生產類鞘氨醇鹼或其衍生物的微生物菌株的製作方法
2023-05-08 18:53:06 2
專利名稱：：生產類鞘氨醇鹼或其衍生物的微生物菌株的製作方法生產類鞘氨醇鹼或其衍生物的微生物菌株術語"鞘脂(sphingolipids)"指衍生自諸如鞘氨醇(sphingosine)的類鞘氨醇鹼(sphingoidbase)的一組脂類物質。鞘脂經常發現於動物、植物和微生物細胞的膜中。神經醯胺是一組特別的鞘脂，其含有鞘氨醇、植物鞘氨醇或者二氫鞘氨醇(dihydrosphingosine，也稱作二氫神經鞘氨醇(sphinganine))，在與月旨肪酸的醯胺連接中作為鹼部分(類鞘氨醇鹼)。神經醯胺是皮膚上層角質層的主要脂類組分。包含鞘脂(例如神經醯胺)的組合物的局部應用能改善皮膚的屏障功能和水分保持性質(Curratolo，1987,Pharm.Res.4,271-277;Kerscheretal.，1991，Eur.J.Dermatol.1,39-43)。此外，上述類鞘氨醇鹼已知能介導若干生理作用，例如抑制蛋白質激酶C的活性，因此由於其抗炎和抗微生物活性被包括進化妝品或皮膚護理組合物。因為鞘氨醇是人類中鞘脂的主要類鞘氨醇鹼，人們對其有著相當大的商業興趣，以生產鞘氨醇和含鞘氨醇的鞘脂，用於食品、製藥和化妝品應用。目前，己開發了用於化學合成鞘氨醇(以及二氫神經鞘氨醇)的若干途徑。但是，由於這些分子中存在兩個立體異構中心，化學合成產生外消旋混合物，其中僅有25%是天然存在的立體異構化學構型。此外，由於在這些分子中存在三個功能基團，必須要應用大量的化學保護方法。因此，通過化學合成生產的鞘氨醇和二氫神經鞘氨醇非常昂貴，使其無法被包括進食物和化妝品配方。對於從天然來源(例如腦或雞蛋)分離的純鞘氨醇和二氫神經鞘氨醇而言，也是這樣。還可獲得從動物來源提取的異源鞘脂製劑。雖然這比純的化合物便宜，但是它們存在組成異源性的缺點，因為可能含有病原物而可能不夠安全。與哺乳動物相反，在微生物中，植物鞘氨醇(而非鞘氨醇)才是鞘脂的主要的類鞘氨醇鹼性組分。通常，植物鞘氨醇不在微生物中積累，但是其是鞘脂的從頭生物合成途徑的一部分。酵母巧c&aay^rZz'(WickerhamandStodola,1960,J.Bacteriol.80,484-491)顯示出能生產相當高水平的類鞘氨醇鹼及其衍生物，但全部是以C18-鞘氨醇及其乙醯化衍生物作為主要組成成分的植物鞘氨醇。其生產水平遠高於對鞘脂從頭進行生物合成所必須的。該鞘氨醇可從酵母中提取，並且化學轉化為，例如，神經醯胺，由此獲得純的化妝品成分(見，例如WO93/20038)。WO00/01839公開了通過經典誘變獲得的屍/c/n'aczy^r/z'菌株，其展示出對類鞘氨醇鹼植物鞘氨醇的提高的生產水平。但是，還沒有獲得用於生產鞘氨醇和二氫神經鞘氨醇純化合物的天然存在的立體異構體的經濟上更可行的方法，人們對其非常需要。Barenholzetal(1973,BiochimicaetBiophysicaActa306:341-345)描述了通過不含細胞的提取物進行的對少量經放射性標記的人工底物向二氫鞘氨醇(二氫神經鞘氨醇)的轉化。但是，整個細胞幾乎專門生產植物鞘氨醇，如作者在第344頁所述"該工作僅測量了對二氫鞘氨醇的合成，而高產者主要積累乙醯化的植物鞘氨醇"。已通過針對丁香假單胞黴素E(syringomycinE)抗性突變體的篩選，通過在單倍體^cc/wframyc^細胞中擾亂SYR2基因(Grilleyetal.，1998,JBiolChem273:11062-11068)，獲得了積累二氫神經鞘氨醇的酵母。但是，這些酵母生產非常低水平的二氫神經鞘氨醇，其不足以高效生產。Baeetal.(2004,Yeast,21:437-443)描述了缺少C4-二氫神經鞘氨醇羥化酶的^ccAaramyc^ce^W^ze犯"空突變體的二氫神經鞘氨醇生產水平。其顯示為僅346pmol/mg蛋白質，這對應於大約10微克/g生物質。這對於商業化工藝來說太低了。因此，本發明的一個目的是提供下述微生物菌株，它們能生產不是C-18植物鞘氨醇的類鞘氨醇鹼，特別是二氫神經鞘氨醇和/或鞘氨醇。因此，在第一個方面，本發明提供了一種微生物菌株，特別是酵母菌株，其能生產對每g生物質乾重而言至少0.1mg的根據結構式I:formulaseeoriginaldocumentpage7的類鞘氨醇鹼或其鹽或酯，其中，A-B選自CH2-CH2和CKNCH構成的組，並且，其中，R選自下述構成的組a)(CH2)m-X-(CH2)n-CH3，其中m和n每個獨立地在0至18(含)之間，X是CH2隱CH2、CH=CH、C三C、CHOH-CH2、HC=0-CH2，前提條件是m+n應當在0至18(含)之間，以及b)(CH2)p-CH=CH-(CH2)q-CH=CH-(CH2)w-CH3，其中p、q和w每個獨立地在0至16(含)之間，前提條件是p+q+w應當在0至16(含)之間。優選地，本發明的酵母菌株能生產對每g生物質乾重而言至少1mg的根據結構式I的類鞘氨醇鹼，更優選地，每g生物質乾重至少10mg。技術人員將理解，類鞘氨醇鹼生產率的上限可能是每g生物質乾重大約500mg。優選地，當在下述條件下培養能生產類鞘氨醇鹼的微生物菌株時，測量本發明的微生物菌株的類鞘氨醇鹼生產率。從瓊脂平板將微生物細胞接種進500ml搖瓶中的100mlYEPD培養基，在30°C和280rpm培養72小時。隨後，將該培養物的1%轉移到裝有100mlLCBNB生產培養基的帶擋板500ml搖瓶中，在30°C和280rpm培養96小時。通過HPLC或MS來方便地測量鞘氨醇生產率。本發明的微生物菌株優選是酵母菌株，更優選地是Ac/^的菌株，最優選地是CZ/^T"的菌株。在另一種實施方式中，根據結構式I的類鞘氨醇鹼是醯基酯形式的。醯基通過羥基連接到類鞘氨醇鹼上，即"真正的"酯連接，和/或通過氨基連接，即，醯胺連接。優選地，醯基是1-4個碳原子的直短鏈醯基，更優選地，是乙醯基。在一種優選的實施方式中，根據結構式I的類鞘氨醇鹼具有根據結構式II的D-赤-(2R，3S)-構型formulaseeoriginaldocumentpage8其中，A-B和R如上文定義。還優選的是根據結構式I或II的化合物，其中，R是(CH2)m-X-(CH2)n-CH3，其中，更優選地，m是0，X是CH2-CH2或CHOH-CH2，最優選地，X是CH2-CH2，n在8至12之間，最優選地，n是10。尤其優選的是其中A-B是CH2-CH2或CH=CH並且R是(012)12-0^3的根據結構式I或II的化合物。技術人員將理解，通過微生物生產的類鞘氨醇鹼可組成具有不同鏈長(即不同長度的R基團)的類鞘氨醇鹼的混合物。一些情況下，一種鏈長可能佔優勢地存在，但是包含大致等量的不同鏈長的混合物也是可能的。在第二個方面，本發明提供了一種方法，用於分離根據第一個方面的微生物菌株。所述方法包括在存在合適濃度的毒素的情況下，培養微生物細胞的群體，選擇對於所述毒素具有抗性的細胞亞群，從對毒素具有抗性的細胞亞群中分離出能生產對每g生物質乾重而言至少0.1mg的結構式(I)的類鞘氨醇鹼的細胞。在根據本發明的方法中，在存在合適濃度的毒素的情況下，培養微生物細胞的群體，分離(選擇)出對於所述毒素具有抗性的細胞亞群。應用的毒素應當對微生物細胞的起始群體具有毒性，即，所述毒素應當具有使得當細胞在合適濃度的該毒素存在的情況下被培養時細胞不能生長或存活的作用。當在存在合適濃度的毒素的情況下培養時，分離出對毒素展示出抗性的細胞亞群，即能在存在毒素的情況下能生長的細胞亞群。這些毒素抗性細胞的亞組可能已獲得了一種或多種突變，所述突變例如提供對根據結構式I的類鞘氨醇鹼的提高的生產水平。可應用於此類選擇的典型的毒素是丁香假單胞黴素E，它在二氫神經鞘氨醇羥化酶的作用下成為有毒性的(Grilleyetal.(1998),J，Biol.Chem.273,11062-11068)，因此抗性細胞可能是二氫神經鞘氨醇羥化酶陰性突變體；非乙醯化的類鞘氨醇鹼，例如二氫神經鞘氨醇、植物鞘氨醇和鞘氨醇，它們作為生長抑制劑或者作為凋亡誘導化合物發揮毒性作用(Chimgetal.(2001),J.Biol.Chem.276,35614-35621;Chengetal.(2003),Mol.Cell.Biol.23,163-177)，抗性細胞可能是非敏感型類鞘氨醇鹼過量生產細胞；伏馬毒素(fumonisin)，其是(二氫)神經醯胺合酶的抑制劑，抗性細胞可能是具有增加的經歷類鞘氨醇鹼生物合成途徑通量的細胞(Merill(2002)，J.Biol.Chem.277,25843-25846);AAL(乂temahaWfemato)毒素，其是類鞘氨醇鹼的類似物，抗性細胞可能是產生具有改變的水平和/或改變的組成的類鞘氨醇鹼的細胞(Abbasetal.(1994),PlantPhysiol.106,1086-1093)。毒素的合適濃度典型地為針對將被用於進行本發明方法的微生物細胞發現的最小抑制濃度(MIC值)左右。MIC值將取決於所用的微生物細胞，其可能在例如2至10/xg/ml之間。