Il-17產生的抑制的製作方法

2023-05-18 19:26:26

專利名稱：：Il-17產生的抑制的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用白介素-23的拮抗劑(IL-23)來抑制T細胞產生促炎細胞因子白介素-17(IL-17)。本發明還涉及IL-23的拮抗劑在治療特徵在於存在升高水平的IL-17的炎性疾病中的用途。相關技術描述IL-17是來自T細胞的促炎分子，其刺激上皮、內皮和成纖維細胞來生產其它的炎性細胞因子和趨化因子，包括IL-6，IL-8,G-CSF，和MCP-I(S.Aggarwal，A.L.Gurney，JLeukocBiol71，1(2002)；Z.Yao等，Immunity3，811(1995)；J.Kennedy等，JInterferonCytokineRes16,611(1996)；F.Fossiez等，JExpMed183,2593(1996)；A.Linden,H.Hoshino,Μ.Laan,EurRespirJ15,973(2000)；Χ.Y.Cai,C.P.Gommoll,Jr.,L.Justice,S.K.Narula,J.S.Fine,ImmunolLett62,51(1998)；D.V.Jovanovic等，JImmunol160,3513(1998)；和Μ.Laan等，JImmunol162,2347(1999))IL-17也與其它細胞因子，包括TNF-α和IL_1β協同作用來進一步誘導趨化因子的表達(Jovanovic等，見上，禾口Μ.Chabaud,F.Fossiez,J.L.Taupin,P.Miossec,JImmunol161,409(1998))。在以下情況中發現IL-17水平顯著提高類風溼性關節炎(RA)滑膜中(S.Kotake等，JClinInvest103,1345(1999)；和Μ·Chabaud等，ArthritisRheum42,963(1999)),同種異體(allograft)移植排斥過程中(M.A.Antonysamy等，TransplantProc31(1999)；Μ.A.Antonysamyφ,JImmunol162,577(1999)；C.C.Loong,C.Y.Lin,W.Y.Lui,TransplantProc32(2000)；禾ΠH.G.Hsieh,C.C.Loong,W.Y.Lui,A.Chen,C.Y.Lin,TransplInt14，287(2001))，和其它慢性炎性疾病，包括多發性硬化(multiplesclerosis)(K.Kurasawa等，ArthritisRheum43,2455(2000))禾口牛皮痛(C.Albanesi等，JInvestDermatol115，81(2000)，禾口B.Homey等，JImmunol164,6621(2000))。儘管IL-17由激活的T細胞產生是清楚的，以前的報告並沒有提供它在以Thl和Th2為兩極的(polarized)細胞因子圖譜(profile)範例內的明確分類。IL-23是異源二聚體細胞因子，它與白介素-12(IL_12)共享亞基p40，該亞基與獨特的亞基P19結合(B.Oppmann等，Immunity13,715(2000))。已經報導IL-23促進T細胞，特別是記憶T細胞的增殖(D.M.Frucht,SciSTKE2002Jan8:2002(114)=PEl)近來描述轉基因pl9小鼠顯示了複雜的全身性炎症(profoundsystemicinflammation)和中性白細胞增多症(neutrophilia)(Μ·T.Wiekowski等，JImmunol166,7563(2001))。至今還沒有建立細胞因子IL-17和IL-23的表達和生物作用之間的相關性。發明概述本發明一方面涉及抑制T細胞產生白介素-17的方法，其包括用白介素-23(IL-23)的拮抗劑處理T細胞。本發明另一方面涉及治療哺乳動物受試者中的炎性疾病的方法，所述疾病特徵在於白介素17(IL-17)的表達提高，其包括給藥所述受試者有效量的白介素-23的拮抗劑(IL-23)。本發明另一方面涉及鑑定抗炎製劑的方法，其包括如下步驟(a)在存在或缺無候選分子時，溫育T細胞培養物與IL-23；(b)監測所述培養物中IL-17的水平；並(c)如果在所述候選分子存在時IL-17的水平比該候選分子缺無時的IL-17水平低，鑑定所述候選分子為抗炎製劑。本發明另一方面涉及誘導在哺乳動物受試者中產生IL-17的方法，其包括給藥所述受試者IL-23的激動劑。所有方面，拮抗劑或激動劑都優選是抗IL-23抗體或抗IL-23受體的抗體，其包括抗體片段。炎性疾病優選是慢性炎性疾病，如例如類風溼性關節炎(RA)，可導致同種異體排斥的移植物抗宿主反應，多發性硬化(MS)或牛皮癬。IL-17產生的誘導通常用於患細菌感染諸如結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染的病人。本發明涉及以下各項1.抑制T細胞產生白介素-17(IL_17)的方法，其包括用白介素_23(IL-23)的拮抗劑處理所述T細胞。2.項1的方法，其中所述T細胞是經活化的T細胞。3.項1的方法，其中所述T細胞是記憶細胞。4.項1的方法，其中所述處理在體內進行。5.項1的方法，其中所述處理在哺乳動物受試者中進行。6.項5的方法，其中所述哺乳動物受試者是人。7.項6的方法，其中所述拮抗劑是抗IL-23抗體或抗IL-23受體抗體。8.項7的方法，其中所述抗體是抗體片段。9.項8的方法，其中所述抗體片段選自Fv，Fab，Fab'，或F(ab')2。10.項7的方法，其中所述抗體是全長抗體。11.項7的方法，其中所述抗體是嵌合的抗體。12.項7的方法，其中所述抗體是人源化的抗體。13.項7的方法，其中所述抗體是人抗體。14.治療哺乳動物受試者中的炎性疾病的方法，所述炎性疾病特徵在於白介素17(IL-17)的表達升高，所述方法包括給藥所述受試者有效量的白介素-23(IL-23)的拮抗劑。15.項14的方法，其中所述哺乳動物受試者是人。16.項15的方法，其中所述炎性疾病選自慢性炎症，自身免疫性糖尿病，類風溼性關節炎(RA)，類風溼性脊椎炎，痛風性關節炎，及其它關節炎疾病，多發性硬化(MS)，哮喘，系統性紅斑狼瘡，成人型呼吸窘迫症候群，白塞病，牛皮癬，慢性肺炎性疾病，移植物抗宿主反應，克隆氏病，潰瘍性結腸炎，炎症性腸病(IBD)，阿爾茨海默病，或發熱。17.項16的方法，其中所述炎性疾病是慢性炎性疾病。18.項17的方法，其中所述慢性炎性疾病選自類風溼性關節炎(RA)，移植物抗宿主反應，多發性硬化(MS)，或牛皮癬。19.項15的方法，其中所述拮抗劑是抗IL-23抗體或抗IL-23受體抗體。20.項19的方法，其中所述抗體是抗體片段。21.項20的方法，其中所述抗體片段選自Fv，Fab，Fab'，或F(ab')2。22.項19的方法，其中所述抗體是全長抗體。23.項19的方法，其中所述抗體是嵌合的抗體。24.項19的方法，其中所述抗體是人源化的抗體。25.項19的方法，其中所述抗體是人抗體。26.項15的方法，其中所述拮抗劑與另外的治療劑聯用給藥。27.項26的方法，其中所述另外的治療劑是抗炎分子。28.項27的方法，其中所述抗炎分子選自皮質類固醇或非類固醇抗炎藥(NSAID)。29.鑑定抗炎製劑的方法，其包括如下步驟(a)在存在或缺無候選分子時，將T細胞培養物與IL-23保溫；(b)監測所述培養物中IL-17的水平；以及(c)如果在所述候選分子存在時的IL-17水平比該候選分子缺無時的IL-17水平低，將所述候選分子鑑定為抗炎製劑。30.項29的方法，其中所述候選分子是非肽小有機分子。31.項29的方法，其中所述候選分子是肽。32.項29的方法，其中所述候選分子是多肽。33.項29的方法，其中所述候選分子是抗體。34.項29的方法，其中所述T細胞是活化的T細胞。35.項29的方法，其中所述T細胞是記憶細胞。36.項29的方法，其中所述IL-17的水平用ELISA監測。37.抗炎製劑，其用項29的方法鑑定。38.誘導在哺乳動物受試者中產生IL-17的方法，其包括給藥所述受試者IL-23的激動劑。39.項38的方法，其中所述哺乳動物受試者是人。40.項39的方法，其中所述人受試者已經暴露於細菌感染。41.項40的方法，其中所述人受試者已經暴露於由結核分枝桿菌造成的感染。42.項39的方法，其中所述IL-23的激動劑是抗體。43.項42的方法，其中所述抗體是抗IL-23抗體或抗IL-23受體抗體。44.項43的方法，其中所述抗體是抗體片段。45.項44的方法，其中所述抗體片段選自Fv，Fab，Fab'或F(ab')2。46.項43的方法，其中所述抗體是全長抗體。47.項43的方法，其中所述抗體是嵌合的抗體。48.項43的方法，其中所述抗體是人源化的抗體。49.項43的方法，其中所述抗體是人抗體。附圖簡述圖1不同細胞種類中的IL-17產生(A)從C57/BL-6小鼠製備單個脾細胞懸液，並通過密度梯度離心從懸浮的脾細胞分離單個核細胞(mononuclearcell)。在存在或缺無微生物脂肽(microbialIipop印tide)LBP(100ng/ml)，LPS(100ng/ml)或LTA(100ng/ml)時，培養2XIO6細胞/ml3天，之後收集所述細胞並用ELISA分析IL-17。⑶從鼠脾細胞獲得純化的T細胞，之後篩選經FACS分選的、CD90標記的細胞中的陽性細胞。在平板結合的抗CD3(5yg/ml)，或來自活化的樹突細胞(LPS-處理的)的上清存在或缺無時培養這些細胞(IXIO6細胞/ml)3天，收集培養物上清並用ELISA試劑盒分析IL-17水平。所述樹突細胞來自巨噬細胞(從脾細胞懸液作為粘附性細胞群(adherentpopulation)獲得)，該過程是通過用rmGM-CSF(2ng/ml)和rmIL-4(1000U/ml)處理巨噬細胞4天，用LPS(0.5μg/ml)洗滌並重新活化(re-activating)實現的。顯示3個獨立試驗的代表性(R印resentative)結果。圖2A-2CJL-23刺激IL-17的產生A.用100U/ml重組IL-2培養從脾細胞分離的單個核細胞(2XIO6細胞/ml)並在存在或缺無各種濃度的IL-23(0.l-1000ng/ml)時溫育6天。用ELISA測定在培養物上清累積的IL-17水平。B.用定量RT-PCR測定應答於IL-23處理的IL-17mRNA水平變化。圖中顯示的(Plotted)是PCR反應Ct(循環閾值(cyclethreshold))的相對變化。每個樣本的數據相對於存在於每個樣本中的3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)mRNA水平取準，然後再次在樣品間相對於零時間(timezero)未刺激狀況時存在的IL-17mRNA水平取準。因為每個Ct對應一個PCR循環，一個Ct約等於mRNA豐度(abundance)變化的2倍。在括號中註明5Ct和IOCt變化的大致mRNA倍數差異。用來自4隻小鼠的脾細胞做試驗，用χ代表單個數據點並用條型柱(barcolumn)表示Ct變化的均值。C.如圖2B的說明，用定量RT-PCR測量IL-17家族成員IL-17F應IL-23處理的mRNA水平變化。圖3JL-23作用於記憶T細胞來刺激IL-17產生用(a)CyC-CD4+PE_CD44或(b)CyC-CD4+PE-CD62L對從鼠脾細胞單個細胞懸液分離的單個核細胞進行染色，並分選具有以下性質的⑶4+細胞⑶44κ/⑶62L或⑶44/⑶62Ls，前者是記憶表型，後者是原初表型。