基於GO和GQDs之間ECL-RET作用的傳感器製備方法及激酶檢測應用的製作方法
2023-05-18 13:56:11
基於GO和GQDs之間ECL-RET作用的傳感器製備方法及激酶檢測應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於GO和GQDs之間ECL-RET作用的傳感器製備方法及激酶檢測應用，屬於電致化學發光領域；它先將殼聚糖滴塗於電極表面，通過共價作用先後將石墨烯量子點和多肽組裝到電極表面；在蛋白激酶和三磷酸腺苷的作用下，多肽發生磷酸化，通過抗原-抗體之間的特異性識別作用，磷酸化抗體共軛的氧化石墨烯被組裝到多肽的磷酸化絲氨酸位點上，拉近了氧化石墨烯和石墨烯量子點之間的距離，使得石墨烯量子點的電致化學發光被猝滅。蛋白激酶的濃度越大，多肽修飾電極表面產生的磷酸化位點越多，組裝於傳感界面的氧化石墨烯就越多，對石墨烯量子點的電致化學發光猝滅效應越強，實現了對蛋白質激酶的高靈敏檢測。
【專利說明】基於GO和GQDs之間ECL-RET作用的傳感器製備方法及激酶檢測應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及電致化學發光領域，尤其涉及一種基於GO和GQDs之間ECL-RET作用的傳感器製備方法及激酶檢測應用。
【背景技術】
[0002]石墨烯是一種二維自由態原子晶體，它是構築維富勒烯、一維碳納米管、三維體相石墨等SP2雜化碳的基本結構單元，自2004年首次報導以來，引起了國內外研究者們的極大關注。石墨烯優良的電化學、力學和熱力學性質，使得其廣泛應用於聚合物材料、傳感器、與能量相關的材料和場效應電晶體等研究。然而，石墨烯是一種零帶隙材料，很難觀察到其發光現象。因此，運用各種方式處理石墨烯的帶隙並拓展其發光應用，引起了科學家極大的研究興趣，如，通過摻雜打開石墨烯的帶隙，通過部分還原和表面鈍化利用氧化石墨烯(GO)，將石墨烯材料腐蝕切割成石墨烯量子點(GQDs)以誘導其光致發光(PL)等。尤其是新發現的GQDs，為電致化學發光(ECL)研究和應用提供了良好材料。然而，迄今為止，GQDs在ECL方面的研究應用非常少。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在於提供了一種基於GO和GQDs之間ECL-RET作用的傳感器製備方法及激酶檢測應用，它製備的傳感器具有檢測靈敏、選擇性好和穩定性好的優點。
[0004]本發明是這樣來實現的，一種基於氧化石墨烯和石墨烯量子點之間電致化學發光能量轉移(ECL-RET)作用的傳感器製備方法，其特徵在於所述製備方法包括以下步驟:
(1)採用Hummers方法製備GO:將1.0 g石墨和1.0 g NaNO3加入到46 mL的質量百分濃度為98%的H2SO4中，冰浴下緩慢加入6.0 g KMnO4,於35 ° C水浴中攪拌I h，加入80 mL超純水，繼續攪拌30 min，再加入200 mL超純水後，逐滴加入6 mL的質量百分濃度為30%的H2O2，室溫下反應I h ;將產物趁熱過濾並用超純水清洗至濾液為中性，將產物分散到500 mL超純水中，超聲處理2 h，即製得均勻分散的GO ；
(2)利用水熱法製備GQDs:將乾燥的GO置於管式爐中，在N2保護的條件下，以5° C/min的升溫速率加熱到200 ° C並保持2 h，得到石墨烯片；將0.05 g石墨烯片加入到體積比為1:3的濃硫酸:濃硝酸的混合溶液中超聲17 h，加入250 mL超純水稀釋；用0.22 Mm微孔濾膜過濾，將收集的濾餅懸浮在40 mL超純水中，用NaOH調節溶液pH為8後，轉移入反應釜中於200 ° C反應12 h，冷卻到室溫；用0.22 Mffl的微孔濾膜過濾除去大體積的石墨烯片，得到的棕色濾液即為GQDs溶液；所述的濃硫酸的質量百分濃度為98%，濃硝酸的質量百分濃度為68% ；
