甲殼素和殼聚糖及其衍生物在製備抗病毒劑中的應用的製作方法

2023-05-10 05:54:36

專利名稱：甲殼素和殼聚糖及其衍生物在製備抗病毒劑中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及甲殼素和殼聚糖及其衍生物的抗病毒活性，更具體地說，涉及甲殼素和殼聚糖及其衍生物在製備抗病毒劑中的應用。
背景技術：
很多折磨人類的重要傳染病是由病毒引起的，由一種或多種病毒引起的疾病的流行越來越引起人們的不安。一些傳染病之所以重要是由由於它們經常是致命的；這些傳染病是狂犬病、天花、脊髓友質炎、肝炎、黃熱病、免疫抉損和多種腦炎。其它傳染病也重要的原因是它們極具傳染性，並會出現急性不適，如流感，麻疹，腮腺炎和水痘，以及呼吸道—胃腸道不適。如風疹的其它傳染病和巨細胞病毒可導致先天性異常，腫瘤病毒可導致人和動物的腫瘤和癌症。而目前造成SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome嚴重急性呼吸系統綜合症，俗稱非典型肺炎)全球流行的則是SARS病毒——冠狀病毒的一個變種。
冠狀病毒科的病毒只感染脊椎動物，與人和動物的許多疾病有關。該類病毒具有胃腸道、呼吸道和神經系統的嗜性。已知的「冠狀病毒」品種超過20個，有9組基因，會存在於牛、馬、狗及禽鳥身上，與人類有關的有3種。它的代表株為禽傳染性支氣管炎病毒，其它成員有人冠狀病毒、鼠肝炎病毒、豬血凝性腦脊髓炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、初生犢腹瀉冠狀病毒、大鼠冠狀病毒、火雞藍冠病毒、貓傳染性腹膜炎病毒，可能成員有犬冠狀病毒、大鼠涎目腺炎病毒、人腸道冠狀病毒。人冠狀病毒分別屬於OC43和229E兩個抗原型，它是引起人類上呼吸道感染的病原，典型的冠狀病毒感染呈流涕、不適等感冒症狀。不同型別病毒的致病力不同，引起的臨床表現也不盡相同，CC43株引起的症狀一般比229E病毒嚴重。冠狀病毒是成人普通感冒的主要病原之一，兒童的冠狀病毒感染卻並不常見。但是，5～9歲兒童有50％可檢出中和抗體，成人中70％中和抗體陽性。冠狀病毒也是成人慢性氣管炎患者急性加重的重要病原。但造成本次傳染性非典型肺炎的冠狀病毒，其基因構造與現有的3種病毒有所不同，很可能是導致普通感冒冠狀病毒的變異種，或由於病毒突破人與動物自然界限，象禽流感一樣傳染給人。世界衛生組織在2003年4月16日正式確認，引起非典型肺炎的病原體是冠狀病毒的一個變種，以前沒有在人體發現過。冠狀病毒家族的成員一般有29,000至31,000個核苷，SARS病毒的基因排序共有29,727個核苷，在冠狀病毒的典型的核糖核酸界值之內。
SARS病毒是一種正鏈有膜核糖核酸(RNA)病毒，很容易發生變異。據悉，香港大學醫學院微生物學系將多個來自香港、廣州和美國、加拿大等地的非典型肺炎病毒樣本進行比較，竟發現當中6個病毒樣本，某一段基因出現不相同的組合，這個發現與一些非典型肺炎患者感染後病情出現極大差異等現象相吻合。事實上，儘管世界衛生組織公布冠狀病毒的一個變種是非典元兇，但一些科學家認為，到現在為止，非典的病原體並沒有完全查明。
