固定於水溶液中的疏水性樹脂上的脂肪酶的酶酯交換的製作方法

2023-05-11 16:34:21 4

固定於水溶液中的疏水性樹脂上的脂肪酶的酶酯交換的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於製備脂肪酸烷基酯的酶批量或連續方法及用於其的體系，所述脂肪酸烷基酯用於生物燃料、食品和清潔劑工業中。所述方法利用在鹼性或弱鹼性含水緩衝液的存在下或在水或水溶液的存在下，與脂肪酸源和醇或醇給體混合的固定於疏水性樹脂上的酶。用於脂肪酸烷基酯的製備方法通過酯交換或酯化同時或連續進行。生物催化劑活性得以保持，而在多個用途中無顯著的活性損失，還避免了甘油和水副產物或其他親水性化合物在所述生物催化劑上的積聚。
【專利說明】固定於水溶液中的疏水性樹脂上的脂肪酶的酶酯交換
【技術領域】
[0001]本發明公開了一種用於製備脂肪酸烷基酯的酶方法，所述脂肪酸烷基酯用於生物燃料、食品和清潔劑工業中。在所述方法中，脂肪酸源和醇或醇給體在固定於疏水性樹脂上的酶的存在下，在鹼性含水緩衝液或水的存在下反應。所公開的方法可使用連續攪拌槽反應器或填充床柱反應器批量地或連續地進行操作。
【背景技術】
[0002]酶的固定化已由大量技術進行描述，所述大量技術基本上旨在降低在整個酶方法中酶的成本貢獻、促進酶從產物中回收，以及使方法能夠連續操作。
[0003]固定化技術通常根據如下劃分:
[0004]1.酶對固體載體(如二氧化矽和不可溶聚合物)的物理吸附。
[0005]2.在離子交換樹脂上的吸附。
[0006]3.酶對固體載體材料(如環氧化的無機或聚合物載體)的共價結合。
[0007]4.酶在增長 中的聚合物中的捕獲。
[0008]5.酶在膜反應器中或在半滲透凝膠中的限制。
[0009]6.交聯酶晶體(CLECS)或聚集體(CLEAS)。
[0010]所有前述酶固定化程序均由如下步驟組成:
[0011]1.關於pH、溫度、緩衝鹽的類型和離子強度，將酶溶解於適當的緩衝液體系中。
[0012]2.將固體載體加入至酶溶液中，並混合一定時間直至酶分子固定至固體載體上。
[0013]3.過濾含有固定化酶的固體載體。
[0014]4.用適當的緩衝液洗滌所述載體以去除鬆散結合的酶分子，然後乾燥所述固體載體。
[0015]界面酶，主要是脂肪酶已遵循前述技術而被固定。這些提供了具有低合成活性和/或短的操作半衰期的固定化酶製劑。為了增加固定化脂肪酶和其他界面酶的合成活性和穩定性，已應用了不同的活化方法。這些方法包括:
[0016]1.將酶的表面官能團與疏水性殘基(如脂肪酸或聚乙二醇)結合。
[0017]2.用表面活性劑(如多元醇脂肪酸酯)塗布酶的表面。
[0018]3.使酶接觸疏水性載體(通常為聚丙烯)，所述疏水性載體已用親水性試劑(如乙醇或異丙醇)進行預處理。
[0019]上述方法都不產生用以進行工業量的酶反向轉化的關於固定化界面酶的穩定和成本效益的令人滿意的結果。而且，已報導當根據前述程序進行固定化時，由於由固定化程序所施加的某些限制，或者由於某些酶抑制劑在反應介質中的存在，大多數酶或者損失顯著部分的它們的合成活性，或者它們不顯示它們的完全活性性能。
[0020]脂肪酶和磷脂酶的另一主要缺點在於它們對親水性底物，特別是短鏈醇和短鏈脂肪酸(C4以下)的低耐受性。已在許多研究中觀察到短鏈醇和短鏈脂肪酸(分別例如甲醇和乙酸)是使必要的水分子從那些酶的四級結構分離，從而導致酶的變性和因此它們的催化活性的損失的原因。該缺點已阻止了脂肪酶用於使用油甘油三酯和甲醇作為底物來製備商業量的脂肪酸甲酯「生物柴油」的應用。
[0021]使用固定化脂肪酶用於脂肪酸源與游離醇的酯交換/酯化的另一缺點在於，所形成的甘油和水副產物在生物催化劑上積聚，因此阻止了底物自由到達固定化酶的活性位點。當使用同一批次的生物催化劑時，這些生物催化劑通常在數個循環之後損失它們的催化性能。
[0022]本發明人已開發了在許多製備循環內顯示出良好的穩定性、持久的活性的特定固定化酶製劑。這種酶製劑的例子尤其公開於W0/2008/084470、W0/2008/139455和W02009/069116 中。
[0023]催化反應進行的條件可不利地影響固定化酶製劑的穩定性和效率。重要的是具有在反應條件下保留穩定性和活性的酶製劑。
[0024]隨著描述的進行，本發明的這些目的和其他目的將變得顯而易見。

【發明內容】

[0025]在一個實施例中，本發明涉及一種用於脂肪酸源與醇的酯交換/酯化以形成脂肪酸烷基酯的方法，其包括在固定化脂肪酶製劑的存在下使脂肪酸源與醇或醇給體反應，其中所述固定化脂肪酶製劑包含至少一種固定至疏水性多孔載體上的脂肪酶，且反應介質含有含水鹼性緩衝溶液。
[0026]在該實施例的所有方面中，所述含水鹼性緩衝溶液可為含水弱鹼性緩衝溶液。所述含水鹼性緩衝溶液可以所述脂肪酸源的至多99重量％，例如至多90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、12%、10%、8%、5%、4%、3%、2%和1%的量包含於所述反應混合物中。或者，所述含水鹼性緩衝溶液可以所述脂肪酸源的超過I重量％，超過2%、3%、4%、5%、6%、8%、10%、12%、15%、20%、25`%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 且至多 99% 的量包含於所述反應混合物中。所述含水緩衝溶液可具有7至約11，例如7-8.5、7-9、7-9.5,7-10和7_11中的任一種的pH。在本發明的方法中，包含所述緩衝溶液的補充弱鹼性試劑的PKa可高於或等於存在於所述脂肪酸源中的游離酸的pKa。
[0027]在另一實施例中，本發明涉及一種用於脂肪酸源與醇的酯交換/酯化以形成脂肪酸烷基酯的方法，其包括在固定化脂肪酶製劑的存在下使脂肪酸源與醇反應，其中所述固定化脂肪酶製劑包含至少一種固定至疏水性多孔載體上的脂肪酶，且反應介質含有水。所述水為具有3至11的pH的蒸餾水或含有各種溶解的鹽的水的形式。在該實施例的所有方面中，所述反應介質可含有脂肪酸源的至多99重量％，例如至多90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、12%、10%、8%、5%、4%、3%、2% 和 1% 的量的水或水溶液。或者，水或水溶液可以脂肪酸源的超過I重量％，超過2%、3%、4%、5%、6%、8%、10%、12%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%且至多99%的量包含於所述反應混合物中。
[0028]在本發明的所有實施例和方面中，所述醇可為短鏈醇，例如C1-C6烷基醇，更特別地C1-C4烷基醇，特別是甲醇或乙醇。當所述醇為甲醇時，所述所得脂肪酸酯為脂肪酸甲酯(FAME-生物柴油)。所述醇也可為中鏈脂肪醇(C6-Cltl)或長鏈脂肪醇(C12-C22X所述醇給體可為單烷基酯或碳酸二烷基酯，如碳酸二甲酯或碳酸二乙酯。
[0029]在本發明的所有實施例和方面中，所述固定化脂肪酶能夠催化游離脂肪酸的酯化以產生脂肪酸烷基酯以及水作為副產物，並能夠催化甘油三酯、部分甘油酯、蠟酯和磷脂的酯交換以分別產生脂肪酸烷基酯和甘油，以及長鏈脂肪醇和甘油磷脂作為副產物。
[0030]在涉及使用鹼性緩衝液或鹼性溶液的本發明的所有實施例和方面中，在反應介質中所述鹼性緩衝液或溶液的量為脂肪酸源的超過0.001重量％。
[0031]在本發明的所有實施例和方面中，所述至少一種脂肪酶可為衍生自任一如下的脂肪酶:米赫根毛黴、假單胞菌屬、雪白根黴、爪哇毛黴、米根黴、黑麴黴、卡門柏青黴、產鹼桿菌屬、無色桿菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、綿毛嗜熱絲孢菌、粘稠色桿菌、南極假絲酵母B、皺褶假絲酵母、南極假絲酵母A、番木瓜種子和胰液素。所述脂肪酶製劑可包含至少兩種脂肪酶，所述至少兩種脂肪酶可各自分別固定至疏水性載體上，或者共固定至同一疏水性載體上。所述脂肪酶能夠同時或連續催化游離脂肪酸的酯化以產生脂肪酸烷基酯以及水作為副產物，以及甘油三酯和部分甘油酯的酯交換以產生脂肪酸烷基酯以及甘油作為副產物，和/或磷脂的酯交換以產生脂肪酸烷基酯和溶血磷脂和甘油磷脂作為副產物。
[0032]在本發明的所有實施例和方面中，所述載體可為疏水性脂族聚合物基載體和疏水性芳族聚合物基載體中的任一種。所述疏水性聚合物載體可由直鏈或支鏈有機鏈組成。所述載體可包含大網絡有機聚合物或共聚物鏈。所述載體可為多孔或非多孔無機載體，所述多孔或非多孔無機載體可為疏水性的，或用疏水性有機材料塗布。所述有機材料可為直鏈、支鏈或官能化的疏水性有機鏈。
[0033]在本發明的所有實施例和方面中，當使用鹼性緩衝溶液時，所述含水鹼性緩衝溶液可為無機鹼鹽或有機鹼的溶液。所述鹼性緩衝溶液可為如下任一種的溶液和它們的任意混合物:鹼金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽和檸檬酸鹽、脂肪酸鹽、伯胺、仲胺和叔胺。在特定實施例中，所述鹼性緩衝溶液可為選自鈉或鉀的碳酸氫鹽和碳酸鹽的弱鹼的溶液。在本發明的方法的一些特定實施例中，可在預混階段將所述鹼性緩衝溶液加入至所述脂肪酸源，或者將所述鹼性緩衝溶液直接加入至所述反應介質。
[0034]在本發明的所有 實施例和方面中，當使用鹼性緩衝溶液時，在酯交換/酯化反應介質中的所述鹼性緩衝溶液的含量可為油原料的超過0.001重量％的量，例如油原料的1-30重量％、1-20重量％、1-10重量％、1-5重量％或1_2重量％，或者油原料的超過5重量％的量，例如油原料的超過6重量％、7重量％、8重量％、10重量％、12重量％、15重量％、20重量％、30重量％、40重量％和50重量％。
[0035]在本發明的一些實施例中，所述脂肪酸源可首先與所述鹼性緩衝溶液或者與水或水溶液混合，然後用所述固定化脂肪酶製劑處理所述混合物，隨後加入所述醇，並允許反應在合適的條件下進行直至所述脂肪酸源轉化為脂肪酸酯。
[0036]在本發明的所有實施例和方面中，所述脂肪酸源可為如下的任一種和它們的任意混合物:植物油、動物脂肪、海藻油、魚油、廢油。所述脂肪酸源可包括在不存在或存在其他少量脂肪酸衍生物下的游離脂肪酸、甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯、它們任意比例的混合物，所述其他少量脂肪酸衍生物例如磷脂、蠟酯和固醇酯。所述脂肪酸源可為未精製的、精製的、漂白的、除臭的或它們的任意組合。
[0037]在本發明的所有實施例和方面中，所述反應可在10°C至100°C之間，特別地25-30°C之間的溫度下進行。
[0038]在本發明的所有實施例和方面中，所述脂肪酸源可與所述醇或醇給體以及所述水或緩衝溶液在預反應準備容器中預混以形成乳狀液，隨後將所述乳狀液與所述固定化脂肪酶製劑一起進料至酯交換/酯化反應容器中。
[0039]在本發明的所有實施例和方面中，所述固定化脂肪酶可在以批量模式或連續模式操作的填充床柱反應器中使用。
[0040]根據本發明的另一方面，提供了一種用於脂肪酸與醇的酯交換/酯化以形成脂肪酸烷基酯的體系，其包括:
[0041]配置用於使反應介質在固定化脂肪酶製劑的存在下反應的反應容器，所述反應介質包含脂肪酸以及醇和醇給體中的至少一種，其中所述固定化脂肪酶製劑包含固定於疏水性多孔載體上的至少一種脂肪酶，且所述反應介質含有含水鹼性緩衝溶液和水中的至少一種。
[0042]所述體系可以任何所需的組合或排列包括如下特徵的一種或多種:
[0043]A.至少在用於製備所述脂肪酸烷基酯的所述體系的操作過程中，所述反應容器可包含所述固定化脂肪酶製劑。
[0044]B.另外地或替代特徵A地，至少在用於製備所述脂肪酸烷基酯的所述體系的操作過程中，所述反應容器 可包含脂肪酸以及醇和醇給體中的至少一種。
[0045]C.另外地或替代特徵A或B地,所述反應介質包含混合物,所述體系還包括與所述反應容器選擇性流體連接的預反應容器，所述預反應容器配置用於至少預混所述脂肪酸以及醇和醇給體中的至少一種以形成所述混合物，並用於至少在用於製備所述脂肪酸烷基酯的所述體系的操作過程中將所述混合物選擇性地遞送至所述反應容器。所述體系可任選地進一步包括脂肪酸源和醇源，所述脂肪酸源與所述預反應容器選擇性流體連接，並配置用於至少在所述體系的所述操作過程中將脂肪酸選擇性地遞送至所述預反應容器，所述醇源與所述預反應容器選擇性流體連接，並配置用於至少在所述體系的所述操作過程中將醇和醇給體中的至少一種選擇性地遞送至所述預反應容器。所述體系可任選地進一步包括緩衝液源，所述緩衝液源與所述預反應容器選擇性流體連接，並配置用於至少在所述體系的所述操作過程中將含水鹼性緩衝溶液和水中的至少一種選擇性地遞送至所述預反應容器以被包含於所述混合物中。
[0046]D.另外地或替代特徵A至C地，所述體系可配置用於至少在所述體系的所述操作過程中以連續方式或不連續批量地將一種或多種脂肪酸和/或醇和醇給體中的至少一種和/或含水鹼性緩衝溶液和水中的至少一種各自選擇性地遞送至所述預反應容器。
[0047]E.另外地或替代特徵A至D地，所述預反應容器可配置用於至少在所述體系的所述操作過程中以連續方式和/或不連續批量地將所述混合物選擇性地遞送至所述反應容器。
[0048]F.另外地或替代特徵A至E地，所述體系可配置用於將如下的至少一種選擇性地直接遞送至所述反應容器:脂肪酸、醇和醇給體中的至少一種、以及含水鹼性緩衝溶液和水中的至少一種。
[0049]G.另外地或替代特徵A至F地，所述反應容器可包括熱調節系統，所述熱調節系統配置用於將所述反應容器中的反應介質保持在所選溫度範圍內。
[0050]H.另外地或替代特徵A至G地，所述體系可任選地進一步包括保留裝置，所述保留裝置配置用於至少在所述體系的操作過程中將所述固定化脂肪酶製劑保留在所述反應容器內。
[0051]1.另外地或替代特徵A至H地，所述體系還包括與所述反應容器選擇性流體連接的產物分離容器，所述體系配置用於將來自所述反應容器的包含反應產物的反應混合物選擇性地遞送至所述產物分離容器，且其中所述產物分離容器配置用於將脂肪酸烷基酯的產量選擇性地從遞送至所述產物分離容器的反應混合物中分離。例如，所述產物分離容器可為離心機和重力分離系統中的一種。
[0052]J.另外地或替代特徵A至I地，所述反應容器配置用於至少在所述體系的所述操作過程中以連續方式和/或不連續批量地將所述反應混合物選擇性地遞送至所述產物分
離容器。
[0053]K.另外地或替代特徵I至J地，所述體系配置用於從所述產物分離容器選擇性地遞送所述脂肪酸烷基酯的產量。例如，所述體系配置用於以連續方式和/或不連續批量地從所述產物分離容器選擇性地遞送所述脂肪酸烷基酯的產量。
[0054]另外地或替代特徵A至K地，所述體系配置用於從遞送至所述產物分離容器的反應混合物增加所述脂肪酸烷基酯的產量。在具有該特徵的體系的一種配置中，所述體系配置用於將所述脂肪酸烷基酯的產量選擇性地再發送至所述反應容器以進一步增加來自所述反應混合物的所述脂肪酸烷基酯的產量，所述反應混合物隨後被遞送至所述產物分離容器。在具有該特徵的體系的另一配置中，所述體系配置用於將所述脂肪酸烷基酯的產量選擇性地再發送至輔助反應器組件，其中所述輔助反應器組件包括輔助反應器容器和輔助產物分離容器，其中所述進一步增加的脂肪酸烷基酯的產量隨後經由所述輔助產物分離容器被選擇性地遞送。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0055]為了理解本發明並領會本發明如何在實踐中進行，現在將僅以非限制性的例子的方式並參照附圖描述實施例`，其中:
[0056]圖1:固定在作為疏水性樹脂的Amberlite XAD1600 (Amb.XAD1600)上和作為親水性樹脂的Duolite D568 (Duo D568)上的脂肪酶綿毛嗜熱絲孢菌(TL)，以及固定在作為疏水性樹脂的S印abeads SP70 (SB SP70)上和作為親水性樹脂的多孔二氧化矽(Sil.)上的脂肪酶假單胞菌屬(PS)的酯交換活性。
[0057]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環
[0058]圖2:在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在0.1M的碳酸氫鈉溶液的不同水平下反應6小時之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。生物催化劑為固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶。
[0059]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環
[0060]圖3:在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在0.1M的碳酸氫鈉溶液的不同水平下反應6小時之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。生物催化劑為固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自假單胞菌屬的脂肪酶。
[0061]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環
[0062]圖4:在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在無水下以及在水的不同水平下反應6小時之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。生物催化劑為固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶。
[0063]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環；DW -蒸懼水
[0064]圖5:在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在水的不同水平下反應6小時之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。生物催化劑為固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自假單胞菌屬的脂肪酶。
[0065]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環；DW -蒸懼水
[0066]圖6:在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在0.1M的碳酸氫鈉溶液的不同水平下酯化/酯交換4小時之後，FFA和豆油的混合物向生物柴油，以及甘油和水副產物的轉化率。生物催化劑為固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自假單胞菌屬的脂肪酶。
[0067]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環；DW -蒸懼水
[0068]圖7:在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在2%的0.1M的碳酸氫鈉溶液的存在下反應4小時之後，豆油水解產物向生物柴油和水的酯化。生物催化劑為固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自假單胞菌屬的脂肪酶。
[0069]縮寫:Ac.Val.-酸值；Cyc.-循環
[0070]圖8:在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在I重量％的0.1M的碳酸氫鈉溶液的存在下反應6小 時之後,魚油與乙醇的酯交換。生物催化劑為固定於AmberliteXAD1600上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌(TL Lip.)和假單胞菌屬(PS Lip.)的脂肪酶。
[0071]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環
[0072]圖9:在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在2重量％的0.1M的碳酸氫鈉溶液的存在下反應6小時之後，牛脂肪與乙醇的酯交換。生物催化劑為固定於AmberliteXAD1600上的綿毛嗜熱絲孢菌、假單胞菌屬脂肪酶(PS Lip.；TL Lip.)。
[0073]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環
[0074]圖10:使用固定於疏水性多孔樹脂上的假單胞菌屬或綿毛嗜熱絲孢菌以及固定於疏水性多孔樹脂上的南極假絲酵母，處理在4小時之後獲得的含有7mg KOH/Ig的FFA值的酯交換/酯化反應介質。
[0075]縮寫:Ac.Val.-酸值；Cyc.-循環
[0076]圖11:固定於作為疏水性樹脂的二乙烯基苯/聚苯乙烯(DVB-PS)上、弱陰離子交換親水性樹脂(Res.)和作為親水性樹脂的多孔二氧化矽顆粒(Sil)上的衍生自產鹼桿菌屬(AL)的脂肪酶的酯交換活性。
[0077]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環
[0078]圖12:固定於作為疏水性樹脂的二乙烯基苯/聚苯乙烯(DVB-PS)上、弱陰離子交換親水性樹脂(Res.)和作為親水性樹脂的多孔二氧化矽顆粒(Sil)上的綿毛嗜熱絲孢菌(TL)脂肪酶的酯交換活性。
[0079]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環
[0080]圖13:固定於作為疏水性樹脂的二乙烯基苯/聚苯乙烯(DVB-PS)上、弱陰離子交換親水性樹脂(Res)和作為親水性樹脂的多孔二氧化矽顆粒(Sil)上的假單胞菌屬(PS)脂肪酶的酯交換活性。
