泛向神經營養因子的製作方法

2023-05-08 07:55:41 1

專利名稱：：泛向神經營養因子的製作方法
技術領域：
：本發明涉及在神經組織尤其神經元的生長、調控或維持中所相關的蛋白質。具體地，本發明涉及泛向的、具有多重神經營養特異性的神經營養因子(MNTS變異體)。發明背景脊椎動物神經元的存活和分化功能的維持受稱為神經營養蛋白(neu-rotrophin)的特異性蛋白的影響。發育中的神經元的存活取決於來自其靶區域中這些因子的供應，而且神經營養蛋白的限量產生可導致多餘神經元的死亡(參見文獻(1)，(2))。各種不同神經營養蛋白功能上的差別在於其支持在中樞和外周神經系統中各種神經元群存活的能力不同〔(3)，(4)，(5)，(80)〕。神經營養蛋白家族是一個高度同源的家族，它包括NT3〔(6)，(7)，(5)，(8)，(9)，(10)〕、神經生長因子(NGF)〔(11)，(12)〕、腦衍生神經營養因子(BD-NF)〔(13)，(14)〕和神經營養蛋白4/5(NT4/5)〔(15)，(16)，(17)〕。研究暗示，神經營養蛋白通過已知的trk(一類含酪氨酸激酶的受體，Mr＝140-145,000)的配體依賴性激活作用而轉導細胞內信號〔(18)，(19)，(21)，(20)，(22)，(23)，(24)，(25)，(26)〕。因此，神經營養蛋白的信號轉導途徑是由這種對特異性的酪氨酸激酶受體的高親和性結合和激活，隨後導致受體自磷酸化而引起的〔(19)，(27)〕。儘管在神經營養蛋白和不同trk之間存在某種程度的交叉受體(cross-receptor)相互作用，主導的特異性似乎是NGF/trkA、BDNF/trkB和NT3/trkC，而NT4/5似乎與BDNF同樣有效地主要與trkB作用〔(27)，(19)，(21)，(25)，(22)，(28)，(18)，(28a)〕。儘管trkC獨特地對NT3產生應答〔(25)，(26)〕，但是trkA和trkB在特定條件下可以在體外應答多種神經營養蛋白。〔(6)，(23)〕。然而，神經元環境的確會限制trkA和trkB對非優選神經營養配體的應答能力(29)。除了trk受體家族，神經營養蛋白還可與稱為「p75低親和NGF受體」的一類不同受體結合〔p75，(30)，(31)〕，它的跨膜信號傳導機制未知，但是在結構上與包括腫瘤壞死因子受體(TNFR)、CD40、0×40和CD27在內的受體基因族相關〔(32)，(33)，(34)，(35)，(36)，(37)〕。gp75在神經營養蛋白的高親和性結合位點的形成以及信號轉導途徑中作用還不清楚〔參見(38)，(39)〕。對神經營養蛋白的一級胺基酸序列的檢查揭示，有7個含7-10殘基的區域造成家族成員中85％的序列差異。神經生長因子(NGF)是120個胺基酸的多肽同源二聚體蛋白，它在外周神經系統的感覺神經元和交感神經元的發育中起主要作用。NGF通過應答神經元上的特異性細胞表面受體而作用，以支持神經元存活、促進軸突產生和增強神經化學分化。NGF的作用是通過神經元膜〔(40)，(41)〕、神經元蛋白的磷酸化狀態〔(42)，(43)〕和某些mRNA和蛋白質的冗餘的變化而完成的，從而在神經元分化和功能中起作用(參見例如(44))。前腦膽鹼能神經元也應答NGF，而且需要NGF以得到營養支持(45)。事實上，NGF的分布和個體發生以及在中樞神經系統(centralnervoussystem，CNS)中它的受體都暗示，NGF作為基礎前腦膽鹼能神經元的靶衍生神經營養因子而發揮作用〔(46)，(81)〕。對於與trkA-酪氨酸激酶受體相互作用所需的NGF胺基酸殘基，人們所知甚少。用純化的人和鼠NGF同源二聚體觀察到生物活性和受體結合的大缺失，這代表了在氨基端和羧基端修飾的同源截短形式〔(47)，(48)，(49)〕。與(1-118)hNGF相比，含109個胺基酸的種類(10-118)hNGF(通過缺失的重組人NGFN末端前9個殘基和C末端後2個殘基的純化而得到)，在將鼠〔125I〕NGF從人trkA受體上置換下來方面的效率低300倍(49)。與(1-118)hNGF相比，它在背根神經節和交感神經節存活方面的活性低50-100倍(48)。(1-118)hNGF有相對較低的trkA酪氨酸激酶自磷酸化活性(49)。在各種外周組織(例如腎、肝、皮膚)以及中樞神經系統(例如小腦、海馬)中觀察到NT3轉錄〔(5)，(7)，(82)〕。在發育中，NT3mRNA轉錄在中樞神經系統中進行神經元增殖、遷移和分化的區域是最顯著的(50)。在神經元發育中發揮作用的有關證據包括NT3對神經冠細胞的促進效應(51)和體內對少突神經膠質細胞前體細胞增殖的刺激(79)。NT3還可在體外支持來自結狀神經節(no-doseganglion，NG)的感覺神經元〔(7)，(5)，(83)〕和背根神經節(dorsalrootganglion，DRG)的肌肉感覺神經元群的存活(52)。除了這些體外研究之外，最近的報導顯示，在模擬Alzheimer氏病中發現的細胞喪失的模型中，NT3在體內可防止成人中樞中藍斑的去甲腎上腺素能神經元的退化。目前，還沒有有關trkC結合所需的胺基酸殘基方面的出版報導。在創建嵌合的或泛神經營養蛋白方面進行的嘗試很有限〔(53)，(56)，(54)，(55)〕。發明概述本發明的一個目的是用重組DNA技術提供泛向神經營養蛋白並產生有用量的這種泛向神經營養蛋白。本發明的另一目的是提供編碼泛向神經營養蛋白的重組核酸、含有編碼泛向神經營養蛋白的核酸的表達載體和宿主細胞。本發明的另一目的是提供產生泛向神經營養蛋白的方法，以及治療病人的神經元疾病的方法。根據上述目的，本發明提供了重組泛向神經營養蛋白、以及分離的或重組的編碼本發明神經營養蛋白的核酸。還提供了含有可操作地連於轉錄和翻譯調控DNA的、編碼泛向神經營養蛋白的DNA的表達載體，以及含有該核酸的宿主細胞。另一方面，本發明提供了產生泛向神經營養蛋白的方法，它包括培養已用表達載體轉化的宿主細胞，使編碼泛向神經營養蛋白的核酸表達以產生重組神經營養蛋白。此外提供的是通過將本發明的神經營養蛋白施用給病人而治療神經性疾病的方法。通過下列與附圖結合的詳細描述和所附的權利要求書，本發明的其他目的和特徵對於本領域的技術人員而言是顯而易見的。附圖的簡要描述圖1顯示了鼠NGF(SEQ.ID.NO.1)和人NT3(SEQ.ID.NO.2)之間的高度同源性，這樣可基於NGF的三維結構來塑造NT3。箭頭指出的是β鏈。β鏈的命名同McDonaldeta1.(1991)(59)。在NGF和NT3之間不同的胺基酸用灰色框標出。結構不同的部分用斜線框標出。圖2A、2B、2C、2D和2E顯示了選定的突變體對背根神經節神經元的存活以及PC12/trkC細胞上軸突延伸方面的生物效應。E9小雞DRG神經元在含NT3或突變體的293細胞的條件培養基中培養72小時。由突變體誘導的應答用NT3應答的百分比表示。A)5ng/mlNT3、R103A/D105A和R103A，B)1ng/mlNT-3、R103M、R103K、N1、Y51A，C)0.2ng/mlNT3、Y11A、T22Q和K80AQ83A。誤差是3個測量值的均方差(SD)。從各數據點中扣減掉來自模擬轉染細胞介質的應答，對200pg/ml、1000Pg/ml、5000Pg/ml試驗的扣減值分別為23％、23％和29％。(D)由含有NT3或R68A突變體的條件培養基誘導的PC12/trkC細胞應答。用不同劑量的神經營養蛋白誘導的具有軸突的細胞的百分比。對所有劑量的NT3和R68A而言，具有和不具有軸突的細胞總數是恆定的。(E)DRG神經元的存活情況。由NT-3、R68A或R114A/K115A誘導的應答用存活細胞的數目表示。結果是3個測量值的平均值±SD。由模擬轉染的條件培養基誘導的應答被從各數據點中扣減掉，為20±4存活細胞。圖3A、3B和3C顯示了NT3與其受體trkC和gP75的結合表位。顯示了NT3模型，其中來自單體A和B的結合決定簇分別用淺灰和深灰色表示。(A)對trkC受體的抗原決定簇，(B)trkC抗原決定簇的側視圖。D15和Y51的位置相對於trkC結合決定簇。(C)對gp75受體的抗原決定簇。圖4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4I和4J顯示了篩選BDNF和NGF等活性更高的NT3突變體的情況。PC12細胞或表達trkB的PC12細胞系被接種在包被有膠原蛋白的培養皿上。用補充有BDNF(A)、NT3(B)、突變體D15A(C)或模擬轉染的293細胞的上清液(E)的PC12培養基處理PC12/trkB細胞系。用補充有NGF(F)、NT3(G)、S1(H)、D15A(D)、MNTS-1(I)或模擬轉染的293細胞的上清液(J)的PC12培養基處理PC12細胞。在處理3天後對代表性區域進行拍照。圖5A、5B、5C和5D顯示，MNTS-1高親和性地與人trkA、trkB和trkC結合。在恆定量標記神經營養蛋白(對trkA、trkB和trkC為50pM，對gP75為100pM)和數量增加的未標記競爭物存在下，測定用受體免疫粘附素(im-munoadhesin)的置換曲線。(o)hNGF，(△)hBDNF，(□)NT-3，(▲)MNTS-1，(X)S1，(＋)D15A。(A)將125I-NGF從人trkA上置換出。(B)將125I-BDNF從人trkB上置換出。(C)將125I-NT3從人trkC上置換出。(D)將125I-NT3從人gp75上置換出。圖6A、6B和6C顯示了由MNTS-1誘導的trkA、trkB和trkC的自磷酸化。在37℃將PC12變異細胞暴露於25ng/ml的神經營養蛋白和突變體5分鐘，然後按試驗程序中所述進行分析。(A)PC12細胞對不加入因子、加入NGF、NT-3、S1、D15A、MNTS-1和模擬轉染的293細胞上清液的應答。(B)PC12/trkB細胞對不加入因子、加入NGF、BDNF、純化的NT-3、表達的NT-3、D15A和模擬轉染的293細胞上清液的應答。(C)PC12/trkC細胞對不加入因子、加入NGF、NT-3、D15A、S1、MNTS-1和模擬轉染的293細胞上清液的應答。在神經營養蛋白下方的數字顯示了用於免疫沉澱的抗血清的類型，443是泛trk抗血清，656是trkC特異性抗血清。圖7顯示，MNTS-1具有與NT-3/BDNF/NGF混合液一樣的對DRG神經元存活的影向力。DRG神經元存活依賴於劑量。在NT3/BDNF/NGF(1∶1∶1)混合液(●)和MNTS-1(▲)下存活的細胞數目。結果是3個測量值的平均值±SD。MNTS-1(虛線)和混合液(實線)的數據符合四參數方程。計算出的MNTS-1和混合液的EC-50值分別為36pg/ml和44pg/ml。圖8顯示了不同的神經營養蛋白的同源性、可變區和恆定區。顯示了NFG(SEQ.ID.NO.3)、BDNF(SEQ.ID.NO.4)、NT3(SEQ.ID.NO.5)和NT4/5(SEQ.ID.NO.6)，其中可變區被框出。圖9A、9B和9C顯示了通過增加純化的N末端修飾的hNGF的濃度，從trkA、p75或trkA＋p75受體中競爭置換〔125I〕hNGF的情況。上面(12A)、中間(12B)和下面(12C)圖分別代表了從表達trkA、p75和trkA＋p75受體的MH3T3、A875細胞和P12嗜鉻細胞瘤中進行置換的情況。競爭性配體如圖所示(●-●)111/111＝(10-118)hNGF同源二聚體；(○-○)118-118＝(1-118)hNGF同源二聚體；(▲-▲)115-115＝(6-118)hNGF同源二聚體；(-)鼠NGF＝(1-118)mNGF同源二聚體。如實施例中所述，受體結合在4℃進行並分析。所示的數據是總結合(特異和非特異的結合)並且是每個細胞系的至少3次單獨結合試驗的平均值。該試驗的IC50示於表5。圖10A和10B顯示了由N末端截短的hNGF誘導的trkA的自磷酸化情況。上圖(10A)顯示了p140trkA條帶的自磷酸化強度是hNGF變異體摩爾濃度的函數，而下圖(10B)顯示了用反射密度儀測定的各條帶的光密度的數值。自磷酸化的p140trkA條帶是在用抗磷酸酪氨酸(antiphosphotyrosine)免疫沉澱之後通過在硝酸纖維素膜上的抗trkA免疫印跡而確定的。所示的數據是兩次獨立試驗的平均值。圖11A和11B顯示了hNGF突變體的表達和蛋白分析。圖A為用SDS-PAGE分離的代謝標記的突變體1-8(描述請參見表1)的放射自顯影圖。變異體瞬時性地在人293細胞中表達並用35S甲硫氨酸和半胱氨酸標記。用純化的兔抗-hNGF多克隆抗體免疫沉澱條件培養基，按實施例中所述方法通過SDS-PAGE分析沉澱物。標記Wt或B的泳道代表分別單獨用野生型(1-120)hNGF表達載體或AdVA載體對細胞的轉染。圖B是對約0.1微克非標記突變型或野生型hNGF的Western免疫印跡分析。在平行於上述的代謝標記細胞時進行的轉染後，從條件培養基中採集樣本。同圖A中所述的相同抗-hNGF多克隆抗體免疫進行免疫印跡。結果與同次試驗中平行進行被免疫印跡的突變體的變化測量值進行比較，並且與特異hNGF單克隆抗體反應，如圖18所示。標記NGF的泳道代表來自0.1微克純化的(1-120)hNGF的信號。兩個圖的左側標出了以千道爾頓(kD)表示的分子量標記物的相對泳動率。圖12A、12B、12C、12D、12E和12F顯示了通過增加純化的hNGF突變體的濃度，從表達trkA(上圖，12A和B)、p75(中圖，12C和D)和p75＋trkA(下圖，12E和F)的細胞中競爭性置換〔125I〕hNGF的情況。為了清楚起見，對各細胞系將數據分成2個圖。為了比較相對結合親和力，在一次試驗中的每個細胞系都測試4個突變體和hNGF野生型對照。兩個圖中的每一個都代表來自一次轉染的至少兩個獨立的結合試驗和來自另一次轉染的一個結合試驗。如實施例中所述，結合試驗在4℃進行。總結合示於圖12。相對野生型hNGF的IC50列於表5。圖13A和13B顯示了由hNGF突變體引發的trkA的自磷酸化。上圖(13A)是用所示濃度的突變或野生型hNGF刺激表達trkA的細胞後p140trkA的放射性自顯影。trkA自磷酸化的水平如圖10進行測量。下圖(13A)是對上述放射自顯影用密度儀進行定量分析。數據是在一次試驗中比較所有突變體引發的trkA自磷酸化的至少兩個試驗的平均值，它與比較每個hNGF試驗中3-4個突變體的其他試驗的數據是一致的。圖14顯示了用PC12細胞軸突產生確定的hNGF的生物活性。PC12細胞在所示濃度的突變型或野生型hNGF存在下生長48小時。在給定顯微鏡區域中延伸出軸突的總細胞的百分比，如實施例所述用與(1-118)hNGF引發的最大應答的校正值表示。