特異性靶向抗微生物肽及其應用的製作方法

2023-05-08 00:53:06 4

專利名稱：特異性靶向抗微生物肽及其應用的製作方法
技術領域：
本申請涉及抗微生物組合物及治療領域。
背景技術：
人黏膜表面所發現的固有微生物群落對於獲取營養以及防止致病微生物定 居來說是十分關鍵的。當正常菌群被各種因素破壞後，黏膜表面通常會發生微 生物感染，這種感染影響著世界範圍內的許多人群。黏膜表面缺乏有效的免疫 反應使醫生只能利用常規的抗生素或抗微生物藥物來治療黏膜感染。不幸的 是，對於正常菌群來說，大多數小分子抗生素具有廣譜活性，會不加區別地殺 死良性微生物和致病微生物。這種效應通常會導致嚴重的抗生素伴隨感染，因 為已經空出了適於致病群落生長的生態位。難辨梭菌、白色念珠菌和金黃色葡 萄球菌是典型的機會致病菌的例子，這些致病菌能夠利用抗生素治療後出現的 增大的生態位。使用廣譜抗生素導致的問題以及耐藥菌株的出現強化了開發新 型"靶向性"抗生素藥物的基本需要，這種藥物能夠殺傷黏膜致病菌，同時對正 常微生物群落的影響又是最小的。
以前為了達到耙特異性抗微生物治療而進行的努力包括將抗生素連接到單 克隆抗體上，或構建包含殺菌域和細菌識別域的大分子融合蛋白(Qiu等，2005)。 但是還沒有一種方法能夠達到有功能的有效治療效果，原因是低效率的化學連 接、不穩定的大蛋白或較高的製備成本。
雖然已經開發出了一種特異性靶向抗微生物肽(STAMP)G10KHc，並且證明 其抗靶細菌的殺傷能力、特異性和動力學有明顯提高(Eckert等，2006)，但是依然需要開發出能夠特異性或選擇性殺傷或抑制不良靶微生物生長的新型
STAMP 。
發明概述
本發明的一個方面涉及包含導向肽和抗微生物肽的選擇性/特異性靶向抗 微生物肽(STAMP)。 STAMP還包含接頭肽。
在一個實施方式中，導向肽選自C16或CSPC16(TFFRLFNRS FTQALGK， SEQ ID NO. 2)、M8或CSPM8(TFFRLFNR， SEQ ID NO 5)和肽1903(NIFEYFLE， SEQ ID NO 10)。
在另一實施方式中，接頭肽選自如下一組GGG(SEQ IDN017)、 AAA(SEQ ID NO 18)、 SAT(SEQ ID NO 19)、 ASA(SEQ ID NO 20)、 SGG(SEQ ID NO 21)、 PYP(SEQIDN0 22)、 SGS(SEQ ID NO 23)、 GGS(SEQ ID NO 24)、 SPS(SEQ ID NO 25)、 PSGSP(SEQ ID NO 26)、 PSPSP(SEQ ID NO 27)、 GGSGGS(SEQ ID NO 28)或上述肽的任意兩個(二聚物)、三個(三聚物)、四個(四聚物)、五個(五聚物) 或五個以上的組合。
在另一實施方式中，抗微生物肽選自如下一組G2(諾弗斯匹林(novispirin) G10的衍生物，KNLRRIIRKGIHIIKKY*,如SEQ ID NO 3所示)(*代表C端醯 胺化)、包含胺基酸序列FKKFWKWFRRF(SEQ ID NO 7)的S6L3-33和包含氨 基酸序列KLFKFLRKHLL(SEQ ID NO ll)的BD2.21 。
在另一實施方式中，STAMP包含導向肽和抗微生物肽，其中導向肽與抗微 生物肽通過肽鍵共價連接，其中導向肽選自C16(SEQ ID NO 2)、M8(SEQ ID NO 5)或1903(SEQ ID No 10);以及其中抗微生物肽選自G2(SEQ ID NO 3)、 S6L3-33(SEQ ID NO 7)或BD2.21(SEQ ID NO 11)。
在另一實施方式中，STAMP包含通過肽鍵共價連接到接頭肽上的導向肽和 通過肽鍵共價連接到接頭肽上的抗微生物肽，其中導向肽選自C16(SEQIDNO 2)、 M8(SEQ ID NO 5)或1903(SEQ ID No 10);其中抗微生物肽選自G2(SEQ ID NO 3)、 S6L3-33(SEQ ID NO 7)或BD2.21(SEQ ID NO 11);以及其中接頭肽選 自GGG(SEQ ID NO 17)、 AAA(SEQ ID NO 18)、 SAT(SEQ ID NO 19)、 ASA(SEQ ID NO 20)、 SGG(SEQIDN0 21)、 PYP(SEQ ID NO 22)、 SGS(SEQ ID NO 23)、
6GGS(SEQ ID NO 24)、 SPS(SEQ ID NO 25)、 PSGSP(SEQ ID NO 26)、 PSPSP(SEQ ID NO 27)和GGSGGS(SEQ ID NO 28)。
在另一實施方式中，STAMP選自下組C16G2(SEQ ID NO. 4); C16-33(SEQ ID NO. 8); C16-BD2.21(SEQIDNO. 14); M8G2(SEQ ID NO. 15); M8-33(SEQ ID NO. 9); M8-BD2.21(SEQIDN0.6); l卯3-G2(SEQ ID NO. 12); 1903-33(SEQ ID NO. 16)和1903-BD2.21(SEQIDNO. 13)。
在另一實施方式中，STAMP內的胺基酸是D-胺基酸對映異構體。 本發明的另一方面涉及包含STAMP和抗生素的STAMP組合物，其中 STAMP組合物具有殺傷或抑制靶微生物生長的協同抗微生物效應。在一個實 施方式中，STAMP是G10KHc(SEQIDNO36)。在另一個實施方式中，抗生素 是妥布黴素。在一個優選實施方式中，STAMP組合物包含GlOKHc(SEQ ID NO 36)和妥布黴素。
本發明的另一方面涉及包含STAMP和能增強、維持或促進STAMP功能或 活性的試劑的STAMP組合物。在一個實施方式中，所述試劑是蛋白酶抑制劑 或rhDNA酶。在一個優選實施方式中，STAMP組合物包含GlOKHc(SEQ ID NO 36)和蛋白酶抑制劑和/或rhDNA酶。
本發明的另一方面涉及包含導向肽和可檢測試劑的診斷試劑。在一個實施 方式中，導向肽連接於偶聯於可檢測試劑。
本發明的另一實施方式涉及本發明的組合物(例如，STAMP或STAMP組 合物)在特異性殺傷、抑制或降低機體內或生物膜上靶微生物生長或治療靶微 生物相關疾病中的用途。
附圖簡述


圖1: C16G2抗變異鏈球菌的選擇性殺傷活性。變異鏈球菌、血鏈球菌和 格氏鏈球菌浮遊細胞暴露於25 nM STAMP C16G2或其非靶向親本抗微生物肽 G2 1分鐘。檢測並比較存活cfu/mL。數據代表至少3次獨立試驗的平均值。
圖2: G2和C16G2抗單一物種生物膜的抑制活性。培養格式鏈球菌(S. gordonii)(A)、血鏈球菌(S. sanguinis)(B)和突變鏈球菌(S. mutans)(C)的單一培養 生物膜，然後暴露於25 pM STAMP或STAMP組分(如圖中所示)l分鐘，洗滌 後用新鮮培養基繼續培養。生物膜隨時間的恢復情況由OD6。。顯示。數據代表3次獨立試驗的平均值。
圖3: C16G2抗多物種生物膜內變異鏈球菌的活性。變異鏈球菌、血鏈球 菌和格氏鏈球菌的混合培養物培養後在唾液內形成生物膜，然後暴露於25 C16G2、 CSPd6或G2。洗滌後使生物膜在新鮮培養基/唾液中生長。通過測定 OD,處的吸光度來監測生物膜隨時間的從新生長情況，同時通過螢光素酶活 性(RLU產物)來測定生物膜內變異鏈球菌的健康度。數據標示為RLU/OD60， 代表至少3次獨立試驗的平均值。
圖4: M8G2抗生物膜內的口腔細菌的活性。變異鏈球菌(A)或血鏈球菌(B) 單一物種生物膜進行模擬處理或暴露於25 M8G2(圖中特地標明的)。去除 STAMP並添加新鮮培養基後，通過測定OD6fl。處的吸光度來監測生物膜隨時 間的恢復情況。數據代表3次獨立試驗的平均值。
圖5: S6L3-33和包含S6L3-33的STAMP的生物膜抑制活性。變異鏈球 菌(A)或血鏈球菌(B)的單一物種生物膜用M8-33、 C16-33或S6L3-33單獨處理 1分鐘(圖中特地標明的)。去除藥物並徹底洗滌後，加入新鮮培養基，通過測 定OD,處的吸光度來監測生物膜在4小時內的從新生長情況。數據代表至少 3次獨立試驗的平均值
圖6: G10KHc的HPLC和MALDI譜。通過HPLC(a)和MALDI質譜(b) 分析純化的G10KHc的質量。通過監測UV 215，在HPLC中監測到了單一峰(處 於10.06 mL處)，說明G10KHc有正確的分子量(4267.44)。
圖7: G10KHc、 G10和妥布黴素的抗微生物動力學。綠膿桿菌菌株ATCC 15692進行模擬處理或者用STAMP G10KHc、非靶向性的G10或妥布黴素(IO HM)處理，1、 5、 30分鐘和2小時後測定存活cfo/mL。實驗在30%小鼠血清中 進行，代表至少3次獨立試驗的平均值。
圖8:抗高密度浮遊綠膿桿菌的時間-殺傷實驗。培養物(lxlScfii/mL)暴露 於5 GlOKHc或GlO，添加和不添加等摩爾的妥布黴素進行協同處理，以 及單獨用妥布黴素處理。24小時後，通過接種確定存活cfU/mL。數據點代表3 次獨立試驗的平均值。
圖9: G10KHc和妥布黴素抗綠膿桿菌生物膜的增強的抗微生物活性。生 物膜在圓盤狀反應器上生長，按照圖中所示用100 pg/mL的藥物處理。4小時和24小時後，收穫存活的細菌並接種以進行定量分析，至少進行三次獨立的 試驗。*表示G10KHc/妥布黴素處理培養物的cfii/mL太小而無法在對數刻度上 標示。
圖10:亞抑制濃度的G10KHc所介導的染料攝取。(a)綠膿桿菌用培養基(左 側柱)或2pMG10KHc(右側柱)處理5分鐘，然後添加PI染料。採集同一區域 的亮視野(上圖)和螢光(下圖)圖像，分析細胞內的染料積聚情況(紅色螢光)，(b) 顯影並以5倍系列稀釋接種後定量測定未處理培養物(只加染料)和G10KHc處 理培養物的cfli/mL。
圖11: G10KHc和G10KHc-D在唾液中的活性和穩定性。(A)外源添加的 綠膿桿菌用25 G10KHc(含或不含PMSF)、 25 G10KHc-D處理，或不進 行處理(圖中特地標示的)，添加藥物後4小時測定復甦的(rescued)存活cfU/mL。 復甦的cfU/mL表示為3次獨立實驗的平均值加標準差。(B)G10KHc(含和不含 PMSF，圖中特地標示)添加到痰液內持續一段特定時間，通過HPLC監測肽的 穩定性(毫吸光度單位，mAU)。逐漸升高的流動相線性梯度用黑色標記。(**) 在滯留體積10.29 mL時MALDI質譜鑑定的G10KHc 。 (*)收集的用於抗微生 物分析的組分(表1)。
圖12: rhDNA酶對G10KHc和G10KHc-D在濃縮痰液中的活性的影響。 添加外源綠膿桿菌的最低限度稀釋的痰液樣品在用或不用rhDNA酶處理後1 小時再用25 G10KHc(含PMSF)或50 pM G10KHc-D處理。定量測定恢復 的細胞，標示為輸入cfo/mL的百分數。數據代表至少三次獨立試驗的平均值 加標準差。
圖13:利用C16-BD2.21和1903-BD2.21殺傷單一物種突變鏈球菌成熟生 物膜。圖中顯示，只需用肽處理生物膜20分鐘，C16-BD2.21和1903-BD2.21 就可將成熟生物膜(生長18-24小時)內33%和15%的活突變鏈球菌殺死。
圖14:C16-BD2.21和1903-BD2.21對口腔鏈球菌多物種生物膜的影響。(A) 顯示C16-BD2.21對總cfu/mL群沒有影響，1903-BD2.21可將總群落降低約 30%。 (B)顯示用C 16-BD2.21處理後存活突變鏈球菌與總鏈球菌的比例為 0.075，用1903-BD2.21處理後該比例約為0.2。
優選實施方式的詳細描述
9本發明的 一個方面涉及選擇性/特異性靶向抗微生物肽(STAMP)及其用途。 術語"選擇性/特異性靶向抗微生物肽"或"STAMP"是指包含導向肽和抗微 生物肽的嵌合多肽，其中導向肽以其C端或N端共價連接或偶聯(例如通過肽 鍵)到抗微生物肽上。例如， 一種STAMP可包含如下兩種結構中的一種l)導 向肽以其c端共價連接到抗微生物肽的N端[氨基末端-導向肽-肽鍵-抗微生物 肽-羧基末端]，以及抗微生物肽以其C端連接到導向肽的N端[氨基末端-抗微 生物肽-肽鍵-導向肽-羧基末端]。
在本發明的一個實施方式中，STAMP還包含接頭肽，導向肽通過它共價連 接或偶聯到抗微生物肽上。在這種例子中，STAMP可包含如下兩種結構中的 一種l)導向肽以其C端共價連接到接頭肽的N端，抗微生物肽以其N端共 價連接到接頭肽的C端(氨基末端-導向肽-肽鍵-接頭肽-抗微生物肽-肽鍵-羧基 末端)，以及2)導向肽以其N端共價連接到接頭肽的C端，抗微生物肽以其C 端連接到接頭肽的N端(氨基末端-抗微生物肽-肽鍵-接頭肽-肽鍵-導向肽-羧基 末端)。
按照本發明，導向肽可以是能夠識別或結合靶標(例如，靶細胞、靶組織、 耙微生物)的任何合適肽。優選的是，導向肽可與靶標特異性地相互作用，或 者特異性地識別靶標，例如，通過細胞表面的附屬物如鞭毛和菌毛，以及靶標 表面暴露的蛋白、脂質和多糖。在一個實施方式中，導向肽能夠特異性地識別 一個或幾個靶標或與其相互作用，同時基本不識別非靶標或不與其相互作用。 在另一實施方式中，導向肽是能特異性結合微生物如靶微生物的肽。
在一個實施方式中，本發明提供的導向肽可通過篩選肽文庫來鑑定。例如， 用耙微生物或其理想抗原或表位來篩選噬菌體展示肽文庫。更具體地說，噬菌 體展示肽文庫(例如，新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)的Ph.D 7、 Ph.D.12、 Ph.D C7C文庫)包含超過109個獨特的含隨機肽序列的噬菌體克隆。 Ph,D,C7C文庫可展示含二硫鍵的7聚肽，而Ph. D. -7和Ph,D,12文庫分別包 含完整的隨機7聚和12聚殘基。可用於該方法的M 13絲狀噬菌體攜帶隨機插 入片段，以其N端融合到小包被蛋白丸上。在篩選能特異性識別靶標或靶微生 物的導向肽時，10"pfU/ml噬菌體文庫與109導向肽的目標微生物(如細菌細胞) 共孵育。離心以後通過抽吸去掉未結合的噬菌體。沉澱物包含與噬菌體結合的靶微生物，用含溫和去汙劑的緩衝液洗滌幾次以去除鬆散結合的噬菌體顆粒， 然後洗脫牢固結合的噬菌體顆粒。這個過程被稱為淘洗。洗脫下來的噬菌體通
