Lcms技術及其應用的製作方法

2023-05-10 13:49:36

專利名稱：Lcms技術及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及改良的LCMS技術及其在選擇性鑑別和鑑定免疫原性表位的方法中的應用，以及其在疫苗開發中的應用。
背景技術：
免疫系統T細胞對免疫原性病原體相關表位的特異性受體介導的識別是針對感染性疾病的保護性免疫性的基礎。在足夠刺激條件下的初始識別之後，這種表位驅動特異性T細胞的克隆群的擴增、分化和維持。在感染期間，這些T細胞群解除(disarm)及消除病原體。之後，所述T細胞群經歷強力收縮，但是一小部分得以維持以在再次遭遇特定抗原時發起快速記憶應答。這個觀點在疫苗開發中採用。針對感染性疾病的疫苗應使免疫系統暴露於源於相關病原體的表位以誘導保護水平的特異性記憶T細胞產生。病原體相關T細胞表位是來自病原體編碼的蛋白質的小蛋白質片段，在細胞內加工為抗原呈遞細胞(後文稱作APC)細胞表面的主要組織相容性複合體(後文稱作MHC)分子的配體之後暴露。對於與MHC分子對肽表位的切除、存活、競爭和最終呈遞相關的過程和酶的了解還非常少。兩種類型的MHC分子參與使表位呈遞至兩種功能性類型的T細胞。MHC I型分子使表位呈遞至⑶8+T細胞，而MHC II型分子使表位呈遞至⑶4+T細胞。為了設計未來的疫苗，我們需要關於T細胞表位的新的想法。尤其對於顯示出高可變表面抗原的病原體或者對於(重新)出現的病原體，保護性T表位及其抗原仍然是難以分辨的。本發明人認識到現有技術中現行疫苗學中的主要慣有觀念(major conventions) 造成了關於病原體相關表位的兩種可區別類型MHC I型Iigandome和MHC II型Iigandome 的知識缺口(knowledge gap)。首先，基於基因組的抗原揭示(反向疫苗學)已經使其進入疫苗學且有希望向我們揭示全部病原體蛋白質組。藉助於免疫信息學，通過in silico預示了表面結構如主要細菌毒力因子和病毒表面抗原，其可以是候選保護性抗原。反向疫苗學方法需要在實驗動物中的重組抗原表達技術和免疫原性研究。這種方法的確已經成功選擇有希望的疫苗候選物，作為基於PorA的腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清群B疫苗 (Masignani et al. 2002)的備選物。儘管利用反向疫苗學方法，但是對於表位的知識缺口仍存在(i)當免疫優勢T細胞抗原是病原體的內部蛋白質時，反向疫苗學將不能揭示該免疫優勢T細胞抗原；以及(ii)動物中的免疫原性也許不能預示人體中的免疫原性和免疫優勢。其次，基於在高通量MHC結合和T細胞測定中使用來自候選蛋白質的合成肽的集合、算法推測的表位或者甚至整個蛋白質組作為重疊合成肽的傳統T細胞表位鑑別方法已經產生了對於相當大數目T細胞表位包括病原體相關表位的認識。然而，本發明人認為這種方法也受限制這些常規方法否認細胞內天然加工的作用、與存活相反的破壞、表位的選擇和競爭以及表位特徵(如T細胞表位在感染期間及對於不同細胞類型的初級序列、多樣性、準確的分子長度和長度多態性、豐度、天然變異以及最後，動力學)對於免疫原性的重
4要性。T細胞表位也通常被認為是初級基因序列的真實的in Silico可預測的翻譯。然而， 越來越多的跡象表明與僅是基於in silico蛋白質組學的預期相比，初級蛋白質序列的多種類型的翻譯後修飾(在後文稱作PTM)包括磷酸化、糖基化、脫醯胺化、甲基化和剪接以及基因組的異讀框翻譯可導致更多樣化的免疫學相關表位集合(Temmerman et al. 2004， Engelhard etal. 2006)。此外，本發明人認識到如上文「其次」段落中所述鑑別T細胞表位的技術依賴於分離自個體的周圍血單個核細胞(PBMC)的體外應答，所述個體對於感興趣的病原體已經變得免疫，且通常在先前的感染中存活下來。典型地，當病原體是罕見或者新出現的時，這些個體是非常缺乏的。因此，關於出現的感染性疾病的表位鑑別應基於不依賴於使用來自先前感染的個體的PBMC的新技術。進一步地，本發明人認識到病原體相關MHC I型和MHC II型表位配體(所謂的 ligandome)的鑑別存在技術難題，需要最大限度的定量和定性靈敏性。一些實驗室的開拓性工作已經示出質譜分析組合液相層析(LCMQ是目前最有效的分析工具，提供對於這些類型ligandome的公正認識(Hunt et al. 1992)。然而，目前的方法不能達到足夠的免疫學和技術靈敏性和選擇性以獲得對於表位特徵的公正認識，如源自病原體衍生蛋白質的免疫原性表位的準確序列、多樣性、豐度、PTM和動力學。在疫苗學中仍需要「免疫蛋白質組學」 以橋連對於病原體相關表位的知識缺口。只有在那時我們才能識別真正的免疫原性和保護性表位以及了解病原體可能逃避其特異性識別的策略。然而，不顯著改良方法學則不能認識到迄今為止已知的表位冰山表面下隱藏著什麼。MHC表位分析是非常有挑戰性的。APC上的MHC分子呈遞大濃度範圍的大量不同的肽表位。所述系統的靈敏性應足以檢測病原體相關表位，甚至當在含有IO7-IO8個細胞的APC細胞培養物的提取物中以一個拷貝/細胞表達時，等於在全部回收時在柱上 IO-IOOattomole的肽量。所述系統的選擇性應足以在幾十萬其它不相關MHC表位中鑑別這種個體表位。本申請揭示了在柱技術學中關於綜合表位挖掘(comprehensive epitope mining)的靈敏性、覆蓋範圍和動力學範圍的改良。因此，本發明的目的是提供新平臺技術， 其以靈敏性、選擇性和簡便方式可在單一分析表位樣品中鑑別由保護性T細胞識別為MHC I型和II型配體的免疫原性病原體相關表位。本發明人認識到這個目的通過組合三個發現結果得以解決(i)改良的高靈敏性和有力平臺LCMS技術，以檢測和鑑別高度複雜的肽混合物中微量的未知肽，組合(ii)特製的體外免疫學實驗設計，以相關方式從其來源蛋白質中釋放每種類型的免疫原性病原體相關表位及釋入單一溶液中，以及(iii)(任選存在的)應用抗原的選擇性化學或者物理修飾，以便於樣品中相關病原體相關表位的快速和明確識別和鑑別。液相層析-質譜分析(LCMQ裝置從US 2002/146349中獲知，所述文獻以其全部內容援引加入本文，特別是關於所述裝置方面的內容。LCMS裝置的目的樣品中待分析物(在本文是指肽)的層析分離通過使用液相層析(LC)柱實現。優選地，該柱的內徑和長度如下所述(i)獲得最高的可能靈敏性，組合
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(ii)最大的分離效率。本發明的一個目的是提供改良的裝備了納級柱(nanoscale column)的LCMS裝置。在本申請中，改良了 LCMS裝置的不同方面。提供了改良的LCMS平臺。所述改良的LCMS 平臺經證實與現有LCMS平臺相比能進行更詳細的分析。本發明的另一目的是使得可以明顯延長總分析時間。發明描述本發明的一方面涉及液相層析質譜分析(LCMQ裝置。本發明提供了使用LCMS裝置的改良的分析方法。本發明進一步提供了生產其部件的改良的方法。本發明另一方面涉及層析方法，特別是二維液相層析法。本發明再一方面涉及無鹽二維高效納級液相層析分離技術。本發明再一方面涉及納級液相層析柱以及用於液相層析應用、特別是液相層析質譜分析中的這種層析柱的製備。本發明另一方面涉及電噴射離子化(ESI)發射器(emitter)，及生產與液相層析柱聯合使用的發射器的方法，所述發射器優選與電噴射離子化質譜分析(LC-ESI/MS)偶聯。本發明另一方面涉及連接納級LC柱的連接和方法。本發明再一方面涉及納級液相層析柱中進行(零死體積(zero-dead volume))連接的連接和方法。在一個實施方案中，提供了窄徑(narrow bore)(毛細管)納級液相層析柱。本發明另一方面涉及本發明LCMS裝置在鑑別表位的方法中的應用。本發明另一方面涉及鑑別表位的方法，其中所述方法包括如下步驟a)製備包含 MHC I型和MHC II型表位(Iigandome)至少之一的樣品，其中所述表位已經被加工並被抗原呈遞細胞呈遞；b)在本發明的LCMS裝置中分析在步驟a)中獲得的樣品。本發明一方面涉及產生包含根據本發明方法鑑別的表位的組合物的方法，其中所述方法包括包含所述表位的分子的化學合成與重組表達至少之一。在一個其它方面中，本發明涉及通過使用本發明的LCMS裝置和/或本發明的表位鑑別方法可獲得的表位。本發明另一方面涉及根據本發明鑑別的表位的應用或者包含所述表位的組合物的應用。所述表位或者包含所述表位的組合物用於生產預防和/或治療由攜帶這種表位的病原體所致疾病的疫苗，或者用於評估哺乳動物的免疫狀況。本發明的所有這些方面均在下文論述。LCMS 裝置在一個實施方案中，所述LCMS裝置包含柱，優選納級柱以進行層析。LCMS裝置包含液相層析(LC)柱，所述LC柱被排列並構造成以納升/分鐘(nl/min)範圍的流速運行。 這種納級柱使得層柱有高分離效率，可以改良在質譜分析儀(MQ的分析。由於質譜分析是作為鑑別肽的強有力的技術出現的，納級液相層析結合質譜分析是目前鑑別MHC-呈遞肽的首要可選擇方法，因為這是能提供在低attomole量的各個肽的序列信息的一種技術。然而，本發明實施方案的應用非僅限於LCMS應用。通常，LCMS裝置的實施方案包含混合泵裝置，其具有泵，優選高壓液相層析(HPLC)泵，在一個實施方案中以便利方式組合分流裝置以非常精確的方式產生混合溶劑系統、分析柱及質譜分析儀所需的低流速。所述LCMS裝置進一步具有電噴射離子化(ESI)單元，其包含發射器、塗層及專用電噴射離子化源。所述LCMS裝置包含連接元件以連接各個毛細管管材(tubing)。優選的實施方案在下文詳細論述。液相層析物理地，液相層析(LC)在柱中進行，例如圓柱樣結構的柱，在其內部具有含有材料的空間(腔)。使用的柱材料和洗脫液通常決定層析的類型。在腔中保持的材料被稱作為靜止相。在優選的實施方案中，將樣品溶解於流動相中。樣品和流動相流經靜止相，在此分離待分析物，然後進行測量或者分析。在隨後的步驟中可以進行進一步分離。在優選的實施方案中及在LCMS裝置設置的優選實施方案中，在對樣品進行分級分離之後，通過質譜分析鑑別各個肽。基於質譜分析產生的質量(Mw)和結構信息(胺基酸序列)可以鑑別所述肽。LCMS 分析本發明的目的可以通過對蛋白酶解消化的蛋白質進行多維LCMS/MS分析而實現， 其中強陽離子交換(Strong Cation eXchange，SCX)分級分離與反相(Reversed Phase,RP) 分離聯合使用。組合這些分析技術以提高分離效率和分析的動力學範圍。在一個實施方案中，提供了在線多維LC方法，其使用陰離子-和陽離子交換顆粒的混合床進行第一分離維。捕獲柱在一個實施方案中，所述LCMS裝置包含固相提取(SPE)捕獲柱或者位於分析或分離柱上遊的捕獲柱。在捕獲柱中，可以使用強陽離子交換(SCX)或者弱陰離子交換(WAX)樹脂或者SCX與WAX樹脂的混合床。這組成了 LCMS/MS分析的一維。第二維可以在下遊分析柱中通過C18反相(RP)層析加入。此外，捕獲柱可以相對快速將相對大體積樣品上樣(轉移)進納級LC柱中。因此，捕獲柱的內徑應與分析柱的內徑相稱。在一個實施方案中，將包含肽(平均至少一種肽)的樣品導入捕獲柱中。優選地， 如隨後在本文鑑別，包含表位的肽被鑑別。在一個實施方案中隨後將溶劑注入捕獲柱中，這將結合的肽從捕獲柱中轉移進反相C18分析柱。在一個實施方案中，陰離子-陽離子交換(ACE)固相捕獲柱包含強陽離子與弱陰離子樹脂的混合物。這種混合床從Motoyama(Motoyama et al. 2007)獲知，其中乙酸銨用於回收結合的肽。現有技術的一個問題是用於回收結合的分析物的陽離子鹽包括乙酸銨的應用不利地影響第二維中在線反相納級LC系統的性能。根據本發明的另一方面，在第一維中結合的分析物的回收可以通過無鹽方式實現。無鹽溶液的應用防止了下遊反相樹脂惡化。優選地，轉移或者洗脫溶劑是無鹽溶劑。優選地，蟻酸(甲酸)用作轉移溶劑。換句話說，甲酸用於洗脫結合的肽。儘管在文獻中已知甲酸的洗脫強度對於從離子交換樹脂中回收肽而言太低，但是在實驗中令人驚奇地發現甲酸可以用作轉移溶劑。對於這個令人驚奇的作用的解釋可在包含具有晶體結構的交聯分子的較多或者較少開放結構的矽石顆粒上WAX樹脂的結構中發現，其中甲酸的COO—基團可以滲入並置換結合的分析物(肽)。在一個實施方案中，鹽酸(HCl)用於這個目的，但這是次優選的。在LCMS裝置或者運行這種裝置的方法的實施方案中，通過捕獲柱加入一定量(例如10μ1)的甲酸和與二甲亞碸的增加強度(濃度)的等摩爾混合物。離開ACE捕獲柱的肽被重新捕獲在反相柱轉換系統的C18反相捕獲柱上。LC分析柱樣品中待分析物(在本文是指肽)的層析分離通過使用LC分析柱實現。在一個實施方案中，所述柱的長度為至少50cm，優選至少75cm，更優選至少85cm，甚至更優選至少 90cm。柱的長度對於LC柱的性能是一個重要參數，特別是對於柱的分離效率而言。在一個實施方案中，安裝內徑低於70 μ m、優選低於55 μ m及在一個實施方案中低於50 μ m的用5 μ m C18顆粒填充的至少75cm、例如90cm分析柱對HLA-A2洗脫樣品進行深度分析。樣品以4-h梯度運行。質譜分析儀被程序化為每個循環進行1次MS和3次連續 CAD MS/MS 掃描。在一個實施方案中，使用熔融二氧化矽柱。在優選的實施方案中，使用熔融二氧化矽毛細管柱。所述柱包含進行液相層析的填料。本發明提供了填充柱的合適方法。在一個實施方案中，所述LCMS裝置包含納級柱。在一個實施方案中，這種柱可包含熔融二氧化矽(毛細管)管材，其具有外半徑和內半徑，內半徑相應於延伸經過熔融二氧化矽的腔。優選所述納級管材的外徑在150-1400 μ m範圍內。所述管材的外徑優選在 200-800 μ m 範圍內。所述柱的內徑低於75 μ m,優選低於55 μ m,更優選低於50 μ m,甚至更優選低於 30 μ m，更優選低於沈μ m。較小的內徑將改良LCMS裝置的靈敏性和分離效率。所述內腔優選直徑在5-100 μ m範圍內，更優選在16-70 μ m內，甚至更優選的實施方案中在18-50 μ m 內。這種毛細管管材可用於5-50nl/分鐘、更優選10-30nl/分鐘範圍內的流速。LC分析柱的生產根據本發明的一個方面，提供了生產LC柱的方法，所述柱包含具有內徑為至多 55 μ m的內腔的長度為至少45cm、優選至少75cm的柱，在所述柱的一端使其熔為玻璃料 (preparing a frit)並將合適的液相層析固相材料填充在柱中，其中液相層析固相材料以在低粘度溶劑中的漿液形式提供。在優選的實施方案中，低粘度溶劑是在20°C粘度為 0. 32cP的丙酮。LC分析柱的填充根據本發明的另一方面，提供了生產LC分析柱的方法，所述分析柱包含長度為至少45cm、優選至少75cm的具有內徑至多為55 μ m的內腔的柱，在柱的一端熔成玻璃料並將合適的液相層析固相材料填充在所述柱中，其中在填充期間對所述柱進行振動或者超聲處理。在一個實施方案中，對所述柱進行超聲處理。現有技術的一個已知問題是「長」 LC分析柱的填充速度。在一個實施方案中，本發明的改良的填充方法包括在填充期間振動所述柱，優選使用超聲振動。在一個實施方案中，在填充期間進行超聲振動。優選地，進入所述柱的漿液被振動。這改良了填充效率並防止填充床中空隙/孔洞的形成。