在存在或缺無IL-23(或其煮製物(boiledpr印)作為對照)、平板結合的抗CD3(5μg/ml)和抗⑶28(1μg/ml)的條件下，用100U/ML的重組IL-2培養所分選的細胞5天，洗滌並用抗⑶3的抗體再刺激(re-stimulate)另外24小時。收集上清並用ELISA測量IL-17水平。圖4A和4B:IL12p40抗體封閉IL-23依賴性IL-17產生(A)用IL_23(100ng/ml)在37°C預溫育濃度漸增加的p40抗體或不相關的同種型(isotype)-匹配的對照抗體1小時，然後在重組IL-2存在時，與從小鼠的脾分離的單個核細胞(2X106細胞/ml)再一同溫育5-6天。收穫上清並用ELISA測量IL-17水平(左邊的組(panel))。將最適濃度的IL-12p40抗體或不相關的同種型匹配的-對照抗體與經LPS刺激的樹突細胞(10%ν/ν)的經調節的(conditioned)培養基在37°C預溫育1小時，然後在重組IL-2存在時，與從小鼠的脾分離的單個核細胞(2X106細胞/ml)另外溫育5天。收穫上清並用ELISA測量IL-17水平(右邊的圖)。(B)在存在ConA時培養從脾細胞分離的單個核細胞3天，並用ELISA測量上清中的IL-17水平，所述脾細胞來自野生型小鼠(C57/BL6)或缺少IL-12組分之一，即IL12a"_(p35敲除)或IL12b"_(p40敲除)的小鼠。圖5A和5B:IL_12對IL-17產生的效果。(A)在存在純化的IL-23(InM)及指定濃度的IL-12時，溫育從脾細胞培養物分離的單個核細胞5天，然後洗滌並用ConA再刺激另外24小時。用ELISA試劑盒測量細胞上清中的IL-17水平。(B)在存在或缺無純化的IL-23(InM)時，溫育從脾細胞培養物分離的單個核細胞5天，然後洗滌並用ConA再刺激另外24小時，所述脾細胞培養物來自野生型或缺乏IL-12Ri32(IL-12Ri32+ko)的小鼠。用ELISA試劑盒測量細胞上清中的IL-17和IFN-γ水平。圖6:IL_23pl9基因座的靶向。A除非另外用雙斜線標出的位置，按比例(toscale)描繪了天然的IL-23pl9基因座(頂部)，靶向型(targeting)構建體(中間)，及正確靶向的基因座(底部)，。空心方塊(Openbox)指示出編碼型外顯子，陰影方塊代表編碼所得到的信使RNA(mRNA)的5'和3'未翻譯區的外顯子。對pl9基因的四個編碼外顯子編號。帶箭頭的方塊指示了新黴素(neo)的啟動子區和胸苷激酶(thymidinekinase)(tk)選擇性盒子，標記有EGFP的空心方塊指示了增強的綠色螢光蛋白報導基因的位置。用於克隆和臂分析的限制性位置被如下標記:B,BamHI；S,SacII；E,EcoRI；Bg,BglII；X，Xhol。用來擴增短臂的反義引物的位置用字母P和箭頭指示。在野生型(WT)和突變型(MUT)基因座中標出用BamHI和EcoRI消化所得的限制性片段大小，並且用粗線顯示用於通過southern印跡來檢測這些片段的兩個探針的位置。B和C分別為用探針I檢測的BamHI消化產物和用探針II探測的EcoRI消化產物的Southern印跡分析。從野生型(WT)胚胎幹(ES)細胞，從ES克隆lc5，並從野生型、雜合的(HET)、和敲除(KO)小鼠提取DNA。在印跡左側指明帶的名稱(identity)，而在右側給出帶的大小。圖7:IL-23pl9+小鼠的總血清免疫球蛋白水平。用同種型特異性ELISA確定16隻野生型(實心圓)和IL-23pl9+(空心圓)小鼠的免疫球蛋白同種型血清水平。在圖底端指出免疫球蛋白的同種型。圖8JL-23ρ19^小鼠的體液免疫反應。A-G用卵清蛋白(OVA)免疫一次(Ist)和兩次(2nd)後IgGl(A)，IgG2a(B),IgG2b(C),IgG3(D),IgE(E)，和IgA(F)的OVA特異性水平。實心圓，野生型小鼠；空心圓，IL-23pl9_~j、鼠，灰色圓，IL-12p40〃_小鼠。如方法和材料部分所述計算任意單位(Arbitraryimit)。在圖底端用黑色水平條和數值指出每組均值。用星號標記小於0.05的統計學顯著的P值。圖9:T非依賴性B細胞反應在IL-23ρ19+小鼠是正常的。用ELISA確定用TNP-LPS(I型，左)或TNP-Ficoll(II型，右)免疫的小鼠的TNP特異性IgM血清水平。實心圓，野生型小鼠；空心圓，IL-23ρ19+小鼠。圖10記憶性T細胞功能。在第O日用卵清蛋白免疫野生型(實心圓)和IL-23Ρ19+小鼠(空心圓)，並在第21天用TNP-OVA攻擊。在第0，14和26天收穫血清，並用ELISA檢驗TNP-特異性IgGl㈧和IgG2a⑶的存在。對於IgGl，使用可購買的標準品(standard)。對於IgG2a，如方法和材料部分所述計算任意單位。圖11遲髮型超敏(DTH)反應(Delayedtypehypersensitivity(DTH)reaction)。抗原特異性腫脹用足墊厚度相對於攻擊前剛測定的足墊厚度的增加百分比來計算。取每組的所有六隻小鼠的結果的均值，用誤差條(errorbar)代表標準偏差。將未致敏的第二個野生型組用作單獨被抗原誘導的腫脹的對照。各種符號內的星號表明對應組和野生型小鼠之間的差別是統計學顯著的(P<0.05)。WT，野生型；pl9ko,IL-23ρ19+小鼠；p40ko,IL-12p40+小鼠。圖12:IL_23抗原遞呈細胞的T細胞引發正常但產生的IL-17水平降低。Abalb/cT細胞與野生型(黑色條)或IL-23pl9+(白色條)樹突細胞的聯合體外異型刺激(allostimulation)實驗。通過FACS分離原初CD4+T細胞和CD8-/CDllc+/MHC-n+細胞，並在存在或缺無細菌脂肽(BLP)時溫育它們。溫育5天後，確定上清中的增殖和細胞因子水平。APC，抗原遞呈細胞。B:體內T細胞反應。分離來自用KLH免疫的野生型(黑色條)或IL-23pl9+(白色條)小鼠的淋巴結細胞懸液，並在體外用25yg/ml的KLH再刺激。培養5天後測量增殖和IL-17水平。優詵實施方案詳細描述A.定義除非另外限定本文所用技術和科學術語與本發明領域技術人員通常理解的同義。見例如Singleton等，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology2nded.,J.Wiley&Sons(NewYork,NY1994)；Sambrook等，MolecularCloning,XLaboratoryManual,ColdSpringsHarborPress(ColdSpringsHarbor,NY1989)。為本發明目的,如下限定如下術語。本文術語「拮抗劑」以最廣義使用。IL-23「拮抗劑」是無論機制如何，部分或完全封閉，抑制，中和，預防(prevent)或幹擾IL-23生物活性的分子。為本發明目的，所述生物活性優選是誘導活化的T細胞產生IL-17的能力。鑑定IL-23的拮抗劑，例如可基於它們抑制，封閉，或逆轉IL-23介導的、由活化(例如記憶)T細胞群產生IL-17的能力。例如可在被試化合物(testcompoimd)存在或缺無時溫育活化的T細胞培養物與IL-23，並例如通過ELISA，監測細胞培養物上清的IL-17水平。如果IL-17的水平在所述被試化合物存在時比其缺無時低，那麼所述被試化合物是IL-23的拮抗劑。或者，在用被試化合物處理前後，可用實時RT-PCR監測組織中的IL-17mRNA表達，該組織也表達IL-23。所述被試化合物存在時IL-17的mRNA水平下降指示該化合物是IL-23的拮抗劑。IL-23拮抗劑的例子包括但不限於抗天然序列的IL-23多肽亞基，例如p40亞基的中和性抗體，包含與免疫球蛋白恆定區序列融合的IL-23亞基的免疫粘附素(immimoadhesin)，小分子，能抑制編碼天然序列的IL-23多肽亞基的基因的翻譯和/或轉錄的反義寡核苷酸，引誘物(decoy)，例如IL-23基因的遺傳引誘物等。類似地，IL-23的拮抗劑包括但不限於抗天然IL-23受體的亞基，例如IL-23Ri31或IL-23R亞基的中和性抗體，包含與免疫球蛋白恆定區序列融合的IL-23受體亞基的免疫粘附素，小分子，能抑制編碼天然序列IL-23受體多肽亞基的基因的翻譯和/或轉錄的反義寡核苷酸，引誘物，例如IL-23受體基因的遺傳引誘物等。本文術語「激動劑」以最廣義使用。IL-23的激動劑是無論機制如何，模擬天然序列IL-23介導的生物活性的任何分子。為本發明目的，所述生物活性優選是誘導活化的T細胞產生IL-17的能力。IL-23的激動劑的例子包括但不限於抗亞基，例如天然IL-23受體的IL-12Ri31或IL-23R亞基的激動劑抗體，肽和有機小分子。「反義寡脫氧核苷酸」或「反義寡核苷酸」(所述術語互換使用)被限定為能以序列特異性方式抑制靶基因的轉錄和/或翻譯的核酸分子。術語「反義」指的是核酸與所述靶基因的編碼(「有意義(sense)」)遺傳序列互補的事實。通過沃森-克裡克(Watson-Crick)鹼基配對，反義寡核苷酸與新生(nascent)mRNA以反向平行定向(antiparallelorientation)雜交。通過結合靶mRNA模板，反義寡核苷酸阻斷被編碼的蛋白的成功翻譯。該術語特異地包括叫做「核酶」的反義製劑(agent)，通過加入有天然自身剪接活性的序列，它已經被設計來誘導靶RNA的催化裂解(Warzocha和Wotowiec,「Antisensestrategy:biologicalutilityandprospectsinthetreatmentofhematologicalmalignancies.〃Leuk.Lymphom24:267_281[1997])。本文術語「抗體」以最廣義使用，並且特異性包括單克隆抗體(包括拮抗劑，例如中和性抗體和激動劑抗體)，多克隆抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及抗體片段。所述單克隆抗體特異性包括「嵌合」抗體，其中部分重鏈和/或輕鏈與來自具體物種(species)或屬於具體抗體種類或亞類的抗體中的對應序列相同或同源，而所述鏈的其它部分與來自其它物種或屬於其它抗體類或亞類的抗體、以及這種抗體的片段中的對應序列相同或同源，只要它們表現出了所需的生物活性(美國專利4，816，567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81=6851-6855[1984])0所述單克隆抗體還包括「人源化」抗體或其片段(如？￥衝油衝油',F(ab')2或抗體的其它抗原結合型的亞序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。大多數情況(Forthemostpart)，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自所述受者CDR的殘基被具有理想的特異性、親合力和載量(capacity)的非人物種(供者抗體)的CDR的殘基所取代，所述非人物種諸如小鼠、大鼠或兔。有時，人免疫球蛋白FvFR殘基被對應的非人殘基所取代。另外，人源化抗體可包含不存在於受者抗體也不存在於引入的(imported)⑶R或框架序列發現的殘基。做這些修飾來進一步改進(refine)抗體並使其性能(performance)達到最大化。