從具有毒素抗性的細胞亞群分離出下述微生物菌株，所述菌株能生產對每g生物質乾重而言至少O.lmg的根據結構式I的類鞘氨醇鹼。令人吃驚地，我們發現，毒素抗性細胞中有很高百分比能生產對每g生物質乾重而言至少0.1mg的根據結構式I的類鞘氨醇鹼。特別地，我們吃驚地發現，使用毒素丁香假單胞黴素E獲得了能生產高水平二氫神經鞘氨醇的丁香假單胞黴素E抗性乃'c/nhczy^rzY。這之所以令人吃驚是因為人們認為針對單倍體物種的方法，例如&ce^v^'^描述的方法(上文Grilleyetal.,)不可能對二倍體物種例如屍z'c/n'ac(/^n7有用(WickerhamandBurton,1962，BacteriolRev.26:382-397)，尤其是如果此類二倍體物種還具有高的類鞘氨醇鹼通量的話。有多個例子證明基於對毒素的抗性來分離特定突變體對二倍體物種很麻煩。例如Noseketal.，(2002，CurrGenet,42:27-35)描述了即使在存在毒素的情況下培養之前對細胞進行誘變處理，也不能分離出二倍體酵母菌株Camfe/a/ara戸z7a^SR23的5-氟乳清酸(5-FOA)抗性克隆。在另一公開文獻(WellingtonandRustchenko,2005,Yeast，22:57-70)中，報導了對二倍體酵母菌株C"^fefaa/^'o^的5-FOA-抗性克隆的分離。但是，這些克隆保留為尿嘧啶原營養型。因此，在單倍體酵母物種中，例如Sacc/wramycecewWw'ae的實驗室菌株中容易進行的通過處理5-FOA對編碼乳清苷-5'-磷酸脫羧酶的基因的定位失活在二倍體酵母菌株中看起來是不可能的。類鞘氨醇鹼，例如二氫神經鞘氨醇，已知能誘導凋亡(Chengetal.,2003,MolCellBiol,23:163-177)。P.q&mY明顯地通過高效乙醯化以及隨後植物鞘氨醇的分泌迴避了該問題。但是，當細胞被驅動以積累二氫神經鞘氨醇來代替植物鞘氨醇的時候此類生物將如何反應卻是不可預測的。用本發明的方法處理的微生物群體可以是從一種特定的親本菌株獲得的相同細胞的群體。以這種方式，典型地，可分離自發突變體。用本發明的方法處理的微生物細胞的群體還可以是先經過誘變處理以將遺傳變異有意引入到所述群體中的細胞群體。典型地，誘變處理可包含所謂的經典處理，其還可包括DNA介導的轉化。經典處理包括原生質體融合和/或用UV放射或某些化學物質進行的處理。在一種實施方式中，生產根據結構式I的類鞘氨醇鹼的微生物細胞是從下述細胞群體分離的，所述細胞群體被誘變處理，但在誘變處理前並不經過毒素處理。當誘變處理是DNA介導的轉化時，該實施方式特別有用，更特別地，為了對鞘脂代謝途徑加以工程改造的目的時。在另一種實施方式中，誘變處理在毒素抗性細胞上進行，優選地，在能生產對每g生物質乾重而言至少0.1mg的根據結構式I的類鞘氨醇鹼的毒素抗性細胞上進行。當誘變處理是DNA介導的轉化以便對鞘脂代謝途徑加以工程改造時，該實施方式也特別有用。對鞘脂代謝途徑進行工程改造可以以多種方式進行。例如，通過對來自代謝途徑的一種或多種酶的表達水平加以改變，即增加或減少，來進行。例如通過對編碼感興趣的酶的基因進行靶向失活，可由此實現表達水平的減少。此外，或或者，通過修飾代謝途徑的一種或多種單個的酶，例如，以獲得對於特定底物具有改變的底物特異性或更高的親和性的酶。對鞘脂代謝途徑進行工程改造的一個例子是增加二氫神經醯胺去飽和酶的表達水平，即過量表達編碼二氫神經醯胺去飽和酶的基因，特別地，這提供於本發明的另一方面中。對鞘脂代謝途徑進行工程改造的另一個例子是以下述方式對去飽和酶的底物範圍加以修飾，所述方式使得，類鞘氨醇鹼(例如二氫神經鞘氨醇)代替神經醯胺(特別是二氫神經醯胺)成為該酶的優選底物，這提供了二氫神經鞘氨醇向鞘氨醇的直接原位轉化。對鞘脂代謝途徑進行工程改造的其它例子是對類鞘氨醇鹼的乙醯化情況的改變，對類鞘氨醇鹼的鏈長組成的改變和/或類鞘氨醇鹼增加或減少的分泌。具有經改變的乙醯化情況的類鞘氨醇鹼可通過下述手段獲得，例如，篩選出以及(可能地)富集具有經修飾乙醯化活性和/或經修飾的分泌活性的突變體菌株，這以下述方式來進行，所述方式使得較之親本菌株能生產更多或更少的、根據結構式I的類鞘氨醇鹼的乙醯化形式的菌株被分離出來。本發明還包括對二氫祌經醯胺去飽和酶活性的修飾，可選地，結合對神經醯胺酶活性的修飾，可選地，結合對乙醯化酶的修飾，可選地，結合對分泌機制的酶的修飾，這以下述方式來進行，所述方式使得從細胞內二氫神經鞘氨醇經由神經醯胺到分泌的鞘氨醇的通量增加。在本發明的一種實施方式中，分離出下述微生物菌株，較之親本菌株，所述微生物菌株展示出對根據結構式I的類鞘氨醇鹼的提高的生產率，和/或鞘脂代謝途徑中的酶表達水平和/或細胞內定位的變化。類鞘氨醇鹼的提高的生產率由此包括較之親本菌株的生產率增加和/或對親本菌株基本不生產的類鞘氨醇鹼的生產。鞘脂代謝途徑中的酶的表達水平的變化由此包括較之親本菌株表達水平的增加和/或親本菌株不表達的酶活性的表達。在本發明的上下文中，親本菌株是基本不產生根據結構式I的類鞘氨醇鹼的菌株。例如，合適的親本菌株可以是下述菌株在特定條件下，其以低於每g生物質乾重0.1mg的水平產生根據結構式I的類鞘氨醇鹼。親本菌株還可以是下述菌株，其生產大量的並非是根據結構式I的類鞘氨醇鹼的類鞘氨醇鹼，例如，優選地，屍/c/n'acz/wnYNRRLY-1031F-60-10禾口/或WO95/12683公開的任何ft'c/n'ac^rn'菌株，所有這些都主要產生C18-植物鞘氨醇。在第三個方面，本發明提供了具有二氫神經醯胺去飽和酶活性的多肽，優選地，可從酵母Ac/^cz/^777獲得。特別地，本發明的具有二氫神經醯胺去飽和酶的多肽具有根據SEQIDNO:1的胺基酸序列和/或具有與SEQIDNO:1至少67%的百分比同一性的胺基酸序列，優選地，與SEQIDNO:1至少70%，更優選地，至少80%，最優選地，至少90%的同一性(同源多肽)。同源多肽可以是可從其它微生物(特別是酵母)菌株獲得的變體，或者可以是經過工程改造的變體。我們吃驚地發現，生產大量植物鞘氨醇而非鞘氨醇的巧c/n'ac^rn'〖含有與來自Oz"^/fla/Zn'ca/u的二氫神經醯胺去飽和酶的序列相似的多肽。技術人員將認識到下述事實，可獲得多種不同的計算程序來確定兩條序列間的百分比同一性。例如，使用NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法來確定兩條胺基酸序列間的百分比同一性，該算法己被併入GCG軟體包的GAP程序(可從h加:〃www.gcg.com獲得),其中使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣，以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權重以及1、2、3、4、5或6的長度權重。技術人員將認識到，所有這些不同參數可能產生略有不同的結果，但是使用不同算法時兩條序列間的整體百分比同一性不會有顯著改變。方便地，採用預設設置(缺口權重為12，長度權重為l),使用Blossom62矩陣。本發明令人吃驚地顯示較之親本菌株展示出對本發明多肽的更高的表達水平的微生物細胞展示出了對根據結構式I的類鞘氨醇鹼的提高的生產率。特別是下述根據結構式I的類鞘氨醇鹼，其中，A-B是CI^CH，R是(CH^-X-(CH2)n-CH3，其中，更優選地，m是0，X是CHrCH2或CHOH-CH2，以及n在8至12之間，最優選地，n是10。在第四個方面，本發明提供了一種多核苷酸，其包含編碼第三個方面的多肽的核苷酸序列。優選地，多核苷酸包含編碼SEQIDNO:1的胺基酸序列的核苷酸序列。更優選地，編碼SEQIDNO:1的胺基酸序列的核苷酸序列是SEQIDNO:2或者被SEQIDNO:3包含。特別地，本發明涉及一種同源多核苷酸，其包含編碼第三個方面的多肽的核苷酸序列，在嚴謹條件下，優選在高度嚴謹條件下，能與根據SEQIDNO:2的核苷酸序列或其亞序列雜交。有利地，此類同源多核苷酸可從生產類鞘氨醇鹼的微生物菌株獲得，特別地，從生產類鞘氨醇鹼的酵母菌株獲得，更特別地，從乃'c/^菌株獲得。例如，使用SEQIDNO:2或其亞序列的核酸序列作為雜交探針，可使用標準雜交和克隆技術(例如，如Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,andManiatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989所述)分離出本發明的核酸分子。本文中使用的術語"雜交"意欲描述下述雜交和洗滌條件，在所述條件下，典型地，互相至少大約50%，至少大約60%，至少大約70%，更優選至少大約80%，進一步更優選至少大約85%至90%，更優選至少95%相同的核苷酸序列保持為互相雜交。此類雜交條件的一種優選非限制性例子是大約45°C時在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，接著在1XSSC、0.1%SDS中於50。C洗一次或多次，優選在55。