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根據本發明另一方面，非粘性溶劑如丙酮與填充柱的方法組合使用。在優選的實施方案中，所述非粘性溶劑與漿液組合使用。優選地使用粘性至少比異丙醇小2倍的溶劑。在一個特異的實施方案中，熔融二氧化矽柱的熔為玻璃料的末端(fritted end) 被置於超聲浴中(例如Branson 200)。在再一個實施方案中，所述超聲處理僅在固相顆粒衝入熔融二氧化矽柱中之後進行。在一個實施方案中，漿液含有至少150mg懸浮在Iml丙酮中的反相顆粒。在填充期間丙酮相對於異丙醇通過柱的線速度等於令人驚訝的7士 1倍。電噴射離子化(ESI)和發射器製造在一個實施方案中，所述LCMS裝置包含用於液相層析的發射器，偶聯至具有用於電噴射端頭(tip)的電噴射離子化質譜分析(LC-ESI/MQ。所述端頭是還包含塗層及電噴射離子化源的電噴射離子化單元的一部分，優選被構造並設置為電噴射從分析柱接受的納升流速(nanolitre flow rate)。已知發射器的問題是金層特別是靠近端頭末端的金層的破壞，其可導致脈動噴射 (pulsating spray)。本發明的目的是改善發射器，特別是允許更長的LCMS-ESI運行。優選地，端頭/發射器包括一次塗層(primary coating)，優選是導電塗層，優選是貴金屬如金塗層。二次塗層被用作保護層。在一個實施方案中，二次塗層是導電碳基塗層。在另一個實施方案中，矽基塗層用作二次塗層。在另一個實施方案中，使用導電聚合物塗層。優選地，發射器由管材形成，優選熔融二氧化矽毛細管管材。在一個實施方案中， 發射器內徑至多55 μ m，優選至多30 μ m。在本發明的一個實施方案中，提供了一種形成發射器的方法。所述方法包括加熱管材並拉伸以形成具有減小的內半徑的端頭。這種減小的內半徑進一步增強LCMS分析的性能。根據一個方面，本發明提供了製造這種改良的發射器的方法。製造用於LCMS裝備中的改良的端頭的方法包括用導電碳基塗料塗覆端頭特別是端頭末端的步驟。靠近其錐形末端的端頭內徑優選在大約2-30 μ m範圍，更優選3-10 μ m。在一個實施方案中，形成的發射器/端頭在錐形末端的發射器內徑為至多10 μ m。在一個實施方案中，在兩端拉伸管材並在中間部分加熱。在加熱期間，在中間部分的玻璃變軟，變得拉長，最終折斷。在這個實施方案中形成兩個錐形發射器。在一個實施方案中，拉長的端頭用貴金屬如金塗覆。之後，切割端頭，優選靠近錐形(拉長/拉伸的)末端切割以形成減小的內直徑的出口。在一個實施方案中，發射器整體形成在分析柱末端。這防止了分析柱末端與發射器上遊末端之間的連接。根據一個方面，提供了用於納級流(nanoscale flow)的發射器，其包含用於接受樣品例如來自液相層析柱的樣品的上遊末端及用於電噴射所述樣品的錐形末端，所述發射器是電噴射離子化單元的一部分，所述發射器從熔融二氧化矽形成並且具有小於陽μ m的內徑，其中所述發射器的錐形末端具有金的導電一次塗層及二次導電碳基塗層。另外，本發明提供了用於納級流的發射器，其包含用於接受樣品例如來自液相層析柱的樣品的上遊末端及用於電噴射所述樣品的錐形末端，所述發射器是電噴射離子化單元的一部分，所述發射器從熔融二氧化矽形成並且具有至多55 μ m的內徑，其中所述發射器的錐形末端具有包含矽合金或導電聚合物的塗層。T-連接器在納級LCMS裝置中，關鍵的是避免流路中的死體積，即空隙(void)，因為具有與流路的內徑相當大小的死體積對帶(峰)寬有很大影響。由於分散所致峰加寬對於系統的靈敏性和動力學範圍均有有害作用。在一個實施方案中，提供了一種改良的連接元件，其至少顯著降低LCMS裝置的流路中死體積的存在。因此，本發明提供了連接元件，其包含內體積，所述內體積橫截面直徑通常等於待安裝管材的外徑。管材的對接(butt connection)本發明的一個方面涉及提供能經受高壓(> 4xl04kPa)的納級柱的對接方法。在本發明的一個實施方案中，用金剛石切割器切割待連接管材的末端，獲得垂直於管材長度方向的「直切口(straight cut)」。這種直切口使得管材末端在連接元件內接合(abutment)並且至少降低當流動相從上遊柱衝到下遊柱入口時死體積的存在。在末端具有直刀口(straight edges)的管材連接通常稱為對接。直切口避免了形成毛邊(burr) 或鰭狀物(fin)。儘管管材的末端是接合的，但是這種對接不是完全或者緊密閉合的並且可發生洩露。在三向連接元件實施方案中，洩露體積可以到達連接元件的第三個連接組合裝置。儘管本發明將用特異實施方案進行描述，但是顯然本發明不限於所示實施方案。 更特別地，所示實施方案顯示了 LCMS技術的應用。然而，本發明不限於在LCMS中應用。儘管本發明將用特異實施方案進行解釋，但是本發明不限於本文公開的明確特徵，也包含任何暗示特徵或等同特徵。儘管特異權利要求附於本申請，本申請的公開不由權利要求限制， 而是包含所有暗示和明顯特徵，並且隨後的分案申請可以涉及這些特徵的任意組合。本領域技術人員了解本發明實施方案可以組合。除非明確說明，任何本文公開的實施方案均可以與另一個公開的實施方案的特徵(的一部分)組合。本發明稍後參照附圖更詳細描述。在整個申請中，表述LCMS裝置可以與LCMS平臺技術或LCMS設備互換使用。LCMS裝置的應用在另一方面，提供了本發明前述方面所述裝置在鑑別表位中的應用。本領域技術人員知道什麼是表位。簡而言之，表位是蛋白質片段，優選是肽。通常， 對於MHC I型配體，表位長度大約是8-10個胺基酸，對於MHC II型配體，表位長度大約是 11-34、優選14-16個胺基酸，但是也可以預期其它長度的肽。這種肽可以進一步通過PTM 改變(Engelhard et al. 2004)。任何表位均可以潛在地用本發明的LCMS裝置鑑別。在一個優選的實施方案中，MHC I型T細胞表位被鑑別。在另一個優選的實施方案中，MHC II型 T細胞表位被鑑別。本領域技術人員理解用單個樣品可以鑑別若干表位。還可以在單個樣品中鑑別多個MHC I型和II型T細胞表位。MHC I 型表位在第一個優選實施方案中，T細胞表位是MHC I型表位。如本領域技術人員已知及在背景中解釋的，MHC I型表位是由APC呈遞在MHC I型分子上以激活⑶8+T細胞的表位。
10MHC I型表位優選源自或者衍生自在哺乳動物細胞內表達的蛋白質，優選衍生自在胞內感染期間的病毒。MHC I型表位也可以源自其它非自身蛋白質，其可以是被加工並被APC呈遞在MHC I型分子中的細菌蛋白。優選地，這些蛋白質衍生自可適應胞內生活方式的細菌， 即它們可以進入哺乳動物APC，優選人類APC。MHC I型表位還可以源自非自身細菌或病毒蛋白質，其可以由APC從細胞外環境攝取並且可以經交叉呈遞到達MHC I型加工區室。另外，MHC I型表位也可以源自宿主蛋白質，其表達是從頭誘導的或者由APC的細胞內感染而上調，因此是感染或病原體相關的。可以使用一些策略用本發明的LCMS裝置鑑別MHC I型表位。對於病毒病原體， 首先需要選擇需要對其鑑別MHC I型表位的病毒。優選的病毒包括但非限於能在所述哺乳動物中誘導病症或疾病的任何病毒。優選哺乳動物是人類。可鑑別MHC I型表位的人類病毒包括逆轉錄病毒科，如人免疫缺陷病毒(HIV)；風疹病毒；副粘病毒科，如副流感病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，呼吸道合胞病毒，人間質肺炎病毒；正粘病毒科，如流感病毒；黃病毒科，如黃熱病毒，登革熱病毒，C型肝炎病毒(HCV)，日本腦炎表達(JEV)，蜱傳腦炎病毒，St. Louis腦炎病毒或者西尼羅病毒；皰疹病毒科，如單純皰疹病毒，巨細胞病毒， Epstein-Barr ^ ；(Bunyaviridae) ；^(Arenaviridae) : ^! 科(Hantaviridae)，如Hantaan ；冠狀病毒科；乳多空病毒科，如人乳頭瘤病毒；彈狀病毒科 (Rhabdoviridae)，如狂犬病病毒。冠狀病毒科如人冠狀病毒；甲病毒科(Alphaviridae)， 動脈炎病毒科(Arteriviridae)，絲狀病毒科(filoviridae)如伊波拉病毒，沙粒病毒科， 痘病毒科如天花病毒及非洲豬瘟病毒。麻疹病毒、流感病毒和呼吸道合胞病毒在實驗部分被作為例子。下一步是製備包含來自選擇的病毒的MHC I型表位的混合物，將這個混合物或者樣品提供給上述LCMS裝置以鑑別所述MHC I型表位。可以使用若干策略鑑別MHC I型表位。在這個優選實施方案(MHC I型表位)中，包含MHC I型表位的混合物優選衍生自包含所述表位的細胞。因此，如果待鑑別的MHC I型表位源自或者衍生自病毒，本領域技術人員首先要用所述病毒感染哺乳動物細胞以獲得所述混合物。這可以用本領域技術人員已知技術進行並且已在作為例子的麻疹或者流感病毒的實驗中充分描述。優選地，使用APC待被感染。APC可以衍生自細胞系或者分離自哺乳動物優選人。專門APC的分離和鑑別方法。優選使用的APC是人DC，更優選是人單核細胞衍生的樹突細胞(MDDC)，如實驗部分所述。APC 優選在合適培養基中培養若干天(大約4-6天)，所述培養基任選補加給定營養素。APC隨後用選擇的病毒根據已知技術感染。根據病毒的性質，本領域技術人員知道採用哪種感染方案。在感染後，收穫APC，洗滌，計數並任選地沉澱和冷凍直至進一步分析。作為對照，可以使用未感染的APC。根據實驗設計，人們可以在至少兩個平行培養物中培養APC，其一用選擇的病毒感染。所述平行培養物之間的唯一其它差異是感染的培養物在50%穩定同位素標記的胺基酸如13C6-L-亮氨酸和/或13C5,15N1-L-甲硫氨酸和/或13C5,15N1-L-纈氨酸和 50%它們天然胺基酸對應物L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-纈氨酸存在下實現。可以選擇其它胺基酸用於標記，優選代表與實驗的HLA背景相關的MHC錨殘基的胺基酸。在洗脫一種 MHC I型表位組合物之前使用感染的和對照APC的1 1混合物(細胞/細胞)會差異影響病毒感染相關的相對於正常未改變的自身表位的同位素離子簇。這會使得稍後更好鑑別病毒感染相關的MHC I型表位。
根據實驗設計，人們可以選擇使用來自特異HLA背景的APC。例如，如果人們使用來自HLA-A*0201背景的APC，人們將鑑別特異存在於這個環境中的表位。我們還可以選擇平行使用來自不同HLA背景的APC以鑑別可能存在於若干背景環境中的表位。在1 1混合APC (細胞/細胞)之後，可以在進行進一步表位分析之前冷凍細胞混合物。當進行分析時，如果是冷凍的，融化APC。APC隨後裂解用於根據已知技術溶解MHC I型分子。優選的方法類似於在MHC II型表位章節描述的方法。更優選的方法也在實驗部分描述。適於下載到用於鑑別洗脫的組合物中存在的每個表位的本發明裝置中的包含MHC I型表位的組合物或樣品的製備物類似於被下載到本發明裝置中的包含MHC II型表位的組合物的製備物。下載合適的組合物到本發明裝置中及分析獲得的結果導致MHC I型表位鑑別是根據本領域技術人員已知並且在實施例中解釋的技術進行的。這個方法允許鑑別已知感染哺乳動物的給定病毒的潛在地任何MHC I型表位。其還洞察給定MHC I型表位的相對豐度。其還可以洞察表位的其它特徵，包括表位的長度變化，由存在包含在洗脫的組合物中的多個長度變體所反映，以及表位的翻譯後修飾(PTM)， 或者在給定HLA環境中呈遞的蛋白質或者表位多態性的作用。這個技術是強有力的並且對於開發功能疫苗是需要的。如果選擇的病毒是已知自身適應現存治療相當快的病毒，本發明的優選實施方案是鑑別衍生自一種病毒的至少2個毒株的共享MHC I型表位，優選地在這個優選實施方案中，病毒是流感病毒。MHC II 型表位在另一優選的實施方案中，T細胞表位是MHC II型表位。在本發明的一個優選應用中，在抗原脈衝實驗中保溫包含表位來源與APC的混合物及隨後將包含已經加工及由 APC呈遞的表位的樣品輸送至本文所述裝置之後鑑別MHC II型表位。優選表位來源是表位的來源蛋白質。正如技術人員所已知且在背景中闡述，MHC II型表位是由APC呈遞在MHC II型分子上以激活CD4+T細胞的表位。本文所用的MHC II型表位優選源自或者衍生自非自身蛋白質。非自身蛋白質優選是來自如後文所述鑑別的病原體的蛋白質，所述蛋白質對於可以由所述病原體感染的哺乳動物是非自身蛋白質。可以使用本發明的LCMS裝置使用一些策略鑑別病原體相關的MHC II型表位。首先，需要選擇針對其需要鑑別MHC II型表位的病原體。優選的病原體包括但不限於能在哺乳動物中誘導病症或疾病的哺乳動物的任何病原體。優選所述哺乳動物是人。可以對其鑑別MHC II型表位的人病原體包括原核生物或者真核生物細胞。優選地，原核生物是細菌。優選的細菌包括螺桿菌屬(Helicobacter)，如幽門螺桿菌(Helicobacter pylori),奈瑟氏球菌屬(Neisseria), BfifilliiM (Haemophilus) 如流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)，博德特氏菌屬(Bordetella)，衣原體屬 (Chlamydia)，鏈球菌屬(Streptococcus)如月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae), 弧菌屬(Vibrio)如霍亂弧菌(Vibrio cholera)，以及革蘭氏陰性腸病原體包括如沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)和埃希氏菌屬(Escherichia)，以及導致炭疽、麻風、結核、白喉、Lyme病、梅毒、傷寒、淋病和Q熱的細菌。優選的細菌屬於博德特氏菌屬或者奈瑟氏球菌屬種。更優選的博德特氏菌屬菌種包括百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella
12parapertussis)或者支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchis印tica)。更優選的奈瑟氏球菌屬菌種包括腦膜炎奈瑟氏球菌。病原體可以是寄生物，例如原生動物，如牛巴貝蟲(Babesia bovis)、瘧原蟲屬(Plasmodium)、利什曼原蟲屬(Leishmania spp)、鼠弓形蟲 (Toxoplasma gondii)，及維蟲屬(Trypanosoma)，如克魯斯維蟲(Trypanosoma cruzi)。優選的真核生物包括真菌。更優選的真菌是酵母或者絲狀真菌。舉例的優選的酵母屬於假絲酵母屬(Candida)。優選的真菌包括麴黴屬(Aspergillus sp.)、白色假絲酵母(Candida albicans)、隱球酵母屬(Cryptococcus)如新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)以及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。病原體也可以是如後文定義的病毒病原體。在這種情況中，當是指病原體細胞時，優選是指病毒感染的細胞。下一步驟是製備包含來自選擇的病原體的一或多個的MHC II型表位的一種來源蛋白質或者多種來源蛋白質的混合物，在抗原脈衝實驗中將這個混合物與APC保溫並將包含已經加工及由APC呈遞的一或多個表位的樣品輸送至本文先前所述LCMS裝置以鑑別所述MHC II型表位。根據實驗的目的和/或技術人員所具有的選擇的病原體的知識和/或根據病原體的性質可以使用一些類型的一或多種來源蛋白質的混合物。在優選的實施方案中，所述混合物衍生自細胞或者包含細胞。更優選地，上下文中的細胞是病原體細胞。優選的病原體已經在本文鑑別。衍生自病原體細胞的混合物優選是衍生自全細胞製備物的混合物。當對所述病原體細胞未知或已知極少幾個表位或者針對所述病原體應鑑別其他表位或者來自未知病原體蛋白質的表位時，這個更優選的實施方案(使用衍生自全細胞製備物的混合物)通常更具吸引力。當已知或未知病原體相關表位與來自病原體的其它已知或未知表位相比應被鑑別為優勢加工和呈遞的時，這個更優選的實施方案也是具有吸引力的。當在單個分析樣品中應包含全部病原體相關的MHC II型 Iigandome (其類似於哺乳動物APC優選人APC對於完全和複雜的病原體蛋白質組的體內加工和呈遞的結果)時，這個更優選的實施方案具有吸引力。簡而言之，為了製備這種混合物，將病原體細胞在兩個平行培養的合適培養基中培養，優選直至靜止相。兩個平行培養物之間的唯一不同是一個培養物在存在wN(天然氮同位素)條件下實現，而另一個在存在1N 穩定同位素條件下實現。在抗原脈衝實驗中使用wN-和15N-標記的病原體細胞1 1的混合物與APC優選產生等拷貝數的輕(14N)和重(15N)形式的表位。這樣可便於隨後在LCMS 裝置中識別病原體相關的MHC II型表位。根據病原體，技術人員已知可以使用哪種合適的培養基以及其可以怎樣任選補加額外的營養物。通常，當病原體細胞達到靜止相時，對其進行熱失活。靜止相優選是指優選使用光密度測量法未檢測出細胞的額外生長。所述光密度優選在590nm測量。隨後，病原體細胞可以在生理緩衝液如PBS中濃縮以獲得具有合適光密度(OD)、優選在0. 6-1之間的全細胞製備物。在另一優選的實施方案中，所述混合物包含細胞的蛋白質或者衍生自細胞的蛋白質，優選病原體細胞的蛋白質。病原體細胞已經在本文定義。優選的蛋白質是P.69 Pertactin，其是得自百日咳博德特氏菌的蛋白質。當已知得自病原體的蛋白質是免疫原性的及需要鑑別新的、改良的或者優勢表位時，典型使用這種類型的混合物。蛋白質優選存在於純化的製備物中。純化的製備物優選是指所述製備物包含或者由至少80%、至少85%、 至少90%的所述蛋白質組成，或者至少95%、或者至少98%、或者至少99% (w/w) 0蛋白質可以從病原體直接純化，或者其編碼基因可以克隆進表達所述蛋白質的另一宿主中。這種