非典型肺炎的治療，一般重症病人可使用免疫增強藥物，如胸腺肽、丙種球蛋白和幹擾素等。一般認為，幹擾素可使細胞預激，使之在病毒感染時充分表現出抗病毒狀態，以達到預防感染、減輕症狀、降低發病率、減少病毒排出的效果。幹擾素作為是一種細胞調節蛋白，它與人體細胞表面的受體結合後，可以刺激細胞產生多種抗病毒蛋白來殺滅病毒，並且具有提高免疫力的作用。幹擾素對目前已知的絕大多數病毒均有抑制作用，是目前國際上公認的具有抗病毒活性的藥物，廣泛用於治療慢性乙型、C型肝炎、肺炎、流行性出血熱、病毒性腦膜炎、尖銳溼疣、皰疹等許多病毒性疾病。最近，美國研究人員正在試驗一種採用「反義療法」試製的新藥，這種新藥含有與非典型肺炎冠狀病毒基因排列相對稱的核糖核酸單鏈，能徹底中和病毒的毒性。正如此，這種新藥據稱能有效攻擊傳染性肝炎病毒、西尼羅河病毒和非典型肺炎冠狀病毒等的核糖核酸(RNA)基因單鏈，阻止非典冠狀病毒基因的複製繁衍過程，從而達到阻止病症發生和惡化的目的。很多中草藥如金銀花、板藍根等及中藥複方在防治非典型肺炎中發揮了很大的作用，但確切療效需要進一步研究和證實。
甲殼索(Chitin)又稱甲殼質、幾丁質、幾丁聚糖、殼多糖、乙醯葡萄糖胺等，化學名稱為聚-N-乙醯-D-葡萄糖胺，是一種天然生物高分子化合物，廣泛存在於蝦、蟹等甲殼中，自然界每年生物合成的甲殼索可達數十億噸，是一種十分豐富的自然資源。由於甲殼索結構中含有多種官能團，因此，具有很強的反應活性，可以發生脫乙醯基、水解、交聯、接枝、醯化、醚化、羧甲基化、氧化還原及絡合等反應，生成具有不同性能的甲殼素衍生物。其中甲殼素脫去乙醯基後稱為殼聚糖(Chitosan)，又稱甲殼胺、可溶性甲殼質等，化學名稱為(1，4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖。殼聚糖含有游離氨基，反應活性和溶解性能均比甲殼素強。甲殼素和殼聚糖因其特殊結構而有較強的生物活性，現已知具有降血脂、降血壓、降血糖、增強免疫力、抗菌抗癌等作用。迄今為止的研究表明，甲殼素和殼聚糖及其衍生物未見對人體有明顯的毒副作用。鄭連英等(材料科學與工程，2000，18(2)22)報導，在分子量30.5萬以下的範圍內，隨殼聚糖濃度的增加，其抗菌作用的效果增強，當濃度為1.0％時，對革蘭氏陽性菌和對革蘭氏陰性菌，其抗菌率均達到100％；對革蘭氏陽性茵，隨殼聚糖的分子量增大，抗菌作用逐漸增強，其原因主要是分子量越大，所形成的外層膜越緻密，越能阻止營養物質進入細菌細胞，因而抗菌作用效果更明顯。對革蘭氏陰性菌，隨殼聚糖的分子量越小，抗菌作用逐漸增強，分子量為5000以下，抗菌作用最強。其原因主要是分子量越小，越容易進入細胞壁的空隙結構內，幹擾細胞的新陳代謝，殺死細菌。有關甲殼素和殼聚糖及其衍生物抗病毒的報導卻較為少見。
本發明的研究表明，甲殼素和殼聚糖及其衍生物具有很好的廣譜抗病毒活性，能抑制SARS病毒的活性，可製成優良的抗病毒製劑，可用於治療流行性感冒、非典型肺炎、慢性乙型、C型肝炎、肺炎、流行性出血熱、病毒性腦膜炎、尖銳溼疣、皰疹等許多病毒性疾病。

發明內容
本發明的目的是提供甲殼素和殼聚糖及其衍生物在預防或治療人或動物中的病毒感染中的新用途，甲殼素或殼聚糖及其衍生物抗病毒譜廣，對SARS病毒有效，對預防和治療病毒引起的疾病有良好效果，且沒有不必要的毒副作用。
本發明的另一個目的是提供由甲殼素和殼聚糖及其衍生物製成的抗病毒藥劑或消毒劑，其中含有藥物可接受的治療有效量或消毒有效量的甲殼素或殼聚糖及其衍生物和藥物可接受的載體。
本發明通過抗病毒體外實驗，包括病毒致細胞病變(CPE)抑制實驗、血凝抑制實驗、誘生幹擾素實驗，以及動物實驗和組織病理學檢查，觀察甲殼素或殼聚糖及其衍生物對病毒所致細胞病變的抑制作用，對病毒感染的阻斷作用，對病毒的直接殺傷作用。結果表明，甲殼素和殼聚糖及其衍生物具有廣譜的抗病毒活性。
