抑制hivtat反式激活作用的化合物的製作方法

2023-05-10 10:00:46

專利名稱：：抑制hivtat反式激活作用的化合物的製作方法
技術領域：
：本發明背景1.本發明領域本發明涉及1，4-雙-(3，4-二羥基苯)-2，3-二甲基丁烷(去甲二氫愈創木酸，NDGA)的衍生物的分離、純化和鑑別的方法。這些衍生物來源於雜酚油木(Larreatridentata，Zygophyllaceae)葉片及花的分離和提取，它們與NDGA一起可以抑制包括HIV病毒的慢病毒中Tat的反式激活作用。2.相關技術Tat是人類免疫缺損病毒(HIV)基因表達的一個反式激活蛋白。在HIV基因表達中，Tat是必不可少的兩個或更多的病毒調節因子之一(TatandRev)。Tat的作用是與TARRNA結合，並從長末端重複(LTR)啟動子方向激活轉錄反應。Tat蛋白質使轉錄反應的延長得以穩定，並且也已經證明Tat蛋白質參與了轉錄反應的啟動。前人的許多研究證明Tat調控與抗體相關的T細胞增生的減少，對免疫反應的失敗具有重大作用。Tat還直接刺激卡波濟細胞(Kaposi’scell)的生長。由於Tat沒有明顯的細胞同源物並且它是一個很重要的陽性調節因子，因此Tat已成為人們開發抗愛滋病(AIDS)藥物的一個很有吸引力的目標(見圖1)。另一方面，與現在也得到一些HIV反轉錄酶的抑制物(AZT，DDT)或防止再次感染的潛在的蛋白酶抑制物相比，抑制病毒基因Tat調控的整合前病毒DNA表達的抑制物將在早期捕捉到病毒(Hsuetal.，Science2541799-1802，1991)。對在真核宿主細胞中轉錄和後期轉錄水平上控制基因表達的抑制物的研究，近來使對現Tat功能的定量評估成為可能(Sim，Ann.N.Y.Acad，Sci.61664-70，1990)。為了篩選抑制物用於Tat調節的反式激活作用(Tat-TRS)，抑制物將分泌胎盤鹼性磷酸酶(SEAP)的識別基因放入質粒pBC12/HIV/SEAP並置於HIV-1LTR啟動子的控制之下。Tat編碼活性由另一個質粒pBC12/CMV/t2提供。COS細胞與這兩種質粒的短暫共轉染，使得鹼性磷酸酶分泌到培養基中，再被用樣品色度計分析(Bergeretal.，Gene661-10，1988)。因此，對SEAP的測定，間接提供了Tat反式激活作用的鑑別方法。一個抑制因子應該降低SEAP的活性，其原因是由於Tat蛋白質(Tat-TRS)引起的HIV-ILTR啟動子的反式激活作用抑制了SEAPmRNA表達的結果。本發明概述在本發明申請中，我們發現沙漠植物雜酚油木(Larreatridentata)對Tat-TRS有抑制活性。在從熱帶雨林和被傳統用於抗病毒感染的沙漠藥用植物中所提取的幾種植物成份中，只有雜酚油木(Larreatridetata)的葉和花的全部提取物對Tat-TRS有抑制作用。對慢性感染了HIV病毒的人成淋巴細胞，這種提取物也可以抑制HIV細胞病理作用，這一作用可以用新發現的可溶甲脂方法測定(Weislowetal.，JNCI81577-586，1989)。本發明所涉及的化合物具下述結構式其中R1，R2，R3和R4分別選自HO-、CH3O-和CH3(C＝O)O-基團，並且R1、R2、R3和R4不同時是HO-基團。每種化合物都是從雜酚油木的葉與花分離提取而來，並且每種化合物都是1，4-雙-(3，4-二羥基苯)-2，3-二甲基丁烷(去甲二氫愈創木酸，NDGA)的衍生物。除此以外，將DNGA或一種其衍生物給予細胞，NDGA和每一種其衍生物可以抑制包括HIV在內的慢病毒的Tat反式激活作用。圖1圖解說明HIV-1的生活史，以及包括Tat-TRS抑制物在內的可能性治療物的不同作用位點。1表示轉錄步驟，2表示病毒調節性的蛋白依賴性反式激活步驟。圖2表示在標準SEAP測定中誘導出的分泌鹼性磷酸酶的水平。圖3表示在分泌鹼性磷酸酶(SEAP)測定中，雜酚油木葉花提取物對Tat-TRS的抑制活性。圖4表示以分析用不易損壞的毛細管交聯5％苯甲基矽氧烷(HP-5)柱子的氣相色譜(GC)方法，分析在組分Lo中植物衍生的HIVTat抑制物質。組分Lo是四種成份的混合物。各洗脫時間(分鐘)表示在峰頂上。圖5表示以分析用不易損壞的毛細管交聯5％苯甲基矽氧烷(HP-5)柱子的氣相色譜(GC)方法，分析在組分Gr中植物衍生物的HIVTat抑制物質。組分Gr是一複合混合物。每一成份被洗脫下的時間(分鐘)標在峰頂上。圖6表示植物衍生物中單一化合物Malachi45-6(Mal4)對Tat誘導的SEAP表達水平的抑制以及NOGA在分泌的鹼性磷酸酶(SEAP)測定中的水平。圖7描述在分別兩個實驗中，用Mal4分別處理感染了HIV和沒有感染上HIV的CEM-SS細胞，用XTT甲脂的產生進行定量用以衡量活細胞。