通常，人源化抗體基本包含所有的至少一個、通常兩個可變區，其中所有或基本所有的⑶R區對應於那些非人免疫球蛋白的CDR區，並且所有或基本所有的FR區是那些人免疫球蛋白序列的FR區。所述人源化抗體也最適地包含免疫球蛋白恆定區(Fe)的至少一部分，其通常來自人免疫球蛋白。更多細節見.Tones等，Nature,321522~525(1986)和Reichmann等，Nature，332323~329(1988)。所述人源化抗體包括raiMATIZED<抗體，其中抗體的抗原結合區源自用感興趣的抗原免疫恆河猴(macaquemonkey)產生的抗體。「抗體片段」包含完整抗體的部分，優選完整抗體的抗原結合或可變區。抗體片段的例子包括Fab，Fab',F(ab')2，和Fv片段；雙抗體(diabodies)；線性抗體(Zapata等，ProteinErg8(10)1057-1062(1995))；單鏈抗體分子；和從抗體片段形成的多特異性抗體。本文術語「炎性疾病」或「炎性病症(disorder)」指導致炎症的病理狀態，其通常由中性粒細胞趨化作用(neutrophilchemotaxis)造成。此種疾病的例子包括炎性皮膚病(inflammatoryskindisease)，其包括牛皮癬和特應性皮炎(atopicdermatitis)；全身性硬皮病(systemicscleroderma)禾口硬化(sclerosis)；與炎症性腸病(inflammatoryboweldisease)(IBD)(如克隆氏病(Crohn『sdisease)禾口饋蕩性結腸炎)相關的反應；缺血再灌注疾病(ischemicreperfusiondisorder)，其包括外科手術組織再灌注損害(surgicaltissuereperfusioninjury)，心肌缺血性疾病(condition)如心肌梗塞，心臟停搏，心臟手術後再灌注和經皮經血管冠狀動脈血管成形T^(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty)後白勺I夾窄(constriction)，中風，和腹主動脈瘤(abdominalaorticaneurysm)；繼發於中風的腦水腫；顱創傷(cranialtrauma)，低血容量性休克；窒息；成人型呼吸窘迫症候群(adultrespiratorydistresssyndrome)；急性肺損傷；白塞病(Behcet'sdisease)，皮肌炎；多發性肌炎；多發性硬化(MS)；皮炎；腦膜炎；腦炎；眼色素層炎(uveitis)；骨關節炎；狼瘡腎炎；自身免疫性疾病如類風溼性關節炎(RA)，乾燥症候群(Sjorgen'ssyndrome)，血管炎；涉及白細胞滲出(leukocytediapedesis)的疾病；中樞神經系統(CNS)炎症性疾病，繼發於敗血症(s印ticaemia)或創傷的多器官損傷症候群(multipleorganinjurysyndrome)；酒精性肝炎；細菌性肺炎；抗原抗體複合體介導的疾病，其包括腎小球腎炎；膿毒病(s印sis)；結節病(sarcoidosis)；對組織/器官移植的免疫病理性反應；肺的炎症，其包括胸膜炎，肺泡炎，血管炎，肺炎，慢性支氣管炎，支氣管擴張，彌散性全細支氣iW(peribronchiolitis)，生月市(hypersensitivitypneumonitis),牛寺胃個生月市千維化(idiopathicpulmonaryfibrosis)(IPF)，和囊性纖維化等。優選的適應徵包括但不限於慢性炎症，自身免疫性糖尿病(autoimmunediabetes)，類風溼性關節炎(RA)，類風溼性脊椎炎(rheumatoidspondylitis)，痛風性關節炎(goutyarthritis)，及其它關節炎狀況(arthriticcondition)，多發性硬化(MS)，哮喘，系統性紅斑狼瘡(systhemiclupuserythrematosus)，成人型呼吸窘迫症候群，白塞病，牛皮癬，慢性肺炎性疾病(pulmonaryinflammationdisease)，移植物抗宿主反應，克隆氏病，潰瘍性結腸炎，炎症性腸病(IBD)，阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease)，和發熱(pyresis)，以及涉及炎症和病症的任何疾病或紊亂。術語「治療」指治療性治療和預防(prophylacticorpreventative)的措施，其中目的是為了預防或減緩(減輕(lessen))不希望的生理改變或紊亂。為本發明目的，有益或理想的臨床結果包括但不限於，症狀的減輕(alleviation)，疾病範圍(extentofdisease)的縮小(diminishment)，疾病狀態的穩定(即未惡化)，疾病進展的遲發或減慢，疾病狀態的改善或緩和(palliation)，及症狀緩解(remission)(無論部分或整體)，而無論其可檢測與否。「治療」也指與未接受治療時的預期存活期相比延長的存活期。需要治療的對象包括已患所述疾病，和易於患所述疾病，或有待預防所述疾病的那些對象。「慢性」給藥指以與急性方式相對的持續方式來給予一或多種製劑，從而維持理想效果延長的(extended)—段時間。「間歇」給藥不是連續無間斷的治療，而是循環的(cyclicinnature)。「聯用」一或更多其它治療製劑給藥包括以任何順序同時(共同(concurrent))和連續給藥。「受試者」是脊椎動物，優選哺乳動物，更優選是人。本文術語「哺乳動物」指任何被分類為哺乳動物的動物，其包括但不限於人，家養(domestic)和飼養(farm)動物，和觀賞動物(zooanimal),競技動物(sportsanimal)或寵物動物，如綿羊，狗，馬，貓，母牛等。優選，本文哺乳動物是人。「有效量」是足夠實現有益或理想治療性(包括預防性)結果的量。可以通過一或更多給藥來給予有效量。B.本發明實施方式除非另外指出，本發明實踐使用本領域內的分子生物學(包括重組技術)，微生物，細胞生物學，生物化學和免疫學的常用技術。文獻中詳細解釋了這些技術，如「MolecularCloning:ALaboratoryManual「，2ndedition(Sambrook等，1989)；「OligonucleotideSynthesis「(Μ.J.Gait,ed.,1984)；「AnimalCellCulture"(R.I.Freshney,ed.，1987)；「MethodsinEnzymology「(AcademicPress，Inc.)；「HandbookofExperimentalImmunology「，4thedition(D.M.Weir&C.C.Blackwell,eds.，BlackwellScienceInc.，1987)；「GeneTransferVectorsforMammalianCells「(J.M.Miller&Μ.P.Calos,eds.,1987)；「CurrentProtocolsinMolecularBiology"(F.Μ.Ausubel^eds.,1987)；「PCR:ThePolymeraseChainReaction〃，(Mullis等，eds.，1994)；禾口〃CurrentProtocolsinlmmunology〃(J.Ε.Coligan等，eds.，1991)。如前述，本發明是基於如下認識IL_23誘導活化T細胞，特別是記憶細胞產生IL-17，並且IL-23的拮抗劑能抑制此進程。因此，IL-23的拮抗劑是治療炎症狀況的有希望的候選藥物(promisingdrugcandidate)，所述炎症狀況的特徵為IL-17水平升高。相反，IL-23的激動劑可用於誘導對多種感染的保護性免疫反應，包括分枝桿菌感染，如例如，結核分枝桿菌(M.tuberculosis)感染。1.鑑定IL-23的拮抗劑或激動劑的篩詵試騎本發明包括鑑定IL-23的拮抗劑的篩選試驗，所述拮抗劑具有治療特徵為存在水平升高的IL-17的炎症性狀況的功效。本發明還包括鑑定IL-23的激動劑的篩選試驗，所述激動劑具有刺激對感染如結核分枝桿菌感染的保護性免疫反應的功效。候選拮抗劑藥物的篩選試驗可被設計用來鑑定化合物，其與IL_23(包括亞基或它的其它片段)或IL-23受體(包括亞基或它的其它片段)結合或複合，或另外幹預IL-23與其它細胞蛋白的相互作用，從而幹預IL-23產生或起作用。本文提供的篩選試驗包括適合高通量(high-throughput)篩選化學文庫的試驗，使它們特別適合鑑定小分子候選藥物。通常，結合試驗和活性試驗是已知的。可以多種形式進行所述試驗，其包括但不限於本領域公知的蛋白-蛋白結合試驗，生物化學篩選試驗，免疫測定，和基於細胞的試驗。對於拮抗劑和激動劑的所有試驗都是常用的，因為它們需要在一定條件下使候選藥物與IL-23多肽，或和IL-23受體多肽，或所述多肽的片段(特別是包括IL-23和IL-23受體亞基)接觸足夠長的時間來使這兩種組分相互作用。例如，所述人IL-23pl9亞基是189個胺基酸的多肽，其序列以登錄號AF301620可得自EMBL資料庫(NCBI605580；GenBankAF301620；Oppmann等，如上述)。IL-23多肽亞基p40的序列也已知(也稱為IL-12p40亞基；NCBI161561)。IL-23所結合的IL-12Rβ1的序列以登錄號NCBI601604可得。製備結合所述多肽的抗體或小分子對本領域技術人員公知。結合試驗中，所述相互作用是結合，並且形成的複合體可被分離或在反應混合物中被檢測。具體實施方案中，IL-23或IL-23受體多肽或所述候選藥物通過共價或非共價連接(attachment)被固定在固相上，例如在微量滴定板上。非共價連接通常通過用IL-23或IL-23受體多肽的溶液包被固體表面並乾燥來完成。或者，可使用對待固定的IL-23多肽或IL-23受體多肽具有特異性的固定化抗體，例如單克隆抗體來將其錨定(anchor)到固體表面。進行所述試驗是通過將可以使用檢測標籤來標記的未固定組分，加入到固定的組分，例如含有所述被錨定組分的被包被的表面。當所述反應完成時，例如通過洗滌來去除未反應組分，再檢測錨定到固體表面的複合體。當原來未固定的組分攜帶檢測標籤時，檢測到固定在表面的標籤表明出現了複合。當原來未固定的組分不攜帶標籤時，可例如通過使用特異性結合所述固定化複合體的經標記的抗體來檢測所述複合。如果候選化合物是與IL-23或IL-23受體相互作用但不與之結合的多肽，可用已知檢測蛋白-蛋白相互作用的方法來測定其與各自的多肽的相互作用。此試驗包括傳統途徑，如例如交聯，共免疫沉澱和用梯度或層析柱共同純化。另外，可用基於酵母的遺傳系統監測蛋白_蛋白相互作用，其如Fields及其合作者描述(Fields和Song,Nature(London),340:245_246(1989)；Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,889578-9582(1991))如Chevray和Nathans,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,895789-5793(1991)公開。很多轉錄活化物(activator)，如酵母GAL4，其由兩個物理上不連續的模塊區(physicallydiscretemodulardomain)組成，一個作為DNA結合區，另一個用作轉錄活化區(activationdomain)0在上述文獻中描述的酵母表達系統(通常指「雙雜合體(two-hybrid)系統」)利用這個性質，並使用兩個雜合蛋白(hybridprotein)，其中之一是靶蛋白，其與GAL4的DNA結合區融合，並且另一個是候選活化蛋白，其與活化區融合。