預防/治療hbv感染和hbv介導疾病的組合物的製作方法
2023-04-28 23:59:01
專利名稱：預防/治療hbv感染和hbv介導疾病的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及包含至少兩種B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、其片段和/或編碼它們的核苷酸的組合物，其中HBsAg在HBsAg S區和前S1區的B型肝炎病毒(HBV)基因型不同並且組合物不包含HBV核心抗原(HBcAg)和編碼該抗原的核酸；本發明涉及包含這些組合物的藥物組合物，特別是疫苗以及它們在預防和治療HBV感染和HBV介導疾病中的用途。本發明還涉及製備用於治療性治療肝炎的患者特異性藥物的方法以及診斷HBV基因型的試劑盒。
全世界有超過2.5億人感染B型肝炎病毒(HBV)。這些感染者的大部分表現出病理性結果，包括慢性肝功能不全、肝硬化和肝細胞癌(HCC)。對於為何一些人發展成急性HBV感染而另一些人沒有發展成急性HBV感染的原因了解甚少。臨床資料以及與其它慢性病毒感染的類似性強調了細胞介導的免疫反應在控制病毒感染中的重要性，特別是包括細胞毒T淋巴細胞的免疫反應。細胞毒T細胞反應的誘導是消除急性HBV感染和預防慢性HBV感染的關鍵因素。病毒基因組還編碼包膜蛋白前S1、前S2和S抗原(HBsAg)、聚合酶和核心蛋白(HBcAg)。
慢性B型肝炎是慢性遷延性和慢性活動性進程的肝臟進行性炎症。慢性遷延性肝炎表現為限定在肝臟中的具有增加形成纖維組織的擴大的門區浸潤；在臨床上遷延性肝炎的病徵維持數年(長達10年)，大約80％的病例為HBsAg陽性。發病機制可能是基於細胞免疫系統功能不全和持續性病毒感染。
B型肝炎的小表面抗原(HBsAg)是一個226個胺基酸的蛋白質(p24/gp27或S蛋白)，它是一個重要的HBV抗原，其自身裝配在20-30nm的脂蛋白顆粒中，其中100-150個亞單位通過多重分子間和分子內二硫鍵交聯起來。來自不同亞型和基因型的HBV株的S蛋白的變異性是有限的。四個穩定HBsAg亞型adw、ayw、adr和ayr涉及鄰近免疫顯性「a-決定簇」(包含殘基124-147的親水區)的位置122和160的單一胺基酸互換。這些亞型先前未曾確定在HBV感染中具有任何生物學或發病機制上的差異。
從慢性HBsAg攜帶者血漿獲得的疫苗於1982年在聯邦德國第一次獲得批准。自那次以後，疫苗可以通過遺傳技術生產並且用於危險人群的主動免疫。在接種前為血清反應陰性的人群中有95％的人在一年後表現出免疫反應。所使用的所有B型肝炎疫苗包含高濃度的純化HBsAg蛋白質(對應於B型肝炎病毒的非感染性外殼)並且不合病毒DNA或者是福馬林滅活的。
先有技術的缺點是在進行免疫的人群中有至少5％為不表現出免疫反應的「非反應者」。此外，迄今為止在已知的疫苗中沒有一個能夠治療慢性遷延性肝炎。
WO 01/40279和WO 01/38498描述了基於B型肝炎病毒基因型G的疫苗，但是兩個專利的說明書沒有提到不同基因型的組合。
Michel等，PNAS92(1995)，5307-5311和Mancini等，PNAS93(1996)，12496-12501涉及基於HBsAg的DNA疫苗。文件中沒有提到不同HBV基因型的HBsAg的組合。
因此本發明基於提供預防/治療HBV感染或HBV介導疾病改進手段的問題。本發明還基於提供治療性治療肝炎的患者特異性藥物的問題。本發明進一步的目標是提供診斷HBV感染的改良試劑盒。
通過提供包含至少兩種B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、其片段和/或編碼它們的核酸的組合物來解決本發明潛在的問題，其中HBsAg在HBsAgS區和/或前S區的B型肝炎病毒(HBV)基因型不同並且組合物不包含HBV核心抗原(HBcAg)或編碼該抗原的核酸。
本發明基於以下令人驚奇的發現在肝中組成型表達HBsAg亞型ayw的轉基因小鼠可以當作評價針對慢性HBV感染的特異免疫治療方案的效率的潛伏期模型。此種小鼠因為持續性抗原血症而產生大量HBsAg，並且它們基本上耐受HBsAg。一方面，本發明人現在已經用其HBsAg基因型恰恰為轉基因小鼠基因型(ayw)的疫苗免疫了HBsAg轉基因小鼠，另一方面，用包含與轉基因小鼠基因型不同的HBsAg基因型的疫苗免疫了HBsAg轉基因小鼠。儘管用對應於其自身HBsAg的HBsAg抗原重複免疫轉基因小鼠，卻沒有觀察到細胞毒T細胞反應。相反，用不同於其自身基因型的HBsAg基因型免疫轉基因小鼠導致產生針對HBsAg的基因型特異和交叉反應的細胞毒T細胞反應。這表明天然存在的HBsAg變體可以通過引發交叉反應性T細胞免疫而打破「耐受」。細胞毒T細胞免疫的活化導致HBsAg ayw抗原的降低並因此導致產生了相當於HBV被有效控制的急性肝炎的肝特異性病症和症候群。由於HBsAg ayw抗原的胺基酸序列與HBsAg adw2抗原的胺基酸序列僅在少數位置不同，因此所觀察到的免疫反應特別明顯。本發明已經證實，甚至T細胞表位內的胺基酸的少量保守交換會導致針對該表位的T細胞反應的變化。
對蛋白質抗原的T細胞反應的特異性和有效性在多種水平受到控制，特別的決定性因素為(i)表位(或抗原肽)的蛋白水解釋放；(ii)抗原肽對主要組織相容性複合物(MHC)的遞呈糖蛋白的親和性；和(iii)對同一抗原不同表位的競爭性發展的T細胞反應的負面幹擾。蛋白質抗原的天然變體(通過表位或表位側翼中關鍵序列的單個胺基酸交換或者通過新表位的產生)以下列四種方式誘導T細胞反應(i)來自蛋白質的抗原肽的更有效蛋白水解加工(釋放)；(ii)抗原肽與遞呈MHC分子的高親和性結合；(iii)通過與(i)和/或(ii)中提到的過程相類似的過程消除能夠減弱表位免疫原性的免疫顯性表位(免疫顯性表位抑制了對同一蛋白質抗原不同表位的反應)；(iv)產生新表位。
在本發明上下文中已經證明HBsAg天然變體(通過基因型所表現出來的)對其所刺激的T細胞反應具有相對廣譜的特異性。
與本發明有關的術語「HBV基因型」意思是指B型肝炎病毒基因組的全部。HBV基因型優選通過全部測序和系統發生分析確定。當前已知8個標準基因型。該8個基因型彼此的核苷酸變化為8％；見Bartholomeusz，Rev.Med.Virol.13(2003)，1-14。優選地，HBV基因型A具有參考核酸序列Genbank X02763或者HBV基因型Aafr具有參考核酸序列GenbankAF297621。對於HBV基因型Ba，參考核酸序列為Genbank D00330並且對於基因型Bj參考核酸序列為AB073858。對於HBV基因型C，參考核酸序列為Genbank AY206389，並且對於基因型Caus，參考核酸序列為Genbank AB048704。對於基因型D，參考核酸序列為Genbank X02496。基因型E的參考核酸序列為X75657。基因型F的參考核酸序列為X69798。基因型G的參考核酸序列為AF160501並且基因型H的參考核酸序列為AY090454。
