通過兩種微生物的順序作用將植物材料轉化為燃料和化學產品的方法

2023-05-19 05:56:36 4

專利名稱：通過兩種微生物的順序作用將植物材料轉化為燃料和化學產品的方法
通過兩種微生物的順序作用將植物材料轉化為燃料和化學
產品的方法交叉引用本申請要求2008年2月27日提交的美國臨時申請61/032，048的優先權，本文引 入該申請作為參考。
背景技術：
人們對於開發由可再生和可持續的生物質資源產生可用能量的方法存在著興趣。 碳水化合物形式的能量可以在廢棄生物質中和在專門的能量作物，如穀物(如玉米或小 麥)或草類(如柳枝稷(switchgrass))中找到。纖維素(cellulosic)材料和木質纖維材 料在許多應用中大量地生產、加工並使用。目前的挑戰是開發將碳水化合物轉化成為可用能量形式的可行和經濟的策略。由 碳水化合物獲得有用的能量的策略包括乙醇(「纖維素乙醇」)和其他醇類(如丁醇)的 生產、碳水化合物轉化成氫和碳水化合物通過燃料電池直接轉化為電能。例如，DiPardo, Journal of Outlookfor Biomass Ethanol Production and Demand(EIA Forecasts), 2002 ；Sheehan, Biotechnology Progress,15 :8179,1999 ；Martin, EnzymeMicrobes Technology,31 :274, 2002 ；Greer, BioCycle,61-65, April 2005 ；Lynd, Microbiology and Molecular Biology Reviews，66 :3，506-577，2002 ；及 Lynd 等人，「Consolidated Bioprocessing of Cellulosic Biomass :AnUpdate, " Current Opinion in Biotechnology, 16 =577-583,2005中描述了生物質乙醇的策略。雖然由穀物和糖生產乙醇是公知的，但這種方法涉及將有價值的糧食作物轉用於 能量生產。因此，將更經濟和更豐富的植物材料(如木質纖維材料)轉化為乙醇是可取 的。令人遺憾的是，儘管非常需要將包含木質纖維素材料(纖維素、半纖維素和木質素) 的源自植物的聚合物高效和完全地生物轉化為燃料和/或化學產品，但現在仍面臨挑戰， 因為只有木質纖維材料的纖維素和半纖維素可以通過目前已知的生物催化劑轉化為燃料 (如乙醇)。此外，材料的緊湊/緻密的結構加上木質纖維素材料的木質素成分的難消化性 (indigestibility)限制了木質纖維素材料中纖維素和半纖維素的實質部分(substantial portion)的生物利用度。並非所有的生物體可以利用這些複雜的化合物和結構。通常情況 下，可以產生想要的終產物(包括可以用作燃料或其他功能化合物的化合物，優選簡單糖 類或其他特殊碳基質)的生物體。目前用於生物轉化木質纖維素物質為燃料和/或化學產品的方法可以包括通過 機械、熱化學和生物化學過程對材料進行大量而昂貴的預處理。一般地，這種預處理過程的 目標包括(1)使得纖維素和半纖維素聚合物更易於為微生物利用，和(2)轉化複雜的纖維 素和半纖維素的多糖成為更簡單、可發酵的糖類或其他簡單化合物，其更容易通過微生物 轉化為燃料和其他化學產品。經常用於木質纖維素材料的預處理中的機械、熱化學和生化 過程構成了主要成本且不是完全有效的。此外，目前用於由木質纖維材料產生燃料和其他 化學產品的微生物缺乏用於裂解複雜植物多糖成為糖類(糖化作用)和然後以有效的方式 將得到的各種糖類轉化成燃料及其他化工產品的必要的細胞機構(cellular machinery) 0因此，為了糖化複雜的多糖和更有效地轉化更廣泛的可發酵糖成為燃料和其他化學產品， 現在仍然需要利用更多能的微生物和/或微生物組合的優勢的生物轉化方法。發明概述本發明提供了轉化複雜的植物多糖(包括纖維素材料)成為燃料和其他化學產品 的方法。在優選的實施方式中，該方法包括通過一種生物體(其然後被另一種生物體用作 生產希望的化合物的底物)轉化植物多糖成為較短鏈的多糖或其他化合物。在其他優選的 實施方式中，該方法包括順序的纖維素水解性(cellulolytic)需氧微生物對植物多糖的 水解和厭氧微生物對水解產物的發酵。在第一方面，公開了一種用於產生生物燃料(如乙醇)和其他化學產品的方法。 該方法包括(1)在厭氧條件下提供生物質材料，其中，生物質沒有用外部提供的化學品或 酶進行處理；(2)用非遺傳修飾厭氧細菌的第一培養物處理生物質，其中，非遺傳修飾的厭 氧細菌轉化生物質的至少一部分成為單糖和二糖；和(3)用作為非專性需氧菌(obligate aerobe)的微生物的第二培養物處理生物質，其中，單糖和二糖轉化為生物燃料。在某些 實施方式中，該方法在封閉的容器中進行。非遺傳修飾的厭氧細菌的第一培養物可以是 Clostridiumphytofermentans ο在第二個方面，公開了一種根據本發明的優選實施方式的製造乙醇和其他化學產 品的方法。該方法包括(1)提供包含植物多糖的預處理的源自生物質的材料；(2)在氧的 存在下，用包含纖維素水解性需氧微生物的第一培養物接種預處理的源自生物質的材料， 以產生需氧培養液(aerobic broth)，其中，需氧微生物能夠至少部分地水解植物多糖；(3) 孵育需氧培養液，直到纖維素水解性需氧微生物消耗氧的至少一部分和水解植物多糖的至 少一部分，從而將需氧培養液轉化成為包含具有可發酵糖的水解產物的厭氧培養液；(4) 用包含能夠轉化可發酵糖成為乙醇的厭氧微生物的第二培養物接種厭氧培養液；和(5)發 酵接種的厭氧培養液，直到可發酵糖的一部分被轉化成乙醇。在第三個方面，公開了生產純化的生物燃料(如乙醇)和其他化學產品的三階段 方法。該方法包括(1)第一階段，其中，在厭氧條件下用非遺傳修飾的厭氧細菌的第一培 養物處理生物質材料，其中非遺傳修飾的厭氧細菌無需外源提供的化學品或酶將生物質基 本上轉化成為單糖和二糖；(2)第二階段，其中，單糖和二糖用第二微生物的培養物處理， 其中，單糖和二糖轉化為生物燃料；和(3)第三階段，其中，從殘留的生物質和培養物分離 和回收產生的生物燃料。在某些實施方式中，該方法在封閉的容器中進行。非遺傳修飾的 厭氧細菌的第一培養物可以是Clostridium phytofermentans。在上述方法的某些實施方式中，從發酵的厭氧培養液回收至少一部分乙醇。在其他的實施方式中，該方法進一步包括溶解(Iyse)發酵的厭氧培養液中的需 氧和厭氧微生物以產生包含剩餘的可發酵糖和細胞內容物的溶解產物(Iysate)的步驟。 在一種變型中，溶解產物可以進行另外的物理和/或化學處理。在另一個變型中，可以用另 一種能夠加快剩餘的可發酵糖轉化為乙醇和其他化學產品的厭氧微生物接種溶解產物。在另一方面，公開了一種根據本發明的優選實施方式的製造乙醇和其他化學產品 的方法。該方法包括(1)提供包含植物多糖的預處理的源自生物質的材料；(2)在厭氧條 件下，用包含Clostridiumphytofermentans細胞的第一培養物接種源自生物質的材料以 水解植物多糖的至少一部分，其中，培養物的細胞吸收水解的植物多糖的至少一部分作為細胞內化合物；(3)溶解Clostridium phytofermentans細胞以產生溶解的培養液；(4)用 包含能夠轉化可發酵糖成為乙醇和其他化學產品的厭氧微生物的第二培養物接種溶解的 培養液；和(5)發酵接種的厭氧培養液，直到可發酵糖的至少一部分被轉化成乙醇和/或其 他化學產品。在另一方面，公開了一種生產生物燃料(如乙醇)和其他化學產品的方法。該方 法包括在中溫條件(mesophilic condition)下，在 Clostridium phytofermentans 禾口選自 丙酮丁酉享梭菌(Clostridiumacetobutyliticum)、熱纖梭菌(Clostridium thermocellum) 和食纖維梭菌(Clostridium cellovorans)的第二種梭菌屬細菌的共培養的存在下，使包 括含纖維素和半纖維素的植物材料的生物質進行發酵，所述培養的比例為使得纖維素乙 醇和半纖維素乙醇的轉化率大於通過使用單獨Clostridium phytofermentans或第二種 梭菌屬細菌獲得的轉化率的量。在另一方面，公開了一種生產生物燃料(如乙醇)和其他化學產品的方法。該方 法包括在中溫條件下，在Clostridium phytofermentans和運動發酵單胞菌(Zymonomas mobilis)的共培養存在下，使包括含纖維素和半纖維素的植物材料的生物質進行發酵， 所述培養的比例為使得纖維素乙醇和半纖維素乙醇的轉化率大於通過使用單獨的 Clostridium phytofermentans或運動發酵單胞菌獲得的轉化率的量。在另一方面，公開了一種同時糖化和發酵來自生物質的纖維素固體物質成為生 物燃料(如乙醇)和其他化學產品的方法。該方法包括在一定條件下，用Clostridium phytofermentans細菌處理封閉的容器中的生物質,其中，Clostridium phytofermentans 細菌產生足以基本上轉化生物質為單糖和二糖的糖分解(saccharolytic)酶，和引入第二 微生物的培養物，其中，第二微生物能夠基本上轉化單糖和二糖為生物燃料。在另一方面，公開了一種由含木質素的生物質生產生物燃料的方法。該方法包 括(1)將含木質素的生物質與具有足以水解含木質素的生物質的至少一部分的濃度的 鹼性水溶液接觸；(2)中和處理的生物質至7-8的PH ； (3)在一定條件下，用Clostridium phytofermentans細菌處理封閉的容器中的生物質,其中，Clostridium phytofermentans 細菌產生足以基本上轉化處理過的生物質為單糖和二糖的糖分解酶；和(4)引入第二微生 物的培養物，其中，第二微生物能夠基本上轉化單糖和二糖為生物燃料。在另一方面，公開了一種由生物質生產生物燃料和營養發酵殘留物的方法。該 方法包括(1)用包含Clostridium phytofermentans的培養物處理生物質，該包含 Clostridium phytofermentans的培養物在發酵反應中產生醇和包含選自胺基酸、輔因子 (cofactor)、激素、蛋白質、維生素和脂類的營養物的發酵殘留物；(2)在適於產生生物燃 料的條件下和適於產生營養物的條件下發酵培養物；(3)從培養分離生物燃料；和(4)回收 包含營養物的發酵殘留物。在另一方面，公開了一種由纖維素基質生產乙醇的方法。該方法包括(1)在反 應容器中提供包含施予了厭氧糖分解酶的纖維素基質、Clostridium phytofermentans細 菌和任選的運動發酵單胞菌(Zymomonasmobilis)細菌的漿料形式的反應混合物；(2)攪拌 反應混合物持續第一選定的時間段，其中，反應混合物在足以引發並保持發酵反應的條件 下反應；(3)停止反應混合物的攪拌足夠的時間以允許反應混合物的不溶性基質在第二選 定的時間段中沉澱，從而形成基本上不含懸浮固體的含乙醇流出層和殘留固體層；(4)在
