檢查晶片、檢測裝置以及被檢物質的檢測方法

2023-05-10 09:52:06 2

專利名稱：檢查晶片、檢測裝置以及被檢物質的檢測方法
技術領域：
本發明涉及使用通過修飾被檢物質的修飾物質的光激勵而發生的電流來檢測被
檢物質的檢查晶片、檢測裝置以及被檢物質的檢測方法。
背景技術：
在疾病的臨床檢查及診斷中，用遺傳因子檢測法、免疫學的檢測法來檢測生物體 樣品中所包含的疾病由來的遺傳因子及蛋白質等。具體而言可列舉免疫膠體金層析法 (Imm皿ochromato)、乳膠凝集法(Latex Agglutination)、酵素免疫法、化學發光免疫法以 及遺傳因子增幅PCR法等。 但是，這些檢測方法從簡易性、快速性、以及成本的任一觀點來看都有改善的餘 地。 因而，在國際公開第2007/037341號小冊子中提出了將通過增感色素的光激勵而 產生的電流利用於被檢物質檢測的方法。在這一方法中，首先在電極上形成半導體層，並在 此半導體層上固定可以與被檢物質結合的探針。接著，在利用探針物質捕捉到用增感色素 修飾過的被檢物質以後，對正在修飾被檢物質的增感色素照射使增感色素激勵的光。其結 果，就從正在修飾被檢物質的增感色素發生電子，通過所發生的電子被半導體層所接納，而 產生電流。對所產生的電流進行檢測。這裡使用矽烷偶聯劑等架橋劑，在半導體層上固定 探針。但是，由於矽烷偶聯劑其導電性較低從而使電流的檢測效率降低，所以就有被檢物質 的檢測靈敏度較低之類的問題點。

發明內容
亦即、本發明提供以下技術方案 (1) —種檢查晶片，用來檢測利用通過光激勵而產生電子的修飾物質修飾後的被 檢物質，包括 具備被形成在半導體層上的金屬層的半導體電極部；
捕捉被檢物質的被固定在上述金屬層上的探針；以及
具備導電層的對極部。 (2)在技術方案(1)所記載的檢查晶片中，上述金屬層由通過電解液而溶解的金 屬組成。
(3)在技術方案(2)所記載的檢查晶片中，上述電解液包含碘或者碘化物。
(4)在技術方案(1) (3)中任意一項所記載的檢查晶片中，上述金屬層由與上述 探針進行化學吸附的金屬組成。 (5)在技術方案(4)所記載的檢查晶片中，與上述探針進行化學吸附的金屬是金。
(6)在技術方案(4)所記載的檢查晶片中，上述探針具有硫醇基作為與上述金屬 層進行化學吸附的結合基。
(7) —種檢測裝置，用來檢測用通過光激勵而產生電子的修飾物質經過修飾的被檢物質，包括 以可受納檢查晶片的方式而構成的檢查晶片受納部，其中該檢查晶片包括具備 被形成在半導體層上的金屬層的半導體電極部；捕捉被檢物質的被固定在上述金屬層上的 探針；和具備導電層的對極部； 對修飾物質進行光激勵的光源，該修飾物質對上述檢查晶片受納部上所插入的上 述檢查晶片內的被檢物質進行修飾；以及 電流測定部，測定通過上述光源的光激勵而從正在對被檢物質進行修飾的修飾物 質流出的電流。 (8)在技術方案(7)所記載的檢測裝置中，上述光源發出激勵正在對被檢物質進 行修飾的修飾物質的波長的光。 (9) —種檢測方法，用來檢測用通過光激勵而產生電子的修飾物質經過修飾的被 檢物質，包括以下步驟 在包括具備被形成在半導體層上的金屬層的半導體電極部；捕捉被檢物質的被固
定在上述金屬層上的探針；和具備導電層的對極部的檢查晶片上應用包含被檢物質的樣
品，由此用被固定在上述金屬層上的上述探針來捕捉被檢物質； 將修飾物質導入被檢物質； 照射對修飾物質進行激勵的光；以及 檢測從經過激勵的修飾物質所產生的電流。 (10)在技術方案(9)所記載的檢測方法中，還包括在上述半導體電極部和上述 對極部之間添加用於流過電流的電解質媒體。


圖1是作為本發明的一個實施方式的檢測裝置1的立體圖。 圖2是檢測裝置1的框圖。 圖3是在檢測裝置1上使用的檢查晶片4的立體圖。 圖4是表示具有檢查晶片4的半導體電極部15的上部板極的立體圖。 圖5是表示具有檢查晶片4的對極部16的下部板極的立體圖。 圖6是將上基板13卸下時的檢查晶片4的立體圖。 圖7是表示檢查晶片4之結構的截面圖。 圖8是表示檢查晶片4的半導體電極部15以及對極部18之結構的示意圖。 圖9是表示由用戶進行的將檢體注入到檢查晶片4的方法的流程圖。 圖10是表示檢測裝置1的檢測動作過程的流程圖。 圖11是雜交反應時和電解液添加時的半導體電極部15的示意圖。 圖12是表示通過實施例1以及比較例1的測定所獲得的光電流值的圖表。 圖13是在實施例2以及比較例2中所檢測出的光電流值的圖表。 圖14是表示在實施例2以及比較例2中所獲得的數據之中、來源於修飾物質的電
流值的圖表。 圖15是在實施例3、比較例3以及比較例4中所檢測出的光電流值的圖表。 圖16是在實施例4、比較例5以及比較例6中所檢測出的光電流值的圖表。
圖17是在實施例5中所檢測出的各膜厚下的S/N比的圖表。
具體實施例方式
