一種重組類人膠原蛋白及其生產方法

2023-05-19 01:40:46 2

專利名稱：一種重組類人膠原蛋白及其生產方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及一種重組類人膠原蛋白及其生產方法。
背景技術：
膠原蛋白(collagen)是廣泛分布於人體結締組織的一組蛋白質家族，也是體內 含量最多的一種蛋白質，約佔蛋白質總量的25% 33%，其對維護細胞、組織、器官的正常 生理功能和損傷修復有重要作用。膠原蛋白作為天然的生物資源，具有合成高分子材料無 法比擬的生物相容性和生物可降解性，可廣泛應用在醫藥、化妝品等工業中，但是天然膠原 蛋白不能溶於水，而且從動物體內提取的膠原蛋白為各種分子量從大到小不等的膠原蛋白 肽的混合體，性質非常複雜，難於進行進一步的加工，限制了其作為生物材料在組織工程等 領域的應用。而且，動物源的膠原蛋白很難避免有病毒感染的嫌疑，同時應用到人類還會帶 來免疫排斥等副作用。為了獲得人源的膠原蛋白，有研究者採用人胎盤作為原料來進行提 取，但是這種方式不僅受原料供應的限制更要面臨倫理道德的指責。當前市場銷售的膠原蛋白類產品或取自豬皮、牛皮等大動物組織或取自魚類的皮 膚組織。由於動物組織提取物經常有病毒感染的隱患，此類產品僅能作為用於化妝品以及 保健品的原料使用，限制了其作為醫藥用品等高端產品方面的應用。生產膠原蛋白傳統的也是目前最主要的方法是利用酸、鹼法處理動物來源的組織 中提取膠原蛋白，另外還有酶解法提取膠原蛋白，這些方法具有較高的回收率，但是這些方 法製取的膠原蛋白水溶性差、難分離到純品，且在臨床上表現出排異反應，使其作為生物醫 學材料或藥物載體等方面的應用受到了很大限制。隨著現代生物技術的發展，利用轉基因技術和基因重組技術，可以在動物、植物和 微生物表達體系獲得重組人膠原蛋白，解決了傳統提取方法存在的病毒隱患等缺點，同時 也改善了膠原蛋白的親水性、免疫排異性等。國內外一些研究機構及生物公司相繼投入研 發研究重組膠原蛋白，如利用轉基因的方法，培育含類人膠原蛋白的小白鼠、通過轉基因微 量注射得到含重組類人膠原奶汁的哺乳動物，但通過哺乳類或昆蟲細胞株生產的成本極 高、生產周期長。我國西北大學的範代娣等採用PCR擴增得到數段人膠原蛋白基因片段，接 著進行拼接重複，轉化大腸桿菌，並通過高密度發酵培養生產類人膠原蛋白，獲得高表達的 重組類人膠原蛋白。2004年，東京農業科技大學的Yao J等對膠原蛋白細胞附著作用和自 身交聯螺旋相關序列作了研究，設計了長度為240個胺基酸的類人膠原蛋白，並在大腸杆 菌中得到了表達。但是細菌表達系統容易造成熱原殘餘，致使表達產物不純，難以應用於臨 床，而且目的蛋白通常以包涵體形式表達，產物純化過程複雜，另外原核表達系統的翻譯後 加工修飾體系不完善，表達產物的生物活性較低等缺點影響產品的品質。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在於針對上述現有技術的不足，提供一種表達量高， 水溶性好，其結構和性能都優於動物源膠原蛋白的重組類人膠原蛋白。
為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是一種重組類人膠原蛋白，其特徵 在於，其序列如下AGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPL GIAGITGARGLAGPPGMPGP60
RGSPGPQGVK GESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTA GEPGRDGNPGSDGLPGRDGS120
PGGKGDRGEN GSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGP180
QGPRGDKGET GERGMGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAEFGADGVAGPK240
GPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRP300
GPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGMGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPA360
GPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGER420
GVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDR480
GDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEP540
GPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGAR600
GSAGPPGATGFPGMGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGPAGRPGEVGPP660
GPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQ720
GPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPP780
GAPGAPGAPGPVGPAGKSGDRGETGPAGPAGPVGPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQGD839