6第二選定的時間段結束時和在進行任何進一步的攪拌之前，從反應容器除去含乙醇的流出 物；(5)向含有殘留固體的反應容器中添加包含步驟(1)的反應混合物的成分的第二反應 混合物；和(6)重複步驟(2)至(5)，以保持連續的發酵反應。在另一方面，本發明提供了一種組合物，其包含在基本上不存在外源提供的酶、 空氣和添加的營養物的情況下，包含有運動發酵單胞菌的第一培養物和不抑制發酵單胞菌 屬(Zymomonas)生長和發酵的量的Clostridium phytofermentans的第二培養物的發酵生 物質。在另一方面，本發明提供了一種用於乙醇生產的封閉系統方法。該系統包括(1) 在能夠由生物質產生糖的Clostridium phytofermentans的細菌存在下和能夠需氧和厭 氧地發酵糖並在厭氧發酵中產生乙醇的兼性厭氧菌的存在下，在至少大約35°C的溫度下， 在發酵容器中進行產生乙醇的厭氧發酵，(2)從厭氧發酵物連續抽取發酵培養基的一部分； (3)從抽取的發酵培養基分離細菌，並將分離的細菌返回到厭氧發酵物中；和(4)從發酵培 養基的抽取部分除去乙醇。引用引入本文通過引用引入本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請，好像各個單 獨的出版物、專利或專利申請具體和單獨地表明通過引用引入本文中。附圖簡述在所附的權利要求中詳細地提出本發明的新特徵。通過參考提出利用本發明原理 的說明性實施方式的下面的詳細說明他附圖，可以獲得對於本發明的特點和優勢的更好的 理解，附圖中

圖1描述示意性地顯示本發明的一種實施方式的方法的框圖。圖 2 顯示 C. phytofermentans 原液(0. 3% CB. MB)的生長。發明詳述^X除非另有定義，本文所用的科學和技術術語具有與本發明所屬領域的普通技術人 員通常所理解相同的意義。為了本發明的目的，下列用語的定義如下。「生物燃料」、「燃料和/或其他化學產品」和「其他產物」可以交替使用，並且在本 文中用來包括適合作為液體燃料、氣體燃料、試劑、化工原料、化學添加劑、處理助劑、食品 添加劑和可以添加化學產品的其他用途的化合物，且包括但不限於碳氫化合物、氫氣、甲 烷、羥基化合物(如醇類，如乙醇、丁醇、丙醇、甲醇等)、羰基化合物(如醛類和酮類(如丙 酮、甲醛、1-丙醛等))、有機酸、有機酸衍生物(如酯類(如蠟酯、甘油酯等))和其他功能 化合物(包括但不限於1，2_丙二醇、1，3_丙二醇、乳酸、甲酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸)、酶 (如纖維素酶、多糖酶(polysaccharase)、脂肪酶、蛋白酶、木質素酶(Iigninase)和半纖維 素酶)，且可作為純的化合物、混合物或不純或稀釋的形式而存在。本文所用的「生物催化劑」包括酶和微生物，包括酶和微生物的溶液、懸浮液和混 合物。在某些情況中，這個詞指酶或微生物任一發揮某種特定功能的可能用途，在其他情況 中，這個詞指酶和微生物二者的結合用途，而在其他情況中，這個詞指酶和微生物二者中的 僅一個。這一用語的上下文表明本領域的技術人員理解的含義。本文所用的「植物多糖」指在植物物質中存在的糖和糖衍生物的聚合物，以及糖聚合物的衍生物。示例性的植物多糖包括木質素、纖維素、澱粉和半纖維素。一般來說，多糖 可以具有兩個或多個糖單元或糖單元的衍生物。糖單元和/或糖單元的衍生物可以以規則 方式或以其他方式重複。糖單元可以是己糖單元或戊糖單元，或這些的組合。糖單元的衍 生物可以是糖醇、糖酸、氨基糖等。本文所用的「生物質」包括可以轉化為生物燃料、化學產品或其他產物的生物材 料。一種示例性的生物質的來源是植物物質。植物物質可以是，例如，木本植物物質、非木 本植物物質、纖維素材料、木質纖維素材料、半纖維素材料、碳水化合物、果膠、澱粉、菊粉 (inulin)、果聚糖(fructan)、葡聚糖、玉米、甘蔗、草、柳枝稷、竹子和由這些物質衍生的材 料。可以通過提及存在的化學物質種類(如蛋白質、多糖和油)進一步描述植物物質。多糖 包括各種單糖和單糖衍生物(包括葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖等)的聚合物。 植物物質還包括農業廢棄的副產物或副產品流(side stream)，如果渣、玉米漿、玉米漿幹 粉(corn steep solids)、酒糟(distillers grain)、果皮、核、發酵廢棄物、秸稈、木材、汙 水、垃圾和剩餘食物。這些材料可以來自農場、林業、工業來源、家庭等。生物質的另一非限 制的例子是動物物質，包括例如牛奶、肉類、脂肪、動物加工廢棄物和動物糞便。「原料」經常 用來指用於加工的生物質，如本文所述的那些。本文所用的「可發酵糖」指可以用作微生物的碳源的糖和/或糖衍生物，包括這些 化合物(包括這些化合物中的兩種或多種)的單體、二聚體和聚合物。在某些情況下，生物 體可以在吸收裂解的材料之前，通過例如水解來裂解這些聚合物。示例性的可發酵糖包括 但不限於葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、纖維二糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和 果糖。本文所用的「培養液」指任何生長階段(包括剛接種後的時刻和任一或所有細胞 活動已停止後的時期)的接種培養基，且可以包括發酵後處理後的材料。如果合適的話，它 包括可溶性和不溶性物質的組合、懸浮物質、細胞和培養基的全部內容物。本文所用的「糖化」指植物多糖向低分子量物質的轉化，所述低分子量物質可以被 附近的生物體利用。對於某些生物體，這包，向單糖、二糖、三糖和高達大約7個單體單元的 寡糖以及糖衍生物的類似鏈大小的糖衍生物及糖和糖衍生物的組合的轉化。對於某些生物 體，允許的鏈節可以更長，和對於某些生物體，允許的鏈節可以較短。本文所用的「預處理」或「預處理的」指無論以組合的步驟進行的或順序進行的任 何機械、化學、熱、生化過程或這些過程的組合，其達到去除或破壞木質素的目的以使得植 物生物質中的纖維素和半纖維素聚合物更容易為纖維素酶和/或微生物利用。在一些實施 方式中，預處理可以包括去除或破壞木質素以使得植物生物質中的纖維素和半纖維素聚合 物更容易為纖維素酶和/或微生物利用。在一些實施方式中，預處理可以包括使用一種類 型的微生物使得植物多糖更容易為另一類型的微生物利用。在一些實施方式中，預處理也 可以包括纖維素/或半纖維素材料的破壞和/或膨脹。蒸汽爆發(steam explosion)和氨 纖維膨脹(或爆發)是公知的熱/化學技術。可以使用水解，包括利用酸和/或酶的方法。 也可以使用其他的熱、化學、生化、酶學技術。碰下面的描述和實施例詳細說明本發明的某些優選實施方式。本領域技術人員會認 識到，存在本發明範圍涵蓋的許多的變化和修改。因此，優選的實施方式的描述不應被視為限制本發明的範圍。本發明的各種實施方式提供涉及以下方面的益處1)以漸進的方式在整個過程 中，而不是依賴於單一的初步預處理步驟的效果，使得木質纖維素材料的纖維素和半纖維 素聚合物具有生物可利用性，無論是使聚合物更容易接近、水解它們、衍生化或以這些或其 他使它們可以由附近的生物利用的方式作用於它們；2)利用多種生物催化劑，以達到植物 聚合物的更完整的糖化、源自植物的糖向燃料和/或化學產品的更完全的轉化、源自植物 的糖向燃料和/或化學產品的更迅速的轉化；3)利用需氧微生物以從進程中除去氧，從而 使得能夠隨後使用厭氧微生物，或在後續使用厭氧微生物或需氧微生物前利用厭氧微生 物；4)循環利用過程中的營養物，以儘量減少培養基的成本；和5)提供在過程中同時製造 兩種或多種產物的方法。本發明的某些實施方式可能顯示所有這些益處，而其他實施方式 可能顯示較少的益處，但仍保持在本發明的範圍之內。在一個優選的實施方式中，預處理或沒有預處理的原料(如農作物、作物殘渣、樹 木、木屑、鋸末、紙張、紙板以及含有纖維素、半纖維素和/或木質纖維素的其他材料(統稱 為「原料」))接觸能夠轉化原料中的一種或多種植物多糖成為低分子量物質的厭氧生物體， 所述低分子量物質可以用作第二微生物生產燃料和/或其他化學產品的碳源。這些低分子 量物質可以保持作為細胞外化合物，可以攝取作為細胞內化合物，或同時作為細胞內和細 胞外的化合物存在。生物體也可以至少部分地聚合或以某種其他方式結合這些化合物。