13宿主的優選實例是大腸桿菌(E. coli)，如本文實驗部分所述。獲得蛋白質的方式不限於本發明中的特定方式，只要所述製備物的純度如本文定義即可。為了獲得所述蛋白質，將病原體在如先前段落中所述的合適條件下培養。在宿主細胞的情況中，所述蛋白質的表達可以通過加入誘導劑誘導。優選地，對於大腸桿菌，使用IPTG作為誘導劑。如果所述蛋白質在細胞內表達，則在培養結束時使用本領域技術人員已知的去汙劑使所述病原體或者宿主細胞裂解。隨後製備包含所述蛋白質的細胞溶質細胞提取物。所述蛋白質隨後從所述細胞溶質提取物中純化。在大腸桿菌的情況中，所述蛋白質可以存在於包涵體中。存在於包涵體中的蛋白質的純化為本領域技術人員已知且可以如實施例中所述進行。隨後，蛋白質製備物可以在生理緩衝液如PBS中濃縮或者稀釋或者可以進一步純化以獲得具有合適濃度蛋白質、優選0. 3-2. 5mg/ml的蛋白質製備物。在另一優選的實施方案中，混合物衍生自細胞區室或者包含細胞區室，優選病原體細胞。病原體細胞已經在本文定義。優選的區室是小泡，更優選是腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜小泡(Outer Membrane Vesicle, OMV) 0當已知得自病原體的小泡是所述病原體的免疫原性實體及需要鑑別新的、改良或者優勢表位時，典型使用這種類型的混合物。細胞區室優選存在於純化的區室製備物中，如前文段落中針對蛋白質所闡述。純化的區室製備物優選是指所述製備物包含或者由至少5 %的已知存在於這種製備物中的一種代表性蛋白質組成。所述製備物優選包含或者由至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、 至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少85 %、至少90 %或者至少95 %、或者至少 98%、或者至少99% (w/w)組成。來自腦膜炎奈瑟氏球菌的OMV中存在的代表性蛋白質的實例是外膜蛋白質孔蛋白A(PorA)。區室優選直接純化自病原體。獲得區室的方式不限於本發明中特定方式，只要滿足包含所述區室的製備物的純度要求即可。為了獲得所述區室製備物，將病原體在如前兩個段落中所述合適條件下培養。根據選擇的區室的性質，技術人員將已知怎樣將其從培養的病原體細胞分離及任選純化。製備包含OMV的製備物的一個優選方式在實施例中描述。隨後，可以將所述區室製備物在生理緩衝液如PBS中濃縮或者稀釋或者可以進一步純化以獲得具有合適濃度的代表所述區室的蛋白質的純化的區室製備物。例如，如果使用來自腦膜炎奈瑟氏球菌的OMV作為所述區室，則純化的區室應優選含有 1. 2-2. 4mg/ml的主要代表性外膜蛋白質孔蛋白A(PorA)。在本發明中可以使用包含MHC II型表位來源的任何其它混合物。優選地，這種來源是蛋白質來源。也可以使用包含病毒表位來源的混合物。優選的病毒在後文定義。包含病毒表位來源的混合物優選是包含病毒蛋白質的混合物或者衍生自其中或者是病毒蛋白質的來源，優選複製性病毒生物體。當應鑑別誘導CD4+T細胞的病毒相關的MHC II型表位時，這個優選的實施方案通常是具有吸引力的。與製備包含MHC II型表位來源的混合物同時，也製備包含來自已知是選擇的病原體的潛在靶位的哺乳動物的APC的製備物。優選地，APC得自人。技術人員已知怎樣從人分離APC。這通常是使用人全血進行梯度離心技術進行，優選使用白細胞除去法暗黃覆蓋層(leukapheresis buffy coat)的梯度離心進行。APC的性質優選通過流式細胞計量術核實，使用特異於APC標記的特異性抗體進行。優選使用的APC是人DC，更優選人單核細胞衍生的樹突細胞(MDDC)，如實驗部分所述。根據實驗設計，可以選擇使用來自特定HLA背景的APC。例如，如果使用來自HLA-DRl背景的APC，則將鑑別在這種環境中特異性呈遞的表位。我們也可以選擇平行使用來自不同HLA背景的APC以鑑別在幾個背景環境中呈遞的表位。也可以使用其它細胞類型如APC，優選來自免疫系統的專門APC，如B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞和除了 MDDC之外的樹突細胞世系。其它哺乳動物細胞類型也可以用作APC 以鑑別在所述細胞的抗原加工和呈遞背景環境中特異性產生的或者疾病狀態相關的表位。 在此，APC優選隨後在合適的培養基中培養幾天(大約4-6天)，所述培養基中可以補加營養物。在培養結束時，將包含一或多個表位的等量的14N和1~來源的1 1混合物(全細胞或者細胞的蛋白質或區室)與APC在合適培養基中保溫1-2天，所述培養基可以進一步補加。補加物可以是佐劑。優選的佐劑是LPS(脂多糖)。更優選地，LPS來自S.abortis equi。這是所謂的抗原脈衝實驗。在保溫結束時，收穫APC、洗滌並計數。在進行進一步表位分析之前將其冷凍。當將要進行分析時，如果APC是冷凍狀態則將其解凍。隨後根據已知技術對APC 進行裂解以使MHC II型分子溶解。如實施例所述，優選的裂解緩衝液包含1%CHAPS，是緩衝的及補加了蛋白酶抑制劑。如實施例所述，離心後獲得的上清隨後可以在一些CNBr-激活的、TRIS-封閉的瓊脂糖柱上純化以獲得包含一或多種表位的洗脫組合物。洗脫組合物可以通過膜濾進一步純化、濃縮並在合適組合物或者樣品中重建，下載進本發明的裝置中以鑑別洗脫組合物中存在的每種表位。根據技術人員已知的及在實施例中闡述的技術，將合適的組合物或樣品下載入本發明的裝置中，根據獲得的分析結果鑑別MHC II型表位。這種方法可以鑑別哺乳動物指定病原體的潛在的任何MHC II型表位。其還提供了對於指定MHC II型表位的相對豐度的認知。其也提供了對於表位的其它特徵的認知，包括由洗脫組合物中包含的多個長度變體的存在而反映出的表位長度變異以及表位的翻譯後修飾(PTM)，或者在指定HLA環境中蛋白質或者表位多態性(例如在腦膜炎奈瑟氏球菌的區域4中大量證實)對於呈遞的作用。這個技術是強力的且是開發功能疫苗所需的。鑑別的表位及其應用另一方面，本發明提供了使用本文所述任何方法可獲得的表位。優選的表位已經在本文鑑別(見實驗數據中表1-8所示，SEQ ID NO :1-153)。實施例中鑑別的每個SEQ ID NO均代表鑑別的表位。在括號內指定的每個鑑別的表位的相鄰殘基優選不認為是該表位的一部分。優選每個SEQ ID NO包括本文指定的任何PTM。麻疹病毒的優選表位在表1和2中鑑別，選自SEQ ID NO :1_45。更優選的表位選自SEQ ID NO :7-45，任選組合SEQ ID NO :1_6中至少一個。與流感病毒感染相關的優選表位在表3中鑑別，選自SEQ ID NO 46-49和SEQ ID NO 52-58。百日咳博德特氏菌的優選表位在表4和5中鑑別，選自SEQ ID NO :59_72。腦膜炎奈瑟氏球菌的優選表位在表6、7和8中鑑別，選自SEQ ID NO :73_153。優選的表位衍生自PorA蛋白，孔蛋白A血清亞型Pl. 5-2，10或者孔蛋白A血清亞型Pl. 7_2， 4。PorA蛋白可以再分為8個區域(見表6)-區域1相應於PorA蛋白、優選孔蛋白A血清亞型Pl.5-2,10或者孔蛋白A血清亞型Pl. 7-2，4的前20個胺基酸，-區域2相應於胺基酸39-59，
15
-區域3相應於胺基酸91-111，-區域4相應於胺基酸131-168，-區域5相應於胺基酸191-224，-區域6相應於胺基酸四2_306，-區域7相應於胺基酸318_；349，-區域8相應於胺基酸349-372。在優選的實施方案中，使用如下所述一或多個PorA表位區域4內包含的PorA表位，和/或區域5內包含的PorA表位和/或區域6內包含的PorA表位，任選地組合區域1 和/或2和/或3和/或7和/或8內包含的PorA表位。每個區域內包含的優選表位在表6中示出-區域1內包含的優選的表位由SEQIDNO:73-76 表示，
-區域2內包含的優選的表位由SEQIDNO:77-79 表示，
-區域3內包含的優選的表位由SEQIDNO:80-91 表示，
-區域4內包含的優選的表位由SEQIDNO:92-95 表示，
-區域5內包含的優選的表位由SEQIDNO:96-99 表示，
-區域6內包含的優選的表位由SEQIDNO100表示，
-區域7內包含的優選的表位由SEQIDNO101表示，
-區域8內包含的優選的表位由SEQIDNO:102-110 表示。在更優選的實施方案中，PorA表位選自SEQ ID NO :92_95，任選地組合至少一種其它鑑別的PorA表位。表7鑑別了從其它(非-PorA)蛋白質中鑑別的腦膜炎奈瑟氏球菌起源表位，由 SEQ ID NO :111-134表示。因此，在優選的實施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌起源表位選自SEQ ID NO :111-134。在更優選的實施方案中，如上述鑑別的Por A表位與從表7所示另一蛋白質中鑑別的腦膜炎奈瑟氏球菌起源表位組合使用。最優選地，PorA表位選自SEQ ID N0:92_95，組合 SEQ ID NO :111-134 中至少一個。表8鑑別了從PorA和非-PorA蛋白質中鑑別的腦膜炎奈瑟氏球菌起源表位，由 SEQ ID NO :135-153表示。因此，在優選的實施方案中，腦膜炎奈瑟氏球菌起源表位選自SEQ ID NO :135-153。在更優選的實施方案中，如上述鑑別的腦膜炎奈瑟氏球菌表位與表8所示腦膜炎奈瑟氏球菌起源表位組合使用。最優選地，PorA表位選自SEQ ID NO :92-95，組合SEQ ID NO :135-153中至少一個。表3、4和5中示出的每個表位以及表2、6、7和8所示其它表位的大部分均被認為是新的，其加強了本發明LCMS裝置的唯一性。任何這些表位均是摻入針對其所源自或者衍生自其中的病原體或者病毒的疫苗中的潛在候選物。因此，本發明還涉及包含在本文鑑別的表位的組合物，以生產預防和/或治療由攜帶這個表位的病原體導致的疾病的疫苗。應理解本發明涵蓋了包含如本文鑑別的一個指定病原體的1、2、3、4、5、6、7、8、9或者更多個表位的組合物。任選地，已知表位可以與本文鑑別的表位組合。
如本文定義，表位通過具有的一定長度而鑑別。包含所述表位的組合物優選不限於一定的長度。所述組合物可包含衍生自如本文定義的病原體的肽，所述肽包含鑑別的表位，優選具有在天然加工和呈遞之後鑑別的特徵，包括PTM。組合物也可以包含這樣的多肽，所述多肽包含鑑別的表位作為核心序列以及兩側具有有利於在體內給予後呈遞所述表位的胺基酸序列。組合物也可包含這樣的多肽，所述多肽包含多個鑑別的表位及側翼序列。 然而，優選表位在由這種組合物在體內輸送之後，對於MHC I型表位長度為8-12個胺基酸， 或者對於MHC II型表位長度為11-34個胺基酸，優選14-16個胺基酸。所述胺基酸序列優選完全或者部分衍生自如本文定義的病原體表達的蛋白質。因此，在優選的實施方案中，包含如本文鑑別的表位的肽用於作為疫苗的組合物中。包含MHC I型表位的肽的長度可以是 8-20個胺基酸或者更長。包含MHC II型表位的肽的長度可以是8-40個胺基酸或者更長。 包含MHC I型或II型表位的所述肽可包含一個表位及來自天然病原體蛋白的另外側翼序列或者非源自天然病原體蛋白的另外側翼序列。肽因此可由鑑別的表位組成，包含鑑別的表位，包含多個鑑別的表位或者具有與本文鑑別的表位序列之一具有至少50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、 95^^97^^99%或者100%相同性的胺基酸序列，以及其中優選這個肽不是源自如本文定義的病原體的天然胺基酸序列。優選地，肽通過其與鑑別的序列之一的相同性及具有如本文先前鑑別的長度而定義。相同性通過在排列兩個序列以保證獲得最大相同胺基酸數目之後確定兩個序列之間相同胺基酸的數目而計算。本發明進一步涵蓋了包含如本文鑑別的表位的組合物可以是指在本文針對其已經鑑別了一或多個表位的病原體的天然蛋白質用作疫苗。當病原體的新的天然蛋白質在本文鑑別為具有至少一個表位時這是優選的。或者，可以使用所述天然蛋白質的部分。在本發明中，「部分」是指所述成熟蛋白質序列的胺基酸數目的至少lO^dO^dO^idO^jO^、 60%、70%、80%、90%或100%。在實驗數據中(見表2，4_8_)，鑑別了一些病原體特異性蛋白質。這些表中鑑別的每一蛋白質或者其部分均可用於組合物中，作為針對相應病原體的疫苗。用於本發明中所述組合物的(多)肽可以是簡單合成的。另一組合物可包含編碼多肽的遺傳(DNA)密碼，所述多肽包含以其最佳形式的一或多個鑑別的表位。本領域目前已知產生所述(多)肽或者所述DNA的許多方法。本發明因此進一步涉及包含如本文先前定義的本發明表位的組合物。所述組合物優選是藥物組合物，及優選用作疫苗。疫苗可以用於哺乳動物的免疫(產生免疫應答)或者接種。組合物可進一步包含佐劑。佐劑在本文被定義為包括這樣的任何物質或化合物，當其與表位組合使用時使哺乳動物、優選使人免疫，刺激免疫系統，從而激發、增強或者促進針對所述表位的免疫應答，優選不產生對於佐劑自身的特異性免疫應答。優選的佐劑使針對指定表位的免疫應答與在相同但不存在所述佐劑的條件下針對所述表位產生的免疫應答相比增強至少1. 5、2、2. 5、5、10或者20倍。本領域可獲得在一組動物或人體中確定超過相應對照組的由佐劑產生的針對指定表位的免疫應答的統計學平均增強的檢測方法。所述佐劑優選能增強針對至少兩個不同表位的免疫應答。本發明的佐劑通常是這樣的化合物， 其對於哺乳動物是外源的，從而排除了哺乳動物內源的免疫刺激性化合物，如白細胞介素、 幹擾素及其它激素。
在進一步優選的實施方案中，藥物組合物進一步包含藥物可接受的載體。所述藥物組合物可進一步包含藥物可接受的穩定劑、滲透劑、緩衝劑、分散劑等。藥物組合物的優選形式依賴於指定的給予模式和治療應用。所述藥物載體可以是適於將活性成分即表位以及任選佐劑輸送至患者的任何相容的無毒性物質。對於鼻內輸送的藥物可接受的載體例如是水、緩衝鹽水溶液、甘油、聚山梨醇酯20、cremophor EL以及辛酸/癸酸甘油酯的水溶液混合物，且可以緩衝以提供中性PH環境。胃腸外輸送的藥物可接受的載體例如是無菌緩衝的0. 9% NaCl或者5%葡萄糖溶液，任選補加20%白蛋白。胃腸外給予的製備物必須是無菌的。胃腸外給予所述活性成分是根據已知方法進行，例如通過皮下、靜脈內、腹膜內、肌內、動脈內或者病灶內(intralesional)、鼻內、皮內注射或者灌注或者口服途徑。本發明的組合物優選通過推注形式給予。肌內注射的典型藥物組合物被製成含有例如I-IOml磷酸鹽緩衝鹽水和1-100μ g、優選15-45 μ g本發明的表位。對於口服給予，活性成分可以在液體劑型中給予，如酏劑、糖漿和懸浮液。口服給予的液體劑型可含有色素和調味劑以增加患者接受性。製備可通過胃腸外、口服或者鼻內給予的組合物的方法為本領域熟知且在多種資料中更詳細描述，包括例如在 Remington' s Pharmaceutical Science (15th ed.，Mack Publishing, Easton, PA, 1980)中描述(在此以其全部內容援引加入本文)。本發明表位的其它應用另一方面，本發明提供了本發明表位在評估哺乳動物免疫狀況中的進一步應用。 在這個方面中，包含病原體表位的混合物可以與來自所述哺乳動物的APC或者T細胞在體外保溫，使用本領域技術人員已知技術進行。評估哺乳動物免疫狀況優選是指評估所述哺乳動物是否已經感染指定的病原體或者評估給予的疫苗是否仍保護所述哺乳動物免於未來感染所述病原體。優選地，表位可以使用本文所述任何方法獲得。優選的表位和包含所述表位的優選的組合物已經在本文鑑別。所述T細胞激活或者與APC相關的表位的加工和識別的檢測可表明所述哺乳動物仍被保護免於所述病原體感染。特異性針對所述表位的T 細胞的激活可以在增殖測定中評估或者通過細胞因子或由這些T細胞產生的其它效應分子的增加而評估。每種這些方法均為本領域技術人員已知。所述應用也被命名為體外「保護相關性(CoP) 」。在本文及權利要求書中，動詞「包含」以其非限制性含義使用，是指包括該詞後面的項目，但是不排除未特別提及的項目。此外，動詞「由……組成」可以由「基本上由……組成」代替，是指如本文定義的產物或者組合物除了特別指出的成分之外還可包含另外的成分，所述另外的成分不改變本發明的特有特性。此外，以不定冠詞「一個」提及某元件時，不排除存在一個以上所述元件的可能性，除非特別明確限定有且僅有一個所述元件情況。不定冠詞「一個」因此通常是指「至少一個」。本說明書中引用的所有專利和參考文獻均以全部內容援引加入本文。如下實施例只是例證本發明的目的，而無以任何方式限制本發明範圍之意。附圖描述

圖1是在第一個實施方案中LCMS裝備的示意圖。圖2是在第二個實施方案中在LCMS裝備中用於電噴射的發射器及其與與電噴射組合使用的分析柱裝配的橫截面圖。圖3a_3d示出根據第二個實施方案製備端頭(tip)的方法示意圖。