所示的數值是每個突變體的至少兩個測量值的平均值。圖15A、15B、15C、15D和15E顯示了對純化的N末端區域突變體的定性研究。1微克純化的H4D突變體2(泳道1)、純化的hNT3/hNGFN-末端嵌合突變體6(泳道2)、部分純化的(1-120)hNGF(泳道3-N)的SDS-PAGE(15％丙烯醯胺)的銀染結果，以及以千道爾頓表示的分子量標記物(泳道4)。純化和分析的細節在材料和方法章節B中給出。用純化的H4D突變體2、hNT3/hNGFN-末端嵌合突變體6和純化的(1-120)hNGF競爭性地置換〔125I〕hNGF。上圖(15B)是對表達trkA的NIH3T3細胞的結合，下圖(15D)為對A875細胞(p75)的結合。上圖(15C)為如圖10和13一樣用抗磷酸酪氨酸免疫印跡檢測的p140trkA自磷酸化的濃度依賴性(M)。下圖(18E)表示了免疫印跡數據的密度儀測量數據。圖16A和16B顯示了單克隆抗體與hNGF的N末端區域的相互作用。A.對0.1微克突變體1-6和8(突變體7因濃度低而被刪去)、hNGF(wt)和對照轉染條件培養基(B)的免疫印跡。將條件培養基上樣於SDS-PAGE，免疫印跡於硝酸纖維素膜，然後與抗-hNGF單克隆抗體14.14反應。突變體的相對泳動率顯示為14kD。B.通過增加圖A中所用的相同單克隆抗體的濃度，從表達tr-kA或表達p75的細胞中競爭性置換25pM〔125I〕hNGF。圖17是根據鼠NGF的X光衍射晶體結構而得出的hNGF單體的示意圖，它顯示了一級胺基酸序列(SEQ.ID.NO.3)、二級結構的基本特徵和突變修飾的殘基。帶黃色陰影的殘基是在hNGF和hNT3之間不同的殘基，並且當結構域交換時由相應的hNT3殘基替換hNGF中的殘基。靠近5-8個陰影殘基的大黑體數字指出了特定神經營養蛋白可變區域。這些可變區域還包括氨基端和羧基端。紅色陰影殘基為那些單獨或成對突變的殘基，而且是大多暴露於溶劑的胺基酸。圖18A、18B和18C顯示了hNGF的組織構成。圖18A描繪了在hNGF一級序列中可變結構域的位置。圖18B描繪了hNGF的可變結構域嵌合突變體，它含有一個hNT3可變結構域。圖18C即清單，列出了在給定的突變體中被hNT3置換的hNGF的各個殘基。圖19A和19B顯示了用於分析hNGF結構變異體的新受體結合程序的特性。A)基於trkA-IgG免疫吸附分析的結合特性與用那些在NIH3T3細胞系中表達的全trkA受體的結合特性之間的比較。trkA-IgG競爭性結合圖與全trkA細胞系的競爭性結合圖(20A)很相似，而且trkA-IgG顯示出相同的神經營養蛋白選擇性(20B；NGF＞＞NT3＞BDNF)。目前所示的結合數據利用了各個trkA、B、C或p75-IgG免疫吸附分析。各種變異體的受體結合特性在全-trkA細胞結合分析中加以證實。圖20A和20B顯示了hNGF/hNT3嵌合突變體與trkA-IgG和gp75受體的結合。突變體的相對親和力用競爭性結合曲線上突變體的IC50與hNGF的IC50的比值進行繪製。所示的平均比值來自3次獨立的結合試驗。NGF/NT3N末端結構域交換的突變體(突變體6)導致trkA結合的大部分喪失而gP75結合卻不受影響。這些結果與在4℃於細胞上進行全-trkA結合試驗中獲得的數據是一致的(圖18B、C)。含有NT3的第一個β轉角的嵌合突變體(突變體10和19)與gp75的結合能力低了4倍。用丙氨酸置換第一個β轉角(突變體21)或C末端(突變體24)中的鹼性殘基導致gp75結合的大部分喪失。圖21A和21B顯示了hNGF/hNT3嵌合突變體分別引發trkA酪氨酸激酶自磷酸化和PC12細胞軸突產生的能力。用hNGF、hNT3或hNGF/hNT3結構域交換的嵌合突變體刺激表達trkA的CHO細胞，然後用磷酸酪氨酸-ELISA分析(OD450/650)測定自磷酸化。與trkA結合一致，用N末端hNGF/hNT3嵌合突變體可刺激少量trkA自磷酸化。在前β-轉角1區域(V18、V20、G23)中的結構域交換導致活性降低2-3倍，這表明這些殘基在確定NGF-tr-kA特異性方面可能發揮作用。對於PC12細胞分化，對所有突變體都測定產生軸突的EC50，並以與hNGF的EC50的比值形式表示。同樣，在N末端hNGF/hNT3結構域交換的突變體中觀察到最大效應，但是在前β-轉角1區域也觀察到生物活性的下降，這與trkA結合和自磷酸化是一致的。圖22A和22B顯示了hNGF/hNT3結構域結合突變體的泛神經營養活性。活性通過trkC-IgG競爭性結合和在trkC轉染的PC12細胞中產生軸突試驗而測定。〔125I〕hNT3的競爭性置換僅在hNT3(IC50＝45pM)和可變區4hNGF/hNT3結構域結合突變體(突變體16；IC50＝80nM)中觀察到。類似地，在可變區4中hNGF/hNT3結構域交換導致在trkC轉染的PC12細胞(它對hNGF無應答)中大量產生軸突。比較突變體16的trk依賴性結合、自磷酸化和PC12細胞活性(圖19、20)揭示，內源hNGF樣活性的喪失很少。含有NT3的N末端的N末端結構域交換突變體(突變體6)不與trkC反應。圖23顯示了兩個N末端交換突變體hNT3-NH2/hNGF是突變體6，它在hNGF的骨架上含有hNT3殘基1-6(YAEHKS-)以置換hNGF的殘基1-7。hNGF-NH2/NT3是P2(S1)，它在hNT3的骨架上含有hNGF殘基1-7(SSSHPIF-)以置換hNT3的殘基1-6。圖24A、24B和24C顯示了P2(S1)分別與trkA、trkC和gP75的泛神經營養蛋白受體結合活性。競爭性結合分析是通過用所示的因子將〔125I〕hNGF或〔125I〕hNT3從受體-IgG免疫吸附上置換下來而進行的。含有hNGFN-末端的hNT3的N-末端結構域交換突變體P2(NGF-NH2/NT3)，具有hNGF樣的tr-kA結合活性，也保留trkC活性。NT3-NH2/NGF(突變體6)是含有hNT3的N末端的hNGF(反向N末端結構域交換突變體)，其與trkA的結合力下降並且與trkC不結合。圖25A和25B顯示了P2(S1)分別在正常的表達trkA的PC12細胞和trkC轉染的、hNGF應答性下降的PC12細胞中的泛神經營養蛋白活性。在給定濃度神經營養蛋白或突變體的條件下，具有軸突的PC12細胞的百分比根據天然神經營養蛋白引發的最大應答而校正。P2(NGF-NH2/NT3)在trkAPC12細胞中的EC50是0.4ng/ml(15pM)，在trkC轉染的PC12細胞中是0.2ng/ml(7pM)，這與hNGF和hNT3的EC50類似。圖26A和26B顯示了hNGF點突變體與trkA和gp75受體的結合。突變體的親和性用競爭性結合測定，並且以突變體IC50與天然hNGF的IC50的比值形式表示。對每個突變體hNGF的兩次獨立轉染，至少進行兩次試驗，根據獲得的競爭性結合曲線來確定IC50。列出了各突變體的4-6個獨立測量值的IC50的SD。測試出對結合有影響的hNGF殘基大多是暴露於表面的，這與根據鼠NGF晶體結構而預測的結果一致。圖27顯示了用trkA-自磷酸化ELISA分析測定的hNGF突變體的生化活性。列出了相對於hNGF的EC(EC50＝120pM)的各突變體EC50。對影響潛力最大的突變殘基列出其殘基編號。對自磷酸化程度(效率)有額外效應的突變殘基標上其殘基編號和星號(*)。圖28顯示了選定的hNGF突變體在trkA-PC12細胞軸突產生分析中的生物活性。根據與hNGF應答相比而得的各突變體的軸突產生的EC50比值進行繪圖。列出了效應最大的突變殘基。所有其他的突變體目前都被測試。發明詳述如本領域中所知，本文所用的胺基酸單字符如下表所述表1胺基酸三字符縮寫單字符縮寫丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬醯胺AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC穀氨醯胺GlnQ穀氨酸GluE甘氨酸GlyG組氨酸HisH異亮氨酸IleI亮氨酸LeuL賴氨酸LysK甲硫氨酸MetM苯丙氨酸PheF絲氨酸SerS蘇氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY纈氨酸ValV脯氨酸ProP因此，胺基酸殘基用胺基酸單字符加上殘基位置數目表示。應理解，位置編號對應特定的神經營養蛋白骨架；因此D15ANT3表示，在NT3中15位的天冬氨酸變成丙氨酸。這個在下述的「恆定區」中所發現的天冬氨酸，對應於NGF的16位，因為NGF在其N末端多一個胺基酸，如圖8所示。本發明提供泛向神經營養蛋白。一般，神經營養蛋白是一種在神經系統尤其神經元的發育、調控和維持中所涉及的蛋白質。目前，至少有5種已知的重要神經營養因子神經生長因子(NGF)、神經營養蛋白3(NT3)、神經營養蛋白4(NT4，有時也稱為神經營養蛋白5(NT5)或NT4/5)、腦衍生神經營養因子(BDNF)和睫狀神經營養因子(ciliaryneurotrophicfactor，CNTF)。術語「泛向神經營養蛋白」或「泛向神經營養因子」或語法上的相同術語，在此處指這樣的神經營養蛋白與天然存在的神經營養蛋白不同，它具有多重神經營養蛋白特異性。即，它含有賦予其不同神經營養蛋白特異性的結構域。在一個例子中，這意味著本發明的泛向神經營養蛋白可與各種不同神經營養受體結合。因此，例如對於天然存在的NGF(它是trkA受體的天然配體)，它不能與trkB或trkC受體高親和性地發生可觀的結合；比如NGF與這些受體結合的KD分別比BDNF或NT3的低500-1000倍。然而，泛向NGF(即胺基酸骨架基於NGF的泛向神經營養蛋白)可以至少與trkA、trkB和p75受體結合。或者，泛向NGF可結合trkA、trkC和p75受體。在一個優選例子中，可結合trkA、trkB、trkC和p75受體。類似地，天然存在的BDNF和NT4/5(它們是trkB受體的天然配體)同樣不能與trkA或trkC發生可觀的結合。因此與所述泛向NGF類似，泛向BDNF和NT4/5可與trkB以及trkA、trkC和p75任何組合發生結合。在其他例子中，天然存在的神經營養蛋白與若干種神經營養蛋白受體低親和性地結合。在該例子中，泛向神經營養蛋白可以以比天然發現的親和性更高的親和性與這些受體結合，這種親和性類似在天然配體中所見的親和性。例如，NT3強烈地與trkC結合，但是與trkA和trkB發生弱結合。因此，泛向NT3以正常結合親和性與trkC結合，同時又以類似trkA的天然配體即NGF的親和性與trkA結合，或者以類似trkB的天然配體BDNF或NT4/5的親和性與trkB結合。在優選例子中，泛向神經營養蛋白對神經營養受體的結合親和力至少為天然配體結合親和力的約50-60％，較佳地為約75-80％，最佳地為約90％。因此，泛向NGF會分別以BDNF或NT4/5、或NT3結合的至少50％與trkB或trkC受體結合。該親和性可用各種不同方法測定，這是本領域技術人員所知曉的。優選方法是使用競爭性分析，如文獻(84)和實施例2中所述。一般結合親和力以IC50表示，即抑制50％標記配體結合於受體時未標記競爭物的濃度。在另一些例子中，神經營養蛋白的泛向性不是通過對神經營養蛋白受體的結合親和力方法測定，而是用神經元存活或軸突產生測試分析方法測定。人們知道，所有的神經營養蛋白支持胚胎神經冠衍生感覺神經元的存活〔(77)，(78)，(7)，(17)〕。胚胎交感神經元的存活僅受NGF的支持，而基板衍生的感覺神經元受NT3和BDNF的支持(85)。背根神經節的感覺神經元的存活受NGF和BDNF兩者的支持(13)。NT3引發背根神經節、交感鏈神經節和結狀神經節中感覺神經元的軸突產生，並且支持結狀神經節神經元和背根神經節神經元的存活。因此，神經元存活研究或軸突產生測試可用於確定泛向神經營養蛋白的泛向性。因此，神經營養蛋白特異性可用神經營養蛋白受體結合、神經元存活測試和/或軸突產生測試等方法測定。所以，具有NGF特異性的泛向神經營養蛋白指這樣的神經營養蛋白它至少表現出NGF的結合特性、神經元存活測試特異性或軸突產生測試特異性。類似地，具有BDNF、NT3或NT4/5特異性的泛向神經營養蛋白至少分別表現出BDNF、NT3或NT4/5的結合特性、神經元存活測試特異性或軸突產生測試特異性。在另一例子中，通過構建共價的異源二聚體而製備泛向神經營養蛋白。一般，神經營養蛋白是同源二聚體，它含有兩個以非共價方式相連的相同單體。如下所述，在該例子中，由於各單體含有賦予不同神經營養特異性的結構域，所以被賦予泛向性。或者，通過將特異性不同的兩個不同神經營養蛋白共價相連以形成共價異源二聚體從而產生泛向性。這樣，例如NGF單體可共價連於NT3單體，形成具有NGF和NT3特異性的泛向神經營養蛋白。類似地，可在NGF、NT3、NT4/5、BDNF或CNTF的任何組合中產生共價異源二聚體，以形成具有至少兩種特異性的泛向神經營養蛋白。此外，該程序可對本身已是泛向的單體進行，從而形成泛向的和單一特異性單體的任何組合的共價二聚體。因此，泛向共價二聚體可以是兩個泛向單體的同源二聚體。然而，為了將其包括在本發明的定義之中，泛向的共價二聚體必須具有至少兩種、較佳為3種神經營養蛋白特異性。共價連接最好是核酸直接融合從而形成一個編碼二聚體的單一核酸，這樣當蛋白質被表達時，第一個單體的C末端直接連於第二個單體的N末端。在其他例子中，可以使用接頭，例如甘氨酸、或者甘氨酸和絲氨酸的短重複片段；例如可以使用諸如gly-gly或gly-gly-ser-gly-gly接頭。這可以用本領域公知的技術完成。其他用於蛋白質共價連接的技術是本領域中眾所周知的。泛向神經營養蛋白通過含有賦予神經營養因子受體特異性或結合性的結構域而實現泛向性結合，或者如上所述實現泛向性神經元存活。結構域可用兩種方法中的一種進行定義。在第一種中，結構域是賦予某種神經營養特異性的神經營養蛋白的一部分。在這種情況下，泛向神經營養蛋白的一個單體可含有一個或多個賦予不同特異性的結構域。結構域的大小從一個胺基酸至約10-15個胺基酸不等。結構域可以由除宿主神經營養蛋白之外的不同神經營養蛋白的胺基酸組合而成，即來自一種神經營養蛋白的結構域可以被置換入第二種神經營養蛋白中，從而賦予第二種神經營養蛋白泛向性。或者，如下所述，結構域可以根據胺基酸取代而得出，這些取代並不基於已有神經營養蛋白的同源性。在優選例子中，結構域含有連續的胺基酸序列；即，一段胺基酸被置換。在另一例子中，結構域可由非連續的胺基酸構成；例如是神經營養蛋白中的幾個區域賦予特異性，因此在神經營養蛋白中的幾個位置上置換都是泛向性所需的。在某些例子中，在神經營養蛋白中有一個以上結構域能夠賦予神經營養特異性，這取決於特定的神經營養蛋白。