α－瓊脂糖酶及其生產方法

2023-05-18 08:23:56 2

專利名稱：α－瓊脂糖酶及其生產方法
技術領域：
本發明涉及α-瓊脂糖酶及其生產方法。具體來說，本發明涉及可用於生產具有瓊脂糖各種生理活性、聚合程度低的瓊脂寡糖的α-瓊脂糖酶和生產α-瓊脂糖酶的方法以及α-瓊脂糖酶的用途。本發明還涉及具有α-瓊脂糖酶活性的多肽以及編碼所述多肽的基因。具體來說，本發明涉及α-瓊脂糖酶的胺基酸序列以及編碼所述胺基酸序列的核苷酸序列，其中所述α-瓊脂糖酶可用於生產具有瓊脂糖各種生理活性、聚合程度低的瓊脂寡糖。而且，本發明涉及應用基因工程生產具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的方法。此外，本發明涉及採用具有α-瓊脂糖酶活性的多肽生產瓊脂寡糖的方法。
背景技術：
瓊脂糖是瓊脂的主要成分。瓊脂糖是一種多糖，它具有其中D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖通過α-1，3-鍵和β-1，4鍵交替連接在一起的結構。人們必須使瓊脂糖降解為小分子，以便由瓊脂產生寡糖。已知化學降解瓊脂糖的方法和酶消化降解瓊脂糖的方法用於此目的。在化學降解法中，可使用酸水解瓊脂糖。在這種情況下，主要裂解α-1，3鍵。已知兩種酶可消化瓊脂糖，一種是β-瓊脂糖酶，它裂解瓊脂糖中的β-1，4鍵，另一種是α-瓊脂糖酶，它裂解瓊脂糖中的α-1，3鍵。
裂解瓊脂糖的β-1，4鍵獲得的寡糖稱為新瓊脂寡糖。新瓊脂寡糖在其還原末端具有D-半乳糖，而其聚合程度表現為偶數。另一方面，裂解瓊脂糖α-1，3鍵獲得的寡糖稱為瓊脂寡糖。瓊脂寡糖在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖，而其聚合程度表現為偶數。最近證實在其還原末端含有3，6-脫水-L-半乳糖的瓊脂寡糖具有生理活性，例如誘導細胞凋亡活性、抑癌活性、各種抗氧化活性、免疫調節活性、抗過敏活性、抗炎活性以及抑制α-糖苷酶活性(WO99/24447、日本專利申請號11-11646)。鑑於其生理活性，所以可提供含有瓊脂寡糖作為其活性成分的藥用組合物和功能食品或飲料。
在化學降解瓊脂糖的方法中，難以控制所產生的寡糖的大小。尤其是難以選擇性產生聚合程度低的小分子寡糖(例如T.Tokunaga等，Bioscience Industry，49734(1991))。如果使用β-瓊脂糖酶，則因為該酶只裂解β-1，4鍵而只能獲得沒有上述生理活性的新瓊脂寡糖。
預期通過採用具有裂解α-1，3鍵活性的α-瓊脂糖酶產生具有生理活性的瓊脂寡糖。已知的α-瓊脂糖酶包括革蘭氏陰性海洋細菌株GJ1B產生的酶(Carbohydrate Research，66207-212(1978)；該菌株在European Journal of Biochemistry，214599-607(1993)中稱為異單胞菌屬(Alteromonas)瓊脂裂解菌株GJ1B)和弧菌屬(Vibrio)細菌(JP-A 7-322878；JT0107-L4株)產生的酶。然而，採用異單胞菌屬瓊脂裂解菌株GJ1B產生的α-瓊脂糖酶不能產生具有顯著生理活性的瓊脂二糖，因為所述酶不能消化己糖或較短的寡糖。此外，弧菌屬細菌產生的α-瓊脂糖酶不能用來利用瓊脂糖作為原料產生瓊脂寡糖，因為該酶只對己糖和較短的寡糖具有活性，而對瓊脂糖根本沒有作用。
如上所述，現有技術關於產生在其還原末端含有3，6-脫水-L-半乳糖而且具有各種生理活性的小分子瓊脂寡糖(例如瓊脂二糖和瓊脂四糖)存在各種問題。
發明目的本發明主要目的是提供可用於有效產生小分子瓊脂寡糖的具有α-瓊脂糖酶活性的多肽、所述多肽的胺基酸序列、編碼所述多肽的基因、產生所述多肽的方法以及產生所述小分子瓊脂寡糖的方法。發明概述由於存在上述各種問題，所以本發明人進行了深入研究，以便獲得裂解瓊脂糖的α-1，3鍵而且產生具有顯著生理活性的瓊脂寡糖的酶。因此，本發明人成功發現了產生具有適用於此目的的特性的酶的兩個微生物菌株。分離這兩種微生物產生的酶，並闡明其物理化學特性以及酶學特性。此外，本發明人成功分離了所述酶的基因，而且找到了通過採用所述基因的基因工程容易地產生具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的方法，因此而完成了本發明。
本發明概述如下。本發明的第一方面涉及具有以下物理化學特性的新型α-瓊脂糖酶(1)作用水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵；(2)底物特異性作用於瓊脂糖、瓊脂己糖和較瓊脂己糖更長的瓊脂寡糖，但是對瓊脂四糖沒有作用；(3)最適溫度在55％或更低溫度下呈現其酶活性；以及(4)熱穩定性於48℃處理30秒後保留其20％或更高活性。
這樣的α-瓊脂糖酶中的典型酶例如為它包含SEQ ID NO14的胺基酸序列第177號胺基酸至第925號胺基酸的749個殘基組成的胺基酸序列，或者在749個殘基組成的所述胺基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個胺基酸的胺基酸序列；或者例如為這樣的酶它包含SEQ ID NO15胺基酸序列第184號胺基酸至第950號胺基酸的767個殘基組成的胺基酸序列，或者在767個殘基組成的所述胺基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個胺基酸的胺基酸序列。
本發明的第二方面涉及編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的基因，該基因編碼第一方面的α-瓊脂糖酶。這類基因中的典型基因例如為它包含SEQ ID NO12核苷酸序列第529號鹼基至2775號鹼基的2473個鹼基組成的核苷酸序列，或在2473個鹼基組成的所述核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個鹼基的核苷酸序列；或者例如為這樣的基因它包含SEQ ID NO13核苷酸序列第550號鹼基至2850號鹼基的2301個鹼基組成的核苷酸序列，或者在2301個鹼基組成的所述核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個鹼基的核苷酸序列。
本發明的第三方面涉及在嚴格條件下可與所述第二方面的基因雜交而且編碼第一方面的α-瓊脂糖酶的基因。
本發明的第四方面涉及包含所述第二或第三方面的基因的重組DNA分子。
本發明的第五方面涉及含有所述第四方面的重組DNA分子的轉化體。
本發明的第六方面涉及一種產生具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的方法，包括培養能夠產生α-瓊脂糖酶的微生物(例如屬於微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)所屬的微生物屬的微生物)，以及從所述培養物中收集所述第一方面的α-瓊脂糖酶。微生物TKR1-7AGα和TKR4-3AGα於1999年1月26日(最初保藏日期)根據布達佩斯條約分別以保藏號FERM BP-6990和FERMBP-6991保藏於日本國際貿易和工業部工業科技局的國立生命科學和人體技術研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)。
本發明的第七方面涉及一種產生具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的方法，包括培養所述第五方面的轉化體以及從所述培養物中收集所述第一方面的α-瓊脂糖酶。
本發明的第八方面涉及一種產生瓊脂寡糖的方法，包括用所述第一方面的α-瓊脂糖酶消化瓊脂糖以及從所獲得消化物中收集瓊脂寡糖。
附圖簡述


圖1圖示本發明的α-瓊脂糖酶對瓊脂己糖的消化作用。
圖2圖示本發明的α-瓊脂糖酶對瓊脂己糖的消化作用。