C，優選在60。C，進一步更優選在65。C洗。高度嚴謹條件包括，例如，在68。C時，在5xSSC/5xDenhardt's溶液/0.1%SDS中雜交，在0.2xSSC/0.1%SDS中於室溫洗滌。或者，可在42。C洗。技術人員將知道用何種條件作為嚴謹雜交條件和高度嚴謹雜交條件。關於此類條件的額外指導可從現有技術容易地獲得，例如，在Sambrooketal.,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;andAusubeletal.(eds.),1995,CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。在一種典型的方法中，使用從SEQIDNO:2獲得的探針，從由選用與SEQIDNO:2同源的多核苷酸。探測到與SEQIDNO:2同源的轉錄子後，可從由合適的菌株分離的RNA來構建cDNA文庫，這利用本領域技術人員公知的標準技術來進行。或者，可篩選全基因組DNA文庫。還可例如通過使用基於本文教導的核苷酸序列設計的兩個(簡併)寡核苷酸引物庫進行PCR來分離同源基因序列。用於反應的模板可以是染色體DNA，或通過對製備自已知能表達或懷疑能表達根據本發明的多核苷酸的菌株的mRNA的反轉錄獲得的cDNA。PCR產物可被亞克隆並測序，以確保擴增的序列代表了本發明的序列。此外，可使用基於SEQIDNO:2含有的序列信息設計的合成寡核苷酸引物，通過PCR來分離包括SEQIDNO:2的全部或一部分的核酸分子。然後可通過多種己知方法，將獲得的PCR片段用於分離全長cDNA。例如，可對PCR片段加以標記，將其用於篩選cDNA文庫或基因組文庫。或者，可使用獲得的PCR片段的DNA序列，應用反向PCR反應。還可以通過誘變技術來獲得同源基因序列，優選地，應用於SEQIDNO:2。合適的誘變技術包括隨機誘變(例如，易錯PCR)、定點誘變和/或基因改組(geneshuffling)。例如，誘變可用於獲得較之競爭性羥化酶而言對其底物具有更高的親和性的去飽和酶多肽，和/或具有更高的的比酶活性和/或具有改變的底物特異性的去飽和酶多肽，例如，關於類鞘氨醇鹼的烴鏈長的方面。本發明還提供了包含第四個方面的多核苷酸的載體，包括克隆載體和表達盒。向其中插入本發明多核苷酸的載體可以是可方便地應用於重組DNA方法的任何載體，對載體的選擇通常將取決於其將引入的宿主細胞。因此，載體可以是自主複製載體，即，作為染色體外實體存在的載體，其複製不依賴於染色體複製，例如質粒、粘粒、病毒或噬菌體載體，通常提供有複製起點。或者，載體可以是下述這樣的當引入宿主細胞時，其整合進宿主細胞基因組，並且與它被整合進其中的染色體一起複製。載體可以是環狀的，例如，質粒，或者線性的，例如表達盒。優選地，本發明的多核苷酸可被插入表達盒。在表達盒中，本發明的多核苷酸與調控序列可操作地相連，所述調控序列能提供宿主細胞從其編碼序列對多肽的表達。術語"可操作地相連"指下述並置，其中，所述組件以允許它們以其期望的方式發揮作用的關係存在。調控序列，例如啟動子、增強子或與編碼序列"可操作地相連"的另一表達調控信號以下述方式定位，所述方式使得在與調控序列相容的條件下獲得多肽從其編碼序列的表達。用於給定宿主細胞的表達盒可包含從相對於編碼第一個方面的多肽的序列的編碼鏈而言5'末端至3'末端以適當的順序互相可操作相連的下述元件啟動子序列，其能指導編碼多肽的DNA序列在給定宿主細胞中的轉錄；可選地，信號序列，其能指導多肽從給定宿主細胞分泌進培養基；可選地，靶向序列，其用於將多肽引導至某亞細胞區室，編碼多肽的成熟形式以及優選活性形式的DNA序列；以及優選地，還有轉錄終止區域(終止子)，其能在編碼多肽的DNA序列下遊終止轉錄。除編碼本發明多肽(的天然存在的前體)的基因天然的啟動子之外，可使用其它啟動子來指導本發明多肽的表達。可根據其指導本發明多肽在表達宿主中表達的效率來選擇啟動子。可選擇與為其設計表達盒或載體的宿主細胞相容的啟動子/增強子和其它表達調控信號。優選地，啟動子序列從可誘導的或高度表達的基因獲得。在本發明的上下文中，高度表達的基因是其mRNA佔細胞總mRNA的至少0.01%(w/w)的基因，例如，在誘導條件下的，或者其基因產物佔細胞總蛋白的至少0.2%(w/w)的基因，或者，在分泌出的基因產物的情況下，可分泌至至少0.05g/1的水平。優選的高度表達的基因(從中優選獲得啟動子，和/或其被包含於用於整合表達盒的優選的預定靶基因座中)包括但不限於，編碼糖分解酶(例如磷酸三糖異構酶(TPI)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、磷酸甘油酯激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK)、醇脫氫酶(ADH))的基因以及編碼/5-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖體蛋白的基因。合適的高度表達的基因的具體例子包括，例如，來自《/M_yVeram;;cM平的丄JC4基因，來自//a"化腦/a和A'c/n'a的甲醇氧化酶基因(JOZ禾n，或者來自Fa"se"M/a"(ymorp/ia的質膜H(+)-ATP酶基因(PA"7)。其它酵母啟動子包括可從乳糖酶或丙酮酸脫氫酶亞基1獲得的強酵母啟動子，或者來自鞘脂生物合成途徑的基因的啟動子，例如SYR2(二氫神經鞘氨醇羥化酶)、LCB1(絲氨酸棕櫚醯轉移酶亞基1)、LCB2(絲氨酸棕櫚醯轉移酶亞基2)、TSC10(酮-二氫鞘氨醇還原酶)、LAC1(神經醯胺合酶/二氫神經鞘氨醇N醯基轉移酶，CoA依賴型)、LAG1(神經醯胺合酶/二氫神經鞘氨醇N醯基轉移酶，CoA依賴型)、DES1(去飽和酶)、YDH1(二氫神經醯胺酶)、YPC1(植物神經醯胺酶)、LCB4(鞘氨醇類脂激酶)、LCB5(鞘氨醇類脂激酶)。編碼多肽的多核苷酸序列下遊可以是含有一處或多處轉錄終止位點(例如終止子)的3'非翻譯區域。終止子的起點並不重要。終止子可以是對於編碼多肽的多核苷酸來說天然的。但是，優選地，在酵母宿主細胞中使用酵母終止子，在有絲真菌宿主細胞中使用有絲真菌終止子。更優選地，終止子是宿主細胞(其中編碼多肽的多核苷酸序列待表達的)內源的。載體可以含有一種或多種選擇標記基因，以便能從佔大多數的未轉化細胞中選出經轉化的細胞。優選的選擇標記包括但不限於補償宿主細胞中的缺陷或賦予對藥物的抗性的那些。它們包括，例如，可用於轉化大多數真菌(包括酵母)的通用選擇標記，例如乙醯胺酶(amJ幻基因或cDNA，或者提供對抗生素(例如G418、潮黴素B、博來黴素、醒腦thricin、腐草黴素、zeocin、殺稻瘟菌素S、aureobasidinA、雙丙氨膦(bialaphos)或環己醯胺)抗性的基因。或者，可使用特異性的選擇標記，例如營養缺陷型標記，其需要相應的突變體宿主菌株，例如17^43(來自S.cwev&'fle的，或來自其它酵母的類似基因)、F/W或7TPh在一種優選的實施方式中，在將表達構建體引入之後，從經轉化的宿主細胞除去選擇標記，以獲得能生產不含選擇標記基因的多肽的經轉化宿主細胞。編碼多肽的核苷酸序列優選作為表達載體或表達盒的一部分引入合適的宿主。關於用表達載體或表達盒對合適宿主的轉化，轉化程序是可獲得的，其為本領域技術人員所公知。表達盒可作為攜帶有選擇標記的載體的一部分用於對宿主的轉化，或者表達盒可作為單獨的分子與攜帶有選擇標記的載體一起進行共轉化。載體可包含一種或多種選擇標記基因。對於大多數有絲真菌和酵母而言，載體或表達構建體優選整合進宿主細胞的基因組，以獲得穩定轉化子。但是，對於某些酵母而言，還可獲得合適的游離載體，其中可以包括表達構建體以穩定和高水平表達。其例子包括從&cc/"row_yc^和K/w少vm附yc^各自的禾卩pKDl質粒獲得的載體。當表達構建體整合進宿主細胞基因組的情況下，構建體整合進基因組的隨機基因座，或者使用同源重組整合進預定的靶基因座，在這種情況下，耙基因座優選包含高度表達的基因。合適的高度表達的基因的大量例子在前文中提供。優選的整合靶位點是rRNA基因座(Baeetal,2003)或者PDA1、ENOl、GAPDH、SYR2的啟動子區域。在另一方面，提供了包含本發明的多核苷酸的宿主細胞。多核苷酸可以是宿主細胞基因組異源的。在本發明的上下文中，術語"異源"表示該多核苷酸並非天然存在於宿主細胞(以其重組形式被引入宿主)基因組中，或者宿主細胞天然不生產該多肽。合適的宿主細胞是原核微生物，例如細菌，或真核生物，例如真菌，例如酵母或有絲真菌。優選的宿主是酵母。用於表達編碼本發明的多肽的DNA序列的優選酵母宿主細胞是5^cc/zfl^omyc^y、X/M,yve^om_yc&s*、//awse"M/a、戶z'c/n'a、Ya廠廠ovWa、Om^/a、五^mo^ec/！^屬的。更優選地，酵母宿主細胞選自QmfizWaw&7&、￡>emo《Aea'wmgawy^p"禾中構成的組。最〈尤選的是酉孝母Pi'c/u'a在本發明的一種尤其優選的實施方式中，宿主細胞是本發明前文所述的毒素抗性細胞。