[0081]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環[0082]圖14:在0.1M的碳酸氫鈉溶液的不同濃度下，在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑(固定於DVB-PS載體上的綿毛嗜熱絲孢菌(TL))反應6小時之後，豆油向脂肪酸甲酯和甘油的轉化率。將甲醇以油與甲醇之間的1:3的摩爾基本比例在一步中添加至反應混合物。
[0083]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環；Sol.-溶液
[0084]圖15:在0.1M的碳酸氫鈉溶液的不同濃度下，在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑(固定於DVB-PS載體上的假單胞菌屬(SP))反應6小時之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。將甲醇以油與甲醇之間的1:3的摩爾基本比例在一步中添加至反應混合物。
[0085]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環；Sol.-溶液
[0086]圖16:在蒸餾水在反應混合物中的不同濃度下，在多個批量實驗中使用同一批(固定於DVB-PS載體上的綿毛嗜熱絲孢菌(TL))反應6小時之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。將甲醇以油與甲醇之間的1:3的摩爾基本比例在一步中添加至反應混合物。
[0087]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環；Wat.-水
[0088]圖17:在0.1M的碳酸氫鈉溶液的不同濃度下，在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑(固定於DVB-PS載體上的綿毛嗜熱絲孢菌(TL))反應6小時之後，油酸向生物柴油和水的轉化率。將甲醇以油與甲醇之間的1:3的摩爾基本比例在一步中添加至反應混合物。
[0089]縮寫:Conv.- 轉化率；Cyc.-循環；Sol.-溶液
[0090]圖18:在8重量％的0.1M的碳酸氫鈉溶液的存在下，在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑(固定於DVB-PS載體上的綿毛嗜熱絲孢菌(TL))反應6小時之後，油酸和豆油甘油三酯的不同混合物向生物柴油、甘油和水的轉化率。將甲醇以油與甲醇之間的1:3的摩爾基本比例在一步中添加至反應混合物。
[0091]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環；01.Ac..-油酸
[0092]圖19:在8重量％的0.1M的碳酸氫鈉溶液的存在下，在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑(固定於DVB-PS載體上的綿毛嗜熱絲孢菌(TL))反應6小時之後，含有磷脂的粗油向生物柴油和甘油的轉化率。基於油與甲醇之間的1:3的摩爾比，將甲醇在一步中添加至反應混合物。
[0093]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環；RSB0 -精製豆油；CSB0 -粗豆油；RSB0 -精製豆油；PL -磷脂;0.-油;
[0094]圖20:在0.1M的碳酸氫鈉溶液的不同pH值下，在多個批量實驗中使用同一批(固定於DVB-PS載體上的綿毛嗜熱絲孢菌(TL))反應6小時之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。反應介質中的緩衝液濃度為油的8重量％。基於油與甲醇之間的1:3的摩爾比，將甲醇在一步中添加至反應混合物。
[0095]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環
[0096]圖21:在0.1M的醋酸鈉溶液的不同pH值下，在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑(固定於DVB-PS載體上的綿毛嗜熱絲孢菌(TL))反應6小時之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。反應介質中的緩衝液濃度為油的8重量％。基於油與甲醇之間的1:3的摩爾比，將甲醇在一步中添加至反應混合物。
[0097]縮寫:Conv.-轉化率；Cyc.-循環；Acet.-醋酸鹽
[0098]圖22:示意性示出了根據本發明的一個方面的用於製備脂肪酸烷基酯的體系的第一實施例。
[0099]圖23:示意性示出了根據本發明的一個方面的用於製備脂肪酸烷基酯的體系的
第二實施例。
【具體實施方式】
[0100]在尋求酶催化工業方法，特別是在固定化脂肪酶的存在下脂肪酸源與醇的酯交換/酯化的方法的改進中，本發明人已開發了特定的條件，在該條件下固定化脂肪酶的穩定性在許多製備循環中得以保持。
[0101]在本發明的一個實施例中，本發明涉及一種用於在無溶劑鹼性微水體系中製備脂肪酸的烷基酯，特別是脂肪酸的短鏈烷基酯，如脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯(生物柴油)的方法。在特定實施例中，所述鹼性微水體系為弱鹼性微水體系。所述方法包括提供脂肪酸源，並在所述鹼性或弱鹼性條件下在固定化脂肪酶製劑的存在下使所述脂肪酸源與游離醇或醇給體反應。不受限於理論，用鹼性緩衝溶液預處理脂肪酸源將產生可能對酶具有抑制作用的中和酸。完成高達100%轉化率的反應所需的醇的量可逐步加入或一次性加入。此外，所述醇可為短鏈醇，例如甲醇或乙醇。其他醇給體可在水解酶的存在下在與脂肪酸源的反應中使用，並允許反應在合適條件下進行，直至所述脂肪酸源轉化為脂肪酸烷基酯，特別是脂肪酸甲酯(FAME)或脂肪酸乙酯，其中所述水解酶製劑包含分別或共同固定至合適的大網絡多孔疏水性聚合物基載體上的一種或多種脂肪酶。
[0102]在另外的實施例中，脂肪酸源和醇或醇給體之間的酯交換/酯化反應在含水微環境中進行，其中將水加入所述反應混合物中。在特定實施例中，水可以以高於0.0001重量％(以脂肪酸源計)的量加入。本文所用的水意指純水或蒸餾水，以及「水溶液」(也稱為含水溶液)，其可為但不限於自來水、海水或來自任何其他天然水源或水庫的水、脫鹽水、經化學或酶淨化或處理的水，以及任何其他含水溶液，例如溶解的鹽溶液。反應體系或水溶液的PH可變化，並可為例如約3-11， 例如4-10、5-10、5-9、6-10、6-9或7-9。
[0103]本發明的方法可在同時從反應混合物中連續去除所形成的甘油和任何過量的水下進行。包含於所述脂肪酸源中的脂肪酸醯基或游離脂肪酸向脂肪酸烷基酯，特別是脂肪酸甲酯的轉化率可在反應過程中在各種時間點進行監測。可在反應過程中在任何所需的時間點通過合適的方式去除反應介質，由此停止反應，並將形成的脂肪酸甲酯和任選的形成的甘油從所述反應介質中分離。當包含於所述脂肪酸源中的脂肪酸醯基或游離脂肪酸向脂肪酸甲酯的轉化率已達到至少70%，例如至少85%，或至少90%時，可特別地停止反應。
[0104]所述反應體系可類似於描述於共同待審的W02009/069116中的反應體系。例如，製備體系可使用具有底部燒結玻璃或不鏽鋼過濾器的攪拌槽反應器，所述底部燒結玻璃或不鏽鋼過濾器將生物催化劑保留在反應器中，但允許反應介質滲透出所述反應器。這種反應器配置允許從固定化酶自解吸的副產物(特別是甘油和水)下沉至反應器的底部，並通過所述過濾器滲透出去。結果是解吸的形成的甘油以及過量的水從反應介質連續移出，從而導致反應向合成移動，由此達到98%以上的轉化率。在該反應器中使用的生物催化劑由單一類型或多個類型的脂肪酶組成，考慮到它們的位置特異性以及它們的來源，如本文所述。或者，可使用具有底部過濾器的兩個連續的攪拌槽反應器。可在所述兩個反應器之間使用沉降槽或離心機。第一反應器可含有由單一類型或多個類型的脂肪酶組成的固定化生物催化劑。在兩個反應器之間的沉降槽或離心機的作用是從反應介質中去除所形成的甘油和過量的水，從而使得在第二反應器中在合理的反應時間原料向它們相應的脂肪酸烷基酯的轉化率增加至98%以上。以下描述一些特定的反應體系和方法。
[0105]術語「反應混合物」、「反應體系」和「反應介質」在本文可同義地使用。
[0106]如在本發明的方法的實施例中，在鹼性緩衝溶液或水的存在下固定於疏水性樹脂上的脂肪酶的使用確保了酶的高穩定性，並避免了親水性物質(如水和形成的甘油副產物)在生物催化劑上的積聚。在其中使用鹼性或弱鹼性緩衝液的本發明的方法的所有方面和實施例中，可使用超過0.001%的鹼性或弱鹼性緩衝溶液，例如但不限於0.01-5%,0.05-5%、0.1-5%、0.5-5%、0.01-50%、0.05-50%、0.1-50%,0.5_50%、1_50%、1_45%、1_40%、1_35%、1-30%、1-25%、1-20%、1-15%、1-10%、1-8%，例如但不限於超過 0.001%,0.01%,0.05%,0.1%、0.5%、0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、6%、7%、8%、10%、12%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%或70%。鹼性或弱鹼性緩衝溶液的水平可為至多99重量％在其中使用水或水溶液的本發明的所有方面和實施例中，水或水溶液以如下水平使用:不限於超過 0.0001%,例如 0.0001-50%,0.001-50%,0.1-50%,0.0001-30%,0.001-30%,0.1-30%,0.0001-20%、0.001-20%、0.1-20%,例如但不限於 0.001-5%, 0.01-5%, 0.05-5%, 0.1-5%,0.5-5%,如超過 0.0001%,0.001%,0.01%,0.05%,0.1%、0.5%、0.75%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、
3.5%、4%、4.5%、5%、6%、7%、8%、10%、12%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50% 或 70%。反應混合物中的水或水溶液水平可為至多99重量％。如所述，當使用鹼性溶液時，其可中和酸，所述酸通常存在於所述脂肪酸源中，或由於副反應而產生。這些副產物的連續主動去除可進一步增加方法的效率。經分離的甘油可工業使用。
[0107]在本發明的方法中使用的脂肪酸源可包含如下的至少一種，或任何所需比例的它們中的至少兩種的任意混合物:豆油、芥花籽油、海藻油、菜子油、橄欖油、蓖麻油、棕櫚油、向日葵油、花生油、棉籽油、麻瘋樹油、玉米粗油、魚油、動物衍生脂肪、餐飲廢油、褐色潤滑月旨、衍生自不可食用的植`物源的油甘油三酯、衍生自那些油的部分甘油酯和游離脂肪酸。
[0108]使用粗油作為脂肪酸源的一個例子示於圖19中，其中使用粗豆油。該圖也顯示了使用含有各種濃度的磷脂的油作為脂肪酸源。游離脂肪酸與油的混合物的使用以示例的方式示於圖18中，其中在不同濃度下的油酸與油的混合物以及油酸本身(100%)充當脂肪酸源。