發明詳述本發明使用的寡糖是指2個或2個以上以及10個或10個以下的單糖組成的糖。瓊脂寡糖是指具有通過α-1，3鍵以及β-1，4鍵交替將D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖連接在一起的結構而且在其還原末端含有3，6-脫水-L-半乳糖的寡糖。多糖是指除單糖和寡糖以外的糖。
本發明的α-瓊脂糖酶是一種水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的酶。它既可作用於多糖如瓊脂糖又可作用於寡糖如瓊脂己糖。本發明的酶不是特定限制的酶，只要它們具有這樣的特性。其實例包括海洋微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或TKR4-3AGα(FERM BP-6991)產生的α-瓊脂糖酶。
微生物TKR1-7AGα產生的瓊脂糖酶1-7和微生物TKR4-3AGα產生的瓊脂糖酶4-3是水解多糖和寡糖中的3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵的酶。這些酶作用於瓊脂糖、瓊脂己糖和比瓊脂己糖更大瓊脂寡糖以及新瓊脂己糖和比新瓊脂己糖更大的新瓊脂寡糖。
以下描述檢測上述兩種酶的活性的方法以及這兩種酶的物理化學特性和酶學特性。
(1)檢測酶活性的方法如下檢測本發明的α-瓊脂糖酶的活性採用瓊脂糖作為底物進行酶反應，然後定量產生的瓊脂四糖。具體來說，在此用於檢測純化的酶製劑的活性以及純化過程中的酶的活性的酶活性檢測方法如下製備在10mM tris鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣和10mM氯化鈉中含有濃度為0.2％的瓊脂糖(Takara Shuzo，編號5003)的溶液。將作為底物的180μl該溶液與20μl酶溶液混合。使混合物於42℃反應30-120分鐘、優選60分鐘，然後於60℃加熱1分鐘終止反應。使30μl所述反應混合物過TSK凝膠α-2500柱(內徑7.8mm；長度300mm；Tosoh，編號18339)。採用70％乙腈溶液作洗脫液、流速為0.8ml/min，在保留時間約26分鐘洗脫出一個峰。定量在所述峰的酶反應產生的瓊脂四糖。一個單位(1U)定義為在10分鐘內產生1微摩爾瓊脂四糖的酶量。
(2)最適pH使酶作用於採用醋酸鹽緩衝液(pH 4.5)、蘋果酸鹽緩衝液(pH5.5)、醋酸鹽緩衝液(pH 6.0，6.5)或tris鹽酸鹽緩衝液(pH 7.0，7.5，8.8)製備的反應混合物中的底物瓊脂糖。結果證實，瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3分別在中性至弱酸性條件下和弱鹼性至弱酸性條件下顯示其消化瓊脂糖的活性。
(3)最適溫度本發明的酶在55℃或更低溫度下呈現其酶活性。在30-48℃溫度範圍具有高活性，而在約37-42℃下具有最大活性。
(4)熱穩定性測量在48℃、50℃或60℃處理30秒鐘後保留的酶製劑活性。結果瓊脂糖酶1-7於48℃處理後保留其25％活性，而瓊脂糖酶4-3於50℃處理後保留其22％活性。
(5)分子量根據採用10-20％聚丙烯醯胺梯度凝膠的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定，鑑定瓊脂糖酶1-7的分子量約95,000。
採用甘油密度梯度平衡密度梯度離心和SDS-PAGE測定瓊脂糖酶4-3的分子量。結果測得瓊脂糖酶4-3的分子量為約85,000。
(6)用Edman降解法測定胺基酸序列採用Edman降解法測得的瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3的N-末端胺基酸序列分別為Asp-Thr-Leu-Ser-Val-Glu-Ala-Glu-Met-Phe和Gly-Asp-Ile-Val-Ile-Glu-Leu-Glu-Asp-Phe-Asp-Ala-Thr-Gly-Thr-Thr-GLy-Arg-Val-Ala。瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3的N-末端胺基酸序列分別示於SEQ ID NO1和2。
如下所述，分離編碼瓊脂糖酶1-7的基因和編碼瓊脂糖酶4-3的基因。此外，測得這些基因編碼的胺基酸序列。瓊脂糖酶1-7基因和瓊脂糖酶4-3基因編碼的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO14和15。SEQ ID NO14胺基酸序列的第177號至第925號胺基酸的749個胺基酸組成的多肽和SEQ ID NO15胺基酸序列的第184號至第950號胺基酸的767個胺基酸組成的多肽二者均具有本發明的α-瓊脂糖酶活性。
可以從通過培養微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)獲得的培養物純化本發明的α-瓊脂糖酶。從海水分離同化瓊脂的細菌TKR1-7AGα和TKR4-3AGα。它們具有以下微生物特性。
微生物特性(1)形態學製備100ml人工海水(產品名稱Jamarine S；JamarineLaboratory)。在其中加入0.3g蛋白腖(DIFCO，編號0123-17-3)和0.02g酵母提取物(DIFCO，編號0127-17-9)。用3M碳酸鈉將pH調節至8.0。把獲得的混合物轉移到500ml錐形瓶中。向其中加入0.1g瓊脂(Nacalai Tesque，編號010-28)。用高壓滅菌器滅菌後，將一種上述微生物接種到所述混合物中，於25℃、120rpm培養過夜。生長於所述培養基中的TKR1-7AGα和TKR4-3AGα細胞是桿菌並可運動。
(2)生長製備100ml人工海水(產品名稱Jamarine S；JamarineLaboratory)。在其中加入0.3g蛋白腖和0.02g酵母提取物。用3M碳酸鈉將pH調節至8.0。向其中加入1.5g瓊脂(Nacalai Tesque，編號010-28)。用高壓滅菌器滅菌混合物以製備平板。將上述微生物接種到所述平板上，證實(a)它們於23-30℃生長良好；和
(b)隨著所述細菌細胞的生長使所述瓊脂凝膠液化。
製備100ml人工海水(產品名稱Jamarine S；JamarineLaboratory)。在其中加入0.3g蛋白腖和0.02g酵母提取物。用3M碳酸鈉將pH調節至不同pH。把獲得的混合物轉移到500ml錐形瓶中。向其中加入0.1g瓊脂。用高壓滅菌器滅菌後，將一種上述微生物接種到所述混合物中。然後證實(c)它們於pH 7.0-8.5生長良好。
TKR1-7AGα和TKR4-3AGα於1999年1月26日(最初保藏日期)根據布達佩斯條約分別以保藏號FERM BP-6990和FERM BP-6991保藏於日本國際貿易和工業部工業科技局的國立生命科學和人體技術研究所。
通過分析其核苷酸序列已知為每種微生物菌株特異性的16S核糖體RNA的基因的編碼核苷酸序列，可獲得關於每種上述微生物的分類學定位的信息。具體來說，從微生物菌株TKR1-7AGα和TKR4-3AGα提取染色體DNA。採用可用於擴增所述基因的一個區或其部分的引物進行PCR。測定所擴增的DNA片段的核苷酸序列。對所測定的序列利用GenBank資料庫進行同源性檢索。然後可知道與所述區的核苷酸序列相似的微生物，即分類學上密切相關的微生物。
按照Bulletin of Japanese Society of Microbial Ecology，1031-42(1995)所述的方法，擴增從微生物TKR1-7AGα和TKR4-3AGα的16S核糖體RNA基因獲得的DNA片段。將所述文獻描述的引物27f和1492r用於所述PCR(引物27f和1492r的核苷酸序列示於SEQ ID NO16和17)。分析所獲得的擴增DNA片段的核苷酸序列。結果發現了以下微生物，各微生物的上述區與一種產生本發明的α-瓊脂糖酶的微生物的同源性約95％TKR1-7AGα科爾韋爾氏菌屬(Colwellia)樣細菌；TKR4-3AGα海洋嗜冷菌IC079。