(3)羧基化GQDs的製備:將0.05 g的NaOH和0.1 g的氯乙酸鈉加入到20 mL的GQDs溶液中，超聲反應3 h，用鹽酸調節溶液pH為中性，即得到羧基化的GQDs ；
(4)抗磷酸化絲氨酸抗體氧化石墨烯(Ab-GO)複合物的製備:將200μ?Λ mg/mL的GO和200 μ?、5 Pg/mL的抗磷酸化絲氨酸抗體(Ab)混合，室溫條件下反應12 h ;將產物在10000 rpm下離心30 min，用超純水清洗3次，將產物重懸於10 mM、pH 7.4的磷酸鹽(PBS)緩衝溶液中，4 °(:下保存；
(5)ECL傳感器的製備:玻碳電極先在粒徑為1.0，0.3，0.05 Mm的Q-Al2O3糊中拋光，再用乙醇和水超聲清洗I min。將10 μ L、質量百分濃度為0.5%的殼聚糖溶液滴塗到玻碳電極表面並晾乾後，將電極浸入到含有5 mM的N-乙基-N』 -1-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的羧基化GQDs溶液中，室溫下孵化5 h ;用10 mM、pH 7.4的PBS緩衝溶液清洗後，將電極插入到含有5 mM的EDC、8 mM的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)和50 μ M的多肽溶液中反應3 h ;再將電極插入到含有蛋白激酶(CK2)和三磷酸腺苷(ATP)的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris)緩衝溶液中反應2 h，使多肽發生磷酸化；將磷酸化多肽修飾電極在Ab-GO複合物溶液中孵化I h，即製得ECL傳感器；上述步驟中，所述的殼聚糖溶液的配製方法為將殼聚糖加入到質量百分比為1%的醋酸溶液中並超聲溶解。所述的Tris緩衝溶液的濃度為20 mM, pH為?.4，包含20 mM的MgCl2。
[0005]激酶檢測應用是指傳感器對蛋白激酶活性及其抑制劑的檢測:隨著CK2濃度的增加，多肽修飾電極表面產生的磷酸化位點越多，組裝到GQDs修飾電極表面的GO就越多，在含有0.1 M Na2S2O8和0.1 M KCl的PBS緩衝溶液中，電極表面捕獲的GO對GQDs的電致化學發光產生的猝滅效應越強，使得ECL信號逐漸下降，0(2濃度在0.01-5 U/mL範圍內與ECL信號呈線性關係，對CK2的檢測限為0.023 U/mL ；ECL強度隨著CK2抑制劑濃度的增大而增強，當鞣花酸濃度為0.15 μΜ時，ECL信號達到最大，計算得到的鞣花酸的半抑制濃度為0.043 μΜ。所述的PBS緩衝溶液的濃度為0.1 M，pH為7.4。
[0006]本發明的技術效果是:本發明利用GO與GQDs之間的電致化學發光能量轉移，使得GO對GQDs的電致化學發光產生猝滅，構建了一種用於對蛋白激酶活性及其抑制劑檢測的ECL生物傳感器，此傳感器具有高靈敏度、檢測限低和穩定性好等特點。
【專利附圖】
【附圖說明】
`[0007]圖1是ECL生物傳感器檢測CK2活性和抑制劑的原理圖。
[0008]圖2是(A)GO和(B)GQDs 的透射電微鏡圖；(C)(a) GO、(b) GQDs 和(c) GQDs-COOH的FTIR圖；(D) GQDs-COOH的(a)紫外吸收光譜和(b)螢光光譜，內插圖為GQDs (I, 2)和GQD-C00H (3，4)在可見光(1，3)和紫外光(2，4)下的對比圖。
[0009]圖3是(a)玻碳電極，(b) CS、(c) GQDs/CS、(d)多肽/GQDs/CS修飾電極以及電極⑷在(e)磷酸化前和(f)磷酸化後在含0.1 M Na2S2O8和0.1 M KCl的PBS (0.1 Μ,ρΗ