關於上面提到的基因型，在基因型和亞型之間存在一定的相關性，如下基因型A與亞型adw2、ayw1相關；基因型B與adw2、ayw1相關；基因型C與adw2、adrq+、adrq-、ayr、adr相關；基因型D與ayw2、ayw3、ayw4相關；基因型E與ayw4相關；基因型F與adw4q-、adw2和ayw4相關；基因型G與adw2相關且基因型H與adw4相關。
通過藉助於單特異抗體例如抗d、抗y、抗r、抗a(w)的血清學方法確定感染患者的HBV亞型。可以以瓊脂凝膠擴散測試形式或者放射免疫分析法形式實現確定；(「HBs Antigen Subtypes」，由Couroucé，A.M.，Holland，P.V.，Muller，J.Y.和Soulier，J.P.出版，Biblotheca Haematologica no.42，S.Karger，Basel，1976)。
還可以通過對來自患者血清的編碼HBsAg的DNA進行測序來確定亞型。然後從所確定核酸序列得到HBsAg的胺基酸序列。然後通過如Magnius，L.O.和Norder，H.(「Subtypes，Genotypes and molecularepidemiology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability ofthe S-gene」Intervirology，38(1-2)24-34)所描述的位置122和160的胺基酸來確定亞型。
與本發明有關的表述「B型肝炎病毒表面抗原」(HBsAg)指HBV的小表面抗原或者S蛋白(p24/gp27)。HBsAg還可以包括前S1蛋白結構域。優選地，HBsAg由S蛋白和/或前S1蛋白結構域組成。
關於HBsAg的編號，使用了依據Kidd-Ljunggren等人J.Gen.Virol.83(2002)，1267-1280的系統。
根據本發明的術語「片段」包括HBsAg的片段。片段優選包含至少5個胺基酸並且包含T細胞表位，優選至少10個、特別地至少20個、更加特別地至少50個胺基酸。依照優選實施方案，組合物包含至少2種HBsAg或2種其片段。此種組合物特別適宜用作基於多肽的疫苗。特別是在組合物包含來自不同HBV基因型HBsAg的2種片段的情況下，第一種和第二種片段共同具有至少10個胺基酸、優選20個胺基酸但是彼此之間至少有一個胺基酸不同。
如上所提到，本發明基於這樣一種認識，即不同基因型所產生抗原(HBsAg)中甚至十分小的差異會導致產生這樣一種修飾T細胞表位，所述的修飾T細胞表位彼此之間僅稍稍不同但能夠導致T細胞反應極大變化。因此彼此之間至少一個胺基酸差異的兩種片段可以通過與已知HBsAg基因型的簡單序列比較容易地檢測。彼此間至少一個胺基酸不同的適宜片段可以用於本發明的組合物中。片段優選包含至少一個T細胞表位，特別是人T細胞表位。確定T細胞表位的方法是已知的，例如Lauer等，J.Virol.76(2002)，6104-6113。
依據優選的實施方案，組合物包含至少2種HBsAg和/或至少2種其片段。
優選地還提供了至少包含第一種HBsAg或其片段和編碼第二種HBsAg或其片段的核酸的組合物，其中第一種和第二種HBsAg的HBV基因型不同。
依據進一步優選的實施方案，組合物至少包含編碼2種HBsAg的2種核酸，其中HBsAg的HBV基因型不同。核酸還可以是編碼如上所定義片段的核酸。核酸可以是病毒DNA或合成DNA，合成DNA應當理解為包括含有修飾核苷間鍵的那些DNA序列。核酸還可以是RNA分子，所述RNA分子對於通過重組載體系統方式的表達是必需的。此外，依據本發明混合DNA/RNA分子也考慮作為核酸。
依據優選實施方案，基因型選自已知基因型A、B、C、D、E、F、G和H。關於各個參考核酸序列可以參照上面定義部分。通常，通過與參考核酸序列具有8％核苷酸變異的方式確定基因型，也就是說與參考核酸序列具有至少92％同一性的核酸也被理解為與所定義一致的基因型。相對於參考核酸序列具有至少95％、特別是98％同一性是特別優選的。相對於參考核酸序列的「同一性」在這裡可以藉助於已知方法進行確定。一般使用具有考慮特殊需求的算法的特殊電腦程式。
首先，使用確定同一性的優選方法產生了被比較序列間的最大一致性。確定同一性的電腦程式包括但不限於包括GAP在內的GCG程序包(Deveroy，J等，Nucleic Acid Research 12(1984)，387；Genetics ComputerGroup University of Wisconsin，Medicine(WI))；和BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215(1990)，403-410)。BLASTX程序可以從國立生物技術信息中心(NCBI)或其它來源(BLAST手冊，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894；Altschul，S.等；見上)獲得。同樣可以使用已知的Smith-Waterman算法確定同一性。
用於核酸比較的優選參數包括下列Needleman和Wunsch算法，J.Mol.Biol.48(1970)，443-453比較矩陣匹配＝+10錯配＝0開口罰分50開口長度罰分3同樣GAP程序也適宜使用上面的參數。在核酸序列比較中上面的參數是默認參數。算法、開口罰分、開口延伸罰分和比較矩陣的另外實例包括程序手冊Wisconsin軟體包(版本9，1997年9月)中的那些實例。對其的選擇取決於所進行的比較，同樣還取決於比較是否在序列對(當使用GAP或Best Fit時)或者序列和大的序列數據銀行(當使用FASTA或BLAST時)之間進行。
依據上述算法的92％的一致性代表著與本發明序列具有92％的同一性。同樣適用於更高的同一性。
優選地，根據本發明的組合物的特徵在於變體編碼其活性基本上相當於參考核酸序列所編碼聚合酶活性的聚合酶和/或變體編碼其免疫反應性基本上相當於參考核酸序列所編碼HBsAg免疫反應性的HBsAg。
聚合酶活性在這裡可以依據Kim等人Biochem.Mol.Biol.Int.1999；47(2)301-308確定。HBsAg免疫反應性可以通過商業可得的抗原ELISA確定。「基本上通過參考核酸所編碼HBsAg的免疫反應性」意思是指抗體同參考HBsAg的結合基本上與抗體同變體所編碼HBsAg的結合親和性相同。
根據優選實施方案，組合物包含至少3種、優選至少5種不同HBsAg、其片段和/或編碼它們的核酸。
特別優選地，組合物包含所有已知HBV基因型的HBsAg、其片段和/或編碼它們的核酸。
根據本發明組合物的進一步優選的實施方案，編碼HBsAg或其片段的核酸存在於適於HBsAg在哺乳動物細胞(優選人細胞)表達的啟動子控制下的載體中。如果組合物包含至少2種編碼HBsAg或其片段的核酸，則這些核酸可以存在於同一載體(雙元載體)中或者分別位於彼此不同的載體中。適宜載體例如質粒、腺病毒、痘苗病毒、杆狀病毒、麻疹病毒和逆轉錄病毒。載體一般包括影響載體在所轉染哺乳動物細胞中複製的複製源。