受GAL4-活化的啟動子控制的GALl-IacZ報導基因的表達依賴於經蛋白-蛋白相互作用的GAL4活性重建。包含相互作用的多肽的集落(Colonies)用β-半乳糖苷酶的(chromogenic)產色底物來檢測。用雙雜合體技術鑑定兩個特異性蛋白間的蛋白-蛋白相互作用的完整試劑盒(MATCHMAKER)從Clontech可購。此系統也能擴展到定位(map)涉及特異性蛋白相互作用的蛋白結構域並精細到(pinpoint)對這些相互作用關鍵的胺基酸殘基。可如下測定幹預IL-23與其它細胞內或細胞外組分，具體是IL-17的相互作用的化合物。通常製備包含IL-23和細胞內或細胞外組分(例如IL-17)的反應混合物，在一定條件下允許兩個產物相互作用足夠長的時間。為測定候選化合物抑制IL-23和IL-17相互作用的能力，在被試化合物缺無和存在時進行該反應。另外，可將安慰劑加入反應混合物來作為陽性對照。既然IL-23已經顯示誘導了IL-17的產生，可例如通過在被試化合物缺無和存在時測量IL-17的量來測定被試化合物抑制IL-23/IL-17相互作用的能力。如果IL-17的量在候選化合物存在時比在其缺無時低，那麼所述候選化合物是本發明限定的IL-23的拮抗劑。基於它們抑制IL-23誘導IL-17產生的能力來鑑定的IL-23拮抗劑是治療炎性疾病的候選藥物，所述疾病的特徵是存在水平提高的IL-17。基於它們促進IL-23誘導IL-17產生的能力來鑑定的IL-23激動劑是候選藥物，其誘發或支持對感染，如結核分枝桿菌感染的保護性免疫反應，結果治療了傳染病(infectiousdisease)，如結核病。強調這裡特異性討論的篩選試驗僅僅是為了解釋。根據所篩選的候選拮抗劑種類(例如多肽，肽，非肽的小有機分子，核酸等)選擇的多項其它試驗對本領域技術人員公知並且同等適用本發明目的。2.抗IL-23和抗IL-23受體的抗體具體實施方案中，IL-23的拮抗劑或激動劑是IL_23(例如IL-23亞基)的單克隆抗體，包括抗體片段。其它具體實施方案中，IL-23的拮抗劑和激動劑包括IL-23受體(例如IL-23受體的亞基)的單克隆抗體。上面已經討論了IL-23，包括其亞基。IL-23的受體包含兩個亞基IL-12R01，和近來被討論叫做IL-23R的亞基(Parham等，J.Immunol.1685699-5798(2002))。對任一亞基的抗體都特異地在本發明範圍內。對於拮抗劑的情況，具體優選特異性結合IL-23R亞基的抗體，因為它們特異性阻斷了IL-23介導的生物活性。生產單克隆抗體的方法本領域公知。因此，可用雜交瘤方法製備單克隆抗體，如Kohler和Milstein,Nature,256495(1975)描述的那些。雜交瘤方法中，通常用免疫製劑免疫小鼠、豚鼠或其它合適的宿主動物，來激發(elicit)產生或能產生會特異性結合到免疫製劑的抗體的淋巴細胞。或者，可在體外免疫淋巴細胞。所述免疫製劑通常包括IL-23或IL-23受體多肽或其融合蛋白。一般來說，如果需要人源的細胞那麼使用外周血淋巴細胞(「PBL")，或如果需要非人哺乳動物來源那麼使用脾細胞或淋巴結細胞。然後用合適的融合製劑，如聚乙二醇將所述淋巴細胞與固定細胞系融合來形成雜交瘤細胞[Goding,MonoclonalAntibodiesprinciplesandPractice,AcademicPress,(1986)pp.59-103]。固定的細胞系通常是經轉化的哺乳動物細胞，具體是齧齒動物、牛和人來源的骨髓瘤細胞。通常用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。所述雜交瘤細胞可能被培養在合適的培養基中，其優選包含一或更多可抑制未融合的固定化細胞的生長或存活的物質。例如如果親代細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(guaninephosphoribosyltransferase)(HGPRT或HPRT)，那麼雜交瘤的培養基通常包括次黃嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶(「HAT培養基")，所述物質防止HGPRT-缺陷的細胞生長。優選的固定細胞系是高效融合的，其支持由所選擇的產生抗體的細胞穩定高水平地表達抗體，並且對培養基如HAT培養基敏感。更優選的固定細胞系是鼠骨髓瘤系，其例如可得自theSalkInstituteCellDistributionCenter，SanDiego，California禾口美H^M^^MMΦ(theAmericanTypeCultureCollection,Manassas,Virginia)。也描述了產生人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤(heteromyeloma)細胞系[Kozbor,J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur等，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,MarcelDekker,Inc.，NewYork，(1987)pp.51-63]。也可測定用於培養所述雜交瘤細胞的培養基中抗IL-23或IL-23受體的單克隆抗體的存在。優選，所述雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性用免疫沉澱或體外結合試驗，如放射免疫試驗(RIA)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)確定。所述技術和試驗本領域已知。所述單克隆抗體的結合親合力可例如，用斯卡查德分析(Scatchardanalysis),Munson和Pollard，Anal.Biochem.，107220(1980)確定。鑑定了理想的雜交瘤細胞後，可用限制性稀釋方法亞克隆所述克隆並用標準方法使其生長「Godim，如上述1。適合此目的培養基包括，例如Dulbecco改良Eagle培養基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)和RPMI-1640培養基。或者，所述雜交瘤細胞可在體內如在哺乳動物的腹水(ascite)內生長。可用常規免疫球蛋白純化方法從培養基或腹水分離或純化由所述亞克隆分泌的單克隆抗體，所述方法如例如，蛋白A-瓊脂糖凝膠(S印harose)，羥基磷灰石(hydroxylapatite)層析，凝膠電泳，透析或親和層析。也用重組DNA方法，如美國專利4，816，567所述的那些來生產單克隆抗體。用常規方法可容易地分離並測序編碼本發明單克隆抗體的DNA(例如，通過使用能特異性結合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。用本發明的雜交瘤細胞作為所述DNA的優選來源。一旦分離，可將所述DNA置入表達載體，然後將其轉染到不會另外產生免疫球蛋白蛋白的宿主細胞，如猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞，來在重組細胞中合成單克隆抗體。也可修飾所述DNA，例如通過用人重鏈和輕鏈恆定區的編碼序列取代同源鼠序列[美國專利4，816，567；Morrison等，如上述]或通過使免疫球蛋白編碼序列與所有的或部分的非免疫球蛋白多肽編碼序列共價連接。所述非免疫球蛋白多肽可以被本發明抗體恆定區取代、或可被本發明抗體一個抗原結合位點的可變區取代來產生嵌合的二價抗體。所述抗體可以是單價抗體。製備單價抗體的方法本領域公知。例如，一種方法涉及重組表達免疫球蛋白輕鏈和被修飾的重鏈。通常在Fc區的任何點截短所述重鏈來避免重鏈交聯。或者，通過相關的半胱氨酸殘基被其它胺基酸殘基取代或缺失來避免交聯。體外方法也適合製備單價抗體。本發明抗IL-23和抗IL-23受體的抗體還可以是人源化抗體或人抗體。非人(例如鼠)抗體的人源化形式是嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv，Fab,Fab'，和F(ab')2或抗體的其它抗原_結合亞序列)，其包含來自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受者互補決定區(CDR)的殘基被具有所需的特異性、親合力和載量的來自非人物種(供者抗體)的CDR殘基取代，所述非人物種如小鼠、大鼠或兔。有時，所述人免疫球蛋白FvFR框架殘基被對應的非人殘基取代。人源化抗體還可包含不在受者抗體和輸入的CDR或框架序列發現的殘基。通常，所述人源化抗體基本包含所有的至少一個、通常兩個可變區，其中所有或基本所有的⑶R區對應於那些非人免疫球蛋白的CDR區，並且所有或基本所有的FR區是那些人免疫球蛋白共有序列的FR區。所述人源化抗體也最適包含免疫球蛋白通常是人免疫球蛋白恆定區(Fe)的至少一部分。「Jones等，Nature,321522~525(1986)Riechmann等，Nature,332323~329(1988)；禾口Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2:593_596(1992)]。人源化非人抗體的方法本領域公知。通常人源化抗體具有由非人來源引入它的一或更多個胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基通常稱為「輸入(import)」殘基，其通常取自「輸入」可變區。人源化基本用Winter及合作者的方法進行「Jones等，Nature,321522-525(1986)Riechmann等，Nature.332323~327(1988)；Verhoeyenφ,Science,2391534-1536(1988)]，它是將齧齒動物的⑶R或⑶R序列取代為人抗體的對應序列。因此，此「人源化的」抗體是嵌合抗體(美國專利4，816，567)，其中基本上不足完整(lessthanintact)的人可變區已經被來自非人物種的對應序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人抗體，其中一些⑶R殘基和可能的一些FR殘基被來自嚙齒類動物抗體中類似位置(analogoussite)的殘基取代。也可用多種本領域公知技術生產人抗體，所述技術包括噬菌體顯示文庫(phagedisplaylibraries)[Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991)]。也可用Cole等和Boerner等的技術來製備人單克隆抗體(Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985)和Boerner等，J.Immunol.，147(1:86_95(1991)]。同樣，可通過將人免疫球蛋白基因座引入到轉基因動物來生產人抗體，所述轉基因動物例如內源性免疫球蛋白基因已被部分或全部失活的小鼠。攻擊後觀察人抗體產生，它與在人中見到的所有方面十分類似，包括基因重排(rearrangement),裝配(assembly)和抗體庫(r印ertoire)。