過感染大腸桿菌F+株進行擴增。經過3-4輪的淘洗和擴增以後，得到噬菌體群， 其中包含與淘洗細菌有高結合活性的克隆。隨機挑選該群中的10到20個噬菌 體克隆進行DNA測序，從中可以確定肽插入片段的胺基酸序列。將同一噬菌 體群來源的多個克隆的胺基酸序列排列在一起，可以構建出結合/導向肽的共有 序列。這個共有序列代表了一種特定微生物特異性的結合/導向肽。為了確認共 有序列的結合特異性，化學合成該肽並偶聯於染料(如，FITC，綠色螢光染料) 上。標記的肽與微生物共孵育，然後通過螢光顯微鏡分析其靶微生物種特異性 的結合。這種方法可確保噬菌體展示篩選出的肽與獨立於M13噬菌體顆粒的 游離肽具有相同的結合特異性。
本發明的導向肽還可以是基於合理設計而獲得的肽。例如，人們可以根據 胺基酸和微生物表面的生物化學和生理學特徵設計導向肽。 一般而言，帶正電 荷的肽可能會與細胞表面帶負電荷的組分結合，反之依然。同樣，疏水性肽可 基於疏水性相互作用與細胞表面的疏水性口袋結合，而肽的二級或三級結構可 能與微生物表面的某些結構相匹配。
通過篩選方法或設計而得到的肽可用作能特異性識別靶微生物的導向肽。 這種導向肽的例子可見於美國專利申請號10/706， 391(美國出版號 20040137482)的描述，其中包括，例如l)能特異性結合或識別假單胞菌屬的細 菌，尤其是綠膿桿菌的導向肽(例如，導向肽12:1、 12:2、 12:3、 12:4、 12:5、 12:6、 12:7、 12:8、 12:9和12: 10); 2)能特異性結合葡萄球菌屬的細菌，尤其 是金黃色葡萄球菌的導向肽(例如，導向肽SA5:1、SA5:3、SA5:4、SA5:5、SA5:6、 SA5:7、 SA5:8、 SA5:9、 SA5:10、 SA2:2、 SA2:4、 SA2:5、 SA2:6、 SA2:7、 SA2:8、 SA2:9、 SA2:10和SA2:11);以及3)能特異性識別大腸桿菌的導向肽(例如，導 向月太DH5.1、 DH5.2、 DH5.3、 DH5.4、 DH5.5、 DH5.6、 DH5.7、 DH5.8和DH5.9)。
在本發明的一個實施方式中，能特異性結合或識別假單胞菌屬的細菌，尤 其是綠膿桿菌的導向肽包括，例如，cat-l(或KH)域，KKHRKHRKHRKH (SEQ ID NO 31)。能特異性結合或識別葡萄球菌屬細菌的導向肽包括，例如，細菌 信息素如CSP(SGSLSTFFRLFNRSFTQALGK ， SEQ ID NO 1) 、 CSPl(EMRLSKFFRDFILQRKK， SEQ ID NO 29)和CSP2 (EMRISRIILDFLFLRKK，
SEQ ID NO 30)及其片段。另外，能特異性結合或識別肺炎鏈球菌的導向肽包 括，例如，CSP1和CSP2。能特異性結合或識別突變鏈球菌的導向肽包括，例 如，CSP、 C16或CSPC16(TFFRLFNRSFTQALGK， SEQ ID NO 2)、 M8或 CSPM8(TFFRLFNR， SEQ ID NO 5)和肽1903(NIFEYFLE， SEQ ID NO 10)。
本發明提供的導向肽可以是天然的或非天然的肽。例如，本發明提供的導 向肽可以是重組製備的、化學合成的或天然存在的肽。在一個實施方式中，導 向肽包含天然存在的胺基酸序列(例如，CSP、 CSP1和CSP2)。在另一實施方 式中，導向肽包含組成天然多肽內部部分的胺基酸序列(例如，本發明的C16 和M8)。在另一實施方式中，導向肽包含天然存在於基因組中的序列所編碼的 胺基酸序列，這種胺基酸序列不與其天然鄰近的任何胺基酸序列相鄰，例如， 這種胺基酸序列與導向肽中的異源序列相鄰。
本發明提供的導向肽還包括含有本發明特別闡釋的靶向胺基酸序列來源的 或修飾的胺基酸序列的肽，只要這種衍生的或修飾的序列還保留與其靶微生物 的特異性，或者特異性更高。例如，可通過缺失、突變、添加胺基酸或其他結 構體，或者任何其他結構改變來對耙向胺基酸序列進行結構修飾，只要這種改 變不會改變靶向胺基酸序列與其靶微生物的結合能力或對其結合能力產生副 作用就可以。
本發明的導向肽可通過不同的分子間相互作用如離子相互作用、範德華力、 配基-受體相互作用或疏水性相互作用與靶微生物特異性相互作用或結合(例 如，通過微生物的外表面)。例如，本發明的導向肽還可以是能特異性識別靶 微生物的肽配基、受體或其片段。在一個實施例中，本發明的導向肽可以是突 變鏈球菌的葡聚糖結合蛋白，該結合蛋白可特異性結合突變鏈球菌表面的不溶 性葡聚糖。在另一實施例中，導向肽可以是細菌信息素或其片段。
本發明的導向肽包含約4-40、 5-30、 6-20個胺基酸。在一個優選實施方式 中，導向肽的長度為5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30個胺基酸。
應當注意的是，導向肽包括能特異性結合靶細胞或靶組織(例如，植物細胞、 動物細胞或真菌)的導向肽。這些導向肽的例子包括殼多糖酶、外源凝集素及
12其靶向片段。
本發明的導向肽可利用本領域技術人員熟知的任何方法單獨製備，或者組 合接頭肽和抗微生物肽製備。例如，導向肽可利用合成儀化學合成，或者利用 表達系統重組製備，例如，細菌、酵母或真核細胞表達系統。在化學合成方法 中，導向肽可利用L-胺基酸對映異構體或D-胺基酸對映異構體製備。實驗證 實，包含D-對映異構體的導向肽穩定性升高，同時導向肽的活性並沒有降低。
本發明的接頭肽是可用於將導向肽連接到抗微生物肽上但是不會影響或降
低導向肽或抗微生物肽的活性的肽。接頭肽約含2到20個胺基酸，或者3到 12個胺基酸。接頭肽的例子包括，例如，GGG(SEQIDNO 17)、 AAA(SEQID NO 18)、 SAT(SEQ ID NO 19)、 ASA(SEQ ID NO 20)、 SGG(SEQ ID NO 21)、 PYP(SEQIDN0 22)、 SGS(SEQ ID NO 23)、 GGS(SEQ ID NO 24)、 SPS(SEQ ID NO 25)、 PSGSP(SEQ ID NO 26)、 PSPSP(SEQ ID NO 27)或所列接頭肽的任何 兩個(二聚體)、三個(三聚體)、四個(四聚體)、五個(五聚體)或5個以上的組合(多 聚體)。在一個實施方式中，接頭肽是GGG(SEQ ID NO 17)。在另一實施方式 中，接頭肽是(SEQ ID NO 24)二聚體，是GGSGGS(SEQ ID NO 28)。
本發明的接頭肽可利用本領域技術人員熟知的任何方法單獨製備，或者組 合導向肽和抗微生物肽製備。例如，接頭肽可利用合成儀化學合成，或者利用 表達系統重組製備，例如，細菌、酵母或真核細胞表達系統。在化學合成方法 中，接頭肽可利用L-胺基酸對映異構體或D-胺基酸對映異構體製備。實驗證 實，包含D-對映異構體的肽穩定性升高，同時肽的活性並沒有降低。
本發明的抗微生物肽是能夠殺傷微生物或抑制其生長的肽。本發明的抗微 生物肽的抗微生物活性包括而不限於抗菌、抗病毒或抗真菌活性。抗微生物肽 包括各類肽，例如，從植物以及動物中分離的肽。在動物中，抗微生物肽通常 通過各種細胞表達，其中包括中性粒細胞和上皮細胞。在哺乳動物中，其中包 括人，抗微生物肽通常見於舌、氣管和上部腸的表面。天然抗微生物肽一般是 短於100個胺基酸的雙親性分子。這些肽中許多肽都是帶正電荷的(即，陽離 子的)，多數情況下形成雙螺旋結構。
在一個實施方式中，本發明的抗微生物肽包含約2到IOO個胺基酸、約5 到50個胺基酸、或者約7到20個胺基酸。在一個優選實施方式中，導向肽的長度為5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30個胺基酸。
在另一實施方式中，抗微生物肽的抗微生物活性為最低抑菌濃度(MIC)不 超過約40pM、不超過約30 pM、不超過約20 pM、或不超過約10 ^M。
在另一實施方式中，抗微生物肽包括表7所列的那些(SEQ ID Nos 34-35和 54-97)。在另一實施方式中，抗微生物肽包含一種或多種抗微生物肽，其中包 括而不限於阿萊克西黴素(alexomycin)、安德羅平(andropin)、阿皮德新 (apidaecin)、大腸桿菌素、p-摺疊大腸桿菌素、貝可替新(bactenecin)、布弗林 (buforin)、卡斯力克丁(cathelicidin)、 a-螺旋可萊弗寧(a-helical clavanin)、天蠶 抗菌肽、十二肽(dodecapeptide)、防衛素、|3-防衛素、a-防衛素、傑古林(gaegurin)、 組肽、吲哚素(ndolicidin)、滑爪蟾素、蜂毒素、乳酸鏈球菌肽、諾弗斯匹林GIO、 內源性抗微生物多肽、瑞萊新(mnalexin)、中國鱟肽、以及上述物質的衍生物。
在這些已知的抗微生物肽中，已知中國鱟肽具有抗真菌和抗細菌活性。安 德羅平、阿皮德新、貝可替新(bactencin)、可萊弗寧、十二肽(dodecappeptide)、 防衛素和吲哚素(indolicidin)是具有抗菌活性的抗微生物肽。布弗林、乳酸鏈球 菌肽和天蠶抗菌肽已被證明對大腸桿菌、痢疾志賀菌(Shigella disenteriae)、鼠 傷寒沙門氏菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌有抗微生物活性。滑 爪蟾素和瑞萊新已被證明對上面相同的微生物有抗微生物活性，另外還對白色 念珠菌、新型隱球菌克魯氏念珠菌和幽門螺旋菌有這種效應。滑爪蟾素也被證 明對單純皰疹病毒有抗微生物效應。阿萊克西黴素已被證明對空腸彎曲桿菌、 黏膜炎莫拉菌和流感嗜血桿菌有抗微生物效應，而防衛素和P-摺疊防衛素已被 證明對肺炎鏈球菌有抗微生物效應。組肽及其衍生物是另一類抗微生物肽，具 有抗包括突變鏈球菌在內的各種微生物的抗真菌和抗細菌活性(MacKay, B. J. 等，Infect. Immun. 44:695-701(1984); Xu等，J. Dent. Res. 69:239(1990))。
在一個實施方式中，本發明抗微生物肽包含一個或多個來源於富組蛋白類 及其衍生物的抗微生物肽。例如，本發明的抗微生物肽包含富組蛋白的一個或 多個衍生物，其中包括而不限於包含胺基酸序列DSHAKRHHGY KRKFHEKHHS HRGY(SEQ ID NO 32)的富組蛋白5或包含胺基酸序列 KRLFKELKFS LRKY(SEQ ID NO 33)的dhvar-l 。在另一實施方式中，本發明抗微生物肽包含一類內源性抗微生物多肽及其 衍生物來源的一個或多個抗微生物肽。例如，本發明的抗微生物肽包含具有氨
基酸序列RGGRLCYCRRRFCVCVGR(SEQ ID NO 33-34)的內源性抗微生物多 肽PG-1。內源性抗微生物多肽已被證明對突變鏈球菌、淋病奈瑟氏菌、沙眼 衣原體和流感嗜血桿菌有抗微生物效應。內源性抗微生物多肽可見於美國專利 Nos. 5，693，486、 5,708,145、 5,804,558、 5,994,306和6,159,936的描述，本文都 已納入作為參考。
在另一實施方式中，本發明的抗微生物肽包含用於治療生齲齒微生物如突 變鏈球菌或綠膿桿菌的一類諾弗斯匹林及其衍生物來源的一個或多個抗微生 物多肽。例如，本發明的抗微生物多肽包括具有胺基酸序列 KNLRRIIRKGIHIIKKYG(SEQ ID NO 35)的諾弗斯匹林G10和G2(諾弗斯匹林 G10的衍生物)，G2含有一個C端胺基酸缺失、 一個G10來源的內部缺失和含 有胺基酸序列KNLRIIRKGIHIIKKY*(SEQ ID NO 3)的醯胺化的C末端(*代表 C端醯胺化)。
在另一實施方式中，本發明的抗微生物肽包含經過合理設計並通過檢測證 明具有抗微生物(例如，突變鏈球菌)活性的肽。這些肽的例子包括而不限於含 有胺基酸序列FKKFWKWFRRF(SEQ ID NO 7)的S6L3-33和含有胺基酸序列 KLFKFLRKHLL(SEQ ID NO ll)的BD2.21 。
本發明的抗微生物肽可利用本領域技術人員熟知的任何方法單獨製備，或 者組合導向肽和接頭肽製備。例如，抗微生物肽可利用合成儀化學合成，或者 利用表達系統重組製備，例如，細菌、酵母或真核細胞表達系統。在化學合成 方法中，抗微生物肽可利用L-胺基酸對映異構體或D-胺基酸對映異構體製備。
在另一實施方式中，STAMP包含導向肽和抗微生物肽，其中導向肽與抗微 生物肽通過肽鍵共價連接，其中導向肽選自C16(SEQ ID NO 2)、M8(SEQ ID NO 5)或1903(SEQ ID No 10);以及其中抗微生物肽選自G2(SEQ ID NO 3)、 S6L3-33(SEQ ID NO 7)或BD2.21(SEQ ID NO 11)。
在另一實施方式中，STAMP包含通過肽鍵共價連接到接頭肽上的導向肽和 通過肽鍵共價連接到接頭肽上的抗微生物肽，其中導向肽選自C16(SEQIDNO 2)、 M8(SEQ ID NO 5)或1903(SEQ ID No 10);其中抗微生物肽選自G2(SEQ IDNO 3)、 S6L3-33(SEQ ID NO 7)或BD2.21(SEQ ID NO 11);以及其中接頭肽選 自GGG(SEQ ID NO 17)、 AAA(SEQ ID NO 18)、 SAT(SEQ ID NO 19)、 ASA(SEQ ID NO 20)、 SGG(SEQIDN0 21)、 PYP(SEQ ID NO 22)、 SGS(SEQ ID NO 23)、 GGS(SEQ ID NO 24)、 SPS(SEQ ID NO 25)、 PSGSP(SEQ ID NO 26)、 PSPSP(SEQ ID NO 27)和GGSGGS(SEQ ID NO 28)。這種STAMP的例子包括而不限於表1 所列的STAMP: C16G2(SEQ ID NO 4); C16-33(SEQ ID NO 8); C16-BD2.21(SEQ ID NO 14); M8G2(SEQ ID NO 6); M8陽33(SEQ ID NO 9); M8-BD2.21(SEQ ID NO 15) ; 1903-G2(SEQ ID NO 12) ; 1903-33(SEQ ID NO 16); 和 1903-BD2.21(SEQ ID NO 13)。
本發明的另一方面涉及包含一組STAMP的組合物，其中組合物包含第一 STAMP和第二 STAMP,其中第一 STAMP不同於第二 STAMP。在一個實施方 式中，第一 STAMP包含通過肽鍵共價連接到第一抗微生物肽上的第一導向肽。 第二 STAMP包含通過肽鍵共價連接到第二抗微生物肽上的第二導向肽。第一 STAMP和第二 STAMP之間是有區別的，因此兩個STAMP至少有一個相應基 序是彼此不同的。例如，在一個實施方式中，第一導向肽與第二導向肽不同， 或者第一抗微生物肽與第二抗微生物肽不同。在另一實施方式中，第一導向肽 與第二導向肽不同，以及第一抗微生物肽與第二抗微生物肽不同。