本發明的另一個方面因此提供了宿主細胞，它們是經本發明的多核苷酸或載體轉化的，或包含本發明的多核苷酸或載體。優選地，所述多核苷酸被攜帶於用於複製多核苷酸和/或表達本發明的多肽的載體中。將選擇與選用的宿主細胞相容的載體。在其中宿主細胞是本發明前文所述毒素抗性細胞的本發明實施方式中，毒素抗性表型可在轉化事件之前或之後獲得。如果本發明的多核苷酸被包括進重組可複製載體，該載體可用於在相容的宿主細胞中複製多核苷酸。因此，在另一方面，本發明提供了一種方法，用於生產根據本發明的多核苷酸，所述方法通過將本發明的多核苷酸引入可複製載體，將所述載體引入相容的宿主細胞以及在能使得所述載體複製的條件下培養所述宿主細胞來實現。可從宿主細胞回收含有根據本發明的多核苷酸的載體。合適的宿主細胞包括細菌，例如五.C(//。在另一個方面，本發明提供了一種方法，用於製備根據本發明的多核苷酸，這是通過將宿主細胞(例如，用前文所述的表達載體轉化過的)在能提供本發明多肽表達的條件下培養，以及可選地，回收表達的多肽來實現的。優選地，多肽作為分泌蛋白生產，在該情況下，表達構建體中編碼多肽的成熟形式的多核苷酸序列與編碼信號肽的多核苷酸序列可操作地相連。在另一個方面，本發明提供了一種方法，用於製備結構式I的類鞘氨醇鹼，這是通過在能提供類鞘氨醇鹼表達的條件下，以及如果必要的話，能提供本發明的多肽表達的條件下，培養根據本發明第一個方面的微生物細胞和/或經根據本發明第四個方面的多核苷酸(例如，克隆於前文所述表達盒中的)轉化的宿主細胞以及可選地回收類鞘氨醇鹼來實現的。可使用本領域已知的手段來培養根據本發明的細胞。對於啟動子和宿主細胞的每種組合來說，可獲得有益於本發明的多肽表達的培養條件。在達到理想的細胞密度後，終止培養，使用已知手段來回收本發明的多肽或類鞘氨醇鹼。發酵培養基可包含含有碳源(例如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜)、氮源(例如，氨、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、有機氮源(例如酵母提取物、麥芽提取物、蛋白腖))以及其它無機營養源(例如磷酸鹽、鎂、鉀、鋅、鐵等)的已知培養基。可選地，可包括誘導劑。對合適培養基的選擇可基於對表達宿主的選擇和/或基於表達構建體的調控序列和/或基於與本發明的類鞘氨醇鹼的最優表達相關的需要。此類培養基是本領域技術人員已知的。發酵可進行0.5至30天的時間。其可以是分批、連續或補料分批過程，合適地，在0至45。C範圍內的溫度下進行，以及，例如，在2至10之間的pH下進行。優選的發酵條件是在20至37°C的範圍內的溫度和/或3至9之間的pH。通常基於選用的表達宿主以及待表達的蛋白質來選擇合適的條件。發酵之後，如果必要的話，可通過離心或過濾手段將細胞從發酵培養液中移出。然後可通過傳統方法回收(以及，如果想要的話，純化以及分離)本發明的多肽和/或類鞘氨醇鹼。本發明有利地表明根據結構式I的類鞘氨醇鹼的生產可完全通過發酵來進行。特別地，其表明，鞘氨醇可通過發酵生產。或者，鞘氨醇可通過下述手段產生從根據本發明的發酵方法生產的二氫神經鞘氨醇通過化學方法生產；或使用經修飾以表達上文所述活性二氫神經鞘氨醇去飽和酶多肽的合適生物並且補料根據本發明發酵生產的二氫神經鞘氨醇通過生物轉化進行；或使用經穩定分離以及可選地經配製的活性二氫神經鞘氨醇去飽和酶，並且補料根據本發明發酵生產的二氫神經鞘氨醇通過應用生物轉化來進行；或通過上述手段的任何組合來生產。方便地，本發明的類鞘氨醇鹼可與合適的賦形劑組合，以生產類鞘氨醇鹼組合物。本發明的類鞘氨醇鹼可作為起始材料使用，以製備其它類鞘氨醇鹼、或鞘脂，例如神經醯胺、神經節苷脂或腦苷脂。圖1A和1B圖示了三步法，其導致對整個乃'c/^cz/em'/i^:w基因座的分離。對屍c^&S7(I.)內部部分擴增之後，進行兩輪反向PCR(II.和III.)。用於各個步驟的寡核苷酸被標出，不同陰影代表的序列展示了各個步驟中確定的DNA序列所屬的ZVlO&S7基因座的部分。與實驗程序相關的限制性位點也被標出。圖2圖示了質粒pCR-PcDESl上A'c/n'"ci/^r"基因座。箭頭表示開放讀碼框屍c/)^&S7(陰影箭頭，從朽c/n》cz/m7'/獲得)、bla(氨節青黴素抗性基因)以及卡納黴素抗性基因(陰影線箭頭，從載體pCR4-T0PC^獲得)的定位和方向。灰色的條帶表示Eco/Z複製起點的定位。還顯示了克隆和限制性分析相關的限制性位點。圖3顯示了對發酵培養液進行LC-UV分析之後的典型色譜，這驗證了三乙醯化二氫神經鞘氨醇TriAsa的存在。圖4顯示了通過從丁香假單胞黴素E抗性菌落的十種穩定分離菌生產的類鞘氨醇鹼的組成(TAPS=四乙醯化植物鞘氨醇；Sa二二氫神經鞘氨醇；DiASa=二乙醯化二氫神經鞘氨醇；TriASa=三乙醯化二氫神經鞘氨醇)。圖5顯示了用於在乃'c/n'acz/ew7中同源過量表達il&S7的質粒pDB007。顯示了屍c屍ZM7啟動子(垂直陰影線的)，屍ci)^S7基因(水平陰影線的)，經修飾的Pc丄4"基因，其介導環己醯亞胺(cycloheximide)抗性(黑色的)，5S-26SrDNA基因間間隔序列，其具有內部的識別位點(IS;格狀的)；氨苄青黴素抗性基因(Wfl;淺灰)以及￡."//複製起點(pUC0h;深灰)。還顯示了克隆程序相關的限制性位點。圖6圖示了對有或沒有的丁香假單胞黴素E抗性屍/c/nVz^/^777突變體中鞘氨醇-N-醯基酯的定量。以棕櫚酸(白)、硬脂酸(垂直陰影線的)、"皿羥基硬脂酸(深灰)、不飽和二十四烷酸(lignocericacid)(水平陰影線的)、二十四垸酸(淺灰)以及a-羥基蜂蠟酸(黑)作為脂肪酸側鏈的鞘氨醇-N-醯基酯的絕對濃度針對如下菌株顯示在對數生長階段(log;24小時培養)和穩定階段(stat;%小時培養)，有(syrEpDB007)和沒有屍c"^S7過量表達(syrE)的丁香假單胞黴素E抗性cz/erh,突變體。實施例1從屍/c/n'ac/fen^'F-60-10ANRRL1031分離基因組DNA在250mlErlenmeyer瓶中的50mlYEPD培養基(蛋白腖2%(w/v)、酵母提取物1%(w/v)和葡萄糖2%(w/v))中，於200rpm禾Q30°C培養P/c/n'""/emYF-60-10ANRRL1031，18小時後，OD,為1.5時收穫。使用用於酵母和革蘭氏陽性細菌的PUREGENEDNAPurificationKit(GentraSystemsInc.,cat.#D-6000A)按照廠商說明書來分離染色體DNA。通過瓊脂糖凝膠電泳對分離出的DNA的定性檢測展示了其高分子量(〉16kbp)。實施例2擴增乃'c/n'ad/^n'z'D￡>S7基因的內部部分首先，通過用Camiz'c/aa/Zn'cawsDeslp蛋白(GenBankacc.弁EAL03178)作為模板進行TBLASTN檢索，從完全的和未完成的真核基因組的NCBI資料庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom—table.cgi)提取來自子囊菌物種的可能的二氫神經醯胺^去飽和酶的胺基酸序列。該蛋白質已經過生化分析，其被證明代表神經醯胺A"去飽和酶(Temesetal.,TheJoumalofBiologicalChemistry,277:25512-25518,2002)。使用ClustalW程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)比對提取的序列(所有E值<2x10—52的入口)。通過在考慮具有高度偏好性的乃'c/z/ac(/br"密碼子使用的情況下，將Deslp序列中高度保守的胺基酸片斷翻譯回去，來獲得用於擴增c^m7'Z)^S/基因的內部部分的合適的寡核苷酸。然後通過MWGBiotech(Ebersberg，Germany)合成下述寡核苷酸des1-deg-fw-2LeuT:desl-deg-rv:這些寡核苷酸用於按照Innis"a/.,(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990，AcademicPress)建立PCR反應，其中按照廠商說明書使用HerculaseHotstartDNA聚合酶(Stratagene,cat.弁600312)。應用該方法可獲得350bp的片段。按照廠商說明書，使用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen,cat.弁28106)來純化該片段。實施例3對P/c/'fla'/^nYD五W基因的內部部分的DNA序列進行測定使用Sangere,a/.(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,U.S.A.,74:5463-5467)開發的雙脫氧鏈終止法來測定經純化PCR產物的DNA序列。實施例1中用於PCR擴增的引物作為測序引物使用。