在一種這樣的實施方式中，使用 Clostridium phytofermentans。Clostridium phytofermentans包括美國典型培養物保藏700394T號，且在一些實施方式中可以根據培 ff liftt ISDgT (ffarnick ^A International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52 =1155-60,2002)的表型和基因型特徵定義。本發明的方面一般包括用 於生產燃料(如乙醇)和/或其他有用的有機產品的系統、方法和組合物，其涉及例如， 菌株ISDgT和/或任何其他Clostridium phytofermentans種類的菌株，包括那些可以 由源自菌株ISDgT的或單獨分離的菌株。某些示例性的物種可以使用標準分類學規則來 定義(Stackebrandt 禾口 Goebel, International Journal of Systematic Bacteriology, 44 =846-9,1994)與典型菌株(ISDgT)相比具有97 %和更高的16S rRNA序列同源性值 的菌株和具有至少大約70%的DNA重組值(re-association value)的菌株可以是值得 考慮的Clostridium phytofermentans。存在相當多的證據表明具有70%或更高的DNA 重組值的許多微生物也具有至少96%的DNA序列一致性，並共有定義物種的表型性狀。 Clostridiumphytofermentans菌株ISDgT的基因組序列分析表明大量很可能參與植物多 糖發酵機制和途徑的基因和遺傳基因座的存在，導致可以在這種微生物的Clostridium phytofermentans種的所有或幾乎所有菌株中發現異常的發酵性能。Clostridium phytofermentans菌株可以是天然的分離物或遺傳修飾的菌株。Clostridium phytofermentans提供了生物質轉化為乙醇和其他產品的有用 的優勢。Clostridium phytofermentans的一個優勢在於它產生能夠水解多糖和高級 糖(higher saccharide)成為較低分子量的糖、寡糖、二糖和單糖的酶的能力。在一 些實施方式中，生物體可用於水解存在於生物質中的各種高級糖成為低級糖，如在用 於發酵以產生乙醇、氫或如有機酸(包括甲酸、乙酸和乳酸)的其他化學品的製備中。 Clostridium phytofermentans的另一個優勢是其水解含有己糖糖單元、含有戊糖糖單元和含有這兩種糖單元的多糖和高級糖成為低級糖，和在某些情況下水解成為單糖的能 力。這些酶和/或水解產物可用於發酵中以生產各種產品(包括燃料和其他化學產品)。 Clostridiumphytofermentans的另一個優勢是由低級糖(如單糖)生產乙醇、氫和其他燃 料或化合物(如包括乙酸、甲酸和乳酸的有機酸)的能力。Clostridium phytofermentans 的另一個優勢是進行水解含有糖和/或高級糖或多糖的高分子量生物質成為低級的糖及 發酵這些低級糖成需要的產品包括乙醇、氫氣和其他化合物(如包括乙酸、甲酸和乳酸的 有機酸)的組合步驟的能力。Clostridium phytofermentans的另一個優勢是在包括升高的乙醇濃度、高糖濃 度、低糖濃度、利用不溶性碳源和/或厭氧條件下運行的條件下生長的能力。這些特徵可 以以不同的組合實現具有長發酵周期的運行，且可用於結合批次發酵、進料批次發酵(fed batch fermentation)、自種(self-seeding) /部分收穫發酵和從作為接種體的最終發酵物 回收細胞。在一些實施方式中，Clostridium phytofermentans接觸預處理或未預處理的含 有纖維素，半纖維素和/或木質纖維素材料的原料。可以存在另外的營養物，包括含氮化 合物(如胺基酸、蛋白質、水解蛋白質、氨、尿素、硝酸鹽、亞硝酸鹽、大豆、大豆衍生物、酪蛋 白、酪蛋白衍生物、奶粉、奶製品(milk derivative)、乳清、酵母提取物、水解酵母、自溶解 的酵母、玉米漿、玉米漿乾粉、穀氨酸一鈉和/或其他發酵氮源)、維生素和/或礦物質補充 劑。在一些實施方式中，一種或多種其他低分子量的碳源可以被添加或存在，如葡萄糖、蔗 糖、麥芽糖、玉米糖漿、乳酸等。這些低分子量的碳源可以發揮多種功能，包括在發酵期開始 時提供初始碳源、幫助建立細胞計數、控制碳/氮比例、除去過量的氮或一些其他功能。與C. phytofermentans接觸一般包括至少一段具有足夠低的溶解氧的時期，以使 生物體繁殖和/或產生纖維素酶和/或在細胞內儲存糖/多糖/寡糖物質和/或產生燃料 和/或其他化學產品。可以通過任何適當的方法實現適當低溶解氧的條件，包括加熱培養 基、用低氧氣體吹洗培養基、培養液或發酵罐、加入厭氧生物體、在培養基製備過程中排除 空氣等。在一些實施方式中，在無氧環境下培養Clostridium phytofermentans細胞，所 述無氧環境可以通過經具有浸沒於培養基表面下的氣體出口的起泡器鼓入基本上不含 氧的氣體來實現和/或維持。過量氣體和由培養基中的反應產生的流出物填充頂部空 間，並最終通過容器壁中形成的出氣口排出。可以用來維持厭氧條件的氣體包括N2、N2/ CO2(80 20)、N2/C02/H2(83 10 7)和隋性氣體(如氦和氬)。在2007年1月26日提 交的題為"Systems and Methods for Producing Biofuels and RelatedMaterials，，的美 國申請11/698，722中描述了實現厭氧條件的方法，本文通過引用完整引入該文獻。在某些實施方式中，C. phytofermentans可以降低原料中的一種或多種多糖的分 子量，並在細胞內吸入低分子量的化合物的至少一部分。吸收這些化合物後，細胞被溶解並 接觸用於生產燃料和/或其他化學產品的另一種生物體。溶解發生在用第二生物體接種 之前、期間或之後。溶解和第二接種的相對時間選擇可以取決於以下事件所使用的溶解 方法、第二生物體的健壯性(robustness)和C. phytofermentans的健壯性。在某些情況 下，可以在用C. phytofermentans接種的同時或之前，用第二生物體接種培養液。適合用 作第二生物體的生物體包括那些能夠產生乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、氫、甲烷、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酮酸、甲醛、丙酮或可作為燃料和/或其他化學產品的其他化合物的生物體。優選 的生物體包括酵母(如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、梭菌屬的種(如熱纖梭菌 (C. thermocellum)、丙酮丁醇梭菌(C. acetobutylicum)禾口食纖維梭菌(C. cellovorans)) 和產生乙醇的細菌(如運動發酵單胞菌)。合適的溶解方法包括單獨或組合地添加酶(如溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、多糖酶)、 添加螯合劑(如磷酸鹽、EDTA、碳酸鹽、離子交換樹脂等)、高剪切混合、超聲處理、壓降漿 (pressure-drophomogenization)、添加酸或鹼、添加氧化或還原劑或其他適當的手段。根據產生的具體物質和所需的純度，可以通過適當的加工方法回收產生的燃料 和/或其他化合物。例如，當生產乙醇時，可以將反應物的全部內容物轉移到蒸餾裝置 (di sti 11 ation unit)，且可以蒸餾和收集96體積％的乙醇/4體積％的水。可以通過96 % 乙醇的共沸蒸餾(例如，通過加入苯，然後再蒸餾該混合物)，或將96%乙醇通過分子篩以 除去水而獲得燃料級乙醇(99-100%乙醇)。一方面，本發明使用順序的需氧或厭氧循環將纖維素/木質纖維材料生物轉化為 燃料和化學產品。一些實施方式使用需氧/厭氧循環將纖維素/木質纖維材料生物轉化為燃料和化 學產品。在一些實施方式中，厭氧微生物可以直接發酵生物質而無需預處理。在某些實施 方式中，原料接觸能夠裂解源自植物的聚合材料為低分子量產物的生物催化劑，所述產物 可以隨後由生物催化劑轉化為燃料和/或其他需要的化學產品。根據一種實施方式的處理步驟可以包括1)將原料與需氧的纖維素水解性微生 物接觸，2)將產生的經處理的原料與厭氧的纖維素水解性微生物接觸，該微生物也能夠發 酵糖成為燃料和/或化學產品，3)從液體部分(包括燃料和/或其他化學產品的至少一部 分)分離固體部分(包括微生物細胞、殘留原料和部分代謝的原料的至少一部分)，4)通過 機械、熱和/或化學技術處理固體，以實現殘留原料材料中的植物聚合物的至少部分裂解， 並產生可用的碳水化合物(如單糖、二糖、寡糖、多糖、糖醇和其他的糖衍生物)和與由前述 處理步驟產生的微生物細胞相關的其他營養物，和5)將處理的固體與能夠轉化存在的至 少一些碳水化合物為燃料和/或其他化學產品的微生物接觸。在一些實施方式中，可以預處理原料，如通過熱、機械和/或化學手段預處理。這 種預處理可以至少部分地水解存在的碳水化合物或蛋白質，破壞細胞結構，增加表面積，或 使碳水化合物更容易為微生物或酶利用。在一些實施方式中，處理步驟包括1)在有氧條件下將預處理的生物質材料接觸 需氧細菌的第一培養物，其中，需氧細菌能夠至少部分地水解預處理的生物質，3)孵育需氧 培養液直到纖維素水解性需氧微生物消耗氧的至少一部分並水解生物質的至少一部分，從 而轉化需氧培養液成為包括含可發酵糖的水解產物的厭氧培養液，和2)用包含能夠轉化 可發酵糖成為生物燃料的厭氧微生物的微生物第二培養物處理。