在另一實施方式中，第一 STAMP包含通過肽鍵共價連接到第一接頭肽上 的第一導向肽和通過肽鍵共價連接到第一接頭肽上的第一抗微生物肽。第二 STAMP包含通過肽鍵共價連接到第二接頭肽上的第二導向肽和通過肽鍵共價 連接到第二接頭肽上的第二抗微生物肽。第一 STAMP和第二 STAMP之間是 有區別的，因此兩個STAMP至少有一個相應基序是彼此不同的。例如，在一 個實施方式中，第一導向肽與第二導向肽是不同的(第一接頭肽與第二接頭肽 相同，第一抗微生物肽與第二抗微生物相同)；或者第一接頭肽與第二接頭肽 是不同的；或者第一抗微生物肽與第二抗微生物肽是不同的。在另一實施方式 中，第一導向肽與第二導向肽是相同的(第一接頭肽與第二接頭肽是不同的， 第一抗微生物肽與第二抗微生物是不同的)；或者第一接頭肽與第二接頭肽是 相同的；或者第一抗微生物肽與第二抗微生物肽是相同的。在另一實施方式中， 第一導向肽與第二導向肽是不同的，第一接頭肽與第二接頭肽是不同的；以及第一抗微生物肽與第二抗微生物肽是不同的。
本發明的STAMP可利用本領域技術人員熟知的任何方法製備。在一個實 施方式中，編碼STAMP的核苷酸序列可通過DNA合成儀合成，或者編碼導 向肽的核苷酸序列可以被直接連接到編碼抗微生物肽基序的核苷酸序列上，或 者通過編碼接頭肽的核苷酸序列連接到編碼抗微生物肽基序的核苷酸序列上。 核苷酸可在合適的表達系統中表達，例如，商業化的細菌、酵母或真核細胞表 達系統。在化學合成方法中，STAMP可利用L-胺基酸對映異構體或D-胺基酸 對映異構體製備。實驗證實，包含D-對映異構體的STAMP穩定性升高，同時 STAMP的活性並沒有降低。
本發明的另一方面涉及包含STAMP和抗生素的STAMP組合物。當STAMP 與殺傷或抑制靶微生物生長的抗生素共同給藥時意外地觀察到具有協同抗微 生物效應。適於和STAMP共同給藥的抗生素包括能抑制微生物生長或殺傷微 生物的合成的或天然的物質。這種抗生素的例子包括而不限於(3-內醯胺類抗生 素(例如，氨苄青黴素、阿洛西林(aziocillin)、氨曲南、羧苄青黴素、頭孢哌酮、 頭孢三嗪、頭孢噻啶、頭孢菌素、鄰氯青黴素、羥羧氧醯胺菌素、青黴素、哌 拉西林和替卡西林)、阿莫西林、桿菌肽、氯黴素、克林黴素、巻麴黴素、粘 菌素M、環丙沙星、強力黴素、紅黴素、夫西地酸、磷黴素、夫西地酸鈉、短 桿菌肽、慶大黴素、林可黴素、米諾環素、大環內酯類、單醯胺菌素、萘啶酸、 新生黴素、氧氟沙星(ofloxdn)、利福黴素、四環素、萬古黴素、妥布黴素和甲 氧苄氨嘧啶。在一個實施例中，STAMP組合物包含G10KHc STAMP(SEQ ID NO 36)和妥布黴素，對生物膜和浮遊培養物中的綠膿桿菌的抗微生物活性有協 同增強效應。
本發明的另一方面涉及包含STAMP和能增強、維持或促進STAMP的功能 或活性的試劑的STAMP組合物。在一個實施方式中，化學物質是蛋白酶抑制 劑。STAMP組合物暴露於存在蛋白酶的環境中，其中蛋白酶的存在可降低 STAMP的活性，例如，通過酶催化降解。蛋白酶抑制劑和STAMP的組合可穩 定STAMP,防止其被蛋白酶降解，因而能增強STAMP的活性。存在蛋白酶的 環境包括，例如，體液(例如，尿液、血液、血清、唾液、痰、粘液)。蛋白酶 包括，例如，中性粒細胞彈性蛋白酶、蛋白水解酶-3、半胱氨酸蛋白酶、金屬
17蛋白酶、絲氨酸蛋白酶或來源於細胞和/或宿主的其他蛋白酶。蛋白酶抑制劑的
例子包括，例如，BMF、 EDTA、 PMFS、節眯、和/或重組a-l抗胰蛋白酶(rAAT)。 在另一個實施方式中，所述試劑是rhDNA酶。STAMP組合物的一個例子 是STAMP(G10KHc(SEQ ID NO 36)和DNA酶的組合。組合物可用於抑制痰中 的綠膿桿菌，可增強G10KHc的抗微生物活性，因為DNA酶可降低痰的粘滯 度，促進STAMP的擴散。
本發明的另一方面涉及包含STAMP和合適藥物載體的藥物組合物。術語 "藥學上可接受的"用於本文中是指藥學上可接受的材料、組合物或載體，例如 液體或固體充填劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包裹材料，參與攜帶STAMP或 將STAMP從一個部位、體液、組織、氣管或身體的一部分轉移到另一個部位、 體液、組織、氣管或身體的一部分。每一種載體都必須是"藥學上可接受的"， 即，與製劑中的其他組分如STAMP相容，並且適用於與人和動物的組織或器 官接觸，不會產生過度的毒性、刺激、變態反應、免疫原性或其他問題或並發 症，具有合理的獲益/風險比。可用作藥學上可接受的載體的材料的例子包括 (l)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)澱粉，如玉米澱粉和土豆澱粉；(3)纖維素 及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；(4)西黃蓍膠粉； (5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)輔料，如可可脂和栓劑蠟；(9)油，如花生油、 棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(IO)醇，如丙二醇；(11)
多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯類，如油酸乙酯和月桂 酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩衝劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無 熱源水；(17)等滲鹽；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩衝液；以及(21) 其他用於藥物製劑中的無毒相容物質。
本發明的另一方面涉及包含導向肽和可檢測試劑的診斷試劑。本發明的診 斷試劑可用於診斷試驗，例如，用於檢測靶微生物易於存在的部位(例如，組 織、器官、體液、痰液、身體或器官表面、黏膜表面、植入物、生物膜、或血 清、裝置、空氣、液體、細胞培養物、工業品或裝置的表面)是否存在靶標或 靶微生物或者其存在的量，或者用於檢測靶微生物相關的疾病(例如，感染或 疾病)的起始、發展或緩解。
在一個實施方式中，導向肽通常用可檢測試劑標記或偶聯到可檢測試劑上。很多可檢測試劑都可以使用，這些試劑通常可分為以下幾類
(a) 放射性同位素，如35S、 14C、 13C、 15N、 125I、 3H和131I。利用本領域熟 知的技術可用放射性同位素標記肽，利用液閃計數可測定放射活性；另外，肽 可進行自旋標記，用於碳和氮標記的電子順磁共振。
(b) 螢光劑，如BODIPY、 BODIPY類似物、稀土金屬螯合物(銪螯合物)、 螢光素及其衍生物、FITC、 5,6羧基螢光素、若丹明及其衍生物、丹醯、麗絲 胺、藻紅蛋白、綠色螢光蛋白、黃色螢光蛋白、紅色螢光蛋白和德克薩斯紅。 螢光強度可利用螢光計定量檢測。
(c) 各種酶-底物試劑，例如，螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶和細菌螢光 素酶)、蟲螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮(2,3-dihydrophthalazinedione)、蘋果酸脫氫 酶、尿素酶、過氧化物酶如辣根過氧化物酶(HRPO)、鹼性磷酸酶、P-半乳糖苷 酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶 和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳酸過氧化 物酶、微過氧化物酶等。酶-底物組合的例子包括，例如(i)辣根過氧化物酶 (HRPO)和作為底物的過氧化氫酶，其中過氧化氫酶可氧化染料前體(例如，鄰 苯二胺(OPD)或3,3',5，5'-四甲基聯苯胺鹽酸(TMB)); (ii)鹼性磷酸酶(AP)和作為 發色底物的對硝基苯基磷酸；以及(iii) (3-D-半乳糖苷酶(P-D-Gal)和生色底物(例 如p-硝基苯基-(3-D-半乳糖苷酶)或發螢光底物A-甲基傘基 (methylumbelliferyl)-(3-D-半乳糖苷酶。
在另一實施方式中，可檢測試劑無需偶聯於導向肽，但是能夠識別導向肽 的存在，並且試劑是可以被檢測的。例如，可檢測試劑是可與導向肽特異性結 合的抗體。然後通過本領域熟知的各種方法檢測抗體(參見，Harlow和Lane， 《抗體 一 實驗室操作手冊》(Antibodies-A Laboratory Manual)( 1988))。
在另一實施方式中，本發明的診斷劑可以試劑盒的方式提供，即，預定量 的試劑和操作診斷試驗的說明書的包裝組合。如果導向肽用酶標記，那麼試劑 盒應該包含酶需要的底物和輔助試劑(例如，提供可檢測發色基團或螢光基團 的底物前體)。另外，試劑盒還可以包含其他附屬物，如穩定劑、緩衝劑(例如， 封閉緩衝劑或裂解緩衝劑)等。各種試劑的相對量的變化範圍很大，只要試劑 溶液中的濃度可以使試驗的敏感性達到最佳即可。更具體地說，試劑可以乾粉的形式提供，通常是冷凍乾燥的，其中包括溶解後可使試劑溶液達到合適濃度 的賦形劑。
根據本發明的另一方面，本發明的組合物(例如，STAMP或STAMP組合 物)可用於殺傷、抑制或降低靶微生物的生長，其中導向肽可與靶微生物特異 性結合。
在一個實施方式中，本發明的組合物可提供對靶微生物的抗微生物效應， 並且可用於治療靶微生物相關的疾病或感染。抗微生物效應包括抑制靶微生物 的生長、殺傷靶微生物或幹擾靶微生物的任何生物學功能。 一般而言，本發明 的組合物可用於治療宿主體內任何部位的疾病或感染，例如，任何組織內的， 其中包括任何組織或植入物的表面。在一個實施方式中，組合物可用於特異性 地殺傷或抑制體液(例如，血液、痰液)內的浮遊靶微生物。在一個實施方式中， 本發明的組合物可用於治療黏膜表面或包含生物膜的表面上疾病或感染。
術語"生物膜"是指積聚在一起的微生物產生細胞外多糖和蛋白物質，這些 物質作為天然膠固定或包埋微生物。生物膜可形成在固體生物或非生物表面。 生物膜基本由非毒性非致病性的共生微生物組成，是維持健康的正常微生物菌 群以防止其他致病性微生物侵入和建立如酵母感染所必須的。但是，如果生物 膜內的微生物群落被過密的致病微生物(例如，生齲齒微生物如突變鏈球菌)破 壞，就會導致生物膜相關的微生物感染。生物膜相關的微生物感染的例子包括 口腔軟組織、牙齒和牙科植入物；中耳；胃腸道；泌尿生殖道；氣管/肺組織； 眼；尿道假體；腹膜和腹膜透析導管，血液透析留置導管和化療藥物慢性給藥 所需的留置導管(Hickman導管)；心臟植入物如起搏器、人工瓣膜、心室輔助 裝置和合成的人造血管和支架；假體、骨內固定裝置和經皮縫合線；以及氣管 和通風換氣管道的感染。內置的和皮下的生物醫學植入物或裝置是微生物或生 物膜感染的潛在位點，是控制感染、炎症和免疫反應的重要靶位。生物醫學系 統如血液充氧器、氣管灌洗機、牙科水單位和透析機也易於被細菌汙染和形成 生物膜。
在另一個實施方式中，本發明的組合物可用於破壞含病原體的生物膜的平 衡(例如，包含過密緻病微生物的生物膜)，這樣不良的致病微生物(靶微生物) 就可以被選擇性地殺傷、抑制或減少，良性的非致病微生物群(非靶微生物)受
20到的影響很小。組合物可用於動物和人體內的許多部位，這些部位具有黏膜表 面，可被多物種微生物膜定居。這些部位的例子包括口腔、陰道、胃腸道(GI)、 食道、呼吸道、植入物。例如，在人口腔內通常存在許多不同的微生物，其中 包括酵母和細菌。大多數細菌是無毒的共生菌。給予本發明的組合物能夠特異 性地靶向到，例如，生齲齒微生物(例如，突變鏈球菌)，對非靶微生物的影響 很小，因此不會對非靶微生物產生不良的效應。
本發明的組合物還可用於抑制人體外的靶微生物或應用到人體外的各種生 物膜表面，例如，工業品或設備。例如，在食品加工工業中，本發明的組合物 可用於食品加工設備或食品本身上以防止食品消耗相關的感染，例如，家禽加 工設備內的沙門氏菌。
本發明的靶微生物可以是任何細菌、立克次體、真菌、酵母、原蟲或諸蟲。 在一個實施方式中，靶微生物是生齲齒微生物如突變鏈球菌。在另一實施方式
中，本發明的靶微生物包括而不限於大腸桿菌(Escherichia coli)、念珠菌 (Candida)、沙門氏菌(Salmonella)、葡萄球菌(Staphylococcus)和假單胞菌 (Pseudomonas)，特別是空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、白色念珠菌 (Candida albicans)、克魯斯念珠菌(Candida krusei)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis),艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、流感嗜血桿菌(Haempohilus influenzae)、 幽門螺旋桿菌 (Helicobacter pylor)、黏膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeroginosa)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、痢疾志賀菌(Shigella disenteriae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)禾口月巿炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)。
例如，突變鏈球菌感染通常見於口腔，可導致齲齒。牙齦卟啉單胞菌 (Porphyromonas gingivalis)、各种放線菌屬的細菌、螺旋菌和黑色色素擬桿菌屬 的細菌通常與齲齒及周圍結締組織的感染有關，可導致牙周病。肺炎鏈球菌、 流感嗜血桿菌或黏膜炎莫拉菌感染常見於急性中耳炎(AOM)和滲出性中耳炎 (OME)，這是幼兒上呼吸道感染的併發症。
幽門螺旋桿菌(H. pylori)可見於胃黏膜層或粘附到胃的黏膜上皮上，90%以 上的十二指腸潰瘍和80%以上的胃潰瘍都是由幽門螺旋桿菌引起的。其他胃腸
21道感染包括而不限於彎曲桿菌感染、主要由空腸彎曲桿菌引起的腹瀉、霍亂弧