7.4)中的ECL強度-電位圖。掃描速率為100 mV/s，光電倍增管的電位為800 V。
[0010]圖4 是(a)玻碳電極，(b) CS、(c) GQDs/CS、(d)多肽 /GQDs/CS、(e)磷酸化多肽 /GQDs/CS和(f) GO-Ab/磷酸化多肽/GQDs/CS修飾玻碳電極在含有5 mM的[Fe (CN) 6] 3_/4_和0.1 M的KCl的PBS溶液中的循環伏安和交流阻抗。掃描速率為100 mV/s，頻率範圍為
0.1-1O5 Hz和擾動電壓為5 mV。
[0011]圖5 是(a) CS、(b) GQDs/CS、(c)多肽/GQDs/CS和(d) GO-Ab/磷酸化多肽/GQDs/CS修飾電極的AFM圖。
[0012]圖6是不同濃度CK2的(A) ECL強度-時間曲線和(B)標準曲線。曲線a_j為0，0.1,0.5,2,5,7,10,20 U/mL 的 CK2。其他條件與圖 3 相同。[0013]圖7是(A)ECL強度與鞣花酸濃度的關係圖。(B)傳感器對鞣花酸、DRB、大黃素和槲皮素的選擇性。其他條件與圖3相同。
【具體實施方式】
[0014]下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步闡述，本發明並不限於此。
[0015]實施例1
(1)採用Hummers方法製備GO:將1.0 g石墨和1.0 g NaNO3加入到46 mL的質量百分濃度為98%的H2SO4中，冰浴下緩慢加入6.0 g KMnO4,於35 ° C水浴中攪拌I h，加入80 mL超純水，繼續攪拌30 min，再加入200 mL超純水後，逐滴加入6 mL的質量百分濃度為30%的H2O2，室溫下反應I h ;將產物趁熱過濾並用超純水清洗至濾液為中性，將產物分散到500 mL超純水中，超聲處理2 h，即製得均勻分散的GO ；
(2)利用水熱法製備GQDs:將乾燥的GO置於管式爐中，在N2保護的條件下，以5° C/min的升溫速率加熱到200 ° C並保持2 h，得到石墨烯片；將0.05 g石墨烯片加入到體積比為1:3的濃硫酸:濃硝酸的混合溶液中超聲17 h，其中濃硫酸的質量百分濃度為98%，濃硝酸的質量百分濃度為68% ;然後加入250 mL超純水稀釋；用0.22 Mm微孔濾膜過濾,將收集的濾餅懸浮在40 mL超純水中，用NaOH調節溶液pH為8後，轉移入反應釜中於200 ° C反應12 h，冷卻到室溫；用0.22 Mffl的微孔濾膜過濾除去大體積的石墨烯片，得到的棕色濾液即為GQDs溶液；
(3)羧基化GQDs的製備:將0.05 g的NaOH和0.1 g的氯乙酸鈉加入到20 mL的GQDs溶液中，超聲反應3 h，用鹽酸調節溶液pH為中性，即得到羧基化的GQDs ；
(4)抗磷酸化絲氨酸抗體氧化石墨烯(Ab-GO)複合物的製備:將200μ?Λ mg/mL的GO和200 μ?、5 Pg/mL的抗磷酸化絲氨酸抗體(Ab)混合，室溫條件下反應12 h ;將產物在10000 rpm下離心30 min，用超純水清洗3次，將產物重懸於10 mM、pH 7.4的PBS緩衝溶液中,4 ° C下保存；
採用透射電鏡(TEM)對GO和GQDs合成進行表徵。由圖可見，GO以單層或者2層形式存在，表面有皺褶(圖2A);當採用水熱合成法處理GO後，獲得了均勻分散且粒徑為3-5 nm的 GQDs (圖 2B)。
[0016]採用傅立葉紅外光譜(FTIR)對製備的GO和GQDs進行表徵(圖2C)。曲線a在3440 cm 1 ( u_oh)、1640 cm 1 ( uc=o)、1380 cm 1 ( uo_H)、1240 cm 1 ( u c-0/C00H)和 1052 cm 1(υ c_0_c)處呈現出GO的特徵吸收峰，表明成功製備了 G0。與GO相比，GQDs在1240 cnT1處C-0/C00H的伸縮振動減弱，而在1052 cnT1處環氧基團的伸縮振動消失(曲線b)，表明GO在熱還原過程中，邊緣和基底的含氧基團被破壞，除去了橋梁氧原子，被切割為小片的GQDs。為了將GQDs通過醯胺反應組裝到殼聚糖修飾電極表面，採用氯乙酸鈉對GQDs進行羧基化，由曲線c可見，在1725 cm \l240 cm 1和1052 cm 1處的吸收峰增強，表明採用本方法成功將GQDs羧基化，製備了 GQDs-COOH。