本發明所述「病毒」包括但不限於一般的DNA和RNA病毒以及逆轉錄病毒。DNA病毒包括細小病毒科，乳多空病毒科，腺病毒科，皰疹病毒科，痘病毒科和嗜肝DNA病毒科。RNA病毒包括小RNA病毒科，披膜病毒科，彈狀病毒科，正粘病毒科，副粘病毒科，冠狀病毒科，呼腸孤病毒科，RNA腫瘤病毒科和線狀病毒科。尤其包括DNA病毒類皰疹病毒科、腺病毒科，RNA病毒類的副粘病毒科，正粘病毒科，小RNA病毒科，冠狀病毒科，披膜病毒科，彈狀病毒科。更加包括皰疹病毒科水痘病毒屬的水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、單純皰疹病毒屬的單純皰疹病I、II型(HSV-I、II)；腺病毒科腺病毒屬的腺病毒3、7型(AdV3、7)；副粘病毒科麻疹病毒屬的麻疹病毒(MV)、肺病毒屬的小鼠肺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒-I；正粘病毒科流感病毒屬的的流感病毒(A3V)、流感病毒亞甲型鼠肺適應株FM1(用於體內試驗)；小RNA病毒科腸病毒屬的脊髓灰質炎病毒III型(PVIII)、埃可病毒6、11型(ECH06、11)、柯薩奇B族病毒3、4、5、6型(CVB3、CVB4、CVB5、CVB6)、柯薩奇病毒A16(CVA16)、新型腸道病毒71型(EV71)；冠狀病毒科冠狀病毒屬的SARS病毒；披膜病毒科風疹病毒屬的風疹病毒(RV)；彈狀病毒科水泡病毒屬的水泡性口炎病毒(VSV)。
本發明所述甲殼素和殼聚糖及其衍生物一般分子量在20萬以下，以分子量在2萬以下、水溶性較好的為佳。甲殼素和脫乙醯度高的殼聚糖都易結晶，不溶於水，而40～80％脫乙醯度，特別是50％左右中度脫乙醯度的甲殼素則有非常好的水溶性，而且分子量越低水溶性越好。與高分子的殼聚糖相比，分子量低於1萬的低分子殼聚糖具有更好的溶解性，更高的抗病毒活性。殼寡糖(Chitosan oligosaccharide)，或稱幾丁寡糖，學名為β-1，4-寡聚-葡萄糖胺，為分子量小於1萬的低聚物，在人體內吸收率近100％，抗病毒效果很好。聚合度低於10的低聚甲殼素或殼聚糖，或者它們的鹽類如鹽酸鹽或硫酸鹽的抗病毒效果都很好，其中包括雙糖和單糖，如殼二糖、2-氨基-D-葡萄糖胺(C6H11NO4)、殼糖胺鹽酸鹽(C6H13NO5·HCl)，特別是聚合度為3～7的N-乙醯低聚殼聚糖或脫乙醯的低聚殼聚糖，如殼己糖、殼庚糖的抗病毒效果更為理想。將甲殼素或殼聚糖上的OH基或NH2適當取代後，可製成水溶性較好的甲殼素或殼聚糖衍生物，例如，羧甲基或丁基化，N-季銨鹽化，磺化或N-硫酸鹽化，羥基化，二(或三)乙氨乙基化等，典型物有N-羧甲基殼聚糖、N-羧苄基殼聚糖、N-羧丁基殼聚糖、N-硫酸鹽化殼聚糖、N-季銨鹽殼聚糖、羥丙基甲殼素、三乙氨基乙級甲殼素、羧醯化殼聚糖等。另外，通過接枝或複合亦可增加水溶性，但一般以殼聚糖分子量在2萬以下為好。
上述甲殼素和殼聚糖及其衍生物具有光譜的抗病毒活性，對DNA和RNA病毒以及逆轉錄病毒引起的病毒感染有效果，但對某一種病毒而言則不是特異性的，因此對變異後的病毒也有效果。
可使用任何適當的施藥類型或模式給哺乳動物，尤其是人提供有效劑量的本發明的甲殼素和殼聚糖及其衍生物藥劑。例如，可使用口服，非腸道和局部施藥。劑型包括片劑、膠囊、粉末、溶液、分散劑、懸浮液、乳劑、軟膏和氣霧劑以及外部消毒用藥劑等。本發明的藥物組合物含有作為有效成分的甲殼素和殼聚糖及其衍生物藥劑和藥物可接受的載體和任選的含有其它治療成分。本發明甲殼素和殼聚糖及其衍生物藥劑可以與其它藥劑聯合使用，所述其它治療成分包括但不限於抗病毒劑、抗癌劑、免疫增強或抑制劑、抗炎劑、細胞因子等。