菌(Vibrio cholerae)血清群引起的霍亂、沙門氏菌如鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門 氏菌(S. enteritidis)引起的沙門氏菌感染、志賀氏菌如痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)引起的志賀氏菌痢以及腸毒性大腸桿菌(ETEC)引起的旅行者腹瀉。 艱難梭狀芽孢桿菌也常見於胃腸道或食道。
研究證明，假單胞菌通常與同源醫院內爆發有關；另外，假單胞菌也被認 為是引起麻醉藥成癮者菌血症、心內膜炎和骨髓炎的原因。假單胞菌感染也會 發生於患者的耳、肺、皮膚或尿道， 一般發生在原始病原體被抗生素清除後。 嚴重感染幾乎無一例外地與局部組織損傷或宿主抵抗力下降相關。囊性纖維化 和中性粒細胞減少症患者特別容易發生嚴重的綠膿桿菌(P. aeruginosa)感染。早 產兒；先天異常兒童和白血球過多症患者；燒傷病人；以及老年消耗性疾病患 者可能會發生假單胞菌感染。該微生物在尿容器和導管以及醫院工作人員的手 上流行。
葡萄球菌是定居於大多數人類皮膚上的耐寒(hardy)革蘭氏陽性細菌，其中 金黃色葡萄球菌是最重要的人病原體。如果皮膚或黏膜被手術或創傷破壞，葡 萄球菌可能會接近皮下的組織並在其中增殖，形成典型的局部淺膿腫。雖然這 些皮膚感染在大多數情況下不會造成損傷，但是繁殖的微生物可能會侵入淋巴 系統和血液，導致葡萄球菌的潛在嚴重併發症。
這些併發症包括膿毒性休克和嚴重的轉移感染，其中包括幾乎所有器官內 的心內膜炎、關節炎、骨髓炎、肺炎和膿腫。金黃色葡萄球菌的某些菌株可產 生引起皮疹或介導多系統機能障礙的毒素，如中毒性休克症候群。凝固酶陰性 葡萄球菌，特別是表皮葡萄球菌是重要的醫院致病原，特別容易感染脈管導管 和假體裝置。腐生葡萄球菌是尿道感染的常見原因。
酵母或念珠菌感染(念珠菌病)通常發生在口腔(口咽念珠菌(Oropharyngeal Candida)或OPC)或陰道(夕卜陰陰道念珠菌(Vulvovaginal Candida)或WC)。念珠 菌病由皮膚和黏膜表面已經存在的念珠菌菌株(最常見的是白色念珠菌)轉移到 局部環境如口腔和陰道進行不受抑制的繁殖而引起的。淋病衣原體、梅毒和滴 蟲病是生殖道內的感染，可引起性傳播疾病，例如，盆腔炎。
本發明組合物的給藥。STAMP或STAMP組合物可通過本領域熟知的任何給藥途徑給予患者，其中包括而不限於口服、腸內給藥、含服、鼻內給藥、局 部給藥、直腸內給藥、陰道給藥、氣溶膠、透黏膜給藥、表皮給藥、經皮給藥、 眼部給藥、肺內給藥、和/或胃腸外途徑給藥。胃腸外途徑給藥是指一般與注射 有關的給藥途徑，其中包括而不限於靜脈注射、肌肉注射、動脈內注射、鞘內 注射、囊內注射、眼眶內注射、心內注射、真皮內注射、腹膜內注射、經氣管 注射、皮下注射、表皮下注射、關節內注射、被膜下注射、蛛網膜下注射、椎 管內注射和/或胸骨內注射和/或輸注
STAMP或STAMP組合物可以適應不同給藥途徑的製劑形式給予患者。用 於本發明的方法中的製劑包括一種或多種STAMP、 一種或多種藥學上可接受 的載體以及任選其他治療性組分。製劑可以單位劑量的形式存在，可通過藥學 領域熟知的任何方法製備。可與製備單個劑型的載體材料組合使用的活性組分 的量可根據被治療的患者以及特定給藥模式而變化。可與形成藥學有效量的載 體材料組合使用的STAMP的量通常是可產生療效的STAMP的量。 一般而言， 這個量的範圍可以是STAMP佔約1%到約99%，優選約5%到約70%。
製備這些製劑或組合物的方法包括使STAMP和一種或多種藥學上可接受 的載體以及任選一種或多種輔助成分混合的步驟。 一般而言，製劑通過STAMP 與液體載體或精細的固體載體立即均勻混合而製備，然後如果需要使產品成 型。
適於口服的製劑可以是膠囊、扁膠囊、丸劑、片劑、錠劑(使用有香味的基 底，通常是蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠)、粉末、顆粒的形式，或者用水性或 非水液體製成的溶液或懸液，或者水包油或油包水液體乳劑，或者酏劑或糖漿， 或者錠劑(使用惰性基底，如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠)和/或口腔洗劑等， 每種劑型都含有預定量的STAMP作為活性成分。化合物可以丸劑、藥糖劑或
糊劑的形式給藥。例如，在一個實施方式中，本發明的化合物可用於治療或預 防生齲齒微生物感染，如與齲齒相關的突變鏈球菌感染，可作為食品添加劑或 直接接觸口腔環境的任何產品的形式製備，特別是易於生齲齒的口腔環境。為 了治療或預防齲齒，本發明的一種或多種組合物可以製備成兒童製劑、漱口劑、 錠劑、凝膠、塗劑、牙膏、牙籤、牙刷或其他潔齒裝置、局部轉移裝置如緩釋 聚合物或微囊、通過機械方式轉移的各種口腔洗液，或者口腔灌洗劑、假乳頭，以及任何食品，其中包括而不限於口香糖、糖果、飲料、麵包、餅乾和牛奶。
在口服固體製劑(例如，膠囊、片齊IJ、丸劑、錠劑、粉末、顆粒等)中，STAMP 與一種或多種藥學上可接受的載體如枸櫞酸鈉或磷酸二鈣和/或下列任何物質 混合充填劑或增充劑，如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或矽酸；(2) 粘合劑，如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯垸酮、蔗糖和/或阿拉伯 膠；(3)溼潤劑，如甘油；(4)崩解劑，如瓊脂、碳酸鈣、土豆或木薯澱粉、海 藻酸、某些矽酸鹽和碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，如石蠟；(6)吸收促進劑，如 季銨類化合物；(7)溼潤劑，如乙醇和單硬脂酸甘油；(8)吸收劑，如高嶺土和 粘土； (9)潤滑劑，如硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其 混合物；以及(10)著色劑。在膠囊、片劑和丸劑的例子中，藥物組合物還可以 包含緩衝劑。相同類型的固體組合物還可以用作軟膠囊和硬膠囊的填充物，使 用賦形劑如乳糖或奶糖，以及高分子聚乙二醇等。
片劑可通過壓縮或塑型製備，任選添加一種或多種輔料。壓縮片劑可利用 粘合劑(例如，明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩 解劑(例如，澱粉羥乙酸鈉或交聯的羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑。 塑型片劑可通過在合適的機器內塑型粉末肽或惰性液體稀釋劑溼潤的肽模擬 物(peptidomimetic)混合物而製備。可選的是，片劑和其他固體製劑如錠劑、膠 囊、丸劑和顆粒可以用包被和外殼壓痕或製備，如腸衣和藥劑學領域熟知的其 他包被。它們還可以製成能緩釋或控釋STAMP的製劑，例如，利用不同比例 的羥丙基甲基纖維素以提供理想的釋放模式、其他聚合物基質、脂質體和/或微 球。它們可通過，例如，除菌濾膜過濾除菌，或者通過加入固體組合物形式的 能在使用前立即溶於無菌水或某些其他可注射介質的滅菌劑來除菌。可選的 是，這些組合物還可以包含乳濁劑(pacifying agent)，可以是只釋放STAMP的 組合物，或者優選在胃腸道的某些部位以延遲的方式釋放。包埋組合物的例子 包含聚合物和蠟。STAMP還可以是微囊形式，如果合適，用上述一種或多種 賦形劑製備。
用於口服的液體製劑包括藥用乳劑、微乳劑、溶液、懸液、糖漿劑和酏劑。 除了 STAMP之外，液體製劑還可以包含本領域常用的惰性稀釋劑，例如，水 或其他溶劑，增溶劑和乳化劑，如乙醇、異丙醇、炭酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲
24醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特別是棉籽油、花生油、玉米油、 胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和去水山梨糖 醇的脂肪酸酯，以及上述物質的混合物。除惰性稀釋劑之外，口服組合物還可 以包含佐劑如溼潤劑、乳化劑和懸浮劑、香料、調味劑、著色劑、香味劑和防 腐劑。
除了 STAMP之外，懸液還可以包含懸浮劑，例如，乙氧基異硬脂醇、聚 氧乙烯山梨糖醇和山梨坦酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、粘土、瓊脂和西黃蓍 膠，以及上述物質的混合物。
用於直腸或陰道給藥的製劑可以是栓劑，這種劑型可通過一種或多種 STAMP與一種或多種合適的非刺激性賦形劑或載體如可可脂、聚乙二醇、栓 劑蠟或水楊酸酯混合而製成，這種製劑在室溫下是固體的，但是在體溫下是液 體的，因而會在直腸或陰道腔內溶解而釋放活性劑。適於陰道給藥的製劑還包 括陰道栓劑、塞子、乳膏、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴劑，其中含有本領域熟 知的合適載體。
用於局部給藥或者經皮或表皮給藥的STAMP組合物的劑型包括粉末噴霧 齊lj、軟膏、糊劑、乳劑、洗齊lj、凝膠劑、溶液、膏藥和吸入劑。活性組分在無
菌條件下與藥學上可接受的載體以及可能需要的防腐劑、緩衝劑或噴射劑混 合。除了 STAMP組合物之外，軟膏、糊劑、乳劑和凝膠劑還可以包含賦形劑， 如動物和植物脂肪、油、蠟、石蠟、澱粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二 醇、矽酮、粘土、矽酸、滑石粉、氧化鋅，或者上述物質的混合物。除了 STAMP 組合物之外，粉末和噴霧劑還包含賦形劑如乳糖、滑石粉、矽酸、氫氧化鋁、 矽酸鈣和聚醯胺粉末，或者這些物質的混合物。噴霧劑還可以添加常用的噴射 劑，如含氯氟碳氫化合物和揮發性的非取代碳氫化合物，如丁垸和丙垸。
STAMP組合物還可以通過氣溶膠給藥。這可以通過製備含STAMP的水性 氣溶膠、脂質體製劑或或固體顆粒完成。非水性(例如，碳氟化合物噴射劑)懸 液也可以使用。聲波噴霧器也可以使用。水性氣溶膠可通過製備藥物和常用的 藥學上可接受的載體和穩定劑的水性溶液或懸液而製備。根據特定化合物的不 同可選擇不同的載體和穩定劑，但是一般包括非離子型表面活性劑(吐溫類、 普流羅尼類或聚乙二醇)、無毒的蛋白質如血清白蛋白、山梨坦酯、油酸、卵
25磷脂、胺基酸如甘氨酸、緩衝劑、鹽、糖或糖醇。氣溶膠通常用等滲溶液製備。
透皮貼劑也可用於將STAMP組合物轉移到注射部位。這種製劑可通過將
藥物溶解或分散到合適的介質中而製備。吸收增強劑還可用於增加肽模擬物透 過皮膚的流量。這種流動的速度可通過提供速度控制膜或將肽模擬物分散到聚 合物基質或凝膠劑中而加以控制。
眼用製劑、眼藥膏、粉末、溶液等也包括在本發明的範圍之內。
適於胃腸外途徑給藥的製劑包含STAMP和一種或多種藥學上可接受的無 菌等滲水性或非水性溶液、分散液、懸液或乳劑，或者能夠在使用前重組成無 菌注射溶液或懸液的無菌粉末，其中包含抗氧化劑、緩衝劑、制菌劑 (bacterostat)、使製劑與受者血液等滲的溶質,、或者懸浮劑或增稠劑。
可用於胃腸外途徑給藥合適製劑所使用的合適水性和非水性載體的例子包 括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇等)，以及上述物質的合適混合物， 蔬菜油，如橄欖油，和可注射有機酯類，如油酸乙酯。通過使用包被材料如卵 磷脂，通過保持分散劑中所需的顆粒大小、以及通過使用表面活性劑可以維持 合適的流動性。
適於胃腸外途徑給藥的製劑還可以包含佐劑，如防腐劑、溼潤劑、乳化劑 和分散劑。通過添加各種抗洗劑和抗真菌藥物，如氨甲酸苄苯酯、三氯丁醇、 酚山梨酸等可以防止微生物的滋生。在組合物中添加等滲劑如糖、氯化鈉等可 能也是需要的。另外，通過添加使藥物延遲吸收的物質如單硬脂酸鋁和明膠可 以使注射劑具有延遲吸收的特性。
長效注射劑可通過將STAMP加入到生物可降解的聚合物如聚乳酸-聚乙醇 酸交酯的微囊基質內而製備。根據STAMP與聚合物的比例，以及所用特定聚 合物的性質可以控制藥物的釋放速率。其他可降解聚合物的例子包括聚(原酸 酯)和聚(酐)。長效注射劑也可以通過將STAMP包裹到和身體組織相容的脂質 體或微乳劑內而製備。
在本發明的一個優選實施方式中，STAMP組合物可以治療有效量轉移到發 病部位或注射部位。正如藥理學領域所熟知的，在治療一個給定患者時可產生 最大療效的藥物有效量的STAMP的精確劑量要根據特定STAMP的活性、特 性、藥代動力學、藥效學和生物利用度，以及患者的生理條件(種族、年齡、性別、體重、飲食、病種和階段、 一般物理狀況、對給定劑量和藥物的反應性)、 製劑中藥學上可接受的載體的性質、給藥途徑和給藥頻率以及致病靶微生物所 引起的疾病的嚴重程度或習性等而定。但是，上述原則可作為調整治療方案的 基礎，例如，確定最佳給藥劑量，而無需再進行額外的常規試驗來監測患者和
調整給藥劑量。Remington:《藥物科學與實踐》(The Science and Practice of Pharmacy) (Gennaro編輯，20增刊，Williams & Wilkins PA， USA)(2000)。
實施例
實施例1.通過給予一組抗微生物肽靶向殺傷突變鏈球菌。 1.1用於本實施例的STAMP的設計和構建以及STAMP組分(例如，選擇 性導向域/肽、抗微生物肽和接頭肽)。本實施例設計和合成的STAMP及其組 分列於表1中。原始的STAMP是通過合成全長突變鏈球菌-特異性感受態刺激 肽(CSP， 21個胺基酸，SEQIDNOl，突變鏈球菌產生的信息素)並在其C端 或N端添加抗微生物肽G2(SEQ ID N03)(16個胺基酸，來源於廣譜抗微生物 肽諾弗斯匹林G10(SEQ ID NO 35)(Eckert等2006)而構建的。CSP C端的16個 胺基酸被稱為CSPC16(SEQ ID NO 2)，以前的研究證實它還具有信息素活性(Qi 等，2005))，可用作CSP的替代物。然後合成在G2的N端或C端包含CSPC16 的肽，二者之間是含易彎曲胺基酸的接頭區，篩選其抗微生物活性(數據未列 出)。從潛在的STAMP中選擇出由CSPC16、短接頭肽(GGG)和G2(從N端到C 端)(表l)組成的C16G2(SEQIDN0 4)作進一步研究，因為其具有更優良的最低 抑菌濃度(MIC)、明顯提高的殺傷動力學和抗突變鏈球菌的選擇性(與單獨的 G2相比)，如下面詳細描述的。
27表1 -選擇出的STAMP和STAMP組分的肽序列(單字母胺基酸密碼)
肽特性胺基酸序列SED ID No.