所述重組類人膠原蛋白的結構為單鏈、單螺旋結構，其胺基酸為839個，其中
1-241為III型肽段，242-839為I型肽段。本發明還提供了一種生產該重組類人膠原蛋白的方法，其特徵在於，該方法包括 以下步驟(1)畢赤酵母基因工程菌的構建；(2)畢赤酵母基因工程菌的發酵培養；(3)重組類人膠原蛋白的誘導和表達；(4)重組類人膠原蛋白的純化。上述步驟(1)中所述畢赤酵母基因工程菌的構建如下a.將人體已知的I型和III型膠原蛋白基因螺旋區的一段基因分別抽提出來，然 後進行縫合，重組DNA;b.選用畢赤酵母SMD1168株作為宿主細胞，將重組DNA轉入並整合到宿主細胞的 基因組中，篩選得到畢赤酵母基因工程菌(巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris C13)；該畢 赤酵母基因工程菌已於2010年12月8日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心(保藏中心地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵 政編碼100101)，保藏編號為CGMCC No. 4437。上述步驟O)中所述畢赤酵母基因工程菌的發酵培養過程如下挑取畢赤酵母基 因工程菌單菌落，置於裝有30mL BMGY培養基的150mL三角瓶中，於 30°C，250rpm 300rpm培養至0D600為2. 0 6. 0，室溫下1500g 3000g離心5min，收集菌體，用BMMY培 養基重懸菌體，使重懸後的菌體0D600為1. 0 ；將重懸菌體所得的菌液置於500mL的三角瓶 中，用四層紗布封口，於 30°C、250rpm 300rpm的搖床上繼續培養；每Mh向培養 基中添加無水甲醇，無水甲醇的添加量為培養基總體積的1%。上述步驟(4)所述重組類人膠原蛋白的純化過程為培養的畢赤酵母基因工程菌經過離心分離後收集上清液，收集的上清液經層析柱SlOO除去顏色物質和腥味，再經脫鹽 柱G75去掉多餘的鹽分，脫鹽後超濾濃縮，收集蛋白冷凍乾燥。上述的一種重組類人膠原蛋白的生產方法，所述重組DNA的序列如下
GCGGGTAACACTGGTGCTCCTGGCAGCCCTGGAGTGTCTGGACCAAMGG TGATGCTGGC60
CMCCAGGAGAGMGGGATCGCCTGGTGCCCAGGGCCCACCAGGAGCTCC AGGCCCACTT120
GGGATTGCTGGGATCACTGGAGCACGGGGTCTTGCAGGACCACCAGGCAT GCCAGGTCCT180
AGGGGMGCCCTGGCCCTCAGGGTGTCMGGGTGAMGTGGGAAACCAGG AGCTAACGGT240
CTCAGTGGAGMCGTGGTCCCCCTGGACCCCAGGGTCTTCCTGGTCTGGCTGGTACAGCT300
GGTGAACCTGGAAGAGATGGAMCCCTGGATCAGATGGTCTTCCAGGCCGAGATGGATCT360
CCTGGTGGCAAGGGTGATCGTGGTGAAMTGGCTCTCCTGGTGCCCCTGGCGCTCCTGGT420
CATCCAGGCCCACCTGGTCCTGTCGGTCCAGCTGGAAAGAGTGGTGACAGAGGAGAAAGT480
GGCCCTGCTGGCCCTGCTGGTGCTCCCGGTCCTGCTGGTTCCCGAGGTGCTCCTGGTCCT540
CMGGCCCACGTGGTGACMAGGTGAAACAGGTGAACGTGGAGCTGCTGGCATCAMGGA600
CATCGAGGATTCCCTGGTMTCCAGGTGCCCCAGGTTCTCCAGGCCCTGCTGGTCAGCAG660
GGTGCMTCGGCAGTCCAGG ACCTGCAGAATTCGGCGCAGATGGTGTTGCTGGTCCCMG720
GGTCCCGCTGGTGAACGTGGTTCTCCTGGCCCTGCTGGCCCCAAAGGATCTCCTGGTGAA780
GCTGGTCGTCCCGGTGMGCTGGTCTGCCTGGTGCCAAGGGTCTGACTGGAAGCCCTGGC840
AGCCCTGGTCCTGATGGCMAACTGGCCCCCCTGGTCCCGCCGGTCMGATGGTCGCCCC900
GGACCCCCAGGCCCACCTGGTGCCCGTGGTCAGGCTGGTGTGATGGGATT CCCTGGACCT960
AMGGTGCTGCTGGAGAGCCCGGCAAGGCTGGAGAGCGAGGTGTTCCCGGACCCCCTGGC1020
GCTGTCGGTCCTGCTGGCMAGATGGAGAGGCTGGAGCTCAGGGACCCCCTGGCCCTGCT1080
GGTCCCGCTGGCGAGAGAGGTGAACMGGCCCTGCTGGCTCCCCCGGATTCCAGGGTCTC1140
CCTGGTCCTGCTGGTCCTCCAGGTGMGCAGGCAAACCTGGTGAACAGGGTGTTCCTGGA1200
GACCTTGGCGCCCCTGGCCCCTCTGGAGCAAGAGGCGAGAGAGGTTTCCCTGGCGAGCGT1260
GGTGTGCMGGTCCCCCTGGTCCTGCTGGTCCCCGAGGGGCCMCGGTGCTCCCGGCMC1320
GATGGTGCTAAGGGTGATGCTGGTGCCCCTGGAGCTCCCGGTAGCCAGGGCGCCCCTGGC1380
CTTCAGGGAATGCCTGGTGA ACGTGGTGCAGCTGGTCTTCCAGGGCCTMGGGTGACAGA1440