適宜啟動子可以是組成型啟動子和可誘導型啟動子。優選啟動子為來自CMV和SC-40的啟動子。
上述組合物可以通過簡單混合各個成分得到，因此可以十分簡單地製備。適宜溶劑和載體取決於組合物(多肽和/或核酸)的性質。原則上，優選包含水的系統。可以合成製備或通過重組製備HBsAg或其片段。所製備多肽可通過色譜方法純化。
備選地，可以通過重組表達系統中編碼HBsAg或其片段的至少2種核酸的共表達而得到組合物。本領域技術人員熟知多種表達系統和方法；優選地使用酵母作為宿主細胞，特別優選地使用多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)。核酸可以存在於一個載體中或者分別存在於彼此分開的兩個載體中。適宜載體和啟動子如上所述。
根據本發明的另一方面，製備了包含本發明組合物和可藥用載體的藥用組合物。可藥用載體是本領域技術人員已知的。實例為鋁鹽、磷酸鈣、添加或不添加多糖的HBsAg凍乾物、水包油乳劑、聚丙交酯共甘醇酸酯。如果此種載體本身不具有佐劑作用，則它們可以與另外的佐劑如脂質A模擬物、免疫刺激性核苷酸或細菌毒素混合。
根據本發明的藥物組合物優選為疫苗。根據本發明，藥物組合物、尤其是疫苗適宜治療性治療HBV感染或HBV介導疾病。藥物組合物、尤其是疫苗還適宜預防性治療HBV感染或HBV介導疾病。HBV感染尤其是慢性遷延性B型肝炎感染。HBV介導疾病可以是急慢性B型肝炎感染。另外的HBV介導疾病為肝硬化和原發性肝細胞癌。疫苗適合施用於臨床不明顯HBV攜帶者，即未患有真正意義上的疾病但具有將來發展成HBV介導疾病的高危險性的攜帶者。
藥物組合物可以肌內、皮下、真皮內、靜脈內、黏膜或口服施用，但是此種施用僅僅為優選的並且不是對施用方式的限制。
藥物組合物包含劑量範圍為0.1-1000μg HBsAg或其片段、優選2.5-40μg HBsAg或其片段的至少2種HBsAg或其片段。
當藥物組合物包含編碼HBsAg或其片段的核酸時，它們存在的劑量範圍為10-1000μg編碼HBsAg或其片段的核酸。
本發明的另一方面提供了製備用於治療性治療B型肝炎的藥物的方法，其包括以下步驟a)確定患者所感染HBV的基因型；和b)提供包含至少一種HBV基因型的HBsAg、HBsAg片段或編碼HBsAg或其片段的核酸的藥物，其中HBV基因型不同於根據a)
所確定的患者內HBV的基因型。
如上所述，本發明的重要的認可是在慢性遷延性肝炎潛伏期模型中，已經通過使用來自與轉基因動物基因型不同的HBV基因型的HBsAg處理轉基因動物實現了治療效果。
通過以下方法可以確定基因型對全HBV基因組或者至少編碼HBsAg的部分進行測序以及系統發生分析、限制性片段長度多態性(RFLP)、多重PCR。
以本身已知的方式通過配製至少一種HBsAg、其片段或者編碼HBsAg或其片段的核酸實現藥物供應。
根據另一方面，本發明提供了診斷HBV感染基因型的試劑盒。試劑盒包含至少2種HBsAg特異性結合物，其特徵在於2種HBsAg特異性結合物是對不同HBV基因型特異的。至少2種HBsAg特異性結合物可以是HBsAg基因型特異性引物和/或特異性抗體。引物長度為10-30個核苷酸並且與各個基因型的已知HBsAg序列互補。抗體可以是通過以下步驟得到的抗體，例如免疫實驗動物(例如具有對應於目的HBsAg基因型的各個HBsAg的小鼠)、以本身已知的方式製備雜交瘤和篩選亞型特異性單克隆抗體。
附圖簡述
圖1HBsAg變體。(A)顯示了B型肝炎小表面抗原(HBsAg)ayw(1)(對應於基因型D)和adw2(2)(對應於基因型A)的胺基酸序列。(B)來自HBsAg ayw和adw2的kb限制性表位序列。表位1(S208-215)僅由加工外源性HBsAg的細胞遞呈，而表位2(S190-197)僅由加工內源性HBsAg的細胞遞呈。
圖2將表位1或表位2特異性細胞毒性T細胞系(CTLL)轉移入HBs轉基因(HBs-tg)宿主導致暫時性肝臟損傷。從pCI/SaywDNA免疫的B6小鼠取出脾細胞並且用同系基因RBL5細胞在體外再刺激，其中RBL5細胞已經用Kb/S208-215結合肽1(ILSPFLPL)或Kb/S190-197結合肽2(VWLSVIWM)負載或用ConA刺激。以每隻小鼠5×106個CD8+CTLL的量靜脈(i.v.)注射入HBs-tg小鼠並且測定平均血清丙氨酸轉氨酶(ALT)水平。
圖3免疫小鼠肝臟和脾臟內存在HBsAg特異性CD8+T細胞的間接體內證明。通過單次注射100μg pCI/SaywDNA肌內免疫C57BL/6小鼠。在免疫後12天證明特異性CD8+T細胞的存在。用Kb/S208-215結合肽1(ILSPFLPL)或者Kb/S190-197結合肽2(VWLSVIWM)體外再次刺激分離肝臟單核細胞(MNC)和脾細胞4小時(在布雷菲爾德菌素A存在的情況下)。顯示了每組4-6隻小鼠的CD8+IFNγ+T細胞/105CD8+T細胞的平均頻率±標準差(來自彼此獨立的兩個實驗)。
圖4在HBs-tg小鼠中HBsAg特異性CD8T細胞對表位1的反應。用編碼HBsAg亞型ayw(pCI/Sayw)或adw2(pCI/Sadw2)的DNA疫苗或者用陰性對照載體pCI(沒有插入片段的載體)肌內免疫在其肝臟中表達HbsAgayw的HBs-tg小鼠三次(免疫間隔為4周)。在最後一次免疫後12天從免疫小鼠中取出脾細胞並用RBL5細胞體外再次刺激4小時(在布雷菲爾德菌素A存在的情況下)，其中RBL5細胞是用ayw(RBL5/SPayw)或adw2(RBL5/SPadw2)亞型的HBsAg顆粒再刺激或者用HBsAgayw(ILSPFLPL)或HBsAgadw2(IVSPFIPL)的Kb/S208-215結合肽1再刺激。顯示了每組4-6隻小鼠脾臟IFNγ+CD8+T細胞/105CD8+T細胞的平均數量±標準差(來自彼此獨立的兩個實驗)。
圖5在HBs-tg小鼠中HBsAg特異性CD8T細胞對表位1的反應。從如圖4的圖例中所描述的已免疫小鼠中取出脾臟細胞，並且用同系基因RBL5/Sayw或RBL5/Sadw2轉染子或者HBsAgayw(VWLSVIWM)或HBsAgadw2(VWLSAIWM)的Kb/S190-197結合肽2再刺激。顯示了每組4隻小鼠脾臟IFNγ+CD8+T細胞/105CD8+T細胞的平均數量±標準差。
圖6S208-215特異性CD8+T細胞在所免疫HBs-tg小鼠肝臟中存在的證明。用編碼HBsAgadw2的DNA疫苗(pCI/Sadw2)免疫轉基因HBs-tg小鼠三次(免疫間隔為4周)。在最後一次注射後12天從所免疫小鼠中取出肝臟和脾臟細胞並且用Kb/S208-215結合肽ILSPFLPL體外再刺激。顯示了每組4隻小鼠脾臟IFNγ+CD8+T細胞/105CD8+T細胞的平均數量±標準差。