以下，基於附圖所示的實施方式來記述本發明。此外，本次所公開的實施方式應當 被認為在所有方面都是示例而不是限制性的。本發明的範圍並非上述實施方式的說明而是 由權利要求的範圍所表示、進而還包含與權利要求的範圍均等的意味以及在其範圍內的所 有變更。〔檢測裝置之結構〕 圖1是表示本發明的一個實施方式所涉及的檢測裝置的立體圖。此檢測裝置是檢 測從生物體細胞所採取的或者以人工方式所合成的核酸、蛋白質、肽等具有特異結合性的 被檢物質的裝置。此檢測裝置1例如能夠從檢體樣品中檢測出作為子宮頸癌的原因病毒的 人類乳頭狀瘤病毒(以下稱之為HPV)的mRNA。 本實施方式的檢測裝置1具備插入檢查晶片4的晶片受納部3和顯示檢測結果的 顯示器2。另外，檢查晶片4還具備樣品注入口 11。 此檢查晶片4是一次性的HPV檢測用的晶片，被插入到檢測裝置1的晶片受納部 3。檢查晶片4具有如下功能，即通過從樣品注入口 ll注入檢體樣品，來捕捉用藉助於光激 勵而產生電子的修飾物質修飾過的HPV的mRNA。 圖2是表示檢測裝置1之結構的框圖。檢測裝置1具備光源5、電流計6、電源32、 A/D變換部7、控制部8和顯示器2。 光源5將光照射到對用檢查晶片4所捕捉到的HPV的mRNA進行了修飾的修飾物 質，以使修飾物質激勵。電流計6測定起因於從被激勵的修飾物質所產生的電子而流過的 電流。電源32對設置於檢查晶片4上的電極施加規定的電位。A/D變換部7對電流計6所 測定的電流值進行數字變換。控制部8由CPU、 ROM以及RAM等所構成，對光源5、電流計6 以及顯示器2的動作進行控制。另外，控制部8根據用A/D變換部7經過數字變換的電流 值，基於預先所作成的表示電流值與HPV量之關係的檢量線來估算檢體樣品中的HPV量。顯 示器2顯示用控制部8估算後的檢體樣品中的HPV量。
〔檢查晶片4之結構〕 使用圖3 圖8就檢測裝置1上所使用的檢查晶片4之結構進行說明。
圖3是檢查晶片4的立體圖。檢查晶片4具備下基板16、設置於下基板16上方 的上基板13、被夾在下基板16和上基板13中的矽橡膠12。另外在上基板13上還設置有 通往內部的樣品注入口 11。 圖4是使圖3的檢查晶片4在水平方向向右旋轉90度，並在垂直方向上旋轉180 度的狀態下的上基板13的立體圖。在此上基板13的表面上形成有半導體電極部15和被 連接到半導體電極部15的電極引線14。上基板13由二氧化矽(Si02)而形成，電極引線 14由氧化銦錫(IT0)和摻雜銻氧化錫(AT0)兩層而形成。關於半導體電極部15使用圖8 在後面敘述。 圖5是使圖3的檢查晶片4在水平方向向右旋轉90度的狀態下的下基板16的立 體圖。在下基板16的表面上分別形成有對極部18、被連接到對極部18的電極引線17、參 考電極31 、被連接到參考電極31的電極引線30。
下基板16用以二氧化矽(Si02)為主體的玻璃而形成，對極部18、電極引線17、參 考電極部31以及電極引線30分別用鉑而形成。 圖6是將圖3的檢查晶片4的上基板13在上方卸下時的檢查晶片4的立體圖。 矽橡膠12如圖6所示那樣以包圍對極部18以及參考電極部31的方式被配置在下基板16 上。連接到對極部18的電極引線17以及連接到參考電極部31的電極引線30從矽橡膠12 的框內延伸到框外。這一延伸到框外的電極引線17以及電極引線30與電源32連接起來。
設置於上基板13的樣品注入口 11是貫通上基板13的孔。檢體樣品以及後述的 電解液從這一樣品注入口 11被注入到矽橡膠12的框內。 圖7是表示圖3的檢查晶片4的A-A截面結構的截面圖。如圖7所示那樣，檢查 晶片4上所包含的上基板13和下基板16隔著矽橡膠12而配置。在上基板13和下基板16 之間形成有空間25。隔著此空間25，被形成在上基板13上的半導體電極部15和被形成在 下基板16上的對極部18以及參考電極部31 (未圖示)相對置。在此空間25上經由樣品 注入口 11而注入檢體樣品以及後述的電解液。 如圖7所示那樣，連接到半導體電極部15的電極引線14沿著上基板13延伸到空 間25之夕卜，連接到對極部18上的電極引線17以及連接到參考電極部31的電極引線30(未 圖示)沿著下基板16延伸到空間25之外。這一電極引線14被連接到電流計6，電極引線 17以及電極引線30被連接到電源32。 此外，在本實施方式中，在上基板13的表面形成半導體電極部15，在下基板16的 表面形成對極部18和參考電極部31，但半導體電極部15、對極部18、參考電極部31的配置 關係只要是各電極與其他電極不接觸地配置在矽橡膠12的框內則並不特別進行限制。例 如，還可以在同一基板上配置半導體電極部15、對極部18和參考電極部31。
這裡，就圖4所示的半導體電極部15進一步進行詳細的說明。圖8是表示半導體 電極部15以及對極部18之結構的示意圖。 半導體電極部15具備形成在上基板13上的導電層21、形成在導電層21上的半 導體層20、形成在半導體層20上的金屬層19。對極部18形成在下基板16上。
在半導體電極部15中所包含的金屬層19上固定著捕捉用藉助於光激勵而產生電 子的修飾物質22修飾後的HPV的mRNA24用的探針23。這一修飾物質22是釕絡化物，修飾 物質22通過與mRNA進行肽結合來修飾mRNA。 半導體電極部15上所連接的電極引線14被連接到電流計6，對極部18上所連接 的電極引線17以及參考電極部31上所連接的電極引線30被連接到電源32。電流計6與 電源32連接起來，用此電流計6來測定在半導體電極部15與對極部18之間流過的電流。