病毒是一種非細胞形態的微生物，它的感染是分子水平的感染。由於其基因組只含一種類型核酸(RNA或DNA)，體內缺乏產生能量的酶系統，只能寄生在活細胞內依靠宿主細胞提供原料和酶系統進行病毒複製增殖。它通過①殺細胞效應引起細胞熔解破壞；②整合感染引起宿主細胞癌變；②引起免疫應答導致宿主細胞損傷最終引起相應疾病。本發明的甲殼素和殼聚糖及其衍生物抗病毒活性的可能機制如下甲殼素和殼聚糖及其衍生物具有強烈的吸附作用，使病毒難以附著和穿入細胞內，影響病毒的複製增殖；甲殼素和殼聚糖及其衍生物激活網狀內皮系統和細胞免疫系統，增強巨嗜細胞的吞噬作用，強化免疫功能，使T淋巴細胞釋放出多種淋巴因子參與殺傷感染病毒的細胞，並阻止病毒核酸和蛋白質在宿主細胞內組合成病毒體。
具體實施例方式
參考下列實施例將更易於理解本發明，給出實施例是為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。
實施例一水溶性甲殼素抗病毒效應(一)材料與方法1.細胞Hep-2、Hela、BHK21 3種細胞均用Eagle培養基培養傳代；PRK細胞取自5d齡的乳兔。用5％乳蛋白水解物培養。
2.病毒 VZVJ1株滴度為10-5TCID50/ml，HSV-1滴度為10-7TCID50/ml，RVGos-10株滴度為10-6.25TCID50/ml，RVJR23株滴度為10-5TCID50/ml。
3.藥物水溶性甲殼素，分子量16000～20000，脫乙醯度為60％；無環鳥苷(Acy)，用Hanks緩衝液配製成1g/L，4℃保存備用。
4.細胞毒性試驗 每種細胞長成單層後，換成含2％小牛血清的維持液，加入不同濃度的藥物，37℃培養96h，每天觀察細胞形態變化。
(二)藥物抗病毒實驗1.水溶性甲殼素對病毒所致細胞質變(CPE)的抑制作用每種細胞接近長成單層時接種病毒，同時加入不同濃度的藥物，每一濃度4管，用含2％小牛血清的維持液於33℃培養。當病毒對照CPE達++++時，判斷結果。
2.水溶性甲殼素對病毒感染的阻斷作用每種細胞形成單層後加入不同濃度的藥物，於37℃培養48h，棄掉含藥物的維持液，用Hanks緩衝液洗滌3次，加入病毒攻擊，在33℃培養72h。
3.水溶性甲殼素對病毒的的直接殺傷作用將10000mg/L水溶性甲殼素與病毒液等量混合，於37℃分別處理12h和34h，每一時間4管。用混合流接種細胞，在33℃吸附1h，然後用Hanks緩衝液洗滌3次，去掉藥物，在33℃培養、雙察CPE產生情況。未加藥物的病毒用同樣方法處理作為對照。
(三)結果1.水溶性甲殼素對不同細胞的毒性 每一濃度組對每種細胞均無毒性作用。細胞形態正常。提示此藥有促進細胞生長的作用。Acy的細胞毒性劑量為5000mg/L。
2.水溶性甲殼素對VZV所致CPE的抑制作用藥物濃度＞100mg/L時，對VZV、HSV所致的CPE有抑制作用，在每種細胞上藥物對病毒的作用程度一致，提示此藥的抗病毒作用無細胞差異。對RV JR23和RV Gos-10的有效抑制濃度分別為5000mg/L和10000mg/L。
3.水溶性甲殼素對病毒侵入細胞的阻斷作用藥物濃度＞5000mg/L時，可減輕和延續VZV引起的CPE，與病毒對照組有明顯的差異，提示此藥大劑量應用才有阻斷感染的作用。
4.水溶性甲殼素對病毒的直接殺傷作用將10000mg/L的水溶性甲殼素分別與VZV和HSV懸液混合，於37℃作用24h使病毒感染力明顯減弱。
本實驗表明，水溶性甲殼素在體外有較明顯的抗VZV、HSV、RV的作用，且隨劑量增加抗病毒作用明顯，並能對病毒顆粒產生直接破壞作用和阻斷感染的作用，提示其作用的多樣性。VZV和HSV屬DNA病毒，而RV屬RNA病毒，水溶性甲殼素對它們均有作用。表明其抗病毒譜廣。
實施例二殼寡糖抗病毒效應(一)實驗材料1.藥物殼寡糖，分子量3000～5000。
2.動物小白鼠，封閉群瑞士種，13～15g，雌雄不拘。