圖7用pCI/Sadw2DNA疫苗免疫的HBs-tg小鼠肝臟組織病理學。在B6小鼠(A，B)中沒有觀察到病理性的肝臟組織學。HBs-tg小鼠(C，D)表現為中等的細胞增大並且細胞質表現出毛玻璃的外觀(D)。肝細胞的細胞核表現為中等程度的多形性。門管周浸潤罕見。用pCI/Sadw2DNA重複免疫引起嚴重的肝臟組織形態學改變(E-I)，這種改變與急性病毒性肝炎引起的改變相一致。位於小葉實質(F)和門管周區(G)的炎性細胞浸潤包括Kupfer細胞、淋巴細胞和少量多形核顆粒細胞。肝細胞出現水腫並且常常具有固縮核，這是凋亡早期階段的徵兆(F，箭頭)。嗜酸小體(H，箭頭)，即凋亡的肝細胞普遍或者常常被病灶炎性細胞浸潤包圍。許多肝細胞表現出明顯的空泡化(I，箭頭)。對福馬林固定並且用石蠟包埋的組織用HE染色。原始放大倍數A、C和E為10倍；B、D和F為40倍；G-I為63倍。
圖8HBs-tg小鼠中HBsAg特異性血清抗體反應的誘導。用編碼HBsAgadw2(pCI/Sadw2)或HBsAgayw(pCI/Sayw)的DNA疫苗肌內免疫B6小鼠和轉基因HBs-tg小鼠，3周後用相同的疫苗加強免疫。在最後一次注射後4周，測試血清樣品中的HBsAg抗原(A)或者HBsAg特異性抗體(B)。顯示了每組4-6隻小鼠的平均抗體滴度(mIU/ml)和血清HBsAg水平(ng/ml)±標準差。
圖9在正常B6和HBsayw-tg小鼠中，HBsAg特異性CD8+T細胞對表位1(S208-215)和表位2(S190-197)的反應。用亞型ayw或adw2的HBsAg蛋白質顆粒(SP)肌內免疫動物三次(免疫間隔為21天)。每個蛋白質疫苗與作為佐劑的CpG寡核苷酸(ODN)或者RC-529混合。PBS用作陰性對照。在最後一次免疫後12天從動物中取出脾臟，然後將分離的脾細胞用預先用HBsAg特異性肽負載的RBL5細胞體外再刺激4小時(在布雷菲爾德菌素A存在的情況下)。為了實現該目的，使用了HBsAgayw(ILSPFLPL)或HBsAgadw2(IVSPFIPL)的Kb/S208-215結合肽1或者HBsAgayw(VWLSVIWM)或HBsAgadw2(VWLSAIWM)的Kb/S190-197結合肽2。顯示了每組4-6隻小鼠脾臟IFNγ+CD8+T細胞/105CD8+T細胞的平均數量±標準差(來自彼此獨立的兩個實驗)。
圖10HBSayw-tg小鼠中HBsAg特異性CD8+T細胞對表位1(S208-215)的反應。
A.用編碼單獨的HBsAg亞型ayw(pCI/Sayw)或三種亞型ayw(pCI/Sayw)、adw2(pCI/Sadw2)和adr(pCI/Sadr)的DNA疫苗或者陰性對照載體pCI(沒有插入片段的載體)肌內免疫在其肝臟中表達HBsAgayw的HBs-tg小鼠3次(免疫間隔為4周)。在最後一次免疫後12天從動物中取出脾臟。將分離的脾細胞用預先用HBsAgayw(ILSPFLPL)或HBsAgadw2(IVSPFIPL)的Kb/S208-215結合肽1負載的RBL5細胞體外再刺激4小時(在布雷菲爾德菌素A存在的情況下)。顯示了每組4-6隻小鼠脾臟IFNγ+CD8+T細胞/105CD8+T細胞的平均數量±標準差(來自彼此獨立的兩個實驗)。
B.用亞型ayw的HBsAg蛋白質顆粒(SP)或亞型ayw、adw2和adr的HBsAg蛋白質顆粒混合物肌內免疫HBsayw-tg小鼠三次(免疫間隔為21天)。每個蛋白質疫苗與作為佐劑的CpG寡核苷酸(ODN)或者RC-529(僅顯示了與亞型混合物的混合)混合。PBS用作陰性對照。在最後一次免疫後12天從動物中取出脾臟。將分離的脾細胞用預先用HBsAgayw(ILSPFLPL)或HBsAgadw2(IVSPFIPL)的Kb/S208-215結合肽1負載的RBL5細胞體外再刺激4小時(在布雷菲爾德菌素A存在的情況下)。顯示了每組4-6隻小鼠脾臟IFNγ+CD8+T細胞/105CD8+T細胞的平均數量±標準差(來自彼此獨立的兩個實驗)。
圖11HBs-tg小鼠中HBsAg特異性血清抗體反應的誘導。
用亞型ayw或adw2的HBsAg蛋白質顆粒疫苗(SP)或亞型ayw、adw2和adr的HBsAg蛋白質顆粒混合物疫苗肌內免疫B6小鼠和轉基因HBs-tg小鼠，3周後用相同的疫苗加強免疫。蛋白質疫苗包含作為佐劑的添加物CpG寡核苷酸(ODN)。在加強免疫注射後4周，測試血清樣品中的HBsAg抗原(A)和HBsAg特異性抗體(B)。顯示了每組4-6隻小鼠的平均抗體滴度(mIU/ml)和血清HBsAg水平(ng/ml)±標準差。
本發明將在以下更加詳細地描述實施例。然而實施例不是旨在限制本發明。
實施例材料和方法概述正在研究的HBV亞型adw2對應於基因型A。HBV亞型ayw對應於基因型D。HBV亞型adr對應於基因型C。
小鼠將C57BL/6Jbom(B6)小鼠(H-2b)置於標準的無病原體條件下。
C57BL/6J-TgN(Alb1HBV)44Bri轉基因(HBs-tg)小鼠、HBsAgayw(由具有保藏號V01460 J02203的HBV序列編碼)從Jackson實驗室(BarHarbour，ME)得到。使用8-16周齡的雌性和雄性小鼠。
細胞、重組HBsAg顆粒和抗原性HBsAg肽所使用的H-2b細胞系RBL5描述於[10]。製備了表達相似數量HBsAgayw和HBsAgadw2的穩定RBL5轉染子(數據未顯示)。亞型ayw、adw2和adr的重組體HBsAg顆粒從Rhein Biotech GmbH(Düsseldorf，德國)得到。如所述[3]純化在多形漢遜酵母宿主RB10株中製備的HBsAg顆粒。合成的Kb結合S208-215ILSPFLPL(ayw)或IVSPFIPL(亞型adw2)肽和Kb結合S190-197VWLSVIWM(ayw)或VWLSAIWM(adw2)肽從JeriniBioTools(Berlin，德國)獲得。將肽以10mg/ml的濃度溶於DMSO溶液並在使用前用培養基稀釋。
質粒和DNA免疫如所述[4；5]將HBsAgayw、HBsAgadw2和HBsAgadr克隆入pCI(Promega)和BMGneo載體。作為DNA疫苗，使用了表達HBsAgayw、HBsAgadw2和HBsAgadr同樣好的質粒pCI/Sayw、pCI/Sadw2、pCI/Sadr。從來自用這些質粒瞬時轉染細胞中對HBsAg進行的免疫沉澱證明了這一點(數據未顯示)。因此，HBsAg表位免疫原性的不同不能解釋為由DNA疫苗所表達HBsAg的量不同或者轉染子不同。對於肌內核酸免疫，如所述[4]將包含1μg/μl質粒DNA的50μl PBS(磷酸緩衝鹽溶液)注射入每一脛骨前肌。通過注射包含1μg/μl pCI/Sayw、1μg/μl pCI/Sadw2和1μg/μlpCI/Sadr的50μl PBS實現HBsAg亞型混合物免疫。