以BDNF為例，它含有多個賦予BDNF特異性的結構域。本發明顯示，在NT3中15位的天冬氨酸轉變為丙氨酸這樣一個胺基酸的改變，會將BDNF特異性賦予NT3。該結構域也可以被引入NGF和NT4/5序列中對應於NT3中15位的相應位置，即NGF中的16位或NT4/5中的18位。應理解，相應胺基酸的確定是通過序列的排列檢查而得出的，如圖8中所示。除了該結構域，在BDNF中含有其他賦予BDNF特異性的結構域。例如，BDNF序列中78-88位(QCRTTQSYVR)的置換，或者93-99位(SKKRIG)的置換都可賦予BDNF特異性(55)。類似地，NT3有多個結構域，當它們被置換入不同的神經營養蛋白時，賦予NT3特異性。已表明，NT3的許多殘基在NT3trkC受體結合以及生物活性測試中是至關重要的。具體地，在R103、D105、K80、Q83、E54、R56、T22、Y51、V97、Y11、E7、R8、E10和R68位置處的突變都與NT3特異性有關，因為在NT3中這些位置的突變會降低NT3活性。其中，K80、Q83、T22和V97位於圖8所示的可變區中，其餘的位於恆定區。此外，在這些殘基附近的殘基也賦予NT3特異性。在某些情況下，在恆定區的變化也可賦予NT3特異性。或者，在R31和E92位的突變會導致NT3結合的增加，具體地，R31A和E92ANT3顯示出trkC結合增加。用下面所述的方法，這些突變可以直接引入除NT3之外的其他神經營養蛋白中。如下所述，可以對這些位置中任何位置上的胺基酸進行改變。NGF有多個結構域，當它們被置換入不同的神經營養蛋白時，賦予NGF特異性。NGF的N末端胺基酸，當其替換NT3的N末端殘基時，可賦予NGF特異性。具體地，NGF的N末端的7個胺基酸(SSSHPIF)可以替換NT3的N末端的6個胺基酸(YAEHKS)，導致具有NGF特異性的泛向NT3。如實施例尤其實施例3中所述，NGF的N末端殘基的確切數目並不重要，尤其在實施例3中，胺基酸4位上的組氨酸對NGF特異性似乎是非常重要的，因此可以互換N末端的約4-10個胺基酸，儘管在某些例子中，單一胺基酸的變化便已足夠了。類似地，已表明NGF的其他許多殘基在NGFtrkA受體結合以及生物活性測試中是至關重要的。例如，有許多殘基，當它們突變時，會導致NGF活性下降。這顯示出殘基對NGF特異性的重要性。這些殘基包括但並不限於H4、P5、V18、V20、G23、D30、Y52、R59、R69、H75、Y79、T81和R103。其中，D30、R59、Y79和T81位於圖8所示的可變區(即在不同神經營養蛋白中有所變化的區域)中，其餘的位於恆定區。在某些例子中，可變區的殘基造成NGF特異性的可能更大，因為恆定區殘基對共同的結構和特性而言是重要的，因而可以不賦予特異性。但是，正如在上述的D15A突變中所見，恆定區的變化也可賦予NGF特異性。此外，在NGF中一些胺基酸的取代會導致NGF結合和/或生物活性的增加。因此，這些取代可以被引入其他神經營養蛋白骨架中以賦予NGF特異性。這些殘基包括但並不限於E11、F12、D24、E41、N46、S47、K57、D72、N77、H84、D105和K115。一旦確定，這些在神經營養蛋白特異性中起重要作用的殘基便可用其他任何胺基酸殘基進行置換，這可用實施例中所述以及本領域中已知的定點誘變技術。一般，待取代的胺基酸可以根據本領域技術人員知曉的特性進行選擇。例如，當特性需要小改動時，一般可根據下表進行置換表2原來的殘基代表性的取代AlaSerArgLysAsnGln，HisAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyProHisAsn，GlnIleLeu，ValLeuIle，ValLysArgMetLeu，IlePheMet，Leu，TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp，PheValIle，Leu功能或免疫特徵的重大改變可以通過選擇那些比表1中所示的保守性更低的取代而實現。例如，可以實現更大地影響下列方面的取代在變化區域多肽骨架的結構，例如α-螺旋或β-摺疊結構；在靶位點上分子電荷或疏水性；側鏈的體積。一般預期會使多肽性質產生最大改變的取代是下列取代(a)親水殘基例如絲氨醯基或蘇氨醯基取代(或被取代)疏水殘基如亮氨醯基、異亮氨醯基、苯丙氨醯基、纈氨醯基或丙氨醯基所取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代(或被取代)其他胺基酸；(c)具有正電荷側鏈的殘基例如賴氨醯基、精氨醯基或組氨醯基，與具有負電荷殘基例如穀氨醯基或天冬氨醯基之間發生取代或被取代；或(d)側鏈體積大的殘基如苯丙氨酸與沒有側鏈的殘基如穀氨酸發生取代或被取代。在一個優選例子中，殘基被改變為丙氨酸殘基。其他位於各種神經營養蛋白中的結構域可以用此處公開的技術加以發現。具體地，實施例1的模型製作(modelling)技術可以鑑別假設的特異性位點。此外，同源性掃描誘變、隨機誘變、盒式誘變技術都可用於產生假設的泛向神經營養蛋白，然後用實施例中及本領域中公知的技術根據與受體的結合而加以篩選。在共價異源二聚體的情況下，結構域也可以指整個神經營養蛋白單體。因此，泛向的共價異源二聚體可以由賦予BDNF特異性的結構域(即BDNF單體)共價地連於賦予NT3特異性的結構域(即NT3單體)所構成。類似地，NT3單體可以與NGF單體配對，或者NGF單體與BDNF單體配對。此外，共價的異源二聚體也可用NT4/5和CNTF單體構成。在這些例子中，結構域是大的，而且一般包括野生型神經營養蛋白胺基酸序列的大部分或全部。在普遍例子中，泛向神經營養蛋白可與至少3種不同的神經營養蛋白受體結合。在優選例子中，泛向神經營養蛋白可與至少4種不同的神經營養蛋白受體結合。此處的術語「神經營養蛋白受體」或其語法上相等詞語，指與神經營養蛋白配體結合的受體。在某些例子中，神經營養蛋白受體是酪氨酸激酶受體家族中的成員，一般稱為「trk」受體，它們在不同的神經元群的表面表達。trk家族包括但並不限於trkA(也稱為p140trk)、trkB(也稱為p145trkB)、trkC(也稱為p145trkC)。在某些例子中，神經營養蛋白受體是p75NGFR，它也被稱為p75或低親和性神經生長因子受體(LNGFR)。應理解，其他的以及未發現的神經營養蛋白受體也可與本發明的泛向神經營養蛋白結合，這一點是本領域的技術人員容易確定的。在優選例子中，泛向神經營養蛋白是泛向的NT3。在這種情況下，泛向NT3是這樣的泛向神經營養蛋白它具有與NT3的胺基酸序列同源的胺基酸序列，並且具有賦予其他神經營養蛋白特異性的結構域。在優選例子中，用結構域取代NT3殘基，即從NT3序列中將某些胺基酸去除，然後用相同或相近數目的胺基酸取代，從而賦予其他的特異性。例如，MNTS-1(多重神經營養特異性-1)泛向NT3含有NGF的前7個胺基酸(它們用於置換NT3中N末端的6個胺基酸)，再加上D15A取代。MNTS-1泛向NT3具有NT3、NGF和BDNF特異性，而且還可與p75受體結合。其他泛向NT3是通過N末端的微小改變而製得的。例如，因為H4和P5在NGF中是保守的，而且在6位和7位的2個疏水性殘基是保守的，因此可以製備下列變異體1)YASHPIF-hNT3；2)YAHPIF-hNT3；3)YASHPIS-hNT3；4)YAEHPIF-hNT3；5)YAQHPIF-hNT3。當添加D15A取代時，得到的神經營養蛋白具有NGF、NT3和BDNF特異性。或者，用NGF的相應區域置換NT3的可變區2或3或4或其組合，可以得到具有NT3和NGF兩種特異性的泛向神經營養蛋白。在一個優選例子中，泛向神經營養蛋白是泛向NGF。在這種情況下，泛向NGF是這樣的泛向神經營養蛋白它具有與NGF的胺基酸序列同源的胺基酸序列，並且具有賦予其他神經營養蛋白特異性的結構域。在優選例子中，用結構域取代NGF殘基，即從NGF序列中將某些胺基酸去除，然後用相同或相近數目的胺基酸取代，從而賦予其他的特異性。例如，可以製備這樣一種泛向NGF，其中引入D16A取代(它賦予BDNF特異性)再加上在前可變區1中的取代(V18E＋V20L＋G23T)和可變區4中的取代(Y79Q＋T81K＋H84Q＋F86Y＋K88R)。或者，在前可變區1中的取代可以與可變區4中僅有的單一胺基酸取代一起；例如可以製備Y79Q、T81K、H84Q、F86Y或K88R之一和V18E＋V20L＋G23T的組合。在一個例子中，泛向神經營養蛋白是泛向的NT4/5。例如通過用NGF的N末端的7個胺基酸置換NT4/5的末端的9個胺基酸，可以賦予NGF特異性。在一個例子中，泛向神經營養蛋白與p75受體的結合可被大大削弱或消除。例如，如圖26所示，有多個胺基酸與p75殘基結合有關，在這些殘基處的突變可導致p75結合下降。在NT3中，在R68、Y11、K73、R114、K115、Y51、K73、R31和H33的突變，以及在NGF中，F12、I31、K32、K34、K50、Y52、R69、K74、K88、L112、S113、R114和K115的突變都可導致p75結合下降。因為如圖8所示，F12、I31、K50、Y52、R69和K74都在神經營養蛋白的恆定區內，所以預計這些胺基酸改變在其他神經營養蛋白中也可改變p75結合性。其他殘基也可加以改變。除了上述的胺基酸變化外，本領域的技術人員知道，在不改變神經營養蛋白的特異性和特性的情況下，可以容忍某些不同的胺基酸序列。因此，與野生型序列相比，泛向神經營養蛋白可以有僅改變序列多樣性而不影響泛向性的胺基酸取代、插入或缺失。在某些情況下，這些突變可能位於對特異性而言至關重要的相同位置上；即在某些情況下，可以在不改變神經營養蛋白特異性的情況下進行中性突變。本發明的泛向神經營養蛋白可用重組技術以多種方式製備。此處的術語「重組核酸」指處於自然條件下不存在的核酸形式。即，重組核酸的側翼的核酸序列在自然界中一般並不位於側翼，或者重組核酸具有在自然條件下不存在的序列。重組核酸最初可以用限制性內切酶對核酸操作，或者用諸如聚合酶鏈反應之類的技術而在體外形成。一旦重組核酸被製備並重新引入宿主細胞或生物體，那麼它便可以非重組地進行複製，即用宿主細胞的體內細胞機制而不是通過體外操作進行複製；然而，這種核酸，一旦是重組產生的，那麼儘管隨後非重組地進行複製，但對於本發明目的而言仍然被認為是重組的。類似的，「重組蛋白」指用重組技術產生的蛋白質，即通過上述重組核酸的表達而產生的蛋白質。重組蛋白與天然存在蛋白的區別至少在於一個或多個特性。例如，可從一般在野生型宿主中相關的部分或全部蛋白質和化合物中分離出該蛋白質。該定義包括從相同或不同的生物體或宿主細胞的生物體中產生泛向神經營養蛋白。例如，可在衍生出該蛋白的相同生物體中製備該蛋白，但是在比一般情況下所見的濃度高得多的情況下製備，例如通過使用誘導型或高表達的啟動子從而提高蛋白的水平。或者，蛋白質處於自然條件下不存在的形式，比如添加抗原決定簇標記或胺基酸取代、插入和缺失。用本發明的編碼泛向神經營養蛋白的核酸，可以製備各種表達載體。表達載體可以是自我複製型的染色體外的載體或整合入宿主基因組的載體。一般，表達載體包括轉錄和翻譯調控核酸，它們可操作地連於編碼泛向神經營養蛋白的核酸。在這種情況下，「可操作地連於」指相對泛向神經營養蛋白的編碼序列而言，轉錄和翻譯調控DNA位於能引發轉錄的位置。一般而言，這意味著啟動子和轉錄起始或開始序列位於泛向神經營養蛋白編碼區域的5′。轉錄和翻譯調控核酸一般與用於表達泛向神經營養蛋白的宿主細胞是相匹配的；例如來自哺乳動物細胞的轉錄和翻譯調控核酸序列可用於在哺乳動物中表達泛向神經營養蛋白。對於各種宿主細胞而言，本領域中已知各種類型的合適表達載體和適當的調控序列。一般，轉錄和翻譯調控序列可以包括但並不限於啟動子序列、信號序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列、終止和polyA信號序列、以及增強子或活化子(activator)序列。在一個優選例子中，調控序列包括啟動子以及轉錄起始和終止序列。啟動子序列是組成型或誘導型啟動子。將一個以上啟動子的元件組合在一起而形成的雜合啟動子在本領域中也是已知的，並且可用於本發明。此外，表達載體可含有其他元件。例如表達載體可具有兩個複製系統，從而可維持於兩種生物體中，例如在哺乳動物細胞中表達，在原核宿主中克隆和擴增。此外，對於整合型表達載體，表達載體應含有至少一段與宿主細胞基因組同源的序列，較佳地含有兩段位於表達構建物兩側的同源序列。通過選擇適當的同源序列並引入載體，可以將整合型載體引入宿主細胞的特定位點。整合型載體的構建物是本領域中已知的。此外，在一個優選例子中，表達載體含有可選擇的標記基因以便選擇轉化的宿主細胞。選擇基因是本領域中已知的，而且可隨所用的宿主細胞而改變。本發明的泛向神經營養蛋白的產生可以通過在適當的條件下，培養用含有編碼泛向神經營養蛋白的核酸的表達載體轉化的宿主細胞，以誘導或導致泛向神經營養蛋白的表達。適合泛向神經營養蛋白表達的條件隨選用的表達載體和宿主細胞而有所不同，這可以由本領域的技術人員容易地確定。例如，在表達載體中使用組成型啟動子需要優化宿主細胞的生長和增殖，而使用誘導型或抑制型啟動子需要適當的用於誘導或抑制的生長條件。在一個優選例子中，泛向神經營養蛋白在表達後被純化或分離。可以用本領域技術人員中熟知的各種方法純化或分離泛向神經營養蛋白，具體方法取決於樣品中存在的其他組份種類。標準純化方法包括電泳、分子、免疫和色譜技術，其中包括離子交換、疏水性、親和性和反相HPLC色譜、層析聚焦。也可以使用與蛋白質濃度結合的超濾和滲濾技術。對於合適的純化技術，可參見文獻(57)。隨所用的泛向神經營養蛋白的不同，所需的純化程度有所不同。在某些情況下，可並不純化。適當的宿主細胞包括酵母、細菌、古細菌(archebacteria)、真菌如絲狀真菌、以及植物和動物細胞包括哺乳動物細胞。特別感興趣的是釀酒酵母和其他酵母、大腸桿菌、枯草桿菌、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、SF9細胞、C129細胞、鏈孢黴屬、和CHO、COS、HeLa細胞、無限增殖的哺乳動物骨髓和淋巴細胞系。優選的宿主細胞是哺乳動物細胞，最優選的宿主細胞包括CHO細胞、COS-7細胞和人胚腎細胞系293。在一個優選例子中，本發明的泛向神經營養蛋白在哺乳動物細胞中表達。哺乳動物表達系統在本領域中也是已知的。當存在內含子時，某些基因的表達會更有效。然而，從缺乏拼接信號的載體中已經有效地表達了數種cDNA。因此，在某些情況下，編碼泛向神經營養蛋白的核酸可含有內含子。