GGTGATGCTGGTCCCAMGGTGCTGATGGCTCTCCTGGCAMGATGGCGTCCGTGGTCTG1500
ACTGGCCCCATTGGTCCTCCTGGCCCTGCTGGTGCCCCTGGTGACAAGGGTGAMGTGGT1560
CCCAGCGGCCCTGCTGGTCCCACTGGAGCTCGTGGTGCCCCCGGAGACCGTGGTGAGCCT1620
GGTCCCCCCGGCCCTGCTGGCTTTGCTGGCCCCCCTGGTGCTGACGGCCA ACCTGGTGCT1680
AMGGCGMCCTGGTGATGCTGGTGCTAAAGGCGATGCTGGTCCCCCTGG CCCTGCCGGA1740
CCCGCTGGACCCCCTGGCCCCATTGGTMTGTTGGTGCTCCTGGAGCCM AGGTGCTCGC1800
GGCAGCGCTGGTCCCCCTGGTGCTACTGGTTTCCCTGGTGCTGCTGGCCG AGTCGGTCCT1860
CCTGGCCCCTCTGGAAATGCTGGACCCCCTGGCCCTCCTGGTCCTGCTGGCAAAGMGGC1920
GGCAAAGGTCCCCGTGGTGAGACTGGCCCTGCTGGACGTCCTGGTGMGTTGGTCCCCCT1980
GGTCCCCCTGGCCCTGCTGGCGAGAMGGATCCCCTGGTGCTGATGGTCCTGCTGGTGCT2040
CCTGGTACTCCCGGGCCTCAAGGTATTGCTGGACAGCGTGGTGTGGTCGGCCTGCCTGGT2100
CAGAGAGGAGAGAGAGGCTTCCCTGGTCTTCCTGGCCCCTCTGGTGMCCTGGCAMCAA2160
GGTCCCTCTG GAGCMGTGG TGAACGTGGT CCCCCTGGTC CCATGGGCCC CCCTGGATTG 2220GCTGGACCCC CTGGTGMTC TGGACGTGAG GGGGCTCCTG GTGCCGMGG TTCCCCTGGA 2280CGAGACGGTT CTCCTGGCGC CMGGGTGAC CGTGGTGAGA CCGGCCCCGC TGGACCCCCT 2340GGTGCTCCTG GTGCTCCTGG TGCCCCTGGC CCCGTTGGCC CTGCTGGCM GAGTGGTGAT 2400CGTGGTGAGA CTGGTCCTGC TGGTCCCGCC GGTCCTGTCG GCCCTGTTGG CGCCCGTGGC 2460CCCGCCGGAC CCCAAGGCCC CCGTGGTGAC MGGGTGAGA CAGGCGMCA GGGCGAC2517本發明與現有技術相比具有以下優點本發明採用畢赤酵母真核表達系統大規模 生產重組類人膠原蛋白，它與傳統的大腸桿菌表達體系相比具有以下優點1、本發明的表達載體利用醇氧化酶基因啟動子，細胞生長速度快，所以該表達系 統表達的外源蛋白產量很高，其表達量比其它系統高10倍甚至100倍，這在表達量方面是 一大突破，在發酵罐中的表達量可達到5. Og/L，單個批次50升罐可生產粗蛋白150g左右， 粗蛋白純度在80 %以上，雜蛋白很少。2、本發明的培養基採用無機鹽，配製簡單、價格低廉。3、本發明的表達載體不是以游離的質粒存在，而是整合在染色體上，構建的菌株 十分穩定。4、本發明的重組類人膠原蛋白具有良好的親水性及穩定性，其胺基酸組成與天然 膠原蛋白胺基酸序列相應部分100%相同，同天然膠原蛋白相比，具有相近的結構和生物活 性，無需變性和復性，應用於人體當中不會造成免疫排斥，可以廣泛應用於生物醫用材料、 化妝品等領域。下面結合附圖和實施例，對本發明技術方案做進一步的詳細說明。


圖1為本發明載體pPIC9K-C03al-C0lal構建的路線圖譜。圖2為本發明菌落PCR鑑定重組畢赤酵母的電泳圖。圖3為本發明pPIC9K-C03al-C0lal重組畢赤酵母誘導表達後的電泳圖。
具體實施例方式一種重組類人膠原蛋白，其序列(SEQ ID NO. 1)如下AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARGRGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA GEPGRDGNPGPGGKGDRGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP AGKSGDRGES GPAGPAGAPGQGPRGDKGET GERGMGIKG HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAEGPAGERGSPG PAGPKGSPGE AGRPGEAGLP GAKGLTGSPG SPGPDGKTGPGPPGPPGARG QAGVMGFPGP KGMGEPGKA GERGVPGPPG AVGPAGKDGEGPAGERGEQG PAGSPGFQGL PGPAGPPGEA GKPGEQGVPG DLGAPGPSGAGVQGPPGPAG PRGANGAPGN DGAKGDAGAP GAPGSQGAPG LQGMPGERGAGDAGPKGADG SPGKDGVRGL TGPIGPPGPA GAPGDKGESG PSGPAGPTGAGPPGPAGFAG PPGADGQPGA KGEPGDAGAK GDAGPPGPAG PAGPPGPIGNGSAGPPGATG FPGMGRVGP PGPSGNAGPP GPPGPAGKEG GKGPRGETGP