[0109]在本發明的所有方法中，通過反應所形成的脂肪酸短鏈烷基酯特別地為脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸異丙酯或脂肪叔丁酯(生物柴油)。其他中鏈脂肪醇(C6-Cltl)和長鏈脂肪醇(C12-C22)也可用於本法的製備方法中。這些更長的醇可特別地適於製備蠟，例如化妝產品。
[0110]所述脂肪酶可為衍生自如下的脂肪酶，但不限於此:綿毛嗜熱絲孢菌、米赫根毛黴、米赫毛黴、假單胞菌屬、根黴屬、爪哇毛黴、羅克福爾青黴菌、黑麴黴、粘稠色桿菌、無色桿菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、南極假絲酵母A、南極假絲酵母B、皺褶假絲酵母、產鹼桿菌屬、卡門柏青黴、番木瓜種子和胰液素。
[0111]所述脂肪酶可共同固定於合適的載體上，特別是疏水性脂族聚合物基載體或疏水性芳族聚合載體上。所述脂肪酶的每一種可被固定至合適的載體上，其中其上固定所述脂肪酶的載體可相同或不同。所用的脂肪酶可對它們的基材為區域專一性的，或隨機的。當使用超過一種脂肪酶時，可將所述脂肪酶固定至相同或不同的疏水性載體上。共固定至同一載體上的脂肪酶可顯示出對它們的基材相同或不同的基材選擇性或區域專一性。
[0112]脂肪酶可為區域專一性的(或位點特異性)，各自單獨使用或與具有相同或不同位點特異性的脂肪酶組合使用。當提及位置sn-1、sn-2-或sn_3時，這些為在各種甘油酯的甘油骨架上的位置。因此，相比於隨機脂肪酶，在本發明的方法中使用的脂肪酶可具有更高的對sn-2位置選擇性，即它們有利於催化醇或醇給體與sn-2位置的脂肪醯基之間的反應，而隨機脂肪酶顯示出對甘油骨架上的所有三個位置的脂肪醯基相同的酯交換活性。一些脂肪酶獨特地顯示出在sn-2位置上的位置活性，特別是在由基材、產物等所決定的特定條件下。在本發明的方法中使用的其他脂肪酶為sn-1，3位置特異性。它們可單獨使用或與隨機脂肪酶(特別是對部分甘油酯具有親和性的脂肪酶，以及任選的具有對sn-2位置的高親和性的第三脂肪酶)一起使用。
[0113]所述載體特別地為多孔大網絡疏水性載體，其可為有機的或無機的。載體的例子為多孔無機載體(例如但不限於疏水化的二氧化矽或和氧化鋁基載體)，和疏水性有機載體(例如但不限於聚合或聚合物基載體)。所述載體可任選地含有選自環氧基或和醛基，或離子基團的活性官能團。
[0114]在本發明的方法中使用的不可溶載體特別地為多孔網狀疏水性脂族或芳族聚合物基載體，如AmberliteK XAD1600和S印abeadsK SP70 (兩者均由多孔微網狀樹脂組成，並由二乙烯基苯或由二乙烯基苯和聚苯乙烯的混合物製得)、AmberliteK XAD7HP(其由微網狀脂族丙烯酸類聚合物組成)和多孔脂族聚合物(如多孔聚丙烯(ACCUrelK))。
[0115]所述載體可為由二乙烯基苯或二乙烯基苯和苯乙烯的混合物組成的網狀疏水性聚合物，和由脂族丙烯酸類聚合物或聚烯烴(如聚丙烯)組成的網狀疏水性脂族聚合物。特定的載體為孔徑在25-1 000 A範圍內，更特別地在80-200 A範圍內的多孔基質。所述載體也可為粉末狀或顆粒狀多孔疏水性二氧化矽或其他無機氧化物。所述載體也可為粉末狀或顆粒狀多孔疏水化的二氧化矽或其他無機氧化物。在特定實施例中，載體樹脂的表面積高於 100m2/g。
[0116]待補充至脂肪酸源和醇之間的脂肪酶催化的酯交換/酯化反應中的鹼性或弱鹼性水溶液的量通常根據其他反應條件、原料、生物催化劑等調節。所述量可不同，如本文所述和示例。該鹼性溶液例如由無機鹼或鹽製得，或者由有機鹼製得。無機鹼和鹽為例如鹼金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽和檸檬酸鹽。有機鹼可為例如伯胺、仲胺或叔胺。也可預期這些鹼性試劑的混合物。在根據本發明的方法中，固定化酶的微環境的PH保持為鹼性或弱鹼性值。蒸餾水向反應體系的添加改進了固定於疏水性載體(樹月旨)上的脂肪酶的性能，如圖4和5所示。如圖16所示，水可以以甚至高量添加，且同時保持生物催化劑(固定化酶)的穩定性，例如在在30重量％的水含量下，在多達50個循環之後，同一批的生物催化劑顯示出60%的轉化活性。各種鹼性緩衝液(其取決於所用的鹼的類型而具有不同的PH值)的添加也獲得了固定於疏水性載體(樹脂)上的脂肪酶的穩定化，例如如圖2和3以及圖14、15和17所示，其顯示了高水平的含水鹼性溶液不損害生物催化劑的活性，例如，在超過多達50個反應循環之後，在反應體系中30重量％的0.1M碳酸氫鈉溶液下，相同批的生物催化劑顯示約60%的轉化率。在不受限於任何理論的情況下，由於酶可優選首先水解甘油酯形式的酯鍵，並使用補充的醇連續酯化所形成的游離脂肪酸，因此需要高濃度的水。添加的水也可能抑制對於保持有利的酶催化構造必要的水分子的提取。碳酸鹽和碳酸氫鹽緩衝液為有效增加固定於疏水性載體上的脂肪酶的穩定性的弱鹼的例子。本文描述其他合適的鹼。本文所用的弱鹼性溶液通常為具有7至約11，例如7-8.5、7-9、7-9.5,7-10或7-11的pH的溶液。通常，所用的鹼性或弱鹼性水溶液的量由以反應中所用的油的量計的重量百分比(重量％)表示。
[0117]在鹼性或弱鹼性溶液的存在下以及在本文限定的水或水溶液的存在下，上述以及具體示例的量的固定於多孔疏水性聚合物基載體(樹脂)上的脂肪酶的使用獲得了在脂肪酸源和醇之間的酯交換/酯化反應中的生物催化劑的活性的穩定。這在如下實例中顯示。
[0118]所述脂肪酸源為如下的至少一種或由至少兩個所述來源組成的混合物:甘油三酯、部分甘油酯、游離脂肪酸、磷脂、脂肪酸的酯和醯胺。
[0119]脂肪酸烷基酯的製備通過酯交換或酯化同時或連續進行。在這種反應體系中，生物催化劑活性得以保持，而在多個用途中無顯著的活性損失，還避免了甘油和水副產物或其他親水性化合物在所述生物催化劑上的積聚。
[0120]本發明提供了利用在許多製備循環中保留高活性和穩定性的特定固定化界面酶的方法。特別地，在酯交換/酯化反應中使用脂肪酶和磷脂酶製劑。這些反應可用於製備食品、化妝品和生物燃料(「生物柴油」)。特別關注地，這些酶可用於合成用作「生物柴油」的脂肪酸短鏈烷基酯。
[0121]本發明利用對短鏈醇(如甲醇、乙醇和甘油)以及短鏈脂肪酸(如乙酸)具有高耐受性的穩定的固定化界面酶。這些酶製劑的使用也防止了親水性物質，特別是甘油和水在固定化生物催化劑上的積聚。
[0122]在本發明的一個實施例中，提供了一種方法，所述方法用於在鹼性或弱鹼性水溶液的存在下，使用固定於疏水性載體(樹脂)上的一種或多種類型的脂肪酶，脂肪酸源與醇的同時或連續酯交換/酯化反`應，從而在合理的反應時間過程中(通常低於5小時)在接近完全轉化下獲得所需產物(即脂肪酸烷基酯)。弱鹼溶液，例如0.001M、0.1M、0.5M或IM的碳酸氫鈉溶液可以反應中所用的油的量的約4重量％或約5重量％或超過5重量％的量(例如6重量％、8重量％、10重量％、12重量％、15重量％、20重量％、25重量％、30重量％、40重量％或50重量％)存在於所述反應體系中。
[0123]如以下實例所示，脂肪酶的操作壽命也可通過如下方式而得以延長:使用用於脂肪酶固定化的疏水性樹脂載體，結合在酯交換/酯化反應介質中使用本文所述和示例的各種水平和濃度範圍和子範圍的鹼性或弱鹼性緩衝溶液。如以下實例進一步所示，反應混合物的水含量可增加，無論PH值為多少。因此，在另一實施例中，在本文所述和示例的各種水平和濃度範圍和子範圍下，生物催化劑的穩定性隨著通過添加水而增加的反應體系的水含量而增加。結果顯示，鹼性溶液(圖2、3、14、15、17)或水(圖4、5、16)的添加導致在許多反應循環內保持了酶活性和穩定性。
[0124]在本發明的方法中所用的醇或醇給體可為短鏈烷基醇，特別SC1-C6烷基醇，更特別為C1-C4烷基醇，且特別地為甲醇或乙醇，或者所述醇給體可為單烷基酯或碳酸二烷基酯，如碳酸二甲酯。例如碳酸二烷基酯的醇給體也可充當用於反應體系的鹼性或弱鹼性的來源。
[0125]根據本發明的另一方面，提供了一種用於製備脂肪酸烷基酯的體系。參見圖22，通常用附圖標記100表示的這種體系的第一實施例包括反應器容器120、預反應準備容器140和產物分離容器160。
[0126]預反應準備容器140配置用於接收原料和緩衝液(和/或水)以從其形成合適的乳狀液，並用於將所述準備乳狀液PE (在本文也稱為乳化原料)進料至反應器容器120。特別地，這種原料可包括分別經由合適的供給線152，154，156提供的來自脂肪酸源182的脂肪酸FA (例如餐飲廢油)、來自醇源184的醇AL (例如甲醇)，和來自緩衝液/水源186的緩衝液(和/或水)BU，所述供給線152，154，156分別經由容器入口 172，174，176和合適的閥門(未顯示)與所述預反應準備容器140流體連接。
[0127]預反應準備容器140限定了內體積Vl，在所述內體積Vl中，包含經由容器入口172，174，176提供其中的原料和緩衝液/水的反應混合物通過合適的攪拌系統142被混合在一起以形成乳狀液PE，所述攪拌系統142由電源(未顯示)驅動。所述預反應準備容器140包括外夾套149，合適的工作流體可通過所述外夾套149循環以將體積Vl保持在所需的穩態溫度下。例如，工作流體可為在不同的容器(未顯示)中加熱或冷卻並經由合適的入口和出口(未顯示)泵送通過夾套149的油或水。在該實施例的可選擇的變型中，代替夾套149或除了夾套149之外，預反應準備容器140可包括加熱和/或冷卻部件(例如電動加熱和/或冷卻部件)系統。
[0128]反應器容器120配置用於從預反應準備容器140接收準備乳狀液PE，從而在合適的生物催化劑BC的存在下，在其中使原料反應以製得反應產物RP，並用於將反應產物RP從反應混合物進料至產物分離容器160。出口線148提供了預反應準備容器140和反應器容器120之間經由合適的閥門(未顯示)的選擇性流體連接，並允許由預反應準備容器140製得的準備乳狀液PE如所需被進料至反應器容器120。
[0129]反應容器120限定了內體積V2，在所述內體積V2中，經由容器入口 122提供其中的反應混合物中的準備乳狀液PE反應，且反應混合物可通過合適的攪拌系統124進行攪拌以形成反應產物RP，所述攪拌系統124由電源(未顯示)驅動。生物催化劑BC可包含合適的酶，並以固定化酶珠粒的形式提供，所述固定化酶珠粒保持在反應器容器120中直至它們變得無效或不足夠有效，此時它們可被移出並用新的生物催化劑BC代替。例如，生物催化劑BC可包括固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶。
[0130]反應器容器120包括外夾套129形式的熱調節系統，合適的工作流體可通過所述外夾套129循環以將體積V2保持在所需的穩態溫度下。例如，工作流體可為在不同的容器(未顯示)中加熱或冷卻並經由合適的入口和出口 123泵送通過夾套129的油或水。在該實施例的可選擇的變型中，代替夾套129或除了夾套129之外，所述熱調節系統包括加熱和/或冷卻部件(例如電動加熱和/或冷卻部件)系統。