將外源核酸引入哺乳動物宿主以及其他宿主的方法在本領域中是眾所周知的，並且隨所用的宿主細胞而有所變化，其中包括葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉澱法、polybrene介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、將聚核酸包裹在脂質體中、以及將DNA直接微注射入核中。在一個例子中，泛向神經營養蛋白在酵母細胞中產生。酵母表達系統在本領域中是眾所周知的，其中包括用於下列酵母的表達載體釀酒酵母、白色念珠菌和麥芽糖假絲酵母(C.maltosa)、多形漢遜氏酵母(Hansenulapolymorpha)、脆壁克魯維氏酵母(Kluyveromycesfragilis)和乳克魯維氏酵母(K.lactis)、吉利蒙德氏畢赤酵母(Pichiaguillerimondii)和巴斯德畢赤酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和Yarrowialipolytica。將外源核酸引入酵母宿主以及其他宿主的方法在本領域中是眾所周知的，並且隨所用的宿主細胞而有所變化。在一個例子中，泛向神經營養蛋白在細菌系統中產生。細菌表達系統在本領域中是眾所周知的，其中包括用於下列細菌的表達載體枯草桿菌、大腸桿菌、乳脂鏈球菌(Streptococcuscremoris)和Streptococcuslividans。將細菌表達載體轉化入細菌宿主細胞可以用在本領域中眾所周知的技術如氯化鈣處理、電穿孔和其他技術。在一個例子中，泛向神經營養蛋白在昆蟲細胞中產生。用於轉化昆蟲細胞尤其基於杆狀病毒的表達載體是本領域中眾所周知的。用於杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統的材料和方法可以試劑盒形式購得，例如來自Invitrogen(SanDiego)的「MaxBac」試劑盒。已經開發出用於感染若干種昆蟲細胞的重組杆狀病毒表達載體。例如，已開發出用於埃及伊蚊(Aedesaegypti)、苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)、中國桑蠶(Bombyxmori)、黑猩猩果蠅(Drosophiamelangaster)、草地(貪)夜蛾(Spodopterafrugiperda)、和粉紋夜蛾(Trichoplusiani)的重組杆狀病毒。一旦表達，泛向神經營養蛋白可用作神經營養因子。這些泛向神經營養蛋白可用於各種診斷和治療用途。本發明的泛向神經營養蛋白可用於檢測神經營養蛋白受體的診斷方法。例如，本發明的泛向神經營養蛋白可被標記。此處的術語「標記的泛向神經營養蛋白」指這樣的泛向神經營養蛋白它有至少一種元素、同位素或附著的化學物質從而能夠檢測泛向神經營養蛋白或與神經營養蛋白受體結合的泛向神經營養蛋白。一般，標記物分成3類a)同位素標記物，它是放射性的或重同位素；b)免疫標記物，它是抗體或抗原；c)著色或螢光染料。標記物可以摻入在泛向神經營養蛋白的任何位置。一旦被標記，泛向神經營養蛋白可用於檢測神經營養蛋白受體，無論在體外或體內。例如，神經營養蛋白受體的存在可以指示某種細胞類型的存在，這在診斷中是有用的。即標記的泛向神經營養蛋白通過受體與細胞結合，可以顯示一亞群的某種類型細胞。此外，本發明的泛向神經營養蛋白可用作神經營養蛋白測定的標準物。例如，在某個特定測定中分析神經營養蛋白的活性可用已知的神經營養蛋白標準加以測定，然後可將泛向神經營養蛋白用於診斷和神經營養蛋白的定量。此外，本發明的泛向神經營養蛋白可用作培養活體神經細胞的培養基中的組份，因為許多神經細胞培養需要生長因子。正如本領域技術人員所知曉的那樣，本發明的泛向神經營養蛋白可用於替換通常用作培養基組份的其他神經營養蛋白。泛向神經營養蛋白的加入量可用標準分析方法輕易確定。本發明的泛向神經營養蛋白也可用於產生抗體，它們可用於生物體或病人中神經營養蛋白或神經營養蛋白抗體診斷、鑑別和定位。例如，如本領域技術人員所知，泛向神經營養蛋白可用於製備多克隆或單克隆抗體。然後標記抗體並用於檢測神經營養蛋白的存在與否。因此，可以檢測與神經營養蛋白關聯的神經性疾病的診斷。或者，抗體可非直接地用第二級抗體檢測。例如，可在鼠或兔中製備第一級抗體，然後用標記的抗-鼠或抗-兔抗體來檢測第一級抗體。這兩種方法中的任一種以及本領域中已知的類似方法，都可在各種組織中檢測神經營養蛋白。此外，產生的針對本發明泛向神經營養蛋白的抗體也可用於純化神經營養蛋白和泛向神經營養蛋白。因為一般而言泛向神經營養蛋白的胺基酸取代是小規模的，因此許多免疫抗原決定簇是神經營養蛋白和泛向神經營養蛋白所共有的。因此，產生的針對泛向神經營養蛋白的抗體可與天然存在的神經營養蛋白結合，因而在純化中是有用的。例如，可使用基於親和色譜技術的純化分案，這是本領域中眾所周知的。在一個優選例子中，本發明的泛向神經營養蛋白可施用於病人以治療神經性疾病。此處的術語「神經性疾病」指與神經元退化或損傷相關的中樞和/或外周神經系統的疾病。神經性疾病的具體例子包括但並不限於Alzheimer病、Parkinson病、Huntington舞蹈病、中風、ALS、外周神經病變和其他特徵為神經元壞死或喪失的病症，無論是中樞的、外周的還是運動神經元(motorneuron)，除了治療因外傷、燒傷、腎衰竭或受傷造成的神經損傷之外。例如，與某些病症相關的外周神經病變如與糖尿病、AIDS或化療相關的神經病變可用本發明的泛向神經營養蛋白治療。此外，在模擬Alzheimer病中發現的細胞喪失方式的模型中，施用NT3可防止成人中樞中藍斑位置處去甲腎上腺素能神經元的退化(86)。此外已表明，添加NT3可增加發育中皮質脊髓束的萌發，以及成年脊髓索損傷後的萌發(58)。事實上，當NT3和抑制髓鞘相關生長抑制蛋白的抗體一起施用時，觀察到長距離的再生。因此，本發明的泛向神經營養蛋白在該用途中可替代NT3。在這種例子中，將治療有效量的泛向神經營養蛋白給病人施用。此處術語「治療有效量」指產生施用效果的劑量。確切的劑量將取決於被治療的疾病，而且可由該領域的技術人員用已知技術確定。一般，本發明的泛向神經營養蛋白的施用量為約1微克/千克至約100毫克/千克每天。另外，如本領域中所知，需要根據年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、施用時間、藥物相互作用和疾病嚴重程度等情況加以調節，這可由該領域的技術人員通過常規試驗而確定。在本發明中「病人」包括人和其他動物及生物體。因此，這些方法可用於人的治療和獸用。本發明的泛向神經營養蛋白的施用可用多種方法進行，其中包括但並不限於口服、皮下、靜脈、腦內、鼻內、透過皮膚、腹膜內、肌內、肺內、陰道給藥、直腸給藥和眼內給藥等。泛向神經營養蛋白可通過融入CNS的流體儲藏體中而連續施用，儘管丸藥注射也是可以接受的(使用本領域公知的技術例如泵或植入法)。在某些情況下，比如在處理傷口時，泛向神經營養蛋白可直接以溶液或噴霧形式施用。本發明的藥物組合物含有泛向神經營養蛋白，它處於適合給病人施用的形式。在優選例子中，藥物組合物是水溶性形式，並且可以含有諸如載體、賦形劑、穩定劑、緩衝液、鹽分、抗氧化劑、親水聚合物、胺基酸、碳水化合物、離子或非離子表面活性劑、聚乙二醇或丙二醇等。泛向神經營養蛋白也可以用本領域已知的技術以緩釋形式植入，或者以微囊形式包埋。下列實施例用於更充分地闡述使用上述發明的方式，並舉出實施本發明各方面的最佳形式。應理解這些實施例不以任何方式限制本發明的實際範圍，而是用於闡述目的。實施例實施例1構建NT-3的分子模型和確定突變分析的目標殘基從N.Q.McDonald和T.L.Blundell獲得鼠NGF三維結構的坐標。在Sili-conGraphicsIrisWorkstation上，利用InsightII反應程序構建NT-3的分子模型。利用MidasPlus程序產生代表性的NT-3結構。(UniversityofCaliforniaatSanFrancisco)。如果獲得了鼠NGF(mNGF)的三維結構(59)，利用蛋白質工程技術來獲取神經營養功能的結構基礎的合理方法將成為可能。mNGF的結構為兩條相同胺基酸多肽鏈緊密締合而成的二聚體。由扭曲的、交替連接的反平行β-摺疊延伸片段形成各單體的摺疊。分子為長形，具有平坦的疏水性表面，此表面構成締合單體的界面(59)。此結構的突出特徵是二硫鍵的分布，現在已知是半胱氨酸-結基元(60)。在不相關的TGF-β〔(61)；(60)〕和PDGF-BB(87)中也發現了這種基元。mNGF結構中的幾個區域，包括氨基端和羧基端以及殘基43和48之間的環並不十分確定，這表明它們是高度可變的結構元。人NT-3(hHT-3)的序列與mNGF(圖1)具有56％的相同性和70％的相似性。序列差異集中在結構不確定的N-末端和殘基43至48之間的環。在神經營養蛋白家族的全部成員中，半胱氨酸的相對位置是保守的，這表明在hNT-3中存在著類似的半胱氨酸一結基元。hNT-3和鼠NGF之間的相似性表明兩者具有相同的基本三維摺疊結構，所以，mNGF可以用作hNT-3模型的支架。在構建模型的第二步，通過InsightII程序(BiosymTechnology，SanDiego，CA)，用hNT-3的胺基酸來替換mNGF與hNT-3之間不相同的側鏈。如果可能，hNT-3側鏈的構象被保持與mNGF的相似，否則，它們將根據對旋轉異構體庫(62)及壓縮和氫鍵的考慮。最後，根據ProteinDataBank中對晶體結構的研究，插入Asn93並調整環93-95。最終模型由104個胺基酸構成，其中不包括N端的6個(Tyr1-Ser6)和C端的4個(Ile116-Thr119)以及成環的5個殘基(G44-V48)。此模型可以確定可能涉及重要結構內容的殘基，從而使它們從突變分析中被排除。這些殘基不涉及界面(W20、F52、Y53、W99、W101)、具有結構重要性的氫鍵和疏水鍵(S12、I30、Q50、P62、883、R100、T106、S107)和二硫鍵(C15、C57、C67、C79、C108、C110)，也不包埋在蛋白質的內部(V13、S16、S18、V21、D29、I30、V35、V37、I102、I104)。但是，有時會希望改變這些殘基。另外，除了Gly44，甘氨酸和丙氨酸都是不變的。與mNGF/trkA相互反應的相關研究相反，取代的主要是單個殘基或胺基酸對，而不是替換多個殘基(53)(56)(55)或去除殘基(49)。殘基多數被替換成丙氨酸(64)。有時，為了潛在地給受體配體反應製造空間障礙，可以在結構中引入較大的胺基酸作為替換。第一套突變作用探測保守和非保守殘基，主要位於β鏈，即暴露在外而可能涉及與trkC和gP75受體結合的表面。有關NGF功能的現有假設(55)認為連接β鏈與末端的環中的不同殘基是受體結合和特異性的主要決定簇。第二套hNT-3突變體評價這些殘基對hNT-3與其受體之間反應的重要性。全套突變基本覆蓋了NT-3分子的整個表面。實施例2NT3和泛向NT3的特異性胺基酸取代先期，人NT-3被克隆、測序和亞克隆入pRK型載體，由此能夠在E.coli中產生雙鏈和單鏈的DNA，並在哺乳動物體系中在巨細胞病毒啟動子的調控下表達成熟的NT-3(65)。根據Kunkel的方法(66)(67)進行該載體上的誘變。在轉化入E.coli菌株XL1-Blue後，利用Sequenase2.0版試劑盒(U.S.Bio-chemicalCorp.)，通過測序單鏈DNA來篩選有所需突變的菌落。對全部陽性克隆檢驗成熟NT-3的全部編碼序列。利用QIAGENDNA純化試劑盒(QiagenInc.，ChatsworthCA)從XL-1Blue中分離雙鏈DNA。然後用此DNA轉染人胚腎細胞系293(68)。其它重組DNA操作均按文獻(69)所述。使用已知技術來產生所有突變的引物。D15A突變的引物是GGTCACCCACAAGCTTTCACTGGCACATACCGAG(SEQ.ID.No.7)，S1突變體(以NT-3的6個N末端胺基酸替換NGF的7個N末端胺基酸的N末端替換)的引物是GTACTCCC-CTCGGTGGAAGATGGGATGGCTCGAGGACCGTTTCCGCCGTG(SEQ.ID.No.8)。野生型和突變型神經營養蛋白的表達通過磷酸鈣沉澱，將含有hNT-3或突變型hNT-3的質粒DNA引入人胚腎細胞293(70)。用10μg質粒DNA/15mm細胞培養皿轉染75％匯合的細胞，並在含血清的培養基中培養15小時。然後，去除培養基，換以補充了10mg/l重組牛胰島素、1mg/l運鐵蛋白和微量元素的無血清培養基(PSO4)。48小時和96小時後，收集由centriprep-10filtrationunites(Amicon，BeverlyMA)濃縮了約20倍的上清液，並過濾滅菌。神經營養蛋白突變體的定量利用豚鼠的蛋白質A純化抗血清(Genentech)進行特異性hNT-3的ELISA。96孔微量滴定板(MaxiSorp；Nunc，Kamstup，Denmark)的每一孔包被溶於0.05M碳酸鈉緩衝液(pH9.6)的抗血清(4μg/ml)100μl溶液，於4℃過夜。用封閉緩衝液(PBS＋0.5％BSA＋0.01％乙基汞硫代水楊酸鈉，pH7.4)封閉1小時後，用ELISA緩衝液(PBS＋0.5％BSA＋0.05％Tween－20＋0.01％乙基汞硫代水楊酸鈉，pH7.4)洗孔6次。將純化的hNT-3或濃度未知的hNT-3突變體樣品在ELISA緩衝液中稀釋至100μl，然後加入孔中。微量滴定板在室溫下連續振蕩培養2小時。用ELISA緩衝液洗滌後，測試孔中加入100μl經生物素標記的抗hNT-3抗體(Genentech)培養2小時，再用ELISA緩衝液洗滌。在測試孔中加入100μl稀釋比為1∶50000的鏈黴親和素/辣根過氧化物酶(Zymed，43-4323)，培養30分鐘，然後用ELISA緩衝液洗滌。最後，使用100μl含0.012％H2O2和0.04％鄰苯二胺的PBS溶液顯色15-20分鐘。加入50μl4.5NH2SO4來終止反應。在Vmaxkineticmicroplatereader(MolecularDeveces，PaloAltoCA)上，在490nm和405nm讀取吸光度。利用濃度為50、25、12.5、6.25、3.13、1.56和0.78ng/ml的純化重組hNT-3(Genentech)確定標準曲線。連續稀釋濃度未知的NT-3樣品1∶10、1∶30、1∶90、1∶270、1∶810、1∶2430、1∶7290和1∶21870，以獲取每份樣品的多個數據點。利用標準物蛋白質試驗獲得的數據點的4參數擬合法確定標準曲線。濃縮後，NT3突變體量在120ng/ml至36ng/ml之間。