在實驗1中，未經Mal4處理的感染了HIV的細胞中XTT甲脂的產生是8.9％，在實驗2中是7.5％。在實驗1中，未感染HIV的細胞用·-·表示，感染的細胞用×-×表示。在實驗2中，未感染的細胞用…··表示，感染的細胞用×…×表示。EC50是4.25μg/ml或13.4μM。IC50估計為100μg/ml或325μM。最佳實施例本發明揭示1，4-雙-(3，4-二羥基苯)-2，3-二甲基丁烷或去甲二氫愈創木酸(NDGA)的衍生物的分離、純化和鑑別的方法。根據下面的各種方法，分離、純化和鑑別NDGA的每一種衍生物。材料和方法細胞系在補充加入10％小牛胎兒血清(FCS)和抗菌素的Isocove修改過的Dulbecco培養基中(Isocove’sModifiedDulbecco’sMedium)(IMDM)，培養帶有SV40原始複製段的COS-7細胞。將細胞放在37℃，溼潤的加有95％O2/5％CO2的溫箱中培養。質粒質粒pBC12/HIVSEAP包含Tat敏感的HIVLTR啟動子與SEAP識別基因，但不具備Tat編碼的功能，用這種質粒表達SEAP的基本活性；質粒pBC12/CMV/t2提供Tat編碼的功能，如誘發SEAP。質粒pBC12/RSV/SEAP包括構造的禽內瘤病毒(RSV)的Tat非敏感的LTR啟動子，作為陽性對照。上述所有質粒來自杜克醫學中心(DukeMedicalCenter)的BryanCullen博士。質粒pSEAP和pBKCMV，以及HIVLTR和TatDNA購於Clontech和Stratagene公司。用大腸肝菌(E.coli)MC1061菌株完成質粒的轉換，該菌株來自耶魯大學(YaleUniversity)，生物系的BarbaraBachmann博士。大腸肝菌MC1061菌株也可從Clontech公司購買到。使用Qiagen提純盒(Qiagen公司)純化所有質粒DNA。化學試劑二乙醇胺(#31589)和P-硝基苯磷酸酯(#71768)購於FlukaBiochemika公司，L-高精氨酸(#H-1007)購於SigmaCo.公司。脂精胺DOGS(Transfectam，#E123A，Promega)用於DNA轉染的研究。植物試驗材料根據醫學藥理學的要求，採集雜酚油木的葉片和花。乾燥植物材料並用一個帶有3mm篩孔的Willy研磨機研磨。在試驗性的研究中，用1g這種植物粉末，加入氯仿∶甲醇溶液連續浸泡並提取。提取物被濃縮至殘留物。所得到的總重量是176mg的粗提物用3ml己醇處理7次。該步驟產生137mg不溶於己醇的物質(HI)和31mg可溶於己醇的物質(HS)。所有這些提取按步驟被SiO2TLC與硫酸鈰炭化法檢驗2％CeSO4(W/V)於5.6％H2SO4(V/V)中，並用SEAP測定抗Tat-TRS的活性。對於SEAP測定法，被測試的材料溶解在以無鈣/鎂離子的PBS製備的10％DMSO溶液中。離心懸浮液，並用Millex-GS22μm(Millipore)的無菌過濾器過濾原液(10mg/ml)。適當稀釋原液，使最終DMSO在PBS中的濃度為0.2％，以得到各種濃度的測試化合物。應用逆流色譜法(CCC)進行不同的分級分離以及活性成份的純化基於上述SEAP檢測的分餾初步結果，用CCC方法進一步分級分離HI中的活性成份。因而得到被認為具有活性的兩種主要活性餾份，定為「綠色」和「黃色」組分。上述識別出主要活性組分的研究，促進了為得到大量的綠色和黃色組分物，而對大量的植物碎末材料進行全面的分級分離。這種分級分離採用了101.4g的植物碎末，並用己醇處理作為開始，如表1所述。利用逆流液體-液體分配色譜法，使用如Ito和Conway(CRC.CriticalReviewsofAnalyticalChemistry1765etseq；1986)所描述的萬能橫軸行星式離心機(CPC)對氯仿∶水提取後所得到有機相的主要化合物進一步分級分離。最佳溶劑體系是己醇∶EtOAC∶MeOH∶0.5％NaCl的混合物，它們之間的比例為6∶4∶5∶5，溶劑上層(有機層)為流動相。5g有機分離的溶解到23ml具有兩相的混合溶劑中，並使其通過迴路閥放入到蛇形管中。當轉速為800rpm時，流動相經蛇形管泵出。在流速大約為每分鐘4ml時，固定相約損失32％(保留下68％)。流動相進入流出液後，收集流動相的分離物，並將其蒸發至乾燥，用TLC檢測，並相應地將其合併為五批流頭(SF)，綠色(Gr)，黃色(Ye)，紅色和固定相(Stp)。然後所有這些分離物用SEAP方法來測定抗Tat-TRS的活性。利用CCC方法，使用一個行星蛇形管式離心機，該離心機也稱作Ito多層蛇形管分離-提取器(ItoandConway，CRC.CribicalReviewsofAnalyticalChemistry1765etseq，1986)對上述所得的綠色和黃色分離物進一步純化。