此方法的描述例如見美國專利5，545，807；5，545，806；5，569，825；5，625，126；5，633，425；5，661，016，及如下科學文獻Marks等，Bio/Technology10,779-783(1992)；Lonberg等，Nature368856-859(1994)；Morrison,Nature368,812-13(1994)；Fishwildφ,NatureBiotechnology14,845-51(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology21826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65_93(1995)。Mendez等(NatureGenetics15:146-156(1997))進一步改進了技術並產生了名為「XenomouseII」的轉基因小鼠系，用抗原攻擊它時會產生高親和力的完全人抗體。通過將巨鹼基(megabase)人重鏈和輕鏈基因座種系整合(germ-lineintegration)到如上缺失內源性Jh節段的小鼠中來實現它。所述XenomouseII容納(harbor)了1，020kb的人重鏈基因座，其包含大約66個％基因，完全的D1^PJh區，以及三個不同的恆定區(μ，δ和X)，它還容納了800kb的人κ基因座，其包含32個Vk基因，Jk節段和Cκ基因。這些小鼠產生的抗體十分類似在人見到的所有方面，包括包括基因重排，裝配和抗體所有組成成分。所述人抗體優選表達超過內源性抗體，因為內源性Jh節段的缺失避免了鼠基因座上的基因重排。或者，可使用噬菌體顯示技術(McCafferty等，Nature348，552-553(1990))，用未免疫供者的免疫球蛋白可變(V)區基因的所有組成成分在體外產生人抗體和抗體片段。根據此技術，將抗體V區基因克隆到如M13或fd的絲狀噬菌體(filamentousbacteriophage)要夕卜冑胃白(majororminorcoatprotein)_13||1石馬_內(in-frame)，並在噬菌體顆粒表面上顯示為有功能的抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基於所述抗體功能性質進行選擇也就選擇了編碼表現出那些性質的抗體的基因。因此，所述噬菌體模擬了B細胞的一些性質。可用多種形式進行噬菌體顯示有關它們的綜述見例如Johnson，KevinS.和Chiswell，DavidJ.，CurrentOpinioninStructuralBiology，564-571(1993)。可用各種V-基因節段來源來作噬菌體顯示。Clackson等，Nature352,624-628(1991)分離了抗噁唑酮(oxazolone)抗體的多樣性陣列(array)，所述抗體來自源自免疫小鼠脾臟的V基因的小隨機組合文庫(randomcombinatoriallibrary)。可構建來自未免疫的人供者的V基因的所有組成成分，並且可基本依據如Marks等，J.Mol.Biol.222，581-597(1991)，或Griffith等，EMBOJ12,725-734(1993)所述的技術分離抗多種抗原陣列(包括自身抗原)的抗體。天然免疫反應中，抗體基因以高速(atahighrate)累積突變(體細胞高變(somatichypermutation))。一些引入的變化會使親和力更高，並且在隨後的抗原攻擊中優選使顯示高親和力的表面免疫球蛋白的B細胞複製並分化。可通過使用「鏈改組(chainshuffling)」的技術來模擬此天然過程(Marks等，BiolTechnol.邊，779-783[1992])。此方法中，要提高通過噬菌體顯示獲得的「第一(primary)」人抗體的親合力，可通過用從未經免疫的供者獲得的V區基因的天然存在變體庫(庫)取代重鏈和輕鏈V區的基因。此技術可產生親合力在nM範圍的抗體和抗體片段。Waterhouse等，Nucl.AcidsRes.21,2265-2266(1993)已描述了製造非常大的噬菌體抗體所有組成成分的策略。已經開發了產生抗體片段的多種技術。傳統上通過蛋白水解消化完整抗體來得到這些片段(見例如，Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods24107-117(1992)和Brennan等，Science229:81(1985))。然而現在可直接由重組細胞產生這些片段。例如，可直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段並化學偶聯來形成F(ab')2片段(Carter等，BiolTechnology10:163-167(1992))。另一個實施方案中，用亮氨酸拉鏈(zipper)GCN4形成F(ab')2，從而促進F(ab')2分子的裝配。根據另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養物分離Fv，Fab或F(ab')2片段。其它產生抗體片段的技術對本領域試驗人員明顯可知。本發明範圍也包括由兩個共價連接的抗體組成的異偶聯(Hetcroconjugate)抗體。此抗體已例如，被建議用來使免疫系統細胞靶向不需要的細胞(美國專利4，676，980)，並用來治療HIV感染(PCT申請公開號W091/00360和W092/200373)。可使用任何方便的交聯方法，用公知、可購的交聯製劑來製備同種異型偶聯抗體。更多涉及產生單克隆抗體的信息也見Goding，J.W.，MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice,3rdEdition,AcademicPress,Inc.,London,SanDiego,1996；Liddell禾口WeeksAntibodyTechnoloRY:AComprehensiveOverview,BiosScientificPublishers:0xford,UK,1995；Breitling禾口DubelRecombinantAntibodies,JohnWiley&Sons,NewYork,1999禾口PhaReDisplay:ALaboratoryManual,Barbaseditors,ColdSpringsHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,2001。3.靶疾病IL-17涉及多種炎性疾病，包括類風溼關節炎(RA)。RA的主要特徵之一是關節周圍骨的侵蝕(erosion)。破骨細胞在骨的重吸收中起主要作用，但破骨細胞從祖細胞形成的機制並未被完全理解。近來，Kotake等，(J.Clin.Invest.1031345(1999))報導，在共培養小鼠造血細胞和初級(primary)破骨細胞時自介素17(IL_17)可誘導破骨細胞樣細胞形成。由IL-17誘導的破骨細胞生成(osteoclastogenesis)顯示被環加氧酶(cyclooxygenase)-2(C0X-2)的選擇性抑制物吲哚美辛(indomethacin)抑制。與骨關節炎(0A)病人相比發現，RA病人的滑液(synovialfluid)包含特別高水平的IL-17。另外，使用免疫染色，在RA病人的滑膜組織但沒有在0A病人的組織內檢測出IL-17陽性的單個核細胞。這些發現現被解釋為表明IL-17有助於RA的骨侵蝕和關節損害，因此可以是被抑制的靶。與健康受試者相比，白塞病的病人已經顯示IL-17的血清水平驚人提高。Hamzaoui等，Scand.J.Rheumatol.31(4)205-10(2002)。在哮喘性氣道(asthmaticairway)內已發現IL-17的水平提高，並且提示IL-17可能通過釋放其它促炎介質，如a-趨化因子來放大炎症性反應。Molet等，J.AllerRYClin.Immunol.108(3):430_8(2001)；禾口Wong等，Clin.Exp.Immunol.125(2)177-83(2001)。在患系統性紅斑狼瘡的病人已報導了IL-17水平提高。Wong等，Lupus9(8)589-93(2000)。已描述IL-17在牛皮癬中起作用。Homey等，J.Immunol.164(12):6621_32(2000)。已報導IL-17mRNA在多發性硬化的血和CSF單個核細胞中被放大(augment)。Matusevicius等，Mult.Scler.5(2)101-4(1999)。基於這些以及諸多類似報導，抑制了IL-23誘導IL-17產生的能力從而降低了IL-17的水平的IL-23拮抗劑，是治療多種(慢性)炎症狀況和疾病的有價值的候選物。所述疾病的例子包括但不限於慢性炎症，自身免疫性糖尿病，類風溼性關節炎(RA)，類風溼性脊椎炎，痛風性關節炎，及其它關節炎狀況，多發性硬化(MS)，哮喘，系統性紅斑狼瘡，成人型呼吸窘迫症候群，白塞病，牛皮癬，慢性肺炎性疾病，移植物抗宿主反應，克隆氏病，潰瘍性結腸炎，炎症性腸病(IBD)，阿爾茨海默病，和發熱。已知IL-17是通過促進IFN-y產生並因此誘導細胞介導的免疫反應來在對某些傳染病，如肺結核產生保護性反應中起重要作用的。因此，IL-23的激動劑，包括激動劑抗體，對誘導針對多種感染(如結核分枝桿菌引起的肺結核)的細胞介導的免疫反應有效，並且是治療每年全球殺死三百萬人以上的傳染病的有希望的候選藥物。4.藥物組合物可以以藥物組合物形式給藥由上文披露的篩選試驗鑑定的、特異性結合IL-23或IL-23受體的抗體，以及其它IL-23的拮抗劑或激動劑分子，來治療多種疾病，特別是炎性疾病或由於誘導細胞介導的免疫反應造成的疾病。使用抗體片段時，優選特異性結合到靶蛋白結合區的最小抑制性片段。例如，基於抗體可變區序列，可設計保持結合靶蛋白序列的能力的肽分子。可化學合成和/或用重組DNA技術生產此肽。見例如，Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889_7893(1993)。也可以例如用團聚(coacervation)技術或界面聚合(interfacialpolymerization)，將所述活性組分包載(entrapped)在製備的微膠囊(microcapsule)中，例如羥甲基纖維素酯(hydroxymethylcellulose)或明膠-微膠囊和聚-(methylmethacylate)微膠囊可分別在膠體藥物傳遞系統(例如，脂質體，微球白蛋白(albuminmicrosphere)，微乳狀液(microemulsion)，納米顆粒(nano-particle)，和納米膠囊(nanocapsule))或在大分子乳狀液(macroemulsion)中。這些技術披露於Remington'sPharmaceuticalSciences,如上述。用於體內給藥的劑型(formulation)必須是無菌的。這可通過濾過無菌濾過膜來容易地實現。可以製備緩釋(Sustained-release)製備物。緩釋製備物的適當例子包括包含抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質，該基質為成型(shaped)顆粒，例如膜(film)或微膠囊的形式。