圖4示出第三個實施方案的連接元件的橫截面圖。圖5示出填充分析柱的方法中一個步驟的橫截面圖。圖6示出填充分析柱的方法中的第二個步驟。圖7示出在第七個實施方案中捕獲柱的示意圖。圖8是由MHC I型或者MHC II型分子呈遞的T細胞表位的分配(allocation)的質譜識別模式的示意圖。圖9示出複雜樣品分析中LCMS技術的組合改良的用途。圖10示出在複雜樣品分析中高質量納級LC技術的結果。圖11示出來自人MDDC的MHC Iigandome的LCMS分析結果。圖12示出使用穩定同位素標記定向LCMS鑑別病毒感染相關的上調的MHC I型自身表位的結果。圖13示出使用穩定同位素定向LCMS鑑別複雜病原體全細胞製備物中病原體衍生的MHC II型配體的結果。圖14示出使用穩定同位素定向LCMS鑑別單一重組表達的蛋白質中病原體衍生的 MHC II型配體的結果。圖15示出使用穩定同位素定向LCMS鑑別細菌膜製備物中病原體衍生的MHC II 型配體的結果。圖16示出使用穩定同位素鑑別具有預料之外PTM的MHC II型表位的結果。圖17示出人MB71.5T細胞對於Ρ1.5-2，1(^ΠΡ1.7-2，4 「區域4」表位的差異識別。圖1-7的詳細描述圖1示意性示出LCMS裝備1的視圖。在左側示意性示出注射器閥2。閥2可以與連接泵優選混合泵的電源3連接。所述閥還連接包含注射環路(loop) 5的環路4。注射器閥可以進一步連接廢棄物出口 6和7及連接下一個閥的出口 8，所述下一個閥更具體地是在圖1右側示意性示出的所謂Deans閥10。所述閥的構造是使得液流的一部分分流到出口 8。Deans閥10用於轉換(switching)、分流及指導柱流進入分析柱11及最終進入質譜分析儀12。Deans閥使用簡單的6埠轉換閥遠程實現分流。柱頭壓(column head pressure)通過限流器(restrictor) 13的尺寸而產生。Deans閥進一步連接塞子14、15和廢棄物16、17。在一個實施方案中，LCMS裝置包括納級泵裝置。所述泵裝置包括泵並且能夠輸送 nl/min範圍的流速給持續變化的二元溶劑。在另一個實施方案中，使用常規高壓液相層析 (HPLC)泵。泵、優選HPLC泵或者二元泵或四元泵，應該能夠(i)以給定柱流速輸送線性和未延遲梯度或者精確梯度流(以精確及良好限定的比率混合至少兩種溶劑)，(ii)固相提取阱應該不負面影響(總體)分離效率；及(iii)在ESI界面的峰加寬應該不存在或者最小。非線性及延遲梯度可以由以相比於泵滯留體積(Vm)太低的流速(F)運行泵而導致。
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在一個實施方案中，納級LC泵用於本發明的LCMS裝置中。然而，它們很昂貴並且在非常低流速即低於30nl/min不能產生精確穩定的梯度。在一個實施方案中，所述泵裝置包括與分流裝置組合的泵優選HPLC泵，作為方便的方式以非常精確方式產生希望的混合溶劑系統的低流速。所述系統基於先前為氣相層析中所謂cutting而開發的遠程轉換機制，並且被稱為Deans轉換。在一個實施方案中使用 6埠轉換閥(稱為Deans閥)以遠程方式實現柱流分流和引導。希望的柱頭壓產生自置於捕獲柱上遊的限流器的尺寸(長度、內徑)和泵的初級出口流速。可以使用T連接器連接所述限流器和後續下遊柱。納級HPLC系統包括溶劑真空脫氣裝置，溶劑混合泵、優選四元混合泵、更優選高壓混合二元泵，能注射至少10 μ 1樣品體積的自動取樣器。優選地，所有連接管材具有小於 105 μ m、優選小於55 μ m、更優選小於30 μ m的內徑。所述管材由未去活化熔融二氧化矽製成。Deans閥10的分流及引導系統的一部分是位於兩個三向連接器20，21之間的捕獲柱19。所述捕獲柱包括靜止相床，包含大小至多5μπι的顆粒，所述靜止相床的尺寸為長度 5mm、優選至少10mm、更優選至少20mm，內直大約50 μ m。在一個實施方案中，LCMS裝置包括位於分析柱11上遊的固相提取(SPE)捕獲柱或捕獲柱19。捕獲柱可以與Deans閥10平行放置，其在文獻中也已知為Vented Column或 V-柱(Licklider et al. 2002)。捕獲柱能使得相對快上樣(轉移)相對大樣品體積進入納級LC柱。捕獲柱19的內徑應該與分析或分離柱11的內徑相稱。具有大內徑(ID)的捕獲柱19的使用導致捕獲的化合物由於流動相的線速度下降到遠低於大約lmm/s的最佳值而以相對寬條帶轉移到分析柱11。捕獲柱19中的流動相的線速度與柱/捕獲ID比率平方成比例，或者對於與以lmm/s線速度運行的50 μ m ID分析柱11組合的300 μ m ID和IOOymID捕獲柱19而言分別是0. 03和0. 25mm/s。另外，大ID 捕獲柱19導致顯著延遲，因為捕獲柱19和連接管材的空體積在洗脫過程可開始之前應該已經通過柱。在一個實施方案中，分析柱11可以包括靜止相床，其包含大小至多3μπι的顆粒， 所述靜止相床的尺寸為長度25cm、優選至少50cm、更優選至少95cm，內徑大約25 μ m。這個柱的末端與導電納米噴射端頭或者發射器對接，一個例子示於圖2 (具有大約25 μ m的內徑並且包含漸縮為在端頭的錐形末端內徑為3. 5 μ m的熔融二氧化矽管材)，根據本發明具有金-碳塗層。具有這種分析柱11的LCMS裝備可以以大約30nl/min的流速運行。高度推薦在分析肽樣品之前檢驗層析系統。在一個實施方案中，使用串聯質譜儀12。質譜儀能以至少10000FWHM的質量解析度運行。質譜應該以譜連續模式(profile continue mode)以至少0. 9秒/掃描的掃描速率獲得。質量測定的精確度應該是IOOppm或更好。樣品組分可以基於分析物的一些物理、化學或者其它特異性質如它們的分子大小、極性、電荷等分離。在一些實施方案中，幾種方法(幾種類型的層析)例如大小排阻層析、離子相互作用或者離子交換層析、特異分子相互作用(例如抗體-抗原)等組合在一起。若干這種層析方法也可以用於分級分離樣品。通過採用SCX層析作為第一維，其垂直於用作第二維的反相層析，分離效率顯著增加。在二維LCMS(2D-LC/MQ中的最佳表現在離線操作模式中獲得，因為其提供了在獨立優化兩個分離系統中的最高自由度，並且其排除了有關分離效率的任何危害。SCX層析對於除去可能仍存在於肽樣品中並且可能在肽洗脫期間有幹擾作用的任何殘餘去汙劑或緩衝液成分是重要的。這些化合物可以從SCX柱中在空體積中洗脫，因此將出現在通常不含肽的最早級分中。LC柱的分離效率可以表示為在單次運行中可分離的組分數目(即峰值容量)。柱分離效率是柱長度(L)和塔板高度(plate height, H)的商。根據Van Deemter (Van Deemter et al. 1956)，理論塔板高度(H)成比例地依賴於靜止相顆粒的顆粒大小(dp)。塔板計數的另一個參數是流動相流速，其是具有最佳線速度 (接近lmm/s)的組合的線性和雙曲線函數。在一個實施方案中，柱頭壓被控制以使得流動相具有大約這個值的線性速度。LCMS裝備是本領域技術人員已知的，並且他了解各種替代裝備是可能的這一事實。圖1示出的裝備僅僅是許多可能裝備之一的例子。圖2示出發射器30的端頭，發射器30是示意性示出的電噴射離子化單元500的一部分。由虛線示出的單元500包括電源501連接502至發射器30，特別是連接至塗層。發射器30用連接器32連接至分析柱31的末端。連接器32僅示意性示出。圖2 示出連接至柱31的末端33的發射器30的橫截面。在該特異實施方案中，發射器30和柱末端33之間的連接是對接。在再一個實施方案中，使用金剛石切割器製備柱31的遠端末端33和發射器30的近端末端34以使得在柱和端頭之間有合適的對接。柱31的外徑36優選在200-800 μ m範圍。管材可包括熔融二氧化矽。在熔融二氧化矽管材中，形成內腔37， 其具有內徑38，優選在大約10 μ m至大約200 μ m範圍，更優選在15 μ m和50 μ m之間。發射器30包括連接至柱末端33的近端末端34和具有錐形形狀的遠端末端39。 錐形末端39具有減小的外徑和減小的內徑。在圖3a_3d中，提供了製備發射器30的端頭的方法的例子。在圖3a所示第一步中，例如使用丁烷火炬(butane torch)44(至少部分)除去熔融二氧化矽管材43的塗層 42。在接下來的步驟中，熔融二氧化矽43的加熱末端46 (通過圖北示意性示出的手段) 在方向45拉伸，導致發射器30在所述方向被拉伸或者拉長。管材被擠壓，減小內腔並最終閉合其。然後在所述熔融二氧化矽管材外表面上提供塗層47，使電流導電到達其錐形末端46以允許電噴射操作。端頭靠近其錐形末端46的內徑41優選在大約2-30 μ m、更優選 3-10 μ m範圍。較小的內徑將進一步增加後續質譜分析的靈敏性。在圖3c中，示出上面提到的塗層施加於端頭上。在一個實施方案中，包括貴金屬如金的第一塗層施加到端頭46上。然而，已經示出金塗層在電噴射期間惡化並且不能長期提供連續的電傳導。替代或者額外地，碳基傳導性塗層被施加於端頭46上。這個塗層可以通過噴射過程施加於端頭上。在一個實施方案中，用氣溶膠或者蒸氣沉積法沉積碳。碳顆粒可以懸浮於異丙醇中。在根據本發明的一個實施方案中，施加塗層的步驟可以重複一次或一次以上。在一個實施方案中，多個塗層被施加於每個上面。優選地使用塗層組合塗覆端頭。在一個實施方案中，首先施加金塗層然後是碳基傳導性塗層。在再一個實施方案中，首先施加金塗層，然後所述金塗層被一層碳基傳導性塗
21層覆蓋。所述一層碳基傳導性塗層通過製備懸浮於Iml異丙醇中的50mg的Leit-C 碳顆粒並且將其噴射在發射器上(即在端頭上)而施加。Leit-C-plast 是具有高電導率和永久可塑性的粘合劑並且可得自 Electron Microscopy Sciences (EMS)，Hatford，UK。在一個實施方案中，傳導性氧化抗性材料被用作在端頭錐形末端金塗層上面的進一步的塗層。在一個實施方案中，使用碳基傳導性塗層。在另一個實施方案中，使用矽合金。在再一個實施方案中，導電聚合物被用作本發明的塗層或者用作額外塗層。所述額外塗層可以粘附於金塗層。所述額外塗層提供保護。在一個實施方案中， 塗層被噴射在發射器的錐形末端上。在另一個實施方案中，氧化抗性塗層施加於錐形末端上。合適的溶劑如異丙醇用於噴射。在另一個實施方案中，待噴射在發射器錐形末端上的漿液含有在Iml異丙醇中的30-70mg、在一個優選的實施方案中45_55mg的傳導性碳膠合物 (cement)0在圖3d中所示的後續步驟中，發射器30的閉合末端48用切割器49例如金剛石切割器除去。切割導致發射器30具有減小的內徑的錐形末端39。擠壓管材43及在管材 43的自由末端施加拉力的組合效果產生內徑的平穩減小。在一個實施方案中，用於熔融二氧化矽管材的連接器用於連接捕獲柱和/或分析柱的各自部分。在LCMS裝備中，使用三向連接器或者T-連接器連接柱或閥。在現有技術中，使用Upchurch 三向連接器(在現有技術中已知為through-hole union，來自Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA)。優選地，具有外徑和內徑、內徑限定一個腔的由熔融二氧化矽組成的管材用這種連接器連接。在一個優選的實施方案中連接器是through-hole連接
ο在一個實施方案中，LCMS裝置包括具有25 μ m內徑的納級柱。在使用肽的應用中， 這些肽以具有典型地1納升或更少體積的濃縮條帶遷移通過這種柱。在另一個實施方案中，提供了缺乏死體積的用於納級管材的連接器，它們優選地適於在超過400巴(即^104kPa)壓力下使用。在一個實施方案中，連接器是適應的Upchurch through-hole T-連接器。在一個實施方案中，T-連接器包括至少一個、可能兩個卡套(ferrule)、優選三個卡套。管材、特別是微毛細(microcapillary)納級柱可以被接納在卡套的腔內。這使得管材裝備在連接元件的內體積中。卡套腔是合適大小的。卡套腔是通過腔(through cavity), 具有通常等於或接近於待接納在卡套腔中的管材的外徑的內徑。卡套腔與插入管材的管材的外徑具有摩擦性接觸。與連接器組合的卡套用於將管材的腔與連接元件的腔對準(align)。連接元件包括用於安裝卡套的接納腔(receiving cavity)，其中安裝腔(fitting cavity)和卡套配合併且是可斷開的。在連接狀態，卡套將具有內腔的管材相對於連接元件內腔定位。優選地，連接元件包括兩個卡套安裝腔組合。在目前Upchurch設計中，連接器的內體積包括死體積。相對目前Upchurch設計，內腔被擴大很多。這與本領域技術人員的已知技能是相反的。圖4示出圖1裝備1的三向連接或轉換元件20，21的細節。該圖不是按比例的。更特異地，所示元件的直徑比率不限於所示比率。三向連接元件20包括3個卡套51-53。所述卡套是適合在三向連接器20的三個末端的接納腔中的物體。在一個實施方案中，所述三個卡套具有不同大小。適合的卡套可以由於其形狀基本上相應於腔的形狀而在腔中自身對準。更特異地，在所示實施方案中，所述卡套可以具有相應於腔的圓錐形式的圓錐形式。自身對準將使得卡套的接納腔進入相對於連接元件20的預定位置。卡套51-53可包括腔。管材M-56的外徑和腔的內徑相適合以使得卡套在其腔中接納任何管材討-56。卡套51-53示出在連接狀態，接納在連接元件20，21的相應腔中。提供了帽 (cap) 57-59，所述的帽包括固定系統(未示出細節)以將帽57-59固定到連接器上並由此固定卡套51-53的位置。在一個實施方案中，固定系統包括鎖閉系統(locking system)，例如螺釘樣連接(screwlike connection)。固定系統還可以構造並設置用於固定和夾緊卡套51-53在連接狀態，導致夾緊力施加在管材M-56的外徑上。這導致管材M-56被鎖定在它們各自位置。連接元件20、卡套51-53和帽57-59可以用各種製造技術製造，特別是通過注塑製造。管材M，56在這樣的狀態，其中它們被接納在卡套中，卡套連接至連接元件，基本上對準。這意味著管材M，56的內腔也基本上對準。在另一個實施方案中，連接元件的內體積、優選連接器的T-body的內體積與用於接納管材的卡套的腔對準。在這種修改的連接元件中，優選其中連接元件的內體(inner body)的一部分已經通過鑽進除去的Upchurch元件，現在提供了一種連接元件，其使得管材對準連接元件的兩個各自橫向末端並且管材的位置是它們的末端對接在連接元件內，連接元件位於連接器優選三向連接器的內腔中。在所示實施方案中，熔融二氧化矽M，56的末端60，61已用金剛石切割器切割以得到直切口，使得管材M，56與連接狀態的卡套51，53對接。這防止在連接元件20本體內存在死體積。儘管是對接連接，來自管材M，56內的液體仍可以通過對接末端洩露，使得液體穿過管材55。在另一個實施方案中，連接元件包括固定元件用於將卡套相對於連接元件固定。 在一個實施方案中，固定裝置包括夾緊裝置。在一個實施方案中，夾緊卡套會導致夾緊管材在被接納在卡套中的位置。構造和設置固定裝置以固定管材以及卡套在相應位置。在再一個實施方案中，兩個管材連接在三向連接器中，其中連接元件的入口和出口呈一直線，第三個連接器垂直於這條直線連接。管材呈對接位置，這個對接連接不是必須在連接管材的精確正中，因為第三個連接器具有連接通道，洩露體積由於在液相層析中使用的高壓能夠到達這個連接通道。圖5和圖6顯示壓力容器或bomb 70。bomb 70可以含有層析顆粒的懸浮液，優選含有懸浮的層析靜止相的小瓶。在一個實施方案中，管材被加熱，例如通過將管材置於溫度編程烘箱中加熱。優選使用編程溫度。在一個實施方案中，初始溫度設為30°C，持續5分鐘，隨後在15分鐘內增加至100°C，這個溫度保持5小時。隨後，玻璃料和管材被冷卻至環境溫度。之後，硬化的玻璃料和熔融二氧化矽被冷卻至室溫。接著，用熔融二氧化矽切割器修剪所形成的陶瓷玻璃料至長度大約為l_2mm。優選使用直切口。在另一個實施方案中，通過填充柱而製造和提供納級LC柱。填充柱的方法包括在熔融二氧化矽(FS)管材中製備保留顆粒的玻璃料(a particle retaining frit)。切割所述管材以具有希望的長度。在一特異實施方案中，提供了比率為90/10(v/v)的矽酸鉀溶液 (本文也稱為KASIL)與甲醯胺的混合物。劇烈振蕩所述混合物。在一個實施方案中，使用渦旋混合物例如10秒渦旋。優選地在其後立即將熔融二氧化矽浸入這個混合物一段短時間(不是關鍵的，例如1秒)以使得一段幾釐米長的所述混合物被吸入管材中。在一個實施方案中，填充LC分析柱包括將被提供有玻璃料的熔融二氧化矽管材裝配在壓力容器(bomb)中。所述壓力容器可以含有希望顆粒的漿液。優選地，使用卡套將所述的管材裝配到所述壓力容器。優選地，使用本發明的連接部件將管材連接在壓力容器中。優選地，使用振動元件(vibrating element) 74使整個柱振動。在本發明方法的一個實施方案中，在柱長度上的至少兩個位置振動柱。在一個實施方案中，使用至少兩個頻率優選超聲頻率進行振動。在特異的實施方案中，熔融二氧化矽柱的熔成玻璃料的末端被置於超聲浴(例如 Branson 200)中。在再一個實施方案中，僅在固相顆粒被衝入熔融二氧化矽柱中之後進行
超聲處理。在填充柱的方法的一個實施方案中，使用高度濃縮(稠)的漿液。使用漿液是填充窄(25 μ m ID)且長柱的最方便方式。在一個實施方案中，漿液含有至少150mg懸浮於Iml丙酮中的反相顆粒。在填充期間丙酮相對於異丙醇通過柱的線性速度是令人驚訝的7士 1倍。在製造填充柱的另一個特異實施方案中，熔成玻璃料的FS管材通過具有0. 5mm孔的卡套放置於(frit up)壓力容器中希望顆粒的漿液中。卡套與所述容器連接。接下來， 裝配在例如氦氣缸上的減壓器的第二級壓力被調節為大約50巴並例如通過開啟閥(例如 Swagelok SS-41GSX2閥)而將所述壓力施加於bomb。一旦柱準備好，則用雙目鏡0 )目視檢查填充緊密性。在使用前，用HPLC泵以 250巴壓力用乙腈/水(85/15，ν/ν)加0. IM乙酸衝洗柱。優選柱在使用前測試。可以檢查柱的背壓(巴/cm)。將一插套(內徑0. 4mm)置於柱的熔成玻璃料的末端。測量插套中彎月面的位移(mm) 1分鐘。體積根據如下得出流速(nl/min)=位移(mm) χ 100 (n 1/mm)。讀出泵的壓力並計算橫過柱的標準化壓降(Pb，巴/cm柱長度)Pb =[時間 / 體積]χ [ (ID/50) 2X125] xP/L其中「時間」是以分鐘表示的流量計量時間，「體積」是以nl表示的收集的體積， 「ID」是以ym表示的柱內徑，「P」是以巴表示的流量計量期間柱頭壓，「L」是以cm表示的