一些實施方式使用厭氧/需氧循環用於纖維素/木質纖維素材料向燃料和化學產 品的生物轉化。其他實施方式使用厭氧/厭氧循環用於纖維素/木質纖維素材料向燃料和 化學產品的生物轉化。在一些實施方式中，厭氧微生物可以直接發酵生物質而無需預處理。在一些實施方式中，處理步驟包括1)在厭氧條件下將生物質材料接觸非遺傳修 飾的厭氧細菌的第一培養物，其中，生物質沒有經外源提供的化學品或酶處理，且其中，非遺傳修飾的厭氧細菌轉化生物質的至少一部分成為單糖和二糖，和2)用非專性需氧菌的 微生物的第二培養物處理生物質，其中，單糖和二糖轉化為生物燃料。該過程可在封閉的容 器中進行。在一些實施方式中，厭氧細菌是C.phytofermentans。在一些實施方式中，第二 培養物是釀酒酵母、梭菌屬的種(如熱纖梭菌、丙酮丁醇梭菌和食纖維梭菌)或運動發酵單 胞菌。在一些實施方式中，處理步驟也可以包括3)分離和回收所產生的生物燃料、殘留的 生物質和培養物。在一些實施方式中，本發明包括產生生物燃料的方法，包括在中溫條件下，在 Clostridium phytofermentans和運動發酵單胞菌的共培養的存在下，使包括含纖維素和 半纖維素的植物材料的生物質進行發酵，所述培養的比例為使得纖維素乙醇和半纖維素 乙醇的轉化率高於通過使用單獨的Clostridium phytofermentans或運動發酵單胞菌獲 得的轉化率的量。在一些實施方式中，用Clostridium phytofermentans和運動發酵單胞 菌的共培養獲得的轉化率高於通過使用單獨的Clostridiumphytofermentans或運動發 酵單胞菌獲得的轉化率的 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。中溫條件優選保持在大約28°至 約 35°。在一些實施方式中，本發明提供了產生生物燃料的方法，包括在中溫條件下，在 Clostridium phytofermentans和選自丙酮丁醇梭菌、熱纖梭菌和食纖維梭菌的第二種 梭菌屬細菌的共培養的存在下，使包括含纖維素和半纖維素的植物材料的生物質進行發 酵，所述培養的比例為使得纖維素乙醇和半纖維素乙醇的轉化率高於通過使用單獨的 Clostridium phytofermentans或第二種梭菌屬細菌獲得的轉化率的量。在一些實施方式 中，用Clostridium phytofermentans和第二種梭菌屬細菌的共培養獲得的轉化率為高於 通過使用單獨的Clostridiumphytofermentans或第二種梭菌屬細菌獲得的轉化率的5%、 10% ,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%, 85%、90%、95% 或 100%。在一些實施方式中，本發明提供了 一種同時糖化和發酵來自生物質的纖維素固體 成為生物燃料的方法。該方法包括在一定條件下，用Clostridium phytofermentans細菌 處理封閉的容器中的生物質，其中，Clostridium phytofermentans細菌產生足夠基本上轉 化生物質為單糖和二糖的糖分解酶。該培養物然後接觸第二微生物的培養物，其中，第二生 物體能夠基本上轉化單糖和二糖為生物燃料。第二培養物的例子包括但不限於釀酒酵母、 梭菌屬的種(如熱纖梭菌、丙酮丁醇梭菌和食纖維梭菌)和運動發酵單胞菌。在一些實施方式中，本發明提供了一種由含木質素的生物質生產生物燃料 的方法。該方法包括1)將含木質素的生物質與具有足以水解含木質素的生物質的 至少一部分的濃度的鹼性水溶液接觸；2)中和處理過的生物質至7-8的pH;3)在一 定條件下，用Clostridiumphytofermentans細菌處理封閉容器中的生物質，其中， Clostridiumphytofermentans細菌產生足夠基本上轉化處理過的生物質為單糖和二糖的 糖分解酶；和4)引進第二微生物的培養，其中，第二生物體能夠基本上轉化單糖和二糖為 生物燃料。在一些實施方式中，本發明提供了一種由生物質生產生物燃料和營養發酵殘留 物的方法。該方法包括1)用包含Clostridiumphytofermentans的培養物處理生物質，
12Clostridium phytofermentans在發酵反應中產生醇和包含選自胺基酸、輔因子、激素、蛋 白質、維生素和脂類的營養物的發酵殘留物；2)在適於產生生物燃料的條件下和適於生產 營養物的條件下發酵培養物；3)從培養物分離生物燃料；和4)回收包含營養物的發酵殘留 物。本發明的一個實施方式由圖1示意性地顯示。經處理或未經處理的原料11輸送到 需氧生物反應器1中，在其中它受到一種或多種需氧微生物作用。步驟1是任選的需氧預 處理步驟。需氧培養的原料12然後輸送到厭氧生物反應器2中，在其中它由一種或多種厭 氧微生物作用，以產生一種或多種用作燃料或其它用途的化合物，並任選地分解存在的糖。 在另一實施方式中，需氧培養1和厭氧培養2可在同一容器中進行。厭氧處理的材料13輸 送到分離器3，在其中主要液體的部分15與富含固體的厭氧處理的殘留部分14分離。步 驟3是任選的分離步驟。在這裡，「主要液體的部分」指由分離產生的具有較低懸浮固體的 部分。這部分一般是可流動的，且在一些實施方式中具有比其他部分高的透光百分比。可 能必要的話，主要液體的部分15經進一步處理，使得分離燃料或所需的化學產品。分離器 3可以是密度分離裝置，如沉澱池、澄清池、離心機、水力旋流器等，或者它也可以是膜裝置 (如反滲透裝置、橫流微濾、超濾、納米過濾等)，或者它也可以是過濾單元、或篩選單元、或 浮選單元、或這些類型的裝置的組合。厭氧處理的殘留部分14可以被丟棄、回收利用、進一 步加工或用這些方法的組合進行處理。厭氧處理的殘留部分14的進一步加工可以包括機械、化學和熱處理步驟。在另一 實施方式中，殘留部分14通過發酵進行加工。在另一實施方式中，殘留部分14由至少一個 處理步驟和發酵的組合進行加工。處理後的殘留部分14也可以為了銷售其中存在的一種 或多種產品而進行加工。在圖1中，厭氧處理的殘留部分14經處理步驟4加工以產生處理的殘留材料16， 其然後再經發酵步驟5加工以產生發酵殘留材料17。發酵殘留材料17然後經分離步驟6 處理，以部分或完全地分離有用的產品(例如燃料或化學產品)。在一個實施方式中，分離 步驟6從富含固體的相18分離主要液體的相19。主要液體的相19然後可以進一步加工以 分離和/或純化用作燃料或化學產品的材料。主要液體的相19的至少一部分也可以在處 理中回收。富含固體的相18可以被丟棄、回收利用、填埋、堆肥、用於向農作物施肥或用作 其他與其組成(composition)有關的目的。本發明的另一實施方式提供了一種用於生產乙醇的封閉系統方法，包括以下步 驟1)在能夠由生物質產生糖的Clostridium phytofermentans細菌存在下和的能夠需氧 和厭氧地發酵糖並在厭氧發酵中產生乙醇的兼性厭氧菌的存在下，在至少大約35°C的溫度 下，在發酵容器中進行產生乙醇的厭氧發酵，2)從厭氧發酵連續地抽取發酵培養基的一部 分；3)從抽取的發酵培養基分離細菌，並將分離的細菌返回到厭氧發酵中；和3)從抽取的 發酵培養基的部分除去乙醇。在一種實施方式中，兼性厭氧細菌是大腸桿菌。本發明的另一實施方式提供了一種由纖維素基質生產乙醇的方法，包括以 下步驟1)在反應容器中提供包含施予厭氧的糖分解酶的纖維素基質、Clostridium phytofermentans細菌和任選的運動發酵單胞菌的漿料形式的反應混合物；2)攪拌反應混 合物持續第一選定的時間段，其中，反應混合物在足以引發並保持發酵反應的條件下反應； 3)停止反應混合物的攪拌持續足夠的時間以允許反應混合物的不溶性基質在第二選定的
13時間段中沉澱，從而形成基本上不含懸浮固體的含乙醇的流出物層和殘留固體層；4)在第 二選定的時間段結束時和任何進一步的攪拌之前，從反應容器除去含乙醇的流出物；5)向 含有殘留固體的反應容器中添加包含步驟1)的反應混合物的成分的第二反應混合物；和 6)重複步驟2)至5)，以保持連續的發酵反應。本發明還提供了組合物。在一些實施方式中，本發明提供了在基本上不存在外源 提供的酶、空氣和添加的營養物的情況下包含含有運動發酵單胞菌的第一培養物和不抑制 發酵單胞菌屬生長和發酵的量的Clostridium phytofermentans的第二培養物的發酵生物 質的組合物。■-鄉千麵、輔麵■誦佳可能含有纖維素、半纖維素和/或木質纖維素材料的原料可以源自農業作物、作 物殘茬、樹木、木片、木屑、紙張、紙板、草和其他來源。纖維素是葡萄糖的直鏈聚合物，其中，葡萄糖單元通過β (1 — 4)鍵連接。半纖維 素是許多糖單體(包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖)的分支聚合物， 並且可以具有同時存在的糖酸(如甘露糖醛酸和半乳糖醛酸)。木質素是主要對-香豆醇 (p-coumarylalcohol)、松柏酉享(conferyl alcohol)禾口芥子酉享(sinapyl alcohol)的交聯 的外消旋大分子。這三種聚合物一起出現在植物生物質中的木質纖維素材料中。這三種聚 合物的不同特點可以使該組合難於水解，因為各種聚合物傾向於屏蔽其他聚合物免受酶的 攻擊。在一些實施方式中，原料材料可以在用於生產燃料和化學產品的生物過程之前進 行任選的機械、熱化學和/或生物化學預處理，但未經處理的木質纖維素材料也可以用於 該方法中。機械方法可以減小木質纖維素材料的顆粒大小，以便它可以在生物過程中更方 便地處理，還可以增加原料的表面積以促進與化學劑/生物化學劑/生物催化劑的接觸。木 質纖維素材料也可進行熱和/或化學預處理以使植物聚合物更易利用，但因為各種實施方 式可以加入木質纖維素處理的多個步驟，因此有可能會使用更溫和和較便宜的熱化學預處 理條件。