[0131]反應器容器120的下部包括出口 127，且以過濾器125形式的合適的保留裝置在出口 127的上遊提供，並配置用於在將反應混合物從反應器容器120移出之前過濾所述反應混合物，特別是反應產物RP，並用於防止生物催化劑BC與反應產物RP —起被移出。
[0132]產物分離容器160配置用於從反應產物RP，從副產物(包括過量的水和甘油G)中分離出所需的產物P (脂肪酸烷基酯)。出口線147提供了產物分離容器160和反應器容器120之間經由合適的閥門(未顯示)的選擇性流體連接，並允許反應產物RP如所需從反應器容器120被進料至產物分離容器160。在該實施例中，產物分離容器160包括用於進行前述分離的離心機或重力分離系統，並包括用於輸出產物P的第一出口 162，和用於收集過量水和甘油G的第二出口 164。產物P可經由龍頭163收集。
[0133]因此所述體系可以以連續製備模式操作，其中將準備乳狀液PE進料至反應器容器120，所需的產物P經由龍頭163以連續方式收集。乳狀液PE可以以連續方式製備並遞送至反應器容器120，從而以與從出口 127移出反應產物RP相同的速率裝滿在反應器容器120中的反應物的體積。或者，乳狀液PE可批量製備並遞送至反應器容器120，從而在經由出口 127連續移出反應產物RP之後，在反應器容器120中的反應物水平下降至特定的最小水平的任何時候，以不連續間隔裝滿在反應混合物中的反應物的體積。當然，也有可能操作體系100，從而批量地而不是連續地提供所需的產物P。
[0134]或者，體系100可以以提高產量的模式操作，其中產物P不是經由龍頭163被立即收集，而是經由任選的再發送系統被再發送至反應器容器120，所述再發送系統包括管線165、容器入口 121和閥門166，其中可選擇性地操作閥門166以從龍頭163轉移產物P。當產物P被再發送至反應器容器120時，產物P可在其中與醇AL進一步反應以製得更高產量的產物P，所述更高產量的產物P可使用產物分離容器160從副產物中再次被分離出，所述醇AL從來源184經由分開的管線(未顯示)提供、從不同的醇源(未顯示)提供，或經由預反應準備容器140從來源184提供。當醇經由準備容器140提供時，準備容器140首先倒空準備乳狀液PE，且合適的閥門防止脂肪酸FA和任選的緩衝液/水由各自的來源182和186提供。
[0135]可提供合適的泵或重力進料和可控閥門以將各自的材料通過各自的管線152，154,156,148,147,165選擇性輸送,且合適的控制器(未顯不)監測並控制體系的操作。
[0136]在第一實施例的至少一些可選擇的變體中，預反應準備容器140可與反應容器120 —體化。例如，各自的內體積Vl和V2可由具有對應於管線148的開放裝置的壁分隔。或者，各自的內體積Vl和V2可 為相接的，但內體積Vl與生物催化劑BC充分間隔，以提供在到達生物催化劑BC之前乳狀液PE形成的充足時間。
[0137]在第一實施例的可選擇的變體中，可將脂肪酸FAJ? AL，和緩衝液/水BU中的一種、兩種或全部繞過預反應準備容器140而直接提供至反應器容器120。例如，脂肪酸源182、醇源184，和緩衝液/水源186中的一種或多種可繞過預反應準備容器140，經由合適的供應管線(未顯示)而直接與反應器容器120選擇性流體連接。
[0138]應了解，根據第一實施例或其可選擇的變體的體系100的所有組件具有合適的形式，並由本領域已知的合適的材料製成，例如以使得每個組件能夠在各自的條件(包括溫度、壓力、PH等)下進行各自的功能。
[0139]參照圖23，所用附圖標記200表示的所述體系的第二實施例包括第一實施例的所有部件和特徵，包括其可選擇的變體，包括已作必要變更的具有一些區別的如圖22的所有類似編號的組件。例如，體系200也包括:反應器容器120、預反應準備容器140、產物分離容器160、脂肪酸源182、醇源184、緩衝液/水源186、供應管線152，154，156、容器入口 172，174，176、攪拌系統142、外夾套149、出口管線148、容器入口 122、攪拌系統124、生物催化劑BC外夾套129、入口和出口 123、出口 127、過濾器125、出口管線147，第一出口 162、第二出口 164，如第一實施例所公開並已作必要變更。[0140]然而，在第二實施例中，省略第一實施例的管線165、龍頭163和閥門166，相反輔助反應器組件300任選連接至產物分離容器160的第一出口 162。
[0141 ] 輔助反應器組件300包括輔助反應器容器220和輔助產物分離容器260，在該實施例中所述輔助反應器容器220和輔助產物分離容器260分別基本上類似於反應器容器120和產物分離容器160並已作必要變更。在操作中，來自產物分離容器160的所需產物P經由管線266、閥門267和容器入口 221而通入輔助反應器容器220。當通入輔助反應器容器220時，產物P可在其中與醇AL進一步反應以製得進一步反應的產物FRP，所述醇AL從來源184或從不同的醇源(未顯示)經由分開的管線(未顯示)而提供。管線249使得所述進一步反應的產物FRP能夠被輸送至輔助產物分離容器260，所述輔助產物分離容器260隨後操作以從副產物中分離更高產量的產物P』。
[0142]體系200可以以類似於體系100的方式(已作必要變更)操作。
[0143]儘管已公開和描述，但應了解本發明不限於本文公開的特定實例、方法步驟和材料本身，方法步驟和材料可有所變化。還應了解本文所用的術語僅為了描述特定實例的目的而使用，並不旨在限定，因為本發明的範圍僅由所附權利要求書及其等同方式進行限定。
[0144]應注意在本說明書和所附權利要求書中所用的單數形式「一種」和「所述」包括複數，除非內容清楚地另外指出。
[0145]在整個本說明書和之後的權利要求書中，除非上下文另外要求，詞語「包含」應理解為暗示包括所述整數 或步驟或整數組或步驟組，但不排除任何其他整數或步驟或整數組或步驟組。
[0146]如下實例代表了本發明人在進行本發明的方面時所用的技術。應了解儘管這些技術示例了用於實施本發明的優選實施例，但根據本公開，本領域技術人員將認識到在不偏離本發明的預期範圍下可進行許多改變。
[0147]實例
[0148]綜述
[0149]全部實驗或者在底部具有居中的玻璃過濾器的體積為30ml的玻璃管中，或者在底部具有孔隙率為150-250 μ m的燒結玻璃過濾器的體積為500ml的機械攪拌反應器中進行。典型的反應介質含有相對於脂肪酸(無論其為游離的或結合於甘油骨架上)1:1摩爾基礎的脂肪酸源、醇(通常為甲醇或乙醇)(對於游離脂肪酸和甘油單酯為1:1，對於甘油二酯為1:2，且對於甘油三酯為1: 3，有利於醇)。脂肪酸源與不同量的鹼性緩衝液(在特定實施例中為碳酸氫鈉)預混。反應通過加入固定於疏水性樹脂上的脂肪酶(10-15重量％)而引發，反應介質或者機械搖動，或者在30°C下攪拌。除非不同指出，醇量在三個步驟中相等地加入，所述三個步驟各自間隔I小時。反應轉化率通過在不同的時間間隔從反應介質中取出樣品並分析脂肪酸組分而跟蹤。向生物柴油的轉化率計算為:100*脂肪酸烷基酯的峰面積/所有峰面積的總和。
[0150]脂肪酶固定化:根據標準程序固定脂肪酶，其中將衍生自某種微生物的脂肪酶溶解於在某個pH值(例如7.5)下的0.1M的緩衝溶液中。將有機或無機聚合物樹脂引入所述脂肪酶溶液中。所述混合物在室溫下搖動8小時。將冷丙酮任選地加入至所述混合物中以增加在樹脂上的蛋白質酶沉澱。過濾所述混合物，乾燥酶珠粒以將水含量減少至小於5%。
[0151]使用不同的樹脂以獲得具有疏水特性的樹脂，所述不同的樹脂包括基於聚苯乙烯/ 二乙烯基苯、石蠟或它們的任意組合的疏水性聚合物樹脂。所用的典型的疏水性樹脂包括AmberliteE XAD1600 (Rohm&Haas, USA)和 SepabeadsR SP70 (Resindion, Italy)。所用的典型的親水性樹脂包括DuoliteK D568 (Rohm&Haas)和多孔二氧化矽凝膠。脂肪酶可分開固定於樹脂上，或者不同的脂肪酶可共固定於同一樹脂上。
[0152]實例I
[0153]固定於作為疏水性樹脂的AmberliteK XAD1600上和作為親水性樹脂的DuoliteKD568上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶，以及固定於作為疏水性樹脂的SepabeadsKSP70上和作為親水性樹脂的多孔二氧化矽上的衍生自假單胞菌屬的脂肪酶的酯交換活性。
[0154]反應條件:精製且漂白的豆油(20g)含有I重量％的0.1M碳酸氫鈉溶液。在三個等同批次中逐步加入甲醇(2.5ml)，所述三個等同批次各自間隔I小時。在300rpm和30°C下搖動含有10重量％的脂肪酶製劑的反應介質。結果示於圖1中。
[0155]圖1示出的結果顯示，使用相同批次的酶在最初5個循環過程中，在I重量％的碳酸氫鈉溶液的存在下，固定於不同樹脂上的綿毛嗜熱絲孢菌和假單胞菌屬脂肪酶均顯示出高的酯交換活性。觀察到在第5批次之後，當使用相同批次的酶時，由於在固定於親水性樹脂(即DuoliteK D568和多孔二氧化矽)上的兩種脂肪酶的珠粒周圍凝膠狀沉澱的形成，從體系過濾反應介質變得困難。在進一步的連續批次中，固定於親水性樹脂上的兩種脂肪酶的酯交換活性急劇下降，且在第10個循環之後它們變得失活。相反，固定於疏水性樹脂SepabeadsE SP70上的假單胞菌屬脂肪酶在70個循環之後保留其初始活性的超過80%，而固定於疏水性樹脂AmberliteK XAD1600上的綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶在超過70個循環之後保留其初始活性的超過20%。
[0156]實例2
[0157]A.在多個批量實`驗中使用同一批生物催化劑在6小時的反應之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。
[0158]反應條件:精製且漂白的豆油(20g)含有不同濃度的0.1M碳酸氫鈉溶液。在三個等同批次中逐步加入甲醇(2.5ml)，所述三個等同批次各自間隔I小時。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖2中。
[0159]B.在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在6小時的反應之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。
[0160]反應條件:精製且漂白的豆油(20g)含有不同濃度的0.1M碳酸氫鈉溶液。在三個等同批次中逐步加入甲醇(2.5ml)，所述三個等同批次各自間隔I小時。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自假單胞菌屬的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖3中。