[0017]採用紫外-可見吸收光譜(UV-vis)對GQD-COOH的形成進行表徵(圖2D)。曲線a在310 nm處呈現出GQDs的微弱肩峰；採用光致發光法(PL)對GQDs和GQDs-COOH的光學性質進行了表徵(圖2D)。在310 nm激發下，GQDs (曲線b)和GQDs-COOH (曲線c)在450nm處均出現一個強吸收峰。而且，GQDs (I)和GQDs-COOH (3)在可見光下均為黃色溶液，在365 nm紫外燈的照射下，GQDs (2)和GQDs-COOH (4)均發出強烈的藍光，表明羧基化之後沒有改變GQDs的光學性質。
[0018]實施例2
ECL生物傳感器的製備過程
Cl)玻碳電極的預處理:玻碳電極在修飾之前，先在粒徑為1.0，0.3，0.05 Mm的a -Al2O3糊中拋光,再用乙醇和水超聲清洗I min ；
(2)ECL生物傳感器的製備過程如圖1所示。將10 μ L、質量百分濃度為0.5%的殼聚糖溶液滴塗到玻碳電極表面並晾乾後，將電極浸入到含有5 mM的EDC的GQDs-COOH溶液中，室溫下孵化5 h ;用10 mM、pH 7.4的PBS緩衝溶液清洗後，將電極插入到含有5 mM的EDC、8 mM的NHS和50 μΜ的多肽溶液中反應3 h ;再將電極插入到含有CK2和ATP的Tris緩衝溶液中反應2 h，使多肽發生磷酸化；將磷酸化多肽修飾電極在Ab-GO溶液中孵化I h，即製得ECL傳感器；
圖3為不同修飾電極在的ECL強度-電位圖。裸電極(曲線a)和殼聚糖修飾電極(曲線
b)的ECL強度很低；當將GQDs組裝到電極表面後，在-1.6 V處的ECL響應迅速增大(曲線
c);將多肽共價結合到GQDs/CS電極表面後，GQDs的ECL響應稍有下降(曲線d)，這可能是由於多肽增大了電極表面的電阻，從而降低了 Na2S2O8和GQDs的ECL反應速率；當沒有CK2存在時，電極表面的多肽不發生磷酸化，不能將Ab-GO捕獲到電極表面，因而，ECL響應僅稍有下降(曲線e);當向溶液中加入5 U/mL CK2和50 μΜ ATP後，電極表面的多肽發生磷酸化，在抗原-抗體的特異性識別作用下，Ab-GO被組裝到電極表面，從而拉近了 GO和GQDs之間的距離，GO與GQDs之間發生ECL-RET作用，導致GQDs的ECL響應大大降低(曲線f)。
[0019]採用電化學交流阻抗法對傳感器的製備過程進行表徵(圖4)。裸玻碳電極的電子傳遞阻力(Rrt)很低(曲線a);當將殼聚糖修飾到電極表面後，電極的Rrt增大(曲線b);將GQDs鍵合到電極表面後，Ret增加為605 Ω (曲線C)，這是由於GQDs帶負電，靜電排斥溶液中的Fe(CN)6] 3 74向電極表面傳遞；當將多肽修飾到電極表面後，Rrt增大為725 Ω (曲線d);當0(2和ATP將電極表面修飾的多肽發生磷酸化之後，Rrt繼續增大(曲線e);當通過抗原-抗體的特異性作用將Ab-GO組裝到磷酸化多肽修飾電極表面之後，Rrt進一步增大(曲線f)。以上結果表明，採用本方法成功實現了 Ab-GO在電極表面的組裝。