通過Sequiserve(Vaterstetten,Germany)來進行DNA領!J序。使用CloneManager7軟體(Scientific&EducationalSoftware)將產生的序列信息(341bp,對應於SEQIDNO:3的1336-1676位核苷酸，圖1A)翻譯成蛋白質，得到的胺基酸序列用作為模板，用於用NCBI的非重複蛋白質資料庫進行的BLASTP檢索(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。檢索使得將Omt/^aa仿z'ca似Deslp(NCBIacc.#EAL03178)鑑定為資料庫中最接近新序列的蛋白質，這證實了事實上已擴增出了屍/c/n'acz/^r"D五W直向同源體的部分。實施例4擴增整條乃'c/^cz'fgm'z'Z)五S7基因以及測定其DNA序列為測定整條A'cA/a"y^r"Z)五W基因(編碼序列、啟動子區域以及3，非翻譯區域)的DNA序列，接著進行反向PCR方法。按照廠商說明書，用Ndel(MBIF畫entas,cat.#ER0581)對來自P油aF-60-10ANRR11031的染色體DNA(300ng)(按照實施例1分離的)進行過夜消化，這以總體積100Ad進行。按照廠商說明書，使用QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen，cat.#28106)，對經消化的DNA進行純化。按照廠商說明書，使用1UT4DNA連結酶，以200/xl的總體積，使用RapidDNALigationKit(RocheDiagnostics,cat.#1635379)對洗脫的DNA(50pi)進行過夜連接。按照廠商說明書，使用MinEluteGelExtractionKit(Qiagen,cat.#28604)對連接的DNA加以純化。將1^洗出物用作模板用於反向PCR反應，這按照Innis"a/.,(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)來進行。為此應用革巴向P/c/n'acz/e/r"i)五W基因的已知部分(見實施例3)的兩條寡核苷酸desl-IP-fw:desl-IP-rv:擴增用HerculaseHotstartDNA聚合酶按照廠商說明書來進行。使用該程序，可獲得1.6kbp的PCR產物。使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說明書來純化片段。按照實施例3所述測定該片段的DNA序列，其中使用寡核苷酸desl-IP-fw、desl-IP-rv和SSc-IPfwl:TTTTTACTTTTGCGAATCG(SEQIDNO:8)作為測序引物。新獲得的序列信息覆蓋了SEQIDNO:3的1-1681位核苷酸，其側翼有兩個A^el位點，這與預期一致，因為對模板DNA進行了7W/el消化。實施例3中獲得的DNA序列下遊沒能獲得新的序列信息，因為3'iV&I位點恰好直接位於該部分的下遊(圖IB)。為了獲得屍z'c/n'"cz/^r"D五W基因編碼區域的3'末端及其3，非翻譯區域的DNA序列，必須要再進行一輪反向PCR。因此，上述實驗方案重複進行，不同之處在於用(NewEnglandBiolabs，cat.#R0132S)來消化屍z'c/n'aa/ern7染色體DNA，在反向PCR期間使用下述寡核苷酸，它們是MWGBiotech(Ebersberg,Germany)合成的desl-IP-fw:desl-RP-Bamffl:使用該程序，可獲得1.2kbp的PCR產物。按照廠商說明書使用QIAquickPCRPurificationKit對片段進行純化。按照實施例3中所述，使用寡核苷酸desl-IP-fw和desl-RP-BamHI作為測序引物，測定該片段的DNA序列。可獲得852bp的新序列信息(SEQIDNO:3中的1682-2534位核苷酸)，其延伸至3'7V^el位點的下一個限制性位點下遊(圖IB)。使用上述三步程序，可分離出總共2534bp的乃'c/n'ac^^YD五67基因座，並可對其DNA序列進行測序(見SEQIDNO:3和圖1)。圖2描述的P/c/n'flc"b77'z'基因座編碼長度為351個胺基酸的PcDeslp蛋白(SEQIDNO1)。PcDeslp與來自OmAc/aa/Wcaws(GenBankacc.#EAL03178)禾口Sc/n.zos^ccAarawj/ces/函6e(GenBankacc.#059715)的Deslp蛋白分別具有62%(76%)和53%(70%)的位置胺基酸同一性(相似性)。來自Owcfe/aa/^caw禾B來自Sc/^aracc/zarawycespomZ^的Deslp蛋白已被生化分析過，其在體內展示出二氫神經醯胺A"去飽和酶活性。PcDeslp含有對於脂肪去飽和酶/羥化酶來說典型的胺基酸序列基元(Sperling&Heinz,BiochimicaandBiophysicaActa,2003,1632:1-15):HXXHH(149-153位胺基酸)和HXXHH(291-295位胺基酸)。此外，PcDeslp被預計攜帶有三個跨膜片斷(87-109、171-193以及205-227位胺基酸；這是TMHMM工具預測的，www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/),其具有二賴氨醯基元作為其C末端，這可能用作為內質網駐留信號(Anderssonetal.,1999,TheJournalofBiologicalChemistry,274:15080-4)。生物信息學分析強烈表明，屍cD^S/編碼屍z'c/n'ac^rn'/二氫神經醯胺A"去飽和酶。實施例5分離丁香假單胞黴素E抗性乃W^突變體為了分離出能高效生產二氫神經鞘氨醇的屍/c&"cz/wn7菌株，進行下述程序。首先，通過將不同濃度的丁香假單胞黴素E加入到瓊脂平板中，來測定屍/c/n'acz/e^T"菌株對於&w/tom;;cM^n'wgae產生的毒性化合物丁香假單胞黴素E(GrossDC,1985,RegulationofsyringomycinsynthesisinPseudomonassyringaepv.syringaeanddefinedconditionsforitsproduction.JApplBacteriol.58:167-174)的天然敏感性。通過將3.5mg丁香假單胞黴素E(從J.Takemoto,UtahStateUniversity獲得的)溶解於1.0ml0.001NHCl中來製備其貯液。為了穩定，將pH保持為低於7，貯藏於-20。C。使用含有0.1至20)Ug/ml之間不同濃度的丁香假單胞黴素E的YEPD平板(每升酵母提取物，10g;蛋白腖，20g;葡萄糖，20g;瓊脂，20g)，測定針對屍z'c/n'aa/wn7菌株的最小抑制濃度(=MIC值)。在具有不同濃度的丁香假單胞黴素E的每塊平板上，塗布100pi新鮮培養物(OD6。Qnm=0.4)，在30。C培養5天。取決於菌株，在有2至10Mg/ml丁香假單胞黴素E的平板上沒有出現菌落，表明MIC值在2至10ptg/ml之間。為分離出丁香假單胞黴素E抗性P.a/ew"變體，選用具有10/ig/ml的選擇性平板，因為該濃度被證實為對於標準P."/wn7菌株是致死性的，在這些平板上能存活的菌株將被命名為"抗性菌株"。如果使用了更低的濃度，這將導致非抗性菌落的背景生長，從而妨礙對真正的抗性突變體的分離。為分離丁香假單胞黴素E抗性屍.ci/^777變體，US6204006(DeBoerLandVanderWildtIFC,Microbialstrainsproducingsphingolipidbases)所述的P.czy^77'/的植物鞘氨醇生產菌株被預先培養於液體YEPD培養液中，直到OD6(K)^^1.0，將其分為不同的小份，塗布到10Mg/ml的丁香假單胞黴素E平板上，在30°C培養5天。將這些平板上表現為自發的丁香假單胞黴素E抗性分離菌的25個菌落轉移到標準YEPD平板，這些平板將作為所謂的主平板(masterplate)。在這些YEPD平板上進行非選擇性生長之後，再在具有10Mg/ml或15Aig/ml丁香假單胞黴素E的YEPD平板上對所有分離菌進行再次驗證。最初的分離菌中能在10yg/ml甚至在15/ig/ml丁香假單胞黴素E上生長的十種分離菌被命名為真正的"抗性"分離菌。這十種分離菌是在標準YEPD平板上純化的菌落，其被貯藏以待後用。實施例6通過丁香假單胞黴素E抗性朽c&ac/fern7突變體對二氫神經鞘氨醇進行搖瓶生產為評價按照實施例5所述分離的Ac;^a/wn'/的丁香假單胞黴素E突變體對類鞘氨醇鹼的生產，將所有十種真正的抗性分離菌的預培養物接種進25mlYEPD(在100mlErlenmeyer瓶中，無擋板)，在30°C和280轉/分鐘下培養3天。隨後，將1%的預培養物用於接種100mlLCBNB(在500mlErlenmeyer瓶中，有擋板)，在30°C和280轉/分鐘下培養4天。