[0161]圖2和3顯示了在反應介質中碳酸鈉的量對固定於疏水性樹脂上的綿毛嗜熱絲孢菌和假單胞菌屬脂肪酶的操作壽命具有主要作用。在圖2和3中可以看出，在不存在鹼性溶液下，兩種固定化脂肪酶均在數個循環之後顯著損失它們的活性，而在作為反應體系中的鹼的碳酸氫鈉溶液的存在下，同樣的固定化脂肪酶在多次使用中保持它們的酯交換活性。兩種固定化酶的結果顯示，在0-4重量％範圍內在反應介質中增加碳酸氫鈉溶液的量可在相同批次的固定化酶的多次使用中減少酶活性的損失。[0162]實例3
[0163]A.在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在6小時的反應之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。反應條件:精製且漂白的豆油(20g)含有不同濃度的蒸餾水。在三個等同批次中逐步加入甲醇(2.5ml)，所述三個等同批次各自間隔I小時。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖4中。
[0164]B.在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在6小時的反應之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。反應條件:精製且漂白的豆油(20g)含有不同濃度的蒸餾水。在三個等同批次中逐步加入甲醇(2.5ml)，所述三個等同批次各自間隔I小時。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自假單胞菌屬的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖5中。
[0165]圖4和5顯示，在多次實驗中使用相同批次的固定於疏水性樹脂上的脂肪酶綿毛嗜熱絲孢菌和假單胞菌屬的酯交換活性也受到反應體系中水量的影響。可以看出，當在連續循環中使用生物催化劑時，將水量從無(零)增加至4重量％可保持生物催化劑的更高剩餘酯交換活性。示於圖2至5中的結果明顯顯示，當在連續循環中使用時，在酯交換反應中使用弱鹼(如碳酸氫鈉溶液)有利於保持固定於疏水性樹脂上的脂肪酶的活性。
[0166]實例4
[0167]在多個批 量實驗中使用同一批生物催化劑在4小時的酯化/酯交換之後，游離脂肪酸(FFA)和豆油的混合物向生物柴油以及甘油和水副產物的轉化率。
[0168]反應條件:初始FFA值為72mg KOH/Ig的游離脂肪酸豆油水解產物(50重量％)和豆油(50重量％)的混合物含有不同量的0.1M碳酸氫鈉溶液。在三個等同批次中逐步加入甲醇(4.5ml)，所述三個等同批次各自間隔I小時。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自假單胞菌屬的脂肪酶(20重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖6中。
[0169]圖6顯示了不同量的鹼溶液對存在於反應混合物中的FFA的同時酯化反應具有主要影響，所述反應混合物由等比例的豆油水解產物和豆油甘油三酯組成。可以看出，當無鹼性溶液加入酯化/酯交換反應體系中時，固定於疏水性樹脂上的假單胞菌屬脂肪酶失去其酯化活性，而當將I和2重量％的0.1M碳酸氫鈉溶液分別加入反應體系中時，同樣的生物催化劑在連續循環中保持其活性。圖6示出的結果顯示，在I重量％和2重量％的0.1M碳酸氫鈉溶液的存在下，固定於疏水性樹脂上的假單胞菌屬脂肪酶的使用將FFA含量從初始值72mg KOH/Ig分別降低至平均8和6mg KOH/Ig,並在22個連續循環中保持該活性。
[0170]實例5
[0171]在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在4小時的反應之後，豆油水解產物向生物柴油和水的酯化。
[0172]反應條件:FFA值為150mg KOH/Ig的游離脂肪酸豆油水解產物(20g)含有I重量％的0.1M碳酸氫鈉溶液。在一個批次中將甲醇(2ml)加入反應介質中。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自假單胞菌屬的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖7中。
[0173]圖7顯示，固定於疏水性樹脂上的假單胞菌屬脂肪酶也能夠催化游離脂肪酸的酯化以形成脂肪酸甲酯和水副產物。結果顯示，使用同一批次的生物催化劑，脂肪酶製劑在含有1%的0.1M碳酸氫鈉溶液的介質中在超過25個循環中保持其酯化/酯交換活性，而未觀察到任何活性的顯著損失。
[0174]實例6
[0175]在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在6小時的反應之後，魚油與乙醇的酯交換。
[0176]反應條件:精製魚油(20g)含有1%的0.1M碳酸氫鈉溶液。在三個等同批次中逐步加入乙醇(2.5ml),所述三個等同批次各自間隔I小時。分別使用固定於AmberliteKXAD1600上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌和假單胞菌屬的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖8中。
[0177]圖8顯示固定於疏水性樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌和假單胞菌屬的兩種脂肪酶也能夠催化魚油甘油三酯與乙醇的酯交換以形成脂肪酸乙酯和甘油副產物。結果也顯示使用同一批次的生物催化劑，兩種生物催化劑製劑在1%的碳酸氫鈉溶液的存在下在超過20個循環中保持其酯交換活性而無顯著的活性損失。
[0178]實例7
[0179]在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在6小時的反應之後，牛脂肪與乙醇的
酯交換。
[0180]反應條件:含有牛脂肪的脂肪酸乙酯(4g)的牛脂肪(16g)和1%的IM碳酸鉀溶液。在三個等同批次中逐步加入乙醇(2.5ml)，所述三個等同批次各自間隔I小時。固定於AmberliteE XAD1600上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌、假單胞菌屬的脂肪酶(10重量％)分別使用或者以相等比例結合使用 。在300rpm和37°C下搖動反應介質。結果示於圖9中。
[0181]圖9顯示分別或結合固定於疏水性樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌和假單胞菌屬的兩種脂肪酶也能夠催化牛脂肪甘油三酯與乙醇的酯交換以形成脂肪酸乙酯和甘油副產物。反應介質的原料由牛脂肪(80%)和衍生自牛脂肪的脂肪酸乙酯組成，以降低反應介質的熔點。圖9所示的結果顯示，當在100個連續循環中使用同一批次的生物催化劑時，在弱鹼性溶液(如IM的碳酸鉀)的存在下所有生物催化劑均保留其初始活性的超過80%。
[0182]實例8
[0183]在多個批量實驗中，使用同一批生物催化劑(10重量％)，使用固定於疏水性多孔樹脂上的假單胞菌屬脂肪酶或綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶以及固定於疏水性多孔樹脂上的南極假絲酵母B脂肪酶和甲醇(分別地，FFA和甲醇之間以摩爾計1:10的比例)處理在4小時之後獲得的酯交換/酯化反應介質，所述反應介質具有7mg KOH/Ig的FFA值。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖10中。
[0184]圖10顯示，在使用如上所述的綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶或假單胞菌屬脂肪酶處理之後獲得的酯交換反應介質(其通常具有3-7mg KOH/Ig的FFA值)可用固定於親水性或疏水性載體上的南極假絲酵母B脂肪酶進行處理，從而將FFA值降低至小於2mg KOH/lg。固定化脂肪酶可在超過100個循環中保持其活性。
[0185]實例9
[0186]固定於作為疏水性樹脂的DVB-PS上和作為親水性離子交換樹脂的DuoliteE D568上和作為親水性酶吸附劑的顆粒多孔二氧化矽上的衍生自產檢桿菌屬(AL)、假單胞菌屬(PS)和綿毛嗜熱絲孢菌(TL)的脂肪酶的酯交換/酯化活性。
[0187]反應條件:精製且漂白的豆油(20g)含有2重量％的0.1M碳酸氫鈉溶液。除非另外指出，否則在一步中，在三個等同批次中逐步加入甲醇(2.5ml)，所述三個等同批次各自間隔I小時。在300rpm和30°C下搖動含有10重量％的脂肪酶製劑的反應介質。結果示於圖10-13中。
[0188]圖10-13所示的結果顯示，當產檢桿菌屬、假單胞菌屬和綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶固定於親水性樹脂上時，使用相同批的生物催化劑，在最初數個循環過程中獲得高轉化率，然而在10個循環之後酶活性急劇下降而達到低轉化率。也觀察到在第5批次之後，當使用同一批酶時，由於在固定於親水性樹脂(即弱離子交換樹脂和多孔二氧化矽)上的兩種脂肪酶的珠粒周圍凝膠狀沉澱的形成，從體系過濾反應介質變得困難。
[0189]相反,在50個循環之後，固定於DVB-PS疏水性樹脂上的產檢桿菌屬、假單胞菌屬和綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶均保持它們初始活性的超過80%。圖10-13顯示，所有脂肪酶在第一批次中顯示高活性，並在第二批次之後略微減小，這最可能是由於洗滌出樹脂上的任何鬆散結合的酶。
[0190]實例10
[0191]A.在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在6小時的反應之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。
[0192]反應條件:精製且漂白的豆油(20g)含有不同濃度的0.1M碳酸氫鈉溶液。在一步中添加甲醇(2.5ml)。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖14中。
[0193]B.在多個批量實`驗中使用同一批生物催化劑在6小時的反應之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。
[0194]反應條件:精製且漂白的豆油(20g)含有不同濃度的0.1M碳酸氫鈉溶液。在一步中添加甲醇(2.5ml)。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自假單胞菌屬的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖15中。