含有每種所述微生物可利用的氮源、無機物質等以及作為碳源的瓊脂、瓊脂糖等的培養基可用作培養所述微生物的培養基。可使用市售瓊脂和瓊脂糖。氮源實例包括肉膏、酵母提取物、酪蛋白水解產物、胰蛋白腖、蛋白腖等。優選使用酵母提取物和蛋白腖。這樣的氮源也可以用作除瓊脂或瓊脂糖外的碳源。此外，作為鹽類可聯合使用以下物質氯化鈉、檸檬酸鐵、氯化鎂、硫酸鈉、氯化鈣、氯化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、溴化鉀、氯化鍶、硼酸鈉、矽酸鈉、氟化鈉、硝酸銨、磷酸氫二鈉等。
特別優選使用通過在人工海水Jamarine S組成的培養基中加入蛋白腖、酵母提取物和瓊脂或瓊脂糖製備的培養基。優選加入瓊脂或瓊脂糖的濃度為0.1-2.0％。通過適當改變瓊脂或瓊脂糖的濃度可製備固體或液體培養基。使用濃度為0.1-0.3％的液體培養基優選用於產生酶，而使用濃度為1.2-2.0％的固體培養基優選用於保藏細胞。如果低熔點瓊脂糖用於液體培養基，則可以0.1-1.0％濃度使用。
儘管培養條件或多或少取決於培養基的組成，但是培養溫度為23-30℃、優選25℃，培養基的pH為7.0-8.5、優選7.2-8.2，而培養時間為12-48小時、優選24-36小時。
如上所述培養期間產生的本發明的α-瓊脂糖酶分泌出所述細胞。然後在培養後通過離心、過濾等去除細胞，獲得培養物上清液。
採用真空濃縮或超濾可濃縮獲得的培養物上清液，以製備液體酶。或者，可通過冷凍乾燥、噴霧乾燥等使所述培養物上清液轉變為粉型酶，以製備粗酶製劑。採用常規純化方法例如用硫酸銨鹽析或溶劑沉澱，可部分純化本發明的α-瓊脂糖酶。而且，採用已知的純化方法例如組合柱層析(例如陰離子交換柱和凝膠過濾柱)可獲得電泳產生一條帶的純化酶製劑。
通過使由此獲得的培養物或不同純化程度的本發明α瓊脂糖酶與紅海藻中含的多糖如瓊脂或瓊脂糖作為底物進行反應，可產生瓊脂寡糖例如瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。
瓊脂糖為具有交替通過α-1，3鍵和β-1，4鍵使D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖連接在一起的結構的多糖。β-瓊脂糖酶是水解瓊脂糖β-1，4鍵的酶。該酶作用產生的在其還原末端具有D-半乳糖的寡糖稱為新瓊脂寡糖，它不具有生理活性，例如用瓊脂寡糖觀測到的生理活性。如果使用裂解瓊脂糖α-1，3鍵的α-瓊脂糖酶，則可產生在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的瓊脂寡糖。異單胞菌屬瓊脂裂解菌株GJ1B和一種弧菌屬細菌(菌株JT0107-L4)產生的兩種酶已知為α-瓊脂糖酶。然而，異單胞菌屬瓊脂裂解菌株GJ1B產生的α-瓊脂糖酶不能作用於瓊脂己糖或更短的寡糖，而弧菌屬細菌產生的α-瓊脂糖酶不能消化瓊脂糖。因此，不能採用已知α-瓊脂糖酶有效由瓊脂糖原料產生瓊脂二糖或瓊脂四糖。
根據上述物理化學特性可知，本發明的α-瓊脂糖酶是作用於瓊脂糖、瓊脂己糖和比瓊脂己糖更長的瓊脂寡糖的酶。因此，它作用於瓊脂糖產生瓊脂寡糖。而且，它可裂解因為所述作用產生的瓊脂己糖中一個α-1，3鍵。換句話說，通過使本發明的α-瓊脂糖酶可作用於瓊脂糖，可獲得瓊脂二糖和瓊脂四糖，瓊脂二糖和瓊脂四糖是按照常規方法幾乎不能大量產生的二糖和四糖。
已知的α-瓊脂糖酶和本發明的α-瓊脂糖酶的底物特異性示於表1。在表1中，符號+和-分別表示所述酶能夠和不能夠消化所述底物。表1

本發明的α-瓊脂糖酶作用於瓊脂己糖產生瓊脂二糖和瓊脂四糖。
採用本發明的α-瓊脂糖酶產生的瓊脂寡糖含有瓊脂二糖和瓊脂四糖。所述瓊脂寡糖可含有瓊脂己糖或比瓊脂己糖更長的瓊脂寡糖，前提是其存在不幹擾所述使用目的。瓊脂、瓊脂糖或瓊脂或瓊脂糖產生的瓊脂寡糖可用作採用本發明的α-瓊脂糖酶產生瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖的原料。用於所述α-瓊脂糖酶作用的條件不特別限制，前提是所述酶在所用的條件下具有活性。例如，在中性至弱酸性條件下可優選使瓊脂糖酶1-7發揮作用，在弱鹼性至弱酸性條件下可優選使瓊脂糖酶4-3發揮作用，而在37-42℃時可使所述酶二者發揮作用。所述反應混合物的組成不特別限制，前提是它適用於所述酶的作用。
如上所述，採用本發明的α-瓊脂糖酶產生的寡糖主要是己糖或聚合程度低的更短寡糖。但是，可通過適當選擇所述反應條件等任選產生不同聚合程度的寡糖。也可以通過分離和純化由此獲得的寡糖，分別獲得瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。
本發明的α-瓊脂糖酶基因是編碼具有上述α-瓊脂糖酶活性的多肽的基因。因此，它是指包含編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的胺基酸序列的核苷酸序列的核酸。本發明的α-瓊脂糖酶基因的實例包括包含編碼微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)產生的瓊脂糖酶1-7的核苷酸序列的基因和包含微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)產生的瓊脂糖酶4-3的核苷酸序列的基因。編碼瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3的基因例如為具有編碼SEQ ID NO14中的第177號胺基酸至第925號胺基酸的749個胺基酸殘基組成的多肽的核苷酸序列的基因和具有編碼SEQ ID NO15中的第184號胺基酸至第950號胺基酸的767個胺基酸殘基組成的多肽的核苷酸序列的基因。
本發明的α-瓊脂糖酶基因還包括包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽具有在上述胺基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個胺基酸的胺基酸序列，而且具有α-瓊脂糖酶活性。
此外，本發明的基因包括具有SEQ ID NO12第529號鹼基至2775號鹼基的22473個鹼基組成的核苷酸序列的基因和具有SEQ ID NO13第550號鹼基至2850號鹼基的2247個鹼基組成的核苷酸序列的基因。本發明的基因還包括包含核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列具有在上述核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個鹼基的核苷酸序列，而且編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽。
此外，本發明的基因包括包含在嚴格條件下與上述基因雜交而且編碼具有α-瓊脂糖酶活性的核苷酸序列的核酸。可照例如T.Maniatis等(編輯)，Molecular CloningA Laboratory Manual第二版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory所述的方法進行雜交。嚴格條件例如為在含6×SSC(1×SSC0.15 M NaCl、0.015檸檬酸鈉，pH 7.0)、0.5％SDS、5×Denhardt’s和100mg/ml鯡魚精子DNA的溶液中於65℃下與探針溫育過夜。
例如可如下克隆本發明的α-瓊脂糖酶基因。
用產生α-瓊脂糖酶的微生物製備基因組DNA。可按照一種合適的已知方法製備所述基因組DNA。例如，組合使用諸如溶菌酶處理、蛋白酶處理、RNA酶處理、酚處理和乙醇沉澱的已知方法可製備基因組DNA。由此獲得的基因組DNA用合適的已知方法例如超聲處理或限制酶消化降解。按照常規方法將獲得的DNA片段摻入載體(例如質粒載體)中，以構建重組DNA分子。然後將重組DNA分子導入合適的宿主(例如大腸桿菌)中獲得轉化體。根據常規方法所用的載體和宿主例如Molecular CloningA Laboratory Manual第二版中所述的載體和宿主，可適當選擇構建重組DNA分子、轉化等的方法。因此獲得含有α-瓊脂糖酶基因的轉化體的基因組文庫。