緩釋基質的例子包括聚酯，水凝膠(例如，聚羥乙基甲基丙烯酸酯(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate)),或聚乙烯醇(poly(vinylalcohol)),多乳酸化合物(polylactide)(美國專利號3，773，919)，L-穀氨酸和y乙基_L_穀氨酸(glutamate)的共聚物，非降解的(non-degradable)乙烯-醋酸乙烯(ethylene-vinylacetate)，降解的乳酸-羥基乙酸(glycolicacid)共聚物如LUPR0NDEPOT(注射的微球，其由乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)組成)，和聚_D_(-)_3_羥基丁酸。儘管聚合物如乙烯_醋酸乙烯和乳酸_羥基乙酸使分子釋放超過100天，某些水凝膠釋放蛋白的時間段卻較短。當被囊化的(encapsulated)抗體在體內長時間保持，由於在37°C暴露於溼氣(moisture)，它們可變性或聚集，導致失去生物活性並可能改變免疫原性。根據所涉及的機制可設計穩定化的合理策略。例如，如果發現聚集機制是通過硫代_二硫互換(interchange)形成的分子間S_S鍵，那麼可通過修飾巰基殘基，在酸性溶液超低溫凍幹(lyophilizing)，控制溼度含量，使用合適添加劑，並開發特異性聚合物基質組合物，來進行穩定化。本文製劑也可包含一種以上對要治療的特定適應症必要的活性化合物，優選具有互補活性但不負面影響彼此的那些。所述分子適合以達到目的的有效量聯合物存在，或可分別製劑(formulate)，並合併或以任何順序連續給藥。例如，本發明IL-23的拮抗劑可與現在用於治療靶疾病和狀況的抗炎製劑和其它活性化合物聯合給藥。所述化合物包括皮質類固醇；非類固醇(non-steroidal)的抗炎藥物(NSAID)，如阿司匹林，布洛芬(ibuprofen)，和C0X-2抑制物，例如Celebrex⑧和Vioxx⑧；可改善疾病的(disease-modifying)抗類風溼藥物(DMARDs)，如氨甲喋呤，來氟洛米(leflunomide)，柳氨磺吡啶(sulfasalazine)，硫唑嘌呤(azathioprine)，環孢菌素(cyclosporine)，羥氯喹啉(hydroxychloroquine)，和D_青黴胺；和生物反應調節物(modifier)(BRM)，如TNF和IL-1的抑制物。提供如下實施例是為了闡述，而不是從任何一方面限制本發明範圍。所有本說明書引用的專利和參考文獻都全文引入作為參考。實施例實施例1白介素-23(IL-23)促講以白介素-17(IL-17)產牛為特ffi的獨特的CD4T細胞』活化狀傑儘管IL-17由激活的T細胞產生是清楚的，以前的報告並沒有提供它在以Thl和Th2為兩極的細胞因子圖譜範例內的清楚分類。此實施例描述最初的試驗是為了檢查應答於與Thl或Th2反應相關的信號不同的(distinctfrom)信號來表達IL-17的可能性。實驗步驟細胞培養物-從C57/BL-6小鼠製備單個脾細胞懸液，並通過密度梯度離心從懸浮的脾細胞分離單個核細胞。在多種刺激存在或缺無時(如圖說明所指的時間)用IL-2(100單位/ml)培養2X106細胞/ml，之後收集細胞並用ELISA(R&DSystems,Minneapolis,MN)分析IL-17。所述樹突細胞來自巨噬細胞(從脾細胞懸液以粘附性細胞群獲得)，獲得它是通過用rGM-CSF(2ng/ml)和rIL_4(1000單位/ml)處理巨噬細胞4天，用LPS(0.5yg/ml)洗滌並重新活化。分離記憶和原初T細胞是如下進行用CyC-⑶4+PE-⑶44或CyC-⑶4+PE-⑶62L染色從鼠脾細胞的單個細胞懸液分離的單個核細胞，並並分選⑶4+細胞，⑶44s/⑶62L是記憶表型或⑶44/⑶62L是原初表型。體外誘導T細胞分化-用抗CD4的磁珠(MiltenyiBiotech)從野生型C57/BL6小鼠的脾純化⑶4+細胞。通過在包被了5ug/ml抗⑶3和lg/ml抗⑶28的抗體的平板上劃線來活化純化的T細胞(2\106細胞/!111)3天。所述培養物補充了IL-2，並用IL-12(20mM)+抗IL4(0.5iig/ml)(為了Thl分化)或IL-23(lOnM)(為產生IL-17)來處理。在最初的活化後，充分洗滌所述細胞培養物並用抗CD3(1ug/ml)再刺激另外24小時，之後用ELISA分析細胞上清中的多種被分泌的細胞因子。IL-12p40抗體抑制IL-17誘導-將抗IL-12抗體(R&DSystems,目錄號(cat.no.)AF-419-NA)或無關的對照抗體(抗FGF_8b(R&DSystems,目錄號AF-423-NA)與18IL-23(100ng/ml)或LPS-刺激的樹突細胞(10%v/v)的條件培養基在37°C預溫育1小時，再與從小鼠脾分離的單個核細胞(2X106細胞/ml)溫育另外5-6天。收集上清並用ELISA測量IL-17水平。純化IL-23-鼠IL-23-通過在人胚胎腎細胞(293個細胞)中共表達羧基末端His-標記的pl9和FLAG0標記的p40來產生IL-23組分，並用鎳親合樹脂純化分泌的蛋白。低於0.2內毒素單位/Ug的內毒素水平不可檢測。MM首先，檢測多種微生物產物刺激IL-17產生的能力。近來Infante-Duarte等JImmunol165，6107(2000)觀察到IL-17應答於致萊姆病(Lymedisease)螺旋菌(spirochete)B.burgdorferi的微生物脂肽反應而增加。存在多種微生物肽包括LPS(革蘭氏陰性細菌)，LTA(革蘭氏陽性細菌)或LBP(細菌脂肽)時，脾細胞培養物會產生IL-17(圖1)。純化的T細胞自身，或純化的巨噬細胞自身都不產生IL-17。在用平板結合的抗CD3與受體交聯，並用來自活化巨噬細胞/樹突細胞的上清處理後，純化的T細胞產生的IL-17增加，這表明存在由這些細胞釋放的未被鑑定的一或多種因子，該因子作用於T細胞上來促進IL-17產生。在繪圖(profile)可能負責促進IL-17活性的候選分子的表達時，用實時RT-PCR觀察到在活化的樹突細胞中，IL-23組分p19和p40的mRNA表達增加了100-1000倍(B.Oppmann等，Immunty13，715(2000))(未示)，從而檢查了IL-23的效果。通過在人胚胎腎細胞(293個細胞)中共表達羧基末端的His-標籤的pl9和FLAG-標記的p40來產生鼠IL-23組分，並用鎳親合樹脂來純化分泌的蛋白。低於0.2EU/Pg的內毒素水平不可檢測。在存在IL-2(100U/ml)和ConA(2.5iig/ml)時，在Thl誘導條件下(IL-12+抗IL-4)、Th2誘導條件下(IL-4+抗IFN-y)，或與純化的IL-23(100ng/ml)溫育脾細胞培養物3-4天，之後洗滌所述培養物並用ConA再刺激另外24小時。用ELISA測量多種細胞因子的水平。低於ELISA試劑盒標準曲線範圍的最低稀釋度水平被記錄為『不可檢測的(N.D.)』。如下結果代表三個獨立進行的試驗。在IL-12-刺激的Thl誘導條件下培養脾細胞導致勉強在檢測限以上的(marginal)IL-17生成，而在Th2誘導條件下IL-17的產生不超過對照。結果見下表1所不。表1tableseeoriginaldocumentpage19tableseeoriginaldocumentpage20培養物中存在的IL-23以劑量依賴方式導致高水平IL-17產生的(圖2)。IL-23也使GM-CSF水平高於在Thl誘導條件下觀察到的水平。相反，IFN-y水平顯著低於在Thl誘導條件得到的水平。TNF-a水平與Thl條件類似。單獨的IL-12p40不會使IL-17產生(數據未示)。IL-23促進IL-17mRNA水平升高(圖2B)。暴露於IL-23六小時以內，IL-17mRNA的水平增加數百倍，並在IL-23持續存在時保持升高。存在抗IL-17的抗體不抑制此效果，這提示IL-17自身對此過程(process)沒有幫助(未示)。另外，近來鑑定的IL-17家族成員IL-17F的mRNA，也被發現應答於IL-23而上調(圖2C)。已經報導IL-23促進記憶的但非原初T細胞的增殖(D.M.Frucht,如上述)。因此，檢查了相對於IL-23對記憶T細胞群的影響而言，IL-23對原初T細胞群IL-17產生的影響。通過螢光活化細胞分選法(FACS)從脾細胞分離純化的CD4+T細胞。選擇記憶細胞群為CD4+CD44髙(R.C.Budd等，JImmunol138，3120(1987)，或CD4+CD62低(T.M.Jung，ff.M.Gallatin,I.L.ffeissman,M.0.Dailey,JImmunol141，4110(1988))，並選擇原初細胞群為⑶4+⑶44或⑶4+⑶62LS。如圖3所見，IL-23隻在記憶細胞群(⑶44s和⑶62L)而不在原初細胞(⑶44或⑶62LS)中刺激IL-17的產生。存在中和型IL-12抗體時，IL-23介導的IL-17產生被完全阻斷，該中和抗體與和IL-23共享的p40亞基相互作用(圖4A，左組)。因為存在無關抗體時IL-17的產生無變化，所以此效果不是由於Fc受體連接到抗原遞呈細胞上。此抗體也抑制應答與來自LPS刺激的樹突細胞的條件培養基時觀察到的IL-17產生誘導的>50%(圖4A，右圖)。缺乏IL-12p40組分的小鼠(品系:B6.129Sl-IL12btmlJm)與野生型小鼠或缺乏IL-12p35組分的小鼠(品系:B6.129Sl-IL12a)相比，前者脾細胞培養物應ConA刺激可見IL-17的產生明顯下降但不是完全缺無(abrogation)(圖4B)。為了檢測IL-12在IL-17產生中的作用，將增加量的(0.001-lnM)鼠IL-12加入包含IL-23(lnM)的培養物。如圖5A所見，IL-12以劑量依賴方式降低IL-17的水平。另外，用純化的IL-23處理脾細胞，該脾細胞來自缺乏IL-12受體3鏈2(IL-12R32)的小鼠(Wu等，JImmunol165，6221(2000))，所述IL-12受體3鏈2為IL-12的特異性受體組分(A.0.Chua,V.L.Wilkinson,D.H.Presky,U.Gublcr,JImmunol155，4286(1995))。IL-12R32+小鼠的脾細胞應IL-23刺激，IL-17產生增多超過了未經刺激的對照(圖5B)，但是該刺激並不影響IFN-y水平。令人驚異的是，這些小鼠的IL-17背景水平與野生型小鼠相比超過10倍，這表明IL-12可能負向(negative)調節IL-23誘導的IL-17產生。然而，與IL-12R02敲除小鼠相反，我們未在IL-12p35敲除小鼠的脾培養物觀察到IL-17增加。此不同的原因未知，但可能與p35缺無時IL-12p40的功能改變、或遺傳背景或病原體暴露不同有關。碰總而言之，這些數據提示了IL-23在促進獨特T細胞活化狀態中的作用，所述T細胞表達IL-17作為效應(effector)細胞因子。已描述Thl和Th2作為促進細胞介導的免疫反應相對於體液的免疫反應的示例。這些反應分別提供了針對細胞內和細胞外病原體的重要防禦，並且這些反應任一中的缺陷都與對具體病原體的易感性增加有關。相反，IL-23可用來促進對病原體的獲得性免疫反應，該病原體的特徵為嚴重地依賴被認為主要用作先天免疫反應介質(mediator)的細胞。作為此反應的主要效應細胞因子，IL-17能夠通過誘導趨化因子產生來促進單核細胞和中性粒細胞更迅速地募集(recruitment)。另外，對IL-23的反應中觀察到高水平的GM-CSF產生，這可證明有另外的髓樣細胞(myeloidcell)產生。由局部IL-17刺激的基質細胞(stromalcell)的G-CSF產生會使其進一步增加。