半導體電極部15中所包含的導電層21由通過濺射而形成的氧化銦錫(ITO)的 層、和在此ITO層上通過濺射而形成的摻雜銻氧化錫(ATO)的層這兩層組成。半導體層20 由通過濺射而形成的氧化鈦(Ti02)的層組成。金屬層19由通用蒸鍍而形成的金(Au)的 層組成。對極部18由通過濺射而形成的鉑的層組成。 探針23具有硫醇基，通過探針23的硫醇基與金屬層19的金原子進行結合，探針 23被固定在金屬層19上。這一固定通過使金屬層19浸漬在使探針23分散的水溶液中來 進行。〔採用了 HPV檢測裝置的檢測方法〕
參照圖9 圖11就採用了具有上述構成的檢測裝置1的檢測方法進行說明。圖9 是表示用戶進行的將檢體注入檢查晶片4的方法的流程圖。圖10是表示檢測裝置1的檢 測動作過程的流程圖。圖11是雜交(hybridization)時以及電解液添加時的半導體電極 部15的示意圖。 根據圖9的流程圖，在步驟Sl用戶將檢體樣品從檢查晶片4的樣品注入口 11進 行注入。此檢體樣品是從子宮頸部細胞中進行均質化以及提取處理並經過精製的mRNA。通 過此步驟Sl如圖11所示那樣，金屬層19上的探針23通過雜交來捕捉檢體樣品中的HPV 的mRNA24。 在步驟S2，用戶將檢查晶片4內的溶液自樣品注入口 ll排出，並用雜交洗滌液對 檢查晶片4內進行洗滌。在步驟S3，用戶從樣品注入口 11注入包含能夠與HPV的mRNA24結合的鹼基配列 的修飾物質22。所注入的修飾物質22對用探針23所捕捉到的mRNA24進行修飾。
在步驟S4，用戶將檢查晶片4內的溶液自樣品注入口 ll排出，並用洗滌用緩衝液 對檢查晶片4內進行洗滌。 在步驟S5，用戶從樣品注入口 ll注入電解液。此電解液包含碘以作為電解質，包
含四丙基碘化銨以作為支持電解質，以及包含將乙腈和碳酸乙烯按體積比混合成6 : 4的
有機溶劑以作為溶劑。若添加電解液則包含在電解液中的碘就溶解金屬層19。 使用圖11就此金屬層19的溶解進行說明。圖11是雜交時和電解液添加時的半
導體電極部15的示意圖。 探針23通過探針23具有的硫醇基(SH基)和金屬層19的金原子進行共價結合， 而被固定在金屬層19上。共價結合是堅固的結合。因此，能夠防止在步驟S1使其雜交的 工序以及步驟S2的進行洗滌的工序之際，探針23從金屬層19剝離。 若添加電解液則包含在電解液中的碘就使由金(Au)組成的金屬層19溶解，探針 23被配置在半導體層20上。由此，從藉助於光源5的光照射而得以激勵的修飾物質22所 產生的電子就高效率地被供給到半導體層20。 圖10是表示檢測裝置1的檢測動作過程的流程圖。在用戶進行了圖9的流程以 後，用戶將檢查晶片4插入到圖1所示的檢測裝置1的晶片插入口 3，在顯示器2上指示測 定開始。 在步驟S6，被插入到檢測裝置1的檢查晶片4的電極引線14、17、31連接到電流計 6及電源32。然後，電源32以參考電極部31作為基準在半導體電極部15上施加0V電位。
在步驟S7，光源5將雷射光照射到對HPV的mRNA24進行修飾的修飾物質22，以使 修飾物質22激勵。被激勵的修飾物質22發生電子，所發生的電子被輸送到半導體層20。 其結果，就在半導體電極部15與對極部18之間流過電流。 在步驟S8，用電流計6測定起因於步驟S5的電子移動而在半導體電極部15與對 極部18之間流過的電流。由於電流計6所測定的電流值與修飾物質22的個數具有相關性， 所以能夠基於所測定的電流值來進行HPV的定量測定。 在步驟S9，首先，通過A/D變換部7經過數字變換的電流值被輸入到控制部8。接 著，控制部8基於預先所作成的表示電流值與HPV量之關係的檢量線，根據經過數字變換的 電流值來估算檢體樣品中的HPV量。然後，控制部8創建用於在顯示器2上顯示所估算的HPV量的檢測結果畫面。 在步驟SIO，由控制部8所創建的檢測結果畫面被發送到顯示器2上並顯示在顯示 器2。 此外，雖然在本實施方式中被檢物質是HPV的mRNA24，但還能夠採用從生物體細
胞所採取的或者以人工方式所合成的核酸、蛋白質或者肽等作為被檢物質。此時，探針23
只要是能夠捕捉被檢物質的物質即可，例如能夠採用核酸、蛋白質或者肽等。 而且，雖然在本實施方式中使用了釕絡化物作為修飾物質22，但只要是藉助於光
源5而激勵並發生電子的物質則不特別進行限定。例如可列舉金屬絡化物、有機色素以及
量子點等。具體而言可列舉出金屬酞花青、釕絡化物、鋨絡化物、鐵絡化物、鋅絡化物、9_苯
氧雜蒽類色素、花青類色素、金屬花青類色素、氧雜蒽類色素、三苯甲烷類色素、吖啶類色
素、噁嗪類色素、香豆素類色素、部花青類色素、若丹菁類色素、聚甲炔類色素、嚇啉類色素、
酞花青類色素、若丹明類色素、氧雜蒽類色素、葉綠素類色素、曙紅類色素、汞溴紅類色素、