LAGPPGMPGP60SDGLPGRDGS120PAGSRGAPGP180FGADGVAGPK240PGPAGQDGRP300AGAQGPPGPA360RGERGFPGER420AGLPGPKGDR480RGAPGDRGEP540VGAPGAKGAR600AGRPGEVGPP660
GPPGPAGEKG SPGADGPAGA PGTPGPQGIA GQRGVVGLPG QRGERGFPGL PGPSGEPGKQ 720GPSGASGERG PPGPMGPPGL AGPPGESGRE GAPGAEGSPG RDGSPGAKGD RGETGPAGPP 780GAPGAPGAPG PVGPAGKSGD RGETGPAGPA GPVGPVGARG PAGPQGPRGD KGETGEQGD 839該重組類人膠原蛋白的結構為單鏈、單螺旋結構，其胺基酸為839個，其中1-241 為III型肽段，242-839為I型肽段。該重組類人膠原蛋白的生產方法包括以畢赤酵母SMD1168為出發菌株，進行畢赤酵母基因工程菌的構建；畢赤酵母基 因工程菌的發酵培養和誘導；重組類人膠原蛋白的提純，獲得目的蛋白。
0103]所涉及的培養基組成分別為0104]YPD培養基0105]酵母浸出粉10g/L胰蛋白腖20g/L0106]葡萄糖20g/L。0107]BMGY培養基0108]酵母浸出粉10g/L胰蛋白腖20g/L0109]ρΗ6· 0磷酸鉀緩衝 賺 1OOmmo1/LYNB13. 4g/L0110]Biotin0. 2mg/L甘油10mL/L。0111]BMMY培養基0112]酵母浸出粉lOg/L胰蛋白腖20g/L0113]ρΗ6· 0磷酸鉀緩衝 賺 IOOmmo1/LYNB 13.lg/L0114]Biotin0. 2mg/L甲醇 IOmL/ZL。0115]一、畢赤酵母基因工程菌的構建0116](一)、重組表達載體的構建0117]從新生兒胎盤組織中提取RNA，反轉錄獲得cDNA ；根據GenBank已發表的人膠原
蛋白I型和III型基因序列，按照引物設計原則，利用PrimerPremier 5. 0和DNAMAN軟體， 設計 col Ial 和 col3al 基因 PCR 擴增引物 Fl (SEQ ID NO. 3), Rl (SEQ ID NO. 4)，F2 (SEQ ID NO. 5)、R2 (SEQ IDNO. 6)，引物序列分別為Fl :5，-CTGGCGCAGA TGGTGTTG-3，；Rl 5，-CCACGGTGAC CCTTTATGC-3，。F2 :5』 -GAATCTGTGA ATCATGCCCT AC-3』 ；R2 :5， -GAAGTCATAA TCTCATCGGT GTT—3，。將I型和III型膠原蛋白基因螺旋區部分擴增出來並且在基因的兩頭用合適的 酶切位點做成接頭得到重組DNA，並縫合到畢赤酵母表達載體PPIC9K中獲得重組表達載體 pPIC9K-co3al-colal ；該重組 DNA 的序列(SEQID N0. 2)如下GCGGGTAACA CTGGTGCTCC TGGCAGCCCT GGAGTGTCTG GACCAAMGG TGATGCTGGC 60CMCCAGGAG AGMGGGATC GCCTGGTGCC CAGGGCCCAC CAGGAGCTCC AGGCCCACTT 120GGGATTGCTG GGATCACTGG AGCACGGGGT CTTGCAGGAC CACCAGGCAT GCCAGGTCCT 180AGGGGMGCC CTGGCCCTCA GGGTGTCMG GGTGAMGTG GGAAACCAGG AGCTAACGGT 240CTCAGTGGAG MCGTGGTCC CCCTGGACCC CAGGGTCTTC CTGGTCTGGC TGGTACAGCT 300GGTGAACCTG GAAGAGATGG AMCCCTGGA TCAGATGGTC TTCCAGGCCG AGATGGATCT 360
CCTGGTGGCAAGGGTGATCGTGGTGAAMTGGCTCTCCTGGTGCCCCTGGCGCTCCTGGT420
CATCCAGGCCCACCTGGTCCTGTCGGTCCAGCTGGAAAGAGTGGTGACAGAGGAGAAAGT480
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CTTCAGGGAATGCCTGGTGA ACGTGGTGCAGCTGGTCTTCCAGGGCCTMGGGTGACAGA1440
GGTGATGCTGGTCCCAMGGTGCTGATGGCTCTCCTGGCAMGATGGCGTCCGTGGTCTG1500
ACTGGCCCCATTGGTCCTCCTGGCCCTGCTGGTGCCCCTGGTGACAAGGGTGAMGTGGT1560
CCCAGCGGCCCTGCTGGTCCCACTGGAGCTCGTGGTGCCCCCGGAGACCGTGGTGAGCCT1620
GGTCCCCCCGGCCCTGCTGGCTTTGCTGGCCCCCCTGGTGCTGACGGCCA ACCTGGTGCT1680
AMGGCGMCCTGGTGATGCTGGTGCTAAAGGCGATGCTGGTCCCCCTGG CCCTGCCGGA1740
CCCGCTGGACCCCCTGGCCCCATTGGTMTGTTGGTGCTCCTGGAGCCM AGGTGCTCGC1800
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GGCAAAGGTCCCCGTGGTGAGACTGGCCCTGCTGGACGTCCTGGTGMGTTGGTCCCCCT1980
GGTCCCCCTGGCCCTGCTGGCGAGAMGGATCCCCTGGTGCTGATGGTCCTGCTGGTGCT2040