添加裂解植物聚合物的酶(糖化作用)可以用作常規的木質纖維素生物轉化過程 中的部分，且這些酶可以構成主要的成本。機械過程包括並不限於，洗滌、浸泡、碾磨、粉碎、過篩、剪切和大小分選過程。化學 過程包括但不限於，漂白、氧化、還原、酸處理、鹼處理、亞硫酸鹽處理、酸式亞硫酸鹽處理、 鹼式亞硫酸鹽處理和水解。熱過程包括但不限於，滅菌、蒸汽爆發、在水存在或不存在的情 況下保持在升高的溫度下和冷凍。生化過程包括但不限於用酶處理和用微生物處理。可以 利用的各種酶包括纖維素酶、澱粉酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、葡聚糖酶(gluconase)和 其他多糖酶(polysaccharase)；溶菌酶；漆酶和其他木質素修飾酶；脂肪氧合酶、過氧化物 酶和其他氧化酶；蛋白酶；和脂肪酶。機械、化學、熱和生物化學過程中的一種或多種可以 組合或單獨使用。這種組合的過程也可以包括那些用於紙張、纖維素產品、微晶纖維素和纖 維素的生產中的過程，且可包括製漿、牛皮製漿(kraft pulping)、酸性亞硫酸鹽處理。原 料可以是來自利用對纖維素、半纖維素和木質纖維素材料的這些處理的一種或多種的設施 (如造紙廠、纖維素廠、棉花加工廠或微晶纖維素廠)的副產品流或廢物流。原料還可以包 括含纖維素或含纖維質的廢料。在準備用厭氧生物接種原料時，可以將如氮源、鹽、維生素和微量元素的另外的營
14養物添加到培養液中。在接種之前、同時或接種後，培養液的氧含量降低到適於使用的特定 生物體的水平。一種優選的生物體是C. phytofermentans。可以採用各種方法以減少氧含 量。例如，可以用氮氣或非含氧氣體流衝洗培養液或發酵罐，培養基可以在排除氧的情況下 配製，可以加熱培養基，或可以添加需氧生物體。在一個實施方式中，利用也能夠製造所需 的燃料和/或其他化學產品的需氧生物體或兼性厭氧生物體。第一生物體向第二生物體的 過渡然後可以通過改變通風模式和選擇性溶解第一生物體來實現。厭氧牛物反應容器對於本發明來說特別感興趣的是具有裂解纖維素和半纖維素及代謝由木質 纖維素材料的糖化作用產生的己糖和戊糖的能力的厭氧纖維素水解性微生物(例如， Clostridium phytofermentans)。為了促進也可以轉化糖為燃料和/或化學產品的厭氧纖 維素水解性生物催化劑的生長，有必要補充營養物以促進快速生長和生化活性，但是，可以 至少部分基於所需要的營養物的簡單性和低成本選擇挑選用於該過程中的微生物培養。雖 然厭氧微生物可以同時糖化木質纖維素材料和由植物聚合物產生的全部範圍的己糖和戊 糖轉化為燃料和/或化學產品，但各種類型的戊糖或己糖轉化為燃料和/或化學產品的速 度會發生變化。因此，一些糖被厭氧生物催化劑比其他催化劑更快地轉化為燃料和/或化 學產品。因此，本發明的一種實施方式允許木質纖維素材料和厭氧纖維素水解性發酵生物 催化劑之間的充分接觸時間，以達到基本上完全的糖化，但只有糖向燃料和/或產品的部 分轉化。在一個實施方式中，將包括至少一種能夠水 解纖維素、半纖維素或木質纖維素材 料並生產所需的燃料和/或其他化學產品的厭氧菌的厭氧培養物添加到原料的一部分中， 例如，原料12。在另一實施方式中，將包括至少一種能夠水解纖維素、半纖維素或木質纖維 素材料並在細胞內儲存水解的物質的厭氧菌的厭氧培養物添加到原料的一部分。在一些實 施方式中，添加到原料中的厭氧菌既可以在細胞內存儲水解的物質，也可以產生所需的燃 料和/或其他化學產品。在優選的實施方式中，厭氧菌是C. phytofermentans.包含C. phytofermentans的厭氧培養物優選維持在大約30°大約120小時。但 是，不同的生物體和不同的培養基組成可能需要較高或較低的溫度和較長或較短的發酵時 間。在這段時間內，厭氧菌可以代謝培養液中存在的碳水化合物，以產生所需的燃料和/或 其他化學產品，並賦予殘留的生物質更易於被另一種微生物後續發酵生物利用。在其他的 實施方式中，厭氧微生物水解培養液中存在的碳水化合物並在細胞內存儲水解的物質。在 其他的實施方式中，厭氧微生物水解碳水化合物，並在細胞內存儲水解的物質的一部分和 由水解的和/或存儲的物質的一部分產生燃料和/或其它化學產品。在一些實施方式中， 如當存在的原料不完全水解時，厭氧微生物可進一步水解剩餘的原料的至少一部分。產生 的燃料和/或其他化學產品通常聚集在細胞外培養基中，但是，在某些情況下，燃料和/或 其他化學產品將聚集在另一個位置。例如，氣體產物(包括氫)可以積聚在生物反應器的 頂部空間中，它可以在生物反應器的頂部空間排出、捕獲等。其他燃料和/或其他化合物可 以在細胞內聚集。任選的厭氧處理原料的分離當原料耗盡，植物多糖的水解速度已經減慢，生物體的碳存儲已經放緩時，或由於 其他原因(如保持平穩的發酵廠的運作)，厭氧發酵步驟可以停止。各種方法可以用來監測生物體的活性，並確定停止厭氧發酵的時間點(包括但不限於監測廢氣率(off-gas rate) 和/或組成、培養液的PH值和培養基組成)。在某些情況下，可以監測當生產速率降低時停 止的發酵中的CO2生產速率和/或氫生產速率。培養液然後可以分成富含固體的部分和主 要液體的部分，例如通過離心、沉澱、過濾、用膜、旋流器處理等。例如，在圖1中，培養液然 後可以分成富含固體的部分14和主要液體的部分15。在各種實施方式中，主要液體的部分(例如，液體部分15)可以包含一種或多種可 進一步純化或直接使用的需要的燃料/或其他化學產品。產品的例子包括醇類、酶類、有機 酸類和有機酸酯類。採用的純化方法可以包括濃縮方法(如蒸發、超濾等)、結晶、沉澱(如 用鹽或加入非溶劑)、液_液分離、蒸餾、色譜、離子交換、吸附、透析和乾燥。在一些實施方式中，一種或多種產品包含於富含固體的部分中，或一種產品可以 在富含固體的部分中和相同或不同的產品可以在主要液體的部分中。當產品包含於富含固 體的部分中時，富含固體的部分可以作為產品本身進行處理，或此部分可進一步加工，如通 過乾燥、洗滌、溶解、提取、衍生化(derivitizing)和/或通過其他技術加工，以達到預期的 純度和產品特性。可選擇地，厭氧處理的原料可直接分離成產品材料和殘留部分。這個途徑的例子 是從靜止底部為殘留部分(例如，殘留部分14)的厭氧處理原料蒸餾乙醇。這一途徑的變型是在發酵過程中回收一種或多種氣體產物(如氫或甲烷)。在圖 1所示的實施方式中，分離過程3可以在發酵過程中在發酵容器內進行而不是在停止發酵 後進行，並包括從發酵培養液14分離氣態產物流15。液體部分主要液體的部分(如液體部分15)經常含有厭氧發酵過程中產生的燃料和/或化 學產品。所需的燃料和/或其他化學產品的回收取決於微生物產生的具體化合物。例如， 在醇類(如乙醇、甲醇、丙醇、丁醇等)的情況下，可以蒸餾液體部分以生產高濃度的醇，其 然後可以進一步脫水，例如用分子篩、過蒸汽化(pervaporation)、另外的蒸餾步驟(包括 用試劑破壞共沸物或以其他方式促進分離)或進行分離的其他技術。所需的燃料和/或其 他化學產品也可以被純化，以除去其他微量成分，或也可以直接使用。當沒有任選的分離步驟時，厭氧處理的殘留部分和厭氧處理的培養液的處理當沒有利用任選的分離步驟(例如，分離步驟3)時，厭氧處理的殘留物(如厭氧 處理的殘留物14)或厭氧處理的培養液(如厭氧處理的培養液13)進行機械、熱化學和/ 或生化處理(如生化處理4)以進一步釋放難以處理的(recalcitrant)植物聚合物，糖化 植物聚合物和/或釋放未代謝的糖類或來自微生物細胞的細胞內內容物的儲存糖類/糖聚 合物和可溶性營養物。如此處理的材料將稱為「處理的殘留材料」，無論加工中是否採用任 選的分離步驟(如分離步驟3)。由此加工固體或厭氧處理的培養液的這一進一步的處理產 生的處理的殘留材料(如處理的殘留材料16)可以用作動物飼料，作為燃料燃燒，或以其他 方式利用，如通過另外的加工或在該過程中反覆利用。使用的加工技術可以包括細胞裂解，如通過超聲波、高剪切混合、蒸汽爆發、酶處 理、化學品處理、滲壓震擾或其他適當的技術。其他加工技術可以包括蛋白質和/或多糖的 水解，如通過用酶、酸、溫度或其他合適技術處理。其他產物(如胞外和/或分泌的酶)可以通過適當的技術回收。這些技術的例子
16可以包括超濾、納米過濾、反滲透、過濾、離心、重力沉降、浮選、乾燥、透析、鹽沉澱、通過加 入非溶劑沉澱、達到或接近等電點的沉澱以及通過這些方法和其他方法的組合的沉澱。可以利用的酶包括單獨或組合的溶菌酶、蛋白酶、多糖酶、脂肪酶。在一些實施方 式中，使用這些種類中一種的1種以上的酶，例如使用兩種或多種蛋白酶。可以通過加入純 化或部分純化形式的單個的酶或通過加入具有存在的多種酶和酶類型的酶混合物，來利用 這些酶。在一些實施方式中，可以通過酶的加入利用化學、熱或機械處理。這種額外的處理 可以在酶的加入之前，期間和/或之後進行。這樣的處理可以包括加熱、冷卻、滲透壓的變 化、加入螯合劑、高剪切混合、均質化、超聲、加入氧化劑、加入還原劑及這些和其他合適技 術的組合。在一些實施方式中，通過溶解步驟暴露的細胞內物質可以包括含糖化合物。這些 含糖化合物(包括多糖)的水解可以釋放單糖、二糖、三糖或較高級的糖。一般來說，這種 水解的目的是提高這些糖類對於隨後的微生物培養的生物利用度。這種培養可以作為循環 步驟的部分，或用於隨後的下遊發酵步驟。處理的殘留材料的發酵處理的殘留材料(如殘留材料16)可以用一種或多種另外的生物體(例如厭氧微 生物)發酵，以產生發酵的殘留材料(如發酵殘留材料17)，其包括一種或多種用作燃料或 化學產品的化合物。示例性的另外的微生物包括釀酒酵母、運動發酵單胞菌、丙酮丁醇梭 菌、C. phytofermentans、熱纖梭菌、食纖維梭菌以及產生或經工程化以產生醇類、有機酸、 有機酸衍生物、醛、酮、氫或甲烷的其他生物體。