CSP信息素SGSLSTFFRLFNRSFTQALGK1
C16(CSPC16)靶向的TFFRLFNRSFTQALGK2
G2抗微生物的KNLRIIRKGIFIBICKY*3
C16G2STAMPTFFRLFNRSFTQALGKGGGKNLRIIRKGIHIIKKY*4
M8或CSPM8耙向的TFFRLFNR5
M8G2STAMPTFFRLFNRGGGKNLRHRKGIffllKKY*6
S6L3-33抗微生物的FKKFWKWFRRF7
C16-33STAMPTRRRLFNRSFTQALGKSGGGFKKFWFRRF TFFRLFNRSGGGFKKFWKWFRRF8
M8-33STAMP9
1903靶向的NIFEYFLE10
BD2.21抗微生物的KLFKFLRKHLL11
1903-G2STAMPNIFEYFLEGGGKNLRHRKGIHnKKY12
1,-BD2,21STAMPNIFEYFLEGGGKLFKFLRKHLL13
C16-BD2.21STAMPTFFRLFNRSFTQALGKGGGKLFKFLRKHLL14
M8-BD2.21STAMPTFFRLFNRGGGKLFKFLRKIILL15
l%3-33STAMPNIPEYFLBGGOTaCFWKWFRRF17
*代表肽的(3端醯胺化
下劃線部分為導向肽和殺傷肽之間的接頭區
為了確定在CSPcw序列內是否有負責突變鏈球菌特異性結合的區，我們合 成了一系列螢光素標記的CSPd6片段，並分析其結合突變鏈球菌的能力。利用
下面的策略仔細分析CSPa6序歹i」(表2):首先，通過沿CSPd6序列從N端到C 端製造3或4個胺基酸的缺失構建一系列片段(C 16-1到C16-5)。另外再合成 缺乏CSPa6C端或N端較大片段的肽。另外，構建包含精氨酸到天冬醯胺(正 電荷到負電荷的變化)(C16-4)或苯丙氨酸到甘氨酸取代(疏水性總體下降)的肽 以及代表C16序列的4殘基丙氨酸掃描的肽(C 16-15到C 16-18)。按照以前描 述的方法(15)進行結合試驗，結果總結在表2中。測定CSPd6和包含CSP的蘇 氨酸6到精氨酸13(TFFRLFNR， SEQ ID NO 5)的任何肽與突變鏈球菌UA 159 或comD細胞的結合，與CSPd6相比，任何通過缺失、取代或丙氨酸掃描而造 成的對該區的中斷的螢光素結合能力都有下降。只包含Thr6-Phe11和 Phe7-Phe11的某些肽如C16-3、 -11、 -16和-17具有結合能力，但是與CSPC16 或包含完整Thr6-Arg13區的任何其他肽相比其結合活性更弱。另外，我們觀 察到精氨酸到天冬醯胺或苯丙氨酸到甘氨酸的取代不利於細胞結合，說明TFFRLFNR(SEQ ID NO 5，被稱為M8或CSP柳)內的這些殘基是與突變鏈球菌 結合所必須的。CSPms與表3所列的其他口腔鏈球菌的結合能力很弱或者根本 不結合，說明CSPM8可能還與突變鏈球菌表面特異性結合。總之，表中所列的 與突變鏈球菌有陽性結合的肽都可用作抗突變鏈球菌的導向肽。這些肽包括 C16(SEQ ID NO 1)、 C 16-3(SEQ ID NO 39)、 C 16-4(SEQ ID NO 40)、 C 16-5(SEQ IDN041)、 C 16-6(SEQIDN0 42)、 C 16-11(SEQ ID NO 47)、 C16-12(SEQID NO 5)、 C 16-16(SEQIDN0 51)、 C16-17(SEQ ID NO 52)和C16-18(SEQ ID NO 53).
表2 - CSP片段肽與突變鏈球菌的結合 報導的相對結合代表UA159和comD的結果
相對的 突變鏈球菌
肽 胺基酸序列 結合
突變鏈球菌1903(SEQ ID NO 10)特異性的導向肽和抗微生物肽 S6L3-33(SEQ ID NO 7)和BD2.21(SEQ ID NO 13)是在發明者的實驗室開發的 (參見實施例4)。導向肽通過接頭GGG(SEQ ID NO 17)偶聯於抗微生物肽形成 STAMPS C16-33(SEQ ID NO 8)、 M8-33(SEQ ID NO 9)、 1903-BD2.21(SEQ ID
+++
++ +++
+
+
++
C16(SEQIDN01) T 3到4個胺基酸內部缺失
C16-1(SEQIDN037) -
C16-2(SEQIDN038^ T
C16-3(SEQIDN039; T
C16-4(SEQIDNO40) T
C16-5(SEQIDN041) T 末端缺失
C16-6(SEQIDN042) T C16-7(SEQ IDN043) C16-8(SEQ IDN044)
C16-9(SEQIDN045) T
C16-10(SEQIDNO46) T
C16-11(SEQIDN047; T
C16-12(SEQIDN05) T (CSPM8) 取代
C16-13(SEQIDN048) T
C16-14(SEQIDN049) T
丙氨酸掃描
C16-15(SEQIDNO50) A
C16-16(SEQIDN051) T
C16-17(SEQIDN052) T
C16-18(SEQIDN053) T
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A F F F14)，所有這些都以C16G2和M8G2相同的
方式進行檢測。
表1和表3所列的所有肽都是按照以前文獻描述的方法(Eckert等，2006) 利用雙偶聯循環通過標準的9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成方法(431A肽合成 儀，應用生物科技公司(Applied Biosciences)或Apex396，高級化學計數公司 (Advanced Chemtech))合成的。完整的肽用95。/。的三氟乙酸(TFA)和合適的清除 劑從樹脂上裂解下來，通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)(ACTA純化儀(ACTA Purifier),愛默生公司(Amersham))純化至90-95%。肽的分子量通過襯質輔助激 光解吸/電離(MALDI)質譜確定。帶有用醯胺化的C末端的肽C16G2、 G2和 M8G2用Fmoc-Tyr (tBu)-Rink Amide MBHA樹脂合成(Anaspec)。其他所有肽都 用適當取代的Wang樹脂合成。
1.2肽的螢光標記和螢光顯微鏡。CSPc16(SEQ ID NO 2)、 CSP-片段肽(表 2)和C16G2(SEQ ID NO 4)按照以前描述的方法(Eckert等，2006)用羧基螢光素 (西格瑪公司)標記。在肽裂解下來以後，進行細菌標記試驗之前，利用螢光計 數儀測定每HM肽所具有的螢光強度(、x-488nm， Xem=520nm， VersaFluor，伯 樂公司(BioRad))，結果發現是相對一致的(數據未顯示)。為了評價肽與細菌的 結合水平，用磷酸鹽緩衝液(lxPBS)洗滌的過夜培養物(OD60(T0.7-1.0)來源的鏈 球菌，用lxPBS按l:2稀釋，並於25'C暴露於肽(16 pM)5分鐘。與肽共孵育 以後，通過三次離心(5分鐘，16,000 x g)從細菌上洗去未結合的肽，懸浮於l XPBS中。口腔鏈球菌的標記利用40倍放大的亮視野和螢光顯微鏡(Nikon E400)評價。利用廠家提供的軟體(SPOT，診斷學公司(Diagnostics))獲取數字圖 像用於半定量結合分析。
1.3確定抗微生物活性。肽抗浮遊細菌的抗微生物總活性通過在TH肉湯 中進行MIC試驗(所有鏈球菌)來確定(Qi等，2005)。
突變鏈球菌、格式鏈球菌Challis(DLl)和血鏈球菌NY101株用Todd Hewitt (TH， Fisher)肉湯培養基在37。C缺氧條件(80。/。N2， 10%<:02和10%1^2)下培養。 突變鏈球菌菌株UA159(Ajdic等，2002)、 ATCC 25175和T8(Rogers, 1975)是野 生型的臨床分離株，而comD是敲除突變株，是以前從野生型UA140背景中 構建出來的(Qi等，2005)。表達螢光素酶的突變鏈球菌菌株JM11構建自
30UA140，如文獻所述(Merritt等，2005)。處於指數生長期的細菌細胞用TH稀 釋到約lx105 cfu/mL，加入到96孔板(Fisher)中。然後對肽進行系列稀釋，加 入到細菌內。通過測定孵育約24小時後能完全抑制細菌生長的肽的濃度來確 定MIC。
1.4確定殺菌動力學。為了確定C16G2和G2的短期殺傷率和選擇性，我 們基本按照以前文獻描述的方法(Eckert等，2006)進行了時間-殺傷試驗。突變 鏈球菌UA159、格式鏈球菌或血鏈球菌培養到指數生長期，用培養基稀釋到 lx105 cfU/mL。在缺氧條件下將25 |xM G2或C16G2加入到細胞懸液內，25 'C孵育。在1分鐘時，取出10 pL細胞懸液，通過稀釋到生長培養基(1:50)內 使其復甦，置於冰上。為了接種，20-500 復甦細胞塗布在生長培養基瓊脂 板上，在37。C缺氧條件下孵育過夜，然後計數長出的克隆。我們將60cfii/mL 設定為本試驗的檢測下限。存活cfu/mL的值表示為C16G2處理培養物的存活 細菌數與暴露於G2的樣品的cfu/mL之比。
1.5抗單一物種生物膜的抗微生物活性的檢測。為了啟動生物膜的形成， 每孔約1X1(T細菌(來源於過夜培養物)接種到96孔平底培養板內，培養基為 TH培養基(IOO ^L)。除突變鏈球菌外，所有鏈球菌所用的培養基都添加 0，/。(w/v)甘露糖和葡萄糖。突變鏈球菌UA159生物膜在含0.5n/。(w/v)蔗糖的培 養基內生長。然後短時離心培養板使細胞成團，然後在37'C孵育3-4小時以便 於生物膜形成。孵育以後，小心去除上清液，生物膜用25pMlxPBS稀釋的肽 或lxPBS處理1分鐘。然後去除肽溶液，加入100 進一步稀釋殘留的肽。 為了使生物膜的損失達到最少，在加入TH後短暫離心細胞，然後去除上清液， 加入含合適糖的新鮮培養基。然後在37'C缺氧條件下培養，通過用微孔板分光 光度計(BenchmarkPlus，伯樂公司)測定006。。處的吸光度值來監測生物膜隨時 間的生長情況。
1.6抗唾液內細菌生物膜的抗微生物活性的評價。為了進行這些試驗，我 們採用了與以前報導的那些方法(Bleher等，2003)相似的方法。在試驗前一天， 收集5個成人志願者的唾液並儲存在實驗室內，用TH肉湯按1:4稀釋，2，000xg 離心10分鐘。然後上清液過濾除菌(0.2 pm濾膜,Nunc)，儲存於4'C。 一部分 儲存的唾液用lxPBS按l:2稀釋，按照上述方法處理。在試驗的那一天，JM11
31和其他口腔鏈球菌的過夜培養物調整到OD6Q 1.0，每一種細菌以 3X106 cfu/mL的濃度加到lOmLTH稀釋的唾液內。然後添加蔗糖、甘露糖和葡萄糖 (濃度都為ln/。w/v)，混合溶液。將唾液和細菌的部分(500 pL)混合物加到1.5 mL 離心管(Fisher)內。短暫離心(4，000xg， 2 min)後，試管於37。C孵育3-4小時以 形成多物種生物膜。然後去除上清，加入100 pL PBS稀釋的唾液(1:2)加25 pM(新鮮加入的)肽。生物膜暴露於藥物5分鐘後，去除PBS-唾液，細胞短暫 離心，然後加入500 含糖的新鮮TH-唾液。在每一個時間點，通過讀取OD600 的吸光度值測定總生物膜生長情況，按照以前描述的方法(Merritt等，2005)根 據螢光素酶的相對表達水平(相對光單位，(RLU)產量)確定菌群內突變鏈球菌 的健康度。簡言之，通過振蕩和抽吸重懸生物膜，將每種100 ^L樣品轉移到 新離心管內，其中包含懸浮於0.1M、 pH6.0的檸檬酸緩衝液中的25^iLlmM D-螢光素(西格瑪公司(Sigma))溶液。在2小時時間點，在記錄螢光素酶活性前 半小時通過加入1%蔗糖重懸以刺激生物膜。利用TD 20/20發光計(騰納生物系 統公司(Tumer Biosystems))測定RLU產量，報導的數值來源於3個獨立樣品的 平均值。數據標示為隨時間的RLU/OD^。
1.7 C16G2具有升高的抗浮遊突變鏈球菌細胞的抗微生物活性。為了評價 C16G2抗微生物活性和一般特異性，進行抗一組細菌其中包括突變鏈球菌的各 種菌株以及密切相關的口腔鏈球菌的最低抑制濃度(MIC)試驗(Gilmore等， 1987)。如圖3所示，C16G2對所有檢測的突變鏈球菌菌株的MIC值都在3-5 DM 之間，比親本抗微生物肽G2的抗微生物活性(12-20 DM)高4-5倍。但是，我 們觀察到G2和C16G2抗格式鏈球菌和血鏈球菌的敏感性差異不大(2倍或更 低)。
孵育24小時以後，G10KHc(SEQIDNo36)的MIC並沒有多大升高，但是 在短時間暴露過程中其抗耙細菌的殺傷動力學和特異性都有明顯提高(與非靶 向親本抗微生物肽相比時(Eckert等，2006)。因此，我們進行了比較試驗以檢 測在短時間暴露後C16G2和G2抗其靶和非靶細菌的殺傷能力。如圖1所示， 經過1分鐘的暴露後，C16G2抗其靶細菌突變鏈球菌的活性比G2高20倍以 上，而其抗其他鏈球菌的活性與G2相似。這些結果首先說明在G2上添加 CSPC16導向區可賦予其抗突變鏈球菌而不是其他密切相關的口腔鏈球菌的選表3 -含G2的STAMP和STAMP組分抗菌MIC MIC代表至少三個獨立試驗的平均值加標準差
菌株CSPCSIPci6MIC(>M) G2C16G2CSPm8M8G2
突變鏈球菌
UA159 50.8±9.3>6012.1±4.53.0±1.6>603.25±1.9
25175>60>6014.8±2.03.8±0.3>603.5±0.5
T8>60>6014.2±1.53.7±0.2>60nt
>60>6015.3±4.25.1±2.4>604.0±2.0
非突變的鏈球菌
格氏鏈球菌>60>603±14.023. 5±7.8>6020±5.0
血鏈球菌>60>6033 .6±7.519.1±4.0>6015±2.5