柱長度。提供了熔融二氧化矽管材71，在管材71的一個末端形成多孔陶瓷玻璃料72。另一末端連接於高壓容器70。所述高壓將部分懸浮顆粒帶入腔。在顆粒流動進入腔期間，可以使用超聲振動元件74振動柱或者柱71的部分以防止在顆粒中形成空體積。在一個實施方案中，振動元件74置於靠近柱中的材料阻塞的位置。當發生下遊阻塞時，柱可以被提起來到漿液外(但仍在容器中)並且衝出液體至乾燥。隨後，將FS放回漿液中，重新開始填充過程直至獲得希望的床長度。圖7示意性示出待與本發明的實施方案之一組合使用的液相層析應用的二維。作為第一維，使用強陽離子交換(SCX)及在示出的實施方案中使用SCX與弱陰離子交換(WAX) 樹脂的混合床。如Motoyama所述的(Motoyama et al. 2007)陰離子和陽離子交換顆粒的混合床是優選的。第二維可以是所示出的C18反相(RP)層析。SCX和反相層析的相容性差，特別是結合使用陽離子溶劑、緩衝液或者介質時。根據本發明的一個實施方案，使用溶劑介質81如甲酸或者鹽酸(HC1)。儘管這些介質的洗脫強度較低，但是特別是甲酸顯示出回收結合在陰離子-陽離子交換(ACE)樹脂上的肽的高效率。在一個實施方案中，蛋白酶解消化的蛋白質的多維LCMS/MS分析，其中SCX分級分離與RP分離結合使用。這些分析技術聯用以增加分離效率和分析的動力學範圍。在一個實施方案中，提供了在線多維LC方法，其使用陰離子和陽離子交換顆粒的混合床作為第一分離維。在一個實施方案中，使用根據Motoyama (Motoyama et al. 2007)的混合離子交換床。在LCMS裝置的一個實施方案中，樣品以在線方式分級分離。優選地，在LCMS裝置中構造並設置二維層析。優選地所述分離機制的至少一種使用樣品組分的疏水性質。在再一個實施方案中，所用的分離機制的至少一種是SCX，其優選用於分級分離HLA-DR洗脫樣
P
ΡΠ O在一個實施方案中，使用正交分級分離。在一個優選實施方案中使用SCX分級分離。在一個組合裝備中，總分析時間可以容易地增加典型15倍。SCX維可以以在線及離線方式使用。 SCX樹脂包含顆粒表面具有強負電基團的顆粒，使得結合帶正電分子。SCX樹脂能夠保持(保留/結合)帶正電肽。通常，結合分子通過用增加強度的合適陽離子鹽水溶液的(連續/非連續)梯度衝洗樹脂來置換/洗脫而釋放/回收。因為梯度，僅鬆散結合的分子會比強結合分子走得更快。這導致複雜樣品的希望的分離。第二維可以是反相層析。在一個實施方案中，第二個分離步驟優選包括C18 RP層析。在一個實施方案中，LCMS裝置的C18反相包括混合陰離子和陽離子交換固相提取捕獲柱。SCX和RP分離之間的正交性是由於SCX使用靜電相互作用保留肽這一事實。在實踐中，SCX肽分離中的保留是靜電(主要)和疏水(次要)相互作用的組合，後者由磺醯基聚合物主鏈的疏水性質產生。這種「混合模式」性質已被認識到是SCX可以分離具有相同淨電荷的結構相似肽的原因之一。離子交換(IEX)和RP分離之間的正交性是基於靜電相互作用和疏水性。在實踐
25中，IEX肽分離中的保留是靜電(主要)和疏水(次要)相互作用的組合，後者由與在二氧化矽顆粒表面性質的矽烷醇基的疏水相互作用產生。這種「混合模式」性質已被認識到是 IEX可以分離具有相同淨電荷的結構相似肽的原因之一。優選地，LCMS方法包括使用弱陰離子交換(Poly WAX LP , The Nest Group, Inc. 45 Valley Road Southborough, MA 01772-1323，本文也稱為 WAX)分級分離的步驟。 在一個優選實施方案中，WAX顆粒包括一層交聯塗層，所述塗層包含正陽離子顆粒。更優選地，WAX顆粒包括與線性聚乙烯亞胺交聯的基於二氧化矽的材料。LCMS裝置優選包括ACE固相提取柱作為回收結合的肽的第一維。在一個實施方案中，SCX中的肽洗脫可以用揮發性有機鹽如醋酸銨實現。在醋酸中的醋酸銨已被提議為用於從ACE柱分離肽的合適溶劑介質。圖8是用於由MHC I型或MHC II型分子呈遞的T細胞表位的分配的質譜識別模式示意圖。上圖MHC I型相關肽通過它們的二項式質譜同位素分布而鑑定，所述分布是由於摻入天然和同位素標記的胺基酸殘基(在感染期間以等摩爾量存在於培養基中)所致。 自身肽的上調程度可以基於天然表位的單一同位素質量(m)和單標記表位的單一同位素質量(m+Δ)的強度比率而計算。對於從頭合成的蛋白質和病原體來源的蛋白質，理論同位素模式將顯示精確的二項式分布。含有至多2個標記的胺基酸殘基的表位的理論同位素分布模式在上圖中給出，上圖為自身肽的未改變的表達及上調5倍、20倍和100倍的表達以及針對從頭合成的上調的自身肽或者感染後的病毒肽。下圖源自病原體的MHC II型相關肽可以無疑義地與自身肽區分，基於實驗方法II中描述的其特徵性質譜雙峰。圖9示出來自衍生自MV感染的WH細胞的未分級分離的HLA-A2 Iigandome的LCMS 基峰離子示蹤，所述示蹤採用如實驗方法I所述的標準LCMS技術後獲得(上圖)以及採用平臺LCMS技術後獲得(下圖)。圖10示出高質量納級LC技術在複雜樣品分析中的應用。使用不同梯度譜在90cm 長C18柱(50μπι ID,df = 5ym)上分離胰蛋白酶化肽，所述梯度譜範圍為2%/min有機改性劑乙腈(上圖)增加至6.7%乙腈/小時(中間圖)及至4%乙腈/小時(下圖)。半最大峰寬(peak-width-at-half-maximum) (FffHM)從3增加至大約30秒。峰容量從陡梯度中的大約300(上圖)增加至緩梯度中的大約900(下圖)。增加工作循環(作為運行時間百分比的洗脫窗)和MS源中化合物的擴大存在使得可以對低豐度肽進行深入的數據依賴性多級LCMS分析(即肽挖掘(ρ印tide mining) )0對於圖11，來自人MDDC的複雜MHC II型Iigandome在分別用3_ μ m和5_ μ m C18顆粒填充的25-μπι ID柱(圖Α，基峰離子示蹤)和50-μ m ID柱(圖B，基峰離子示蹤)上用相同梯度斜率分析。固相參數確定在MHC II型ligandome分析中的LCMS性能。 25-μ m ID柱顯示在靈敏性和峰解析度方面顯著改善的LCMS性能。圖C和D詳細示出分別在25-μπι ID和50-μπι ID柱上這個樣品中兩個同重肽(即不相同的肽序列，但是具有相同的質量[Μ+2Η]2+ = 615. 4Da)的LC性能差異。對於圖12，對分離自在用流感病毒感染後的人MDDC的HLA-A2 ligandome以及如實驗方法I (方法C)所述使用穩定同位素標記的胺基酸進行LCMS分析。上圖顯示通過幾乎二項式分布的同位素模式示出的帶2電荷的上調的表位。三個標記殘基摻入表位中。在 m/z 573.3Da(下圖)獲得的這個肽的MS/MS譜揭示肽序列(基於y_型離子系列及精確質量測定)為VVSEVDIAKAD。這個特定實驗已在感染期間用亮氨酸(L)、纈氨酸(V)和甲硫氨酸(M)作為培養基中的標記殘基進行。這個肽中的三個標記殘基全部是纈氨酸(V)。這個表位的上調程度可以基於在m/z 573. 306Da的天然表位的單一同位素質量m與在m/z 576. 313Da的單一標記的異構體的單一同位素質量[m+3]的質譜強度比率而計算(見實驗方法I)。對於這個特定表位，由於流感病毒感染導致的上調程度等於16。
對於圖13，對分離自如實驗方法II (方法D)所述用14N-和15N-標記的百日咳博德特氏菌全細胞製備物脈衝後的人MDDC的HLA-DR2 Iigandome進行LCMS分析。上圖顯示ESI質譜，含有在m/z 788. 94Da和797. 42Da的帶2電荷的質譜雙峰。插圖示出去卷積 (deconvoluted)質譜，表示含有17個氮原子的候選百日咳博德特氏菌肽。所述MS譜符合使用穩定同位素方法的細菌來源表位正分配(positive allocation)的一般標準(見文字)。下圖顯示在m/z 788. 94Da的這個肽的去卷積MS/MS譜，揭示推定的周質蛋白(登錄號CAE43606)來源肽AAFIALYPNSQLAPT序列(b_型離子系列)。對於圖14，對分離自如實驗方法II (方法E)所述用14N-和15N-標記的百日咳博德特氏菌rP. 69 Prnl脈衝後的各種人MDDC的異質混合物的HLA-DR Iigandome進行LCMS 分析。上圖顯示ESI質譜，含有在m/z 770. 43Da和780. 39Da的帶2電荷的質譜雙峰。插圖示出去卷積質譜，表示含有20個氮原子的候選rP. 69 Prnl來源肽。所述MS譜符合使用質量標記輔助方法rP. 69 Prnl來源表位正分配的一般標準(見文字)。下圖顯示在m/z 770. 43Da這個肽的去卷積MS/MS譜，揭示rP. 69 Prnl來源肽LRDTNVTAVPASGAPA序列(b-型離子系列)。對於圖15，對分離自如實驗方法II (方法F)所述用不同的14N-和15N-標記的腦膜炎奈瑟氏球菌OMV製備物脈衝後的人MDDC的HLA-DR1/P1. 7-2,4和HLA-DR2/P1. 5-2,10 Iigandome 進行 LCMS 分析。在圖 A 的 HLA-DR1/P1. 7-2，4 樣品及圖 B 的 HLA-DR2/P1. 5-2,10 樣品的Iigandome中通過檢索算法均檢測到譜雙峰。MS測序鑑別了 Pl. 7_2，4衍生的表位 SPDFSGFSGSVQFVPIQNSK (圖 B)及其 Pl. 5-2，10 同系物 SPEFSGFSGSVQFVPAQNSK (圖 D)。在這些表位的第3位和第16位的殘基是菌株特異性的。所述LCMS譜符合使用質量標記輔助方法(實驗方法II)的細菌來源表位的一般標準。另外，在每個表位中所含的氮原子數可以從LCMS譜中推導出。在圖A中所述帶2電荷質譜雙峰(Δ = 12Da)和在圖B中所述帶3 電荷質譜雙峰(Δ = 8. ODa)之間的質量差異顯示每個表位含有24個N原子。事實上，兩個鑑別的表位均符合這些數據。對於圖16，對分離自如實驗方法II (方法F)所述用14N-和15N-標記的腦膜炎奈瑟氏球菌P1. 7-2，40MV製備物脈衝後的人MDDC的HLA-DRl 1 igandome進行LCMS分析。作為代表區域8的一組長度變體之一，鑑別了腦膜炎奈瑟氏球菌P. 1-7-2，4來源表位 IGNYTQINAASVGL(圖A和C)。在這個天然表位的豐度，檢測到一個帶2電荷質譜雙峰， 代表不規則Pl. 7-2，4衍生表位，其顯示出與天然表位的令人驚訝的相似性，除了 C末端胺基酸殘基僅+IDa不同。IGNYTQINAASVG-[+114Da](圖B和D)(注意該不規則表位中所含的病原體衍生的氮原子數根據其離子對推導是18，與天然表位的17不同)。結果，非天然表位(D)的完整y_型離子系列與天然表位(C)相比位移+IDa，而b-型離子系列保持未變。 所述雙峰的重離子和輕離子的集合y-和b-型離子系列表明這個非天然表位是病原體衍生蛋白質的蛋白質剪切事件及隨後同一個Pl. 7-2，4分子的不同片段的分子內連接的結果，導致產生剪接的MHC II型配體。圖17示出人MB71.5 T細胞對Pl. 5-2，10和Pl. 7-2，4 『區域4，表位的差異識別。八僅871.51~細胞，在用重組？1.5-2，10蛋白體外再刺激(2x)來自供體MB71的PBMC 後產生，在用合成肽 PEFSGFSGSVQFVPAQNS (S011-24)和 SGSVQFVPAQNSKSAYTP (S011-25) 脈衝的自體PBMC存在下增殖，但是用PDFSGFSGSVQFVPIQNS(S004. 29)或 SGSVQFVPIQNSKSAYTP (S004. 30)不增殖。B :MB71. 5T細胞僅識別在「區域4〃序列的C末端部分表達丙氨酸(A)的PorA變體，即Pl. 5-2，10，Pl. 5-1，2-2和Pl. 22，14，但是不識別在該位置表達異亮氨酸(I)的變體，即Pl. 7-2,4, Pl. 7，16和Pl. 19，15 (見結果部分文字)。
實施例 實驗方法I :MHC I 型 Iigandome麻疹病毒、流感病毒和呼吸道合胞病毒將Edmonston B株系的噬斑純化的麻疹病毒(後文稱作MV)在Vero細胞中生長。 流感病毒(A/Wisconsin/67/2005株)在MDCKl細胞中生長。噬斑純化的呼吸道合胞病毒 (RSV-A2 no. VR-1302，ATTC)在 h印-2 細胞中生長。人B細胞系冊和MB02及人單核細胞衍牛的樹突細胞將表達HLA-A*0201的EBV轉化的B細胞系WH和表達HLA_A*0201，_B*0701的^V 轉化的B細胞系MB-02在補加抗生素和5%胎牛血清(後文稱作FBS，Harlan，USA)的RPMI 1640培養基中培養。人單核細胞衍生的樹突細胞(後文稱作MDDC)根據Sal lusto (Sal lusto et al. 1994)所述程序進行培養。簡而言之，通過對從HLA-A*0201，_B*0701純合血液供體中知情同意獲得白細胞除去法暗黃覆蓋層的Iymphopr印(Axis-shield，Norway)進行密度離心新鮮分離1 X 109PBMC。將PBMC以5xl06/ml密度種植在溼化保溫儀中的150_mm組織培養皿(Corning Costar，USA)中在37°C、5% CO2條件下培養2小時，所述培養皿中具有補加抗生素(GibcoBRL，USA)和 FBS 的 Iscove，s Modified Dulbecco' s 培養基(GibcoBRL, USA)。在除去未粘附的級分之後，將粘附細胞在含有抗生素、FBS、500U/ml重組人 GM-CSF (PeproTech,USA)和 250U/ml 重組人 IL_4 (Strathman Biotech, Deutschland)的培養基中進一步培養6天。在第3天更換培養基和生長因子。在第6天，MDDC準備好進行病毒感染。在病毒感染之前和之後，將1 %等份的MDDC通過流式細胞計量術鑑定，以證實MDDC 的純度以及成熟(數據未示出)。肽合成使用SYRO II 同時多個肽合成儀(MultiSyntech GmbH, ffitten, Germany)通過固相FMOC化學製備合成的肽標準物。所述合成的肽的純度和性質通過反相高效液相層析 (HPLC)評估。實驗方法A、A』、B、C和C』使得人細胞批次表達病毒感染相關的MHCI型 Iigandome0在方法A中，使用IO7組織培養感染劑量5(1/ml MV原種在含有抗生素和1 % FBS的 RPMI 1640培養基中感染2 X IO9WH細胞的B細胞批次2小時，感染複數(後文稱作m.o. i.) 為0.5。之後，洗滌細胞並生長40小時以使得MV相關的MHC I型Iigandome表達。製備2X109未處理的WH細胞的另一細胞批次，在標準培養基中培養之後表達對照MHC I型 ligandome。在分別製備和分析MHC I型Iigandome之前收穫這兩個細胞批次，洗滌、計數、 沉澱、速凍及貯存在_70°C。相似地，在方法A』中，使用IO8組織培養感染劑量5(l/ml流感病毒原種在含有抗生素和1 % FBS的RPMI 1640培養基中感染3. 5xl08MB_02細胞的B細胞批次1小時，感染複數(後文稱作m. ο. i.)為5。之後，洗滌細胞並使其生長另外9小時以使得流感病毒相關 MHC I型ligandome表達。在製備和分析MHC I型ligandome之前，收穫該細胞批次，洗滌、 計數、沉澱、速凍及貯存在-70°C。