其次，篩選基因組文庫，以選擇具有α-瓊脂糖酶基因的轉化體。篩選方法的實例如下(1)利用α-瓊脂糖酶活性的表達作為指標的篩選使基因組文庫生長於瓊脂板上。具有α-瓊脂糖酶基因的轉化體表達具有α-瓊脂糖酶活性的多肽。所述多肽通過其α-瓊脂糖酶活性作用溶解瓊脂凝膠。因此選擇溶解瓊脂板中的的瓊脂凝膠的菌落或菌斑。
(2)利用抗體的篩選如上所述製備α-瓊脂糖酶的部分純化的粗酶製劑或純化的酶製劑。採用所述酶製劑作抗原，按照常規方法製備抗α-瓊脂糖酶的抗體。
使基因組文庫生長於平板上。將生長的菌落或菌斑轉移到尼龍或硝酸纖維素濾膜上。表達的重組蛋白與所述菌落或菌斑一起轉移到所述濾膜上。使濾膜上的重組蛋白與抗α-瓊脂糖酶抗體反應，以鑑定與抗體反應的克隆。
按照已知方法可鑑定與所述抗體反應的克隆，例如使結合過氧化物酶的二抗與已經與所述抗α-瓊脂糖酶抗體反應的濾膜反應，使濾膜與顯色底物反應，然後檢測產生的顏色。
如果將使摻入所述載體的DNA中的基因高效表達的表達載體用於構建用於上述方法(1)或(2)的基因組文庫，則能夠容易地選擇具有目的基因的轉化體。
(3)利用DNA探針雜交的篩選使基因組文庫生長於平板上。將生長的菌落或菌斑轉移到尼龍或硝酸纖維素濾膜上。通過變性使DNA固定在所述濾膜上。按照常規方法使所述濾膜上的DNA雜交到標記探針上，以鑑定與所述探針雜交的克隆。
用於該篩選的探針包括根據上述α-瓊脂糖酶的胺基酸序列信息製備的寡核苷酸、根據另一種胺基酸序列信息製備的寡核苷酸以及採用根據這種胺基酸序列信息製備的引物擴增的PCR片段。用於所述探針的標記的實例包括但不限於放射性同位素標記、螢光標記、地高辛標記和生物素標記。
如下製備的富集具有α-瓊脂糖酶基因的轉化體的基因組文庫可用作用於所述篩選的基因組文庫。
由產生α-瓊脂糖酶的微生物製備基因組DNA，用合適的限制酶消化，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，然後按照常規方法將其印跡到尼龍或硝酸纖維素濾膜上。按照常規方法使濾膜上的DNA與上述標記的探針雜交，以檢測與所述探針雜交的DNA片段。從所述瓊脂糖凝膠提取並純化對應於所述信號的DNA片段。
按照常規方法將由此獲得的DNA片段摻入載體(例如質粒載體)中，以構建重組DNA分子。然後將重組DNA分子導入合適的宿主(例如大腸桿菌)中獲得轉化體。根據常規方法例如Molecular CloningALaboratory Manual第二版中所述方法，可選擇適用於所用載體的轉化方法。因此獲得富集含有α-瓊脂糖酶基因的轉化體的基因組文庫。
採用這樣的基因組文庫可更有效地進行篩選。
(4)利用PCR的體外克隆通過篩選如上所述的方法(1)至(3)的轉化體，克隆目的基因。利用PCR可體外進行克隆，而不必利用轉化體。
由產生α-瓊脂糖酶的微生物製備基因組DNA。通過合適的已知方法例如超聲處理或用限制酶消化降解基因組DNA。按照常規方法使接頭連接到由此獲得的DNA片段。
採用根據α-瓊脂糖酶的胺基酸序列信息製備的寡核苷酸和與所述接頭雜交的寡核苷酸作為引物以及用所述基因組文庫作模板，進行PCR。按照常規方法使獲得的擴增產物摻入載體(例如質粒載體)中。
按照已知方法可測定上述(1)至(3)獲得的含有α-瓊脂糖酶基因的轉化體中的α-瓊脂糖酶基因的核苷酸序列以及上述(4)獲得的含有α-瓊脂糖酶基因的重組DNA分子的核苷酸序列。如果所述克隆不編碼完整的α-瓊脂糖酶多肽，則通過重複步驟揭示所述α-瓊脂糖酶的完整讀框，所述步驟包括根據已確定的核苷酸序列製備新探針，並用所述探針篩選基因組文庫以獲得新的克隆。例如根據由此獲得的信息可製備包含編碼α-瓊脂糖酶的完整讀框的克隆。
通過將上述獲得的編碼α-瓊脂糖酶的基因與合適的表達載體連接在一起，經基因工程可大量產生具有α-瓊脂糖酶活性的多肽。
以下簡述獲得瓊脂糖酶1-7基因的方法。
用溶菌酶裂解通過培養TKR1-7AG獲得的細胞，然後使其去除蛋白，乙醇沉澱等獲得基因組DNA。用限制酶BamHI部分消化基因組DNA。將獲得的DNA片段插入質粒載體(氨苄青黴素抗性)中，以構建質粒文庫。使用質粒文庫轉化大腸桿菌。使轉化體在含1.5％(w/v)瓊脂和50μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂培養基上生長，並於37℃培養5天。培養後，分離觀測到周圍瓊脂分解的菌落，將其接種到含氨苄青黴素的LB培養基中並培養。測定由所述細胞製備的粗提取物的α-瓊脂糖酶活性。按照常規方法由觀測到α-瓊脂糖酶活性的轉化體提取質粒DNA。測得插入質粒DNA的DNA長度約8kb。該重組質粒命名為pAA1。用所述質粒轉化的大腸桿菌命名並表示為大腸桿菌JM109/pAA1，於1999年5月26日(最初保藏日期)根據布達佩斯條約以保藏號FERM BP-6992保藏於日本國際貿易和工業部工業科技局的國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)。
對插入質粒pAA1的DNA片段的核苷酸序列進行分析顯示，它含有作為編碼α-瓊脂糖酶的一個區的編碼925個胺基酸組成的多肽的讀框(ORF)。所述讀框的核苷酸序列和所述讀框編碼的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO12和14。因此，SEQ ID NO14的胺基酸序列是本發明瓊脂糖酶的一個實例。比較該胺基酸序列與以前測定的瓊脂糖酶1-7的N-末端胺基酸序列(P1)表明，瓊脂糖酶1-7是SEQ ID NO14胺基酸序列第28號胺基酸至第925號胺基酸的胺基酸序列組成的多肽，而且所述胺基酸序列由SEQ ID NO12核苷酸序列第82號鹼基至2778號鹼基(包括終止密碼子)的核苷酸序列編碼。認為SEQ ID NO14胺基酸序列的胺基酸1-27組成的胺基酸序列是信號序列。而且，具有SEQID NO14胺基酸序列第177號胺基酸至第925號胺基酸的749個胺基酸殘基組成的胺基酸序列的多肽也具有本發明的α-瓊脂糖酶的一種活性。
以下簡述獲得α-瓊脂糖酶4-3基因的方法。根據SEQ ID NO2表示的瓊脂糖酶4-3的N-末端胺基酸序列(P2)製備混合的引物3和4。混合的引物3和4的序列分別示於SEQ ID NO6和7。
如以上關於α-瓊脂糖酶1-7所述，由TKR4-3AGα製備的染色體DNA用限制酶BamHI完全消化。使BamHI接頭連接到消化的DNA末端。採用獲得的DNA作為模板以及採用LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)所附的混合的引物3和引物Cl進行PCR。
其次，採用第一PCR如此獲得產物作為模板以及LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)所附的混合的引物4和引物C2進行PCR。結果觀測到約2kb的擴增產物。該DNA片段命名為4-3N。
分析所擴增片段的末端區的核苷酸序列。根據對應於所述瓊脂糖酶N-末端部分的編碼區的核苷酸序列，製備其核苷酸序列分別示於SEQ ID NO8和9的引物5和6。同樣，根據對應於所述瓊脂糖酶C末端部分的核苷酸序列，製備其核苷酸序列分別示於SEQ ID NO10和11的引物7和8。
當如上所述對4-3N進行PCR時，例外的是使用引物5和6代替混合的引物3和4，獲得約1.0kb的DNA片段，稱為4-3UN。同樣，當用引物7和8進行PCR時，獲得約2.0kb的DNA片段，稱為4-3C。儘管考慮了以前確定的4-3N的核苷酸序列，但是對片段4-3UN和4-3C進行核苷酸序列分析顯示，編碼951個胺基酸組成的多肽的讀框。所述讀框的核苷酸序列和所述讀框核苷酸序列編碼的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO13和15。在R-3UN中，發現了編碼胺基酸序列P2的核苷酸序列(編碼183個胺基酸的上遊核苷酸序列)以及另一個上遊SD樣序列。