1.8 C16G2也具有抗生物膜細胞的活性。突變鏈球菌主要存在於體內處於 生長狀態的生物膜內。本領域熟知的是，生物膜相關細胞對抗生素的耐藥性會 升高100-1000倍(Donlan等，2002)。為了檢測C16G2是否還具有抗體外的突 變鏈球菌生物膜的活性，用25DMC16G2、 G2、 CSP、 CSPcw或lxPBS處理 生物膜相關的突變鏈球菌、格式鏈球菌或血鏈球菌1分鐘，洗滌，監測其隨時 間的從新生長情況。如圖2所示，在加入和去除肽以後，暴露於所有被測肽的 格式鏈球菌或血鏈球菌生物膜的生長與未處理的生物膜相似(圖2A-B)。與此相 反，經C16G2處理後，突變鏈球菌菌株UA159(圖2C)以及T8和25175(數據 未顯示)的生長受到明顯抑制，但是用其他肽處理的菌株的生長未受影響。這 些結果說明C16G2可以作為抗突變鏈球菌STAMP,只需很短的一段暴露時間 (1分鐘)就能在生物膜環境中發揮功能，這段時間與口腔的臨床治療時間相似 (Axelsson&Lindhe， 1987)。
1.9 C16G2可以選擇性地從混合物種生物膜中清除突變鏈球菌。除了作為 體內的生物膜生長以外，突變鏈球菌通常還會存在於唾液中，因為它們會粘附 在牙齒表面。為了檢測C16G2是否能夠選擇性地殺傷這些條件下的突變鏈球 菌，將兩種非生齲齒口腔鏈球菌(格式鏈球菌和血鏈球菌)與突變鏈球菌JM11 混合，JM11中包含一個位於螢光素酶(luc)和組成性活化基因乳酸脫氫酶(ldh) 啟動子之間的轉錄融合因子，該菌株對C16G2的敏感性與野生型UA159相似。 在以前的研究中，JM11被用於檢測突變鏈球菌菌群的適應性，結果發現相對 光單位(RLU)產量的下降與細胞活力的降低密切相關(Merritt等，2005)。利用
33唾液製備混合物種生物膜，然後在唾液中加入肽(25 pM)，處理5分鐘，去除 肽以後繼續監測生物膜在處理後的生長情況。同時通過測定螢光素酶的表達來 定量測定生物膜內活突變鏈球菌的細胞數。研究發現，經過5分鐘的暴露後， 與CSPd6和G2相比，C16G2能夠明顯抑制混合物內的突變鏈球菌菌群(反映 在低螢光素酶活性上)(圖3)。令人感興趣的是，即使在處理後120分鐘時，混 合物內的突變鏈球菌總是依然很低(圖3)。總之，這些結果說明短時間暴露於 C16G2就能夠選擇性地抑制唾液存在的條件下多物種生物膜內的突變鏈球菌 的生長最少達2小時，同時不會損害其他細菌或影響生物膜的健康度。
1.10 C16G2升高的抗微生物活性與CSPd6和突變鏈球菌靶向ComD非依 賴的結合有關。為了進一步探究C16G2抗突變鏈球菌的活性升高的機制， CSPd6禾卩C16G2用螢光素標記，檢測它們與突變鏈球菌以及其他鏈球菌結合 的能力。根據所觀察到的殺傷活性，我們發現CSPa6和C16G2能夠在很短的 時間暴露後(l-2分鐘)特異性地結合突變鏈球菌，但是不與其他口腔鏈球菌結合 (數據未顯示)。以前的遺傳學研究表明CSP可與ComD相互作用，活化突變鏈 球菌內DNA的感受性(Li等，2001)。我們意外地發現UA159和comD菌株具 有相似的MIC(表3)。根據這個結果，我們還發現螢光素標記的CSPd6和C16G2 以相同的方式與UA159和comD突變株結合，說明CSP與突變鏈球菌的特異 性結合能力是ComD非依賴性的。
1.11M8G2與C16G2具有相似的抗突變鏈球菌活性。根據上述數據，我們 推測CSPM8可能也能夠作為另一個導向區發揮抗突變鏈球菌STAMP的功能， 為了驗證我們的推測，將CSP雄和G2合成在一起形成STAMPM8G2 (表1)。 如表3所示，與C16G2相比，M8G2具有相似的抗突變鏈球菌及其他口腔鏈球 菌MIC。另外，單一物種生物膜抑制試驗表明，經過l分鐘的暴露後，M8G2 與C16G2 —樣能夠抑制突變鏈球菌生物膜的恢復(圖4A)，但是不能抑制血鏈 球菌的恢復(圖4B)。由於CSP柳區比CSPc!6更短，因此更容易化學合成，這 些結果為下一步設計更短的基於CSPM8的抗突變鏈球菌STAMP提供了基礎。
1.12 CSPC16/CSPM8引導的STAMP作為另一種殺傷區是有功能的。由於 STAMP的耙向組分和抗微生物組分在功能上是獨立的，因此儘管它們是作為 一個肽合成的(Eckert等，2006)，但是我們有理由確信CSPd6或CSP柳與不同
34的通用抗微生物肽的組合對突變鏈球菌的殺傷活性和選擇性比單獨的非耙向
殺傷肽相比要高。因此，兩種導向肽以C16G2和M8G2相同的排列方式與廣
譜抗微生物肽S6L3-33偶聯形成STAMP C16-33和M8-33(表1)。如表4所示，
S6L3-33與衍生的STAMP之間抗突變鏈球菌和其他口腔鏈球菌的MIC差異為
2-3倍。但是，在進行單一物種生物膜試驗時(圖5所示)，STAMP的突變鏈球
菌選擇性活性是很容易觀察到的，C16-33和M8-33在短時間暴露後都能夠抑
制突變鏈球菌生物膜的生長(圖5A)，而血鏈球菌培養物不受STAMP處理的影
響(圖5B)。這些結果說明突變鏈球菌生物膜特異性的STAMP的活性明顯升高。
表4 -用S6L3-33抗微生物區構建的STAMP的MIC
MIC代表至少三個獨立試驗的平均值加標準差
_MIC(gM)_
肽 UA159 comD 血鏈球菌 格氏鏈球菌
S6L3-33 7.0±3.0 6.5±2.5 40±7.5 20±5.0
C16-33 2.5±2.1 2.2±0.5 13.3±5.8 14.6±5.0
M8-33 2.5±2.0 2.5±2.0 20±2.0 10±2.5
總之，我們合成並評價了具有突變鏈球菌而不是其他口腔鏈球菌特異性的 一系列STAMP。我們通過插入一部分天然信息素設計出了具有突變鏈球菌選 擇性活性的STAMP,其中天然信息素是由這些生齲齒細菌(CSP)產生的，這種 插入的片段作為線性STAMP肽內的導向區。通過只利用短(小於3kD)線性肽 作為導向區和抗微生物區，我們能夠通過固相化學合成方法快速合成和分離一 條完整的STAMP分子，與以前所描述的(Qiu等，2005)構建大的(大於70kD) 蛋白靶向抗微生物肽所需的重組表達和複雜純化途徑相比，本發明的方法具有 明顯的優勢。另外，在構建抗突變鏈球菌的STAMP時通過導向區(CSPM8和 CSPd6)和殺傷區(G2和S6L3-33)的不同組合之間的轉換，使合成途徑具有了很 大的靈活性，因而能夠使我們很容易地提高STAMP的多樣性，否則要完成這 一任務就需要複雜的克隆過程。
如圖5所示，CSP^和CSPM8能夠與其他抗微生物肽(S6L3-33)偶聯而不會 丟失突變鏈球菌選擇性殺傷能力。這一發現進一步證明了 STAMP導向區和抗 微生物區在功能上是互相獨立的，並且能夠以不同的組合相連接而不會丟失活 性這一概念。這說明未來構建STAMP將是一個無限的"和諧"過程，因為可以 合成抗微生物區、接頭區和導向區的無數組合以便於篩選出具有最佳特異活性的STAMP。另外，通過轉換成其他功能類似的STAMP組分，可以很容易地克 服STAMP的細菌耐藥性(應該是進化出的)(Perron等，2006)，正如本研究中用 G2和S6L3-33所做的。另外，肽信息素被致病性細菌廣泛使用，尤其是革蘭 氏陽性微生物，因此它代表一個大的而且不斷增大的群，可以從中篩選出其他 導向肽用於STAMP構建。
C16G2、 M8G2、 C16-33和M8-33表現出了很強的抗浮遊培養物中的以及 單一物種和多物種生物膜內的耙向突變鏈球菌的特異性活性，說明我們能夠構 建一系列能夠區分突變鏈球菌和其他非生齲齒口腔鏈球菌的功能性STAMP。 這種選擇性活性與這些肽的低細胞毒性(Eckert等，未發表的數據)的組合說明 它們可用於開發抗齲齒治療藥物。目前，治療突變鏈球菌感染的方法包括禁止 吃糖、機械清除牙菌斑和常用的殺菌漱口劑。所有這些方法都只能達到不同程 度的臨時效果，同時機械清除或常用的抗生素治療會不可避免地導致正常菌群 的丟失，這樣會使突變鏈球菌很容易地在口腔內重新建立生態位(Caufidd等， 2000)。因此，具有病原體選擇性(如突變鏈球菌選擇性)殺傷能力的STAMP是 一種理想的解決方法，能夠選擇性地殺傷或抑制菌群內的致病菌(例如，突變 鏈球菌)，同時使影響突變鏈球菌菌群的正常菌群過度生長。這種"抗生素-益 生元"(antibiotic-probiotic)治療方法可幫助預防齲齒發展，減少治療這種疾病 所需的高額醫療費用(Anderson&Shi， 2006)。
實施例2.通過共同給予G10KHc和妥布黴素提高抗綠膿桿菌的抗微生物 活性。
2.1綠膿桿菌是常見的人機會致病菌，與致命的急性感染和囊性纖維化期 間的慢性呼吸道定居有關。在美國專利申請出版號NO. 20040137482中， 一個 廣譜抗微生物肽諾弗斯匹林G10被轉化成選擇性靶向抗微生物肽 (STAMP)G10KHc。與諾弗斯匹林G10相比，G10KHc STAMP抗門多薩假單 胞菌的殺傷能力升高。在這個試驗中，我們研究了 G10KHc的抗綠膿桿菌抗微 生物活性，發現G10KHc STAMP與妥布黴素共同給藥對殺傷活性具有協同增 高效應。
2.2 G10KHc STAMP及其組分。G10Hc STAMP包含如下序列和組分 G10KHc [導向S太-Mtt-抗微生物肽，下劃線部分是接頭肽]:
36KKHRKHRKHRKHGGSGGSKNLRRIIRKGIHIIKKYG(SEO ID NO 36) G10(諾弗斯匹林)抗微生物肽KNLRRIIRKGIHIIKKYG(SEQ ID NO 35) Cat-1 (也被稱為KH)導向肽KKHRKHRKHRKH(SEQ ID NO 31) 接頭肽GGSGGS(SEQ ID NO 28)。
利用Fast-Fmoc(9-芴甲氧羰基)法在431A肽合成儀(應用生物科技公司)上進 行肽 G10(KNLRRIIRKGIHIIKKYG ， SEQ ID NO 35)禾卩 GlOKHc (KKHRKHRKHRKHGGSGGS-KNLRRIIRKGIHIIKKYG， SEQ ID NO 36)的固 相合成。利用95% TFA和合適的清除劑從樹脂上裂解下完整肽。肽的分子量 通過襯質輔助雷射解吸/電離(MALDI)質譜(Voyager系統4291，應用生物系統 公司(AppliedBiosystems))確定，粗肽用反相高壓液相色譜(HPLC， ACTA純化 儀，愛默生公司)純化，同時監測UV215。HPLC過程中的流動相包含水/乙腈(含 0.1%三氟乙酸)，流速為0.5mL/分(Sourcel5RPC層析柱，愛默生公司)。純化 的G10KHc的HPLC和MALDI結果顯示於圖6中。純化後，在保留體積10.06 mL處觀察到了 G10KHc的單一峰(圖6A)，這與G10KHc的預測分子量一致(預 測的為4267.08，觀察到的是4267.44)，如圖6B所示。
2.3抗微生物活性。利用以前文獻報導的(Eckert等，2006)最低抑菌濃度 (MIC)試驗來評價G10KHc、 G10和妥布黴素抗綠膿桿菌臨床分離株的抗微生 物總活性，結果顯示在表5中。MIC表示為|iM， 1 pM妥布黴素=0.468 pg/mL。 綠膿桿菌生長到指數生長期，用馬—欣二氏(MH)肉湯調整到 lx105 cfU/mL的 濃度，加到96孔板內。然後將二倍系列稀釋的肽加到細菌上，培養板在37'C 孵育18-24小時。根據最後一個清晰孔(無細菌生長)的肽的濃度來確定MIC。 正如所預期的，與單獨的G10相比，G10KHc的抗綠膿桿菌臨床分離株活性明 顯升高(斯氏t檢驗，p = 0.001): G10KHc的MIC為0.5到29 pM(平均6.22 |iM)， 而G10的MIC為10到60 pM(平均23.4 jxM)。由於KH區(或Cat-l肽)自身不 具有任何抗微生物活性，因此G10KHc抗綠膿桿菌活性的升高可能是由KH與 假單胞菌spp的靶向結合能力導致的，如以前所報導的(Eckert等，2006)。與 妥布黴素不同，GlOKHc還能有效地抑制對氨基糖甙類抗生素和多抗生素耐藥 的分離自CF患者(AGRIO， MR15)的綠膿桿菌。另外，由於黏膜綠膿桿菌通常 與對抗微生物藥物的敏感性下降有關，因此當我們發現GlOKHc具有抗此類菌株PDO300的活性時倍受鼓舞。總之，G10KHc抗被測敏感分離株的活性與妥
布黴素不同(一般低1-2個稀釋步驟)。
表5 -妥布黴素、G10和G10KHc抗綠膿桿菌實驗室和臨床分離株的MIC。
表中所示的是至少三次獨立試驗的MIC平均值。單獨的KH導向區沒有抗微
生物活性(數據未列出)。作為參考，1 ^M妥布黴素=0.468嗎/mL。
MIC(iiM)
菌株G10KHc諾弗斯匹林G10妥布黴素
PAOl6232.5
PA145.5100.7
PAK5.5132.12
PDO300*645nt
ATCC 156926163.05
ATCC 275836161.75
ATCC 101454.514.51.75
ATCC 90275.5152.12
AGR101.11855
MR150.51455
S4029600.4
S603.13300.4
S1001.1303.5
*類粘蛋白表型，nt:未檢測到
時間-殺傷(殺傷動力學)試驗基本按照以前文獻報導的方法進行(Eckert等， 2006)。簡言之，綠膿桿菌培養到指數生長期後用含30。/。小鼠血清(MP生物藥 品公司(MPBiomedicals))的LB稀釋到 lx105 cfli/mL(中等密度的浮遊培養物)， 然後在細胞懸液中加入10pM妥布黴素、G10或G10KHc。在每一個時間點取 10pL培養物，稀釋到500(iLLB中以恢復綠膿桿菌細胞，置於冰上直到接種。 接種到LB瓊脂上，在缺氧條件下37'C孵育過夜，然後測定存活cfo/mL。
如圖7所示，殺傷動力學試驗結果表明G10KHc抗綠膿桿菌的殺傷活性明 顯高於G10:用10 G10KHc處理培養物就可以使活綠膿桿菌數下降(30分 鍾時降到100 cfo/mL以下)，而G10在整個試驗周期中都是無效的。G10KHc 抗微生物活性率與等摩爾劑量的妥布黴素(4.68 pg/mL)相似。這些結果說明 G10KHc與妥布黴素具有相似的抗臨床分離株和實驗室株的能力，G10KHc可 抑制耐藥性綠膿桿菌的生長。另外，數據還說明G10KHc發揮有效的綠膿桿菌 細胞殺傷作用需要KH假單胞菌屬導向區單獨的G10的活性很低，除非孵育
3818-24 h(表5)。
2.4 G10KHc和妥布黴素的協同殺傷效應。為了評價G10KHc與妥布黴素之 間升高的抗高密度浮遊培養物的活性，ATCC 15692培養過夜，用ddH20 (pH 7.4) 調整到 lxlOcfu/mL，然後暴露於5pM妥布黴素、5 G10KHc或二者的組 合(5 hM妥布黴素(2.34 ing/mL)和5 G10KHc或G10的組合)。24小時後通 過稀釋來復甦IO pL經處理的培養物，接種到LB上，在LB瓊脂上生長後計 數，計算存活cfu/mL。.