用HBsAg蛋白質顆粒免疫向每隻小鼠皮下注射5μgHBsAg蛋白質顆粒和溶於100μl PBS(磷酸緩衝鹽溶液)的30μg CpG寡核苷酸(ODN1826，MWG Biotech，Ebersberg，德國)或8μg RC-529(Corixa Corp.Settle，WA，美國)。對於用HBsAg亞型混合物進行免疫，在一次中皮下注射5μgHBsAgayw、5μg HBsAgadw2和5μg HBsAgadr蛋白質顆粒以及溶於100μl PBS的30μg CpG寡核苷酸佐劑或8μg RC-529。
特異性脾臟和肝臟CD8+-T細胞頻率的確定脾細胞懸液[1]和肝臟NPC(非實質)細胞製備描述於[6；7]。將脾細胞和肝臟NPC(1×106/ml)在具有5μg/μl HBsAg衍生肽或HBsAg表達轉染子(106/ml)或HBsAg顆粒負載的細胞的RPMI-1640培養基孵育1小時。然後加入5μg/μl的布雷菲爾德菌素A(BFA)(目錄號15870；Sigma)並且將培養物進一步孵育4小時。收穫細胞並且用抗CD8 mAb對其表面進行染色，然後固定、透性處理和細胞質IFNγ染色。通過FACS分析確定CD8+IFNγ+CTL的頻率。顯示了105個脾臟或肝臟T細胞中CD8+IFNγ+T細胞的平均值。
特異性CD8+T細胞系的轉移從用pCI/SaywDNA疫苗免疫的B6小鼠脾臟獲得CD8+T細胞系。使用經Kb/S208-215結合肽1(ILSPFLPL)或Kb/S190-197結合肽2(VWLSVIWM)負載的同系基因RBL5細胞體外再刺激脾細胞。在體外刺激大約2周的細胞系中，超過80％的CD8+T細胞具有預期的表位特異性，這如特異性IFNγ表達測試所證明。洗滌細胞並且用這些細胞系的5×106個細胞靜脈內注射。對照細胞是從ConA刺激3天的培養物分離的非特異性CD8+T母細胞(blast)。
血清中轉氨酶、HBsAg和抗HBsAg抗體的確定通過在注射後一定時間點自尾靜脈抽取血液從各個免疫小鼠或對照小鼠中重複獲得血清抗體。使用Reflotron測試(目錄號745138；RocheDiagnostics GmbH)測定血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)活性。通過商業ELISA AUSZYME II測試(ABBOTT Laboratories，Wiesbaden，德國)測定轉基因小鼠血清中的HBsAg濃度。使用商業IMxAUSAB測試(目錄號7A39-20；Abbott，Wiesbaden，德國)測定抗HBsAg抗體。
使用6份標準血清定量抗體水平。將測試血清稀釋以致於所測定的OD值在標準血清1和6的數值之間。用血清稀釋倍數乘以所測定抗體水平(mIU/ml)得到此處所示數值。所給出的血清滴度對應於4隻單個小鼠的平均值±標準差。
組織學薄的肝臟組織切片(＜3mm)用4％福馬林(pH 7.0)固定24小時並且用石蠟包埋。將2μm厚的石蠟切片用蘇木精-伊紅(HE)染色。
HBsAg肽與Kb的結合如所述[8，9]，在3μM人β2m存在的條件下，將親和純化的MHC I類分子Kb與濃度遞增的測試肽和限定濃度(大約2nM)放射性標記的VSVNP 52-59指示肽於18℃孵育48小時。然後，通過Sephadex G50柱凝膠過濾[8]確定肽與MHC I類分子的結合。放射性標記的VSV NP 52-59肽位於排斥體積(MHC結合肽)和內含體積(inclusion volume)(游離肽)。這可以通過γ放射光譜學測定，並且確定結合MHC分子的測試肽相對於測試肽總量的比例。確定了達到指示肽結合50％抑制所需要的測試肽濃度(IC50值)。IC50值越低，則測試肽的結合越好。為了防止配體耗盡，在所有結合實驗中使用的MHC體積足以實現至多15-25％結合。在這些條件下，IC50值接近於解離常數(Kd)。所有結合實驗均作為抑制實驗進行。
實施例1表位1或表位2特異性Kb限制性CD8+T細胞系過繼轉移入HBs-tg B6小鼠導致肝臟損傷從使用pCI/Sayw質粒DNA免疫的B6小鼠脾臟產生對HBsAg表位1或表位2(圖1B)特異性的短期CD8+T細胞。在這些細胞中有＞95％的細胞為CD8+，並且在這些CD8+T細胞中有＞80％的細胞能誘導表達IFNγ。將這些細胞系的5×106個細胞過繼轉移入在肝臟中從轉基因表達HBsAgayw的同類系B6宿主中導致急性肝損傷，如通過血清轉氨酶的短期且極大升高所示(圖2)。在轉移後5-6天，血清轉氨酶水平恢復正常，此時在宿主中檢測不到CD8+T細胞。轉移相同數量的多克隆(絲裂原刺激的)CD8+T母細胞沒有表現出肝損傷。因此，可以確定(i)在HBs-tg小鼠中特異性CD8+T細胞誘導肝損傷(如在[2]中所述)；(ii)在表達轉基因的肝臟中出現了通過內源或外源HBsAg加工產生的HBsAg表位；和(iii)過繼轉移進入的CD8+T細胞被迅速地從轉基因宿主中去除。所轉移的CD8+T細胞具有不同的HBsAg特異性，因此可以進入肝臟並被原位活化，但是不能被穩定吸引。
實施例2在脾臟和肝臟中觀察到識別HBsAg表位1和2的Kb限制性CTL開展了關於疫苗所致敏HBsAg特異性CD8+T細胞是否能夠進入正常或表達轉基因HBsAg(HBs-tg)的B6小鼠肝臟的研究(圖3)。從預先用pCI/Sayw疫苗免疫12-15天的B6小鼠中分離脾細胞和非實質肝細胞(NPC)。從來自正常B6小鼠的脾臟和肝臟CD8+T細胞群中發現了表位1或表位2特異性的CD8+T細胞(圖3A)。雖然在肝臟CD8+T細胞群中HBsAg特異性CD8+T細胞的頻率高，但是它們的絕對值比脾臟中的小(數據未顯示)。相反，在用編碼HBsAgayw的DNA疫苗免疫的HBsAgaywtgB6小鼠中沒有CD8+T細胞反應(圖3B)。用DNA疫苗三次加強免疫注射(間隔為3周)和用HBsAg抗原顆粒及寡核苷酸佐劑重複免疫均不能在HBs-tg小鼠中產生HBsAg特異性CD8+T細胞免疫(數據未顯示)。因此，使用小鼠所耐受的相同HBsAg變體進行接種的方案不能引發有效的抗病毒CD8+T細胞免疫。
實施3Kb限制性T細胞對HBsAgayw和HBsAgadw2變體的反應具有226個胺基酸的HBV株HBsAgayw和HBsAgadw2蛋白質不同之處在於16個胺基酸殘基(相應的胺基酸同一性為93％)。所使用的HBsAgayw蛋白質的序列與HBs-tg B6小鼠所表達的轉基因編碼的HBsAgayw的序列相同。所選擇的HBsAgayw和HBsAgadw2的Kb結合表位1和2的序列不同之處分別在於表位內的1個和2個胺基酸殘基，但是它們的側翼序列是相同的(圖1A，1B)。HBsAgayw和HBsAgadw2的S208-215表位1存在2個位置的不同adw2中位置2上的纈氨酸(V)被亮氨酸(L)取代，並且位置6上的異亮氨酸(I)被亮氨酸(L)取代(圖1B)。表位1的Kb結合親和力相當低；與表位的HBsAgayw變體相比，表位1的HBsAgadw2變體表現出更高的Kb結合親和力(表1)。相反，表位2的Kb結合親和力高(表1)。
表1免疫原性HBsAg表位對Kb的結合親和力