表1.LCBNB(=長鏈鹼營養培養液)培養基的組成tableseeoriginaldocumentpage26表2.痕量和維生素貯液的組成tableseeoriginaldocumentpage26tableseeoriginaldocumentpage27或二氫神經鞘氨醇)，將2.5克總培養液轉移至25ml容量瓶中。然後加入2.5ml經純化的水以及12ml丙酮。混合該容量瓶10分鐘，以萃取脂肪，之後用丙酮填裝至25ml。在10,000rpm對2ml該溶液加以10分鐘離心。將10Ad注射到柱上。使用Waters2695HPLC系統和來自GLScience的柱(InertsilODS-80A，4.6x250mm)分析樣品。流動相由乙腈中的0.05%TFA構成。流速為1ml/分鐘，在200nm處進行UV檢測。所用條件如下tableseeoriginaldocumentpage27商業可獲得的LCBs作為對照物被乙醯化並使用。在發酵培養液中可探測到表示為TriASa的三乙醯化二氫神經鞘氨醇(圖3)。選出的丁香假單胞黴素E抗性突變體生產的(乙醯化)二氫神經鞘氨醇的典型濃度被發現為每g生物質乾重10-100mg的範圍內。實施例7通過LC-MS鑑定二氫神經鞘氨醇為驗證乙醯化二氫神經鞘氨醇的存在，使用LC-MS。用乙醯化試劑對標準二氫神經鞘氨醇和植物鞘氨醇(作為對照)進行乙醯化。乙醯化試劑含有40mg4-二甲基氨基吡啶、0.6ml乙酸酐以及0.2ml三乙胺，它們溶解於10ml不含乙醇的氯仿中。大約3-4mg類鞘氨醇鹼溶解於10ml乙腈中作為標準物。向0.8ml類鞘氨醇鹼溶液中加入0.2ml乙醯化試劑。室溫下20-25分鐘的反應時間後，注射5yl。可探測到二氫神經鞘氨醇的三乙醯化形式(TriASa)。LC-UV-MS細節儀器LC-ZQ，來自Waters(CV18)MSESI/pos毛細電壓3.66kV錐孔電壓24V提取器(extractor)電壓2VRF鏡(lens)電壓0.1V去溶劑化溫度350°C源溫度130°C去溶劑化氣流600L/小時錐孔氣流120L/小時km能量0.1增效器650V掃描MS模式m/z400-800UV200nm柱YMCJ，sphereODS-H80,4m250*4.6mm條件流速1.0ml/分鐘注射體積5Ad滿環(fullloop)柱溫20°C槽溫環境切換閥1分鐘至廢料流動相乙腈中的0.05%TFA稀釋緩衝液水/丙酮(10:90)表3.對三乙醯化二氫神經鞘氨醇(TriASa)的MS鑑定tableseeoriginaldocumentpage29實施例8屍z'c/n'adfCT77'z'產生的二氫神經鞘氨醇變體的鏈長分離出的菌株能生產和排出Sa和/或其乙醯化形式，如實施例6和7所示。LCB的鏈長可根據脂肪酸合成的效率變化。已用LC-MS測定了從發酵培養液獲得的二氫神經鞘氨醇(Sa)及其乙醯化形式的鏈長。Sa及其衍生物主要以C18的最優鏈長存在。表4.(乙醯化)Sa和TAPS的駐留時間tableseeoriginaldocumentpage29表5.不同鏈長的(乙醯化)Sa和TAPS的比例tableseeoriginaldocumentpage29tableseeoriginaldocumentpage30nd=未檢領!j實施例9屍z'c/n'ac//^r"產生的二氫神經鞘氨醇變體的組成分離出的菌株能生產和排出Sa和/或其乙醯化形式。乙醯化程度可在0至3之間變動，這分別產生*二氫神經鞘氨醇(Sa)*單乙醯二氫神經鞘氨醇(NASa)二乙醯二氫神經鞘氨醇(DiASa)*三乙醯二氫神經鞘氨醇(TriASa)己用LC-MS測定了從典型的發酵培養液獲得的二氫神經鞘氨醇(Sa)及其乙醯化形式的相對組成。樣品包含50%完全乙醯化的TriASa。第二主要部分是DiASa，較少組分是游離的Sa。表6.兩種樣品中不同(乙醯化)組分的相對貢獻tableseeoriginaldocumentpage30實施例10分離穩定的、生產二氫神經鞘氨醇的屍Z'C/^C/Z^7^'突變體因為CZy^77'/是二倍體物種，導致對丁香假單胞黴素E抗性的突變可能是不穩定的。為了分離出穩定的生產二氫鞘氨醇的戶/c/2/a"y^r"菌株，進行下述程序。在非選擇性YEPD瓊脂上對選出的丁香假單胞黴素E抗性菌落進行菌落純化，以誘導良好生長。隨後，按照實施例6所述，在搖瓶中對兩種不同的最初丁香假單胞黴素E抗性菌落中的10種分離菌加以檢驗。分離菌顯示了產生的類鞘氨醇鹼具有的不同光譜，包括仍生產四乙醯化植物鞘氨醇的細胞系(見圖4;SYR2l-2H)。使用該方法，可能分離出穩定並且專門性的二氫神經鞘氨醇生產細胞系。實施例11構建過量表達二氫神經醯胺去飽和酶基因的丁香假單胞黴素E抗性Ac/u.flc(fer"7菌株為構建過量表達乃'c/n'aa/wn7二氫神經醯胺去飽和酶基因的丁香假單胞黴素E抗性突變體，我們首先構建整合型D^S7表達載體，其含有選擇標記——用於將線性化載體同源整合進乃'c/n'acz/ernY染色體DNA的DNA序列。選擇核糖體DNA基因間間隔序列作為染色體整合位點。為插入核糖體DNA基因間間隔序列，以及在整合位點中間產生獨特的Pmel識別序歹U，按照Innis&(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress),通過PCR來擴增5S-26SrDNA基因間間隔序列(IS)白勺兩個片段(Baeetal.,Integrativetransformationsystemforthemetabolicengineeringofthesphingoidbase-producingyeast屍z.c/n'flcz/em'/.2003.AppliedandEnvironmentalMicrobiology;美國專利6，638，735)，其中使用200ng屍/c/n'flc7/^777F-60-10ANRRL1031的染色體DNA作為模板，以及使用下述寡核苷酸片段l:pIS-Ndel-rev:5'-TATATACATATGGCTAGATTGACAGAAGTCGATCAG-3'[包括5，末端的MfeI識別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:11)Pmel-rv:5'-(SEQIDNO:12)片段2:p-IS-Ndel-for:括5'末端的Mfel識別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:13)Pmel-fw:(SEQIDNO:14)使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說明書對獲得的PCR片段(分別為503禾卩519bp)進行純化。隨後，按照Innis"a/.(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990，AcademicPress),代表屍/c/u'acz>m5S-26SrDNA基因間間隔序列的5，和3'部分的兩種PCR產物中的每種取10ng作為模板，通過建立PCR來獲得片段1和片段2的融合，其中使用下述寡核苷酸p-IS-Ndel-for:5'-TATATACATATGCTAATCACAACAGAACATTCTCTAACG-3，[包括5'末端的M^I識別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:15)pIS-Ndel畫rev:5'-TATATACATATGGCTAGATTGACAGAAGTCGATCAG-3'[包括5，末端的MfeI識別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:16)得到的1kbpPCR片段在其兩個末端都含有Mfcl識別序列，在片段中間含有識別序列。使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說明書對片段進行純化。用iVdel對PCR產物和載體pAG25(Goldsteinetal.,ThreenewdominantgenedisruptioncassettesforgenedisruptioninSaccharomycescerevisiae,1999，Yeast)加以切割(按照限制性內切酶的廠商說明書NewEnglandBiolabs,Schwalbach，Germany)。進行連接，產生載體pTH-IS2-Pmel。插入的定向和正確性通過DNA測序來驗證。對化學感受態五^^en'c^aco//細胞的連接、製備和轉化通過技術人員已知的方法來進行。為構建D^S/過量表達盒，使A'c/u'aa/err"的Z)￡W基因處於Ac/u'ac^rn'z'丙酮酸脫氫酶亞基A基因(屍ZMJ)啟動子區域的控制下。首先，使用200ng屍/c/n'""/emYF-60-10ANRRL1031的染色體DNA作為模板用於按照Innisa/.