在一些實施方式中，另外的生物體可以是優先利用只是被厭氧培養步驟中使用 的微生物緩慢利用的糖的生物體。例如，對於C.phytofermentans，緩慢利用的糖類包括 乳糖、阿拉伯糖和木糖，而更迅速利用的糖類包括葡萄糖、纖維二糖和半乳糖。對於運動 發酵單胞菌，更迅速利用的糖類包括葡萄糖、果糖和蔗糖。在此步驟產生的產物可能與在 厭氧發酵步驟產生的相同或不同。處理的殘留材料的發酵條件根據所使用的具體生物體 和最終需要的產物而變化。對於C. phytofermentans，在排除氧和低於大約8. 5的pH的 條件下，使用大約28°C至大約38°C或優選大約33至36°C或大約35°C的溫度。其他培養 條件可以在 2007 年 8 月 2 日提交的題為 「System and Methods forProducing Biofuels and Related Materials」 的美國專利申請 11/698，727 和 Thomas A. Warnick 等人， Clostridium phytofermentans sp.nov., Acellulolytic Mesophile from Forest Soil, 52 International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology 1155 (2002) 中發現，本文通過引用將其完整引入。發酵的殘留材料的分離發酵的殘留材料(如發酵的殘留材料17)可通過例如離心、沉澱，過濾和用膜、旋 流器處理等分為富含固體的部分(如富含固體的部分18)和主要液體的部分(如液體部分 19)。在一些實施方式中，發酵的殘留材料可直接分離成產品材料和富含固體的材料。 這種方法的例子是從靜止底部為富含固體的材料(例如，富含固體的材料18)的厭氧處理 原料蒸餾乙醇。在其他的實施方式中，如當產品是氣體(如氫或甲烷)時，可以通過從發酵罐除去氣相而在發酵罐中發生從發酵的殘留材料(如發酵的殘留材料17)分離產品。當從 培養液直接分離產物時和當從發酵罐收集氣體產物時，可以對產物流進行額外的純化或處
理步驟。富含固體的材料富含固體的部分(如富含固體的部分18) —般含有木質纖維素材料和微生物細 胞。在一些實施方式中，這部分可能會被丟棄，用作動物飼料、肥料或掩埋。在其他的實施 方式中，可以用機械、化學、熱方法或這些方法的組合處理這些固體。處理的固體可以具有 回收的其它產物，或它們可以在該過程的上遊點回收，或者它們可以例如在額外的發酵步 驟中處理。在一些實施方式中，可以處理富含固體的材料以分離含有糖和/或營養物的主 要液體的部分。可以以與材料的剩餘部分同樣的方式或不同的方式利用這種主要液體的部 分。處理的固體的隨後發酵在各種實施方式中，將分離的富含固體的部分返回至較早的培養步驟中，以便比 以另外的方式可能實現的更完全地將植物聚合物轉化為糖和有用的產品。在一些實施方式 中，與「單程」方法相比，更溫和的處理和/或更經濟的處理步驟是可能的，因為木質纖維素 材料會由於微生物對原料作用的結果而被明顯軟化。此外，由在該方法的培養階段生長的 細胞釋放的細胞材料的循環利用可以作為在那些階段中的營養物，這導致成本降低。在其他的實施方式中，用另外的生物體培養經處理的處理固體以產生燃料和/或 其他化學產品。優選的生物體包括那些快速利用只是被用於厭氧培養步驟中的微生物緩慢 利用的糖的生物體。此步驟產生的產物可能與厭氧發酵步驟中產生的產品相同或不同。任選的需氧生物反應器預處理在一些實施方式中，預處理或未預處理的木質纖維素材料可以任選地與同時 和/或順序地促進糖化和氧消耗的活性纖維素水解性需氧微生物(例如，裡氏木黴 (Trichoderma reesei))接觸。糖化酶的原位產生可以減少處理成本，且除去氧產生了適於 纖維素水解性厭氧微生物生長的環境。在一個實施方式中，將包含至少一種纖維素水解性需氧微生物的培養物添加到原 料中。如需要，額外的營養物(如氮源、維生素、礦物質和微量元素)可以通過微生物添加。 加入足夠的接種體以在合理時間內提供良好的生長。可以控制或緩衝PH值到微生物的合 適的範圍。如需要，可以為生物體提供通風，並將溫度操控在合適的範圍內。在另一實施方式中，如上，將包含至少一種纖維素水解性需氧微生物的培養物添 加到含有對於需氧細胞增殖足夠的原料和營養物的漿料中。將這種培養物維持在對於生物 體適當的溫度和PH值並結合足夠的通風以支持生物體生長。此外，可以使用富氧氣流來代 替或與空氣流結合，以達到所需要的細胞活性或溶解氧含量。在需氧發酵末期，如通過監測木質纖維素基質的水解速率或其他適當的方法所確 定的，減少通風以使生物體消耗剩餘的氧，以準備用於厭氧培養的生長。可以採用各種方法 以降低氧含量。例如，在批培養中，可以簡單地關閉進風，或可以用氮氣或氧耗減的氣流取 代空氣。可選擇地，可以將培養物轉移(例如，通過管道)到另一個容器，並在轉移過程中， 將培養物與氧供應切斷。在連續培養中，培養液可以通過其中不添加氧的區域。這樣的區 域可以是生物反應器的部分、管道、另一容器等。實施例實施例1. MBl培養基的製備可以在燒杯中通過混合以下成分製備MBl培養基a. 750毫升雙蒸水b. 8 克 K2HPO4c. 4 克 KH2PO4d. 1 克(NH4)2SO4e. 6克半胱氨酸f. 6克Amberex695AG 6克(經濟的酵母提取物可以使用Bacto)g.底物-例如，纖維二糖、葡萄糖、纖維素以及本文所述的其他底物如果底物是不溶性的(如玉米秸稈、紙漿(paper sludge))，培養基的pH值在沒有 底物的情況下進行調整。將培養基分布於分離的容器中，並將底物分別添加到各個容器中。 接種體繁殖(inoculumpropagation)的標準品為0. 3%的纖維二糖。用NaOH或KOH將pH 值調整到7. 50。將ddH20添加至IL的體積。將培養基分布於獨立的容器中，密封，並使得 絕氧。將培養基在設定為121°C的液體中高壓滅菌持續最少20分鐘。如果高壓滅菌器中 的總體積大於3升或容器容納大於500毫升，那麼時間增加。可以使用其他時間和溫度，限 制是過多熱量或過長時間可能會破壞糖底物。可以由Sensient Flavors Co. , 330S. Mill Street, Juneau WI53039 (920-386-4527)獲得 Amberex 695AG。可以在高壓滅菌前添加底物。並不需要使用刃天青(Resazurin)。任選地，可以添 加刃天青以保證該容器是絕氧的。將所有成分都放入燒杯中。加入水，且如果需要，用6N KOH調整pH至pH 7.50。用微波加熱混合物至剛剛沸騰。迅速取出後，使用Hungate方法 用來形成絕氧或使用真空歧管來用氮氣使試管或燒瓶絕氧。如果使用真空歧管，則培養基應置於適用橡膠隔片的試管或/瓶中。凸緣試管(如 Cat#2048-11800 Bellco Glass Inc，Vineland NJ)通常用橡膠隔片密封，或對於較大的培 養體積，使用配備位於螺絲蓋的適當位置的適當大小的橡膠隔片的螺絲蓋瓶/燒瓶。隨後 可以用無菌針刺穿試管和燒瓶的橡膠隔片，以加入接種物或底物或取出樣品進行分析。實施例2. GS-2培養基的製備可以在燒杯中通過混合以下成分製備GS-2培養基a. 750毫升雙蒸水b. 2. 90 克 K2HPO4c. 1. 50 克 KH2PO4d. 2. 10 克尿素e. 2. 00克鹽酸半胱氨酸f. 10. 00 克 MOPSg. 3. 00克二水合檸檬酸三鈉h. 6 克 Bacto 酵母提取物(Catalogueii2I275O Becton, Dickinson Co.)i. 1.00毫升0. 的刃天青
j.底物-例如，纖維二糖、葡萄糖、纖維素以及本文所述的其他底物添加ddH20到補足900mL。如果底物是不溶性的(玉米秸稈、紙漿)，在沒有底物的 情況下調整PH值。然後將培養基分布於單獨的容器中，並將底物分別添加到各個容器中。 接種體繁殖的標準品為0. 3%的纖維二糖。用NaOH或KOH將pH值調整到7. 50。將培養基轉移到圓底燒瓶中並用微波加熱至沸騰，而不將培養基沸騰。將燒瓶放 置在Himgate儀器附近的加熱的攪拌板上，並保持加熱至恰未沸騰，同時用氮氣衝洗，直到 培養基「去粉紅色(cbpinks) 」。在恆定的氮氣氣氛下，將8. 7毫升分配到各管，用氮氣衝洗直到刃天青無色。冷卻 培養基至室溫，然後，在冰浴中冷卻10分鐘。將管放置在具有向下牢固地擰緊在塞子頂部的頂板和墊的壓熱鍋(autoclave press)中。(使用在底部具有橡膠墊的試管架以避免管開裂。)將培養基在設定為121°C的液體中高壓滅菌持續最少20分鐘。如果高壓滅菌器中 的總體積大於3升或容器容納大於500毫升，那麼增加時間。可以使用其他時間和溫度，限 制是過多熱量或過長時間可能會破壞糖底物。經過高壓滅菌後，使得試管達到室溫，並從壓 熱鍋中取出。使用Hungate儀器和恆定的氮氣流，添加1. 0毫升的無菌GS-2鹽。高壓滅菌後， 加入10% ν/ν的GS-2鹽。GS-2鹽的配方如下GS-2 鹽a. ddH20100 毫升b.MgCl2*6H20 1. 0 克c.CaCl2*2H20 0. 15 克d. FeS04*7H20 0. 00125 克可以使得培養基絕氧或需氧地使用。如果有氧，添加時培養基會變成微粉紅色；它 由於培養基中的半胱氨酸會很快地去粉紅色。如對培養基(上文)一樣高壓滅菌。在二者都冷卻之後和接種前，向培養基添加10% ν/ν的鹽如果是培養基管，則達 到最終的10毫升體積，9mL的GS-2培養基和ImL的GS-2鹽。實施例3.培養基高壓滅菌程序高壓滅菌設定溫度為121°C，其相當於15psi的壓力。液體循環如果高壓滅菌器中的培養基總體積小於或等於3升，運行20分鐘，如果 高壓滅菌器中的培養基的總體積大於3升或如果單獨的容器容納500毫升或更多，增加高 壓滅菌的時間。高壓滅菌器循環的時間和溫度的最大限制因素是，存在著培養基中的可溶性糖的 「焦糖化(carmelizing)」的危險-它會變成深褐色且結構變化。這改變了糖的性質，因而 應該避免。Ml10毫升培養基體積Bellco玻璃厭氧管，20mm的嘴* 具有 Bellco blue 20mm 塞的塞子* 具有 Wheaton grey 20mm 塞的塞子