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CAGAGAGGAGAGAGAGGCTTCCCTGGTCTTCCTGGCCCCTCTGGTGMCCTGGCAMCAA2160
GGTCCCTCTGGAGCMGTGGTGAACGTGGTCCCCCTGGTCCCATGGGCCCCCCTGGATTG2220
GCTGGACCCCCTGGTGMTCTGGACGTGAGGGGGCTCCTGGTGCCGMGGTTCCCCTGGA2280
CGAGACGGTTCTCCTGGCGCCMGGGTGACCGTGGTGAGACCGGCCCCGCTGGACCCCCT2340
GGTGCTCCTGGTGCTCCTGGTGCCCCTGGCCCCGTTGGCCCTGCTGGCMGAGTGGTGAT2400
CGTGGTGAGACTGGTCCTGCTGGTCCCGCCGGTCCTGTCGGCCCTGTTGGCGCCCGTGGC2460
CCCGCCGGACCCCAAGGCCCCCGTGGTGACMGGGTGAGACAGGCGMCAGGGCGAC2517( 二)、大量製備重組質粒 pPIC9K-co3al_colal將載體菌株在含有卡那黴素抗性的培養基上培養20個小時左右、8000r/min離心 10分鐘，去掉上清，用質粒提取試劑盒提取質粒DNA。
(三)、pPIC9K-co3al_colal 質粒的線性化取限制性內切酶Sail 10 μ L，pPIC9K-co3al_colal 質粒 20 μ g 左右，加入 100 μ L buffer H，加水補足到1000 μ L後混勻，37°C水浴消化5h，終止反應前先取出5 μ L反應液， 以0. 7%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否酶切完全，酶切完全後，用質粒提取試劑盒對線性化質粒 進行質粒提取。提取完成時，線性化質粒的體積要在10 μ L以上，濃度為1. 0μ g/μ L以上。 用去離子水溶解，用於下一步的電轉化。(四)、轉畢赤酵母方法1.畢赤酵母感受態細胞的製備挑取畢赤酵母(SMD1168)單菌落，接種至含有5mL YPD培養基試管中，30°C， 250rpm 300rpm培養過夜；取50 μ L的培養物接種至含有50mL新鮮YPD培養基的300mL 三角瓶中，28°C 30°C，250rpm 300rpm培養過夜，至0D600值達到1. 1 1. 3 ；將細胞培 養物於4°C，1500g離心5min，用50mL的冰預冷的無菌水將菌體沉澱重懸；重複離心之後按 照相同方法用20mL的冰預冷的lmol/L山梨醇溶液將菌體沉澱重懸，離心，用0. 3mL的冰預 冷的lmol/L山梨醇溶液將菌體沉澱重懸，其終體積約為0. 5mL,分裝為80 μ L —份，-70°C 保存。2.畢赤酵母的電轉化將感受態細胞解凍並冰浴，將10 μ g左右的線性化DNA與80 μ L的畢赤酵母感受 態細胞混勻，轉至0. 2cm冰預冷的電轉化杯中，在電壓為1. 5kV，電容為25 μ F，電阻為200 Ω 條件下電擊4msec IOmsec ；電擊完畢後，加入ImL冰預冷的lmol/L山梨醇溶液將菌體混 勻形成菌懸液，轉至1. 5mL離心管中；將菌懸液塗布於MD平板上，每100 μ L 200 μ L塗布 一塊平板，然後置於30°C培養箱倒置培養。3.多拷貝插入重組子的篩選(1)在生長有轉化子的MD平板表面加入2mL滅菌雙蒸水，然後用無菌三角塗布器 在His+轉化子表面輕輕塗刮，並轉移到50mL離心管中；(2)向步驟(1)中所述離心管中加入20mL滅菌雙蒸水稀釋，混勻後測定0D600值 (10D600 = 5X 107cells/mL)；(3)取IO5個轉化子塗布於含有0. 5mg/mL G418的YPD平板上，倒置，30°C培養 72h 96h ；(4)在無菌96孔板中每孔加入200 μ L YPD液體培養基；(5)用接菌牙籤往步驟⑷中所述96孔板中分別接入步驟(3)中培養獲得的轉化 子，混勻，於30°C培養48h;(6)取一塊新的無菌96孔板，每孔加入190yL YPD液體培養基，然後在相應孔中 加入10 μ L步驟(5)中96孔板所得的培養物，於30°C培養24h ；(7)再取一塊新的無菌96孔板，每孔加入190yL YPD液體培養基，在相應孔中加 AlOyL步驟(6)中96孔板所得的培養物，於30°C培養24h ；(8)分別從步驟(7)中的96孔板中取出1 μ L培養液，點在含有1. Omg/mL和 4. 0mg/mL G418的YPD平板上，於30°C培養96h 120h，畢赤酵母SMD1168轉化子若能 在含越高濃度G418的培養基上生長，說明該轉化子含有越多拷貝的目的基因，即有多個 pPIC9K-co3al-colal片斷轉化進了畢赤酵母SMD1168並整合到畢赤酵母SMD1168的染色體上，經過這一步篩選得到的高拷貝的重組畢赤酵母將更有可能實現目的蛋白的高效表達。4.菌落PCR鑑定重組畢赤酵母挑取待測畢赤酵母轉化子，按下述方法進行PCR模板的預製(1)挑取高拷貝轉化子的單菌落，置於裝有200 μ L去離子水的1.5mL離心管中， 2000g離心5min，棄上清；(2)將裝有菌體的離心管置於微波爐中檔加熱aiiin，然後轉移到-80°C冰凍 5min ；(3)再置於微波爐中檔加熱aiiin後轉移到_80°C冰凍5min，最後再移至微波爐中 檔加熱2min ；(4)向步驟(3)中加熱後的離心管中加入30 μ L去離子水，於IOOOOg離心Imin, 吸取上清作為PCR反應的模板；(5)使用 9k-coll 鑑定引物 F(SEQ ID NO. 7)、R(SEQ ID NO. 8)，進行 PCR 擴增；其 中9k-coll鑑定引物序列為F 5' -GCTGAAGCTG TCATCGGTTA CTCA-3，；R 5，-TCGCTCTCCA GCCTTGCCG-3，。