[0020]採用原子力顯微鏡(AFM)對生物傳感器的構建過程進行了表徵(圖5)。殼聚糖修飾玻碳基底表面較為光滑(圖5A);當將GQDs-COOH共價鍵合到玻碳基底表面後，AFM圖中出現了高度約2 nm的小突起(圖5B)，表明GQDs成功修飾到玻碳基底表面；將多肽共價組裝到GQDs修飾玻碳基底表面時，AFM圖中出現均勻的高度約6 nm的突起(圖5C)，表明多肽成功組裝到了玻碳基底表面；當將Ab-GO進一步捕獲到玻碳基底表面時，AFM圖中突起的高度增加至約30 nm (圖OT)，表明GO-Ab成功組裝到了基底表面。
[0021]實施例3
ECL生物傳感器用於檢測CK2
在最優實驗條件下，利用GO與GQDs之間的ECL-RET作用構建的ECL生物傳感器檢測CK2活性。由圖6A可見，隨著CK2濃度的增大，GQDs的ECL信號逐漸下降，當CK2濃度為30 U/mL時，ECL強度達到最大。圖6B為CK2檢測的標準曲線，CK2濃度為0.05_5 U/mL時，CK2濃度與ECL信號呈良好的線性關係，線性方程為I = 1621.6 - 142.7c(I為ECL強度，(:為0(2濃度)，檢測限為0.023 U/mL。本方法比採用電化學法和螢光法的檢測限低且線性範圍寬，表明本發明提出的ECL傳感器能高靈敏檢測激酶活性。
[0022]在含有0.1 M Na2S2O8^P0.1 M KCl 的PBS (0.1 Μ,ρΗ 7.4)溶液中，將組裝了 Ab-GO的玻碳電極在電位範圍為O到-1.6 V (vs Ag/AgCl)、掃描速率為100 mV/s條件下連續掃描，掃描22圈後GQDs的ECL信號仍然非常穩定,相對標準偏差為0.97%,表明傳感器具有良好的電位循環穩定性。對ECL傳感器的重現性和再現性進行了考察。在0(2濃度為2.5U/mL時，測量10次ECL響應以評估生物傳感器的批內分析精確度，批間分析精確度用製備的10根電極測量CK2，批內分析和批間分析的偏差係數分別為6.7% 和8.1%。以上結果表明，本發明設計的ECL生物傳感器具有良好的穩定性、重現性和再現性。
[0023]實施例4
ECL生物傳感器用於對CK2抑制劑的篩選
本研究以鞣花酸為例對CK2的抑制劑進行篩選研究(圖7)。GQDs的ECL信號隨著鞣花酸濃度的增加而增強，當鞣花酸濃度為0.15 μΜ時，ECL信號達到最大，鞣花酸對CK2的半抑制濃度為0.043 μΜ。還考察了另外三種非CK2特異性抑制劑如5，6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯丙咪唑(DRB)、大黃素和槲皮素對CK2活性的影響。由圖7Β可見，鞣花酸對CK2的抑制效果最強，表明本發明構建的生物傳感器對CK2抑制劑具有良好的選擇性。
【權利要求】
1.基於GO和GQDs之間ECL-RET作用的傳感器製備方法，其特徵在於所述製備方法包括以下步驟: (1)採用Hummers方法製備氧化石墨烯:將1.0 g石墨和1.0 g NaNO3加入到46 mL的質量百分濃度為98%的H2SO4中，冰浴下緩慢加入6.0 g KMnO4，於35 ° C水浴中攪拌I h，加入80 mL超純水，繼續攪拌30 min，再加入200 mL超純水後，逐滴加入6 mL的質量百分濃度為30%的H2O2，室溫下反應I h ;將產物趁熱過濾並用超純水清洗至濾液為中性，將產物分散到500 mL超純水中，超聲處理2 h，即製得均勻分散的氧化石墨烯； (2)利用水熱法製備石墨烯量子點:將乾燥的氧化石墨烯置於管式爐中，在N2保護的條件下，以5 ° C/min的升溫速率加熱到200 ° C並保持2 h，得到石墨烯片；將0.05 g石墨烯片加入到體積比為1:3的濃硫酸:濃硝酸的混合溶液中超聲17 h，加入250 mL超純水稀釋；用0.22 Mffl微孔濾膜過濾，將收集的濾餅懸浮在40 mL超純水中，用NaOH調節溶液PH為8後，轉移入反應釜中於200 ° C反應12 h，冷卻到室溫；用0.22 Mm的微孔濾膜過濾除去大體積的石墨烯片，得到的棕色濾液即為石墨烯量子點溶液； (3)羧基化石墨烯量子點的製備:將0.05 g的NaOH和0.1 g的氯乙酸鈉加入到20 mL的石墨烯量子點溶液中，超聲反應3 h，用鹽酸調節溶液pH為中性，即得到羧基化的石墨烯量子點； (4)抗磷酸化絲氨酸抗體氧化石墨烯複合物的製備:將200μ?