3.病毒流感病毒亞甲型鼠肺適應株FM1，用於體內試驗，為本實驗室保存於-60℃低溫的毒株；副流感病毒-I、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3、7型(AdV3，7)、腸道埃可病毒11型(ECHO11)、柯薩奇B族病毒4、5、6型(CoxB4，5，5)、單純皰疹病I、II型(HSV-I、II)，經傳代後使用。
4.細胞人喉癌傳代細胞Hep-2株。
5.細胞培養液含10％小牛血清、0.29mg/ml穀氨醯胺、100u/ml青、鏈黴素的Eagles液；細胞維持液；除所含小牛血清為2％外，其它含量均同培養液。
6.標記抗體羊抗免IgG-FITC，4℃保存備用。
7.免疫血清用雞胚尿囊液傳代的流感病毒FM1免疫家兔，獲得高效價的免疫血清，凍於-60℃冰箱備用。
(二)實驗方法1.殼寡糖對Hep-2培養細胞的毒性試驗將藥液以細胞培養液作1∶4～1∶1024倍比稀釋，加入列96孔微量培養板已長成Hep-2細胞單層上，每孔加100ul，每個稀釋度各加入4孔細胞，同時設正常細胞對照。將培養板置37℃ 5％CO2培養箱中培育4天，每日用倒置顯微鏡觀察藥液對細胞的影響，以細胞不出現退變的最小稀釋度判為該藥對細胞的無毒界限。
2.殼寡糖對病毒致細胞病變作用的影響取已長成單層細胞的培養板，倒掉培養液，接種100 TCID50的不同病毒液50ul於細胞孔，每種病毒接種8孔，置37℃ 5％CO2培養箱中吸附1小時，倒掉病毒液，用維持液洗細胞面3次後，加入1∶256、1∶512稀釋度藥液100ul。同時設病毒、藥液、陽性對照藥病毒唑、正常細胞等4個對照組。培養4天，每日用倒置顯微鏡鏡檢一次，觀察細胞有無病變。連續4天。細胞出現病理變化的程度按以下4級標準記錄。+細胞病變約佔整個單層細胞的25％以下；++細胞病變約佔整個單層細胞的50％以下；+++細胞病變約佔整個單層細胞的75％以下；++++細胞病變約佔整個單層細胞的75％以上。根據細胞病變程度，用秩和檢驗法，比較給藥組與病毒對照組有無顯著性差異。凡試驗孔細胞病變程度與病毒對照組有顯著性差異者，判為有抑制作用(+)，否則判為無抑制作用(-)。試驗均經2次重複。
3.殼寡糖對流感病毒感染小鼠所致病毒性肺炎的影響將小鼠按體重隨機分為6組，其中3組分別給予殼寡糖，3組分別為病毒唑組，病毒對照組，正常對照組。對照組給予相同藥液容積的蒸餾水。除正常對照組外，將小鼠用乙醚輕度麻醉，以15LD50流感病毒液滴鼻感染，每隻0.05ml。從感染前一天開始給藥或水，每天2次.每次0.5ml，連續5天，第6天稱取體重，解剖取肺稱重，肉眼觀察肺部病變，記錄肺部肝樣實變程度，逐個計算肺指數值，並求出肺指數抑制率。肺指數＝肺重(g)/體重(g)×100；肺指數抑制率＝[病毒對照組肺指數均值-試驗組肺指數均值]÷病毒對照組肺指數均值×100％，肺指數值大，表示肺重量大，肺病變程度嚴重。將各組肺指數進行組間t檢驗。
4.殼寡糖對流感病毒在鼠肺內增殖的影響除病毒感染量為1000LD50外，動物分組、給藥方法等均同上。實驗組從感染前一天給予殼寡糖6，12.24g/kg/d，感染病毒後48小時處死小鼠，解剖取肺，摘取左側中葉肺固定，按病理切片常規脫水、包埋、製作石蠟切片。以間接免疫螢光法染色，以螢光素標記的抗流感病毒血清作示蹤原，通過間接免疫螢光結合，觀察感染鼠肺內特異性的病毒抗原，判斷藥物對病毒增殖的作用，螢光陽性率高，表明病毒顆粒增殖多，給藥組螢光陽性率降低，表明藥物對病毒的複製有抑制效果。具有抗病毒作用。
(三)實驗結果殼寡糖對副流感-1、RSV、ECHO11、CoxB4、B5、B6、HSV-II病毒致細胞病變有抑制作用，當藥液濃度增至4mg/ml時，對AdV3、HSV-1病毒也有抑制作用。殼寡糖對流感病毒感染小鼠所致肺病變有抑制作用。殼寡糖對小鼠肺內流感病毒增殖量有顯著的作用，具有明顯的抗流感病毒效果。