(6)PCR結束後，進行瓊脂糖電泳檢測，在1155bp左右出現條帶的，可以初步確定 為陽性轉化子。(五)、蛋白表達分析將從高抗性平板(含G418的YPD平板)上篩選到的並且經過驗證的陽性菌株按 照如下程序進行誘導表達實驗將陽性菌株接種於5mL YPD培養基，30°C培養12h，然後轉接入20mLBMGY培養基 中，30°C，250rpm培養12h，4000rpm離心IOmin後倒掉上清，用無菌水清洗菌體，4000rpm離 心lOmin，加入適量的BMMY培養基使菌液的0D600為1. 0，在30°C，250rpm條件下，甲醇誘 導120h(每隔24h添加培養基總體積的的甲醇)，按時間點分別取菌液樣品，取樣量為 1.011^，置於1. 5mL離心管中，常溫，12000rpm離心5min，收集上清，時間點一般取:12h,24h, 36h、48h、60h 和 72h。(六)、重組類人膠原蛋白N端測序將收集的上清純化後進行SDS-PAGE (聚丙烯醯胺凝膠電泳)分析，並以考馬斯亮 藍G-250染色得單一條帶，可見分子量在100KD，比理論分子量大，將重組蛋白轉至PVDF膜 上並剪下進行N端測序，對N端胺基酸進行測定的結果為A-G-N-T-G，與基因設計一致。(七)、重組類人膠原蛋白質譜分析將純化後的上清用AXIMA-CFR plUS基質輔助雷射解吸附電離飛行質譜儀測得 的類人膠原蛋白分子量為74019. 02，與計算分子量74213. 9相對誤差為-0.沈％，準確度 < 士0. 5%。(八)、DNA序列分析提取陽性菌株基因組，以此為模板，採用PCR方法擴增重組類人膠原蛋白基因，擴 增產物經過純化進行DNA測序分析，PCR方法擴增的重組DNA測定結果與基因設計一致，確 定該陽性菌株為畢赤酵母基因工程菌(巴斯德畢赤酵母Pichiapastoris C13，保藏編號為 CGMCC No. 4437)。
二、畢赤酵母基因工程菌的發酵培養和誘導挑取畢赤酵母基因工程菌單菌落，置於裝有30mL BMGY培養基的150mL三角瓶中， 於 28°C 30°C、250rpm 300rpm培養至 0D600 為 2 6 ；室溫下 1500g 3000g 離心 5min， 收集菌體，用BMMY培養基重懸菌體，使重懸後的菌體0D600為1. 0 ；將重懸菌體所得的菌液 置於500mL的三角瓶中，用四層紗布封口，於28°C 30°C，250rpm 300rpm的搖床上繼續 培養；每24h向培養基中添加無水甲醇至培養基中，無水甲醇的添加量為培養基總體積的 1% ；按時間點分別取菌液樣品，取樣量為l.OmL，置於1.5mL離心管中，常溫，12000rpm離 心5min，收集上清，分析目的蛋白的表達量和菌液最佳收穫時間，時間點一般取12h、24h、 36h、48h、60h和72h，待檢測樣品於-70 V保存備用。三、重組類人膠原蛋白的提純分離純化工藝將培養的畢赤酵母基因工程菌菌液經過離心分離後收集上清液，上清液經層析柱 SlOO除去顏色物質和腥味，再經脫鹽柱G75去掉多餘的鹽分，脫鹽後超濾濃縮，收集蛋白冷 凍乾燥。本發明從已知序列的人體膠原蛋白基因I型和III型的螺旋區中精選水溶性、穩 定性強的核苷酸序列，將這兩段基因插入畢赤酵母表達質粒中，轉化畢赤酵母篩選得到高 表達畢赤酵母基因工程菌，經過發酵罐大規模發酵分泌表達及一系列的純化步驟，得到高 純度的重組類人膠原蛋白。實驗證明該法生產的重組類人膠原蛋白具有良好的親水性及穩 定性，由於其結構與天然膠原蛋白基因序列相應部分100%相同，所以應用於人體當中不會 造成免疫排斥，可以廣泛應用於生物醫用材料、化妝品等領域。該發明獲得的類人膠原蛋白 表達量高，純化方便，在發酵罐中的表達量可達到5. Og/L,單個批次50升罐可生產粗蛋白 150g左右，由於表達量高，粗蛋白純度在80%以上，雜蛋白很少，只有畢赤酵母常見的副產 物以及腥味等需要去除，這樣給純化帶來很大的方便。本發明採用的是分泌型表達載體，成 功實現了重組類人膠原蛋白的分泌型表達，表達產物分泌在上清液中，方便純化，具有其他 重組類人膠原蛋白生產所不具備的優勢，便於規模化生產操作。由於載體電轉入畢赤酵母 之後，基因整合在畢赤酵母基因組上，所以重組菌的穩定性好，經過多次傳代基因不容易發 生流失並能保持高效表達的性狀，能夠很好的實現穩定生產，畢赤酵母生產方法為好氧發 酵，菌體密度高，表達量還有很大的提升空間。圖1是載體pPIC9K-C03al-C0lal的構建路線圖co3al表示III型膠原蛋白螺 旋區部分基因，colal表示I型膠原蛋白螺旋區部分基因，pPIC9k表示畢赤酵母表達載體。 co3al 和 pPIC9k 經雙酶切之後(Xho I 和 EcoR I 雙切)連接成 pPIC9k-co3al，pPIC9k_co3al 和colal用EcoRl單酶切之後連接成pPIC9k-co3al_colal，為最終表達載體。圖2是菌落PCR鑑定重組畢赤酵母的電泳圖經過G418不同濃度的反覆篩選，最 終在高濃度4. Omg/mL條件下篩選到9個高拷貝重組子，並對其進行菌落PCR鑑定，結果顯 示，9個重組子都能擴增出約1155bp左右的片段，說明重組子篩選結果正確。圖3是pPIC9K-C03al-C0lal重組畢赤酵母誘導表達後的電泳圖挑選高拷貝重組 子菌株搖瓶發酵，在甲醇誘導發酵後，分別在24h、36h、48h、60h和72h取樣，SDS-PAGE電泳 分析，顯示與預測的C03al-C0lal基因所表達的蛋白的表觀分子量為lOOKDa，比理論分子 量大，發酵至60h表達量已達到最高，而且條帶單一，基本無其它雜蛋白，便於後期的純化。