然而，此獲得性反應的特徵並非僅依賴於髓樣譜系(lineage)反應的吞噬細胞，因為已知IL-17促進IL-17誘導ICAM，從而為進一步的T細胞反應提供重要的共刺激。近來數項研究指出了p35缺陷的小鼠和p40缺陷的小鼠之間的顯著差別(Decken等，InfectImmun.664994-5000(2002)；Cooper等，JImmunol.1681322-1327(2002)；Elkins等，Infection&Immunity701936-1948；Holscher等，J.Immunol.1676957-6966(2001))。這些研究都發現，通常在多種生物體模型(modelorganism)的免疫介導的清除(clearance)中缺失p40比缺失p35更有害。IL-17的表達與數項嚴重炎性疾病相關提示IL-23的拮抗劑可以是治療這些疾病的有希望的候選藥物。實施例2白介素-23(IL_23)缺陷的小鼠為進一步研究IL-23與IL-17的體內關係，比較IL-23缺陷的小鼠和IL-17缺陷的動物的表型。實驗步驟小鼠在無特殊病原體(specificpathogenfree)條件飼養(house)所有小鼠。從theJacksonlaboratory(BarHarbor,MA)獲得IL-12p40+小鼠，並從CharlesRiverlaboratories(SanDiego,CA)獲得C57BL/6小鼠。試劑除非另外指出，從如下供應商購買試劑從BDPharmingen(SanDicgo,CA)獲得抗體和ELISA試劑，從R&Dsystems(Minneapolis,MN)獲得細胞因子，從BiosearchTechnologies(Novato，CA)獲得TNP-偶聯的抗原，從Invitrogen(Carlsbad，CA)獲得組織培養試劑。IL23pl9缺陷的小鼠的產生。用GenomeSystems(IncyteGenomics,PaloAlto,CA)自基因組BAC文庫的克隆198a3分離包含鼠IL23pl9基因座的基因組DNA。用標準分子克隆技術，從如下DNA片段構建靶載體，該載體被設計為用EGFP報導基因來取代整個IL23pl9編碼區胸苷激酶選擇盒；由分別在遠端和近端的內源性SacII和BglII位點限定的5403鹼基對的5'同源性臂；用BamHI(5'末端)和Afllll(3'末端)從pEGFP-1切割的EGFP表達盒(BDClontech,PaloAlto,CA)；PGK-neo抗性盒；和由在近端的內源性Xhol位點和在遠端的引物5'-GCTTGGTGGCCCACCTATGAT-3『(SEQIDN0:1)限定的1203個bp的短臂(圖6A)。將此構建體電穿孔到129/SvEv胚胎幹(ES)細胞(Huang等，Science2591742(1993)),用G418和Gancyclovir選擇後在600個克隆中的9個出現同源重組。為確認正確靶向所述基因座，用southern印跡分析ES細胞和動物的基因組DNA。用BamHI消化之後，使膜與探針1(用寡聚物(oligo)5『-AGACCCTCAAAGTTCATGAC-321『(有義)(SEQIDNO2)禾口5'-CTGACGGCGCTTTCTCTACC-3『(反義)(SEQIDNO3)通過PCR獲得的831bp的基因組DNA片段)雜交，產生了對於野生型等位基因7027bp的片段和對於正確靶向的突變等位基因11788bp的片段。類似地，用EcoRI消化基因組DNA之後，膜與探針2(用寡聚物5『-TTTTGCCAGTGGGATACACC-3『(有義)(SEQIDNO4)和5'-AACTGCTGGGGCTGTTACAC-3『(反義)(SEQIDNO5)通過PCR獲得的390bp的基因組DNA片段)雜交，野生型等位基因產生了9197bp的片段，正確靶向的突變等位基因產生了6211bp的片段。將兩個ES細胞克隆(lc5和3h6)注射到胚泡(blastocyst)，並獲得在其種系中傳遞了突變等位基因的嵌合動物。對於常規基因分型(genotyping)，我們所用的基於PCR的方法使用了常用反義引物(5'-GCCTGGGCTCACTTTTTCTG-3『)(SEQIDNO:6)，和對野生型特異的有義引物(5'-GCGTGMGGGCAAGGACACC-3『)(SEQIDNO:7)以及敲除-特異性有義引物(5'-AGGGGGAGGATTGGGAAGAC-3『(SEQIDNO:8))。此引物三聯體(triplet)對於野生型等位基因擴增了210bp的片段，並對於突變等位基因擴增了289bp的片段。在Robocycler(Stratagene,LaJolla，CA)進行PCR，其條件如下1個循環，94°C，60〃；35個循環，94°C，30"，58°C，30"，72°C，60"；1個循環，72°C，7〃。血細胞亞型(subset)FACS分析從6_8周齡小鼠分離脾，胸腺和淋巴結，並用標準方法製備單個細胞懸液。通過心臟穿刺取外周血並用EDTA處理來避免凝固，用ACK裂解緩衝液(lysingbuffer)(Biosource,Camarillo,CA)裂解紅細胞。所有細胞在冰上在補充了2%的熱滅活的胎牛血清的Hanks平衡的鹽溶液(HBSS)中溫育30分鐘。然後用偶聯了藻紅蛋白，生物素或Cychrome的各種抗體以1Pg/百萬細胞在相同的緩衝液中對細胞進行染色。使用生物素化的抗體時，用偶聯了鏈黴抗生物素蛋白(str印tavidin)的PE-TR偶聯物(Caltag，Burlingame，CA)來檢測。用相同的緩衝液洗滌兩次後，用Epics-XL流式細胞儀(flowcytometry)系統(BeckmanCoulterInc.,Fullerton,CA)檢測螢光。刺激同種異型(allotypic)!1細胞從6-8周齡balb/c小鼠的脾用兩步分離法分離CD4和CD62L雙陽性T細胞。首先，用陰性磁選擇(magneticselection)(Miltenyi,Auburn,CA)除盡(d印lete)其它細胞類型的T細胞。然後用抗⑶4和⑶62L的抗體標記這些細胞並在MoFlo分選儀(sorter)(DakoCytomation,FortCollins,CO)上用FACS分選。用兩步分離法分離均在C57BL/6背景中的野生型或IL-29pl9+小鼠的樹突細胞。用磁分離(magneticseparation)(Miltenyi,Auburn,CA)陽性選擇CDllc陽性脾細胞後，用抗⑶11c，II類MHC，和⑶8的抗體標記所述細胞。然後用FACS，再用MoFlo分選儀分選⑶11C+/MHC-II7⑶8_細胞。所有實驗中使用的群是純度至少98%。為誘發同種異型刺激(allostimulatory)反應，在補充了青黴素-鏈黴素和10%熱滅活胎牛血清(clone，Logan，UT)的總共200u1IMDM中一式雙份溫育了104個樹突細胞和105個T細胞。有些情況下，加入lOOng/ml的細菌脂肽來刺激樹突細胞產生細胞因子。溫育5天後，取出120yl的上清來通過ELISA測量細胞因子，並置換為含有每孔lyCi3H-胸苷的新鮮培養基。16小時後用TopCount液體爍計數器(liquidscintillationcounter)(PackardInstruments,Meriden,CT)根據生產商的說明書確定胸苷摻入。體內T細胞分化將75ug的匙孔血藍蛋白(keyholelimpethemocyanin)(KLH)(Sigma,St.Louis,M0)諸如每組的四隻雄和四隻雌的小鼠左後足墊用於免疫，其中所述匙孔血藍蛋白在30ii1CFA(BDBiosciences,SanDiego，CA)和PBS11乳狀液中。5天後22收穫引流的(Draining)腹股溝(inguinal)和胭窩(popliteal)淋巴結並在補充了青黴素-鏈黴素，10%的熱滅活胎牛血清(Hyclone，Logan,UT)，和25ug/mlKLH的IMDM中再刺激。就增殖試驗而言，一式三份接種200ill的5X105個細胞到96孔板，使其增殖112小時，並在溫育階段的最後18小時每孔加入lyCi3H-胸苷。用TopCount液體閃爍計數器(PackardInstruments,Meriden，CT)根據生產商的說明書確定胸苷摻入。就細胞因子分泌而言，在48孔板中溫育2.5X106個細胞1ml，並在72小時後收穫上清。通過ELISA測定細胞因子分泌。所示數據是三個完整試驗的一個代表。遲髮型超敏反應在每組6隻小鼠的腹部三個位置經皮下注射200yg甲基化的牛血清白蛋白(mBSA)(Sigma,St.Louis，M0)，所述血清白蛋白混合在總量為200yl的CFA(BDBiosciences,SanDiego，CA)和PBS的11乳狀液中。在免疫後第8天，通過注射20yl5mg/mlPBS中的mBSA到一個後(rear)足墊來攻擊所述小鼠，而給予另一後足墊20ylPBS。在攻擊後18，42，66小時用一系列裝了7根彈簧(7spring-loaded)的卡尺(caliper)(Mitutoyo,CityofIndustry,CA)測量足墊腫脹。通過注射了抗原和PBS的足墊之間的足墊厚度差別確定DTH反應的強弱(magnitude)。T依賴性體液反應和免疫球蛋白分析為測量總免疫球蛋白水平，從8隻雄的和8隻雌的6-9周齡、各個基因型的未經免疫的小鼠獲得血清。用Luminex珠試驗(Upstate，LakePlacid，NY)測量總免疫球蛋白同種型的水平。為估計0VA特異性體液免疫反應，在第0日(day0)用CFA中的0VA免疫每種基因型的7隻小鼠(4隻雄的和3隻雌的)，並在第21和42天用不完全福氏佐劑(IFA)(Sigma,St.Louis,M0)中的相同抗原對其加強免疫。為作血清分析，在免疫前和免疫後第14，28和49天通過眶後放血(retro-orbitalbleeding)取血。以OVA作為俘獲製劑(captureagent)和檢測用的同種型特異性第二抗體，通過ELISA檢測0VA特異性免疫球蛋白同種型。為了在ELISA的線性範圍內，如下稀釋血清樣本對於IgGl為13125000，對於IgG2a為125000，對於IgG2b為1625000，並且對於IgG3，IgM，IgA和IgE為11000。因為純化的OVA特異性同種型不可購，用得自以前實驗的0VA-免疫小鼠的連續稀釋的血清作為標準品。結果用任意單位(arbitraryunit)表示，其中最後放血(lastbleed)的野生型組的均值被設為100。為評估記憶T細胞對於體液反應的作用，在第0日用CFA中的0VA免疫任一基因型的5-6隻小鼠的組，並在第21天用IFA中的TNPn-0VA對其加強免疫。為作血清分析，在免疫前和免疫後第14和28天通過眶後放血來取血。通過ELISA，用TNP28-BSA作為俘獲製劑和檢測用的同種型特異性第二抗體來檢測TNP特異性免疫球蛋白同種型。對於TNP-特異性IgGl，使用可購標準品。對於TNP-特異性IgG2a，使用從以前實驗中的TNP免疫小鼠獲得的連續稀釋的血清，並如上述計算結果。樣本稀釋度對於IgGl為131250並且對於IgG2a為11250。T非依賴性體液反應用PBS中的50iigTNPfLPS或100ugTNP20-AECM-Ficoll經腹膜內免疫每個基因型的6隻小鼠的組。10天後收穫血清，並通過ELISA，用TNP28-BSA作為俘獲製劑和檢測用的IgM特異性第二抗體來分析TNP-特異性IgM。用TNP特異性IgM抗體作為ELISA的標準品樣本稀釋度對於Ficoll為11280，對於LPS為15120。MM缺失IL-23pl9基因。為確定IL-23的非豐餘(non-redundant)體內效應，產生了IL-23缺失但能夠產生IL-12的小鼠。