在方法B中，IO7組織培養感染劑量5(1/ml MV用於在含有抗生素和1 % FBS的 RPMI-1640培養基中感染1.5X109WH細胞的B細胞批次2小時，m. ο. i.為0. 5。隨後將這些細胞保溫40小時以使得病毒感染相關的MHC I型ligandome在RPMI-1640培養基中表達，所述培養基中無L-亮氨酸和L-甲硫氨酸(Invitrogen)，補加5% FBS，而且對於 50%標準濃度的L-亮氨酸和L-甲硫氨酸補加穩定同位素標記的胺基酸13C6-L-亮氨酸和 13C5Z5N1-L-甲硫氨酸(每個胺基酸與其未標記的輕同位素相比質量增加6Da ；Cambridge Isotope Laboratories)，對於另外50%補加未標記的胺基酸L-亮氨酸和L-甲硫氨酸 (Sigma-Aldrich)。這些胺基酸是HLA-A2配體的主要錨殘基。含有5% FBS和100%未標記的胺基酸的RPMI-1640培養基用於製備另一批次1.5X IO9未感染的WH細胞。在製備和分析MHC I型ligandome之前，收穫這兩個細胞批次，洗滌、計數、以1 1細胞比率混合， 然後沉澱為一個單一細胞批次、速凍及貯存在-70°C。在方法C中，使用7 X IO7噬斑形成單位/ml流感病毒感染2. 2 X 107HLA_A*0201純合MDDC細胞批次4小時，m. ο. i.為2。隨後將這些細胞保溫40小時，使得病毒感染相關的 MHC I型ligandome在RPMI-1640培養基中表達，所述培養基中無L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-纈氨酸(Invitrogen)，補加5% FBS，而且對於50%標準濃度的L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-纈氨酸補加穩定同位素標記的胺基酸13C6-L-亮氨酸、13C5,15N1-L-甲硫氨酸和13C5, 15N1-L-纈氨酸(每個胺基酸與其未標記的輕同位素相比質量增加6Da ；Cambridge Isotope Laboratories)，對於另外50%補加未標記的胺基酸L-亮氨酸、L-甲硫氨酸和L-纈氨酸 (Sigma-Aldrich)。製備另一 2. 2 X 107HLA_A*0201純合MDDC細胞批次，在標準培養基中培養之後表達對照MHC I型ligandome。在製備和分析MHC I型ligandome之前，收穫這兩個批次細胞，洗滌、計數、以1 1細胞比率混合，然後沉澱為一個單一細胞批次、速凍並貯存在-70°C。相似地，在方法C』中，使用噬斑純化的呼吸道合胞病毒感染 2. 5X107HLA-A*0201，-B*0701純合MDDC細胞批次3小時，m. o. i.為5。隨後將這些細胞保溫48小時，使得病毒感染相關的MHC I型ligandome在完全RPMI-1640培養基中表達。在製備和分析MHC I型ligandome之前，收穫細胞批次、洗滌、計數、沉澱、速凍並貯存在_70°C。MHC I 型 ligandome 的分離將根據實驗方法A、A』、B、C或者C』生長的細胞批次解凍及裂解，以使MHC I型分子溶解，隨後分離病毒感染相關的MHC I型ligandome。簡而言之，將細胞在含有1 % CHAPS(Roche)和蛋白酶抑制劑的pH = 8. 0的TRIS-HCl緩衝液中裂解。離心後，將上清相繼經過三個CNBr-激活的TRIS-封閉的瓊脂糖柱第一個非免疫球蛋白結合的柱(即預清除柱(preclearU)、第二個結合正常小鼠免疫球蛋白(即預清除柱2)以及第三個結合特異於人MHC I型分子的特異性小鼠抗體(即清除柱)。在一個實例中，使用與HLA-A2分子 (克隆BB7. 2)反應的小鼠抗體；在另一個實例中，使用與HLA-B分子(克隆Bi. 23. 2)反應的小鼠抗體。保留在清除柱上的MHC I型分子及相關的肽用10% (ν/ν)乙酸洗脫，並經過 10-kDa分子量截斷值濾膜。使用真空離心使濾物濃縮為士 10μ1，隨後在5%甲酸和5% 二甲亞碸中重建至終體積為100 μ 1，在-70°C溫度下貯存直至進行分析。將所述肽混合物摻加已知量的兩種合成的肽標準物(血管緊張素-III和催產素，Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)以校準在隨後的樣品處理期間的樣品損耗。標準LCMS技術
通過納流(nanoflow)液相層析結合電噴射離子化質譜分析(後文稱作LCMS)分析肽樣品。將代表士 IO9B-細胞或者1-2 X IO7MDDC的等份肽樣品加樣於標準納流LC柱轉換系統C18前置柱中，通過標準MicroTee管狀元件相繼連接20-cm長分析柱，所述分析柱內徑(後文稱作ID)為50 μ m，充填5- μ m C18顆粒。使用的流動相是線性梯度，流速為125nl/ 分鐘的乙腈，在55分鐘內從僅100% A (水+0. I-M乙酸)至在A中僅60%乙腈+0. I-M乙酸。柱端頭用金塗層，柱頭壓為150bar。在質譜分析儀(Q-TOF，Waters Corp.)上以每秒 「質量與電荷比率」(後文稱作m/z)記錄質譜，至少10，000半峰全寬(Full Width at Half Maximum)(後文稱作FWHM)的分辨超過300-1，500Da (MS分析)。對於候選病毒感染相關的MHC I型表位的MS測序(MS/MS分析)，主要使用隨後的肽樣品等份，MSl分析的周期與預選質量或者質譜分析儀中洗脫時間最富集的質量的碰撞誘導斷裂的周期交替。MS/MS譜在掃描速度lsec/scan、質量範圍50_2，OOODa及質量分辨為5，OOOFffHM的條件下獲得。最佳碰撞能量主要依賴於表位的性質和所用質譜儀的類型，且在這些實驗中優化。對MS/MS譜的解釋通過人工或者使用軟體工具解釋，例如 Mascot(Perkins et al. ,1999 at www. matrixscience. com, Matrix Science Ltd., London UK)>ProteinProspector(www. prospector, ucsf. edu,University of California, San Francisco, CA, USA)、Biofforks (Thermo Scientific, ffaltham, MA, USA)禾口 / 或 ProteinLynx (Waters Corp.，Milford, MA, USA)。對於鑑別的表位的半定量，相關應答因數通過將鑑別的表位的合成類似物的強度量除以標準肽血管緊張素-III和催產素的平均強度量而計算。這些因數隨後用於對在細胞批次中存在的天然表位的數目進行半定量。候選MV相關的MHC I型配體的鑑別在方法A中，對比衍生自MV感染的和未感染的WH細胞的MHC I型Iigandome中的MS離子示蹤，質量對質量。對於此的標準程序是使用在兩個樣品中均存在的富集肽離子評估在μ LC保留時間內發生的微小改變。對僅在感染的WH細胞中出現的肽質量進行測序
及半定量。在方法B和C中，基本質譜信息(由「質量值」和「強度值」定義)從得自MHC I型 Iigandome的MS譜中提取並用於算法搜索。首先，基於如下各項計算模擬的同位素模式 (i)使用的穩定同位素標記的類型和數目，(ii)這些穩定同位素的天然發生率，(iii)推測的摻入表位中的標記的胺基酸的最大數目，(iv)實驗設計以及(ν)涉及的離子的電荷狀況。每個單獨模擬的同位素模式均沿著MS譜的質量軸以數學方式移動。
圖8上圖示出了在如方法B中方法所述，在使用兩種穩定同位素後提取自病毒感染的細胞批次的病毒和自身MHC I型配體的模擬的同位素模式。在兩個位置表達例如甲硫氨酸和/或亮氨酸的病毒表位可以通過質量m (50)、m+Δ (100)和m+2 Δ (50)的相對比率識另|J，其中對於帶單電荷的離子△是6Da，其對於方法B中的標記和細胞混合程序固有的三個同位素變體是典型的(圖8，上圖，右側模式)。另外，保持未改變的或者在病毒感染期間被上調的自身表位可以通過它們自己的同位素模式識別(圖8，上圖，左側4個模式)。另外， 可以計算上調程度，基於單標記異構體(Ι[ω+Δ])和天然表位(Im)的單一同位素質量的強度比率，公式為
強度比率、
上調程度=2Χ --
yx-強度比率j其中χ代表表位內所含的標記胺基酸的最大數。上調至少2倍被認為是與感染顯著相關的。因此，同位素模式針對3個標記的胺基酸的使用而被模擬，如方法C。匹配同位素簇被選擇作為候選的病毒感染相關的MHC I型配體以用於進一步LCMS/MS分析。平臺LCMS技術對於病毒感染相關的MHC I型ligandome的「肽挖掘」，修改LCMS系統的一些獨立參數以獲得靈敏性改良一或多個數量級的平臺LCMS技術，由此可以檢測例如在成批的 IO7-IO8個細胞中以單拷貝/細胞存在的MHC I型表位。所述平臺LCMC技術組成為標準納流LC柱轉換系統C18前置柱，通過修飾的 MicroTee管狀元件相繼連接於長度> 90cm的分析柱，所述分析柱ID為25 μ m,緻密填充了 3ym C18顆粒。使用的流動相是平緩線性梯度，流速為30nl/分鐘的乙腈，在240分鐘內從在A(水+0. IM乙酸)中8%乙腈+0. IM乙酸至在A中28%乙腈。柱端頭用碳塗層，柱頭壓 ^ 400bar。如標準LCMS技術所述進行表位的MS譜解釋、隨後的MS/MS分析以及半定量。使用肽樣品分析平臺LCMS技術的優越性，所述肽樣品得自在方法A中描述的MV 感染的WH B-細胞批次，得自在方法A』中描述的流感病毒感染的MB-02 B細胞-批次，以及得自在方法C』中描述的RSV-感染的MDDC細胞批次(如後文示出)。結果MHCI 型 ligandome標準LCMS技術可以鑑別有限數目的HLA-A2-結合的MV表位在MV感染後如所述從人WH細胞獲得MHC I型配體以通過標準LCMS技術鑑別MV 相關的MHC I型表位。研究兩個HLA-A2 ligandome樣品，一個通過方法A分析(減法分析)，一個HLA-A2 ligandome樣品通過方法B分析(同位素標記)。在每種方法中，可以檢測三個候選的病毒相關的MHC I型表位，在MS/MS測序之後證實其是MV表位(表1)。如所公布的，標準LCMS技術使得可以鑑別共4個不同的表位，含有超優勢(supradominant) MV_C84_92表位，發現其以> 100，000拷貝/細胞表達。對比實施例平臺LCMS技術可以鑑別10-15倍更多的MV表位儘管標準LCMS技術能支持在複雜的MHC I型ligandome樣品中以亞飛摩爾範圍在幾千個化學相似的自身表位中鑑別和鑑定一些、可能是最富集的病毒表位，但是有跡象表明現有技術存在關於重要的其它次優勢病毒表位的知識缺口。我們探討了如果在該技術的LC部分進行嚴格修飾將產生使得可以檢測和鑑定次優勢MHC I型配體的平臺LCMS技術。圖9示出了對於一個單一 MV感染相關的MHC I型樣品(如在方法A中製備)的級分的典型LCMS峰性能，使用標準LCMS技術(上圖)或者含有如在方法中所述的一些組合的獨立修飾的平臺LCMS技術(下圖)。下圖LCMS運行的在線數據依賴性LCMS/MS測序(平臺技術)可以鑑別39個MV衍生的HLA-A2配體，代表31 個不同表位(表2)。這些天然呈遞的表位中的26個表位是新的MV表位，3個是使用標準 LCMS技術已經鑑別的表位(表1)，2個儘管新鑑別是量化的天然HLA-A2配體，但是在文獻中描述為是小鼠和人 MV CD8+T 細胞表位(Neumeister et al. 1998，Nanan et al. 1995)。 因此，通過對標準LCMS方法的平臺修改可以鑑別出至少10倍以上的表位。通過平臺LCMS技術從其它病毒中講行MHC I型Iigandome表位挖掘的其它實例

為了進一步分析其優越性，使用平臺LCMS技術分析如方法A』和C』所述從其它病毒感染的細胞批次中製備的MHC I型ligandome。鑑別6個病毒MHC I型表位，其通過標準 LCMS技術不可檢測4個表位涉及流感病毒感染，2個表位涉及RSV感染(表2)。平臺LCMS技術對MHC I型ligandome的表位挖掘是通過對LC方法講行一勝獨立改良而實現為了體會所述方法中一個修飾對於峰性能和肽挖掘的作用，在單獨的支持性實驗中研究梯度傾斜度組合長柱的作用以及C18顆粒大小組合柱ID的影響。如圖10所示，使用複雜胰蛋白酶化蛋白消化物，應用更平緩和擴展的梯度斜率組合90cm長柱可以增加層析中肽的峰容量及擴展峰寬。這使得允許在MS來源中大量存在化合物，便於低豐度肽的綜合數據依賴性多級MS/MS分析(肽挖掘)。正如所期望的，當使用充填在較小ID (25 μ m)的柱中的3-μ m C18顆粒時獲得LCMS系統的4倍的較高靈敏性，使用充填在50-μ m ID柱中的3-μπι C18顆粒則相反(圖11，上組)。出人預料地，分離效率也由較小ID柱改良(圖 11，下組)。平臺LCMS分析可以鑑別MV表位的特有特徵MHC I型配體的除了序列信息和多樣性之外的重要特徵是表位的長度變化、豐度和可能的ΡΤΜ。表2示出了在MV衍生的HLA-A2配體中發現的5個不同長度的肽8_聚體(η =2)，9-聚體(η = 21)，10-聚體(η = 9)，11-聚體(η = 5)及 12-聚體(η = 2)。因此，9-聚體是最普遍的，根據半定量數據，分別呈現26%和18%的MV-衍生的HLA-A2 ligandome的兩個最富集的肽種類均是9-聚體。從先前的研究中已知是超優勢表位的KLWESPQEI (表1) 在這個分析中未充分呈現。這是預期的，因為僅含有這個特殊表位的小HPLC級分為其它研究目的而從樣品中選擇性除去。從7個表位中，鑑別共有相同核心表位的2或3個長度變體(表2)。 此外，來自大結構蛋白的表位RAN*VSLEEL、來自融合糖蛋白FO前體的KLMPN*ITLL 以及來自血凝素糖蛋白的LSVDLSpPTV (表2)是翻譯後修飾的表位，不可如此從翻譯的基因組中推導。這種修飾在關於病毒MHCI型表位的文獻中未描述。病毒感染相關的上調的MHC I型自身表位的鑑別如圖8所示，不僅病毒特異性表位、而且從頭誘導或者上調的自身表位通過組合使用同位素標記與MHC I型分離和LCMS技術也可以被檢測。流感病毒感染相關的HLA-A2 ligandome分離自人MDDC，如方法C所述，並且進行標準LCMS技術。查找匹配應用三個標記的胺基酸的上調的肽的模擬同位素模式的同位素簇。圖12例證了具有3個同位素標記的胺基酸的同位素簇的實例。所述表位被鑑別為VVSEVDIAKAD，衍生自人幹擾素誘導的GTP-結合蛋白Mxl (登錄號P20591)。在流感病毒感染後鑑別出6個其它上調的自身表位(表3)。 儘管已經報導其它自身表位是在病毒感染後上調的天然存在的MHC I型配體，但是本發明中鑑別的表位是新的表位且能與流感病毒感染特異性相關。實驗方法II :MHC II 型 Iigandome 百日咳博德特氏菌菌株509在天然的含有14N的基本Bioexpress細胞生長培養基中或者在98% -富集的15N-穩定同位素標記的基本Bioexpress細胞生長培養基 (Cambridge Isotope Laboratories，USA)中生長至靜止期，兩個培養基均含有過濾的 0. 15%乳酸(Fluka, Switzerland)及 18. 6mM NaOH0 生長後，14N-禾口 15N-標記的細菌培養物通過在56°C保溫30分鐘而熱失活，並通過在2000g離心20分鐘並將沉澱置於1/5體積 PBS中而在PBS中濃縮5倍。14N-和15N-標記的全細胞製備物的光密度在590nm測量，為進行抗原呈遞細胞的抗原脈衝，基於這些OD59tl值製備這些製備物的1 1混合物。從百日咳博德特氏菌製備重組P. 69 Pertactin含有編碼百日咳博德特氏菌P. 69 Pertactin野生型變體P. 69 Prnl (登錄號 AJ011091)的胞外結構域的質粒pPRNl (Hijnen et al. 2005)的大腸桿菌菌株BL21_Codonp Ius (DE3) -RP (Stratagene, la Jolla, CA)在天然的 14N 標記的基本 Bioexpress 細胞生長培養基中或者在98原子％富集的15N-標記的基本Bioexpress細胞生長培養基(Cambridge Isotope Laboratories, USA)中在 250rpm 下於 37 °C 生長，直至 OD59tl 達到 0. 6-0. 8。隨後，培養物用ImM異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導，並再保溫4小時。誘導的14N-和15N-標記的細菌通過在4°C 5000g離心10分鐘收集，隨後用Bug Buster試劑 (Novagen, Darmstadt, Germany)裂解。細胞裂解物用每克溼細胞糊用5，000U溶菌酶和125U benzonase核酸酶處理。離心收集包涵體並用1 10稀釋的Bug Buster試劑洗滌3次。 純化的14N-和15N-標記的包涵體溶解在6M鹽酸胍(GuHCl)，IOmM苯甲脒，ImM EDTA, IOOmM NaCl和50mM Tris 『 HCl pH = 8. 8中。14N-和15N-標記的rP. 69 Prnl蛋白質的重摺疊通過快速50倍稀釋進不含GuHCl的相同緩衝液中起始。在4°C對ImM EDTA, IOOmM NaCl禾口 50mM Tris -HCl pH = 8. 8過夜透析過程中使蛋白質充分重摺疊。隨後，用50kDa分子量截
(Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA), Μ /fft WS&MXi 50mM Tris · HCl pH = 8. 8透析2次。蛋白質在具有50_kDa截斷值的Amicon Ultra-15濃縮器 (Millipore,Billerica,MA)上濃縮。最後向lmg/ml濃縮蛋白質中加入2 μ g蛋白酶抑制劑 (Roche，Penzberg，Germany) 。 ^jitif 入MDDC 白勺Bicinchoninic Acid( VX 下稱為 BCA)蛋白質測定(Pierce Protein Research Products, Rockford, USA)中測量的蛋白質含量，製備14N-和15N-標記的rP. 69 Prnl蛋白的1 1蛋白質/蛋白質混合物。腦膜炎奈瑟氏球菌等基因菌株在基本培養基中的生長及OMV製備腦膜炎奈瑟氏球菌H44/76的兩個分別表達可變主要外膜蛋白孔蛋白A(以下稱為 PorA)的血清亞型 Pl. 5-2，10 或 Pl. 7-2，4 的 class 3、class 等基因菌株(Peeter et al. 1996)在天然的含有14N的基本Bioexpress細胞生長培養基中或者在98%富集的15N-標記的基本 Bioexpress 細胞生長培養基(Cambridge Isotope Laboratories, USA)中生長至靜止期。從這些培養物製備14N-和15N-標記的外膜小泡(以下稱為0MV)批次，並根據Claassen (Claassen et al. 1996)所述鑑定。為進行人MDDC的抗原脈衝，基於在BCA蛋白質測定(Pierce Protein Research Products, Rockford, USA)中測量的蛋白質含量製備 14N-和15N-標記的OMV批次的1 1蛋白質/蛋白質混合物。&縣·；麵馳表汰禾口統為進行全細胞百日咳博德特氏菌製備物的蛋白質分析，從14N-和15N-標記的全細胞百日咳博德特氏菌製備物的小等份製備膜複合物。細菌細胞批次在7000g離心(15分鐘， IO0C )，沉澱重懸於IOmM Tris -HCl pH = 8. 0中。這些懸浮液在冰上超聲處理以破壞細胞膜，在6500g離心(10分鐘，IO0C )，收集上清。離心膜片段(40000g，1小時)並置於IOmM Tris -HCl pH = 8. 0中的十二烷基肌氨酸鈉(sarcosyl)中。膜複合物進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(以下稱為SDS-PAGE)，之後蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上。膜用抗已知毒力因子絲狀血凝素(1 500，克隆31E5)，P. 69 Pertactin(1 50，克隆Pem4)，百日咳毒素亞基1(1 1，000，克隆151C1)，百日咳毒素亞基4(1 100，克隆1-227)和Fimbriae 2(1 1，000，克隆21E7)的單克隆抗體探查(western印跡)，所有單克隆抗體均來自荷蘭 Netherlands Vaccine Institute。之後，膜與鹼性磷酸酶標記的抗小鼠IgG(1 5, 000 ； SBA, UK)保溫，用即用AP綴合物底物試劑盒(Biorad，USA)檢測信號。同位素標記效率用P. 69 Pertactin作為代表性蛋白質例子研究。在SDS-PAGE上分離蛋白質後，14N-和15N-標記的69-kDa條帶從凝膠上切下。將14N-和15N-標記的P. 69 Pertactin及其胰蛋白酶消化物分別進行LCMS (P. 69 Pertactin)和LCMS/MS (消化物)。14N-和15N-標記的rP. 69 Pertactin製備物中蛋白質的完整性及14N-和15N-OMV 製備物中PorA的完整性以及蛋白質及胰蛋白酶消化物的同位素標記效率用上述針對百日咳博德特氏菌膜複合物所述相似技術(SDS-PAGE，western印跡，LCMS和LCMS/MS)評估，特別是通過分別靶向P. 69 Pertactin和PorA進行。對PorA，在western印跡中使用血清亞型特異性單克隆抗體。實驗方法D、E和F導致表達病原體相關MHC II型Iigandome的人MDDC批次在方法D中，人MDDC根據有小改變的實驗方法I中所述程序進行培養。在此，用白細胞除去法暗黃覆蓋層分離IxIO9PBMC,所述暗黃覆蓋層經知情同意得自HLA-DR2純合血液供體。在第6天，仍未成熟的MDDC用終濃度為OD59tl = 0. 028的14N-和15N-標記的全細胞百日咳博德特氏菌製備物的1 1混合物脈衝。在第8天，收集全細胞百日咳博德特氏菌脈衝的MDDC，在PBS中洗滌並計數。沉澱20x106MDDC，冷凍，在-80°C儲存直至肽分離和分析。在全細胞百日咳博德特氏菌脈衝之前和之後的小等份(1%)MDDC經流式細胞術鑑定以驗證MDDC純度及成熟(未示出)。在方法E中，如上，人MDDC根據有小改變的實驗方法I中所述程序進行製備。在此，經知情同意得自代表HLA-DR分型的異質群體的9個不同血庫供體的PBMC分別培養 (3xl08PBMC/供體)以生長MDDC。在第6天，仍未成熟的MDDC用最終蛋白質濃度為10yg/ml 的14N-和15N-標記的rP. 69 Pertactin製備物的1 1混合物在20ng/ml來自S. abort is equi的LPS的存在下脈衝。在第8天，收穫rP. 69 Pertactin-脈衝的MDDC (η = 9)，在PBS 中洗滌，合併並且計數。然後沉澱70χ106合併的MDDC，冷凍並儲存在-80°C直至肽分離和分析。在百日咳博德特氏菌rP. 69 Pertactin脈衝之前和之後的小等份(1%)MDDC經流式細胞術鑑定以驗證MDDC純度及成熟(未示出)。
在方法F中，如上，人MDDC根據有小改變的實驗方法I中所述程序進行製備。在此，經知情同意得自HLA-DRl純合供體及經知情同意得自HLA-DR2純合供體的PBMC被分別培養QxIO9PBMC/供體)以生長MDDC。在第6天，每個MDDC批次分成兩個等份並用最終蛋白質濃度為25 μ g/ml的14N-和15N-標記的Pl. 7-2，40MV的1 1混合物或者14N-和 15N-標記的Pl. 5-2，100MV的1 1混合物在20ng/ml來自S. abort is equi的LPS的存在下脈衝。在第8天，收穫4種不同的OMV脈衝的MDDC批次，在PBS中洗滌，計數，沉澱，冷凍並儲存在_80°C直至各個肽分離和分析。在OMV脈衝之前和之後的小等份(1%)的每種 MDDC批次經流式細胞術鑑定以驗證MDDC純度及成熟(未示出)。肽合成合成肽標準品經固相FMOC化學使用SYRO II同時多個肽合成儀(MultiSyntech GmbH, ffitten, Germany)製備。合成的肽的純度和性質經反相高效液相層析(HPLC)評估。MHC II 型 Iigandome 的分離根據方法D、E和F製備的MDDC批次解凍並裂解以溶解MHC II型分子，隨後根據實驗方法I所述的MHC I型Iigandome分離經如下小改變而經免疫化學分離病原體相關的MHC II型ligandome。在清除步驟中，使用特異於人HLA-DR分子的小鼠抗體(克隆B8. 11. 2)， 用10%乙酸從清除柱洗脫後，HLA-DR分子和締合肽通過ΙΟ-kDa分子量截斷值膜濾器，濾過物加熱15分鐘至700C ο MHC II型Iigandome的濃縮、重建、摻加(spiking)和儲存均類似於實驗方法I中針對MHC I型ligandome所述的程序。平臺LCMS分析肽樣品經本文上面所述的優化的納流液相層析結合電噴射離子化-質譜分析 (平臺LCMS)進行分析。代表l-hl07MDDC的肽樣品等份上樣到C18前置柱，其經修改的 MicroTee管狀元件順序連接25-cm長分析柱，所述分析柱具有25- μ m ID，用3- μ m C18顆粒緻密填充。所用流動相是流速為30μ Ι/min乙腈+0. I-M乙酸的平緩線性梯度，在45分鐘內從100% A(水+0. I-M乙酸)至在A中的60%乙腈+0. I-M乙酸。柱端頭用金和碳塗覆，柱頭壓> 250巴。以1秒/掃描的掃描速率記錄質譜，質量範圍為300-1，500Da,質量解析度至少為10，OOOFffHM(MS分析)。對於候選病原體相關MHC II型表位的MS測序(MS/MS分析)，多數使用肽樣品的第二個等份，MSl分析循環與預選擇質量或者在洗脫進質譜儀時最豐富的質量上的碰撞誘導斷裂的循環交替。以1秒/掃描的掃描速率獲得MS/MS譜，質量範圍為50-2，000Da，質量解析度為5，000FWHM。最佳碰撞能量主要取決於表位的性質和所用質譜儀的類型，並且在這些實驗中被優化。MS/MS譜的解釋手工進行或者使用軟體工具，例如Mascot (Perkins et al. 1999. , www. matrixscience. com, Matrix Science Ltd. , London UK), ProteinProspector (www. prospector, ucsf.edu, Univ. of California, San Francisco, CA,USA),Bio Works (Thermo Scientific,ffaltham,MA,USA)和 / 或ProteinLynx (Waters Corp.，Milford, MA, USA)。為量化鑑別的表位，通過鑑別的表位的合成類似物的強度量除以標準肽血管緊張素III和催產素的強度量的平均值而計算相對應答因數。這些因數隨後用於細胞批次中存在的天然表位數的半量化。在線2-維平臺LCMS分析
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通過在線2維納級液相層析結合電噴射離子化_質譜分析(2D-LCMS)分析肽。代表1-2x107MDDC的肽樣品等份被上樣到包含以幹顆粒重量為2-3比率混合的弱陰離子交換顆粒(例如Poly WAX LP ，得自PolyLC, Columbia, MD, USA)和強陽離子交換顆粒(例如 PolySULFOETHYL Aspartamide ，得自 PolyLC，Columbia, MD, USA)混合物的前置柱中。這種混合的陰離子-陽離子交換(ACE)靜止相以漿液填充在熔融二氧化矽管材中並夾心在兩個C18顆粒(例如尺印1~08丨1-卩1^ (1840，5「111顆粒大小，120 A孔徑，得自Dr. Maisch, Germany)床長度之間。前置柱床的每個部分的長度是20mm，前置柱的內徑是50 μ m。 C18-ACE-C18夾心前置柱經修改的MicroTee管狀元件連續連接至25 μ m ID的用3_μπι C18 顆粒(例如R印!·08丨1- 皿 (1840，3「111顆粒大小，120入孔徑，得自Dr. Maisch, Germany) 緻密填充的25cm長分析柱。所用流動相是流速為30 μ 1/min乙腈+0. I-M乙酸，從100% A(水+0. I-M乙酸)至在A中的60%乙腈+0. I-M乙酸的平緩線性梯度。柱端頭用金和碳塗覆，柱頭壓> 250巴。以1秒/掃描的掃描速率記錄質譜，質量範圍為300-1，500Da，質量解析度至少為10，000FWHM(MS分析)。進行5個隨後的注射、分析分離和MS分析循環，注射等份包含水的含有增加量的甲酸和二甲基亞碸(DMSO)的無鹽洗脫溶劑，濃度分別為InM， 1 μ Μ, IOmM, IM和2M，隨後用上述乙腈+0. I-M乙酸的平緩線性梯度和質譜分析條件進行肽的分離和MS分析。候詵病原體相關的MHC II型配體的鑑別為將病原體衍生的MHC II型配體與自身衍生的配體區分開，從MS譜中提取關鍵的質譜信息(由「質量值」和「強度值」定義)並用於MHC II型質譜解釋算法，檢索質譜雙峰。為了明確地將質譜雙峰歸為候選病原體相關的MHC II型配體，5個標準必須滿足(i) 「輕」和「重」表位的單一同位素質量的質量差異(Am)必須是「輕」表位質量的大約1.2%。這個相對質量差異基於蛋白質和肽中氮原子的平均天然發生率。每個氮原子質量增加IDa導致針對完整肽/蛋白質的1. 2%的相對質量增量；(ii) 「輕」和「重」表位的電荷狀態(Z)必須相等；(iii) 「輕」和「重」表位的強度比必須是大約1 ；(iv) 「重」表位的質譜模式必須體現98原子％富集的15N-同位素的摻入，觀測為 [M*-l]和[M*-2]同位素峰(M*代表含有15N-同位素均勻摻入的「重」表位的單一同位素質量)；(ν)計算的存在於候選表位中的氮原子數必須是整數。這個數可以通過「輕」和 「重」表位的單一同位素質量的絕對質量差異(Δπι)乘以這些表位的電荷狀態(ζ)而計算。圖8 (下圖，右側譜)示出當使用穩定同位素及滿足上述標準時提取自抗原脈衝的 MDDC的病原體相關的II型配體的模擬的同位素模式。候選病原體相關的MHC II型配體通過將模擬的同位素模式沿肽洗脫物的MS譜的質量軸數學移動而檢索。選擇匹配同位素簇用於進一步LCMS/MS分析。免疫淋巴細胞知情同意後獲得來自Sanquin (Amsterdam)的健康血庫供體的外周血 (S03. 0015—X) 。fycoll_hyp￡ique(Ph￡irm￡ici￡i Biotech, Uppsala Sweden)
黃覆蓋層細胞而分離外周血單個核細胞(PBMC)並新鮮使用或者冷凍保存直至用於實驗。 PBMC在完全培養基即補加2%人AB血清(Harlan，USA)的AIM-V培養基(GibcoBRL，USA)中培養。雌性spf Balb/c小鼠和C57black/6小鼠購自Harlan並在常規條件下保持。所有實驗均經過The Animal Ethics Committee of the NVI批准。各組4隻小鼠在第0天和第28天用含有在PBS中的rPl. 7-2,4或rPl. 5-2,10 (1. 5 μ g)的LpxLl佐劑化脂質體或者用如實驗方法II所述製備的Pl. 7-2，4或Pl. 5-2，100MV (Ijyg PorA/劑)皮下免疫。 在第42天解剖後，通過機械解離器官通過70-μ m孔徑尼龍濾器獲得單個脾細胞和淋巴結細胞懸液。脾細胞懸液中的紅細胞用IOmM KHCO3,0. ImM EDTA在4°C裂解2分鐘。脾細胞置於完全 IMDM-10 培養基中，即補加 10% FCS (HyClone，USA)和 pen/str印/glu (GibcoBRL， USA)的 Iscove，s Modified Dulbecco' s Medium (GibcoBRL, USA)。淋巴結細胞置於補加 5%正常小鼠血清(Harlan，USA)和pen/str印/glu的完全IMDM-5培養基中。PorA肽和蛋白質如所述製備的具有12個胺基酸重疊的分別跨越整個Pl. 7-2，4和Pl. 5-2,10蛋白的重疊合成18聚體肽通過smart pooling集合成16個集合(A至H及1至8)，即由此每個合成肽在兩個不同的8肽集合中表現。重組？1.7-2，4和？1.5-2，10蛋白(以下稱為 rP1.7-2，4和rP1.5-2，10)使用來自所提到的腦膜炎奈瑟氏球菌H44/76的等基因菌株的 PorA基因通過現有技術已知的重組蛋白質表達技術獲得。增殖測定對於P. 69 Pertactin特異性人增殖測定，IO5PBMC在不存在或者存在1或10 μ M 相關肽條件下在完全培養基中以150 μ 1/孔在37°C 5 % CO2氣氛下保溫。對於PorA特異性人增殖測定，IO5PBMC或^104ΜΒ71. 5T細胞在不存在或者存在指示濃度的相關肽、肽集合或 PorA rPl. 7-2,4, Pl. 5-2,10，Pl. 7，16，Pl. 19，15 或 Pl. 22，14 條件下在完全培養基中以 150μ 1/孔在37°C 5% CO2氣氛下保溫。在第4天，取100-μ 1體積進行細胞因子測定。然後在收穫細胞之前18小時將0.5 μ Ci (18. 5kBq) 3H-胸苷(Amersham, USA)加入培養物中。 CPM的確定和結果的計算如針對免疫脾細胞的增殖測定所述進行。結果表示為來自至少一式三份孔的SI 士SD。區域4特異性T細胞系MB71. 5通過在完整培養基中用0. 5 μ g/ml rPl. 5-2，1重複體外再刺激MB71 PBMC而產生。對於小鼠增殖測定，來自Pl. 7-2，4或P. 15_2，10免疫的Balb/c或C57Black/6小鼠的脾細胞在96孔圓底平板(Greiner)中在存在rPorA或18聚體寡肽或者僅培養基的條件下以1. 5x10s細胞/150 μ 1在IMDM-IO中培養。在第4天，將0. 5 μ Ci (18. 5kBq)3H-胸苷 (Amersham,USA)加入孔中，細胞再培養18小時。收穫細胞，3H-胸苷摻入用Wallac 1205 β 平板液體閃爍計數器確定為每分鐘計數(CPM)。結果表示為來自一式三份孔的刺激指數 (Si) 士SD，計算為在抗原存在下培養物的CPM除以在僅培養基存在下培養物的CPM的商。結果II :MHC II 型 jigandome在基本培養基中的蛋白質表汰及mN*1^同位素標記的效率如實驗方法II的方法D所述產生的14N-和15N-標記的全細胞百日咳博德特氏菌製備物的膜複合物中的細菌蛋白質經SDS-PAGE分離並用Western印跡分析。絲狀血凝素 (Filamentous Hemagglutinin)、P. 69 Pertactin、百日咳毒素亞基 1 禾口 4 以及 Fimbriae 2以相似比率在wN-和15N-標記的製備物中表達，提示在重同位素標記的培養基中的正常蛋白質表達。提取自wN-和15N-P. 69 Pertactin條帶的蛋白質的LCMS分析證實P. 69 Pertactin蛋白的重形式相對於其輕形式的1.2%的質量增量。另外，得自wN-和15N-P. 69Pertactin的胰蛋白酶消化產物的MS/MS譜揭示典型的片段化為重和輕胺基酸，證實在遍及P. 69 Pertactin蛋白的全序列上的成功的穩定同位素標記。類似地，對如實驗方法II的方法E所述的rP. 69 Pertactin以及方法F所述的衍生自腦膜炎奈瑟氏球菌的OMV製備物也評價了蛋白質表達及wN-和15N-標記效率。對於 rP. 69 Pertactin和PorA製備物分別觀測到了蛋白質完整性和遍及全蛋白的成功標記。實飧她D Φ HLA-DR2-結合的百日晐t軎德特氏菌表擬的鑑另I丨病原體相關的HLA-DR配體從如實驗方法II所述用14N-和1N-標記的全細胞百日咳博德特氏菌製備物的1 1(0D/0D)混合物脈衝的HLA-DR2純合MDDC提取。用數學檢索算法在LCMS譜中檢索代表候選百日咳博德特氏菌MHC II型配體的質譜雙峰。圖13(上圖)示出在m/z 788. 94Da和797. 42Da檢測的匹配同位素簇的例子，代表含有17個氮原子的候選表位(圖13，插圖)。表位的MS/MS譜(圖13，下圖)揭示出部分序列，鑑別了衍生自百日咳博德特氏菌的推定周質蛋白(登錄號CAE43606)的表位。6個其它譜雙峰被測序， 代表衍生自百日咳博德特氏菌的4個不同蛋白質的4個表位的長度變體(表4)。所述表位用內部標準半量化。實驗方法E中HLA-DR-結合的百日咳博德特氏菌rP. 69 Pertactin表位的鑑別