ELISA測試在模擬轉染細胞的上清液中未測得NT3，而且此檢測不與NGF轉染細胞上清液中的重組NGF發生交叉反應(數據未示)。對於每次NT3突變體的表達，平行進行一次天然hNT3的表達和定量，以獲取用於受體結合研究的可比野生型濃度。對全部突變體進行至少2次表達、定量和分析。碘化用改良的Enzymobeadradioiodinationreagent(Bio-Rad)方法(71)，通過乳過氧化物酶處理來標記純化的hNT-3，hBDNF和hNGF(Genentech)。通常，將2μg神經營養蛋白碘化至比活性3000至3500cpm/fmol。標記後的材料保存於4℃，在製備後的2周內使用。結合試驗以細胞為基礎的結合試驗使用取自表達鼠trkC(NIH3T3/trkC，(26))的穩定細胞系的細胞膜製劑。根據已有描述(26)進行競爭性取代試驗。取一組重複數據，對多重表達的每一種突變體進行兩次與trkC受體結合親合性試驗。此方法能夠估計各種突變體親合性測定的誤差。瞬時表達細胞中的非純化重組NT-3就其從NIH/3T3細胞表達的trkC受體上取代125-I標記的NT-3的能力與純化NT-3進行比較。兩者的取代率相似，非純化NT-3的IC-50為7pM，純化NT-3的IC-50為9pM。這表明，293表達細胞上清液中的非純化NT3能夠被精確定量，由此可以用於受體結合研究。NGF、BDNF和模擬轉染細胞上清液不能從trkC上取代已結合的NT-3(數據未示)，由此證明了此結合試驗的特異性。將人trkA、trkB、trkC和gp75的胞外域與免疫球蛋白的恆定區融合，由此構建受體免疫粘附素(Genentech，未公開的研究結果)。用100μl5μg/ml山羊F(ab′)2抗人FcIgG(OrganonTechnika，WestChester，PA)包被緩衝液溶液包被一96孔的微量滴定板(Corning，ELISAwellstrips)，在4-8℃放置15小時。吸淨測試孔，用PBS洗滌3次，然後加入100μl40ng/ml受體免疫粘附素蛋白的結合緩衝液(補充以5mg/mlBSA(Intergen，Purchase，PA)、0.1mg/ml馬心細胞色素C(Sigma)和20mMHEPES的Leibovitz’sL15培養基，pH7.2)溶液，培養2小時。用PBS洗滌後，立刻加入50μl結合緩衝液以防變幹。用結合緩衝液連續稀釋天然和突變體蛋白儲備液，使得濃度在4096-2pM範圍內。每孔加入25μl連續稀釋液，然後加入25μl標記過的神經營養蛋白。每孔中標記過的神經營養蛋白的最終濃度，在trkA、trkB和trkC試驗中是50pM，在gp75結合試驗中是100pM。室溫培養3小時後，用PBS＋0.5％Tween-20洗孔，計算被結合的放射活性。利用Kaleigraph軟體包，使用4參數擬合法對全部取代試驗進行分析。條柱圖中的全部結合結果均表示為IC-50突變型/IC-50野生型。神經營養因子對PC12細胞系上trk受體的自磷酸化的刺激用25ng/ml神經營養蛋白在37℃對約1×107個細胞處理5分鐘。根據已有描述(26)用抗血清443(泛向trk)或656(trkC特異性)進行NP-40平板裂解和免疫沉澱。根據已有描述(23)，用單克隆抗體4G10，通過Western轉移分析磷酸酪氨酸的濃度。根據已有描述(26)檢測4G10。PC12細胞和表達trkB和trkC的PC12細胞的分化試驗將約103個表達不同trk家族成員(trkC；(26)trkB；Soppet，未公開的觀察結果)的PC12細胞平板培養在總共含2ml培養基的35mm包被膠原蛋白的組織培養皿中。對表達trkC的PC12細胞進行3種濃度(10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml)的試驗，用10ng/ml的NT-3突變體上清液對只表達trkA的親代PC12細胞或表達trkB的PC12細胞進行試驗。每一種處理，至少計數200個細胞。3-4天後，通過計數含有至少兩倍於細胞體長度的軸突部分的細胞個數，測定帶軸突細胞所佔比例。胚胎組織和神經元培養物的解剖將白色Leghorn小雞的卵(SPAFAS，Reinholds，PA)於38℃在卵孵化箱中孵育規定的時間，由此獲取不同發育階段的小雞胚胎。在含1×青黴素/鏈黴素的培養基中，用修表鑷子和電解切削的鎢針解剖胚胎期第8天的背根神經結、節狀神經結和胚胎期第11天的交感神經結。雞胚神經結在37℃用胰蛋白酶消化20分鐘，然後在培養基(F14，含10％熱失活馬血清和5％熱失活胎牛血清)中洗滌，然後用灼燒拋光的吸管將其溫和搗碎成單細胞懸浮液。雞胚細胞平板培養在包被聚鳥氨酸(0.5mg/ml，溶於pH8.6的0.15M硼酸緩衝液，放置過夜)和層粘連蛋白(20ml/ml，37℃放置4-6小時)的35mm培養皿中，培養皿含有2ml培養基，有2ng/ml神經營養蛋白，濃度或者如本文中所述。72小時後，計數每個培養皿中部的5×5格內所有具有神經元形態的細胞。結果列於表3和4。表3突變表達trkC-結合gp75-結合軸突延伸自磷酸化(IC50突變體/IC50野生型)IC50突變體/IC50野生型)PC12PC12(佔野生型的百分NIH3T3IAIAtrkCtrkBtrkAtrkC比)人NT-31001.00±0.081.00±0.091.00±0.1+--++b-鏈D15A260.63±0.200.69±0.071.00±0.02++-++E17A/L19A50.95±0.10+--++T22Q423.28±0.733.55±0.450.87±0.04+--+D23A660.66±0.21+--++K24A31.44±0.141.23±0.15+--+S25Q1140.86±0.13+--++S26K1160.77±0.27+--++S25K/S26Y970.63±0.06+--++I28Q361.17±0.13+--N.D.T36E2890.97±0.26+--++L38E41N.D.1.25±0.23N.D.N.D.N.D.N.D.E40A2510.44±0.08+--++Y51A4＞15.0021.52±2.3218.00±1.10---+Y51F591.25±0.22+--++E54A32.99±1.621.40±0.05+--N.D.R56A112.32±0.891.80±0.29+--++V63A3801.12±0.130.72±0.01+--++R68A671.46±0.281.55±0.56118.20±46.40+/---++K80A/Q83A122.32±0.512.72±0.171.81±0.06+--+R87M270.93±0.20+--++L89E1N.D.1.18±0.40N.D.N.D.N.D.N.D.S91M491.15±0.25+--++S91E851.54±0.12+--++S91A/E92A350.55±0.17+--N.D.V97E391.82±0.351.53±0.131.34±0.17+--++R103A/D105A74＞100.00130.00±37.01.22±0.12----R103A426＞100.0082.00±36.002.19±0.35----R103M1001.95±0.231.89±0.331.60±0.10+--+R103K102＞100.00117.00±19.000.90±0.12----D105A750.67±21+--++氨基端和羧基端H4A/H7A/R8A/E10A4614.15±0.813.70±0.071.80±0.30+--++(N1)NGF-替換(S1)18N.D.1.00±0.330.82±0.15+N.D.+++(YAEHKS＞SSSHPIF)E3A2510.68±0.18+--++H4D348N.D.1.35±0.13N.D.N.D.N.D.N.D.E3A/K5A/S6A(N2)2001.65±0.68+--++Y11A1013.34±0.234.17±1.2757.94±23.91+--++R114A/K115A1461.05±0.121.38±0.18182.66±37.37+--++環和順序R31A/H33A/Q34A0N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.R31A740.38±0.128.45±2.18+--N.D.H33A81N.D.1.17±0.202.01±0.73N.D.N.D.N.D.N.D.Q34A1761.05±0.05+--N.D.Q34E1661.04±0.34+--N.D.R42A/T43A861.28±0.26+--++N45A/S46A/K49A/Y51A0N.D.N.D.N.D.N.D.N.D.G44A881.17±0.13+--++N45A2400.88±0.12+--++S46A2650.95±0.22+--++P47A1090.64±0.21+--++V48A300.62±0.06+--++K49A311.06±0.21+--++E59AR61A1041.21±0.09+--++K58A/E59A/R61A1101.68±0.771.5±0.391.31±0.01+--++K64A/N65A/D72A521.13±0.26+--++D71A/H74A/N76A50.65±0.200.60±0.06+--++D71A/K73A/H74A430.98±0.375.54±1.85+--++Q78A801.24±0.26+--++N93A/N94A/L96A551.01±0.17+--++K95A1221.13±0.341.13±0.13+--++NGF替換(S2)870.96±0.09+--++(ENNKLVG＞DGKQAA)表4神經營養蛋白DRGNGSYMP(佔NT-3＋BDNF＋NGF的百分比)(佔NT-3＋BDNF的百分比)(佔NGF的百分比)NT-312.9±1.941.8±11.61.1±0.5BDNF35.4±1.665.4±19.7N.D.NGF53.7±2.8N.D.100.0±3.7NT-3＋BDNF53.7±2.2100.0±1.8N.D.NT-3＋NGF66.5±0.6N.D.N.D.NT-3＋BDNF100.0±0.8N.D.N.D.＋NGFD15A11.4±0.446.6±10.01.4±0.6S169.3±4.546.0±12.491.9±5.7MUTS-193.0±5.686.4±12.4100.3±6.7實施例3N末端NGF變異體的產生、純化和鑑定NGF蛋白中的幾個帶電和不帶電殘基對其它種類來說是保守的。具體地說，8個已知NGF序列中7個的His4、Pro5和His8是保守的；Arg9隻存在於人和雞的NGF中，其它種類NGF中的此位置多數是Met。通過寡聚核苷酸指導的誘變產生了10種突變體1)用丙氨酸單獨或集合替換hNGFN末端的部分帶電殘基，2)用位於N末端hBDNF序列位置3的帶負電的天冬氨酸替換His4(65)或者3)產生具有hBDNF的前5個殘基或hNT3的前6個殘基，或其它可以得到hNT3可變區的嵌合hNGF分子。形成的突變體構建物載體含有人CMV啟動子的載體，在人293細胞中瞬時表達，如下所述。按Burton等(1992)(48)和Kahle等(1992)(49)所述，利用反相HPLC和高性能離子交換色譜從被轉染的CHO細胞系條件培養基中純化的純化重組子(1-118)、(6-118)和(10-118)，然後利用N末端序列分析、SDS-PAGE和胺基酸分析進行鑑定(數據未示)。通過在調節CHO細胞培養基過程中利用至今未知特性蛋白酶的原位蛋白酶解或利用加工途徑來產生這些經加工變異體。根據SDS-PAGE，每一種形式的純度為99％，並利用定量胺基酸分析來測定其濃度。根據對N末端截短變異體的有關描述，從無血清的轉染293細胞的條件培養基(參見下文)中純化和分析H4D突變體2(由300ml培養基得20μg)和N末端hNT3/hNGF突變體6(由300ml培養基得5μg)。修改BioRadMuta-Gene試劑盒中的指示(66)(BioRadRichmond，CA)，利用寡聚核苷酸定向法(72)進行誘變。利用鏈終止法，通過單鏈噬菌粒克隆的DNA測序來檢驗突變體(73)。在瞬時轉染人293細胞後，在條件培養基中表達hNGF突變體(68)(70)。用於收穫的培養基是補充有N2的50∶50F12/DMEM無血清培養基，在無血清培養基中培養48小時後進行收穫。用Amicon濃縮機將條件培養基濃縮10倍。通過利用純化的兔抗hNGF多克隆抗體的酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定hNGF突變體的濃度。各突變體的濃度為3至8μg/ml。每個突變體至少進行3次表達，並在2-3個不同的時間通過ELISA測定濃度。還利用通過添加200μCi35S-甲硫氨酸和半胱氨酸(Amersham)代謝標記轉染的293細胞(60mm平板，1.2ml培養基)來分析突變體。18小時後，收穫培養基，在4℃與兔抗hNGF多克隆抗體或鼠單克隆抗體反應3-4小時，用蛋白A珠(Pharmacia)沉澱收穫，然後上樣在15％的丙烯醯胺SDS-PAGE凝膠(Novex)上，電泳後，乾燥凝膠然後置於X光膠片上。如上所述產生非放射性標記的突變體，凍幹成0.1μg的等份，重溶在SDS-PAGE樣品緩衝液中，在相同的凝膠上電泳，按標準法轉移到硝酸纖維素膜上(BioRad)。印跡用兔抗hNGF多克隆抗體或鼠抗hNGF單克隆抗體在4℃處理過夜，洗滌，然後用偶聯了鹼性磷酸酶的山羊抗兔或抗鼠IgG抗體檢測突變體。受體結合、trkA自磷酸化和PC12軸突產生試驗根據Escandon的方法(71)，利用Enzymobead法(BioRad)產生〔125I〕hNGF。經對起始反應混合物和凝膠過濾色譜後的〔125I〕hNGF進行TCA沉澱測定，比放射活性一般為60-90μCi/μg。如對表達trkB的NIH3T3細胞的有關描述(23)，在4℃，在重組表達兔trkA的NIH3T3細胞(Dr.LuisParada提供)上，表達p75的人A875黑素瘤細胞(ATCC)上和兔細胞PC12(Dr.LuisRe-ichardt提供)上，將受體結合試驗進行過夜。NIH3T3-trkA細胞和A875-p75細胞的使用濃度為1×106細胞/ml；PC12細胞為5×105細胞/ml。〔125I〕hNGF的最終濃度為50pM，體積為0.2ml。利用濾紙結合試驗，NIH3T3trkA細胞的非特異性結合，即1×10-6M未標記hNGF存在時的結合〔125I〕hNGF，為15-25％。p75-A875細胞為20-35％，trkA＋p75PC12細胞為20-30％。