溶劑是己醇∶EtoAC∶MeoH∶0.5％NaCl混合物(7∶3∶5∶5)。200mg綠色分離物純化出6.8mg被稱作Gr的成份，總產量大約是原始植物碎末的0.051％。用類似的方法，從黃色分離物中可純化出9.3mg被稱作Lo的成份。這些被提純了的成份(Lo和Gr)各自都由幾種化合物組成。純化的Lo和Gr作為「原」分離物，在測定其生物活性和用於更進一步的特徵研究前，將它們保存在4℃條件下。表1雜酚油木NDGA衍生物的逆流色譜(CCC)和分級分離細胞培養和DNA轉染COS細胞培養在如前所述的培養基中(Cullen，Cell46973-982，1986)。應用經過修改的脂精胺(Transfectam，Promega#E123A)方法，進行DNA轉染，該方法最早在其它地方描述過(LoefflerandBehr，MethodsinEnzymology217599-618，1993)。簡單地說，DNA轉染前一天，直徑為17mm的平底培養平板的Linbro24孔，以0.5ml的0.1％明膠無菌液預處理。該平板在無菌通風罩內放置1小時(除特別指出以外，所有轉染步驟均在無菌通風罩內進行)。明膠溶液被吸出後，用0.5ml補充加入10％小牛胎盤血清和抗菌素(完全培養基)的IMDM培養液衝洗平板。COS細胞以每一個17mm板大約1.5×105個細胞的密度接種，並在37℃，溼潤的，95％O2/5％CO2的培養箱中培養。當30-50％的細胞融合時，進行DNA轉染。按照生產廠家的建議，將Transfectam製劑，DOGS配製成在10％的乙醇蒸餾水中的濃度為1mg/0.380ml(2.38mg/mlor3.4mM)。在無菌試管中加入兩種溶液組成的轉染製劑a)溶液A中含有150mM無菌NaCl溶液十質粒DNAs(非選擇性/選擇性基團的比例為2∶1)每孔加入0.35μg的pBC12/HIV/SEAP+0.175μg的pBC12/CMB/t2(對Tat功能編碼)。b)溶液B含有等體積的150mMNaCl和Transfectam製劑，該製劑為DNA總量的6倍。將溶液A和B各自均化並立刻混合。反應進行十分鐘。同時，將生長培養基從亞融合的COS細胞中除去，並加300μl(100μl完全IMDM培養基+200μl未添加血清的培養基)於每一個孔中。在每一孔中加入相同體積的轉染製劑。對照樣品孔內不加DNA，只加入150mM無菌NaCl溶液，其它處理相同。所有樣品培養10到12小時後，加入700μl完全培養基。將在5％DMSO/無Ca-Mg離子PBS中製備的測試化合物，以不同的濃度迅速加入孔內。未經藥品處理的對照樣中只加入5％DMSO/PBS溶液(DMSO最終濃度是0.2％)。所有樣品再繼續培養48小時後，取出300μl每一培養樣品的上清液用作SEAP分析。分泌的鹼性磷酸酶(SEAP)測定按照最初描述的(Bergeretal.，Gene661-10，1988)方法進行分泌鹼性磷酸酶的分析。簡言之，取250μlCOS細胞培養基上清液的等分試樣，在65℃加熱5分鐘以選擇性地使內源磷酸酶失去活性(SEAP具熱穩定性)，在一小型離心機中離心2分鐘。取2×SEAP測定緩衝溶液100μl(1.0M二乙醇胺，pH9.8；0.5mMMgCl2；10mML-高精氨酸)，加入到100μl的樣品等分試樣中。二者混合後，轉移到一個96孔的平底培養盤中(Corning)。將預先加熱的底物溶液(120mMP-硝基苯磷酸酯溶於1×SEAP測定緩衝溶液)20μl，用一個多頭移液器加到己加好反應混合物的每一個孔中。在37℃培養60分鐘，每5分鐘用EL340i微盤續數儀(Bio-tekInstruments，Inc.)在A405吸收波下讀數，每次讀數前自動振動培養盤5秒鐘。在標準SEAP誘導測定中，依據吸收度的改變，以時間為橫坐標作圖。在篩選藥物測定中，在30分時SEAP表達抑制的百分率計算如下％抑制＝100-〔(CT+-C+)×100〕其中C-對照樣品(無DNA，無藥物)CT-對照樣品(+DNA，無藥物)C+藥物處理的樣品(無DNA，+藥物)CT+藥物處理的樣品(+DNA，+藥物)最佳的轉染技術多種多樣的技術被應用於真核細胞的DNA轉染。這些方法包括磷酸鈣或陽離子聚合物與DNA一同沉澱，以及應用化學的方法(洗滌劑、溶劑、酶、雙嗜性聚合體)或物理的方法(熱學、滲透壓或電擊、或粒子碰撞)改變細胞膜的通透性。這些技術都有不同程度的細胞毒性，並且轉染的效率不穩定。使DNA順利穿過完整無損的細胞質，被細胞攝取的先決條件是，「其DNA分子呈緊密狀態，並將其所帶的電荷包埋起來」。(LoefflerandBehr，MethodsinEnzymology217599-618，1993)。新近應用的Transfectam方法，已經成功地實現了上述要求。