用pCI/Sayw或pCI/Sadw2DNA疫苗免疫的B6小鼠表現出對Kb結合表位1的CD8+T細胞反應，這是在對已經用HBsAgayw或HBsAgadw2顆粒或者用HBsAgayw或HBsAgadw2抗原肽S208-215負載的致敏脾臟CD8+T細胞進行間接體內再刺激5小時後觀察到的(圖4A，組2，3)。表位1的ayw和adw2變體交叉反應，因為(i)通過pCI/Sayw或pCI/Sadw2能夠使表位1特異性CTL致敏；和(ii)已經用HBsAgayw或HBsAgadw2顆粒或者已經用肽ILSPFLPL(ayw)或肽IVSPFIPL(adw2)負載的細胞向致敏CD8+T細胞遞呈表位1。因此，8-mer表位1內的2個替代不能表現出有效的表位加工、Kb結合或遞呈。
已經用pCI/SaywDNA疫苗致敏的CD8+T細胞識別HBsAgayw或HBsAgadw2的表位2(S190-197)(圖5A；組2)。這可以通過使用負載肽的細胞或者表達HBsAgayw的轉染子間接體內再刺激5小時後得到證明。致敏CD8+T細胞不識別表達內源性HBsAgadw2的轉染子。用pCI/Sadw2DNA疫苗免疫不能使表位2特異性T細胞致敏(圖5A，組3)。用pCI/Sadw2(而不是pCI/Sayw)DNA疫苗致敏的CD8+T細胞能夠識別轉染子所遞呈的表位/限制特異性未知的adw2特異性表位(圖5，組3)。因此第5位胺基酸的替換(將疏水的纈氨酸V交換成疏水的丙氨酸A)抑制表位2的產生，但是不抑制由Kb分子的遞呈[1]。
實施例4交叉反應性Kb限制性CD8+T細胞對HBsAg表位1的反應在HBs-tg B6小鼠中致敏HBs-tg B6小鼠在肝臟中從轉基因表達HBsAgayw。HBs-tg小鼠用HBsAgayw(pCI/Sayw)或HBsAgadw2(pCI/Sadw2)免疫(圖4，5B)。使用pCI/SaywDNA疫苗重複免疫HBs-tg B6小鼠沒有得到CD8+T細胞反應(圖4，5B，組2)。相反，使用pCI/Sadw2DNA疫苗免疫HBs-tg B6小鼠則產生了對HBsAg的CD8+T細胞反應(圖4B，組3)。這種交叉反應性的CD8+T細胞反應識別已經用HBsAgayw或HBsAgadw2顆粒或者用表位1的肽形式的ayw或adw2變體負載的細胞(圖4B，組3)。這些CD8+T細胞不識別RBL5/Sayw轉染子或者Kb結合表位2S190-197(圖5B，組3)。CD8+T細胞表現出對由RBL5/Sadw2轉染子(而非RBL5/Sayw轉染子)遞呈的未確定決定簇的亞型特異性反應(圖5B，組3)。這顯示HBsAg的天然變體能夠通過交叉反應性T細胞免疫的致敏而「打破耐受」。
對於特異性CD8+T細胞群是否存在於已經用pCI/Sadw2免疫的轉基因小鼠的產生抗原的肝臟中開展了研究。在已經用pCI/Sadw2免疫的HBs-tg B6小鼠的脾臟和肝臟NMC中，特異性CD8+T細胞反應性可以存在數月的時間階段(圖6)。因此，與過繼轉移的CD8+T細胞(圖2)相比，疫苗致敏的抗HBV特異性CD8+T細胞已經進入和表現出穩定吸引進入生產抗原的靶器官中達至少3個月。
實施例5表現出對HBsAg表位1具有特異性CD8+T細胞反應性的已免疫HBs-tg小鼠肝臟的組織學HBsAg特異性CD8+T細胞在產生HBsAg的肝臟中誘導炎性反應。未處理的B6小鼠表現出正常肝臟組織學(圖7A，B)。來自HBs-tg B6小鼠的肝細胞增大並且表現精細顆粒、淺色嗜酸性胞質，這是在人HBV感染病例中觀察到的「毛玻璃肝細胞」的特徵(圖7C，D)。沒有觀察到炎性細胞浸潤。
已經用pCI/Sadw2(而非pCI/Sayw)DNA疫苗免疫的HBs-tg小鼠表現出嚴重的肝臟組織病理學(圖7E)。在實質(圖7F)和門管周(圖7G)區發現的炎性細胞浸潤主要由單核細胞組成(圖7F)。大量小的淋巴樣細胞分布於實質和門管周區。局部化的炎性細胞群圍繞著凋亡肝細胞(圖7H)。與未處理HBs-tg小鼠相比，免疫的HBs-tg小鼠肝細胞的增大和水腫更甚。一些小的細胞核表現出濃縮的染色質和核周暈(圖7F，箭頭)，這表明處於凋亡早期。此外，可觀察到多數Councilman小體、正在凋亡的肝細胞(圖7H，箭頭)。一些肝細胞出現核液泡化(圖7，箭頭)。沒有出現明顯的膽汁鬱積。
實施例6HBs-tg小鼠中HBsAg特異性CD8+T細胞的致敏與抗原血症的降低相關未處理HBs-tg小鼠表現出30-50ng/ml的HBsAg血清水平(圖8A)。在HBsAgadw2免疫後發展出對表位1具有交叉反應性的CD+T細胞的小鼠表現出降低的抗原血症(抗原水平範圍為5-15ng/ml)，而在HBsAgayw免疫後未發展出任何HBsAg特異性CD8+T細胞免疫的動物中抗原血症水平沒有變化(圖8A)。因此，在免疫的轉基因小鼠中抗原血症的部分控制與特異性CD8+T細胞的出現相關。
實施例7在已經使用HBsAgadw2免疫的HBs-tg小鼠中出現了抗HBsAg血清抗體除了T細胞免疫以外，抗HBsAg體液免疫在監測抗原血症中也起著作用。在疫苗免疫的正常和轉基因小鼠中觀察到抗HBsAg血清抗體的存在。用pCL/Sayw或pCL/Sadw2DNA疫苗免疫正常(非轉基因)B6小鼠和同系基因HBs-tg B6小鼠兩次。在最後一次免疫2周後，使用能夠確定HBsAg不同亞型的ImxAUSAB測試(Abbott)確定對HBsAg特異性的血清抗體滴度。在已經用pCL/Sayw或pCL/Sadw2質粒DNA免疫的非轉基因小鼠中發展出高水平的抗HBsAg血清抗體，而HBs-tg小鼠僅在用pCL/Sadw2(而非pCL/Sayw)質粒DNA免疫後表現出抗HBsAg的血清抗體反應(圖8B)。在用HBsAgayw或HBsAgadw2顆粒免疫的小鼠中觀察到相似的抗體反應(數據未顯示)。亞型特異性ELISA(使用HBsAgayw或HBsAgadw2顆粒包被的板)表明在正常小鼠中，由所有疫苗產生的＞95％的抗體反應是針對HBsAg「a」決定簇的；在HBs-tg小鼠中，＞90％的抗體反應是針對adw2特異性決定簇的(數據未顯示)。
實施例8在用HBsAg蛋白質顆粒免疫的HBs-tg B6小鼠中針對HBsAg表位1的交叉反應性Kb限制性CD8+T細胞反應的有效致敏使用亞型ayw或者adw2的HBsAg蛋白質顆粒免疫正常B6小鼠導致針對Kb結合表位1(S208-215)的CD8+T細胞介導的免疫反應(圖9A)。因此可以看出，不論疫苗的性質如何(蛋白質顆粒或者DNA)，具有不同序列的表位能夠引發交叉反應性T細胞反應。與使用DNA疫苗免疫(圖5)相類似，使用亞型ayw的HBsAg蛋白質顆粒接種B6小鼠引發了針對HBsAg Kb限制性表位2(S190-197)的CD8+T細胞反應，而使用亞型adw2的HBsAg蛋白質顆粒接種則不能引發這種反應(圖9A)。
使用相當於亞型ayw或者亞型adw2的HBsAg蛋白質顆粒疫苗免疫HBsayw-tg小鼠。用HBsAgayw蛋白質疫苗重複免疫後沒有產生CD8+T細胞反應，而用異源HBsAgayw蛋白質抗原免疫則產生了針對表位1的HBsAg特異性CD8+T細胞反應(圖9B)。因此，表明HBsAg的天然變體能夠通過交叉反應性T細胞反應的引發和通過蛋白質亞單位接種打破存在的耐受。