權利要求
1. 一種重組類人膠原蛋白，其特徵在於，其序列如下AGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARGLAGPPGMPGP60RGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGS120PGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGP180QGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAEFGADGVAGPK240GPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRP300GPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPA360GPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGER420GVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDR480GDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEP540GPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGAR600GSAGPPGATGFPGAAGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGPAGRPGEVGPP660GPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQ720GPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPP780GAPGAPGAPGPVGPAGKSGDRGETGPAGPAGPVGPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQGD839所述重組類人膠原蛋白的結構為單鏈、單螺旋結構 ，其胺基酸為839個，其中1-241 為III型肽段，242-839為I型肽段。
2.—種生產如權利要求1所述的重組類人膠原蛋白的方法，其特徵在於，該方法包括 以下步驟(1)畢赤酵母基因工程菌的構建；(2)畢赤酵母基因工程菌的發酵培養；(3)重組類人膠原蛋白的誘導和表達；(4)重組類人膠原蛋白的純化。
3.根據權利要求2所述的一種重組類人膠原蛋白的生產方法，其特徵在於，步驟(1)中 所述畢赤酵母基因工程菌的構建如下a.將人體已知的I型和III型膠原蛋白基因螺旋區的一段基因分別抽提出來，然後進 行縫合，重組DNA ；b.將重組DNA轉入並整合到畢赤酵母的基因組中，篩選得到畢赤酵母基因工程菌。
4.根據權利要求2所述的一種重組類人膠原蛋白的生產方法，其特徵在於，步驟(2)中 所述畢赤酵母基因工程菌的發酵培養過程如下挑取畢赤酵母基因工程菌單菌落，置於裝 有30mL BMGY培養基的150mL三角瓶中，於 30°C，250rpm 300rpm培養至0D600為 2. 0 6. 0，室溫下1500g 3000g離心5min，收集菌體，用BMMY培養基重懸菌體，使重懸後 的菌體0D600為1. 0 ；將重懸菌體所得的菌液置於500mL的三角瓶中，用四層紗布封口，於 30°C、250rpm 300rpm的搖床上繼續培養，每Mh向培養基中添加無水甲醇；所述 無水甲醇的添加量為培養基總體積的1%。
5.根據權利要求2所述的一種重組類人膠原蛋白的生產方法，其特徵在於，步驟(4)所 述重組類人膠原蛋白的純化過程為培養的畢赤酵母基因工程菌經過離心分離後收集上清 液，收集的上清液經層析柱SlOO除去顏色物質和腥味，再經脫鹽柱G75去掉多餘的鹽分，脫 鹽後超濾濃縮，收集蛋白冷凍乾燥。
6.根據權利要求3所述的一種重組鄉DNA的序列如下GCGGGTAACACTGGTGCTCCTGGCAGCCCTCAACCAGGAGAGAAGGGATCGCCTGGTGCCGGGATTGCTGGGATCACTGGAGCACGGGGTAGGGGAAGCCCTGGCCCTCAGGGTGTCAAGCTCAGTGGAGAACGTGGTCCCCCTGGACCCGGTGAACCTGGAAGAGATGGAAACCCTGGACCTGGTGGCAAGGGTGATCGTGGTGAAAATCATCCAGGCCCACCTGGTCCTGTCGGTCCAGGCCCTGCTGGCCCTGCTGGTGCTCCCGGTCAAGGCCCACGTGGTGACAAAGGTGAAACACATCGAGGATTCCCTGGTAATCCAGGTGCCGGTGCAATCGGCAGTCCAGGACCTGCAGAAGGTCCCGCTGGTGAACGTGGTTCTCCTGGCGCTGGTCGTCCCGGTGAAGCTGGTCTGCCTAGCCCTGGTCCTGATGGCAAAACTGGCCCCGGACCCCCAGGCCCACCTGGTGCCCGTGGTAAAGGTGCTGCTGGAGAGCCCGGCAAGGCTGCTGTCGGTCCTGCTGGCAAAGATGGAGAGGGTCCCGCTGGCGAGAGAGGTGAACAAGGCCCTGGTCCTGCTGGTCCTCCAGGTGAAGCAGACCTTGGCGCCCCTGGCCCCTCTGGAGCAGGTGTGCAAGGTCCCCCTGGTCCTGCTGGTGATGGTGCTAAGGGTGATGCTGGTGCCCCTCTTCAGGGAATGCCTGGTGAACGTGGTGCAGGTGATGCTGGTCCCAAAGGTGCTGATGGCACTGGCCCCATTGGTCCTCCTGGCCCTGCTCCCAGCGGCCCTGCTGGTCCCACTGGAGCTGGTCCCCCCGGCCCTGCTGGCTTTGCTGGCAAAGGCGAACCTGGTGATGCTGGTGCTAAACCCGCTGGACCCCCTGGCCCCATTGGTAATGGCAGCGCTGGTCCCCCTGGTGCTACTGGTCCTGGCCCCTCTGGAAATGCTGGACCCCCTGGCAAAGGTCCCCGTGGTGAGACTGGCCCTGGTCCCCCTGGCCCTGCTGGCGAGAAAGGACCTGGTACTCCCGGGCCTCAAGGTATTGCTCAGAGAGGAGAGAGAGGCTTCCCTGGTCTTGGTCCCTCTGGAGCAAGTGGTGAACGTGGT人膠原蛋白的生產方法，其特徵在於，所述重組GGAGTGTCTGGACCAAAAGGTGATGCTGGC60CAGGGCCCACCAGGAGCTCCAGGCCCACTT120CTTGCAGGACCACCAGGCATGCCAGGTCCT180GGTGAAAGTGGGAAACCAGGAGCTAACGGT240CAGGGTCTTCCTGGTCTGGCTGGTACAGCT300TCAGATGGTCTTCCAGGCCGAGATGGATCT360GGCTCTCCTGGTGCCCCTGGCGCTCCTGGT420GCTGGAAAGAGTGGTGACAGAGGAGAAAGT480CCTGCTGGTTCCCGAGGTGCTCCTGGTCCT540GGTGAACGTGGAGCTGCTGGCATCAAAGGA600CCAGGTTCTCCAGGCCCTGCTGGTCAGCAG660TTCGGCGCAGATGGTGTTGCTGGTCCCAAG720CCTGCTGGCCCCAAAGGATCTCCTGGTGAA780GGTGCCAAGGGTCTGACTGGAAGCCCTGGC840CCTGGTCCCGCCGGTCAAGATGGTCGCCCC900CAGGCTGGTGTGATGGGATTCCCTGGACCT960GGAGAGCGAGGTGTTCCCGGACCCCCTGGC1020GCTGGAGCTCAGGGACCCCCTGGCCCTGCT1080CCTGCTGGCTCCCCCGGATTCCAGGGTCTC1140GGCAAACCTGGTGAACAGGGTGTTCCTGGA1200AGAGGCGAGAGAGGTTTCCCTGGCGAGCGT1260CCCCGAGGGGCCAACGGTGCTCCCGGCAAC1320GGAGCTCCCGGTAGCCAGGGCGCCCCTGGC1380GCTGGTCTTCCAGGGCCTAAGGGTGACAGA1440TCTCCTGGCAAAGATGGCGTCCGTGGTCTG1500GGTGCCCCTGGTGACAAGGGTGAAAGTGGT1560CGTGGTGCCCCCGGAGACCGTGGTGAGCCT1620CCCCCTGGTGCTGACGGCCAACCTGGTGCT1680GGCGATGCTGGTCCCCCTGGCCCTGCCGGA1740GTTGGTGCTCCTGGAGCCAAAGGTGCTCGC1800TTCCCTGGTGCTGCTGGCCGAGTCGGTCCT1860GGCCCTCCTGGTCCTGCTGGCAAAGAAGGC1920GCTGGACGTCCTGGTGAAGTTGGTCCCCCT1980TCCCCTGGTGCTGATGGTCCTGCTGGTGCT2040GGACAGCGTGGTGTGGTCGGCCTGCCTGGT2100CCTGGCCCCTCTGGTGAACCTGGCAAACAA2160CCCCCTGGTCCCATGGGCCCCCCTGGATTG2220GCTGGACCCC CTGGTGAATC TGGACGTGAG GGGGCTCCTG GTGCCGAAGG CGAGACGGTT CTCCTGGCGC CAAGGGTGAC CGTGGTGAGA CCGGCCCCGC GGTGCTCCTG GTGCTCCTGG TGCCCCTGGC CCCGTTGGCC CTGCTGGCAA CGTGGTGAGA CTGGTCCTGC TGGTCCCGCC GGTCCTGTCG GCCCTGTTGG CCCGCCGGAC CCCAAGGCCC CCGTGGTGAC AAGGGTGAGA CAGGCGAACA TTCCCCTGGA2280TGGACCCCCT2340GAGTGGTGAT2400CGCCCGTGGC2460GGGCGAC251全文摘要
本發明公開了一種重組類人膠原蛋白，該類人膠原蛋白具有良好的親水性及穩定性，其結構與天然膠原蛋白基因序列相應部分100％相同，應用於人體當中不會造成免疫排斥，可以廣泛應用於生物醫用材料、化妝品等領域。本發明還公開了該重組類人膠原蛋白的生產方法，包括畢赤酵母基因工程菌的構建；畢赤酵母基因工程菌的發酵培養；重組類人膠原蛋白的誘導和表達；重組類人膠原蛋白的純化。採用本發明方法生產的類人膠原蛋白表達量高，純化方便，在發酵罐中的表達量可達到5.0g/L，單個批次50升罐可生產粗蛋白150g左右，由於表達量高，粗蛋白純度在80％以上，雜蛋白很少。
文檔編號C12N1/19GK102146135SQ20101060211
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月23日 優先權日2010年12月23日
發明者侯增淼, 張鳳龍, 聶蘇秦 申請人:陝西九州生物醫藥科技園發展有限公司