靛藍類色素或者硒化鎘等。 另外，在本實施方式中，光源5隻要是發出使修飾被檢物質的物質進行激勵的波 長的光的光源則不特別進行限定。例如可列舉雷射、發光二極體、無機場致發光元件、有機 場致發光元件、白色光源、具備光學濾波器的白色光源等。 在本實施方式中表示了在探針23捕捉到HPV的mRNA24以後，用修飾物質22對 HPV的mRNA24進行修飾的例子。也可以是用修飾物質22來修飾HPV的mRNA24，並通過探 針23捕捉HPV的mRNA24來進行HPV的mRNA24的檢測。另外，在被檢物質以及探針是核酸 時，還可以列舉使修飾物質結合在捕捉到被檢物質的探針和被檢物質形成的雙鏈核酸之間 的基於內插(Intercalation)的方法。 此外，雖然在本實施方式中使用了金作為金屬層19，但金屬層19隻要是能夠與探 針23結合的金屬即可。最好是能夠與探針23共價結合的金屬。進而最好是能夠與探針23 的硫醇基結合的金屬。例如可例示金、鉬、銀、鈀、鎳、汞、銠、釕、銅或者它們的合金等。另外 雖然在本實施方式中使用了蒸鍍作為使金屬層19形成在半導體層20上的方法，但也能夠 使用濺射、刻印、網板印刷、電鍍處理或者溶膠凝膠法等來進行形成。 雖然在本實施方式中，半導體層20使用氧化鈦(Ti02)，但半導體層20隻要是可以 取得能夠接受由修飾物質22的激勵所產生的電子的能級的物質即可。例如，可列舉矽、鍺 等半導體、氧化鈦(Ti02)、氧化銦(In203)、氧化錫(Sn02)、氧化鋅(Zn0)、硒化鎘(CdSe)、硫 化鎘(CdS)、氮化鎵(GaN)、氮化鈦(TiN)等化合物半導體或者有機物半導體等。
而且雖然在本實施方式中，導電層21使用了用氧化銦錫(IT0)以及摻雜銻氧化錫 (AT0)所形成的導電層，但只要是導電性材料則不特別進行限定。例如能夠列舉鉑、金、銀、 銅等金屬、導電性陶瓷或者金屬氧化物等。另外，在半導體層20自身也作為導電性材料發 揮功能情況下，導電層21能夠省略。 另外，雖然在本實施方式中，對極部18使用了用鉑所形成的對極部，但只要是導 電性材料則不特別進行限定。例如可列舉金、銀、銅等金屬、導電性陶瓷或者金屬氧化物等。
雖然在上述本實施方式中，使用了碘作為使金屬層19溶解的物質以及電解質，但 使金屬層19溶解的物質和電解質也可以是不同的物質。 此外，雖然在本實施方式中探針23直接結合在金屬層19上，但也可以在探針23與金屬層19之間存在乙二硫醇等架橋劑。 另外，本實施方式中的檢測裝置l以及檢查晶片4也可以按在金屬層19上彼此分 離的多個區域逐個區分開來固定探針23，並對各區域單獨地進行利用光源5的光照射。由 此，就可以用一個半導體電極部15測定多個樣品。通過按每個區域固定多種探針，就能夠 用一個檢查晶片4進行多檢體評價、多項目測定。 而且，雖然在本實施方式中，電源32以參考電極部31作為基準在半導體電極部15 上施加了 0V電位，但此參考電極部31可以省略。在此情況下，電源32就以對極部18作為 基準在半導體電極部15上施加0V電位。
實施例
實施例1 (針對半導體電極的金屬層形成與否的研究)
〔半導體電極部的製作〕 半導體電極部是在基板上形成導電層、半導體層和金屬層而製作出來。導電層是 在由二氧化矽(Si02)構成的基板上通過濺射而形成了 100nm厚度的氧化銦錫(IT0)以及 摻雜銻氧化錫(AT0)的層。半導體層是在導電層上通過濺射而形成了 10nm厚度的氧化鈦 (Ti02)的層。金屬層是在半導體層上通過蒸鍍而形成了 10nm厚度的金薄膜的層。半導體 層通過採用包含鈦或鉻的半導體，使金屬層與半導體層的粘合力提高。在此半導體電極部 上連接有用於與電流計進行連接的半導體電極引線。 [OO"]〔對極部的製作〕對極部是在由二氧化矽(Si02)構成的基板上通過濺射而形成了 200nm厚度的鉑 薄膜來製作。在此對極部上連接有用於與電流計進行連接的對極弓|線。
〔探針的固定〕 首先，將半導體電極部浸漬在使探針分散的水溶液(探針濃度10iiM)18小時。此 探針是具有硫醇基的DNA(24base)。在進行了浸漬以後，用超純水洗滌半導體電極部，並使 其乾燥30分鐘。其結果，通過探針具有的硫醇基與金屬層的金原子的結合，探針就被固定 在金屬層上。〔被檢物質的製作〕 被檢物質是使修飾物質結合於包含與探針相互補的鹼基配列的DNA而製作出來。 修飾物質使用了增感色素即Pulsar650("' 公司)。此 增感色素是釕絡化物，使DNA肽結合於此釕絡化物上。
〔被檢物質與探針的雜交〕 首先，將半導體電極部的周圍用矽橡膠(厚度O. 2mm)配置成為隔壁。在用此矽橡 膠所形成的空間注入10i!L雜交用溶液。此雜交用溶液使用了將利用修飾物質修飾後的 DNA(濃度10iiM)和雜交緩衝劑(Affymetrix公司)混合起來的溶液。
然後，在矽橡膠上蓋上蓋玻璃片，成為溶液不乾燥的狀態來進行雜交。此時，半導 體電極部上的探針捕捉用修飾物質修飾過的被檢物質。雜交是以45t:、靜置1小時使其進 行反應。雜交反應後，用洗滌用緩衝劑(WashbufferA、 Affymetrix公司)和超純水來洗滌 半導體電極部，並用鼓風機使其乾燥。
〔電解液的調製〕 電解液是將0. 6M的四丙基氯化銨(NPr4Cl)作為支持電解質鹽，將0. 06M的碘作
9為電解質使其溶解在將乙腈(AN)和碳酸乙烯(EC)以體積比混合成6 : 4的溶劑中而調製。
〔光電流測定〕 將具有使被檢物質和探針雜交的半導體電極部的基板周圍用矽橡膠(厚度 0.2mm)配置成側壁。在用此矽橡膠所形成的空間注入10i!L電解液。然後，從具有被填充 了電解液的半導體電極部的基板上方用具有對極部的基板進行密封。由此，就成為半導體 電極部和對極部接觸於電解液的狀態。 接著，將半導體電極引線和對極引線連接到電流計。然後從半導體電極部方向朝 向對極部自光源照射光。光源使用了波長473nm、強度13mW的雷射光源。其結果，修飾物質 被激勵，從經過激勵的修飾物質所發生的電子被輸送到半導體層，在半導體電極部與對極 部之間流過電流。對這一電流值進行了測定。