如圖8所示，我們觀察到當妥布黴素和STAMP(但不是G10)共同給藥時殺 傷活性明顯升高。共處理培養物的存活cfii/mL( lx103 cfu/mL)比未處理培養物 的水平( lx108 cfii/mL)或暴露於妥布黴素或G10KHc的那些cfli/mL (分別為 lxlO、fU/mL和 lxlScfu/mL)低5個數量級。這些結果說明，當聯合使用時， 這些藥物比單一組分具有明顯升高的抗浮遊綠膿桿菌活性，24小時後幾乎可以 清除所有的高細胞密度培養物，即使G10KHc的使用濃度低於被測菌株的 MIC。
2.5 G10KHc和妥布黴素對生物膜的協同殺傷效應。我們還觀察了妥布黴素 和G10KHc之間抗生物膜相關綠膿桿菌的協同殺傷效應。在該試驗中，旋轉平 皿生物膜反應器系統用於測定生物膜對妥布黴素、G10和G10KHc的敏感性定 量數據。系統包括一個反應器，其中包含250 mL稀釋的胰酶解大豆酪蛋白肉 湯(TSB)(1:100)培養基。反應器用過夜培養物接種(1%， v/v)。在TSB中靜態生 長過夜後，開始啟動新鮮培養基流(稀釋速率為0.7h")。在培養基流中培養24 小時以後，按照無菌操作從旋轉皿上取下附著有生物膜細菌的聚碳酸酯小片， 用ddH20(pH7.4)洗滌三次，然後在1 mLddH20中孵育。按照說明加入GIO(IOO pg/mL)、 GlOKHc(lOO pg/mL)、妥布黴素(IOO ^g/mL或者二者的混合物。然後 將小片放入24孔組織培養板(Falcon，編號353047; BD實驗室設備公司(Becton Dickinson Labware)，富蘭克林湖(Franklin Lakes),紐約州)孵育4小時或24小 時。為了估計剩餘活綠膿桿菌數，平皿置於lmLPBS中，利用組織勻漿器(布 林克曼儀器公司(Brinkmann Instruments),西拜瑞(Westbury)，紐約州)分散細胞， 通過系列稀釋和接種到LB瓊脂上確定每個小片上的總cfU。
如圖9所示，單獨的100 pg/mL G10KHc或100 |xg/mL妥布黴素在處理4小時後，甚至是24小時後，其抗綠膿桿菌生物膜的殺傷效應也是很有限的。
但是100昭/mL G10KHc和100 pg/mL妥布黴素的混合物在4小時後就能明顯 降低存活cfb/mL的水平，與單個藥物相比殺傷活性提高4個數量級。更引人 注目的是，當組合藥物與綠膿桿菌共孵育24小時以後，沒有檢測到cfu/mL(下 降近5個數量級)。這些數據說明當G10KHc和妥布黴素用於在體外抑制綠膿 桿菌生物膜時可以使殺傷活性明顯升高。另外，這些結果與圖8的結果一致， 說明G10KHc和妥布黴素可以發揮協同效應以抑制綠膿桿菌浮遊或生物膜模 式的生長，儘管還需要做進一步的試驗來確立完整的協同活性。
2.6 G10KHc介導的膜滲透性。圖8和圖9的結果說明G10KHc共同處理可 提高妥布黴素的細胞殺傷率。在缺少肽時，細菌對妥布黴素的有效攝取是一個 需要完整A平梯度(質子動力勢的電位)的主動過程，在有氧呼吸期間達到最大 水平。這個過程在缺氧環境中可能是緩慢的，或者缺少這個過程，(例如在生 物膜內部)，說明妥布黴素彌散透過綠膿桿菌膜(或者缺乏這個過程)在這些細菌 對氨基糖甙類抗生素耐藥的至少一個機制中發揮關鍵作用(14， 33， 40)。因此， 由於G10KHc內含有可破壞膜的AMP區，並且以前文獻報導G10KHc具有抗 外膜活性(ll)，因此我們推測G10KHc可能會導致綠膿桿菌的外膜和內膜透化， 增加妥布黴素的攝取，產生所觀察到的協同效應。
為了確認G10KHc對膜的破壞可以介導小分子在細胞內的積聚，將綠膿杆 菌的過夜培養物按1:50稀釋到LB內，使其生長到指數生長期(3-4小時， lxl05 cfu/mL)，然後進行模擬處理，或者用2 G10KHc處理。5分鐘後，在存在 或缺少亞致死濃度的G10KHc(2 pM)的情況下，按照廠家的說明書用碘化丙啶 (PI)(LIVE/DEADBaclight Viable Stain，因維曲根公司(Invitrogen))染色膜破損的 細胞。PI是能夠結合雙鏈DNA的小分子，在激發時能發出紅色螢光，在不易 分析氨基糖甙類抗生素的內化時可作為妥布黴素的替代物。該染料不能透過完 整的漿膜，通常用於細胞活力分析。利用40倍放大的螢光顯微鏡(NikonE400) 可檢測插入到DNA內的染料(紅色染色)。採用廠家默認的參數(SPOT，診斷學 公司)採集亮視野圖像和紅色螢光圖像。為了確定肽處理和PI染色後的殺菌活 性，與直觀培養物平行製備的樣品按1:5系列稀釋後接種到LB瓊脂上。利用 帶QuantityOne軟體的GelDoc(伯樂公司)採集存活cfo/mL的圖像。我們預計，與單獨的PI相比，G10KHc誘導的膜破裂將導致核酸染色的增 強。如圖10所示，單獨用PI處理的細菌未被染色。但是，暴露於PI和GlOKHc 的培養物可以清楚地觀察到胞內PI染色。另外，所觀察到的紅色螢光的量與 GlOKHc的量和處理時間成正比(數據未顯示)。為了確保我們不僅僅是對 GlOKHc殺傷的綠膿桿菌染色，分析直觀培養物的活cfu/mL。從下面圖10的 圖像所示的系列稀釋結果來看，可以清楚地看到單獨PI處理的和PI/G10KHc 處理的培養物之間的復甦活綠膿桿菌數是相似的。總之，這些數據說明亞致死 劑量的GlOKHc能夠誘導膜損傷並促進小分子的攝取，例如妥布黴素或PI進 入代謝活躍的綠膿桿菌細胞內。
2.7結論。總之，在本試驗中，我們研究了 GlOKHc抗綠膿桿菌的抗微生 物活性。結果發現GlOKHc具有抗綠膿桿菌臨床分離株的高活性(與妥布黴素 相似)。最令人感興趣的是，我們發現當綠膿桿菌的生物膜和浮遊培養物用 GlOKHc和妥布黴素共同處理時對殺傷活性有協同增強效應。數據說明活性升 高的機制可能包括因GlOKHc介導的細胞膜破裂而產生的妥布黴素攝取增多。 這些結果說明GlOKHc可用於抑制急性和慢性感染狀態下的綠膿桿菌，尤其是 與妥布黴素共同使用時。
綠膿桿菌是一種持久存在和反覆發作的機會致病菌，是導致CF期間致命 復發感染的原因。經常能夠分離出抗生素耐藥的綠膿桿菌說明，在現有治療選 項不再有效前開發出一種能抑制和治療綠膿桿菌定居於呼吸道黏膜表面的新 治療措施是十分關鍵的。
本試驗的結果顯示，與其廣譜的親本肽GIO相比，GlOKHc的活性得到明 顯改善，與妥布黴素的活性相似。另外，GlOKHc可在體外有效抑制高密度的 浮遊培養物和綠膿桿菌生物膜(圖3-4)。與妥布黴素相比，每的GlOKHc 降低生物膜活力的能力幾乎提高10倍(IOO pg/mL妥布黴素=213 pM， 100 pg/mL GlOKHc = 23.5 |iM)。但是，對於抗高密度浮遊細胞來說，處理24小時 後，單獨的5 pM(2.34嗎/mL)妥布黴素的殺菌活性比5 GIO或GlOKHc都 要高(高出1-2個數量級)。妥布黴素活性的差異可能與綠膿桿菌生物膜內部的 缺氧環境有關，這種缺氧環境可抑制細胞有效攝取氨基糖甙類抗生素。
當兩種藥物聯合使用時可以在浮遊培養物或生物膜培養物內產生最高水平的抗綠膿桿菌活性。共同給予妥布黴素和G10KHC可使殺傷活性明顯增強在 浮遊培養物或生物膜培養物中，共同處理比任一單一處理所清除的細菌數幾乎
高10,000倍。儘管以前已有文獻報導過抗微生物肽和妥布黴素之間(Saiman等， 2001)以及妥布黴素和許多其他常規小分子抗生素之間(Bonacorsi等，1999)具 有抗綠膿桿菌的加合效應和協同效應，但是，本試驗首先報導了利用氨基糖甙 類抗生素/肽組合可以協同地或加合地清除生物膜相關的綠膿桿菌。
妥布黴素氣溶膠已被批准用於治療CF患者的綠膿桿菌感染，不出意外的 是，已經從CF患者的痰液中分離出了綠膿桿菌和其他微生物的妥布黴素和氨 基糖甙類抗生素耐藥株。這一事實連同治療後呼吸困難、支氣管痙攣和咳嗽增 加相對較高的發生率說明妥布黴素的最佳使用方案是較小劑量的妥布黴素與 其他藥物聯合使用。我們的結論是G10KHc可以成為共同給藥的候選藥物，因 為它具有經過改造的假單胞菌選擇性和強大的抗綠膿桿菌生物膜和多藥耐藥 株及氨基糖甙類抗生素耐藥株的抗微生物效應。
實施例3.利用D胺基酸對映異構體合成STAMP和/或化學拮抗劑(例如， rhDNA酶)可以提高G10KHc STAMP的穩定性和活性
3.1材料和方法。按照以前文獻描述的方法，利用從Anaspec(聖何塞(San Jose)，加州)購買的用於合成G10KHc-D的D-胺基酸，通過快速 Fmoc(Fast-Fmoc)(9-銜甲氧羰基)方法在431A肽合成儀(應用生物科技公司)上 合成G10KHc(KKHRKHRKHRKHGGSGGSKNLRRIIRK GIHIIKKYG， SEQ ID NO 36，[導向域-接頭-抗微生物域])和D-對映異構體G10KHc-D。
來自於不同患者的8個痰液樣品收集自洛杉磯兒童醫院(洛杉磯，加州，美 國)的CF患者，在常規臨床實踐期間收集，在收集後的1小時內儲存於-8(TC。 用於本研究的痰液樣品的收集經過了洛杉磯兒童醫院倫理委員會的批准(CCI #05-00040)。所有個人標示，其中包括年齡、性別和預後，都對本實驗室設盲。
3.2 G10KHc和G10KHc-D在痰液中的活性和穩定性。肽在痰液中的抗微生 物效應或活性的測定以以前文獻報導相似的方式進行(Sajjan等，2001)。為了 分析G10KHc和G10KHc-D在痰液中抑制外源添加的綠膿桿菌的活性，收集的 痰液樣品用10 mM PBS(PBS)以1:10的比例稀釋並儲存(被稱為儲存痰液)。在 100 nL儲存的痰液中加入濃度為 5x106 cfli/mL的ATCC 15692，然後添加25
42flM肽。
在用於檢測蛋白酶抑制劑對肽活性的效應的樣品中，儲存的痰液樣品用1
mM蛋白酶抑制劑苯甲基磺醯氟化物(PMSF)、 p巰基乙醇(BME)或乙二胺四乙 酸(EDTA)預處理30分鐘，然後加入25 pM G10KHc禾卩ATCC 15692 ( 5><106 cfu/mL)。
經過肽處理後存活下來的細胞用生長培養基稀釋(1:50)，使其復甦4小時， 在進行適當稀釋前置於冰上放置4小時，然後接種到添加氨苄青黴素(25 pg/mL) 的LB瓊脂上。37'C孵育過夜後計數長出的克隆，計算存活cfo/mL。對所有接 種方法來說100 cfWmL都被認為是可計數的下限。在儲存痰液中已經存在內源 性微生物，但是與外源添加的細胞相比，只佔少數(低於1%，數據未顯示)。作 為結果，在這些培養物中內源性和外源性cfu/mL是無法區分的。
通過殺傷動力學試驗評價G10KHc在CF患者痰液樣品中的抗微生物總效 應。如圖11A所示，在加入肽後4小時，G10KHc未顯現出抗外源添加到儲存 痰液樣品中的綠膿桿菌的活性。這一結果與生長培養基中的G10KHc活性相 反，在生長培養基中，暴露於G10KHc STAMP 10分鐘後就可以使可復甦cfu/mL 下降90%以上，處理2小時就可以清除所有綠膿桿菌cfWmL(參見試驗2)。
考慮到可能是因G10KHc降解而導致的活性丟失，我們又測定了 G10KHc STAMP在痰液中隨時間的穩定性。通過HPLC監測肽在痰液中的穩定性。簡 言之，儲存的痰液樣品用PBS按1:10稀釋，重複離心以去除不溶性物質。然 後在100 hL稀釋的儲存痰液(用或不用1 mM PMSF預處理1小時)中加入 G10KHc或GlOKHc-D(lOO pM)，在室溫下混合。在指定時間點加入20 10% HC1以終止肽降解，樣品過濾兩次(0.2pm尼龍膜，Nunc),然後上載到層析柱 上(Source 15 RPC，愛默生公司)。含0.1%三氟乙酸的水/乙腈用作流動相，樣 品用逐漸升高的線性梯度的乙腈組合物(從10%到 35%)洗脫，流速為0.25 mL/min，每輪用11.5 mL流動相。通過UV(215 nm)監測完整G19KHc及其降 解產物，在圖中所示處收集組分。收集自連續流程的組分混合在一起，凍幹過 夜，然後利用上述MIC試驗評價其抗微生物活性。利用廠家推薦的操作方法 (Unicorn，愛默生公司)收穫HPLC圖，利用Photoshop 7.0 (Adobe)進行不同著 色和重疊以繪製圖IIB。
43如圖11B所示，G10KHc的標記峰(滯留體積10.29)在暴露於痰液後30分 鍾幾乎完全降解。收集得到的幾個組分，利用質譜鑑定可能的降解產物，結果 發現所有組分抗幾個綠膿桿菌臨床分離株的MIC都在100 以下(表6)。
表6 - G10KHc、 G10KHc-D和痰液消化產物的MIC(^iM)
MIC(,)a
合成的肽 ATCC 15692 ATCC 9027 ATCC 27853
G10KHcb 6
G10KHc-D 15 HPLC收集的組分e:
10.29(G10KHc) 6
8.50 >100
7.49 >100
4.04 >100
15 6
>100 >100 >100
6 10
6
>羅 >100 >100
a三次獨立試驗的MIC範圍 b以前報導的數據用於比較(6) e圖1B所示的組分
本領域已知的是，痰液中存在的絲氨酸蛋白酶的水平是升高的。因此，我
們推測這一類蛋白酶是造成所觀察到的G10KHc快速降解的原因，蛋白酶抑制 劑應該能夠穩定痰液中的G10KHc，恢復其抗微生物功能。為了驗證這種可能 性，將綠膿桿菌和G10KHc添加到用各種蛋白酶抑制劑預處理的儲存痰液樣品 中，計數存活的細菌數。用BME(—種半胱氨酸蛋白酶抑制劑)或EDTA(金屬蛋 白酶抑制劑)處理的樣品中G10KHc的活性或穩定性沒有恢復(數據未顯示)。然 而，如圖IIA所示，在通用絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF預處理的樣品中綠膿杆 菌可以被GlOKHc STAMP有效殺傷(存活cfo/mL下降超過3個數量級)。單獨 的抑制劑對綠膿桿菌活力只有很小的影響。相應的，在利用HPLC檢測時發現， PMSF處理的痰液中G10KHc信號可以在4小時內維持高水平(圖IIB)。總之， 這些數據說明在防止被絲氨酸蛋白酶降解後，G10KHc具有抗痰液內綠膿桿菌 的活性。
3.3 D-對映異構體GlOKHc STAMP及其活性。由於大多數絲氨酸蛋白酶具有手性要求(Milton等，1992)，我們合成了包含全D胺基酸對映異構體的 G10KHc、 G10KHc-D作為另一種無需使用抑制劑就可以抑制蛋白酶活性的方 式。利用上述標準固相方法合成G10KHc-D，通過質譜加以確認。
如圖11A所示，在暴露於肽後4小時，G10KHc-D可以使復甦的綠膿桿菌 水平降低3-4個數量級(與未處理的樣品相比)，說明G10KHc-D在痰液中的活 性水平與經過穩定的L-G10KHc相似。但是，在生長培養基中，用對映異構體 處理24小時不會對其綠膿桿菌抑制活性產生影響，說明G10KHc-D和 L-G10KHc的活性並不完全一致。
3.4 rhDNA酶對STAMP在痰液中的活性的影響。rhDNA酶常用於治療CF 以降低痰液的粘滯度和促進呼吸道清潔(Fuchs等，1994)，將其加入到儲存的 濃縮痰液樣品中以確定在這些條件下共同處理是否能夠提高G10KHc/PMSF和 G10KHc-D的活性。為了確定rhDNA酶(基因技術公司(Genentech)，舊金山， 加州)對STAMP殺傷能力的影響，將不同痰液樣品按1:2稀釋到100 pg/mL rhDNA酶中，簡單混合後在室溫下孵育IO分鐘。然後收集處理的樣品，加入 1 mM PMSF，孵育1小時。然後加入25 (iM G10KHc或G10KHc-D和 5xl06 cfu/mLATCC 15692，孵育4小時。復甦存活的細菌，按照上述接種方法進行 計數。
如圖12所示，我們觀察到當rhDNA酶與G10KHc/PMSF或G10KHc-D聯 合使用時，與未用rhDNA酶處理的樣品相比(復甦的未處理cfti/mL約為30%)， 抗微生物活性明顯升高(剩餘的未處理cfii/mL低於5%)。單獨用rhDNA酶處理 對綠膿桿菌沒有影響。這些結果說明G10KHc/PMSF或G10KHc-D在痰液中的 殺傷效應可通過與痰液溶粘蛋白劑共處理而進一步增強，後者可降低痰液的粘 滯度，促進肽的擴散。