20
*來自Bellco或Wheaton的具有20mm鋁捲曲的捲曲*來自Bellco orWheaton的用〃捲曲機〃工具固定的捲曲Hungate管*管是只對於 $8/管的特定型號*塞子是綠色橡膠，漸縮的用於適配，可用於各種位置50mL的培養基體積血清瓶，20mm的嘴* 具有 Bellco blue 20mm 塞的塞子* 具有 Wheaton grey 20mm 塞的塞子*來自Bellco或Wheaton的具有20mm鋁捲曲的捲曲*來自Bellco或Wheaton的用〃捲曲機〃工具固定的捲曲100-200毫升培養基體積分刻度的250mL血清瓶，30mm的嘴* 具有 Wheaton grey 30mm 塞的塞子*來自Wheaton的具有30mm鋁捲曲的捲曲*來自Wheaton的用〃捲曲機〃工具固定的捲曲< 200毫升的培養基分刻度的250mL螺絲蓋培養基瓶體積*用EDPM凍乾式黑色塞子塞住的*用塑料螺絲帽W/中心孔固定的分刻度的500mL、l升或2升螺絲蓋培養基瓶*用EDPM凍乾式黑色塞子塞住的*用塑料螺絲帽W/中心孔固定的^MM 4. AU吝養基去除氧,的稈序絕氧指示劑刃天青-粉紅=有氧無色=厭氧當培養基進入高壓滅菌器時，刃天青應該是無色的。如果是粉紅色的，容器中存在氧。但是，半胱氨酸是緩慢的還原劑，在充氣後對於100毫升的瓶去粉紅色耗時10分 鍾是不尋常的。如果當培養基從高壓滅菌器出來時它仍然是粉紅色或在搖晃新從高壓滅菌器取 出的容器後變成粉紅色，則氧存在。當充氣MBl時如果培養基太暗以至於不能可靠地觀察刃天青的顏色，那麼準備 具有等於分布的培養基容器體積的絕氧指示劑溶液的容器。絕氧指示劑溶液的配方如下絕氧指示劑溶液100毫升a. 100 毫升 ddH20b. 0.06克半胱氨酸d. 0.01毫升的刃天青溶液對同時具有培養基的絕氧指示劑溶液的容器充氣和使用清晰可見的刃天青反應 來判斷培養基需氧條件。真空歧管的程序這是設計用於製備捲曲蓋管和燒瓶中的無氧環境、HPLC緩衝液的過濾、殘留底物過濾和真空乾燥的多功能裝置。打開氮氣罐a.檢查以觀察氮氣罐正確地連接到調節器。i.如果關閉通過放鬆調節器前的黃銅T型閥來緩解隔膜(diaphragm)上的壓 力，然後打開氮氣罐頂部的閥門ii.用大的黑色刻度盤調整調節器壓力至3或4psiiii.調節調節器側的小銅刻度盤以讓氮氣流向N2/真空選擇閥激活冷阱和真空泵iv.移動冷阱W的頂部/浸泡冷卻器探針進入阱桶中，打開冷卻器。v.等待10分鐘使得探針冷卻阱；你會發現防凍劑凍結到較低的線圈。vi.通過按冷卻器旁邊的電源板上的開關打開真空泵。b.脫氣管和燒瓶i.將22號針應用於真空歧管的5個埠中的各個。你可以重複使用針。ii.關閉主歧管上的所有5個黑色塑料閥。不調整連接到超壓釋放閥的第六個黑 色塑料閥。iii.刺穿你的管或燒瓶的隔片iv.使用玻璃傾斜雙聯閥選擇真空功能v.打開5個黑色塑料歧管閥並將真空應用到各個埠。vi.以300mBars或更低的壓力使管真空2分鐘，使小於500毫升的燒瓶真空2分 鍾，使500毫升以上的燒瓶真空5分鐘vii.調整玻璃選擇閥至氮氣，並衝洗管，直到過壓安全閥底部的白色聚四氟乙烯 球發出丁當聲。(大約20秒)viii.檢查以觀察液體表面停止起波紋(大約5秒鐘以上)ix.調整玻璃傾斜雙聯閥來重複真空循環χ.用氮第三次衝洗後，從隔片移除針，關閉所有5個埠，調整傾斜雙選擇器至真 空並切換到5個新的管或燒瓶。c.過濾HPLC緩衝液i.關閉主歧管上的所有5個黑色塑料閥。不調整連接到超壓釋放閥的第六個黑色 塑料閥。ii.將通過單孔塞將側臂錐形過濾燒瓶連接到大的金屬歧管。用#8塞子密封其餘 端□。iii.將0.45微米過濾器放置在過濾器支架中，用夾子固定，並置於錐形燒瓶中iv.使用玻璃閥打開真空管到歧管上。v.將緩衝液倒入過濾器漏鬥並重複直到溶液過濾vi.關閉到真空泵的真空管角的玻璃閥vii.用黑色刻度盤打開歧管埠，以恢復到大氣壓力viii.除去過濾的緩衝液。d.過濾殘留底物i.關閉主歧管上的所有5個黑色塑料閥。不調整連接到超壓釋放閥的第六個黑色
22塑料閥。ii.將玻璃過濾漏鬥放置於歧管上的6個埠的各個中。iii.將預先稱重的0. 45微米過濾器放置於各個漏鬥中iv.確保用於過濾歧管的液體阱是空的。v.將上清液倒入過濾漏鬥vi.調整玻璃閥以將真空管應用於歧管。vii.當過濾完成時，關閉玻璃閥以阻止真空流。通過打開黑色塑料閥恢復到大氣 壓力viii.除去濾紙和殘留固體e.激活真空爐i.關閉主歧管上的所有5個黑色塑料閥。不調整連接到超壓釋放閥的第六個黑色 塑料閥。ii.將乾燥爐真空管通過單孔塞連接到歧管。用#8塞子密封其餘埠。iii.調整玻璃閥以將真空管應用於乾燥爐。iv.使用爐頂部的刻度盤以調節壓力。當達到預期的壓力時密封閥。v.當完成時，關閉玻璃閥以阻止真空流。關機f.關閉玻璃閥以阻止通過歧管的真空流。g.關閉真空泵。h.關閉冷卻器。i.通過調節器側面的小銅刻度盤關閉氮氣流。你可以使罐開放。i.通過打開歧管前面的黑色塑料閥使歧管恢復到大氣壓力。HunRate 程序打開 Hungatea.滑動玻璃管，使得所有的銅在加熱單元之內。b.通過向下翻轉開關打開變阻器至120伏特上面的刻度盤調節熱_ 一旦調整， 不要動！c.打開氮氣i.垂直於顯示器的大旋鈕應該是松的ii.打開罐上的主閥iii.大旋鈕擰緊，直到左側的刻度盤中的針移動。它不是必須移動許多。該旋鈕 調節隔膜片上的彈簧，其調節流量；它們可能通過壓力的突然變化損壞，這就是在打開罐時 為什麼它應該松的原因。iv.通過使用調節器上的小的側面旋鈕(連接顯示器)調節流量。允許小流量只 通過一個埠，直到預備好為培養基加氣；這確保了氮氣相對於大氣的正向流動。d.使用Hungate前，允許用空氣流加熱銅(copper) 40分鐘。使用Hungate以使培養基除氣(gas out)a.轉移培養基至燒瓶，並在微波爐中或加熱板上加熱至沸騰_不要煮沸溢出。b.將燒瓶放置在Himgate儀器附近的加熱的攪拌板上。保持燒瓶恰低於沸騰下加熱，並用來自Himgate的氮氣衝洗直到培養基去粉紅色。分配的同時繼續衝洗和加熱。c.將培養基分配到容器，各用氮氣衝洗。輕輕地將塞子置於衝洗套管上。*在分配過程中培養基變為微粉紅色衝洗直到去粉紅色，同時在冰浴中冷卻至 略低於室溫。*d.取出套管，同時保持塞子向下，以最小化大氣汙染。e.將管架放置於管架壓力機中。固定用於其他容器的塞子。如對於容器和總體積 (如上所述)適宜地進行高壓滅菌。關閉 Hungatea.除了 一個之外，所有埠應關閉，通過該埠具有非常小的流量。b.關閉變阻器開關應在中間位置(最多=140伏)。c.滑動玻璃管，使得所有的銅在加熱元件之外。d.關閉氮氣前使得銅冷卻15-20分鐘(直到徒手觸摸舒適)。e.關閉氮氣i.關閉主罐閥ii.等待兩個刻度盤指針靜止於零。iii.當兩個錶盤讀數為零時，通過逆時針轉動大的旋鈕直至變松以釋放隔膜片調 節器實施例 5.發酵條件-C. phytofermentans溫度35°C或30°Ca. 35°促進生長，並用於可溶性底物b. 30°用於不溶性底物Sft 試管培養在沒有攪拌的情況下靜態生長。培養物可以靜態地或以不同的攪拌速度在燒瓶中生長。如果底物是不溶性的(即 Avicel)那麼攪拌是有用的，且可獲得的底物表面積可能是限制因素。調整攪拌速度以保持 底物懸浮，且這根據底物的類型和底物濃度變化。pH 倌7. 50 (見培養基 SOP)C. phytofermentans可以在6. 5-8. 5的pH值下生長，最好在較高的中間範圍內。^M 0. 3%纖維二糖-維持接種物的標準物高於2. 5%可能會導致抑制。一些人證明了依賴葡萄糖的生長抑制纖維素酶產生，這種抑制在轉移到纖維素前 向纖維二糖的中間轉移是可逆的。轉移條件通常情況下，C. phytofermentans的工作原液作為含0. 3%纖維二糖的GS-2或MBl 培養基中活躍生長的植物性培養而保持。使用用於試管中繁殖的2%接種體積，將培養轉 移生長的中對數期(見下文)。通常使用10%接種體積接種生物反應器。可以調整接種體 積，以實現需要支持實驗要求的時間的中對數期生長。通過測量660nm波長處的OD可以確 定C. phytofermentans的生長(圖2)。中對數的OD為底物依賴的a. 0. 3%底物0D 660nm處轉移0. 500-0. 700吸光度單位，底物是限制的，且培養 物在0. 700吸光度單位後不久進入靜態生長