構建靶向載體，其中4個外顯子組成的pl9完整編碼23區被增強的GFP(eGFP)報導基因和新黴素抗性盒取代(圖6)。在兩個正確靶向的ES細胞克隆lc5和3h6得到種系傳遞，並用每個染色體3個標記物高速同類系法(speedcongenics)以將突變回交(backcross)到C57BL/6背景中。基於此分析，只選擇來自129背景的遺傳汙染對於實驗而言少於5%的實驗的小鼠。eGFP表達的模式與內源性pl9mRNA(數據未示)可比。IL-23pi小鼠無明顯表型。如IL-23/IL-12雙缺陷的IL-12p40+小鼠的表型那樣，IL-23pl9+動物不表現任何明顯表型，其出生符合孟德爾頻率(mendelianfrequencies)。經組織病理檢查未發現器官異常，並且進一步分析臨床化學和血液參數發現野生型和敲除動物之間無差異。另外，IL-23pl9+小鼠的大小和體重正常，並且兩性都是完全可育的。通過流式細胞術分析胸腺細胞，脾細胞和外周血白細胞的多種細胞表面標記物表明，野生型和IL23pl9+動物之間無任何顯著不同(表2)。因為已知IL-23作用於記憶T細胞，我們測定了每個亞型的記憶細胞(⑶44s⑶62L_)與原初(⑶62L+)細胞的比率，但野生型和IL-23pl9+小鼠之間未發現不同。在整個分析中，兩個基因型之間唯一可見的不同在於樹突細胞亞群略偏向CD8+表型。在此效應不明顯(minor)時，由於數據的緊密性(tightness)它具有統計學顯著意義，這與近來觀察到的IL-23對抗原遞呈細胞有作用是一致的。總而言之，正常發育沒有顯示需要IL-23，並且引入eGFP盒不會對任何所檢驗的細胞類型有毒性作用表2胸腺野生型敲除P(diff.)CD4+5.7+/丨-0.55.5+/-0.00.504CD8+3.3+/丨-0.13.1+/-0.30.397DN25.0+/丨-4.217.0+/-8.00.202DP65.9+/丨-3.774.3+/-8.00.174脾野生型敲除P(diff.)CD4+24.3+/丨-0.822.5+/_2.70.342%naive69.0+/-1367.5210090%memory29.1+/-1231.0190029CD8+15.2+/[1.212.3+/_2.00.101%naive64.1+/-5467.0280199%memory18.1+/-1818.3140084I-A(b)+/CDllc+2.0+/%CD8+12.8+/-0916.3」-170000%CDS-87.2+/-0983.6180000CD19+52.4+/[2.055.2+/-6.50.512B220+52.0+/2.055.5+/-5.30.360NK1.1+3.2+/丨-0.12.8+/-0.10.055外周血野生型敲除P(diff.)CD3+47.9+/2.644.9+/_3.60.053CD4+28.2+/[2.326.9+/-2.50.27024CD8+16.5—-/-0.815.6—-/-1.70.150CD19+43.2—-/-3.245.2—-/-3.60.215B220+44.9—-/-3.546.4—-/-4.80.466DX5+9.9—-/-3.09.7—-/-5.00.929CD16+8.0—-/-0.98.6—-/-1.50.302I-A(b)+44.0—-/-1.945.4—-/-4.90.428IL-23pl9+小鼠的體液免疫反應。為確定IL-23在產生體液免疫反應中的作用，首先測量任何基因型的16隻小鼠血清中的所有免疫球蛋白同種型總水平。野生型和IL-23P19+小鼠之間沒有顯著的統計學意義上的不同(圖7)，這表明IL-23不是保持正常的免疫球蛋白水平必需的。另外，我們確定了IL-23是否參與產生針對在佐劑中遞送的蛋白抗原的T依賴性體液反應。至此為止，用卵清蛋白(OVA)免疫每組7隻小鼠，，並在兩次連續免疫的每一次之後(圖8)估計前血清(preserum)中OVA-特異性免疫球蛋白同種型(都為陰性，數據未示)。初次免疫後，所有組的OVA特異性IgGl，IgG2b，IgG3，和IgE都無顯著不同。然而，初次免疫後觀察到IL-23pl9+和IL-12p40+動物的OVA特異性IgG2a和IgA水平顯著下降。如預期那樣，再次免疫後所有同種型的水平都急劇升高。此時，IL-23pl9+和IL-12p40+小鼠顯示所有被檢測的同種型明顯下降。這兩個基因型之間的不同通常並不顯著，這表明內源性IL-12在IL-23缺無的體液反應中不起主要作用。因為體液免疫反應依賴於B和T細胞的適當功能，隨後我們意圖確定是什麼機制使IL-23起刺激作用。為確定B細胞功能是否直接受IL-23缺無的影響，我們測定了IL-23缺陷的小鼠啟動(mount)抗T非依賴性(TI)抗原的B細胞反應的能力。TI-1抗原三硝基苯基-(TNP-)LPS導致經由CD14和TLR4激活B細胞，而TI-2抗原TNP-Ficoll通過表面B細胞受體簇(clustering)激活B細胞。IL_23pl9+小鼠啟動了對兩種抗原的正常B細胞反應(圖9)，表明IL-23在T非依賴性B細胞反應中不起作用。另外，IL-23小鼠的B細胞應LPS，抗IgM，和抗⑶40在體外正常增殖，並且應IL-4經歷正常同種型轉換(switching)(未示)。IL-23刺激B細胞不使增殖或同種型轉換增加(未示)，因此我們得出結論IL-23不直接影響B細胞功能。因為體液免疫反應主要在再次免疫階段被削弱(compromise)，並因為B細胞功能在IL-23pl9+小鼠表現正常，我們假設可能由於抗原特異性輔助性T細胞的低效(inefficient)再活化而造成此表型。為更直接說明這個問題，我們在第0天用0VA免疫了數個5-6隻小鼠的組，之後用TNP偶聯的0VA在第14天再次免疫。用此免疫方案(regimen)，經由再次免疫再次活化對0VA特異的記憶T細胞，但在第二個時間點只有新的一組對TNP有特異性的B細胞被活化。因此，所述0VA特異性記憶B細胞亞型不對TNP-特異性免疫球蛋白的形成起作用。增強(booster)後7天，我們測定了血清中的TNP特異性IgGl和IgG2a,並且發現兩種同種型都在IL-23pl9+小鼠顯著降低(圖10A，B)。此結果進一步說明了IL-23在T依賴性B細胞反應中的重要性。IL-23pl9+小鼠中的遲髮型超敏(DTH)反應。為進一步調查記憶⑶4+細胞在IL-23pl9+小鼠的作用，評估這些動物啟動DTH反應的能力。DTH反應為強T細胞依賴性，過去報導它在IL-12p40+小鼠是缺陷的(defective)，但在缺無IL-12p35的小鼠中呈正常，這提示它們可能被IL-23介導。針對此問題，我們用完全福氏佐劑(CFA)中的甲基化BSA(mBSA)使野生型，IL-23pl9+，和IL-12p40"_組(每組6隻)的動物致敏，並在7天後通過注射mBSA到足墊來誘發DTH反應。為作非特異性腫脹的對照，我們也攻擊了一組未致敏化的野生型小鼠。攻擊後18，42，和66小時測量特異性足墊腫脹，發現與野生型小鼠相比，特異性足墊腫脹可在IL_12p40+和IL-23pl9+小鼠以類似程度被抑制(圖11)。動力學也是類似的，在IL-12p40+和IL-23pi小鼠都顯示在42和66而不是18小時的時間點有力地減輕腫脹。因此，IL-23是DTH反應的主要介質，並且IL-23缺陷導致記憶⑶4+T細胞反應低效。IL-23pl9"_樹突細胞刺激T細胞的能力。為排除在IL_23pl9+小鼠觀察到的缺陷是由於IL-23缺陷抗原遞呈細胞的低效T細胞引發造成的可能性，我們又觀察了IL-23P19+DC刺激分離自balb/c小鼠脾的同種型原初⑶4+T細胞的能力。缺無DC時，這些T細胞既不增殖也不分泌可觀察量的細胞因子(圖12A)。加入任一種基因型的DC使得兩種基因型強(robust)增殖並產生IL-2。我們已經顯示IL-23是IL-17的有效(potent)誘導物，之後我們又用細菌脂肽誘導DC產生IL-23，所述細菌脂肽是有效的Toll-樣受體-(TLR-)2激動劑和產生IL-23的誘導物。所以這種情況下，wtDC有力地誘導T細胞產生IL-17(圖12A，底組)，而用IL-23P19+DC刺激的T細胞產生明顯更少的IL-17。為在更生理化的設置(morephysiologicalsetting)中確認這些觀察數據，我們又用完全福氏佐劑(CFA)中的匙孔血藍蛋白(KLH)免疫數個8隻小鼠的組來誘發體內T細胞反應。5天後收穫引流的淋巴結細胞(LNC)並用KLH在體外再刺激。我們又觀察到從IL-23pl9+小鼠收穫的LNC產生明顯更少的IL-17(圖12B，底組)。兩個基因型中的LNC增殖是可比的(圖12B，頂組)，這表明wt和IL-23pl9+小鼠啟動了針對所述抗原的強T細胞反應。因此，IL-23缺陷不嚴重(grossly)損害樹突細胞的刺激能力，但使T細胞產生IL-17減少。碰用IL-23pl9缺陷的小鼠評估IL-23的並不豐富體內功能，發現IL-23缺陷使T細胞依賴性免疫反應，如體液免疫反應和DTH反應減弱。在IL-23pl9+小鼠觀察到顯著降低的體液免疫反應，它影響到所有的免疫球蛋白同種型。同樣(inparallel),IL-12p40+小鼠的反應被抑制到類似或稍高水平。我們的結果支持如下結論即有效的體液反應絕對需要IL-23，而仍需要通過使用IL-12p35+小鼠來確定是否IL-23對於IL-12缺無時的正常體液反應是足夠的。總而言之，IL23pl9+小鼠的體內T細胞反應減弱，其明顯表現為DTH和體液免疫反應減弱，並且在表型上類似IL-17缺陷的小鼠。我們的結果表明，臨床給藥IL-23或其激動劑可能有益於在免疫方案和免疫受損的病人中支持T細胞。雖然已經參考被認為是具體的實施方案描述了本發明，仍應理解本發明不限於所述實施方案。相反，本發明應包括在所附權利要求的精神和範圍內的多種修改和等同替代。2權利要求白介素-23(IL-23)拮抗劑，供在用於抑制T細胞產生白介素-17(IL-17)的體外處理方法中使用。2.白介素-23(IL-23)拮抗劑在製備用於抑制T細胞產生白介素-17(IL-17)的藥物中的用途。3.權利要求1的拮抗劑或權利要求2的用途，其中所述抑制在哺乳動物受試者中進行。4.權利要求3的拮抗劑或用途，其中所述哺乳動物受試者是人。5.抑制T細胞產生白介素-17(IL-17)的方法，該方法包括在體外用白介素-23(IL-23)拮抗劑處理所述T細胞。6.權利要求1的拮抗劑、權利要求2的用途或權利要求5的方法，其中所述T細胞是經活化的T細胞。7.權利要求1的拮抗劑、權利要求2的用途或權利要求5的方法，其中所述T細胞是記憶細胞。8.前述權利要求任一項的拮抗劑、用途或方法，其中所述拮抗劑是抗IL-23抗體或抗IL-23受體抗體。9.權利要求8的拮抗劑、用途或方法，其中所述抗體是抗體片段。10.權利要求8的拮抗劑、用途或方法，其中所述抗體是全長抗體。全文摘要本發明涉及IL-17產生的抑制。本發明涉及用白介素-23(IL-23)的拮抗劑來抑制T細胞產生促炎細胞因子白介素-17(IL-17)。本發明還涉及IL-23的拮抗劑在治療炎性疾病中的用途，所述疾病的特徵是存在升高水平的IL-17。IL-23的拮抗劑包括但不限於，特異性結合亞基或IL-17或IL-17受體的抗體。本發明另外涉及通過使用IL-23的激動劑來誘導IL-7的產生。文檔編號C07K16/24GK101824088SQ20101014393公開日2010年9月8日申請日期2003年10月29日優先權日2002年10月30日發明者奧斯汀·L·格尼申請人:健泰科生物技術公司