所以，SEQ ID NO15胺基酸序列為本發明瓊脂糖酶的一個實例。比較此胺基酸序列與前面鑑定的瓊脂糖酶4-3的N-末端胺基酸序列表明，瓊脂糖酶4-3為SEQ ID NO15胺基酸序列第184號胺基酸至第951號胺基酸的胺基酸序列組成的多肽，而所述胺基酸序列由SEQ ID NO13核苷酸序列的第550號至第2856號(包括終止密碼子)的核苷酸序列編碼。
如上所述獲得的瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3的胺基酸序列和編碼這些酶的基因的核苷酸序列與β-瓊脂糖酶的胺基酸序列和編碼所述酶的基因的核苷酸序列沒有同源性，其中β-瓊脂糖酶是以不同於本發明瓊脂糖酶的方式裂解瓊脂糖的已知瓊脂糖消化酶。因此，認為這些序列是絕對新的。
通過將編碼本發明α-瓊脂糖酶的基因(例如編碼瓊脂糖酶1-7或瓊脂糖酶4-3的基因)連接到合適載體上，能夠構建重組DNA分子。而且，通過將重組DNA分子導入合適宿主中可製備轉化體。用通過培養所述轉化體獲得的培養物生產本發明的α-瓊脂糖酶。所以，採用所述轉化體有可能大量生產本發明的α-瓊脂糖酶(例如瓊脂糖酶1-7或瓊脂糖酶4-3)。
按照已知方法在編碼α-瓊脂糖酶的基因中導入一種突變，可產生突變的α-瓊脂糖酶。可使用的導入突變的方法實例包括但不限於寡核苷酸雙琥珀法(Hashimoto-Gotoh，T.等，Gene，152271-275(1995))、缺口雙鏈體法(Kramer，W.等，Nucl.Acids Res.，129441(1984)；Kramer，W.等，Methods in Enzymology，154350(1987))和Kunkel法(Kunkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488(1985)；Kunkel，T.A.，Methodsin Enzymology，154367(1987))。
通過表達編碼其中在需要表達的α-瓊脂糖酶的N-末端加入信號序列的多肽的基因，可使目的α-瓊脂糖酶分泌出轉化體。所述信號序列不限於具體某一種，例如SEQ ID NO14的第1-27號胺基酸代表的瓊脂糖酶1-7的信號序列。該信號序列由SEQ ID NO12的第1-81號鹼基的核苷酸序列編碼。
可用於構建所述重組DNA分子的載體的實例包括但不限於質粒載體、嗜菌體載體和病毒載體。根據使用所述重組DNA的目的可選擇合適的載體。如果構建重組DNA分子是為了產生α-瓊脂糖酶，則優選含有啟動子和/或其它用於表達控制的區段的載體。這類質粒載體的實例包括但不限於pKF19k、pT7BlueT和pET16b。可用於製備轉化體的宿主包括但不限於諸如細菌、酵母和絲狀真菌的微生物以及哺乳動物、魚、昆蟲等的培養細胞。使用採用適用於所述宿主的載體構建的重組DNA分子，製備轉化體。
下面簡述通過基因工程產生瓊脂糖酶1-7的方法。
採用編碼α-瓊脂糖酶1-7基因的質粒pAA1作為模板，通過PCR擴增含有編碼多肽的核苷酸序列的DNA片段，所述多肽具有例如從SEQ ID NO14第28或177號胺基酸開始的胺基酸序列，以便構建其中所擴增的片段插入合適質粒載體(例如pKF19k(Takara Shuzo)、pT7BlueT(Takara Shuzo)或pET16b(Takara Shuzo))中的質粒。用合適液體培養基培養用這種質粒轉化的大腸桿菌(例如大腸桿菌JM109或BL21(DE3)pLysS)。必要時，採用IPTG等進行誘導。表達插入所述質粒的DNA片段編碼的多肽。單位體積培養物內轉化體表達的α-瓊脂糖酶活性通常高於TKR1-7AGα培養物觀測到的活性。
對於瓊脂糖酶4-3，在用所述微生物TKR4-3α的染色體DNA作為模板，通過PCR擴增含有編碼例如具有從SEQ ID NO15的第184號胺基酸開始的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的DNA片段後，如以上關於瓊脂糖酶1-7所述，可用基因工程製備編碼所述α-瓊脂糖酶的轉化體。獲得的轉化體表達α-瓊脂糖酶活性，而且單位體積培養物的活性高於TKR4-3AGα培養物觀測到的活性。
採用常規純化方法例如用硫酸銨鹽析或溶劑沉澱，能夠部分純化用如上所述的基因工程產生的本發明α-瓊脂糖酶。此外，利用已知純化方法例如組合柱層析(例如陰離子交換柱和凝膠過濾柱)能夠獲得電泳時產生單一帶的純化酶製劑。
使如此獲得的不同純度的本發明重組α-瓊脂糖酶與作為底物的紅海藻含有的多糖如瓊脂或瓊脂糖反應，可產生諸如瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖的瓊脂寡糖。
實施例以下實施例更詳細地闡明本發明，而不是用來限制本發明範圍。
實施例1用TKR1-7AGα產生α-瓊脂糖酶純化本發明的α-瓊脂糖酶後，如下檢測酶活性用瓊脂糖L03(Takara Shuzo，編號5003)作底物進行酶反應，然後採用高效液相色譜定量產生的瓊脂四糖。下文更詳細介紹該方法。
製備在10mM tris鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣和10mM氯化鈉中含有瓊脂糖L03濃度為0.2％的溶液。使180μl該溶液與20μl酶溶液混合。使該混合物於42℃反應30-120分鐘、優選60分鐘，然後於60℃加熱1分鐘終止反應。將30μl反應混合物過TSK凝膠α-2500柱(內徑7.8mm；長度300mm；Tosoh，編號18339)。利用70℃乙腈溶液作洗脫液、流速0.8ml/分鐘，在保留時間約26分鐘洗脫出一個峰。定量在所述峰中酶反應產生的瓊脂四糖。1單位(U)本發明α-瓊脂糖酶定義為10分鐘產生1微摩爾瓊脂四糖的酶量。
製備100ml人工海水(產品名稱Jamarine S；JamarineLaboratory)。分別以0.3％和0.02％濃度向其中加入蛋白腖(DIFCO，編號0123-17-3)和酵母提取物(DIFCO，編號0127-17-9)。然後用3M碳酸鈉將pH調節至8.0。把獲得的混合物轉移到500ml錐形瓶中。向其中加入0.1g瓊脂(Nacalai Tesque，編號010-28)。用高壓滅菌器滅菌後，將微生物TKR1-7AGα接種到所述混合物中，於25℃、120rpm培養過夜。獲得的培養物用作預培養物。
如下進行主培養。以51小型發酵罐製備31上述培養基，用高壓滅菌器滅菌。將30ml預培養物接種到所述培養基中，於25℃、250rpm培養24小時。然後以8,000×g離心培養物20分鐘收集約31去除細胞的上清液。
於4℃或4℃以下進行以下步驟。
將所述上清液置於透析膜(Sanko Junyaku，編號UC-36-32-100)，並將其浸入約500g聚乙二醇2個夜晚進行濃縮，直到其中的溶液體積約100ml為止，然後用緩衝液A(20mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣、10mM氯化鈉)透析脫鹽。將透析液上樣到用緩衝液A平衡的裝填30ml強陰離子交換樹脂Super Q(Tosoh，編號17227)的柱上。用10mM-150mM氯化鈣的線性梯度(總洗脫體積600ml)洗脫吸附的α瓊脂糖酶。收集於50mM-100mM氯化鈣濃度洗脫的約60ml具有α-瓊脂糖酶活性的流分。
用緩衝液B(10mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣、10mM氯化鈉)透析該流分，使其脫鹽，然後加樣到裝填20ml Super Q的柱(2cm×6.3mm)上。在這種情況下，用10mM-1.0M氯化鈉線性梯度(總洗脫體積200ml)洗脫所吸附的酶。於約0.5M氯化鈉洗脫獲得40ml具有α-瓊脂糖酶活性的流分。用緩衝液B透析該流分，然後使其過裝填10ml DEAE-TOYOPEARL(Tosoh，編號007473)的柱(0.8cm×5.7mm)。用10mM-150mM氯化鈣線性梯度(總洗脫體積100ml)收集約20ml具有α-瓊脂糖酶活性的流分。