將數據擬合成取代等溫線，利用Kaleidagraph程序中的4參數方程計算IC50。有時，受體結合試驗在25℃進行90分鐘，利用蔗糖梯度離心將結合的〔125I〕hNGF與游離的分離。trkA的自磷酸化在37℃進行5分鐘，利用Kaplan(19)描述的改良方法(19)測定磷酸化程度。利用瓊脂糖珠固定化的抗磷酸酪氨酸單克隆抗體4G10(UBI)免疫沉澱三硝基甲苯X-100(TritonX-100)裂解的trkA細胞，SDS-PAGE電泳(8％丙烯醯胺-Novex)，免疫印跡，用兔抗trkA多克隆抗體(Dr.DavidKaplan提供)檢測。利用偶聯了鹼性磷酸酶(AP)的山羊抗鼠IgG抗體(TAGO)測定trkA。在Primaria聚陽離子24孔微量滴定板上培養PC12細胞至匯合20-30％，將培養基換成高葡萄糖的無血清DMEM，其中補充了N2，並含有hNGF的野生型或突變型變異體。48小時後，在代表性目測區域計數軸突超過兩倍細胞體長的細胞個數，表示為其佔此區域總細胞數的百分率，總數通常為100-140個細胞。各種突變體和NGF對照的活性至少在不同試驗中測定2次。根據13次的測定，最大hNGF濃度時的應答細胞比例為55-75％，平均值為63％。考慮到不同試驗中最大應答的變化，用該平均值校正全部數據。hNGF單克隆抗體對〔125I〕hNGF與trkA和p75結合的抑制在與濾紙結合試驗相同的條件下，提高抗hNGF單克隆抗體的濃度，將它們加入25pM的〔125I〕hNGF中，在25℃孵育30分鐘。然後，加入每毫升1×106個NIH3T3-trkA或A875-p75細胞(最終體積為0.2ml)，在4℃孵育過夜，期間劇烈混合。然後將樣品稀釋，並在WhatmanGF/C濾紙上過濾，再計數。結果結果列於表5和表6。表5hNGF結構突變體的相對受體結合親合度表6NGF結構突變體的生化及生物活性表a.按照試驗步驟中所述和對圖2和圖5的說明，在1×10-10、1×10-9和1×10-8M進行TrkA自磷酸化。以上數值代表的是用hNGF結構變異體刺激NIH3T3-trkA細胞後，自身磷酸化p140trkA條帶的密度計面積與(1-118)hNGF(截短的hNGF)或野生型hMGF(突變體)之比。b.根據試驗步驟中所述，和對圖6的說明，根據軸突生長來測定PC12細胞的分化。由圖6中的數據得出EC50和比值，它們代表的是每一突變體兩個單獨試驗的平均值。為了開始測定hNGF完全活性所必需的N末端胺基酸，由重組表達hMGF的CHO細胞的條件培養基中分離出hNGF的截短形式(6-118)。由限制性蛋白水解(48)產生9個胺基酸截短的形式(10-118)。(6-118)和(10-118)hNGF由高性能離子交換色譜(HPIEC)純化，反相HPLC鑑定，N末端序列分析，SDS-PAGE，和胺基酸分析(數據未示)。然後，將純化的(6-118)hNGF取代表達trkA，p75和trkA＋p75的細胞上〔125I〕hNGF的相對能力與(10-118)hNGF、(1-118)hNGF或(1-120)hNGF、和(1-118)mNGF相比(圖9)。根據它們生物活性方面的相當性(74)，初期試驗未表現出(1-118)與(1-120)hNGF之間的結合特性差異。hNGF與trkA(80-100pM)、p75(2-300pM)和PC12細胞(50pM)的相對IC50與其它IC50和Kd報導值(49)(75)(76)(20，21)相差在2至3個因數內。與Vroegop等一樣，我們發現hNGF與p75的親合性略高於一般報導值(IC50＝0.3nM對1-2nM)。前5個胺基酸缺失導致與重組表達鼠trkA的NIH3T3細胞的結合降低9倍，而與表達p75的A875人黑素瘤細胞或表達trkA＋p75的PC12細胞中幾乎沒有差別，前者無變化，後者降低3倍。相反，與(I-118)hNGF相比，(10-118)hNGF與trkA和PC12細胞的結合分別下降265和82倍，與p75的結合下降10倍。相對於trkA和PC12細胞，(10-118)hNGF對BC12細胞具有中等強度的取代能力，這顯示兩種受體對取代等溫線形狀的影響(圖9C)。在本研究中使用的是重組表達鼠trkA的細胞和放射性碘標記的人NGF，但Kahle等的一個先前(10-118)hNGF研究中使用的是人trkA表達細胞和放射性標記的鼠NGF。所以，不管分析中使用的是人的還是嚙齒類的trkA或放射性標記的NGF，都可觀察到相似的(1-118)hNGF與(10-118)hNGF的結合差異。此外，不論是用人或鼠的NGF為可取代示蹤物，(1-118)hNGF與人或鼠trkA的親合性比(1-188)mNGF大2-3倍。(6-118)hNGF誘導的trkA自磷酸化(圖10)和PC12細胞的分化活性(表6)，與(1-118)hNGF誘導的相似。但是，(10-118)hNGF與(1-118)hNGF相比，其在trkA自磷酸化中的能力低至少10倍，而在刺激PC12軸突產生中低80倍(圖10，表6)，這與過去的結果一致(48)(49)。綜合起來，這些結果表明，N端的前5個胺基酸對完全的hNGF-tr-kA結合活性是重要的，但它們的缺失能夠保留大部分受體激活活性和生物活性。繼續缺失其後的4個胺基酸對trkA結合和激活作用的不利影響更嚴重，同時對與p75的結合有一定的影響。通過免疫沉澱後的代謝標記，或對非標記條件培養基的免疫印跡分析可檢測hNGF突變體形式，其表現為經完全加工的14KD的多肽(圖11)。利用多克隆抗hNGF抗體的ELISA測定每種突變體的濃度。表達水平相似，而且由多克隆抗體在三種不同類型的免疫活性方面識別出主要存在單一加工種類，由此表明突變型與野生型hNGF具有相近的結構穩定性。將三個帶電胺基酸全部取代成丙氨酸(突變體4H4A＋H8A＋R9A)，結果喪失了在4℃從trkA上可測競爭性取代〔125II〕hNGF的能力，而野生型hNGF可完全取代示蹤物(IC50＝1×10-10M；最大取代＝1×10-9M，圖12，上方，表5)。與受體結合力喪失相關的還有效力下降至少10倍，最大trkA自磷酸化效率明顯下降4-5倍。突變體4與(1-118)hNGF相比的PC12分化能力的EC50低85倍(圖14)，與PC12受體結合情況一致，後者反應了取代主要來自p75以及是反應了突變體與trkA更低的親和結合力的非取代成份(圖12，下方)。然後分別分析了His4和Arg9變異體。hNT3和hBDNF的N末端區域都具有一個組氨酸，這暗示可能具有保守性的功能作用。以丙氨酸(突變體1)或天冬氨酸(突變體2)取代His4，使得trkA結合力、自磷酸化和刺激PC12細胞分化能力大大減弱(圖12，13，14)。如hNGF與其它種類的NGF在位置9的序列改變所揭示，突變R9A對trkA或p75活性沒有大影響。但是，其刺激trkA自磷酸化和PC12細胞分化的能力略低(圖12，上，中，圖13和14)。在25℃，與hNGF相比，P5A和H8A變異體表現出的trkA結合力分別下降3倍和1.5倍，但H4D喪失了約40倍的結合能力；沒有觀察到與p75結合力的改變。不論在4℃還是在25℃，所有上述突變體與p75結合力的減弱都在2倍之內，這表明誘變引起的總體結構效應是很小的。為了測試特異性N末端序列是否是神經營養蛋白與trkA反應所必需的，用hBDNF或hNT3的N末端(分別為HSDPA或YAEHKS)替換hNGF的N末端來生成嵌合突變體(突變體5和6)。這些突變體將由此保留hNGF的二鹼性His8、Arg9殘基。即便在4℃，濃度比產生完全受體取代的(1-118)hNGF高10倍，形成的嵌合神經營養蛋白也不能從trkA上取代〔125I〕hNGF，而且其誘導trkA自磷酸化活性的能力低於突變體1和2(圖13)。這些突變體與p75的結合與(1-118)hNGF沒有區別，而PC12受體取代可能主要是與p75相互反應(圖12，底)。與三丙氨酸突變體4相似，與hNGF的所有結構變異體相比，N末端嵌合突變體是最弱的PC12細胞分化誘導者，IC50改變近100倍。由此表明，hNGF特異性N末端序列是與trkA有關的高親合性結合和激活性所必需的，但並非與p75結合所必需。為了證實保持整體結構不變時，N末端序列變異體能夠抑制hNGF與trkA的高親合性反應，大量表達和純化H4D突變體2和hNT3/hNGF突變體6。在可能的最高濃度即高於(1-118)hNGF的IC50(IC50＝1×10-10M)2000倍時，在4℃，突變體2和6隻分別從trkA上取代30％和10％的〔125I〕NGF，與p75的結合曲線相互類似(圖15)。與圖13所示的結果相一致，純化的突變體激活trkA自磷酸化的能力明顯低於(1-118)hNGF。這些結果表明，各種胺基酸取代之後保留了整體結構穩定性，而且證實是這些特異性修飾作用導致了與trkA結合的高親合性和自身磷酸化作用的下降。還產生了一些嵌合突變體，以初步比較可能為hNGF的trkA受體特異性決定簇的另兩個可變區的作用。在突變體7和8中，分別將β轉角可變區3內的6個殘基(Arg59-Ser66)和β轉角可變區5內的7個殘基(Met92-Ala98)與突變體7和8內相應的hNT3殘基交換。突變體7從trkA取代〔125I〕NGF略強於hNGF，突變體8與p75的結合略差(3-5倍)。此外，這些突變體在其與trkA和p75的結合曲線，顯示trkA自磷酸化或PC12軸突產生方面與hNGF的差別很小(圖12，13，14)。這些結果表明，區域3和5對與trkA結合反應的影響小於N末端。突變體8與p75的低親合性可能反應了保守性殘基Lys95(顯示與p75反應)(54)周圍的結構改變。為了測定hNGF結構變異體其Mr＝14,000全加工形式的相對表達水平，利用免疫印跡測試了抗hNGF單克隆抗體和多克隆抗體識別突變體的能力(圖11和12)。在等量的於條件培養基中表達的N末端突變體進行免疫印跡時，有幾個不能被單克隆抗體識別但全部能被親合純化的多克隆抗體識別。H4D突變體和hBDNF或hNT3N末端嵌合突變體沒有表現出免疫印跡信號，而H4A＋H8A＋H9A突變體的影響較小(圖16)。H4A或R9A突變不影響抗體結合。然後測試了單克隆抗體競爭〔125I〕NGF與trkA或p75結合的能力。提高抗體濃度能夠抑制〔125I〕NGF與兩種受體的結合；IC50＝1×10-9M對4×10-8M表明，其封閉hNGF與trkA結合的效力比封閉與p75結合的效力強40倍。這些結果表明，N末端至少構成hNGF單克隆抗體的抗原決定簇的部分，而且，抗體與hNGF的結合以較高的親合性封閉了後者與trkA的反應。對與p75結合的弱抑制表明，或者在N末端外側有一個親合性較低的抗原決定簇可能影響到hNGF-p75結合，或者是抗體的空間障礙部分幹擾了與p75的結合。初步研究顯示，在β轉角3區域的確存在著此抗體的一個弱結合抗原決定簇，由hNT3/hNGF嵌合突變體7代表。現在正對此區域在hNGF與p75和trkA結合中的作用進行研究。雖然，尚不確定在抗體存在下，與trkA結合力下降是由於抗體與某個次級抗原決定簇的結合還是由於空間障礙，但數據與對上述一些N末端變異體觀察到的即與trkA的結合下降大於與p75的結合下降一致。實施例4hNGF胺基酸變異體hNGF和hNT3泛向神經營養蛋白的產生與鑑定突變分析目標殘基的確定NGF與其神經營養蛋白家族成員NT3、BDNF和NT4/5具有56％的序列一致性。神經營養蛋白家族成員間的胺基酸序列差異可能部分決定了受體結合的特異性。這些殘基可以直接與trk受體結合，或者起抑制其它可變、或保守殘基的trk反應的作用。產生hNGF與hNT3之間的hNGF結構域交換突變體，以測試不同殘基決定trk受體結合特異性的作用。神經營養蛋白基本序列比較顯示，有7個每個由7-10個胺基酸組成的區域包括了大多數的序列差異(80％)(圖8，圖18A和18B)。在hNGF和hNT3之間，120個胺基酸中有52個不同。這52個差異中的41個(79％)發生在這7個不同區域內。在包括人、鳥、蛇、蛙在內的9個NGF中，這52個殘基中有24個是保守的，表明對與trkA結合特異性的影響。對鼠NGF的X光晶體結構檢查揭示，4個可變區/結構域在結構上是β轉角，1個可變區是β摺疊，最後兩個是氨基端和羧基端。每個不同區域具有幾個帶電和極性的側鏈，它們與溶劑接觸，並能夠與受體反應。將hNGF7個可變區每一個中的部分或全部殘基與hNT3的相應結構域交換，由此產生13個嵌合或結構域交換的突變體。對兩個差異較小的附加區域也進行了替換前可變區1和4。這樣，總共對不同胺基酸殘基中的90％評價了其在決定trkA和trkC特異性方面的作用。嵌合突變體是根據實施例3中所述的寡聚核苷酸指導的誘變和哺乳動物細胞表達產生的。進行誘變的hNGF單個殘基的選擇主要是根據它們在鼠NGF的X光晶體結構中的位置。據推測，因為被替換的殘基大多數是功能保守性的，所以人和鼠NGF之間的序列差異只產生很小的結構改變(10/12)。根據X光晶體結構坐標和實施例1所述，由計算機產生的鼠NGF模型揭示了使側鏈突出進入溶劑並能夠與trkA和gP75受體反應的胺基酸。其中有些是經結構域交換突變作用修飾過的可變殘基，但大部分是可變區和保守區內的hNGF和HNT3之間的保守性殘基。據估計為側鏈暴露度很小的側鏈，如那些涉及形成二聚體界面的(F12、V14、W21、F49、Y52、W76、T85、F86、W99、F101、T106、A107、V109、V111)、形成疏水性內部的(V36、V38、F53、I71、A89、I102和I104)和結構依賴性而且包埋在內的氫鍵的(Q51、S78、T91、R100)，很少被修飾。在形成二硫鍵的半胱氨酸殘基、甘氨酸和丙氨酸中，只有A97被修飾。在下列情況中出現例外殘基I30和Y52雖然位於二聚體界面，但它們具有表面側鏈；殘基L39、L90、M92和A97也形成疏水性表面部分，雖然通過氫鍵連接，D16、K25、D30、E55、K57、R59、D72、H75殘基仍表現為一定程度的接觸溶劑的側鏈。大多數殘基被替換成丙氨酸(64)；有時，在測試受體反應中的特異性作用時，為了維持結構也進行其它取代。hNGF變異體的產生和受體結合鑑定按照實施例3所述，進行hNGF變異體的誘變、表達和蛋白質鑑定。寡聚核苷酸指導的誘變後，由雙脫氧核苷酸測序鑑定全部突變體。在人293細胞中表達hNGF突變體(圖11A和B)，用Amicon濃縮(10X)和ELISA定量後，觀察到大多數hNGF變異體的表達水平與一般hNGF對照的相近(5-25ug/ml)，但取代了可變區2或3的突變體例外(0.6-1ug/ml)。兩種嵌合分子都產生脯氨酸殘基的插入或缺失，加上其它側鏈功能的某些改變，所以，低回收率可能反映了結構不穩定性。但是，可得量允許進行hNGF變異體與trkA和gp75受體結合親合性的測定。