可接受的載體或輔料。
7、 權利要求1-3任意一種所述的0型口蹄疫病毒雙效疫苗載體在製備口蹄疫 病毒藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種口蹄疫病毒雙效疫苗載體以及該雙效疫苗載體的構建方法和用途。本發明口蹄疫病毒雙效疫苗載體主要由雙順反子表達載體序列組成，其中含有能夠與口蹄疫病毒基因組5』非編碼區RNA結合的反義基因序列和完整的口蹄疫病毒VP1結構蛋白基因序列。動物試驗表明，本發明口蹄疫病毒雙效疫苗在動物口蹄疫的防制方面具有基因治療及基因免疫雙重功效。
文檔編號C12N15/63GK101195831SQ20071010308
公開日2008年6月11日 申請日期2007年5月28日 優先權日2007年5月28日
發明者喜 蘭, 劉兆弼, 方玉萍, 李學瑞, 李寶玉, 李志勇, 彬 楊, 柳紀省, 殷相平, 韓曉榮 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所