(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress)的PCR，擴增出屍cD五W，其中使用下述寡核苷酸:DESl-fw:GGCTACAATTACACATAGAAAAAACCCTTCACAAC-3'[包括5'末端與寡核苷酸PDAl-rv互補的50個鹼基的序列(斜體表示)](SEQIDNO:17)DESl陽rv:TA-3'[包括5，末端的/^I識別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:18)接著，用下述寡核苷酸來擴增乃'c/n'a"y^77'/丙酮酸脫氫酶亞基A基因(PA4/)的啟動子區域PDAl-fw:5'-TATACTGCAGTGTGCTCTAAATTTGCCCGGTTCGCGACG-3'[包括5'末端的/^I識別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:19)PDAl-rv:TA-3'(與寡核苷酸DESl-fw的5'末端互補)(SEQIDNO:20)使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說明書對獲得的PCR片段(分別為687bp禾Q1596bp)進行純化。隨後，按照Innis"a/.(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990,AcademicPress),代表P〖c/u'aa/em'ZZ)￡W基因和A'c/u'aa/emYPZM7啟動子區域的兩種PCR產物中的每種取10ng作為模板，通過建立PCR來獲得屍A47啟動子區域和Z)^W基因的融合，其中使用下述寡核苷酸PDAl-fw:5'-TATACTGCAGTGTGCTCTAAATTTGCCCGGTTCGCGACG-3'[包括5'末端的屍WI識別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:21)DESl-rv:TA-3'[包括5'末端的/^I識別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:22)使用該程序，可獲得2.2kbp的PCR產物。使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說明書對片段進行純化。然後，用限制性內切酶屍WI對PCR產物進行消化(按照限制性內切酶的廠商說明書NewEnglandBiolabs，Schwalbach，Germany)，將其連接進屍Wl切割過的載體pTH-IS2-Pmel(見上文)，得到pTH-DESl-IS2-Pmel。插入的定向和正確性通過DNA測序來驗證。對化學感受態^&c力en'c/n'aco/z'細胞的連接、製備和轉化通過技術人員已知的方法來進行。構建賦予環己醯亞胺抗性的抗性表達盒作為選擇性標記，它基於編碼核糖4本蛋白L41的A'c/n'aa/e/r"基因(Baea/"Integrativetransformationsystemforthemetabolicengineeringofthesphingoidbase-producingyeast/^c/'acz/ern'/.2003.AppliedandEnvironmentalMicrobiology;美國專禾U6,638,735)。按照Innis&(PCRprotocols.Aguidetomethodsandapplications,1990，AcademicPress)通過PCR擴增編碼核糖體蛋白L41的乃'c/n'ac^m7基因的兩條片段，以獲得經修飾的L4P基因，其中使用屍/c/n'aci/br//F-60-10ANRRL1031的染色體DNA作為模板，使用下述寡核苷酸片段l:PcL41隱SalI-fW:5'-TATAGTCGACGAATTCTCTTAAATGATGTTGG-3'[包括5'末端的&/1識別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:23)PcL41-internal陽rvGG-3'[與寡核苷酸PcL41-intemal-fW的5'末端互補，並且插入點突變(C到A，粗體)，代替來自A'c/n'ac^bT7'Z的L41蛋白的第56位胺基酸(脯氨酸到穀氨醯胺)，產生環己醯亞胺抗性(Bae"fl/.，Integrativetransformationsystemforthemetabolicengineeringofthesphingoidbase-producingyeast屍/cAz'a2003.AppliedandEnvironmentalMicrobiology;美國專利6,638,735)〗(SEQIDNO:24)片段2:PcL41-internal-fw:CCAAAAAAGTTGTTTTACG-3'[包括5'末端與寡核苷酸PcL41-internal-rv互補的49bp的序列，插入點突變(C到A，粗體)，代替來自乃'c/^ci/^r//的L41蛋白的第56位胺基酸(脯氨酸到穀氨醯胺)，產生環己醯亞月安，亢個生)(Baea/.,Integrativetransformationsystemforthemetabolicengineeringofthesphingoidbase-producingyeast屍z'c/n'a"/em.2003.AppliedandEnvironmentalMicrobiology;美國專利6,638,735)](SEQIDNO:25)PcL41-SacI-rv:5'-TATAGAGCTCAATTCCAATGTTTTGATCTGTC-3'[包括5'末端的^cl識別序列(下劃線表示)](SEQIDNO:26)使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說明書對獲得的PCR片段(分別為1222bp和753bp)進行純化。然後，兩種PCR產物每種取IOng進行PCR，來獲得代表經修飾的L4P基因(介導環己醯亞胺抗性)的兩條片段的融合，其中使用下述寡核苷酸PcL41隱SalI隱fw:5'-TATAGTCGACGAATTCTCTTAAATGATGTTGG-3'(包括5'末端的識別序列)(SEQIDNO:27)PcL41-SacI-rv:5'-TATAGAGCTCAATTCCAATGTTTTGATCTGTC-3'(包括5'末端的識別序列)(SEQIDNO:28)使用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說明書對獲得的1.9kbp的PCR片段進行純化。然後，用限制性內切酶&ZI^7&cI對PCR產物進行消化(按照限制性內切酶的廠商說明書NewEnglandBiolabs,Schwalbach,Germany)，將其分別連接進pTH-DESl-IS2-Pmel(見上文)，產生載體pDB007(圖4)。插入的定向和正確性通過DNA測序來驗證。對化學感受態^cAen'c/n'aco/z'細胞的連接、製備和轉化通過技術人員已知的方法來進行。用Pmel對載體pDB007進行線性化(按照限制性內切酶的廠商說明書NewEnglandBiolabs，Schwalbach，Germany)，貪《後"f吏用QIAquickPCRPurificationKit按照廠商說明書進行純化。對乃'c/u'ac(fern'!'F-60-10ANRRL1031細胞的轉化按照近來所描述的來進4亍(Bae&a/.，Integrativetransformationsystemforthemetabolicengineeringofthesphingoidbase-producingyeast屍z'c/n'aczy^r".2003.ApplEnvironMicrobiol.;美國專利6，638,735)。將丁香假單胞黴素E抗性朽c/^cz/^t//(實施例5中所述的)培養於YEPD培養基中，至600nm處的光學密度為1至1.5。通過離心收穫細胞，將其懸浮於0.1倍培養液體積的50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.5)中，使用之前該緩衝液中已加入25mM二硫蘇糖醇。在37°C培養15分鐘後，用一倍培養液體積的冷穩定溶液[270mM蔗糖、10mMTris-HCl(pH7.5)、1mMMgCy對細胞洗兩次，將其重新懸浮於0.01倍培養液體積的穩定溶液中。將5;xl線性化載體pDB007(含有1.6jLtgDNA)與50jul細胞混合，在冰上放置10分鐘。然後將轉化混合物轉移到2mm電穿孔管中。電穿孔用GenePulserX細胞(Bio-RadLaboratories,Mtinchen,Germany)在500V、50jLtF和700(]下按照廠商說明書來進行。電穿孔之後，將細胞重新懸浮於500Ad穩定溶液中，轉移至含有2mlYPD培養基的培養管中。細胞在30。C過夜再生後，將再生培養物的小份塗布到含有每ml0.5Mg環己醯亞胺的YPD平板上。在30。C培養7天後，出現數十個菌落。