然後用離心超濾膜Centriprep-10(Amicon，編號4304)使所述流分濃縮至約1ml。利用以緩衝液B平衡的裝填Sephadex G-100(Pharmacia，編號17-0060-01)的柱(0.8cm×60mm)，使濃縮液進行凝膠過濾，獲得約15ml具有α-瓊脂糖酶活性的流分。使該流分過5ml QAE-TOYOPEARL(Tosoh，編號14026)的柱(0.8cm×10mm)，利用10mM-150mM氯化鈣線性梯度(總洗脫體積100ml)洗脫獲得約4ml的α-瓊脂糖酶流分。
經SDS-PAGE分析如此獲得的α-瓊脂糖酶流分揭示，目的酶幾乎純化至均一，其分子量約95,000。如此獲得的純化α-瓊脂糖酶製劑的總活性為45U。該流分在以下的實驗中用作瓊脂糖酶1-7。
實施例2用TKR4-3AGα產生α-瓊脂糖酶如在上文實施例1中關於微生物TKR1-7AGα所述，培養微生物TKR4-3AGα，以獲得約31培養物上清液。
將培養物上清液置於透析膜(Sanko Junyaku，編號UC-36-32-100)，並將其浸入約500g聚乙二醇2個夜晚進行濃縮，直到其中的溶液體積約300ml為止，然後用緩衝液C(10mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣、50mM氯化鈉)透析。將約三分之二的透析液上樣到用緩衝液C平衡的裝填30mlSuper Q的柱(2cm×9.5mm)上。用10mM-80mM氯化鈣線性梯度(總洗脫體積400ml)洗脫吸附的α瓊脂糖酶。收集於40mM-50mM氯化鈣濃度洗脫的約40ml具有α-瓊脂糖酶活性的流分用Centriprep-10濃縮該流分，並用緩衝液B稀釋脫鹽，然後加樣到裝填10ml DEAE-TOYOPEARL的柱(1.5cm×5.7mm)。用10mM-100mM氯化鈣線性梯度(總洗脫體積100ml)洗脫吸附的酶。於約45mM氯化鈣濃度洗脫獲得9ml具有α瓊脂糖酶活性的流分。用Centriprep-30(Amicon，編號4306)濃縮該流分，並用緩衝液B稀釋5倍，然後將其過用緩衝液B平衡的裝填2ml QAE-TOYOPEARL的柱(0.8cm×4cm)。用10mM-120mM氯化鈣線性梯度(總洗脫體積40ml)收集吸附於所述柱上的α瓊脂糖酶的流分。
經SDS-PAGE分析如此獲得的α-瓊脂糖酶流分揭示，所述α-瓊脂糖酶幾乎純化至均一。獲得的所述α-瓊脂糖酶總活性為1.53U。該流分在以下的實驗中用作瓊脂糖酶4-3。
實施例3檢測酶的各種特性(1)底物特異性和作用製備10μl反應緩衝液(10mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣、10mM氯化鈉)，它含有一種選自以下的糖4種瓊脂寡糖(瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂己糖和瓊脂八糖)(濃度各為2.5mM)、3種新瓊脂寡糖(新瓊脂二糖、新瓊脂四糖和新瓊脂己糖)(濃度各為2.5mM)和瓊脂糖L03(濃度為1％)。向其中加入10μl瓊脂糖酶1-7或瓊脂糖酶4-3溶液。使所述混合物於42℃反應30分鐘。利用展開溶劑使反應產物進行薄層層析，所述展開溶劑的組成為氯仿∶甲醇∶醋酸＝3∶3∶1。展開後，苔黑酚-硫酸法證實反應產物。
結果證實，瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3均裂解瓊脂己糖、瓊脂八糖、新瓊脂己糖和瓊脂糖。
使瓊脂糖酶1-7作用於瓊脂己糖獲得的薄層層析結果示於
圖1。使瓊脂糖酶4-3作用於瓊脂己糖獲得的薄層層析結果示於圖2。在
圖1和2中，在相應的道上展開的樣品如下道1瓊脂二糖；道2瓊脂四糖；道3瓊脂己糖；道4與本發明瓊脂糖酶反應的瓊脂己糖；道5瓊脂二糖和瓊脂四糖的混合物。由這些圖可知，本發明的α-瓊脂糖酶消化瓊脂己糖產生瓊脂二糖和瓊脂四糖。
(2)鑑定α-瓊脂糖酶反應的產物在10mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣和10mM氯化鈉中含有1.0％濃度瓊脂糖L03的溶液2.0ml中加入瓊脂糖酶1-7或瓊脂糖酶4-3。使所述混合物於42℃反應60分鐘。反應後，取部分反應混合物過凝膠過濾柱(Tosoh，TSKgel α-2500)，採用70％乙腈作洗脫劑、流速0.8ml/分鐘進行層析。收集保留時間約26分鐘洗脫的流分，用旋轉蒸發器濃縮至幹。測定產物重量約4mg。
利用JNM-EX270 FT NMR系統(Nippon Denshi)經核磁共振分析流分證實，各酶作用由瓊脂糖產生而且包含於所述流分的物質為瓊脂四糖。因此，證實瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3均可水解瓊脂糖分子中D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖之間的α-1，3鍵，產生包含瓊脂四糖的瓊脂寡糖。
(3)反應pH
製備10μl反應混合物，它包含1％瓊脂糖L03、10mM氯化鈣和10mM氯化鈉，採用終濃度為10mM的括號內所示緩衝液將反應混合物的pH調節至以下值4.5(醋酸鹽緩衝液)；5.5(蘋果酸鹽緩衝液)；6.0、6.5(醋酸鹽緩衝液)；或7.0、7.5或8.8(tris緩衝液)。向其中加入10μl酶溶液。使混合物於42℃反應1小時。使反應混合物進行薄層層析，用氯仿∶甲醇∶醋酸＝3∶3∶1(v/v/v)展開。通過苔黑酚-硫酸法證實反應產物。結果證實，瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3分別在中性至弱酸性條件下和弱鹼性至弱酸性條件下呈現其消化瓊脂糖的活性。
(4)最適溫度於不同溫度下檢測瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3的酶活性。對於瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-4而言，抑制酶失活而且反應迅速進行的溫度為37-42℃。
(5)熱穩定性於48℃、50℃或60℃加熱瓊脂糖酶1-7或瓊脂糖酶4-3的純化酶溶液30秒鐘。然後在所加熱的溶液中加入含0.2％濃度瓊脂糖L03的10mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣和10mM氯化鈉的溶液。使混合物於42℃反應1小時。用沸水加熱1分鐘終止反應。按照實施例1所述測定活性的方法定量反應產物。結果，瓊脂糖酶1-7於48℃處理後保留其25％活性，而瓊脂糖酶4-3於50℃處理後保留其22％活性，沒有熱處理的活性定義為100％。
(6)分子量通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳測定瓊脂糖酶1-7的分子量。用含SDS的10-20％聚丙烯醯胺梯度凝膠，將瓊脂糖酶1-7和分子量標記物(Bio-Rad，肌球蛋白(m.w.200,000)，β-半乳糖苷酶(m.w.116,250)、磷酸化酶b(m.w.97,400)、牛血清白蛋白(m.w.66,200)、卵清蛋白(m.w.45,000)、碳酸酐酶(m.w.31,000)、胰蛋白酶抑制劑(m.w.21,500)、溶菌酶(m.w.14,400))一起電泳。根據基於在凝膠中的遷移率測定，瓊脂糖酶1-7的分子量約95,000道爾頓。
通過平衡密度梯度離心測定瓊脂糖酶4-3的分子量。通過變化緩衝液中的15％-35％的甘油濃度製備密度梯度，所述緩衝液含有10mMtris-鹽酸(pH 7.0)、10mM氯化鈣和50mM氯化鈉。用2個5-ml離心管制備4.8ml線性密度梯度，使得最低層的甘油濃度為35％，而最高層的甘油濃度為15％。將100μl溶液覆蓋於一支離心管上層液，所述溶液含15μl分子量標記物Low Range(Bio-Rad)和15％濃度甘油的上述緩衝液。使100μl瓊脂糖酶4-3酶製劑覆蓋於另一支離心管上層液。利用擺動式轉子於45,000rpm、4℃將兩支離心管離心21小時。離心後，從每支離心管的頂部至底部收集各含250μl緩衝液的流分1-20。對從加入分子量標記物的離心管收集的相應流分進行SDS-PAGE。對從加入酶製劑的離心管收集的相應流分進行SDS-PAGE以及測量酶活性。根據含分子量標記物的流分的SDS-PAGE結果，在相當於分子量約65,000-85,000的流分第8-10號檢測到α-瓊脂糖酶活性峰。根據這些結果以及含所述酶製劑的流分的SDS-PAGE結果，估計瓊脂糖酶4-3的分子量約85,000。