比較例1 比較例1除了在半導體層上形成金屬層的工序以外，用與實施例1同樣的方法進
行了測定。
〔結果〕 圖12是表示通過實施例1以及比較例1的測定所獲得的電流值的圖表。在實施 例1的方法中獲得了 229nA的電流值。相對於此在比較例1的方法則獲得了 80nA的電流值。 根據這一事實可知通過在半導體層上形成金屬層，取得約3倍的電流值，電流的 檢測靈敏度提高了。 實施例2 (基於用修飾物質經過修飾的被檢物質的電流測定的檢測)〔半導體電極部的製作〕 用與實施例1同樣的方法來製作。〔對極部的製作〕 用與實施例1同樣的方法來製作。〔探針的固定〕 用與實施例1同樣的方法來進行。
〔被檢物質的調製〕 準備使修飾物質結合於包含與探針相互補的鹼基配列的DNA的被檢物質(被檢物 質A)、和使修飾物質結合於不包含與探針相互補的鹼基配列的DNA的被檢物質(被檢物質 B)作為被檢物質。 修飾物質使用了作為增感色素的Pulsar650 ("、才寸 一 ，於夕乂 口 -一《- Y " >公司)。此增感色素是釕絡化物，通過肽結合與DNA結合起來。
〔利用探針的被檢物質的捕捉〕 用被檢物質A或者被檢物質B與金屬層上的探針進行雜交反應。首先，將半導體 電極部的周圍用矽橡膠(厚度O. 2mm)配置成隔壁。在用此矽橡膠所形成的空間注入10 ii L 雜交用溶液。此雜交用溶液使用了將利用修飾物質修飾後的DNA(濃度10iiM)和雜交緩衝 劑(Affymetrix公司)混合起來的溶液。 接著，在矽橡膠上蓋上蓋玻璃片，成為溶液不乾燥的狀態來進行雜交。雜交是以 45t:、靜置1小時使其進行反應。雜交反應後，用洗滌用緩衝劑(WashbufferA、Affymetrix公司)和超純水進行洗滌後，用鼓風機使其乾燥。
〔電解液的調製〕
用與實施例1同樣的方法來進行。
〔電流測定〕 將具有使被檢物質A或者被檢物質B與探針雜交的半導體電極部的基板周圍用矽橡膠(厚度0. 2mm)配置成側壁。在用此矽橡膠所形成的空間注入10 L電解液，並從具有填充了電解液的半導體電極部的基板上方用具有對極部的基板進行密封。由此，就成為半導體電極部和對極部接觸於電解液的狀態。 接著，將半導體電極引線和對極引線連接到電流計。從半導體電極部方向朝向對極部自光源照射光。此光源使用了波長473nm、強度13mW的雷射光源。由此，修飾被檢物質的修飾物質被激勵，從經過激勵的修飾物質所發生的電子被輸送到半導體層，在半導體電極部與對極部之間流過電流。對這一 電流值進行了測定。 此外，為了測定來源於電極的電流值，不進行使被檢物質與金屬層上的探針雜交的工序地測定了電流。來源於電極的電流是指電極自身通過光照射而被激勵所發生的電流。 比較例2 除了在半導體層上形成金屬層的工序以外，與實施例2同樣地進行被檢物質的檢
〔結果〕 圖13是在實施例2以及比較例2所檢測出的電流值的圖表。 在實施例2中，在使用具有與探針相互補的鹼基配列的DNA(被檢物質A)進行了
雜交的情況下，所檢測出的電流值是36. 3nA。 另外，在使用不具有與探針相互補的鹼基配列的DNA(被檢物質B)進行了雜交的情況下，電流值是24. 7nA。這一電流值與來源於電極的電流值24. 9nA同等。根據這一事實能夠確認，在用被檢物質A使其雜交的情況下所檢測出的電流值不是通過被檢物質向半導體電極部的非特異性吸附所產生的電流值，而是通過識別出配列的特異性檢測所產生的電流值。 圖14是表述在實施例2以及比較例2中所獲得的數據之中、來源於修飾物質的電流值的圖表。來源於修飾物質的電流值是指從在被檢物質的測定所獲得的電流值中扣除來源於電極的電流值的值。 可知來源於修飾物質的電流值，使用了包含金屬層的半導體電極部的情況(實施例2) —方比使用了不包含金屬層的半導體電極部(比較例2)的情況約大4. 5倍。
實施例3(使用了進行長波長激勵的修飾物質的半導體電極的效果)
〔半導體電極部的製作〕 半導體電極部是在基板上形成導電層、半導體層和金屬層而製作出來的。導電層是在由二氧化矽(Si02)構成的基板上通過濺射而形成了 100nm厚度的氧化銦錫(IT0)的層。半導體層是在導電層上通過濺射而形成了 10nm厚度的氧化銦(In203)的層。金屬層是在半導體層上通過蒸鍍而形成了 10nm厚度的金薄膜的層。在此半導體電極部上連接有用於與電流計進行連接的半導體電極引線。
接著，將所製作的半導體電極部在氧氣氛中進行燒結(150°C )，以使金屬層與半
導體層的粘合力提高。〔對極部的製作〕對極部是在由二氧化矽(Si02)組成的基板上通過濺射而形成了 200nm厚度的鉑薄膜來製作。在此對極部上連接有用於與電流計進行連接的對極弓I線。
〔探針物質的固定〕 首先，將半導體電極部浸漬在使探針分散的水溶液(探針濃度10iiM)18小時。此探針是具有硫醇基的DNA(24base)。在進行了浸漬以後，用超純水洗滌半導體電極部，並使其乾燥30分鐘。其結果，通過探針具有的硫醇基與金屬層的金原子的結合，探針就被固定在金屬層上。〔被檢物質的製作〕 作為被檢物質製作使修飾物質結合於包含與探針相互補的鹼基配列的DNA的被檢物質。修飾物質使用了作為有機色素的AlexaFluor750( e卜口 -工 >公司)。使DNA肽結合於此有機色素上。