實施例12驗證二氫神經醯胺去飽和酶基因表達盒的存在進行菌落PCR，以驗證用攜帶有乃'c/^aa/^777二氫神經醯胺去飽和酶基因(D￡W)的質粒pDB007對丁香假單胞黴素E抗性朽c/n'fl"/^77'z'突變體的轉化，所述基因處於乃'c/n》c^w'/的丙酮酸脫氫酶亞基A基因CP工X4"的啟動子區域控制下。為達到該目的，在PCR中將來自實施例10的環己醯亞胺抗性菌落直接用作為模板，其中使用在PIM7啟動子區域結合的一條寡核苷酸(PDAl-DESl-fw)，以及在DES1基因結合的另一條(PDA1-DES1-rv)，僅在攜帶有處於PiX47啟動子控制下的D五W基因的轉化子中產生402bp的片段PDAl-DESl-fw:5'-CTAGGAAAGATAGGGGACAATCAAG-3'(SEQIDNO:29)PDAl-DESl-rv:5'-AAGGTTCAGGTCCACAAAGTTCTG-3'(SEQIDNO:30)通過PCR，可在檢驗的所有環己醯亞胺抗性菌落中證實巧c/n'aa/er"'PA4/啟動子和A'c/nhq'/^m7D五57之間融合的存在。實施例13通過過量表達cz'/^r"二氫神經醯胺去飽和酶基因的丁香假單胞黴素E抗性乃'c/nVzd/^77'/突變體對鞘氨醇-N-醯基酯進行搖瓶生產為檢驗過量表達ci/^r"二氫神經醯胺去飽和酶基因的丁香假單胞黴素E抗性突變體對鞘氨醇-N-醯基酯的增加的生產，按照實施例6中關於通過丁香假單胞黴素E抗性朽c/n力"/^777突變體對二氫神經鞘氨醇進行的搖瓶生產的部分所述(不同之處在於在攜帶載體pDB007的丁香假單胞黴素E抗性突變體的情況下加入每ml培養基2/xg的環己醯亞胺)，培養攜帶有載體pDB007(二氫神經醯胺去飽和酶基因表達載體)的丁香假單胞黴素E抗性突變體的一個克隆以及丁香假單胞黴素E抗性親本菌株，用於對鞘氨醇-N-醯基酯進行搖瓶生產。24小時(對數生長期)和4天(穩定期)後取樣。將10ml總發酵培養液轉移至10ml離心管中，在5300xg於4°C離心10分鐘，沉澱重新懸浮於1ml0.9%(w/v)氯化鈉(含有10mg/mlGlucanex(Sigma-Aldrich,Taufkirchen,Germany))中。細胞懸浮液在室顯培養1小時，隨後使用SoniprepMSE對細胞懸浮液進行3次超聲波處理，每次10秒，中間間隔冷卻。在5300xg對細胞懸浮液進行離心，使用BCA試驗，按照Smitha/.(Measurementofproteinusingbicinchoninicacid.AnalBiochem.1985Oct;150(l):76-85)，用牛血清清蛋白作為對照來測定上清液中的蛋白質濃度。向800Ml含有300Mg蛋白質的上清液中，加入3ml氯仿/乙醇混合物(1:2的比例)。劇烈混合達成單相之後，將樣品在室溫保持1小時。然後通過加入1ml氯仿和1ml蒸餾水使相分離。劇烈混合之後，在13000xg於室溫下對樣品進行15分鐘的離心。分離出較低的含脂肪氯仿相，通過真空離心進行蒸發(ChristVakuumzentrifuge，ChristAG,Osterode)。實施例14通過ESI-MS/MS在過量表達二氫神經醯胺去飽和酶基因的丁香假單胞黴素E抗性屍z'W/acz'/^t/z'突變體中定量和表徵鞘氨醇-N-醯基酯使用電噴霧離子化串聯質譜(ESI-MS/MS)測定按照實施例12製備的細胞提取物中鞘氨醇-N-醯基的濃度。ESI-MS/MS細節儀器QuattroUltima(Micromass)MSESI/pos毛細電壓3.5kV錐孔電壓50VRF1鏡電壓0.1V孔電壓0.0VRF2鏡電壓0.6V去溶劑化溫度300°C源溫度100°C去溶劑化氣流660L/小時錐孔氣流100L/小時碰撞能量25eV碰撞氣壓l.(r3Torrlon能量10.51on能量21.0增效器650V親本離子掃描m/z400-800範圍內，m/z264.2LC條件流速0.05ml/分鐘注射體積20Ml滿環槽溫7°C流動相含10mM甲酸銨的甲醇使用該方法，可展示過量表達乃'c力z'aa/em'/二氫神經醯胺去飽和酶基因的丁香假單胞黴素E抗性突變體較之相應的親本菌株能生產出至少兩倍的鞘氨醇-N-醯基(圖5)。醯基殘基被測定為幾乎排他性地代表ce-羥基硬脂酸和蜂蠟酸(圖5)。N-a-羥基-硬脂醯-鞘氨醇以163ng/mg細胞蛋白質的量存在，a-羥基-蜂蠟醯-鞘氨醇以392ng/mg細胞蛋白質的量存在。加起來，我們發現相對於每mg蛋白質有至少550ng的鞘氨醇-N-醯基酯。由於蛋白質相對總細胞乾重的比例被測定為每g細胞千重520mg蛋白質，鞘氨醇-N-醯基酯的總量為每g細胞乾重0.29mg。權利要求1.一種微生物菌株，其能生產對每g生物質乾重而言至少0.1mg的根據結構式I的類鞘氨醇鹼或其鹽或酯，其中，A-B選自CH2-CH2和CH＝CH構成的組，並且，其中，R選自下述構成的組a)(CH2)m-X-(CH2)n-CH3，其中m和n每個獨立地在0至18(含)之間，X是CH2-CH2、CH＝CH、C≡C、CHOH-CH2、HC＝O-CH2，前提條件是m+n應當在0至18(含)之間，以及b)(CH2)p-CH＝CH-(CH2)q-CH＝CH-(CH2)w-CH3，其中p、q和w每個獨立地在0至16(含)之間，前提條件是p+q+w應當在0至16(含)之間。2.如權利要求1所述的微生物菌株，其中所述類鞘氨醇鹼具有D-赤-(2R,3S)-構型。3.如權利要求1或2所述的微生物菌株，其中R是(CH2)m-X-(CH2VCH3，優選地，其中，m是O，X是CHrCH2或CHOH-CH2，n在8至12之間。4.如權利要求3所述的微生物，其中，m是O，X是CEb-CH2，n在8至12之間。5.如權利要求1-4中任意一項所述的微生物菌株，其中，所述微生物菌株是酵母菌株，優選地，是A'c/n'fl的菌株，更優選地，是"/em'z'的菌株。6.—種方法，用於獲得前述任意權利要求所述的微生物菌株，所述方法包括在存在合適濃度的毒素的情況下，培養微生物細胞的群體，選擇對於所述毒素具有抗性的細胞亞群，從對毒素具有抗性的所述細胞亞群中分離出能生產對每g生物質乾重而言至少0.1mg的結構式I的類鞘氨醇鹼的細胞。7.如權利要求6所述的方法，其中，所述毒素是丁香假單胞黴素E。8.如權利要求6或7所述的方法，還包括用編碼鞘脂代謝途徑的酶的多核苷酸，對下述對毒素具有抗性的微生物細胞群體進行DNA介導的轉化，所述對毒素具有抗性的微生物細胞群體能生產對每g生物質乾重而言至少0.1mg的結構式I的類鞘氨醇鹼。9.如權利要求6或7所述的方法，還包括在與所述毒素一起培養之前，用編碼鞘脂代謝途徑的酶的多核苷酸，對所述微生物細胞群體進行DNA介導的轉化。10.如權利要求8或9所述的方法，其中，所述鞘脂代謝途徑的酶是可從a;/b777獲得的二氫神經醯胺去飽和酶。11.如權利要求8或9所述的方法，其中，所述鞘脂代謝途徑的酶是選自下述多肽構成的組的二氫神經醯胺去飽和酶a.具有如SEQIDNO:1所示的胺基酸序列的多肽，b.具有下述胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO:1具有至少67%的序列同一性。12.—種多肽，其具有二氫神經醯胺去飽和酶活性，其選自下述多肽構成的組a.具有如SEQIDNO:1所示的胺基酸序列的多肽，b.具有下述胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與SEQIDNO:1具有至少67%的序列同一性。13.編碼權利要求12所述的多肽的多核苷酸。14.如權利要求13所述的多核苷酸，其是SEQIDNO:2。15.經轉化的微生物菌株，其能生產對每g生物質乾重而言至少0.1mg的結構式I的類鞘氨醇鹼，其可由權利要求8-10中任意一項所述的方法獲得。16.—種方法，用於生產根據結構式I的類鞘氨醇鹼，所述方法包括將權利要求1-5或15中任意一項所述的微生物菌株在有益於生產所述類鞘氨醇鹼的條件下發酵，以及從發酵培養液中回收所述類鞘氨醇鹼。全文摘要本發明提供了微生物菌株，特別是酵母菌株，所述菌株能生產對每g生物質乾重而言至少0.1mg的類鞘氨醇鹼。本發明還提供了一種方法，用於獲得能生產類鞘氨醇鹼的微生物菌株，所述方法包括在存在合適濃度的毒素的情況下，培養微生物細胞的群體，選擇對於所述毒素具有抗性的細胞，從對毒素具有抗性的細胞群體中分離出能生產對每g生物質乾重而言至少0.1mg的結構式(I)的類鞘氨醇鹼的細胞。可選地，所述方法還包括用編碼鞘脂代謝途徑的酶的多核苷酸對能生產相對於每g生物質乾重而言至少0.1mg的結構式(I)的類鞘氨醇鹼的、對毒素具有抗性的細胞群體進行DNA介導的轉化。本發明還提供了具有二氫神經醯胺去飽和酶活性的多肽，其可從Pichiaciferrii獲得。文檔編號C12P13/02GK101098968SQ200580045976公開日2008年1月2日申請日期2005年11月7日優先權日2004年11月5日發明者斯特芬·舍弗爾,馬爾科·亞歷山大·范德勃戈申請人:科斯莫費爾姆有限公司