實施例9在用HBsAg天然變體混合物免疫的HBs-tg B6小鼠中針對HBsAg表位1的交叉反應性Kb限制性CD8+T細胞反應的有效致敏使用編碼三種HBsAg亞型ayw(pCI/Sayw)、adw2(pCI/Sadw2)和adr(pCI/Sadr)的DNA疫苗(圖10A)以及含有亞型ayw、adw2和adr混合物的HBsAg蛋白質顆粒(圖10B)免疫HBsayw-tg小鼠。在用DNA和蛋白質顆粒免疫後，HBsAg天然變體混合物均引發了針對表位1的交叉反應性Kb限制性CD+T細胞反應。
實施例10在用HBsAg天然變體混合物免疫之後，HBs-tg小鼠中抗原血症降低在未處理HBs-tg小鼠中，觀察到30-50ng/ml的血清抗原水平。在用異源性HBsAg疫苗(HBsAgadw2)或者天然HBsAg變體混合物(HBsAgayw+HBsAgadw2+HBsAgadr)免疫之後發展出針對表位1的交叉反應性CD8+T細胞反應的動物中，抗原血症降低了(HBsAg水平為5-17ng/ml)。在單獨用同源性HBsAgayw免疫並且因此不能夠產生HBsAg特異性T細胞免疫的動物中，血清抗原數量沒有變化。使用HBsAg天然變體的混合物免疫相應地導致抗原血症降低。
實施例11用HBsAg天然變體的混合物免疫之後，HBs-tg小鼠中抗HBsAg血清抗體的誘導在用HBsAgayw、HBsAgadw2、HBsAgadr以及三種亞型的混合物免疫之後，正常B6小鼠出現明顯的抗體反應(未顯示)。
研究了免疫之後HBs-tg小鼠中HBsAg特異性血清抗體的形成。HBs-tg小鼠僅在用天然HBsAg變體混合物或者用異源亞型adw2免疫之後才出現血清抗體反應。在用同源性亞型ayw免疫之後沒有誘導抗HBsAg反應。亞型特異性ELISA(使用HBsAgayw和HBsAgadw2蛋白質顆粒包被的微量滴定板)表明在HBs-tg小鼠中＞90％的HBsAg特異性抗體反應針對adw2特異性決定簇(數據未顯示)。
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141
150DE10339927.51512003-08-291607170PatentIn版本2.12101211226212PRT213B型肝炎病毒220
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223HBV亞型ayw/基因型D的HBsAg多肽4002Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln1 5 10 15Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu20 25 30Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys35 40 45Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser50 55 60Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe65 70 75 80Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu leu Val85 90 95Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly100 105 110Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala115 120 125Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp130 135 140Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys145 150 155 160Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu165 170 175
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223HBV亞型adw2HBsAg表位208-2154005Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu1 521062118212PRT213B型肝炎病毒220
223HBV亞型ayw HBsAg表位208-2154006Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu1 52107211225212PRT213B型肝炎病毒220
223HBV亞型adr/基因型C的HBsAg多肽4007Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln1 5 10 15Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu20 25 30Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Ala Cys35 40 45Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Leu Thr Ser50 55 60Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe65 70 75 80Ile Ile Phe Leu Phe Thr Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu leu Val85 90 95Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly100 105 110Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala115 120 125Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp130 135 140Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg145 150 155 160Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu165 170 175Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu180 185 190Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile195 200 205Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val210 215 220