〔被檢物質與探針的雜交〕 首先，將半導體電極部的周圍用矽橡膠(厚度O. 2mm)配置成為隔壁。在用此矽橡膠所形成的空間注入10i!L雜交用溶液。此雜交用溶液使用了將利用修飾物質修飾後的DNA(濃度10iiM)和雜交緩衝劑(Affymetrix公司)混合起來的溶液。
然後，在矽橡膠上蓋上蓋玻璃片，成為溶液不乾燥的狀態來進行雜交。此時，半導體電極部上的探針捕捉用修飾物質修飾後的被檢物質。雜交是以45t:、靜置1小時使其進行反應。雜交反應後，用洗滌用緩衝劑(WashbufferA、 Affymetrix公司)和超純水來洗滌半導體電極部，並用鼓風機使其乾燥。
〔電解液的調製〕 電解液是將0. 6M的四丙基氯化銨(NPr4Cl)作為支持電解質鹽，將0. 06M的碘作為電解質使其溶解在將乙腈(AN)和碳酸乙烯(EC)以體積比混合成6 : 4的溶劑中而調製。
〔光電流測定〕 將具有使被檢物質和探針雜交的半導體電極部的基板周圍用矽橡膠(厚度0.2mm)以包圍的方式進行配置。在用此矽橡膠所形成的空間注入10i!L電解液。然後，從具有被填充了電解液的半導體電極部的基板上方用具有對極部的基板進行密封。由此，就成為半導體電極部、對極部以及參考電極部接觸於電解液的狀態。 接著，在半導體電極上以參考電極的電位作為基準施加OV電位。然後從半導體電極部方向朝向對極部自光源照射光。在此光源上使用了波長785nm、強度13mW的雷射光源(Cube785、^ t ^ >卜公司)。由此，修飾物質被激勵，從經過激勵的修飾物質所發生的電子被輸送到半導體層，在半導體電極部與對極部之間流過電流。對這一電流值進行了測定。
此外，為了測定來源於電極的電流值，不進行使被檢物質與金屬層上的探針雜交的工序地測定了電流。來源於電極的電流是指電極自身通過光照射而激勵所發生的電流。
比較例3 比較例3除了在半導體層上形成金屬層的工序以外，通過與實施例3同樣的操作進行了測定。
比較例4 比較例4使用矽烷偶聯劑(氨丙基三乙氧基矽烷APTES)對探針DNA進行了固定。
〔半導體電極部的製作〕 半導體電極部是在基板上形成導電層、半導體層和矽烷偶聯劑的薄膜層而製作出來。導電層是在由二氧化矽(Si02)組成的基板上通過濺射而形成了 100nm厚度的氧化銦錫(IT0)的層。半導體層是在導電層上通過濺射而形成了 10nm厚度的氧化銦(In203)的層。矽烷偶聯劑的薄膜層是在半導體層上通過在將矽烷偶聯劑(氨丙基三乙氧基矽烷APTES)以1 %的濃度溶解於甲苯的溶液中，浸漬在基板上形成了導電層和半導體層的電極而形成的層。然後在以ll(TC對電極進行了加熱以後，在甲苯中反覆進行三次超音波洗滌(5分鐘)，通過用脫水乙醇進行洗滌將尚未結合在半導體電極表面的矽烷偶聯劑除掉。這樣，半導體電極部被製作出來。在此半導體電極部上連接有用於與電流計進行連接的半導體電極引線。〔對極部的製作〕 用與實施例3同樣的方法來製作。〔探針物質的固定〕 使由DNA(24base)構成的探針固定在半導體層上。首先，將使探針分散的水溶液
(探針濃度100uM)禾口UV交聯用的試劑(Microarraycrosslinking reaget D，Amersham)以
1 : 9的混合比進行了混合的溶液在半導體電極上滴下6iiL。之後，用UV交聯劑(FS-1500、
7於- * )照射UV光(160mJ)，用超純水進行洗滌並使其乾燥10分鐘。其結果，UV交聯用
試劑就成為DNA與矽烷偶聯劑的架橋劑，探針被固定在半導體層上。〔被檢物質的調製〕 用與實施例3同樣的方法來調製。〔被檢物質與探針的雜交〕 用與實施例3同樣的方法來進行。〔電解液的調製〕 用與實施例3同樣的方法來調製。〔光電流測定〕 用與實施例3同樣的方法來進行。
〔結果〕 圖15是表示在實施例3、比較例3以及比較例4中所檢測出的光電流值的圖表。
在實施例3中，在使用具有與探針相互補的鹼基配列的DNA進行了雜交反應的情況下，所檢測出的光電流值是158nA。另外在僅固定了探針DNA的情況下，所檢測出的光電流值是0. 082nA。據此S/N = 158/0. 082 = 1930。 在比較例3中，在使用具有與探針相互補的鹼基配列的DNA進行了雜交反應的情況下，所檢測出的光電流值是O. 24nA。另外在僅固定了探針DNA的情況下，所檢測出的光電流值是0. 028nA。據此S/N = 0. 24/0. 028 = 8. 6。若與前述實施例3進行比較可知通過使用金屬層來源於修飾物質的光電流值提高660倍，S/N比提高220倍。
此外，在比較例4中，在使用具有與探針相互補的鹼基配列的DNA進行了雜交反應的情況下，所檢測出的光電流值是19nA。另外在僅固定了探針DNA的情況下，所檢測出的光電流值是0.021nA。據此S/N = 19/0.021 = 900。若與上述實施例3相比較，通過使用金屬層來源於修飾物質的光電流值提高8倍、S/N提高2倍。在比較例4中也同樣地發現來源於修飾物質的光電流值的提高和S/N的提高。 根據以上說明，若使金屬層形成在半導體電極部，電流的檢測靈敏度將會提高。作為電流值的檢測靈敏度提高的要因，可以認為因形成金屬層而使(l)DNA固定量增加(2)導電性提高(3)金屬層中的等離子體激勵所引起的光電變換效率的提高等。