使用trk和gp75受體的免疫吸附構建物(88)和放射性標記的神經營養蛋白(實施例2所述)，通過競爭性結合來測定每種hNGF變異體的結合親合性。每一種hNGF變異體至少在293細胞中表達2次，對每一次轉染進行2-3次的結合試驗。以一個變異體全部測定的平均IC50與hNGF的IC50之比來表示與一般hNGF相比較的相對親合性。trkA自磷酸化和PC12細胞分化的生物試驗如實施例3所述，評定trkA的自磷酸化來測定hNGF變異體的trkA激酶生化激活作用。發展了一種定量分析法(89)，允許對trkA自磷酸化的EC50進行劑量依賴性測定。在96孔微量滴定板中，具有取自單純皰疹表面蛋白的肽抗原決定簇標記的一種trkA受體變異體在CHO細胞中穩定表達(88)。此hNGF的抗原決定簇標記的trkA的親合性與一般受體的相同(88)。在37℃，用8種不斷升高的hNGF變異體濃度(10pM-10nM)刺激細胞(對每一濃度有重複孔)10分鐘。如實施例3所述，用三硝基甲苯X-100裂解緩衝液裂解細胞，然後轉移到民被針對此抗原決定簇標記的單克隆抗體的微量滴定板上。結合後，捕獲的trkA再與結合了HRP的抗磷酸酪氨酸單克隆抗體反應，於是發生顯色反應。然後讀取吸光度，並對濃度作圖。hNGF的EC50為100-120pM。根據實施例3所述，進行PC12細胞的分化，但是，細胞先在NGF中生長或引發7-10天。然後收穫帶軸突的細胞，並在24孔培養皿中平板培養在加有或不力hNGF變異體的普通生長培養基中。根據實施例2所述，在72小時後，定量測定帶軸突的細胞的百分比。在對hNGF不應答的trkC轉染的PC12細胞(由Dr.PantelisTsol-fous和LuisParada，NCI提供)中，對hNGF/hNT3泛向神經營養變異體的hNT3樣trkC生物活性進行評價。結果利用hNGF/hNT3嵌合體對可變殘基的誘變分析將hNGF7個可變區每一個中的部分或全部殘基與hNT3的相應區域交換，由此產生13個嵌合突變體(參見圖8，18A，18B)。對兩個較穩定的區域(一個在β摺疊A內，一個在連接β平面B和C的一保守性β轉角內)也進行了取代。用hNGF變異體進行從trkA或gp75免疫吸附融合蛋白質上取代〔125I〕hNGF的競爭性結合試驗。這些受體含有trkA或gp75的胞外域和人IgG的Fc區。這些免疫吸附與hNGF結合的親合性與全trkA和gp75的相近，表現出對神經營養蛋白的親合性的數量級相同(圖19A，B)。取每一種hNGF變異體IC50的平均值，表示為其與一般hNGF的IC50之比(IC50hNGF＝100pM；圖23A)。如前所述(圖12，15)，對trkA結合最明顯的影響是由與hNT3的N末端結構域交換造成的結合親合性下降近300倍。前可變區1內的三殘基交換(β摺疊AV18E＋V20L＋G23T)，產生2-3倍的結合力下降。其它hNGF變體與trkA結合親合性的下降小於2倍，但可變區3(β轉角3)嵌合突變體和C末端的結合力上升(圖20A)。與trkA結合力下降相一致，trkA自磷酸化和PC12細胞分化(軸突的延伸)的劑量應答曲線表明，N末端和前可變區1變異體造成活性喪失(圖21A，B)。與NT3可變區1和前可變區4的交換使得與gp75的結合力分別下降5和7倍(圖20B)。可變區5突變體與gp75的結合也下降了2-3倍。V1交換表現出的gp75結合力下降可能是由於K32換成了R，K34換成了H，E35換成了Q，因為這些殘基的丙氨酸取代會使gp75的結合力下降(圖8；(54))。這些結果表明，hNGF與trkA和gp75的結合與部分可變神經營養蛋白殘基有關。trkA結合力和受體激活活性的喪失表明，N末端和前可變區1中的可變殘基與trk受體特異性有關。通過測試受體與trkC-IgG免疫粘合體的結合和對NGF不應答的trkC轉染的PC12細胞的軸突產生對這一可能進行了檢測。令人驚奇的是，hNT3的N末端(突變體6)並不賦予trkC反應(圖22A，B)，但是，hNGF可變區4內的四胺基酸交換(T81K、H84Q、F86Y、K88R)產生明顯的trkG反應(圖22A，B)。此變異體較低的trkC親合性和軸突產生能力表明其它區域可能與有效的trkC反應有關。現在對前可變區1突變體的trkC反應性進行評價，同樣對可變區4內的各殘基的作用進行了評價。但是，可變區4內的重疊突變顯示，V4中的多個殘基是trk特異性所必需的。例如，β轉角3/4變異體，即改變了在T81K重疊的3個可變殘基(S73、Y79Q、T81K)，在trkC-PC12細胞中的軸突產生活性僅為可變區4突變體的5-10％(圖22B)。但是，trk功能受到丙氨酸突變體Y79A＋T81A的影響，進一步表明此區域中可變殘基在trk受體反應中的關係。可變區4突變體保留了trkA活性表明4個hNT3殘基參與了與trkA的結合，但對等的hNGF殘基可能在hNGF與trkC的反應具有抑制作用。雖然神經營養蛋白的N末端結構域似乎不是通用的trk特異性結構域，但hNGF的該區域似乎是trkA反應的一個重要決定簇。用hNGF的前7個殘基取代NT3的前6個殘基，產生了一個能夠同時高親合性地結合trkA和trkC並能夠高強度地將它們激活的泛向性變異體(圖24、25和26)。此外，它保留了與gp75的親合性結合力。所以，產生一個由hNT3開始，將hNGF的可變區如N末端、V2、V3、V4和V5包括在內的有效的泛神經營養蛋白是可能的。反過來，可以通過交換以hNT3β摺疊1內(C1)和V4內的可變殘基來對hNGF進行修飾使之具有類似的泛向trkA/trkC性能。雖然取代可變區的hNGF/hNT3嵌合體2不產生trkC活性，但它的確使trkA結合力略有下降(1.5倍)。現在對相反的結構域交換即用相應的hNGF結構域取代hNT3的可變區2，進行測試，測試其產生trkA活性的能力和作為候選的trkA/trkC泛神經營養蛋白。單個hNGF可變殘基和保守殘基的誘變分析與trkA和gp75反應的hNGF殘基結構模型。利用前述鼠NGF的晶體結構，通過對hNGF的45個殘基的定點誘突進行測定，這些殘基中的許多具有與溶劑接觸的側鏈功能性，而且能夠與trkA或gp75反應。競爭性結合分析顯示，H4、P5A、S13、D30、I31、Y52、R59、R69、Y79、T81和R103突變影響trKA結合力1.8-10倍，而殘基E41、K57、D72、N77的突變增加結合力1.5-2倍(圖27)。這些結果揭示了這些殘基與trkA反應有關，而且表明由能夠影響trk特異性的可變殘基(H4、P5、I31、R59、Y79、T81)和保守殘基(S13、D30、Y52、R69、R103)都可以產生變異體。在殘基F12、I31、K32＋K34＋E35、K50、Y52、R69、K74、H75、K88、L112、S113、R114和K115處的突變使與gp75的結合力下降3→50倍(圖30)。特別是，存在10nM的突變體(分別在F12、K32＋K34＋K35、Y52、R69、K88和R114＋R115處被交換)時，沒有觀察到置換，這表明這些殘基是gp75結合的關鍵性決定簇。利用抗原決定簇標記的trkA進行的自磷酸化分析顯示，在殘基H4、P5、D30、Y52、R69、Y79＋T81和R103處的突變使激活能力下降1.5-6倍(圖28)。在所有這些突變體中都觀察到了trkA自磷酸化效力的顯著下降(20一60％)，殘基F12突變例外。這些結果與PC12細胞的分化能力相一致；H4、F12、D30、Y52、R69、Y79＋T81和R103處的突變使EC50下降2-50倍。最近對其它hNGF變異體進行了評價，包括P5突變。有趣的是，其突變對trkA結合和激活trkA自磷酸化的影響都很小的殘基能夠降低trkA自磷酸化的效率。trkA自磷酸化的減弱可以解釋由R69和Y79＋T81誘導的PC12細胞分化的減弱。另一方面，R69突變大大降低與p75的結合力，p75在hNGF信號轉導中的作用尚不清楚，與p75反應性的喪失可能導致生物活性的降低。正在就降低hNGF與p75結合力的其它hNGF變異體對這種可能性進行研究。根據鼠NGF的結構，由計算機建立了與trkA和gp75反應的殘基的模型。由此試驗發現了兩個主要的trkA反應區1)N末端(H4、P5)，晶體結構未知；和2)由β摺疊C和D的Y79、T81、H84和R103構成的一表面。β摺疊A和B的殘基V18，V20，G23，Y52和R69部分參與構成一延伸的包圍β摺疊鏈的表面。靠近Y52區域和β摺疊A殘基的是第二原聚體的D30和I31。這兩個殘基從表面略微突出進入溶劑，但是，它們可能參與構成由β摺疊殘基構成的一連續的結合表面。發現的兩個主要的p75反應區是1)一原聚體的可變區1和另一原聚體的β摺疊B和C，2)不同原聚體C末端和β轉角3內的保守性殘基。與β摺疊對形成的間隙間的trkA相關殘基相反，p75反應性殘基是十分暴露的。正如(54)從β髮夾轉角1可變區突出的K32和K34所示。我們發現，來自另一原聚體的鄰近殘基K50和Y52與p75結合有關。對與p75的結合具有重要貢獻的K88位於此區域內，但並不高度外露。另一結合表面由K74(β轉角3)，末端的R114和K115(C末端)、F12和另一原聚體的R69構成。根據上述誘變分析發現，現在正對其它有效的泛向神經營養蛋白進行構建和評價。通過hNGF中的以下改變可產生泛向trkA/trkC分子1)前可變區1(V18E＋V20L＋G23T)加上可變區4(Y79Q＋T18K＋K88R)；2)前可變區1加可變區4中的最少殘基取代。在hNGF的N末端的前7個殘基進行最少的取代和取代hNT3的前6個殘基能夠產生泛向trkA/trkC分子。由於H4和P5在各種NGF中是保守的，而且6和7位的2個疏水性殘基也是保守的，可以產生以下變異體1)YASHPIF-hNT3；2)YAHPIF-hNT3；3)YASHPIS-hNT3；4)YAEHPIF-hNT3；5)YAQHPIS-hNT3。用hNGF相應區域取代hNT3的可變區2或4或5或其組合能夠產生泛向trkA/trkC神經營養蛋白。用hNGF的前7個殘基取代hNT4/5的前9個殘基，或結合可變區4或前可變區1內的殘基取代，可產生泛向trkA/trkC神經營養蛋白。文獻(1)Snider，W.D.Johnson，E.M.(1989)＂神經學年報＂，26，489-506(2)Barde，Y.-A.(1989)＂神經元＂，2，1525-1534(3)Davies等人，＂神經科學雜誌＂(J.Neuroscience)，6，1897(1986)(4)Davies，A.M.，＂遺傳學趨勢＂(TrendsinGenetics)，139-143(1988)(5)Maisonpierre，P.C.，Belluscio，L.，Squinto，S.，Ip，N.Y.，Furth，M.E.，Lindsay，R.M.和Yancopoulos，G.D.(1990)＂科學＂247，1446-1451(6)RosenthalA，Goeddel，D.V.，Ngyuen，T.，Lewis，M.，Shih，A.，Laramee，G.R.，Nikolics，K.，和Winslow，W.(1990)＂神經元＂(Neuron)4，767-773(7)Hohn，A.，Leibrock，J.，Bailey，K.，和Barde，Y.-A.，＂自然＂(Nature)，344，339-341，1990(8)KaishoY，Yoshimura，K.和Nakahama，K.(1990)FEBSLett.266，187-191(9)Emfors，P.，Ibanez，C.F.，Ebendal，T.，Olson，L.，和Persson，H.(1990)＂美國科學院院報＂(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87，5454-5458(10)Jones，K.R.和Reichhardt，L.F.(1990)＂美國科學院院報＂，87，8060-8064(11)Levi-Montalcini，R.和Angeletti，P.U.(1968)＂生理學回顧＂(Physiol.Rev.)，48，534-569(12)ThoenenH.，Bandtlow，C.和Heumann，R.(1987)，＂生理學生物化學藥物學回顧＂(Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.)，109，145-178(13)Barde，Y.-A.，Edgar，D.和Thoenen，H.(1982)歐洲分子生物學雜誌(EMBOJ.)，1，549-553(14)Leibrock，J.，Lottspeich，F.，Hohn，A.，Hofer，M.，Hengerer，B.，Masiakowski，P.，Thoenen，H.，和Barde，Y.-A.(1989)＂自然＂(Nature)，341，149-152(15)Holb＂＂k，F.等人，(1991)＂神經元＂(Neuron)，6，845-858(16)Berkemeier，L.R.，Winslow，J.W.，Kaplan，D.R.，Nikolics，K.，Goeddel，D.V.和Rosenthal，A(1991)＂神經元＂(Neuron)，7，857-866(17)Ip，N.Y.，Ibanez，C.F.，Nye，S.H.，McClain，J.，Jones，P.F.，Gies，D.R.，Belluscio，L.，LeBeau，M.M.，Espinsosa，R.，III，Squinto，S.P.，Persson，H.和Yancopoulos，G.D.(1992)＂科學院院報＂(Proc.Natl.Acad.Sci.)，89，3060-3064(18)Martin-Zanca，D.，Oskam，R.，Mitra，G.，Copeland，T.和Barbacid，M.(1989)，＂分子細胞生物學＂(Mol.Cell.Biol.)，9，24-33(19)Kaplan，D.R.，Martin-Zanca，D.，和Parada，L.F.(1991)＂自然＂，350，158-160(20)Klein，R.，Jing，S.，Nanduri，V.，O′Rourke，E.，和Barbacid，M.(1991a)＂細胞＂(Cell)65，189-197(21)Kaplan，D.R.，Hempstead，B.，Martin-Zanca，D.，Chao，M.，和Parada，L.F.(1991)＂科學＂252，554-558(22)Klein，R.，Nanduri，V.，Jing，S.，Lamballe，F.，Tapley，P.，Bryant，S.，Cordon-Cardo，C.，Jones，K.R.