[0195]圖14和15顯示了在反應介質中碳酸氫鈉的量對固定於疏水性樹脂上的脂肪酶綿毛嗜熱絲孢菌和假單胞菌屬的使用壽命操作壽命具有主要作用。在圖4和5中可以看出，在不存在弱鹼性溶液的情況下，兩種固定化脂肪酶均在數個循環之後顯著損失它們的活性，而在作為反應體系中的鹼的碳酸氫鈉溶液的存在下，同樣的固定化脂肪酶在多次使用中保持它們的酯交換活性。兩種固定化酶的結果顯示，在0-30重量％範圍內在反應介質中增加碳酸氫鈉溶液的量可在同一批固定化酶的多次使用中產生增加的酶酯交換活性。將碳酸氫鈉溶液的量增加至超過30重量％導致降低酶活性。不受限於理論，所述降低可能歸因於從樹脂上洗出酶。
[0196]實例11
[0197]在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在6小時的反應之後，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。
[0198]反應條件:精製且漂白的豆油(20g)含有不同濃度的蒸餾水。在一步中添加甲醇(2.5ml)。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖16中。
[0199]圖16顯示，在反應介質中的水量也對固定於疏水性樹脂上的綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶的操作壽命具有主要作用。在圖16中可以看出，在不存在水的情況下，固定化脂肪酶在數個循環之後顯著損失其活性，而在反應體系中水的存在下，同樣的固定化脂肪酶在多次使用中保持其酯交換活性。固定化酶的結果顯示，在0-30重量％範圍內在反應介質中增加水量可在同一批固定化酶的多次使用中產生增加的酶酯交換活性，而將水量增加至30重量％以上導致降低酶活性。
[0200]實例12
[0201]在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在6小時的反應之後，油酸向生物柴油和水的轉化率。
[0202]反應條件:油酸(20g)含有不同濃度的0.1M碳酸氫鈉溶液。在一步中添加甲醇(2.5ml)。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖17中。
[0203]圖17顯示，反應介質中的碳酸氫鈉溶液的濃度對決定固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的綿毛嗜熱絲孢菌的酯化活性具有主要作用。在圖17中可以看出，在反應體系中不存在水的情況下，當在多個批量試驗中使用時，固定於疏水性樹脂上的脂肪酶急劇損失其活性。在0-20重量％範圍內增加碳酸氫鈉溶液的濃度可在多次使用中導致增加生物催化劑的酯化活性。將水相的量增加至30重量％以上導致在多次使用中酶活性的損失，最可能是由於從樹脂上洗出酶。
[0204]實例 13
[0205]在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在6小時的反應之後，油酸和豆油甘油三酯的混合物向生物柴油、甘油和水的轉化率。
[0206]反應條件:含有不同濃度的油酸的精製且漂白的豆油(20g)補充8重量％的0.1M碳酸氫鈉溶液。在一步中添加甲醇(2.5ml)。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖18中。
[0207]圖18顯示，固定於疏水性多孔脂肪酶樹脂上並在緩衝溶液的存在下的綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶能夠使游離脂肪酸和甘油酯酯化或酯交換，以形成生物柴油以及副產物甘油和水。結果也顯示，在多次使用同一批生物催化劑達50個循環中，固定化脂肪酶保持它們的催化活性而無顯著的活性損失。
[0208]實例14
[0209]在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑在6小時的反應之後，含有磷脂的粗油向生物柴油和甘油的轉化率。
[0210]反應條件:含有不同濃度的磷脂的粗豆油(20g)補充8重量％的0.1M碳酸氫鈉溶液。在一步中添加甲醇(2.5ml)。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖19中。
[0211]圖19顯示了固定於疏水性多孔二乙烯基苯-聚苯乙烯樹脂上的綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶的酯交換活性。分析結果顯示，相比於之前的文獻報導，在碳酸氫鈉溶液的存在下固定於疏水性樹脂上的脂肪酶能夠使包括磷脂的甘油酯進行酯交換，以產生生物柴油以及副產物甘油和甘油磷脂。而且，結果顯示，當在多次使用中使用同一批固定化酶時，脂肪酶保持它們的酯交換催化活性。
[0212]實例15
[0213]A.在0.1M的碳酸氫鈉溶液的不同pH值下，在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑(固定於DVB-PS載體上的嗜熱真菌(TL))，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。
[0214]反應條件:精製且漂白的豆油(20g)含有8重量％的在不同pH值下的0.1M碳酸氫鈉溶液。在一步中添加甲醇(2.5ml)。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖20中。
[0215]B.在0.1M的醋酸鈉溶液的不同pH值下，在多個批量實驗中使用同一批生物催化劑(固定於DVB-PS載體上的嗜熱真菌(TL))，豆油向生物柴油和甘油的轉化率。
[0216]反應條件:精製且漂白的豆油(20g)含有8重量％的在不同pH值下的0.1M醋酸鈉溶液。在一步中添加甲醇(2.5ml)。使用固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶(10重量％)。在300rpm和30°C下搖動反應介質。結果示於圖21中。
[0217]圖20中所示的結果顯示，在高於5.5的pH值下，在使用同一批酶50個循環之後，生物催化劑保持其初始酯交換活性的超過60%。結果清楚顯示，在5.5的pH值下存在酶活性的線性降低，酶活 性達到初始酶活性的低於20%。
[0218]當在高於6.5的pH值下使用緩衝醋酸鹽時，觀察到類似的趨勢，其中在50次重複使用之後酶保持其初始活性的超過50%(圖21)。圖21中所示的結果也顯示，當使用pH5.5的醋酸鈉溶液時，酶活性較低，但是在重複使用50個循環之後保持恆定。
[0219]實例16
[0220]使用圖22所示的體系的第一實施例，含有10%FFA的餐飲廢油與甲醇的酯交換/酯化以形成生物柴油、水和甘油。
[0221]反應條件:含有2%的0.1M的碳酸氫鈉溶液的餐飲廢油(I 100g)和甲醇(140g)首先在預反應準備容器140中預混以形成乳狀液，隨後將所述乳狀液引入具有約2升的內體積V2的反應器容器120。所述反應混合物在反應器容器120中與固定於疏水性多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯基樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌的脂肪酶(油的30重量％)在30°C下混合6小時。將所述反應混合物過濾通過過濾器125，並進料至產物分離容器160。將甘油和過量的水從產物分離容器160中的反應混合物中移出。將含有脂肪酸甲酯和未反應的甘油酯的上層相經由再發送管線165再引入至反應器容器120，並在將甲醇(IlOg)加入至反應器容器120中的反應介質之後重新開始反應器容器120中的攪拌。在2小時之後向甲酯的轉化率為98%。將含有餐飲廢油(83重量％)、甲醇(15%)和0.1M的碳酸氫鈉溶液(2%)的乳化反應介質(準備乳狀液)以約30ml/min的流量連續進料至反應器容器120中。當使用同一批次的固定於大孔疏水性樹脂上的衍生自綿毛嗜熱絲孢菌脂肪酶的生物催化劑時，向脂肪酸甲酯的轉化率保持超過3個月而無顯著的活性損失。
【權利要求】
1.一種用於脂肪酸源與醇的酯交換/酯化以形成脂肪酸烷基酯的方法，其包括在固定化脂肪酶製劑的存在下使脂肪酸源與醇或醇給體反應，其中所述固定化脂肪酶製劑包含至少一種固定在疏水性多孔載體上的脂肪酶，且反應介質含有含水鹼性緩衝溶液。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述含水鹼性緩衝溶液為含水弱鹼性緩衝溶液。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述含水鹼性緩衝溶液以所述脂肪酸源的至多5重量％的量被包含。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述含水緩衝溶液具有7至約11的pH。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述pH為7-8.5、7-9、7-9.5,7-10和7_11中任一種。
6.根據權利要求1所述的方法，其中包含所述緩衝溶液的補充弱鹼性試劑的PKa高於或等於存在於所述脂肪酸源中的游離酸的pKa。
7.一種用於脂肪酸源與醇的酯交換/酯化以形成脂肪酸烷基酯的方法，其包括在固定化脂肪酶製劑的存在下使脂肪酸源與醇反應，其中所述固定化脂肪酶製劑包含至少一種固定在疏水性多孔載體上的脂肪酶，且反應介質含有水。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述水為具有3至11的pH的溶解的鹽的水溶液的形式。
9.根據權利要求7或權利要求8所述的方法，其中所述反應介質含有所述脂肪酸源的至多30重量％，特別地至多25重量％，更特別地至多20重量％，更特別地至多15重量％，更特別地至多10重量％，更特別地至多5重量％的水或溶解的鹽的水溶液。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述醇為短鏈醇。
11.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述醇給體為單烷基酯，如乙酸甲酯，或者碳酸二烷基酯，如碳酸二甲酯，其也充當在反應介質中的弱鹼性試劑源。
12.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述至少一種脂肪酶為衍生自任一如下的脂肪酶:米赫根毛黴、假單胞菌屬、雪白根黴、爪哇毛黴、米根黴、黑麴黴、卡門柏青黴、產鹼桿菌屬、無色桿菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、綿毛嗜熱絲孢菌、粘稠色桿菌、南極假絲酵母B、皺褶假絲酵母、南極假絲酵母A、番木瓜種子和胰液素。
13.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述固定化脂肪酶能夠催化游離脂肪酸的酯化以產生脂肪酸烷基酯以及水作為副產物，並能夠催化甘油三酯和部分甘油酯的酯交換以產生脂肪酸烷基酯以及甘油作為副產物。
14.根據權利要求1至6和10至13中任一項所述的方法，其中在反應介質中的所述鹼性溶液的量為脂肪酸源的至多30重量％，特別地至多25重量％，更特別地至多20重量％，更特別地至多15重量％，更特別地至多10重量％，更特別地至多5重量％。