Transfectam試劑(雙十八烷基醯氨基氨基乙醯精胺)是一種合成的陽離子脂多胺化合物，它具有一個帶正電荷的領頭的精胺集團並與DNA(Kd=10-5-10-7M)有很強的親和力。這一領頭的精胺集團以共價鏈通過肽鍵與脂相連。這種脂精胺分子與DNA分子結合，將DNA分子用脂肪層包埋起來。在足夠多的脂精胺存在條件下，形成帶正電荷的脂類包埋的小球形狀的質粒DNA，而且複合體的脂肪部分與細胞膜融合，細胞內吞作用將DNA攝入細胞。用Transfectam試劑調控的DNA轉染方法，已經被證明具有比其它現有方法更高的轉染效率。(Bartheletal.，DNA和CellBiology12(6)553-560，1993)。以外，Transfectam是一種性能穩定的並且基本上無細胞毒性的製劑。然而，在選用COS細胞系進行DNA轉染時，要對達到理想轉染的幾個因素加以說明。這些因素包括轉染的延續時間，Transfectam試劑與DNA的比例，DNA的濃度，以及其它稀釋因子如NaCl的體積和離子強度。下面是得到理想轉染結果時的實驗條件。a)轉染的持續時間用COS細胞與固定濃度的質粒DNA一起培養來研究培養時間。這一研究的目的在於篩選出次最佳培養時間點以用於研究各種測試化合物對SEAP表達的抑制實驗。誘導SEAP表達的時間研究結果顯示(具體結果未描述)，SEAP的表達隨時間的延長有一定的增加。這種誘導開始於4小時之內，24小時達到最高。在10，12和15小時之間，沒發現有顯著的區別。因此，在所有後來藥物篩選的研究中，對SEAP表達的抑制實驗選用12-15小時作為適合的次最佳的DNA轉染培養時間。b)DNA濃度根據以前使用Transfectam試劑的研究結果(LoefflerandBehr，MethodsinEnzymology217599-618，1993)，決定DNA在轉染中的最佳濃度。對於共轉染，如已經報導的(Hsuetal.，Science2541799-1802，1991)，2∶1的比例(非選擇性基因/選擇性基因)被認為是最適合的。在Linbro17mm直徑24孔平底培養平板中，非選擇性的質粒pBC12/HIV/SEAP加入的濃度為每孔0.35μg，對Tat功能編碼的質粒pBC12/CMV/t2濃度為每孔0.75μg。c)Transfectam對DNA的比例和離子強度的確定Transfectam(DOGS)與質粒DNA的最佳比例和所用NaCl離子強度是在以前研究基礎上的修改值(LoefflerandBehr，MethodsinEnzymology2171799-1802，1993)，其確定如下所示將原濃度為1mg/0.400ml(2.38mg/ml)的Transfectam原液，配在10％(v/v)酒精的蒸餾水中，每一微克所用DNA需要6倍體積(μl)的原液。由以下關係式決定150mMNaCl的一個適當體積，以保證該溶液的最佳離子強度。NaCl體積(μl)＝Transfectam體積(μl)/0.6在選擇了上述最佳反應條件後，在標準測定中Tat所誘導出的SEAP水平的結果如圖2如示。概括地說，在補充加有10％小牛胎血清(FCS)和抗菌素的Isocove修改過的Dulbecco培養基中(IMDM)培養COS細胞。細胞以每孔大約1.5×105個細胞的濃度，接種到17mm直徑Cinbro24孔平底培養平板中，做三組重複樣品，接種後在37℃，加溼並在95％O25％CO2的培養箱中培養，直到細胞達到50％融合。次融合細胞用脂精胺的方法進行轉染(LoefflerandBehr，MethodsinEnzymology217599-618，1993)。吸乾次融合細胞的培養基，重新加入300μl新鮮培養基(IMDM加3％FCS)。對COS細胞進行三種處理的轉染。處理1為只加入質粒pBC12/HIV/SEAP(0.35μg/孔)，處理2為以0.175μg/孔的濃度加入質粒pBC12/CMV/t2(對Tat功能編碼)+pBC12/HIV/SEAP(0.35μg/孔)，處理3為只加入緩衝溶液(無DNA對照樣器)。該培養平板在培養12到15小時之後，加入700μl完全培養基(IMDM含10％FCS)。再培養48小時之後，取250μl該細胞培養的上清液的等份試樣，並在65℃加熱5分鐘，使細胞內的磷酸酶失去活性(SEAP具熱穩定性)。這些樣品在一小型離心機內離心2分鐘。並加入100μl2×SEAP測定緩衝溶液(1.0M二乙醇胺，pH9.8；0.5mMMgCl2；10mML-亮精氨酸)加入到100ml樣品的等份試樣中。將溶液混合後移入一個96孔平底的培養板中(Corning)。用一多頭滴定器將20μl預先加熱的底物溶液(120mM硝基苯磷酸鹽溶於1×SEAP測定緩衝溶液)滴加到含有上述反應混合液的每一孔中。