實施例4(使用了一鹼基多型(SNP)的非特異吸附的研究)
〔半導體電極部的製作〕 半導體電極部是在基板上形成導電層、半導體層和金屬層而製作出來。導電層是在由二氧化矽(Si02)構成的基板上通過濺射而形成了 100nm厚度的氧化銦錫(ITO)的層。半導體層是在導電層上通過濺射而形成了 10nm厚度的氧化銦(In203)的層。金屬層是在半導體層上通過蒸鍍而形成了 2nm厚度的金薄膜的層。在此半導體電極部上連接有用於與電流計進行連接的半導體電極引線。
〔對極部的製作〕 對極部是在由二氧化矽(Si02)組成的基板上通過濺射而形成了 200nm厚度的鉑薄膜來製作。在此對極部上連接有用於與電流計進行連接的對極弓|線。
〔探針物質的固定〕 首先，將半導體電極部浸漬在使探針分散的水溶液(探針濃度10iiM)16小時。此探針是具有硫醇基的DNA(24base)。在進行了浸漬以後，用超純水洗滌半導體電極部，並使其乾燥10分鐘。其結果，通過探針具有的硫醇基與金屬層的金原子的結合，探針就被固定在金屬層上。〔被檢物質的製作〕 作為被檢物質製作使修飾物質結合於包含與探針不互補的鹼基配列(僅1鹼基不互補)的DNA的被檢物質。修飾物質使用了作為有機色素的Alexa Fluor750 ( e卜口-工>公司)。使DNA肽結合於此有機色素上。
〔被檢物質與探針的雜交〕 首先，將半導體電極部的周圍用矽橡膠(厚度O. 2mm)配置成為隔壁。在用此矽橡膠所形成的空間注入10i!L雜交用溶液。此雜交用溶液使用了將利用修飾物質修飾後的DNA(濃度10iiM)和雜交緩衝劑(Affymetrix公司)混合起來的溶液。
然後，在矽橡膠上蓋上蓋玻璃片，成為溶液不乾燥的狀態來進行雜交。此時，半導體電極部上的探針捕捉用修飾物質修飾後的被檢物質。雜交是以45t:、靜置1小時使其進行反應。雜交反應後，用洗滌用緩衝劑(Wash bufferA、Affymetrix公司)和超純水進行洗滌後，用鼓風機使其乾燥。
〔電解液的調製〕 電解液是將0. 6M的四丙基氯化銨(NPr4Cl)作為支持電解質鹽，將0. 06M的碘作為電解質使其溶解在將乙腈(AN)和碳酸乙烯(EC)以體積比混合成6 : 4的溶劑中而調製。
〔光電流測定〕 將具有使被檢物質與探針雜交的半導體電極部的基板周圍用矽橡膠(厚度0.2mm)以包圍的方式進行配置。在用此矽橡膠所形成的空間注入10i!L電解液。然後，從具有被填充了電解液的半導體電極部的基板上方用具有對極部的基板進行密封。由此，就成為半導體電極部、對極部以及參考電極部接觸於電解液的狀態。 接著，在半導體電極上以參考電極的電位作為基準施加OV電位。然後從半導體電極部方向朝向對極部自光源照射光。在此光源上使用了波長785nm、強度13mW的雷射光源(Cube785、^ t ^ >卜公司)。由此，修飾物質被激勵，從經過激勵的修飾物質所發生的電子被輸送到半導體層，在半導體電極部與對極部之間流過電流。對這一電流值進行了測定。
此外，為了測定來源於電極的電流值，不進行使被檢物質與金屬層上的探針雜交的工序地測定了電流。來源於電極的電流是指電極自身通過光照射而激勵所發生的電流。
比較例5 比較例5除了作為被檢物質使用了與探針相互補的鹼基配列的以外，通過與實施例4同樣的操作進行了測定。
比較例6 比較例6除了不使被檢物質雜交以外，通過與實施例4同樣的操作進行了測定。
〔結果〕 圖16是在實施例4、比較例5以及比較例6中所檢測出的光電流值的圖表。
在實施例4中，使用具有與探針不互補的鹼基配列的DNA進行了雜交反應的情況下，所檢測出的光電流值是1. 7nA。在比較例5中，使用具有與探針相互補的鹼基配列的DNA進行了雜交反應的情況下，所檢測出的光電流值是195nA。在比較例6中僅固定了探針DNA的情況下，所檢測出的光電流值是O. 067nA。據此能夠確認非特異地吸附在金薄膜上的DNA較少，能夠配列特異地檢測被檢物質。
實施例5 (金薄膜的膜厚依賴性)
〔半導體電極部的製作〕 半導體電極部是在基板上形成導電層、半導體層和金屬層而製作出來。導電層是在由二氧化矽(Si02)構成的基板上通過濺射而形成了 100nm厚度的氧化銦錫(ITO)的層。半導體層是在導電層上通過濺射而形成了 10nm厚度的氧化銦(In203)的層。金屬層是在半導體層上通過蒸鍍而形成了 0. 2nm厚度的金薄膜的層。在此半導體電極部上連接有用於與電流計進行連接的半導體電極引線。
〔對極部的製作〕 對極部是在由二氧化矽(Si02)構成的基板上通過濺射而形成了 200nm厚度的鉑薄膜來製作。在此對極部上連接有用於與電流計進行連接的對極弓|線。
〔探針物質的固定〕 首先，將半導體電極部浸漬在使探針分散的水溶液(探針濃度10iiM)16小時。此探針是具有硫醇基的DNA(24base)。在進行了浸漬以後，用超純水洗滌半導體電極部，並使其乾燥10分鐘。其結果，通過探針具有的硫醇基與金屬層的金原子的結合，探針就被固定在金屬層上。〔被檢物質的製作〕 作為被檢物質製作使修飾物質結合於包含與探針相互補的鹼基配列的DNA的被檢物質。修飾物質使用了作為有機色素的AlexaFluor750( e卜口 -工 >公司)。使DNA肽結合於此有機色素上。