b. 1% +底物0D處轉移0. 500-0. 700吸光度單位實施例6.冷凍C. phytofermentans原液的製備為了製備C. phytofermentans的冷凍原液，製備中對數期培養，加入等體積的無 菌甘油(30%原液)，並放於-80°C冰箱內。這些冷凍原液可以無限期儲存。為了使冷凍原 液恢復活性，在冰上解凍原液，而且將培養物挑染到適當的瓊脂板上或者2%的接種體用於 液體培養基中，通常在試管中。如果將培養物挑染到瓊脂板上，那麼在30°C的3至5天的無 氧接種可取得良好的生長。無菌接種環用於將單一菌落轉移到微離心管中的1毫升無菌培 養基(GS-2或MB 1)中，並攪拌以產生細菌細胞的懸浮液。無菌注射器用於吸取細菌懸浮 液，並將它接種到密封的絕氧試管中。如果將解凍的培養物直接加入到試管中，則無菌注射 器用於吸取適當體積(2%的接種體積是典型的)的微生物細胞懸浮液，並通過含GS-2或 MB-I培養基的密封無氧試管的隔膜注射它。所有這些操作都在絕氧手套箱中進行的。使冷 凍培養恢復活性後，在作為營養工作原液使用之前，允許至少2次分培養事件。這使得冷凍 的原液適應在液體培養中生長並產生可靠的生長動力學。實施例7.糖和乙醇分析產物形成和剩餘底物濃度的數據來自HPLC分析。1)無氧地對培養物採樣優選22號針用於通過塞子無氧取樣。遵循以下步驟a.將無氧氣體吸入注射器，並排空注射器至少兩次b.吸保持等於樣品體積的量的無氧氣體進入注射器c.將無氧氣體注入容器中d.採取樣品(通常1至1. 5毫升)2)將樣品放置於微量離心機並以12000rpm離心10分鐘。3)上清液用0. 45微米注射器過濾器過濾進入HPLC取樣瓶的(可以使用插入物)。4)使用在55 °C下運行的Aminex HPX-87H柱用0. 005mM的硫酸流動相，通過高壓液 相色譜進行樣品分析。也可以用在樣的柱上或使用水流動相在80°C下的Aminex HPX-87P 柱，對纖維二糖的濃度進行定量。實施例8.對於培養物汙染的評估可以以各種方法檢測汙染。例如a.通過在顯微鏡下觀察樣品。如果看到除了 C. phytofermentans之外的其他任何 東西，則樣本被汙染。b.通過監測培養物的pH值，如果pH值低於6. 8，則懷疑受到汙染。c. HPLC數據有時可以表明更常見的汙染物中的一種如果檢測到非常大量的乳 酸，則培養物被汙染。d.可以將培養物的樣品挑染到瓊脂板上(參見，用於瓊脂培養基的S0P，以得到對 於C. phytofermentans選擇性的瓊脂或其他瓊脂的配方)。如果形態明顯不同的菌落在畫 線路徑上生長，則培養汙染。可以用於本文所述的實施例中的試劑的例子和訂購詳情如下表所述。厭氧管 藍色20mm塞子 灰色20mm塞子 20mm iaJ^^j
20mm捲縮機
血清瓶
Hungate管w/塞子 Hungate壓熱鍋
分刻度的250mL血清瓶 灰色30mm塞子
訂購詳情 Bellco 2048-00150 Bellco 2048-11800 VWR 16171-650
Bellco 2048-11020/VWR 16171-829 或 VWR 16171-851
(撕開)
Bellco 2048-10020/VWR HP9301-07
VWR 16171-385
特殊訂貨項目 特殊訂貨項目
30mm 的嘴VWR 16171-420
VWR 16171-630
2630mm鋁捲曲 30mm捲縮機
250mL螺絲蓋培養基瓶
黑色橡膠EDPM塞子 用於W/注射器的帽W/孔
VWR 16171-862 VWR 26676-406
VWR 89000-236 (具有這種可用的類型開口的其他大, 的瓶)
VWR 16171-620 VWR 16149-145
K2HPO4
KH2PO4
(NH4)2SO4
水合鹽酸半胱氨酸
Amberex酵母提取物
D-(+)-纖維二糖
D-葡萄糖，無水
尿素
MOPS
二水合檸檬酸三鈉 Bacto酵母提取物 刃天青 LB培養肉湯 Bacto-瓊脂 MgCl2MH2O CaCl2*2H20 FeS04*7H20
Sigma-Aldrich P3 786 Sigma-Aldrich P5379 Sigma-Aldrich A2939 Sigma-Aldrich C7880 Sensient 695AG MP Biomedicals 101298 Mallinckrodt Chemicals 4912-12 Sigma-Aldrich Ul250 Sigma-Aldrich M1252 Sigma-Aldrich S4641 BD 212750 Sigma-Aldrich R7017 VWR 900003-118 Difco 0140-01 Sigma-Aldrich M2670 Sigma-Aldrich 223506
Sigma-Aldrich 215422 雖然本文已經顯示和描述了本發明的優選方式，對於本領域的技術人員顯而易見 的是，提供這樣的實施方式只是為了舉例。在不背離本發明的情況下，本領域的技術人員可 以想到許多變化、改變和替換。應該理解，在實踐本發明時，可以使用本文所述的本發明的 實施方式的各種替代方案。意味著下列權利要求定義本發明的範圍，因此這些權利要求範 圍內的方法和結構及其等價物由本發明覆蓋。
權利要求
一種用於產生乙醇和其他化學產品的方法，包括提供包含植物多糖的預處理的源自生物質的材料；在氧的存在下，用包含纖維素水解性需氧微生物的第一培養物接種所述的預處理的源自生物質的材料，以產生需氧培養液，其中，所述需氧微生物能夠至少部分地水解植物多糖；孵育所述需氧培養液直到所述纖維素水解性需氧微生物消耗至少一部分氧和水解至少一部分植物多糖，從而將需氧培養液轉化成包含具有可發酵糖的水解產物的厭氧培養液；用包含能夠將可發酵糖轉化成為乙醇和其他化學產品的厭氧微生物的第二培養物接種所述厭氧培養液；和發酵接種的厭氧培養液，直到可發酵糖的至少一部分被轉化成乙醇和其他化學產品。
2.根據權利要求1的方法，其中，從發酵的厭氧培養液回收至少一部分乙醇。
3.根據權利要求1或2的方法，進一步包括溶解發酵的厭氧培養液中的需氧和厭氧微 生物，以產生包含剩餘的可發酵糖和細胞內容物的溶解產物。
4.根據權利要求3的方法，進一步包括對所述溶解產物進行另外的物理和/或化學處理。
5.根據權利要求3的方法，進一步包括用能夠加快剩餘的可發酵糖轉化為乙醇和其他 化學產品的另一種微生物和/或酶混合物接種所述溶解產物。
6.一種用於製造適合作為燃料的材料的方法，包括 提供包含多糖的源自植物的材料；用包含纖維素水解性需氧微生物的第一培養物接種所述源自植物的材料，以產生需氧 培養液，其中，所述需氧微生物能夠至少地部分水解多糖；在氧的存在下，孵育所述培養液，使得多糖的至少一部分水解成為一種或多種糖類物質；在一定條件下孵育所述培養液以降低氧濃度，從而將所述培養液轉化為厭氧培養液； 用包含能夠將所述的一種或多種糖類物質轉化成適合作為燃料的材料的厭氧微生物 的第二培養物接種所述厭氧培養液；發酵接種的厭氧培養液，以產生適合作為燃料的材料。
7.根據權利要求6的方法，其中，從發酵的厭氧培養液回收至少一部分適合作為燃料 的材料。
8.根據權利要求6或7的方法，進一步包括溶解發酵的厭氧培養液中的需氧和厭氧微 生物，以產生包含細胞內糖和細胞內容物的溶解產物。
9.根據權利要求8的方法，進一步包括對所述溶解產物進行另外的物理和/或化學處理。
10.根據權利要求9的方法，進一步包括用另一種微生物接種所述溶解產物。
11.根據權利要求6的方法，其中，所述源自植物的材料在用纖維素水解性需氧微生物 接種之前進行預處理。
12.根據權利要求6的方法，其中，所述適合作為燃料的材料包括乙醇。
13.一種製造乙醇和其他化學產品的方法，包括2提供包含植物多糖的源自生物質的材料；在厭氧條件下，用包含Clostridium phytofermentans細胞的第一培養物接種所述源 自生物質的材料，以水解植物多糖的至少一部分，其中，所述培養物的細胞吸收水解的植物 多糖的至少一部分作為細胞內化合物；溶解Clostridium phytofermentans細胞以產生溶解的培養液； 用包含能夠將可發酵糖轉化為乙醇和/或其他化學產品的厭氧微生物的第二培養物 接種所述溶解的培養液；和發酵接種的厭氧培養液，直到可發酵糖的至少一部分被轉化成乙醇和/或其他化學產PΡΠ O
14.一種生產生物燃料的方法，包括如下步驟在厭氧條件下在封閉的容器中提供生物質材料，其中，所述生物質沒有用外源供給的 化學產品或酶進行處理；用非遺傳修飾的厭氧細菌的第一培養物處理所述生物質，其中，所述非遺傳修飾的厭 氧細菌將生物質的至少一部分轉化為單糖和二糖；和用非專性需氧的微生物的第二培養物處理所述生物質，其中，所述單糖和二糖轉化為 生物燃料。
15.根據權利要求14的方法，其中，所述非遺傳修飾的細菌的第一培養物是 Clostridium phytofermentans0
16.根據權利要求14的方法，其中，所述微生物的第二培養物選自釀酒酵母、運動發酵 單胞菌、丙酮丁醇梭菌、C. phytofermentans、熱纖梭菌、食纖維梭菌。
17.根據權利要求14的方法，進一步包括溶解發酵的厭氧培養液中的需氧微生物，以 產生包含剩餘的可發酵糖和細胞內容物的溶解產物。
18.根據權利要求17的方法，進一步包括對所述溶解產物進行另外的物理和/或化學 處理。
19.根據權利要求14的方法，進一步包括從殘留的生物質和培養基分離和回收轉化的 生物燃料。
20.根據權利要求14的方法，其中，所述生物質包括含纖維素和半纖維素的材料。
21.根據權利要求14的方法，其中，所述生物質包括木質素。
22.根據權利要求22的方法，進一步包括將所述生物質與具有足以水解含木質素的生 物質的至少一部分的濃度的鹼性水溶液接觸，並中和處理的生物質至7-8的pH。
23.一種生產生物燃料的方法，該方法包括在中溫條件下，在Clostridium phytofermentans和選自丙酮丁醇梭菌、熱纖梭菌和食纖維梭菌的第二種梭菌屬細 菌的共培養物存在下，使包括含纖維素和半纖維素的植物材料的生物質進行發酵，所 述培養物的比例為使得纖維素乙醇和半纖維素乙醇的轉化率高於通過單獨使用 Clostridiumphytofermentans或所述第二種梭菌屬細菌獲得的轉化率的量。
全文摘要
本發明公開了將複雜的植物多糖(包括纖維素材料)轉化為燃料和其他化學產品的方法。在優選的實施方式中，該方法包括通過兩種或多種微生物順序水解植物多糖。
文檔編號C12R1/145GK101981199SQ200980110745
公開日2011年2月23日 申請日期2009年2月27日 優先權日2008年2月27日
發明者J·基爾貝恩, W·G·拉圖夫 申請人:奎特羅斯公司