該培養板在37℃條件下培養60分鐘，每5分鐘用一臺EL340i微盤讀數儀(Bio-tekInstruments，Inc.)在A405吸收波下讀數，每次讀數前自動振動培養盤5秒鐘。象以前所描述的一樣(Bergeretal.，Gene661-10，1988)，吸收度的改變被換算為SEAP的表達水平的mU單位，並對照時間作圖。實驗結果表明，在一小時之後，誘導的SEAP水平比較無DNA的對照樣品，或只用非選擇性基團(HIV/SEAP)的誘導水平增加了幾乎65倍。以檢測為指導的應用逆流色譜法分離雜酚油木提取物的活性成份如上所述，應用逆流色譜法(CCC)對雜酚油木提取成分進行不同的分級分離及純化，分離得到兩大組分(表1)。用SiO2TLC方法從綠色分離物中分離到6.8mg的被稱為Gr的成份，總收穫率大約是開始植物碎末重量的0.051％。從黃色分離物(Ye)中分離出9.3mg被稱為Lo的成份。雜酚油木葉和花的提取物對Tat-TRS活性的抑制作用用幾種植物提取物進行SEAP測定試驗發現，只有從雜酚油木Larreatridertata葉和花的提取物顯示出對HIVTat蛋白質活性有明顯的抑制作用。如圖3所示，雜酚油木對SEAP的表達有依據劑量的抑制作用。概括地說，用三組重複的COS細胞應用上述脂精胺方法，以2∶1的比例轉染混合質粒pBC12/HIV/SEAP和pBC12/CMV/t2(Tat功能編碼)。轉染後，細胞培養12-15小時。雜酚油木的提取母液(10mg/ml)以10％DMSO無Ca/鎂離子的PBS溶液製備，並用一個Millex-GS22μm的過濾器(Millipore)進行無菌過濾。將適當濃度的雜酚油木的提取液加到己轉染DNA的細胞液中，使樣品中DMSO的最終濃度為0.2％，並將樣品再培養48小時。SEAP測定，從每孔中取250μlCOS細胞培養液的上清液，並在65℃加熱5分鐘，使細胞內的磷酸酶失去活性(SEAP具有熱穩定性)。用一小型離心機離心樣品2分鐘。從離心後的樣品中各取出100μl上清液，將100μl2×SEAP測定緩衝溶液(1.0M二乙醇胺，pH9.8；0.5mMMgCl2；10mML-高亮精氨酸)加入到100μl樣品的等份試樣中。將溶液混合後移入到一個96孔平底的培養平板中(Corning)。用一多頭滴定器將20μl預先加熱的底物溶液(120mM硝基苯磷酸鹽溶於1×SEAP測定緩衝溶液)滴加到含有上述反應混合液的每一孔中。該培養板在37℃下培養60分鐘，每5分鐘用EL340i微盤讀數儀(Bio-tekInstruments，Inc.)在A405吸收度下讀數，每次讀數前儀器會自動振動培養板5秒鐘。在30分鐘時，SEAP表達的抑制百分比計算如下％抑制作用＝100-〔(CT+-C+)/(CT--C-)×100〕其中C-對照樣品(無DNA，無藥物)CT-對照樣品(+DNA，無藥物)C+藥物處理的樣品(無DNA，+藥物)CT+藥物處理的樣品(+DNA，+藥物)如圖3中所看到的，當濃度是20μg/ml時，開始出現抑制作用；當濃度是600μg/ml時，抑制作用達到最大值。對於這種粗提物質，它的EC50(抑制50％時的濃度)估計為110μg/ml。隨著這些活性成份被進一步純化，這種(些)活性成份的活性作用逐漸增加，比較最原始的總的粗提物的21％，經分離後的有機相分離物其活性提高了三倍(68％)。HIV細胞藥理作用的抑制一種抑制Tat反式激活作用的化合物，應該能阻斷HIV的複製。因而雜酚油木提取物被送到國家癌症研究所(NCI)，用甲脂溶解測定方法試驗該提取物對HIV細胞病理機制的抑制作用(Weislowetal.，JNCI81577-586，1989)。用CEM-SS細胞(ATCC，Rockuille，MD)與產生HIV的H9細胞一起培養。HIV病毒侵染寄生CEM-SS細胞，在一周內，病毒在CEM-SS細胞內複製並殺死多數細胞。如果該藥物能抑制HIV的在細胞內的繁殖，那麼CEM-SS細胞就可以避免由於HIV的存在而死亡。四唑翁製劑是由於活細胞的代謝減弱而得到一種帶顏色的甲脂產物，在450nm的色度計φ可以測量到。在實驗中，將三組CEM-SS細胞(5000)加入到96孔微滴定板中。將適當濃度的測試化合物加到5％DMSO無鈣/鎂離子的PBS溶液，最終液體體積為100μl。對照樣品中只加化合物的介質(PBS)。五分鐘後，將500高度侵染性HIV-I的H9細胞或正常的H9細胞加入到已含有適當濃度藥物的孔中。該微滴板在37℃，95％O2/5％CO2條件培養6在後，加入50μlXTT與甲硫酸N-甲基吩嗪翁(PMS)的混合物。之後再培養4小時，觀察其顏色的變化(XTT甲脂產物)。將微滴板封好，用一臺微盤讀數儀在OD450測定樣品，在讀數之前讀數儀自動搖動滴板，使孔內成份混合均勻。每一數值代表三次讀數的平均。