，Reichardt，L.F.，和Barbacid，M.(1991b)＂細胞＂66，395-403(23)Soppet，D.，Escandon，E.，Maragos，J.，Middlemas，D.S.，Reid，S.W.，Blair，J.，Burton，L.E.，Stanton，B.R.，Kaplan，D.R.，Hunter，T.，Nikolics，K.和Parada，L.F.(1991)＂細胞＂，65，895-903(24)Squinto，S.P.，Stitt，T.N.，Aldrich，T.H.，Davis，S.，Bianco，S.M.，Radzieiewski，C.，Glass，D.J.，Masiakowski，P.，Furth，M.E.，Valenzuela，D.M.，DiStefano，P.S.和Yancopoulos，G.D.(1991)＂細胞＂，65，885-893(25)Lamballe，F.，Klein，R.和Barbacid(1991)，＂細胞＂，66，967-979(26)Tsoulfas，P.，Soppet，D.，Escandon，E.，Tessarollo，L.，Mendoza-Ramirez，J.-L.，Rosenthal，A.，Nikolics，K.和Parada，L.F.(1993)＂神經元＂(Neuron)，10，975-990(27)Cordon-Cardo，C.，Tapley，P.，Jing，S.，Nanduri，V.，ORourke，E.，Lamballe，F.，Kovary，K.，Klein，R.，Jones，K.R.，Reichhardt，L.F.和Barbacid，M.(1991)，＂細胞＂，66，173-183(28)Klein，R.，Lamballe，F.，Bryant，S.，和Barbacid，M.(1992)＂神經元＂(Neuron)8，947-956(28a)KleinR.，Parada，L.F.，Coulier，F.和Barbacid，M.(1989)，歐洲分子生物學雜誌(EMBOJ.)，8，3701-3709(29)Ip，N.Y，Stitt，T.N.，Tapley，P.，Klein，R.，Glass，D.J.，Fandl，J.，Greene，L.A.，Barbacid，M.和Yancopoulos，G.D.(1993)＂神經元＂(Neuron)，10，137-149(30)Johnson，D.，Lanahan，A.，Buck，C.R.，Sehgal，A.，Morgan，C.，Mercer，E.，Bothwell，M.和Chao，M.(1986)＂細胞＂，47，545-554(31)Radeke，M.J.，Misko，T.P.，Hsu，C.，Herzenberg，L.A.和Shooter(1987)＂自然＂，325，593-597(32)Loetscher，H.，Pan，Y.-C.E.，Lahm，H.-W.，Gentz，R.，Brockhaus，M.，Tabuchi，H.，和Lesslauer，W.(1990)＂細胞＂61，351-359(33)Smith，C.A.，Davis，T.，Anderson，D.，Solam，L.，Beckmann，M.P.，Jerzy，R.，Dower，S.K.，Cosman，D.，和Goodwin，R.G.(1990)＂科學＂248，1019-1023(34)Schall，T.J.，Lewis，M.，Koller，K.J.，Lee，A.，Rice，G.R.，Wong，G.H.W.，Gatanga，T.，Granger，G.A.，Lentz，R.，Raab，H.，Kohr，W.J.，和Goeddel，D.V.(1990)＂細胞＂61，361-370(35)Mallet，S.，Fossum，S.，和Barclay，A.N.(1990)歐洲分子生物學雜誌(EMBOJ.)9，1063-1068(36)Camerini，D.，Walz，G.，Loenen，W.A.M.，Borst，J.，和Seed，B.(1991)＂免疫學雜誌＂(J.Immunol.)，147，3165-3169(37)Stamenkovic，I.，Clarke，E.A.，和Seed，B.(1989)歐洲分子生物學雜誌(EMBOJ.)8，1403-1410(38)Bo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20個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO3SerSerSerHisProIlePheHisArgGlyGluPheSerValCys151015AspSerValSerValTrpValGlyAspLysThrThrAlaThrAsp202530IleLysGlyLysGluValMetValLeuGlyGluValAsnIleAsn354045AsnSerValPheLysGlnTyrPhePheGluThrLysCysArgAsp505560ProAsnProValAspSerGlyCysArgGlyIleAspSerLysHis657075TrpAsnSerTyrCysThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu808590ThrMetAspGlyLysGlnAlaAlaTrpArgPheIleArgIleAsp95100105ThrAlaCysValCysValLeuSerArgLysAlaValArgArgAla110115120(2)SEQIDNO4信息(i)序列特徵(A)長度119個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO4HisSerAspProAlaArgArgGlyGluLeuSerValCysAspSer151015IleSerGluTrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAsp202530MetSerGlyGlyThrValThrValLeuGluLysValProValSer354045LysGlyGlnLeuLysGlnTyrPheTyrGluThrLysCysAsnPro505560MetGlyTyrThrLysGluGlyCysArgGlyIleAspLysArgHis657075TrpAsnSerGlnCysArgThrThrGlnSerTyrValArgAlaLeu808590ThrMetAspSerLysLysArgIleGlyTrpArgPheIleArgIle95100105AspThrSerCysValCysThrLeuThrIleLysArgGlyArg110115119(2)SEQIDNO5信息(i)序列特徵(A)長度119個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO5TyrAlaGluHisLysSerHisArgGlyGluTyrSerValCysAsp151015SerGluSerLeuTrpValThrAspLysSerSerAlaIleAspIle202530ArgGlyHisGlnValThrValLeuGlyGluIleLysThrGlyAsn354045SerProValLysGlnTyrPheTyrGluThrArgCysLysGluAla505560ArgProValLysAshGlyCysArgGlyIleAspAspLysHisTrp657075AsnSerGlnCysLysThrSerGlnThrTyrValArgAlaLeuThr808590SerGluAsnAsnLysLeuValGlyTrpArgTrpIleArgIleAsp95100105ThrSerCysValCysAlaLeuSerArgLysIleGlyArgThr110115119(2)SEQIDNO6信息(i)序列特徵(A)長度130個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO6GlyValSerGluThrAlaProAlaSerArgArgGlyGluLeuAla151015ValCysAspAlaValSerGlyTrpValThrAspArgArgThrAla202530ValAspLeuArgGlyArgGluValGluValLeuGlyGluValPro354045AlaAlaGlyGlySerProLeuArgGlnThrPhePheGluThrArg505560CysLysAlaAspAsnAlaGluGluGlyGlyProGlyAlaGlyGly657075GlyGlyCysArgGlyValAspArgArgHisTrpValSerGluCys808590LysAlaLysGlnSerTyrValArgAlaLeuThrAlaAspAlaGln95100105GlyArgValGlyTrpArgTrpIleArgIleAspThrAlaCysVal110115120CysThrLeuLeuSerArgThrGlyArgAla125130(2)SEQIDNO7信息(i)序列特徵(A)長度34鹼基(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO7GGTCACCCACAAGCTTTCACTGGCACATACCGAG34(2)SEQIDNO8信息(i)序列特徵(A)長度50鹼基(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQIDNO8GTACTCCCCTCGGTGGAAGATGGGATGGCTCGAGGACCGTTTCCGCCGTG50權利要求1.一種泛向神經營養蛋白，其特徵在於，它含有(a)賦予NGF特異性的結構域；(b)賦予BDNF特異性的結構域；和(c)賦予NT3特異性的結構域。2.如權利要求1所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該泛向神經營養蛋白與神經營養蛋白受體的結合至少為天然神經營養蛋白配體與該受體結合的80％。3.如權利要求1所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該泛向神經營養蛋白至少與4種不同的神經營養蛋白受體結合。4.如權利要求3所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，所述的受體是tr-kA、trkB和trkC以及p75。5.如權利要求1所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該泛向神經營養蛋白是泛向的NT3。6.如權利要求1所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該泛向神經營養蛋白是泛向的NGF。7.如權利要求1所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該泛向神經營養蛋白是泛向的NT4/5。8.如權利要求1所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該泛向神經營養蛋白是泛向的BDNF。9.如權利要求5所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該泛向NT3是MNTS-1。10.一種泛向神經營養蛋白，其特徵在於，它含有單一的胺基酸改變，而且該泛向神經營養蛋白至少與3種不同神經營養蛋白受體結合。11.如權利要求10所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該泛向神經營養蛋白在對應NT3中D15的位置上用丙氨酸殘基置換。12.如權利要求10所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，它是D15ANT3。13.如權利要求10所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，它是D16ANGF。14.編碼權利要求1所述的泛向神經營養蛋白的核酸。15.含有權利要求14所述的核酸的表達載體。16.含有權利要求14所述的核酸的宿主細胞。17.一種製備權利要求1所述的泛向神經營養蛋白的方法，其特徵在於，包括將含有編碼該泛向神經營養蛋白的核酸的宿主置於允許表達該泛向神經營養蛋白的條件下。18.一種含有權利要求1所述的泛向神經營養蛋白的藥物組合物。19.一種治療神經性疾病的方法，其特徵在於，它包括給病人施用權利要求1所述的泛向神經營養蛋白。20.一種泛向神經營養蛋白，其特徵在於它是共價的異源二聚體。21.如權利要求20所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該異源二聚體含有NT3單體和NGF單體。22.如權利要求20所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該異源二聚體含有NT3單體和NT4/5單體。23.如權利要求20所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該異源二聚體含有NT3單體和BDNF單體。24.如權利要求20所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該異源二聚體含有NGF單體和BDNF單體。25.如權利要求20所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該異源二聚體含有NGF單體和NT4/5單體。26.一種泛向的共價同源二聚體，其特徵在於，它含有兩個MNTS-1單體。27.一種泛向的共價同源二聚體，其特徵在於，它含有兩個D15ANT3單體。28.如權利要求6所述的泛向神經營養蛋白，其特徵在於，該泛向NGF是D16A-V18E-V20L-G23T-Y79Q-T81K-H84Q-F86Y-K88R-NGF。全文摘要提供了具有多重神經營養特異性的泛向神經營養蛋白。本發明的泛向神經營養蛋白可用於治療神經元疾病。還提供了編碼泛向神經營養蛋白的核酸和表達載體。文檔編號C12N15/18GK1153528SQ95193381公開日1997年7月2日申請日期1995年6月1日優先權日1994年6月3日發明者R·厄弗,L·G·普雷斯塔,J·W·溫斯洛申請人:基因技術股份有限公司