實施例三聚合度3～7的殼聚糖抗病毒效應(一)材料與方法1.細胞系人羊膜細胞(FL)，人胚腎細胞(293)，人宮頸癌細胞(HeLa)。
2.動物昆明種小鼠，雌雄各半，18～20g，4周齡。
3.病毒柯薩奇病毒B3、B4〔CVB3、CVB4〕、柯薩奇病毒A16(CVA16)、新型腸道病毒71型(EV17)、脊髓灰質炎病毒III型(PVIII)、埃可病毒6型(ECHO6V)、腺病毒III型(Adv III)、單純皰疹病毒I型、II型(HSV-1、HSV-2)、呼吸道合胞病毒(RV)、SARS病毒、流感病毒〔A3V〕、麻疹病毒(MV)、風疹病毒(RV)、水泡性口炎病毒(VSV)。
4.藥品和試劑聚合度3～7的殼聚糖。
(二)儀器與方法1.儀器酶標測定儀、LBK紫外可見分光光度計，LC-9A輸液泵，低溫離心機，Olympus相差顯微鏡。
2.細胞的篩選與製備所用14種病毒分別接種於FL、HeLa及293細胞以測定敏感性，細胞按常規方法傳代。同時製成2×10-5/ml細胞懸液，每孔0.1ml，24h後形成單層細胞備用。
3.病毒毒力測定採用TCID50微量法，採用不同病毒的100-TCID50/0.1ml。
4.初篩與分組實驗形成單層細胞孔棄去培養液，加入對細胞無毒性濃度的藥物作用24h，吸出藥液加入病毒液，按一般病毒吸附的時間，均採用37℃吸附1h吸出，加入含藥的維持液，置37℃、5％CO2恆溫箱培養48～96h，待病毒對照孔病變達+++～++++，細胞對照正常時測結果。將初篩有意義的病毒分4組進行實驗，探討藥物的具體作用環節。I組感染前24h給藥，吸出藥液，用Hank’s液洗3遍，加入病毒液。II組感染後給藥，先加液置37℃吸附1h洗去病毒加含藥維持液。III組藥液與病毒同時加入細胞層。IV組藥液與病毒混合置37℃、2h後加入細胞層。以上均設正常對照及病毒對照。
5.感染動物模型的建立及給藥方案病毒性心肌炎、胰腺炎，肺炎模型建立參見文獻。實驗動物隨機分為病毒感染模型組、正常對照組、聚合度為3～7的殼聚糖不同濃度給藥組，其他同類藥比較組，每組10隻，均在相同條件下飼養，均為ip給藥。
6.結果測定①光鏡下觀察細胞病變(CPE)；②染色攝入法；②藥物對組織細胞保護率計算。連續給藥1周，無菌取小鼠胰腺、肺、心臟，分別作病理學、組織學檢查，判斷藥物療效。
(三)結果利用光鏡檢查CPE，結果表明聚合度為3～7的殼聚糖可以不同程度地抑制14種病毒對組織細胞的CPE。在鏡下觀察CPE基礎上，用結晶紫染色細胞，測定吸光度，以便進一步客觀地反映加藥與不加藥之差別。I組實驗目的是觀察藥物能否進入細胞或吸附於細胞表面，以阻止病毒的吸附與穿入。結果表明，聚合度為3～7的殼聚糖此法對A3V，AdVIII，RSV，HSV-1，HSV-2，EV71，SARS、CVB3，CVB4，CVA15 10種病毒有意義(P＜0.05＝。II組實驗目的是觀察藥物能否對已進入細胞內的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟釋放。結果表明，聚合度為3～7的殼聚糖此法對A3V，AdVIII，MV，RSV，HSV-1，HSV-2，SARS、CVB3，CVB4，CVA15，EV71 11種病毒有意義(P＜0.05＝。III、IV組為藥物與病毒在不同條件下作用，觀察藥物對病毒直接滅活作用，結果表明。聚合度為3～7的殼聚糖對除RV以外的13種病毒均有作用。說明聚合度為3～7的殼聚糖無論是藥物與病毒同時加入細胞層或是藥物與病毒先作用2h然後加入細胞層，均具有抗病毒效應。對細胞的保護率最高可達96％。聚合度為3～7的殼聚糖對CVB4病毒感染所致的胰腺炎和心肌炎有明顯的保護作用，治療組胰腺組織結構基本正常，有少量淋巴細胞侵潤，心肌僅見小灶狀壞死，病毒對照鼠胰腺有大量淋巴細胞及分葉核細胞侵潤，心肌大片灶狀壞死。雙黃連對小鼠病毒肺炎有保護作用。