在測試化合物存在的條件下，未侵染的細胞與HIV感染了的細胞其兩次重複數據的平均值之間沒有顯著差異。相反，感染了HIV的樣品在有測試化合物或沒有測試化合物存在的條件下，兩次重複數據的平均值之間有顯著性差異(P＜0.05)。上述研究結果歸納在表2之中，濃度為0.75μg/ml的Gr成份對HIV的抵禦為58％(細胞成活率)，而Gr不存在時，只有15％的細胞成活。在成份Lo只有0.187μg/ml這麼低時，也顯示了對HIV細胞病理活性的更強抑制。在有HIV侵染的樣品中，成活細胞是87％，該百分比與沒有加入侵染的HIV對照樣品的結果(89％)很接近；相反，在沒有成份Lo，侵染HIV存在時，成活細胞只為14％。所用的這些化合物的濃度，不會對細胞造成毒害。表2.在溶解性甲測定法中，雜酚油木提取化合物對HIV-1細胞病理機制的抑制作用不殺死細胞並用XXT甲產物測定在第六天時成活細胞的百分率可最大程度抵未感染感染HIV感染HIV御HIV的測加加無測試樣品試樣品的濃度測試樣品測試樣品測試樣品μg/ml綠色分離物0.187596716成分Gr0.75806716-重複成分Gr0.75704814黃色分離物0.187605714成分Lo0.187918614-重複成分Lo0.187898714雜酚油木提取物活性成份的結構說明確定已經純化了的從植物提取的活性組分的化學性質，主要採用質譜儀和H-與C-的核磁共振(NMR)的方法。發現成份Lo是四種相關化合物的混合體(L1，L2，L3和L4)。應用氣相色譜(GC)方法，該方法用一個分析用不含換壞的毛細管並以5％苯甲基矽氧烷(HP-5)交聯成的柱子，該柱子與一臺質譜質相連接，對上述混合物的每一峰值進行分離和鑑別。GC研究發現，第一化合物(L1)佔混合成份的6％；第二化合物(L2)佔總混合成份的76％(MW＝316)；第三化合物(L3)與L2為異構體並佔總混合成份的9％(MW＝316)；第四化合物(L4)佔總混合成份的9％(MW＝358)。這些化合物從柱子中流出的時間標在圖中的蜂值處(圖4)。組份Gr包括五種化合物。應用氣相色譜(GC)方法，該方法以分析用不會損壞的毛細管交聯5％苯甲基矽氧烷(HP-5)而成的柱子與一臺質譜儀相連接，對上述混合物的每一峰值進行分析和鑑別。該GC研究發現，十五種化合物中的四種(G1，G2，G3和G4)是木酚素，並與L化合物結構相關。這些化合物從柱子中流出的時間在圖中的蜂處標出(圖5)。這八種(L1，L2，L3，L4，G1，G2，G3和G4)化合物的化學結構描述如下L1的成份是C18H22O4，已經確認出該化合物與以前已知的一化學品相同，為1，4-雙-(3，4-二羥基苯)-2，3-二甲基丁烷(去甲二氫愈創木酸，NDGA，MerckIndex，10thEdition，#6534)。L1的化學結構式如下L2由C19H24O4組成，並被確認為3-O-甲基-NDGA或1-(3，4-二羥基苯)-4-(3-甲氧基-4-羥基苯)-2，3-二甲基丁烷。3-O-甲基-NDGA結構式如下L3也含有C19H24O4，並被確認為4-0-甲基-NDGA或1-(3，4-二羥基苯)-4-(3-羥基-4-甲氧苯基)-2，3-二甲基丁烷。4-O-甲基-NDGA還被記載為Malachi45-6或Mal4。4-O-甲基-NDGA結構式如下L4由C21H26O5組成，並被確認為3-O-甲基-4-O-乙醯基-NDGA或1-(3，4-二羥基苯)-4-(3-甲氧基-4-乙酸苯基)-2，3-二甲基丁烷。3-O-甲基-4-O-乙醯基-NDGA結構式如下G1的分子量為344，由C21H22O4組成，並被確認為3，3』，4-三-O-甲基-NDGA或1-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-4-(3，H-二甲氧基苯基)-2，3-二甲基丁烷。3，3』，4-三-O-甲基-NDGA結構式如下G2的分子量是344，由C21H22O4組成，被確認為3，4，4』-三-O-甲基-NDGA或1-(3-甲氧基-4-羥基苯)-4-(3，4-二甲氧基苯)-2，3-二甲基丁烷。該3，4，4』-三-O-甲基-NDGA的結構式如下G3和G4的分子量都是372，由C22H28O5組成。G3是3』，4-二-O-甲基-3-O-乙醯基-NDGA(如G3A)或3，3』-二-O-甲基-4-O-乙醯基-NDGA(如G3b)。3』，4-二-O-甲基-3-O-乙醯基-NDGA也被稱作1-(3-甲氧基-4-羥基苯基)-4-(3-乙醯氧基-4-甲氧基苯基)-2，3-二甲基丁烷，其結構式如下G3a3，3』-二-O-甲基-4-O-乙醯基-NDGA也稱作為1-(3-甲氧基-4-羥基苯)-4-(3-甲氧基-4-乙醯氧基苯)-2，3-二甲基丁烷，結構式如下G3b類似地，G4為4，4』-二-O-甲基-3-O-乙醯基-NDGA(如在G4a中)或3，4』-二-O-甲基-4-O-乙醯基-NDGA(如在G4b中)。