〔被檢物質與探針的雜交〕 首先，將半導體電極部的周圍用矽橡膠(厚度O. 2mm)配置成為隔壁。在用此矽橡膠所形成的空間注入lOyL雜交用溶液。此雜交用溶液使用了將利用修飾物質修飾後的DNA(濃度1 ii M)和雜交緩衝劑(Affymetrix公司)混合起來的溶液。 然後，在矽橡膠上蓋上蓋玻璃片，成為溶液不乾燥的狀態來進行雜交。此時，半導體電極部上的探針捕捉用修飾物質修飾後的被檢物質。雜交是以45t:、靜置1小時使其進行反應。雜交反應後，用洗滌用緩衝劑(WashbufferA、 Affymetrix公司)和超純水進行洗滌後，用鼓風機使其乾燥。
〔電解液的調製〕 電解液是將0. 6M的四丙基氯化銨(NPr4Cl)作為支持電解質鹽，將0. 06M的碘作為電解質使其溶解在將乙腈(AN)和碳酸乙烯(EC)以體積比混合成6 : 4的溶劑中而調製。
〔光電流測定〕 將具有使被檢物質與探針雜交的半導體電極部的基板周圍用矽橡膠(厚度0.2mm)以包圍的方式進行配置。在用此矽橡膠所形成的空間注入10i!L電解液。然後，從具有被填充了電解液的半導體電極部的基板上方用具有對極部的基板進行密封。由此，就成為半導體電極部、對極部以及參考電極部接觸於電解液的狀態。 接著，在半導體電極上以參考電極的電位作為基準施加OV電位。然後從半導體電極部方向朝向對極部自光源照射光。在此光源上使用了波長785nm、強度13mW的雷射光源(Cube785、^ t ^ >卜公司)。由此，修飾物質被激勵，從經過激勵的修飾物質所發生的電子被輸送到半導體層，在半導體電極部與對極部之間流過電流。對這一電流值進行了測定。
進而，在半導體電極部的製作中，關於金薄膜的厚度改變成lnm、2nm以及5nm時的電流值都與上述同樣地進行了測定。 此外，為了測定來源於電極的電流值，不進行使被檢物質與金屬層上的探針雜交的工序地測定了電流。來源於電極的電流是指電極自身通過光照射而激勵所發生的電流。
〔結果〕 圖17是在實施例5中所檢測出的各膜厚下的S/N比的圖表。可知在金薄膜為lnm時，獲得最好的S/N比。 另外，在金薄膜的厚度大於等於5nm時，金薄膜將會通過洗滌工序而從半導體層剝離。因此，在金薄膜的厚度大於等於5nm時，就需要使用包含鈦或鉻的半導體層(實施例1以及2)，或者使用進行了燒結處理的半導體層(實施例3)，以使金薄膜與半導體層的粘合力提高。
權利要求
一種檢查晶片，用來檢測利用通過光激勵而產生電子的修飾物質修飾過的被檢物質，其特徵在於包括具備被形成在半導體層上的金屬層的半導體電極部；捕捉被檢物質的被固定在上述金屬層上的探針；以及具備導電層的對極部。
2. 按照權利要求1所記載的檢查晶片，其特徵在於 上述金屬層由通過電解液而溶解的金屬組成。
3. 按照權利要求2所記載的檢查晶片，其特徵在於 上述電解液包含碘或者碘化物。
4. 按照權利要求1 3中任意一項所記載的檢查晶片，其特徵在於 上述金屬層由與上述探針進行化學吸附的金屬組成。
5. 按照權利要求4所記載的檢查晶片，其特徵在於 與上述探針進行化學吸附的金屬是金。
6. 按照權利要求4所記載的檢查晶片，其特徵在於 上述探針具有硫醇基作為與上述金屬層進行化學吸附的結合基。
7. —種檢測裝置，用來檢測利用通過光激勵而產生電子的修飾物質修飾過的被檢物 質，其特徵在於包括以可受納檢查晶片的方式而構成的檢查晶片受納部，其中該檢查晶片包括具備被形 成在半導體層上的金屬層的半導體電極部；捕捉被檢物質的被固定在上述金屬層上的探 針；和具備導電層的對極部；對修飾物質進行光激勵的光源，該修飾物質對上述檢查晶片受納部中所插入的上述檢 查晶片內的被檢物質進行修飾；以及電流測定部，測定通過上述光源的光激勵而從正在對被檢物質進行修飾的修飾物質流 出的電流。
8. 按照權利要求7所記載的檢測裝置，其特徵在於 上述光源發出對正在修飾被檢物質的修飾物質進行激勵的波長的光。
9. 一種檢測方法，用來檢測利用通過光激勵而產生電子的修飾物質修飾過的被檢物 質，其特徵在於包括以下步驟在包括具備被形成在半導體層上的金屬層的半導體電極部；捕捉被檢物質的被固定在 上述金屬層上的探針；和具備導電層的對極部的檢查晶片上應用包含被檢物質的樣品，由 此用被固定在上述金屬層上的上述探針來捕捉被檢物質；將修飾物質導入到被檢物質；照射對修飾物質進行激勵的光；以及檢測從激勵後的修飾物質所產生的電流。
10. 按照權利要求9所記載的檢測方法，其特徵在於還包括 在上述半導體電極部和上述對極部之間添加用於使電流流過的電解質媒體。
全文摘要
本發明提供一種能夠使被檢物質的檢測靈敏度提高的用於檢測被檢物質的檢查晶片。該用於檢測被檢物質的檢查晶片包括具備被形成在半導體層上的金屬層的半導體電極部；捕捉被檢物質的被固定在上述金屬層上的探針；以及具備導電層的對極部。
文檔編號C12Q1/68GK101726528SQ200910205180
公開日2010年6月9日 申請日期2009年10月16日 優先權日2008年10月31日
發明者巖永茂樹, 桐村浩哉 申請人:希森美康株式會社