(7)利用Edman降解法分析胺基酸序列用Edman降解法測定實施例1和2獲得的α-瓊脂糖酶1-7和α-瓊脂糖酶4-3的胺基酸序列。利用10-20％聚丙烯醯胺梯度凝膠，對含相當於10皮摩爾酶蛋白的瓊脂糖酶1-7或瓊脂糖酶4-3的純化酶製劑進行SDS-PAGE。電泳後，把在凝膠中分離的酶印跡到膜ProBlot(AppliedBiosystems)上。用蛋白質測序儀G1000A(Hewlett Packard)分析吸附有酶的膜部分。結果測得瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3分別包含胺基酸序列P1Asp-Thr-Leu-Ser-Val-Glu-Ala-Glu-Met-Phe(SEQ ID NO1)和胺基酸序列P2Gly-Asp-Ile-Val-Ile-Glu-Leu-Glu-Asp-Phe-Asp-Ala-Thr-Gly-Thr-Thr-Gly-Arg-Val-Ala(SEQ ID NO2)。
實施例4產生瓊脂寡糖以1.0％(w/v)濃度在2ml反應緩衝液(10mM tris-鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣、10mM氯化鈉)中加入瓊脂糖L03。再向其中加入2U純化的瓊脂糖酶1-7製劑。使混合物於42℃反應16小時。反應後，使反應混合物通過0.22-μm濾膜(Millipore，編號SLGVL040S)過濾。在與在實施例1中用於測定本發明的所述酶的活性的相同條件下，利用高效液相層析分析過濾後的反應混合物，以測定所產生的瓊脂寡糖。結果在反應混合物中檢測到瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂己糖。因此，證實上述酶反應產生這些較小的瓊脂寡糖。
實施例5用TKR1-7AGα和TKR4-3AGα製備染色體DNA製備人工海水(產品名稱Jamarine S；Jamarine Laboratory)。分別以0.3％(w/v)和0.02％(w/v)濃度向其中加入蛋白腖(DIFCO，編號0123-17-3)和酵母提取物(DIFCO，編號0127-17-9)。然後用3M碳酸鈉將pH調節至8.0。以0.1％(w/v)濃度向其中加入瓊脂(Nacalai Tesque，編號010-28)。用高壓滅菌器滅菌混合物。將10μlα-瓊脂糖酶生產菌株TKR1-7AGα和TKR4-3AGα之一的甘油原種接種到2ml所述培養基中，於25℃培養過夜。將1ml所述培養物接種到100ml所述相同培養基中，於25℃培養過夜。然後以8,000×g離心10分鐘收集細胞。將細胞懸浮於10ml緩衝液A(100mM氯化鈉、100mM tris-鹽酸鹽(pH 8.0)、10mM EDTA(pH 8.0))中。向其中加入0.25ml溶菌酶溶液(20mg/ml)。使混合物於37℃溫育1小時。然後向其中加入2.5ml含5％濃度SDS的緩衝液A。振搖下使獲得的混合物於60℃溫育20分鐘。向其中加入1.5ml蛋白酶K溶液(20mg/ml)。使混合物於37℃溫育過夜。然後加入幾乎等體積的酚，室溫下輕輕振搖混合物約10分鐘。以2,000×g離心混合物10分鐘。將上清液轉移到冷乙醇中。用玻棒纏繞染色體DNA。重複所述步驟2次後，加入50μl RNA酶溶液(10mg/ml)，使所述混合物於37℃溫育10分鐘。通過乙醇沉澱從所述溶液回收染色體DNA，並懸浮於5ml緩衝液B(140mM氯化鈉、20mM tris-鹽酸鹽(pH 7.5)、1mM EDTA(pH 7.5))中。用相同緩衝液透析所述懸浮液過夜。然後從TKR1-7AGα和TKR1-7AGα分別獲得約1.5mg和約3.1mg染色體DNA。根據OD260nm/280nm檢測各DNA的純度。在各情況下純度測定值均約1.8。染色體DNA用於下文所述的克隆。
實施例6克隆α-瓊脂糖酶1-7基因用1.0％低熔點瓊脂糖凝膠對10μg用限制酶BamHI部分消化的TKR1-7AGα染色體DNA進行電泳。用溴化乙錠染色後，在紫外線照射下切取相當於4-10kb的部分。通過按照常規方法熱熔化從凝膠提取以及純化DNA。利用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo)使回收的DNA片段插入質粒pUC19(Takara Shuzo)的BamHI位點中。用質粒文庫轉化大腸桿菌JM109。使轉化體在含1.5％(w/v)濃度瓊脂和50μg/ml濃度氨苄青黴素的LB瓊脂培養基上生長。於37℃培養過夜後，一個平板上生長約1000個轉化體。使20個平板再於25℃培養4天。結果觀測到2個菌落周圍的瓊脂降解。把各菌株接種到2ml含氨苄青黴素的LB培養基中，於37℃培養過夜。檢測到由獲得細胞製備的粗提取物的α-瓊脂糖酶活性。按照常規方法提取各轉化體的質粒DNA。用限制酶BamHI消化測得各轉化體的插入DNA長度約7.2kb。根據限制酶消化譜型認為這些雜種質粒彼此相同，命名為pAA1。將用質粒pAA1轉化的大腸桿菌命名並表示為大腸桿菌JM109/pAA1，於1999年5月26日(最初保藏日期)根據布達佩斯條約以保藏號FERM BP-6992保藏於日本國際貿易和工業部工業科技局的國立生命科學和人體技術研究所。
根據SEQ ID NO1表示的瓊脂糖酶1-7的胺基酸序列P1，設計SEQ ID NO3表示的混合引物1。採用該引物和與pUC載體特異性雜交、SEQ ID NO4表示的引物2以及pAA1作為模板進行PCR。
在0.5-ml試管中加入50ng pAA1、5μl ExTaq緩衝液、8μl dNTP混合物、1μl混合的引物1、1μl引物2和0.5μl TaKaRa ExTaq，以進行PCR。再加入無菌水使總體積為50μl。在所述溶液上方覆蓋50μl礦物油後，將試管置於自動基因擴增儀Thermal Cycler(Takara Shuzo)中。於94℃變性2分鐘後，進行30個PCR循環。每個循環包括於94℃變性1分鐘，引物於50℃退火2分鐘以及於72℃進行合成反應3分鐘。PCR後，使全部反應混合物在1.0％低熔點瓊脂糖凝膠中進行電泳。使從所述凝膠切除的約3.5kb的擴增DNA片段與pT7Blue(Novagen)連接。用Tap DNA聚合酶，按照雙脫氧鏈終止法從其N端側測定該DNA片段的核苷酸序列。根據如上所述測定的序列設計SEQID NO5表示的引物。利用該引物測定上遊核苷酸序列。結果發現，在編碼對應於SEQ ID NO1表示的胺基酸序列P1的核苷酸序列的上遊存在編碼27個胺基酸的核苷酸序列，在其進一步的上遊區存在SD樣序列，而pAA1含有編碼總計925個胺基酸組成的多肽的讀框(ORF)。該讀框的核苷酸序列和此讀框編碼的胺基酸序列分別示於SEQID NO12和14。從微生物TKR1-7AGα純化的α-瓊脂糖酶的N-末端序列P1等於SEQ ID NO13胺基酸序列第28號至第37號胺基酸的序列。
實施例7克隆α-瓊脂糖酶4-3基因根據SEQ ID NO2表示的瓊脂糖酶4-3的胺基酸序列P2第2-11號以及第12-20號胺基酸的序列，設計混合的引物3和4。利用LAPCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)使用這些引物克隆瓊脂糖酶4-3基因。混合的引物3和4的序列分別示於SEQ ID NO6和7。