實施例四水溶性甲殼低聚糖抗病毒效應(一)實驗材料1.病毒與實驗用細胞柯薩奇病毒3、5型(CB3、CB5)，SARS病毒，腺病毒3、7型(AdV3、AdV7)，合胞病毒(RSV)，流感病毒，副流感病毒，水泡性口腔炎病毒(VSV)。Hep-2細胞，來源於人喉上皮細胞癌細胞系。
2.藥物水溶性甲殼低聚糖，分子量1500～1600。
(二)方法1.對CB、AdB、RSV、SARS病毒的體外抑病毒實驗①實驗用細胞選用對實驗用病毒敏感的製成1×105-6萬/ml的細胞懸液的Hep-2細胞。②實驗樣品對實驗用細胞毒性測定將樣品用細胞維持液從1∶10濃度開始做2倍系列稀釋，以對50％細胞產生毒性時的藥物濃度為CC50。③病毒感染滴度測定取CB3、CB5、AdV3、AdV7、RSV、SARS的新鮮病毒懸液，以10倍遞次稀釋法稀釋成不同稀釋度，分別接種到組織培養單層細胞管內，每管接種100ul，每個稀釋度接種4隻細胞管，使病毒與細胞充分接觸，37℃吸附1h，以Hank’s液洗3次，加入細胞維持液，37℃培養，逐日在普通顯微鏡下觀察記錄細胞病變情況，觀察1～5d，測定組織培養半數感染量TCID50。本實驗選用不同病毒的100TCID50/0.5ml。④中和實驗 將樣品自對細胞不產生毒性的前一孔濃度起作系列倍比稀釋，1藥物與100TCID50的病毒等量相加，搖勻放37℃水浴作用1.5h，接種到形成單層細胞的96孔培養板內，同時設病毒對照、正常細胞對照、中藥對照組，以產生50％細胞病變的藥物最高稀釋度作為判定結果。
2.對流感、副流感病毒的血凝抑制實驗取96孔培養板，將樣品順序作倍比稀釋至1∶5120，每孔加入4個單位的血凝素100ul等量混合，37℃作用1h，加入1％雞紅細胞各100ul，搖勻後置室溫30』、45』各觀察1次結果，以45』為準。對照組設藥物對照，病毒對照(分別加入4、2、1、1/2單位血凝素各100ul+生理鹽水各100ul、紅細胞對照，以上各對照組再分別加入1％雞紅細胞100ul，搖勻，在相同條件下觀察結果。以能完全抑制紅細胞凝集的最小藥物濃度為終點。
4.樣品誘生人白細胞幹擾素效價測定實驗①樣品誘生幹擾素將100ml新鮮人全血3000rpm離心1min，分離血漿，取血細胞加3倍量0.83％NH4Cl作用一定時間後，低速離心留取白細胞，稀釋成200萬單位/ml，與不同稀釋度的藥物混合，37℃搖床搖晃培養18h，離心，上清即為誘生的a幹擾素。②幹擾素效價測定將每組樣品每個稀釋度誘生的幹擾素分別做4倍稀釋，接種到已形成單層細胞的呢孔培養板內，同時設5組對照系統藥物對照系統、VSB病毒對照系統、藥物+VSV病毒對照系統、幹擾素(IFN)對照系統、正常細胞對照系統。37℃孵育24h，每孔加入100ul 100TCID50VSV病毒(藥物對照和正常細胞對照系統加入維持液)，待對照孔的細胞全部或75％以上發生明顯病變時閱讀結果，判定保護50％細胞免疫病毒破壞的樣品誘生幹擾素的稀釋度。
(三)結果水溶性甲殼低聚糖對CB3、CB5、AdV3、AdV7、RSV、SARS均有抑制效果。從樣品誘生幹擾素的效價測定結果來看，隨著樣品稀釋，誘生幹擾素的能力逐漸下降，證明水溶性甲殼低聚糖的抗病毒及免疫調節作用。
權利要求
1.甲殼素和殼聚糖及其衍生物在製備抗DNA或RNA病毒或逆轉錄病毒的藥劑中的應用。