Λ mg/mL的氧化石墨烯和200 μ?、5 Pg/mL的抗磷酸化絲氨酸抗體混合，室溫條件下反應12 h;將產物在10000 rpm下離心30 min，用超純水清洗3次，將產物重懸於10 mM、pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液中，4 0C下保存； (5)ECL傳感器的製備:玻碳電極先在粒徑為1.0,0.3,0.05 Mm的a -Al2O3糊中拋光，再用乙醇和水超聲清洗I min;將10 μ L、質量百分濃度為0.5%的殼聚糖溶液滴塗到玻碳電極表面並晾乾後，將電極`浸入到含有5 mM的N-乙基-N』 -1-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的羧基化石墨烯量子點溶液中，室溫下孵化5 h ;用10 mM、pH 7.4的磷酸鹽緩衝溶液清洗後，將電極插入到含有5 mM的N-乙基-N』 -1-(3- 二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、8 mM的N-羥基琥珀醯亞胺和50 μΜ的多肽溶液中反應3 h ;再將電極插入到含有蛋白激酶和三磷酸腺苷的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液中反應2 h，使多肽發生磷酸化；將磷酸化多肽修飾電極在抗磷酸化絲氨酸抗體氧化石墨烯複合物溶液中孵化I h，即製得ECL傳感器。
2.根據權利要求1所述的基於GO和GQDs之間ECL-RET作用的傳感器製備方法，其特徵在於步驟(2)中，所述的濃硫酸的質量百分濃度為98%，濃硝酸的質量百分濃度為68%。
3.根據權利要求1所述的基於GO和GQDs之間ECL-RET作用的傳感器製備方法，其特徵在於步驟(5)中，所述的殼聚糖溶液的配製方法為將殼聚糖加入到質量百分比為1%的醋酸溶液中並超聲溶解。
4.根據權利要求1所述的基於GO和GQDs之間ECL-RET作用的傳感器製備方法，其特徵在於步驟(5)中，所述的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩衝溶液的濃度為20禮，？!1為7.4，包含 20 mM 的 MgCl2。
5.基於GO和GQDs之間ECL-RET作用製備的傳感器在激酶檢測應用，是指傳感器對蛋白激酶活性及其抑制劑的檢測應用:隨著蛋白激酶濃度的增加，多肽修飾電極表面產生的磷酸化位點越多，組裝到石墨烯量子點修飾電極表面的氧化石墨烯就越多，在含有0.1 MNa2S2O8和0.1 M KCl的磷酸鹽緩衝溶液中，電極表面捕獲的氧化石墨烯對石墨烯量子點的電致化學發光產生的猝滅效應越強，使得電致化學發光信號逐漸下降，蛋白激酶的濃度在0.01-5 U/mL範圍內與電致化學發光信號呈線性關係，檢測限為0.023 U/mL;電致化學發光強度隨著蛋白激酶抑制劑濃度的增加而增強，當鞣花酸濃度為0.15 μΜ時，電致發光信號達到最大，計算得到的鞣花酸的半抑制濃度為0.043 μΜ。
6.根據權利要求5所述的基於GO和GQDs之間ECL-RET作用製備的傳感器的應用，其特徵在於所述的磷酸鹽緩衝溶液的濃度為0.1 M，pH為7.4。
【文檔編號】G01N21/76GK103512878SQ201310356006
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月16日 優先權日:2013年8月16日
【發明者】邱建丁, 向彩雲, 梁汝萍 申請人:南昌大學