15.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述脂肪酶製劑包含至少兩種脂肪酶，所述至少兩種脂肪酶可各自分別固定至疏水性載體上，或者共固定至同一疏水性載體上。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述脂肪酶具有相同或不同的區域專一性。
17.根據權利要求15或權利要求16所述的方法，其中所述脂肪酶能夠同時或連續催化游離脂肪酸的酯化以產生脂肪酸烷基酯以及水作為副產物，以及甘油三酯和部分甘油酯的酯交換以產生脂肪酸烷基酯以及甘油作為副產物。
18.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述載體為疏水性脂族聚合物基載體和疏水性芳族聚合物基載體中的任一種。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述疏水性聚合物載體由直鏈或支鏈的有機鏈組成。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述載體包含大網絡有機聚合物或共聚物鏈。
21.根據權利要求1至17中任一項所述的方法，其中所述載體為多孔或非多孔無機載體，所述多孔或非多孔無機載體可為疏水性的或用疏水性有機材料塗布。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述有機材料為直鏈、支鏈或官能化的疏水性有機鏈。
23.根據權利要求1至6和10至22中任一項所述的方法，其中所述含水鹼性緩衝溶液為無機鹼性鹽或有機鹼的溶液。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述鹼性緩衝溶液為如下任一種的溶液和它們的任意混合物:鹼金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、脂肪酸羧酸鹽和檸檬酸鹽、伯胺、仲胺和叔胺。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述鹼性緩衝溶液為選自鈉或鉀的碳酸氫鹽和碳酸鹽的弱鹼的溶液。
26.根據權利要求1至6和10至25中任一項所述的方法，其中在預混階段將所述鹼性緩衝溶液加入至所述脂肪酸源，或者將所述鹼性緩衝溶液直接加入至所述反應介質。`
27.根據權利要求1至6和10至26中任一項所述的方法，其中在酯交換/酯化反應介質中的所述鹼性緩衝溶液的含量為油原料的30重量％，更特別地至多25重量％，更特別地至多20重量％，更特別地至多15重量％，更特別地至多10重量％，更特別地至多5重量％。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述鹼性緩衝溶液的含量為油原料的1-20重量％，特別地1-15重量％，更特別地1-10重量％，更特別地1-5重量％，更特別地1-2重量％。
29.根據權利要求1至6和10至28中任一項所述的方法，其中所述脂肪酸源首先與所述鹼性緩衝溶液混合，然後用所述固定化脂肪酶製劑處理所述混合物，隨後加入所述醇，並允許反應在合適的條件下進行直至將所述脂肪酸源轉化為脂肪酸酯。
30.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述脂肪酸源為如下的任一種和它們的任意混合物:植物油、動物脂肪、海藻油、魚油、廢油。
31.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述脂肪酸源包括在不存在或存在其他少量脂肪酸衍生物下的游離脂肪酸、甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯、它們任意比例的混合物，所述其他少量脂肪酸衍生物例如磷脂和固醇酯，更特別地所述脂肪酸源為未精製的、精製的、漂白的、除臭的或它們的任意組合。
32.根據權利要求1至10和12至31中任一項所述的方法，其中所述醇為短鏈烷基醇，特別地為C1-C6烷基醇，更特別地為C1-C4烷基醇，特別地為甲醇或乙醇。
33.根據權利要求1至10和12至31中任一項所述的方法，其中所述醇為甲醇，且所述所得脂肪酸酯為脂肪酸甲酯(FAME-生物柴油)。
34.根據權利要求1至10和12至31中任一項所述的方法，其中所述醇為中鏈脂肪醇(C6-C10)或長鏈脂肪醇(C12-C22)tj
35.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述反應在10°C至100°C之間，特別地在25-30°C之間的溫度下進行。
36.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述脂肪酸源與所述醇或醇給體以及所述水或緩衝溶液在預反應準備容器中預混以形成乳狀液，隨後將所述乳狀液與所述固定化脂肪酶製劑一起進料至酯交換/酯化反應容器中。
37.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述固定化脂肪酶在以批量模式或連續模式操作的連續攪拌槽反應器中或填充床柱反應器中使用。
38.一種用於脂肪酸與醇的酯交換/酯化以形成脂肪酸烷基酯的體系，其包括: 配置用於使反應介質在固定化脂肪酶製劑的存在下反應的反應容器，所述反應介質包含脂肪酸以及醇和醇給體中的至少一種，其中所述固定化脂肪酶製劑包含固定於疏水性多孔載體上的至少一種脂肪酶，且所述反應介質含有含水鹼性緩衝溶液和水中的至少一種。
39.根據權利要求38所述的體系，其中至少在用於製備所述脂肪酸烷基酯的所述體系的操作過程中，所述反應容器包含所述固定化脂肪酶製劑。
40.根據權利要求38或權利要求39所述的體系，其中至少在用於製備所述脂肪酸烷基酯的所述體系的操作過程中，所述反應容器包含脂肪酸以及醇和醇給體中的至少一種。
41.根據權利要求38至40中任一項所述的體系，其中所述反應介質包含混合物，所述體系還包括與所述反應容器選擇性流體連接的預反應容器，所述預反應容器配置用於至少預混所述脂肪酸以及醇和醇給體中的至少一種以形成所述混合物，並用於至少在用於製備所述脂肪酸烷基酯的所述體系的操作過程中將所述混合物選擇性地遞送至所述反應容器。
42.根據權利要求41所述的體系，其還包括脂肪酸源和醇源，所述脂肪酸源與所述預反應容器選擇性流體連接，`並配置用於至少在所述體系的所述操作過程中將脂肪酸選擇性地遞送至所述預反應容器，所述醇源與所述預反應容器選擇性流體連接，並配置用於至少在所述體系的所述操作過程中將醇和醇給體中的至少一種選擇性地遞送至所述預反應容器。
43.根據權利要求42所述的體系，其還包括緩衝液源，所述緩衝液源與所述預反應容器選擇性流體連接，並配置用於至少在所述體系的所述操作過程中將含水鹼性緩衝溶液和水中的至少一種選擇性地遞送至所述預反應容器以被包含於所述混合物中。
44.根據權利要求42或權利要求45所述的體系，其配置用於至少在所述體系的所述操作過程中以連續方式將一種或多種脂肪酸以及醇和醇給體中的至少一種選擇性地遞送至所述預反應容器。
45.根據權利要求43或權利要求44所述的體系，其配置用於至少在所述體系的所述操作過程中以連續方式將含水鹼性緩衝溶液和水中的至少一種選擇性地遞送至所述預反應容器。
46.根據權利要求42至45中任一項所述的體系，其配置用於至少在所述體系的所述操作過程中不連續批量地將一種或多種脂肪酸以及醇和醇給體中的至少一種選擇性地遞送至所述預反應容器。
47.根據權利要求43至46中任一項所述的體系，其配置用於至少在所述體系的所述操作過程中不連續批量地將含水鹼性緩衝溶液和水中的至少一種選擇性地遞送至所述預反應容器。
48.根據權利要求41至47中任一項所述的體系，其中所述預反應容器配置用於至少在所述體系的所述操作過程中以連續方式將所述混合物選擇性地遞送至所述反應容器。
49.根據權利要求41至48中任一項所述的體系，其中所述預反應容器配置用於至少在所述體系的所述操作過程中不連續批量地將所述混合物選擇性地遞送至所述反應容器。
50.根據權利要求38至49中任一項所述的體系，所述體系配置用於將如下的至少一種選擇性地直接遞送至所述反應容器:脂肪酸、醇和醇給體中的至少一種，以及含水鹼性緩衝溶液和水中的至少一種。
51.根據權利要求38至50中任一項所述的體系，其中所述反應容器包括熱調節系統，所述熱調節系統配置用於將所述反應容器中的反應介質保持在所選溫度範圍內。
52.根據權利要求38至51中任一項所述的體系，其還包括保留裝置，所述保留裝置配置用於至少在所述體系的操作過程中將所述固定化脂肪酶製劑保留在所述反應容器內。
53.根據權利要求38至52中任一項所述的體系，其還包括與所述反應容器選擇性流體連接的產物分離容器，所述體系配置用於將來自所述反應容器的包含反應產物的反應混合物選擇性地遞送至所述產物分離容器，且其中所述產物分離容器配置用於將脂肪酸烷基酯的產量選擇性地從遞送至所述產物分離容器的反應混合物中分離。
54.根據權利要求53所述的體系，其中所述產物分離容器包括離心機和重力分離系統中的一種。
55.根據權利要求53和54中任一項所述的體系，其中所述反應容器配置用於至少在所述體系的所述操作過程中 以連續方式將所述反應混合物選擇性地遞送至所述產物分離容器。
56.根據權利要求53至55中任一項所述的體系，其中所述反應容器配置用於至少在所述體系的所述操作過程中不連續批量地將所述反應混合物選擇性地遞送至所述產物分離容器。
57.根據權利要求53至56中任一項所述的體系，其配置用於從所述產物分離容器選擇性地遞送所述脂肪酸烷基酯的產量。
58.根據權利要求57所述的體系，其配置用於以連續方式從所述產物分離容器選擇性地遞送所述脂肪酸烷基酯的產量。
59.根據權利要求57所述的體系，其配置用於不連續批量地從所述產物分離容器選擇性地遞送所述脂肪酸烷基酯的產量。
60.根據權利要求53至59中任一項所述的體系，其中所述體系配置用於從遞送至所述產物分離容器的所述反應混合物增加所述脂肪酸烷基酯的產量。
61.根據權利要求60所述的體系，其中所述體系配置用於將所述脂肪酸烷基酯的產量選擇性地再發送至所述反應容器以進一步增加來自反應混合物的所述脂肪酸烷基酯的產量，所述反應混合物隨後被遞送至所述產物分離容器。
62.根據權利要求60所述的體系，其中所述體系配置用於將所述脂肪酸烷基酯的產量選擇性地再發送至輔助反應器組件，其中所述輔助反應器組件包括輔助反應器容器和輔助產物分離容器，其中所述進一步增加的脂肪酸烷基酯的產量隨後經由所述輔助產物分離容器被選擇性地遞送。
63.根據權利要求1至37中任一項所述的方法，其在權利要求38至62中任一項所述的體系中進行。`
【文檔編號】C12P7/64GK103781911SQ201180072930
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2011年8月31日 優先權日:2011年8月31日
【發明者】S·巴舍, A·埃格巴爾埃, R·馬斯裡 申請人:轉換生物柴油有限公司