Tyr Ile22權利要求
1.包含至少2種B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、其片段和/或編碼它們的核酸的組合物，其中HBsAg在HBsAg S區或前S1區的B型肝炎病毒(HBV)基因型不同，並且組合物不包含HBV核心抗原(HBcAg)或編碼該抗原的核酸。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於組合物包含至少2種HBsAg和/或至少2種其片段。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，其特徵在於HBsAg的片段包含至少5個胺基酸並且含有T細胞表位，優選地為至少10個、特別是至少20個、更加特別是至少50個胺基酸。
4.根據權利要求3所述的組合物，其特徵在於片段包含HBsAg的「A決定簇」。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的組合物，其特徵在於第一種和第二種片段共同具有至少10個胺基酸、優選至少20個胺基酸，但彼此至少有一個胺基酸不同。
6.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於組合物包含至少2種編碼HBsAg或其片段的核酸。
7.根據權利要求1-6中任意一項所述的組合物，其特徵在於基因型選自A、B、C、D、E、F、G或H。
8.根據權利要求7所述的組合物，其特徵在於(i)HBV基因型A具有與Genbank X02763相一致的參考核酸序列、與Genbank AF297621相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的它們的變體；(ii)HBV基因型B具有與Genbank D00330相一致的參考核酸序列、與Genbank AB073858相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的它們的變體；(iii))HBV基因型C具有與Genbank AY206389相一致的參考核酸序列、與Genbank AB048704相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的它們的變體；(iv)HBV基因型D具有與Genbank X02496相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的其變體；(v)HBV基因型E具有與Genbank X75657相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的其變體；(vi)HBV基因型F具有與Genbank X69798相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的其變體；(vii)HBV基因型G具有與Genbank AF160501相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的其變體；和(viii)HBV基因型H具有與Genbank AY090454相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的其變體。
9.根據權利要求8所述的組合物，其特徵在於變體編碼其活性基本上相當於參考核酸序列所編碼聚合酶活性的聚合酶和/或變體編碼其免疫反應性基本上相當於參考核酸序列所編碼HBsAg免疫反應性的HBsAg。
10.根據權利要求1-9中任意一項所述的組合物，其特徵在於組合物包含至少3種、優選5種不同的HBsAg、其片段和/或編碼它們的核酸。
11.根據權利要求1-10中任意一項所述的組合物，其特徵在於組合物包含全部已知HBV基因型的HBsAg、其片段和/或編碼它們的核酸。
12.根據權利要求1-11中任意一項所述的組合物，其特徵在於編碼HBsAg或其片段的核酸存在於載體中，其中所述載體處於適於HBsAg在哺乳動物細胞中表達的啟動子的控制下。
13.根據權利要求12所述的組合物，其特徵在於載體選自質粒、腺病毒、痘苗病毒、杆狀病毒、麻疹病毒和逆轉錄病毒。
14.根據權利要求13所述的組合物，其特徵在於啟動子選自組成型啟動子和可誘導型啟動子。
15.製備根據權利要求1-14中任意一項所述組合物的方法，其包括將各個成分混合的步驟。
16.製備根據權利要求1-14中任意一項所述組合物的方法，其包括至少2種編碼HBsAg或其片段的核酸在宿主細胞、優選酵母細胞、特別是多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中共表達。
17.藥物組合物，其包含根據權利要求1-14中任意一項所述的組合物和可藥用載體。
18.根據權利要求1-14中任意一項所述的組合物的用途，其用於治療性治療HBV感染或HBV介導疾病。
19.根據權利要求1-14中任意一項所述的組合物的用途，其用於預防性治療HBV感染或HBV介導疾病。
20.根據權利要求18或19所述的用途，其特徵在於HBV感染是慢性遷延性B型肝炎。
21.根據權利要求18或19所述的用途，其特徵在於HBV介導疾病是急慢性B型肝炎感染、肝硬化或原發性肝細胞癌。
22.根據權利要求18-21中任意一項所述的用途，其特徵在於組合物通過肌內、皮下、真皮內、靜脈內、黏膜或口服施用。
23.製備用於治療性治療B型肝炎的藥物的方法，其包括a)確定患者所感染HBV的基因型；和b)提供包含至少一種HBV基因型的HBsAg、其片段或編碼HBsAg的核酸的藥物，其中所述的基因型與根據a)所確定的患者的HBV基因型不同。
24.根據權利要求23所述的方法，其特徵在於基因型通過PCR方法確定。
25.包含至少2種HBsAg特異性結合物的用於診斷HBV感染的基因型的試劑盒，其特徵在於2種HBsAg特異性結合物是對不同HBV基因型特異的。
26.根據權利要求25所述的試劑盒，其特徵在於2種HBsAg特異性結合物是引物和/或抗體。
全文摘要
本發明涉及包含至少2種B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、其片段和/或編碼它們的核酸的組合物，其中HBsAg在S區和/或前S1區的HBV基因型不同並且組合物不包含HBV核心抗原(HBcAg)或編碼該抗原的核酸；以及涉及藥物組合物，特別是包含那些用於預防/治療HBV感染或HBV介導疾病的組合物的疫苗。本發明還涉及製備用於治療性治療B型肝炎的患者特異性藥物的方法。
文檔編號C07K14/02GK1874787SQ200480031744
公開日2006年12月6日 申請日期2004年8月27日 優先權日2003年8月29日
發明者K·梅爾貝爾 申請人:萊因新生物技術工藝和產品有限公司