3.5結論。總之，當通過構建D版本肽和/或共同給予蛋白酶抑制劑和/或聯 合rhDNA酶以防止蛋白酶裂解後G10KHc的活性得以擴展。尤其是我們發現， 如果通過化學拮抗劑或通過構建D胺基酸對映異構體G10KHc抑制了與痰液 相關的絲氨酸蛋白酶依賴的降解，那麼G10KHc STAMP在痰液中的高活性就 能夠保持。另外我們還發現，當樣品用肽和rhDNA酶聯合處理後，STAMP在 痰液中的活性進一步升高。這些結果說明探索CF聯合治療方法的重要性，尤其是用蛋白酶敏感的肽藥物如G10KHc作為常規小分子抗生素的替代物或與其聯合使用時。
實施例4.肽1903和BD2.21的鑑定及其STAMP。
導向肽1903是通過掃描突變鏈球菌UA140的基因組序列獲得的。我們分析了公開的基因組的預測開放閱讀框架(ORF)，記錄下編碼50個胺基酸以內的蛋白的那些ORF，經過掃描整個基因組後重新分析。篩選出多個經預測可被這些ORF編碼的肽，用螢光素標記物合成，檢測其與突變鏈球菌的結合能力。結果發現肽1903具有與突變鏈球菌結合的活性，然後用它來合成以1903為基礎的STAMP 。
BD2.21是作為，缺失2"抗微生物肽文庫的一部分經過合理設計獲得的。在指定位置上用帶最多正電荷(C)和最疏水(H)的殘基取代常見的a螺旋殘基排列HHCCHHCHHH(n)。在我們所使用的殘基模式中有某些變化，插入了一些非疏水殘基和不帶電荷的殘基。每個肽中的取代限制在3-5個陽離子胺基酸和4-7個疏水殘基(總共9到12個)。測定修飾對肽的抗微生物效應的影響，結果發現BD2.21抗浮遊突變鏈球菌的MIC為5.5 uM。然後利用BD2.21合成以BD2.21為基礎的STAMP,如1903-BD2.21,其中包含如SEQ ID NO. 13所示的胺基酸序列NIFEYFLE-GGG-KLFKFLRKHLL，以及包含如SEQ ID NO 14所示的胺基酸序列TFFRLFNRSFTQALGK-GGG-KLFKFLRKHLL的C16-BD2.21。
單一物種突變鏈球菌成熟生物膜的殺傷。突變鏈球菌生物膜用105細胞/孔接種，在48孔板(總體積400pL)中用"/。蔗糖(TH培養基)培養。孵育以後，從生物膜上去除上清，替換以200 pL含50 pM STAMP的PBS。單純PBS為陰性對照(100%存活)，乙醇為生物膜完全殺傷對照(0%存活)。生物膜用肽處理20分鐘，然後用lxPBS洗滌。為了測定生物膜的存活情況，每孔加入20 ^L用160pL TH培養基稀釋的CellTiterBlue。 3-5分鐘以後，將上清液轉移到96孔板內，測定570 nm處的吸光度值。在570處有高吸光度值說明有較多的底物被生物膜內剩餘的活細胞還原。如圖13所示，結果說明只需經過20分鐘的處理，C16-BD2.21和1903-BD2.21就能分別殺死生物膜內66%和85%的活突變鏈球菌。STAMP抗口腔鏈球菌多物種生物膜的選擇性。為了測定STAMP的選擇性，將混合生物膜接種到48孔板內。草綠色鏈球菌、齲齒鏈球菌、格式鏈球菌和血鏈球菌與突變鏈球菌菌株JM11(壯觀黴素耐藥的)按1:1:1:1:10的比例混合，每孔細胞總數為105。生物膜在含1%蔗糖、1%葡萄糖和P/。甘露糖的TH培養基內過夜培養18-24小時。然後按照單一物種生物膜試驗的方法用PBS加STAMP處理成熟生物膜，設定的對照組相同。處理以後，生物膜用PBS洗滌兩次，每孔加入100iiLPBS，用無菌吸管物理破壞生物膜。然後將細胞懸液無菌稀釋10倍到106。稀釋的懸液接種到TH培養基和添加800 pg/mL壯觀黴素的TH上。通過計數只含TH的平皿上的克隆數來確定生物膜的殺傷總量(所有鏈球菌)。對照未處理為100%，對應於從未處理生物膜記錄的cfu/mL數，乙醇無菌樣品得到的數據為0%存活。通過計數TH-壯觀黴素平皿上的克隆來確定突變鏈球菌殺傷數，組合的總cfo/mL用於計算突變鏈球菌:總菌群的比例。l:l說明沒有選擇性。
如圖14所示，C16-BD2.21對總cfu/mL群沒有影響，說明STAMP對非突變鏈球菌沒有明顯影響(參見圖14(A))。這一點可被所觀察到的存活突變鏈球菌與總鏈球菌的比例所證實，這一比例為0.075(參見14(B))。 l卯3-BD2.21也具有選擇比(遠低於l，參見圖14(B)),儘管其對其他口腔鏈球菌也有某些影響(參見圖14(A))。
表7.抗微生物肽
雄抗菌肽(SEQ ID NO 54)
WDILDKMENAIHKAAQAGIGIAKP正KMILPK
阿皮德新(SEQIDN0 55)
GNRPVYIPPPRPPHPRL
細菌素留可辛(leucocin) A(SEQ ID NO 56)
KYYGNGVHCTKSGCSVNWGEAFSAGVHRLANGGNGFW
貝可替新(SEQ ID NO 57)
RLCRIVVIRVCR
布弗林II(SEQIDN0 58)
TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK
47抗菌肽(人LL-37)(SEQ ID NO 59)LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLWRTES可萊弗寧A(SEQIDN0 60)VFQFLGKIIHHVGNFVHGFSHVF天蠶抗菌肽(SEQ ID NO 61)
RWKIFKKIEKVGQNIRDGIVKAGPAVAWGQAATI
環十二肽(SEQ ID NO 62)
RICRIIFLRVCR
(3-防衛素I(人)(SEQ ID NO 63)
DFASCHTNGGICLPNRCPGHMIQIGICFRPRVKCCRSWa-防衛素(HNP-l)(SEQ ID NO 64)ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC傑古林(SEQ ID NO 65)
SLFSLIKAGAKFLGKNLLKQGACYAACKASKQC組肽(SEQ ID NO 66)
DSHEERHHGRHGHHKYGRKFHEKHHSHRGYRSNYLYDN
吲哚素(SEQ ID NO 67)
ILP籃WPWWPWRR
滑爪蟾素II(SEQ ID NO 68)
GIGKFLHSAKKFGKAFVGEI顧S
蜂毒肽B(SEQ ID NO 69)
GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ
乳鏈球菌素A(SEQ ID NO 70)
ITSISLCTPGCKTGALMGCN區TATCHCSIHVSK
諾弗斯匹林G10(SEQIDNO35)
KNLRRIIRKGIHIIKKYG
普特格林(Protegrin)(SEQ ID N034)
RGGRLCYCRRRFCVCVGR
牛蛙防禦肽(SEQ ID NO 71)LGGLIKIVPAMICAVTKKC中國鱟肽(SEQ ID NO 72)KWCFRVCYRGICYRRCR
極大肽H5(Maximin H5)(兩棲動物)(SEQ ID NO 73)ILGPVLGLVSDTLDDVLGIL表面活性劑提取物l(SEQ ID NO 74)DDDDDD
DCD-l(SEQIDNO 75)
SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSV
SSL-25(SEQ ID NO 76)
SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDA
SSL-23(SEQ ID NO 77)
SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGK
皮抑菌肽DS5(SEQ ID NO 78)
GLWSKIKTAGKSVAKAAAKAAVKAVTNAV
家蠶抗菌肽(昆蟲)(SEQ ID NO 79)
AKIPIKAIKTVGKAVGKGLRAINIASTANDWNFLKPKKRKA
鈴蟾抗菌肽(蛙)(SEQ ID NO 80)
GIGALSAKGALKGLAKGLAEHFAN
胸膜肽(Pleurocidin)(白鰈)(SEQ ID NO 81)
GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALHTYL
SMAP29(綿羊)(SEQ ID NO 81)
RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG
PMAP-23(豬)(SEQ ID NO 83)
RIIDLLWRVRRPQKPKFVTVWVR
VCP-5h(黃蜂)(SEQ ID NO 84)
FLPIIGKLLSGLL-NH2
艾比新(Abaecin)(蜜蜂)(SEQ ID NO 85)
YVPLPNVPQPGRRPFPTFPGQGPFNPKIKWPQGY果蠅菌素(果蠅)(SEQ ID NO 86) GKPRPYSPRPTSHPRPIRV
吡咯霍可瑞新(Pyrrohocoricin)(吸汁啄木鳥臭蟲)(SEQ ID NO 87)
VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN
L15K7(SEQ ID NO 88)
KIXKIXLKIXKIXLKLIXKIXK
KLApep(SEQ ID NO 89)
KLALKLALKAWKAALKLA-NH2
D2A21(SEQ ID NO卯)
FAKKFAKKFKKFAKKFAKFAFAF
建模肽(Modelin)-l(SEQ ID NO 91)
KLWKKWAKKWLKLWKAW
LARL(SEQ ID NO 92)
Ac-LARLLARLLARL-Ac
YLK誦P(SEQ ID NO 93)
YKLLKLLLPKLKGLLFKL-NH2
KSL2(SEQ ID NO 94)
KKVWKFKFK-NH2
CAM135(SEQ ID NO 95)
GWRLIKKILRWKGL-NH2
PGAa(SEQ ID NO 96)
GILSKLGKALKKAAKHAAKA-NH2
PGYa(SEQIDNO 97)
GLLRRLRDFLKKIGEKFKKIGY-NH2本說明書中的參考文獻列於下文，本文已完整納入作為參考。
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權利要求
1. 一種包含具有如SEQ ID NO.2、5或10所示的胺基酸序列的導向肽的組合物。
2. 如權利要求1所述的組合物，其特徵在於，所述導向肽連接於接頭肽的 一個末端，所述接頭肽的另一個末端連接有抗微生物肽。
3. 如權利要求2所述的組合物，其特徵在於，所述接頭肽具有選自如下一 組的胺基酸序列SEQIDNOs 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27和28。
4. 如權利要求2所述的組合物，其特徵在於，所述抗微生物肽選自下組 SEQ ID NOs 34-35和SEQ ID NOs 54-97。
5. 如權利要求1所述的組合物，其特徵在於，所述抗微生物肽所具有選自 下組的胺基酸序列SEQ ID NOs 3 、 7和11 。
6. 如權利要求1所述的組合物，該組合物還包含可檢測試劑。
7. 如權利要求6所述的組合物，其特徵在於，所述導向肽連接於偶聯於可 檢測試劑。
8. 如權利要求7所述的組合物，其特徵在於，所述可檢測試劑選自放射性 同位素、螢光劑或酶底物劑。
9. 一種包含具有如SEQ ID NO. 3、 7或11所示的胺基酸序列的抗微生物 肽的組合物。
10. 如權利要求9所述的組合物，其特徵在於，所述抗微生物肽連接於接 頭肽的一個末端，所述接頭肽的另一個末端連接有導向肽。
11. 如權利要求10所述的組合物，其特徵在於，所述接頭肽具有選自如下 一組的胺基酸序列SEQIDNOs 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27和28。
12. 如權利要求10所述的組合物，其特徵在於，所述導向肽具有選自下組 的胺基酸序列SEQIDNOs 2、 5和10。
13. —種STAMP組合物，該組合物包含a)導向肽，所述導向肽具有選自下組的胺基酸序列SEQIDNO. 2、 5和b)接頭肽，所述接頭肽的一個末端連接有導向肽；以及 C)抗微生物肽，所述抗微生物肽連接於接頭肽的另一個末端。
14. 如權利要求13所述的STAMP組合物，其特徵在於，所述接頭肽具有 選自如下一組的胺基酸序列SEQIDNOs17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27和28。
15. 如權利要求13所述的STAMP組合物，其特徵在於，所述抗微生物肽 選自下組SEQ ID NOs 34-35和SEQ ID NOs 54-97。
16. 如權利要求13所述的STAMP組合物，其特徵在於，所述抗微生物肽 具有選自下組的胺基酸序列SEQIDNOs3、 7和11。
17. 如權利要求16所述的STAMP組合物，其特徵在於，所述STAMP具 有選自下組的胺基酸序列SEQIDNos4、 6、 8、 9、 12、 13、 14、 15和16。
18. —種STAMP組合物，該組合物包含a) 抗微生物肽，所述抗微生物肽具有選自下組的胺基酸序列SEQIDNO. 3、 7或11;b) 接頭肽，所述接頭肽的一個末端連接有抗微生物肽；以及c) 導向肽，所述導向肽連接於接頭肽的另一個末端。
19. 如權利要求18所述的STAMP組合物，其特徵在於，所述接頭肽具有 選自如下一組的胺基酸序列SEQIDNOs 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27和28。
20. —種STAMP組合物，該組合物包含a) 導向肽，所述導向肽具有長度為4-50個胺基酸的胺基酸序列；b) 接頭肽，所述接頭肽的一個末端連接有導向肽；c) 抗微生物肽，所述抗微生物肽連接於接頭肽的另一個末端；以及d) 抗生素。
21. 如權利要求20所述的STAMP組合物，其特徵在於，所述抗生素選自 下組(3-內醯胺類抗生素、阿莫西林、桿菌肽、氯黴素、克林黴素、巻麴黴素、 粘菌素M、環丙沙星、強力黴素、紅黴素、夫西地酸、磷黴素、夫西地酸鈉、 短桿菌肽、慶大黴素、林可黴素、米諾環素、大環內酯類、單醯胺菌素、萘啶酸、新生黴素、氧氟沙星、利福黴素、四環素、萬古黴素、妥布黴素和甲氧苄 氨嘧啶。
22. —種STAMP組合物，該組合物包含a) 導向肽，所述導向肽具有長度為4-50個胺基酸的胺基酸序列；b) 接頭肽，所述接頭肽的一個末端連接有導向肽；c) 抗微生物肽，所述抗微生物肽連接於接頭肽的另一個末端；以及d) 能增強或維持所述肽的活性的藥物。
23. STAMP組合物，所述試劑是蛋白酶抑制劑或rhDNA酶。
24. 選擇性殺傷或抑制對象內耙微生物的方法，該方法包括給予對象如權 利要求13、 18、 20或22所述的STAMP的步驟，所述導向肽可特異性結合靶 微生物。
25. 選擇性殺傷或抑制生物膜內耙微生物的方法，該方法包括給予生物膜 如權利要求13、 18、 20或22所述的STAMP的步驟，所述導向肽可特異性結 合靶微生物。
26. —種STAMP組合物，該組合物包含a) 導向肽，所述導向肽具有選自下組的胺基酸序列SEQIDNO. 2、 5或 10;以及b) 抗微生物肽，所述抗微生物肽通過肽鍵連接到導向肽上。
27. —種STAMP組合物，該組合物包含a) 抗微生物肽，所述抗微生物肽具有選自下組的胺基酸序列SEQIDNO. 3、 7或11;以及b) 導向肽，所述導向肽通過肽鍵連接到抗微生物肽上。
全文摘要
本發明涉及能特異性結合微生物(例如，綠膿桿菌或突變鏈球菌)得到導向肽、具有抗微生物活性的抗微生物肽以及特異性/選擇性靶向抗微生物肽(STAMP)。另外，本發明還提供了通過使用本發明提供的肽或組合物選擇性殺傷或抑制微生物的方法。
文檔編號A61K38/00GK101511382SQ200780032853
公開日2009年8月19日 申請日期2007年9月6日 優先權日2006年9月6日
發明者D·K·亞布拉夫, I·H·麥克哈迪, M·H·安德森, R·H·埃克特, 堅 何, 施文元, 齊鳳霞 申請人:加利福尼亞大學董事會