病原體相關的HLA-DR配體從如實驗方法II所述用wN-和15N-標記的rP. 69 PertactinWl 1 (0D/0D)混合物脈衝的HLA-DR雜合的MDDC的集合批次提取。用數學檢索算法在LCMS譜中檢索代表候選P. 69 Pertactin MHC II型配體的質譜雙峰。圖14(上圖)示出在m/z 770. 43Da和780. 39Da檢測的匹配同位素簇的譜雙峰的例子，代表含有20 個氮原子的候選表位(圖14，插圖)。表位的MS/MS譜(圖14，下圖)揭示出P. 69 Prnl (登錄號AJOl 1091)的匹配肽序列LRDTNVTAVPASGAPA的b_型離子系列。總共5個譜雙峰被測序，它們代表來自百日咳博德特氏菌P. 69 Pertactin的2個表位區域的長度變體(表5)。 所述表位用內部標準半量化。通過用代表表位的合成標準物體外再刺激來自一組健康成年供體的PBMC，我們研究了所述兩個百日咳博德特氏菌P. 69 Pertactin表位區域在人中的免疫原性。對於包含 ASTLffYAESNALSKRLG序列的第二個表位區域，在至少2個供體中觀測到免疫識別(表5)，提示這個表位是功能性人表位。實驗方法F中HLA-DRl和2結合的腦膜炎奈瑟氏球菌表位的鑑別病原體相關的HLA-DR配體從如實驗方法II所述用標記的OMV製備物脈衝的 4個MDDC批次提取，從而代表下述的HLA-DR等位基因和PorA血清亞型組合HLA_DR1/ Pl. 7-2，4，HLA-DR2/P1. 7-2,4, HLA-DR1/P1. 5-2，10，和 HLA-DR2/P1. 5-2, IO0 用數學檢索算法在LCMS譜中檢索代表衍生自Pl. 7-2，4或Pl. 5-2,10的候選MHC II型配體的質譜雙峰。圖15示出譜雙峰的兩個例子，在HLA-DR1/P1. 7-2，41igandome中，一對[MH2]2+離子在 m/z 1065. OlDa 和 1076. 47Da 被檢測到(圖 A)，在 HLA-DR2/P1. 5-2, IOligandome 中，一對[MH3]3+離子在m/z 701. OlDa和708. 67Da被檢測到(圖B)。這兩個質譜雙峰內的質量增量表示在每個候選表位中存在M個氮原子。在m/z 1065. OlDa的[MH2]2+ 離子和在m/z 701. OlDa的[MH3]3+離子的分別MS/MS測序揭示譜匹配PorA同系物表位 SPDFSGFSGSVQFVPIQNSK(P1. 7-2，4，圖 C)和 SPEFSGFSGSVQFVPAQNSK(P1. 5-2，10，圖 D)。在實驗方法II方法F所述製備的4個Iigandome中，總共38個譜雙峰被鑑定為是來自腦膜
38炎奈瑟氏球菌PorA的8個表位區域的長度變體、血清亞型變體和/或HLA-DR等位基因特異性配體(表6)。用內部標準半量化所述表位。觀個天然存在的表位是新的PorA HLA-DR 配體，10個是早先描述的，定位於4個已知表位區域(區域1、3、7和8)。因此，公開了 4個新的天然存在的PorA表位區域(區域2、4、5和6)，其中區域2已被報導刺激人⑶4+T細胞(Wiertz et al. 1992)。在所有4個研究的Iigandome中，區域8表位是豐富表達的。 HLA-DR1/P1. 7-2,41igandome中的質譜雙峰的MS測序揭示這個表位區域的2個變體，代表總區域81igandome的大約1 %，含有IGNYTQINAASVG核心序列，但是C末端延長+114Da或 +270Da,不與PorA中這個高度保守區域中的表位的天然C末端側翼殘基匹配(圖16)。這些變體的wN-和15N-標記的對應物的及為此目的製備的合成標準物的LCMS特徵揭示所述延長與應該產生自分子內剪接事件的分別具有胺基酸GG(或N)或者GGR(或NR)的核心序列的非正常型延長(non-orthodox elongation)匹配。MHC II型配體的剪接未有描述。作為MHC II型配體的PTM的這個首次證實的剪接是使用穩定同位素結合專門免疫學實驗設計和LCMS的直接結果。因此，對於MHC II型配體的PTM現象的未知，與對於MHC I型配體一樣，對我們有關T細胞表位的知識是一個現實的威脅，並且需要上述方法來解決。作為如實驗方法中的方法F所述獲得的4個ligandome中的質譜雙峰的全面LCMS 分析的另一個結果，鑑別了 M個額外的不是衍生自PorA蛋白的表位。總體上，所述表位代表來自與腦膜炎奈瑟氏球菌OMV製備物相關的13個不同蛋白質的18個表位(的長度變體)(表7)。這個發現揭示了作為潛在T細胞靶的表位區域及它們各自的前體蛋白質。用在線2維平臺LCMS技術講行MHC ligandome的高通量分析為促進MHC ligandome的高通量分析，衍生自方法F中描述的OMV脈衝的MDDC批次的相同MHC II型肽樣品的一半用於在線2維平臺LCMS技術。除了早先用平臺LCMS分析離線製備的方法F樣品的SCX級分鑑別的表位之外，在線2-D應用以快速及節省樣品方式獲得19個額外的先前未鑑別的源自腦膜炎奈瑟氏球菌PorA和非PorA蛋白的肽表位(表 8)。MHC ligandome是免疫原性和保護作用的(共)相關物((co) correlates)因此，這個類型的分析不僅揭示了抗原的潛在CD4T細胞表位區域的多樣性，而且提供了對它們的相對豐度(其調節免疫原性和T細胞應答的質量和最終的PTM)的深入了解。重要的是，如本實施例所示，所述實驗設置與同位素標記和專門LCMS技術一起促進了對病原體抗原變異和人HLA-DR多態性在T細胞免疫性中的作用的研究。多種已知腦膜炎奈瑟氏球菌PorA血清亞型的序列對比揭示微多態性在表6所述天然存在區域中的三個中發生(區域1、4和幻。我們用來自健康成年供體的PBMC和來自免疫 Balb/c小鼠和C57black/6小鼠的脾細胞研究了新的微多態性區域4的功能作用。首先，我們詢問通過分別用Pl. 7-2，4或Pl. 5-2，10重複體外再刺激來自各種供體的PBMC 是否會產生分別特異於SPDFSGFSGSVQFVPIQNSK (P1. 7_2，4變體，以下稱為D/I)或者 SPEFSGFSGSVQFVPAQNSK(P1. 5-2，10變體，以下稱為E/A)的T細胞系。從一個供體產生了 一個特異性T細胞系(MB-71. 5)，其識別用代表Pl. 5-2，10表位變體的重疊合成18聚體肽 PEFSGFSGSVQFVPAQNS (代碼 SO11-24)和 SGSVQFVPAQNSKSAYTP (代碼 SOl 1-25)而非代表Pl. 7-2，4對應物的重疊合成18聚體肽PDFSGFSGSVQFVPIQNS (代碼S004-29)和 SGSVQFVPIQNSKSAYTP (代碼S004-30)脈衝的自體抗原呈遞細胞(圖17A)。當用經Pl. 5_2，10蛋白脈衝的自體抗原呈遞細胞刺激時，MB-71. 5 T細胞也增殖(圖17B)或者產生細胞因子(未示出)。從5種其它PorA變體，僅Pl. 5-1，2-2 (E/A)和Pl. 22，14 (D/A)變體再刺激 MB-71. 5 T細胞，而PL 7-2，4(D/I)，Pl. 7，16(E/I)或PL 19，15(D/I)不能，表明天然加工的 「區域4」表位的C-末端半部分中的丙氨酸㈧殘基對於T細胞識別是關鍵的。另外，在任何所測試個體(n = 5)中未能檢測到D/I或A/I特異性T細胞。在臨床前動物研究中，我們有類似觀測來自用Pl. 5-1，2-2(—種類似於Pl. 5-2，10的E/A 『區域4』變體)免疫的 Balb/c小鼠的脾細胞應答Pl. 5-2，10 『區域4，肽SOl 1-24 ^P S011-25，但不應答Pl. 7-2,4 特異性區域4變體S00449和S004-30(數據未示出)。用Pl. 7_2，4免疫的小鼠不產生針對區域4的(可測量的)T細胞應答(表9)。另外，衍生自用Pl. 5-2，10免疫的Balb/c小鼠的T細胞雜交瘤在6種野生型PorA變體存在下具有與人MB-71. 5 T細胞相同的反應模式(數據未示出)。另外在C57black/6小鼠中，Pl. 7_2，4未能誘導針對「區域4」的(可測量的)T細胞應答，而P1.5-l，2-2 『區域4』是免疫原性的。兩種PorA同樣能引起抗由專門LCMS技術鑑別的另一個表位區域「區域6」的T細胞應答，說明Pl. 7-2，4不是完全不能作為T細胞抗原(表9)。Pl. 7-2，4在人中及在小鼠中誘導殺細菌抗體的能力差(參考文獻15和16)是疫苗開發中的一個問題。在Balb/c小鼠中，抗「區域4」脾細胞增殖幅度在個體小鼠中與抗Pl. 5-1,2-2的殺細菌效價水平相關(R = O, 78)。總之，這些免疫原性數據表明「區域4」是PorA的重要功能性T細胞表位。討論MHCI 型和 II 型 Iigandome第一次，如平臺LCMS技術代表的新組合方法導致改良的LCMS裝置，使得可以對以前用標準LCMS技術僅產生有限數目表位的MHC I型和II型肽樣品進行表位挖掘。另外， 通過平臺技術確定了特異性表位特徵如長度和長度變化、豐度和PTM。與使用相關免疫學實驗設計和同位素標記一起，平臺LCMS技術能夠無疑義地以空前高水平的精確度和靈敏性鑑別病原體相關的MHC I型和II型ligandome。平臺LCMS技術與先前使用的(標準)LCMS方法在MHC I型和II型ligandome分析方面通過允許更低的流速、更高的柱頭壓以及組合所需的更長和更可靠的液體噴射方法而區分。總之，這增強了在MS/MS循環時離子的強度和停留時間，因此增強了 LCMS/MS的鑑別性能到達這樣的水平，即優勢和次優勢肽種類可以被可靠地鑑定。表1 :MV感染WH細胞後用標準LCMS鑑別病毒HLA-A2相關表位
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權利要求
1.一種分析樣品的液相層析-質譜儀裝置，其包含泵裝置、分析柱、電噴射離子化單元以及質譜儀，其中所述泵裝置被構造並設置成用於為分析柱提供納級流，其中所述分析柱包含進行液相層析的靜止相及其中所述分析柱具有低於70 μ m的內徑，其中電噴射離子化單元包含在樣品流路中位於所述分析柱下遊的電噴射發射器，所述發射器內徑低於70 μ m， 其中所述質譜儀位於發射器的下遊，其中所述發射器包含錐形末端以噴射樣品，所述錐形末端具有傳導性第一塗層以及保護性第二塗層。
2.權利要求1的液相層析-質譜儀裝置，其中所述分析柱和發射器的內徑低於55μ m， 優選內徑為至多^ym。
3.權利要求1或2的液相層析-質譜儀裝置，其中所述發射器與所述分析柱整體形成。
4.權利要求1-3任一項的液相層析-質譜儀裝置，其中所述保護性第二塗層包含碳，優選傳導性碳膠合物。
5.權利要求1-3任一項的液相層析-質譜儀裝置，其中所述保護性第二塗層是矽合金或者導電聚合物。
6.權利要求1-5任一項的液相層析-質譜儀裝置，其中發射器的錐形末端的內徑低於 20 μ m，優選低於10 μ m。
7.權利要求1-6任一項的液相層析-質譜儀裝置，其中所述第一塗層是貴金屬，如金。
8.權利要求1-7任一項的液相層析-質譜儀裝置，其中所述發射器包含具有第一和第二塗層的熔融二氧化矽。
9.用於納級流的發射器，其包含接受樣品如從液相層析柱接受樣品的上遊末端以及電噴射樣品的第二錐形末端，所述發射器是電噴射離子化單元的一部分，所述發射器由熔融二氧化矽形成，內徑至多為55 μ m，其中發射器的錐形末端具有金傳導性第一塗層和第二傳導性碳基塗層。
10.權利要求9的發射器，其中所述發射器接近錐形末端的內徑至多為10μ m。
11.分析樣品的液相層析-質譜儀裝置，其包含泵裝置、分析柱、電噴射離子化單元以及質譜儀，其中所述泵裝置被構造並設置成用於為所述分析柱提供納級流，其中所述分析柱包含進行液相層析的靜止相及其中所述分析柱內徑低於70 μ m，其中所述電噴射離子化單元包含在樣品流路中位於所述分析柱下遊的電噴射發射器，所述發射器內徑低於70 μ m， 其中所述質譜儀位於發射器的下遊，所述液相層析-質譜儀裝置包含至少二維層析，其中第一維包含至少強陽離子交換(SCX)，第二維包含反相層析，其中洗脫溶劑通常是無鹽溶液。
12.權利要求11的液相層析-質譜儀裝置，其中所述無鹽溶液包含乙酸。
13.權利要求11或12的液相層析-質譜儀裝置，其中所述無鹽溶液包含甲酸。
14.分析樣品的液相層析-質譜儀(LCMQ裝置，其包含泵裝置、分析柱、電噴射離子化單元和質譜儀，其中所述泵裝置被構造並設置成用於為分析柱提供納級流，其中所述分析柱由管狀元件形成，所述管狀元件具有內徑低於70 μ m的腔，其中進行液相層析的靜止相容納在所述腔內，其中電噴射離子化單元包含在樣品流路中位於所述分析柱下遊的電噴射發射器，所述發射器內徑低於70 μ m，其中質譜儀位於發射器下遊，其中LCMS裝置包含連接 LCMS裝置的至少兩個管狀元件的連接元件，所述管狀元件具有外徑和具有內徑的腔，其中所述連接元件包含至少兩個卡套和至少兩個接納腔以接受卡套，所述卡套具有具有適合接受管材部件的內徑的內腔，並且在所述接納空間中的兩個卡套對準所述管狀元件，其中所述連接元件包含連接和對準所述卡套內腔的內體積，所述內體積具有的內徑適於接受所述管材部件的末端並且在連接狀態下允許管材部件末端與所述內體積對接。
15.權利要求14或者權利要求1-13任一項組合權利要求7的液相層析-質譜儀裝置， 其中所述連接元件包含鎖閉系統以鎖閉接納腔中的卡套。
16.權利要求14或15或者權利要求1-13任一項組合權利要求14的液相層析-質譜儀裝置，其中內體積和卡套內腔的內徑通常等於管材部件的外徑。
17.權利要求14-16任一項或者權利要求1-13任一項組合權利要求14的液相層析-質譜儀裝置，其中所述連接元件是三向連接元件。
18.權利要求17的液相層析-質譜儀裝置，其中三向連接元件的第三個連接形成內體積的出口。
19.生產液相層析柱的方法，包括提供具有內徑至多為55μ m的內腔、長度為至少45cm 的柱，在該柱的一端熔成玻璃料並將合適的液相層析固相材料填充在柱中，其中在填充期間振動所述柱。
20.生產液相層析柱的方法，包括提供具有內徑至多為55μ m的內腔、長度為至少45cm 的柱，在該柱的一端熔成玻璃料並將合適的液相層析固相材料填充在柱中，其中所述液相層析固相材料是在低粘度溶劑中的漿液。
21.權利要求20的方法，其中所述低粘度溶劑是丙酮。
22.權利要求20或21的方法，其中所述低粘度溶劑的粘度至多為0.35cP。
23.權利要求19-22任一項的方法，其中所述內徑至多為35μ m。
24.權利要求19-23任一項的方法，其中所述柱是熔融二氧化矽柱。
25.權利要求1-8或者11-18任一項的裝置在鑑別表位的方法中的應用。
26.鑑別表位的方法，其中所述方法包括如下步驟a)製備包含MHCI型和MHC II型表位至少之一的樣品，其中所述表位已經被加工並由抗原呈遞細胞呈遞；及b)在權利要求1-8或者11-18任一項的裝置中分析在步驟a)中獲得的樣品以鑑定表位。
27.產生包含權利要求25或沈中鑑別的表位的組合物的方法，其中所述方法包括化學合成及重組表達包含所述表位的分子中的至少一種。
28.通過權利要求25的應用或者權利要求沈的方法可獲得的表位。
29.權利要求25或沈中所述的表位或者包含所述表位的組合物在生產預防和/或治療由攜帶這個表位的病原體所致疾病的疫苗中的應用。
30.權利要求25或沈中所述的表位或者包含所述表位的組合物在評估哺乳動物免疫狀況中的應用。
全文摘要
本發明涉及改良的LCMS技術及其在選擇性鑑別和鑑定免疫原性病原體相關表位的方法中的應用以及在疫苗開發中的應用。一種橋連T細胞表位知識缺口的方式是應用新的平臺技術「免疫蛋白質組學」，以通過提取的肽樣品的納級質譜分析直接評估在抗原呈遞細胞表面的表位展示。這是唯一的方法學，其可提供對於表位特徵的無偏倚的見解，如源自病原體衍生的蛋白質的T細胞表位的精確的分子性質、多樣性、豐度、動力學及PTM。因此，這個平臺技術和免疫蛋白質組學應成為疫苗學的固有一部分。
文檔編號G01N30/56GK102216768SQ200980144627
公開日2011年10月12日 申請日期2009年9月9日 優先權日2008年9月9日
發明者A·P·J·M·德容, C·A·C·M·范埃爾斯, E·C·瑟圖特, H·D·邁林 申請人:由衛生福利和體育大臣代表的荷蘭王國