4，4』-二-O-3-O-乙醯基-NDGA也被稱作為1-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-4-(3-乙醯氧基-4-甲氧苯基)-2，3-二甲基丁烷，其結構式如下G4a3，4』-二-O-甲基-4-O-乙醯基-NDGA也稱作為1-(3-羥基-4-甲氧苯基)-4-(3-甲氧基-4-乙醯氧基苯)-2，3-二甲基丁烷，其結構式如下G4b除上面所述的分離和純化方法以外，每種所揭示出的NDGA的衍生物也可以應用Ikeya等(Chem.Pharm.Bull.27(7)1583-1588，1979)的方法，通過對NDGA甲基化和/或乙醯化的化學合成方法而得到。大量提純Lo組分以及從Lo組分中提純兩種純化物(L2和L3)對一大批植物材料應用大規模CCC分級分離方法，以得到大量的組份Lo。總共稱取110g植物碎末，先用700ml己醇處理5次，去掉溶於己醇的物質(1.17g)。乾燥不溶於己醇的物質(HI組分)，並用800ml氯仿甲醇溶液連續浸漬三次。這樣總共得到20g提取物(Jex)，並將其與前一批得到的7.6gHI組份合併在一起，因此共得到27.6g植物粗提物。將其分為10g和17.6g兩批做進一步分離。這兩批樣品先分別在己醇∶EtoAc∶MeOH∶0.5％NaCl其比例為6∶4∶5∶5的溶劑系統中過大容量可能橫軸CPC(Shinomiyaetal.，J.Chromatogr644215-229，1993)，其上層(有機層)作為流動相。完全根據TLC的圖形將所得到的分離物放在一起，從兩次CCC的分離中共確定出四種主要的組份，它們是綠色組分(Gr)(1.12g)，組份Lo(2.87g)，末尾組分(1.78g)，和最後固定相SP(20.84)。所得到整個2.87g的Lo組份用己醇∶EtoAc∶MeOH∶H2O其比例為7∶3∶5∶5的系統在大型三聯體CPC中進一步分離，水質層作為流動相。根據脫流出的先後順序及TLC圖形，四個分離物分別定為LYI(0.375g)，LYII(0.113g)，LYIII(0.280g)和LYIV(2.80g)。這些分離物以10μg/ml的濃度進行抗Tat-TRS活性的測定。根據測試的結果，選擇LYI做進一步提純。從組份Lo中的LYI分離物中分離純淨的L2和L3化合物採用前面已經改善了的條件，如三聯體CPC用Hex∶CHCl3∶MeOH∶10mMNaCl其比例為1∶4∶4∶2的溶劑系統來進一步較少疏水性的LYI組份。得到經NMR和質譜儀確定的148mgL3類似物和109.3mg的純淨L2oL3(Malachi45-6)和L2的結構式前面已有描述。化合物L2和L3都是以前已定名的化學品1，4-雙-(3，4-二羥基苯)-2，3-二甲基丁烷(去甲二氫愈創木酸，NDGA，MerckIndex，10thEdition，#6534)的衍生物。MDGA的結構式與前所述L1的結構式相同，如下NDGA和它的衍生物的抗-HIV活性(Tat調控HIV反激活的抑制作用)以前不為人知。NDGA和其衍生物Malachi45-6(Mal4)的抗-HIV反式激活作用的活性比較見圖6所示。概括地說，用上面已經描述過的脂精胺方法對兩組重複的亞融合態的COS細胞，分別同時轉染質粒pBC12/HIV/SEAP和pBC12/CMB/t2(Tat功能編碼)。然後培養轉染細胞12到15小時。先將所要測試的化合物溶解到10％DMSO/無鈣-鎂離子的PBS溶液中，再將其以適當的濃度加到已轉染了的細胞中，使DMSO的最終濃度為0.2％。樣品培養48小時之後，每一樣品取250μl的細胞培養上清液，用圖3中的標準測定曲線進行SEAP分析。在30分鐘時SEAP表達抑制百分率的計算方法如下％抑制作用＝100-〔(CT+-C+)/(CT--C-)×100〕其中C-對照樣品(無DNA，無藥物)CT-對照樣品(+DNA，無藥品)C+藥物處理樣品(無DNA，+藥物)CT+藥物處理樣品(+DNA，+藥物)圖中每一點代表兩組數據的平均值。Mal4和NDGA其濃度分別是8μg/ml(25μM)和6μg/ml(20μM)，它們的EC50值之間沒有顯著性差異。EC50是指在未處理的對照細胞中，Tat調控的HIV反式激活作用降低到50％時，所測試的化合物的抑制濃度。比較Mal4和NDGA所產生的HIV反式激活作用的抑制見表3。表3天然化合物Mal4和NDGA對HIV啟動子活性的反式激活作用的抑制化合物NDGA和Mal4如圖6所示測定。對照樣品做四次重複。30分鐘後的抑制百分比和OD405值是C-對照樣品(無DNA，無藥物)0.091CT-對照樣品(+DNA，無藥物)0.805圖7所示的是Mal4處理CEM-SS細胞後，作為衡量細胞成活的XTT甲脂產物的數量。