2.權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述DNA病毒選自細小病毒科、乳多空病毒科、腺病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科和嗜肝DNA病毒科，所述RNA病毒選自小RNA病毒科、披膜病毒科、彈狀病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、冠狀病毒科、呼腸孤病毒科、RNA腫瘤病毒科和線狀病毒科。
3.權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述DNA病毒選自皰疹病毒科、腺病毒科，所述RNA病毒選自副粘病毒科、正粘病毒科、小RNA病毒科、冠狀病毒科、披膜病毒科、彈狀病毒科。
4.權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述病毒選自皰疹病毒科水痘病毒屬的水痘-帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒屬的單純皰疹病I、II型；腺病毒科腺病毒屬的腺病毒3、7型；副粘病毒科麻疹病毒屬的麻疹病毒、肺病毒屬的小鼠肺炎病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒-I；正粘病毒科流感病毒屬的的流感病毒、流感病毒亞甲型鼠肺適應株FM1；小RNA病毒科腸病毒屬的脊髓灰質炎病毒III型、埃可病毒6、11型、柯薩奇B族病毒3、4、5、6型、柯薩奇病毒A16、新型腸道病毒71型；冠狀病毒科冠狀病毒屬的SARS病毒；披膜病毒科風疹病毒屬的風疹病毒；彈狀病毒科水泡病毒屬的水泡性口炎病毒。
5.權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述病毒為冠狀病毒科冠狀病毒屬的SARS病毒。
6.任選權利要求1～5所述的應用，其特徵在於，所述甲殼素和殼聚糖及其衍生物分子量在2萬以下，40～80％脫乙醯度。
7.權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述甲殼素和殼聚糖衍生物選自羧甲基或丁基化，N季銨鹽化，磺化或N-硫酸鹽化，羥基化，二或三乙氨乙基化後水溶性較好的衍生物。
8.任選權利要求1～5所述的應用，其特徵在於，所述甲殼素和殼聚糖衍生物為分子量低於1萬的殼寡糖。
9.權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述甲殼素和殼聚糖衍生物為聚合度低於1～10的低聚甲殼素或殼聚糖，或者是它們的鹽酸鹽或硫酸鹽。
10.權利要求9所述的應用，其特徵在於，所述甲殼素和殼聚糖衍生物為聚合度為3～7的N-乙醯低聚殼聚糖或脫乙醯的低聚殼聚糖。
11.抗病毒藥物組合物，含有藥物可接受的治療有效量的甲殼素和殼聚糖衍生物藥劑。
全文摘要
本發明涉及甲殼素和殼聚糖及其衍生物在製備抗病毒劑中的應用，本發明通過抗病毒體外實驗以及動物實驗和組織病理學檢查，表明甲殼素和殼聚糖及其衍生物對DNA病毒或RNA病毒或逆轉錄病毒具有廣譜的抗病毒活性，對預防和治療病毒引起的疾病有良好效果，且沒有不必要的毒副作用，可製成抗病毒藥劑或消毒劑。
文檔編號A61K31/722GK1548056SQ03128740
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月8日 優先權日2003年5月8日
發明者朱永宏, 傅明, 曹鳳蘭, 楊悅武, 李旭 申請人:天津市金士力藥物研究開發有限公司