圖中的每一點表示經過連續Mal4稀釋的感染或未感染HIV的CEM-SS靶細胞(104/M孔)。EC50表示Mal4的濃度(如13.4μM)將感染培養物的XTT甲脂產生量增加(即保護)到未感染、未處理的培養細胞的50％的Mal4的濃度(例如，13.4μM)。IC50表示將未感染的培養細胞的XTT甲脂產量降低到未處理、未感染的對照細胞的50％的Mal4抑制或毒性濃度(例如，325μM，估計值)。未處理的感染對照細胞的XTT甲脂產量是未處理的未感染對照細胞的9％。對HIV-1細胞致病作用的溶解性甲脂檢測按照Weislowetal.，JNCI81577-586，1989所述的程序進行。雖然本發明已經按照現在認為是最佳和最實際的方案進行了描述，但應該理解的是本發明並不應該僅限於這些實例，與此相反，不離開本發明的實質和附屬的權利要求書的範圍的其它變型和修飾都是本發明所包含的。因此，應該理解的是在不脫離權利要求書所限定的本發明的創新方面的前提下，可以有眾多的NDGA衍生物的變型，以及對Tat反式激活的抑制方法。權利要求1.一種如下述結構式所示的化合物其中R1，R2，R3和R4分別選自HO-、CH3O-和CH3(C＝O)O-基團，並且R1、R2、R3和R4不能同時是HO-基團。2.根據權利要求1的化合物，其中R1、R2和R3均為HO-，且R4是CH3O-，結構式如下3.根據權利要求1的化合物，其中R1、R2和R4均為HO-，R3是CH3O-，結構式如下4.根據權利要求1的化合物，其中R1和R2是HO-，R3是CH3(C＝O)O-且R4是CH3O-，結構式如下5.根據權利要求1的化合物，其中R1、R3和R4均為CH3O-，R2是HO-，結構式如下6.根據權利要求1的化合物，其中R1是HO-，且R2、R3和R4均為CH3O-，結構式如下7.根據權利要求1的化合物，其中R1和R3為CH3O-，R2是HO-且R4是CH3(C＝O)O-，結構式如下8.根據權利要求1的化合物，其中R1和R4是CH3O-，R2是HO-且R3是CH3(C＝O)O-，結構式如下9.根據權利要求1的化合物，其中R1是HO-，R2和R3是CH3O-且R4是CH3(C＝O)O-，結構式如下10.根據權利要求1的化合物，其中R1是HO-，R2和R4是CH3O-且R3是CH3(C＝O)O-，結構式如下11.一種在細胞中抑制慣病毒的Tat反式激活作用的方法，包括下列步驟a)將雜酚油木Larreatridentata的提取物用於細胞，其中所述的提取物選自於氣相色譜圖譜如圖4中所示的提取物，和氣相色譜圖譜圖5中所示的提取物；和b)使該提取物在細胞內抑制慢病毒的Tat反式激活作用。12.一種在細胞中抑制慢病毒Tat反式激活作用的方法，包括下列步驟a)將具有下述結構的一種化合物用於細胞；和b)使該化合物抑制慢病毒在細胞中的Tat反式激活作用。13.一種在細胞中抑制慢病毒Tat反式激活作用的方法，包括下列步驟a)將具有下述結構式的化合物用於細胞其中R1、R2、R3和R4分別選自HO-，CH3O-和CH3(C＝O)O-，並且R1、R2、R3和R4不能同時是HO-；和b)使該化合物抑制細胞內慢病毒的Tat反式激活作用。14.根據權利要求13的方法，其中R1、R2和R3均為HO-且R4是CH3O-，該化合物結構式如下15.根據權利要求13的方法，其中R1，R2和R4均為HO-且R3是CH3O-，該化合物結構式如下16.根據權利要求13的方法，其中R1和R2是HO-，R3是CH3(C＝O)O-且R4是CH3O-，該化合物結構式如下17.根據權利要求13的方法，其中R1、R3和R4均為CH3O-且R2是HO-，該化合物的結構式如下18.根據權利要求13的方法，其中R1是HO-且R2、R3和R4均為CH3O-，該化合物的結構式如下19.根據權利要求13的方法，其中R1和R3是CH3O，R2是HO-且R4是CH3(C＝O)O-，該化合物的結構式如下20.根據權利要求13的方法，其中R1和R4是CH3O-，R2是HO-且R3是CH3(C＝O)O-，該化合物的結構式如下21.根據權利要求13的方法，其中R1是HO-，R2和R4是CH3O-且R4是CH3(C＝O)O-，該化合物的結構式如下22.根據權利要求13的方法，其中R1是HO-，R2和R4是CH3O-和R3是CH3(C-O)O-，該化合物的結構式如下全文摘要本發明揭示了從雜酚油木Larreatridentata分離、純化及鑑別具有結構式(I)的一組化合物。在結構式中，R文檔編號A61K31/222GK1162301SQ9519603公開日1997年10月15日申請日期1995年9月22日優先權日1994年9月30日發明者R·C·黃,J·N·格納布裡申請人:約翰斯·霍普金斯大學