如下進行第一輪PCR。用限制酶BamHI完全消化由實施例5的TKR4-3AGα製備的染色體DNA。用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo)使BamHI接頭連接到消化的DNA末端。將一部分連接混合物置於0.5-ml試管中，以進行PCR，其中加入5μl 10×LA PCR緩衝液、8μl dNTP混合物、1μl混合引物3、1μl LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)附帶的引物Cl和0.5μl TaKaRa LATaq。再加入無菌水使總體積為50μl。在所述溶液上方覆蓋50μl礦物油後，將試管置於自動基因擴增儀Thermal Cycler(Takara Shuzo)中。於94℃變性2分鐘後，進行30個PCR循環。每個循環包括於94℃變性1分鐘，引物於50℃退火2分鐘以及於72℃進行合成反應3分鐘。
用如此獲得的第一輪PCR產物進行第二輪PCR。在第一輪PCR所用的相同條件下，用1μL第一輪PCR反應混合物作模板，以及混合引物4和LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)附帶的引物C2的組合進行PCR。去除上層覆蓋的礦物油後，使5μl反應混合物在1.0％瓊脂糖凝膠中進行電泳。利用溴化乙錠染色DNA證實擴增的產物。結果觀測到約2kb的擴增產物，將所述DNA片段命名為4-3N。
從瓊脂糖凝膠切除此擴增片段，按照常規方法提取純化，並將其連接到載體pT7Blue。用連接混合物轉化大腸桿菌JM109。用獲得的轉化體按照雙脫氧鏈終止法測定4-3末端區核苷酸序列。
根據測定的4-3N末端區序列設計引物。利用LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)克隆位於4-3N上遊以及下遊的DNA片段。
根據如上所述測定的4-3N末端區中的N-末端周圍區序列設計、分別以SEQ ID NO8和9表示的引物5和6，使用它們克隆位於4-3N上遊的DNA片段。如上所述進行克隆，以克隆4-3N，不同的是退火引物的溫度變為55℃。結果獲得約1.0kb的DNA片段，命名為4-3U。
根據如上所述測定的4-3N末端區中的C-末端周圍區序列設計、分別以SEQ ID NO10和11表示的引物8和9，使用它們克隆位於4-3N下遊的DNA片段。如上所述進行克隆，以克隆4-3N，不同的是退火引物的溫度變為55℃。結果獲得約2.0kb的DNA片段，命名為4-3C。
將由此獲得的4-3UN和4-3C片段各自連接到載體pT7Blue(Novagen)。按照雙脫氧鏈終止法測定核苷酸序列。對如上所述測定的4-3N、4-3UN和4-3C DNA片段的核苷酸序列進行分析和序列對比，揭示一個讀框(ORF)編碼951個胺基酸組成的多肽。所述讀框的核苷酸序列和所述讀框的所述核苷酸序列編碼的胺基酸序列分別以SEQ IDNO13和15表示。在4-3UN中，發現編碼胺基酸序列P2的核苷酸序列、編碼183個胺基酸的上遊核苷酸序列和更上遊的SD樣序列。測得從微生物TKR4-3純化的α-瓊脂糖酶的N-末端胺基酸序列P2等於SEQ ID NO15胺基酸序列第184號至第203號胺基酸的序列。
如上所述獲得的瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3的胺基酸序列以及所述基因的核苷酸序列與β-瓊脂糖酶胺基酸序列及其基因的核苷酸序列沒有同源性，已知β-瓊脂糖酶以不同於本發明的瓊脂糖酶的方式裂解瓊脂糖的瓊脂糖消化酶。因此，認為這些序列絕對是新型的。
實施例8構建表達α-瓊脂糖酶1-7的質粒合成具有SEQ ID NO18序列的引物10。引物10是這樣一種引物它在第8至13號鹼基含有限制酶NdeI的識別序列，在第14至25號鹼基含對應於α-瓊脂糖酶1-7胺基酸序列(SEQ ID NO14)中的第28至31號胺基酸的胺基酸序列的核苷酸序列。
採用引物10和與pAA1的一部分載體pUC19雜交的引物2(SEQID NO4)以及用pAA1作模板進行PCR。
在0.5-ml試管中加入引物10和引物2各10皮摩爾、10ng作為模板的實施例6獲得的pAA1、5μl 10×ExTaq緩衝液、8μl dNTP混合物和0.5μl TaKaRa ExTaq，以進行PCR。再加入無菌水使總體積為50μl。將試管置於自動基因擴增儀Thermal Cycler(Takara Shuzo)中。於94℃變性2分鐘後，進行25個PCR循環。每個循環包括94℃1分鐘，55℃2分鐘以及72℃3分鐘。通過乙醇沉澱濃縮PCR產物並使其脫鹽，用限制酶NdeI(Takara Shuzo)和BamHI(Takara Shuzo)雙重消化，然後使其在1.0％瓊脂糖凝膠中進行電泳。分離、提取以及純化NdeI-BamHI消化產物。用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo)使純化產物與用NdeI和BamHI消化的pKF19k(Takara Shuzo)混合併連接。用10μl連接混合物轉化大腸桿菌JM109。使轉化體生長於含1.5％(w/v)濃度的瓊脂和50μg/ml濃度的卡那黴素的LB培養基上。用白色菌落製備質粒，進行DNA測序，選擇所述PCR產物正確插入的質粒，命名為pAA201。pAA201是編碼瓊脂糖酶1-7胺基酸序列(SEQ ID NO14)第28至925號胺基酸的胺基酸序列的質粒。
將插入pAA201的轉化體接種到2.5ml含50μg/ml卡那黴素和10mM氯化鈣的LB液體培養基中，於37℃培養過夜。取一部分培養物接種到2.5ml相同新鮮培養基中，於25℃培養直到指數生長期為止。此時以1.0mM終濃度加入IPTG。繼續於15℃培養過夜，以誘導目的蛋白表達。然後離心收集細胞，將其懸浮於150μl細胞破碎溶液(20mM tris鹽酸鹽(pH 7.0)、10mM氯化鈣、10mM氯化鈉)中。超聲破碎細胞。離心使上清液提取物和沉澱物彼此分離，並用作利用瓊脂糖作底物檢測α-瓊脂糖酶活性的樣品。然後觀測提取物的活性。在100ml培養物中含有的活性比野生型菌株TKR1-7AGα活性高約25倍。
實施例9採用pT7BlueT載體表達α-瓊脂糖酶1-7的系統合成具有SEQ ID NO19序列的引物11。引物11是這樣一種引物它在第13至30號鹼基具有對應於α-瓊脂糖酶1-7胺基酸序列(SEQID NO14)第28至33號胺基酸序列的核苷酸序列。
用引物11和引物2並使用pAA1作為模板進行PCR。在1.0％瓊脂糖凝膠中通過電泳分離PCR產物，提取以及純化。使純化PCR產物連接到設計用於克隆的載體pT7BlueT(Takara Shuzo)，以構建表達載體。用於PCR的條件與實施例8所述條件相同。進行DNA測序，並選擇正確插入所述PCR產物的質粒。
選定的雜種質粒命名為pAA301。pAA301是一個類似於pAA201的質粒，編碼α-瓊脂糖酶1-7胺基酸序列(SEQ ID NO14)第28至925號胺基酸序列。
使用pAA301轉化大腸桿菌JM109，將獲得的轉化體接種到含50μg/ml氨苄青黴素和10mM氯化鈣的LB培養基中。利用IPTG誘導目的蛋白表達，按照以上實施例8所述測定α-瓊脂糖酶活性。然後觀測到提取物的活性。100ml所述培養物含有的活性比TKR1-7AGα的活性高約100倍。
實施例10利用pET16b表達α-瓊脂糖酶1-7的系統合成具有SEQ ID NO20序列的引物12。引物12是這樣一種引物它在第17至34號鹼基具有與對應於α-瓊脂糖酶1-7胺基酸序列(SEQ ID NO14)第919至924號胺基酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，在第9至14號鹼基具有限制酶BamHI識別序列。
利用引物10(SEQ ID NO18)和引物12(SEQ ID NO18)並使用pAA1作為模板，在實施例8所述條件下進行PCR。通過乙醇沉澱濃縮所擴增的片段並使其脫鹽，用NdeI(Takara Shuzo)和BamHI(TakaraShuzo)消化，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，提取以及純化。使所述產物連接到用NdeI和BamHI消化的pET16b(Takara Shuzo)中。獲得的雜種質粒命名為pAA401。pAA401是類似於pAA201和pAA301的質粒，編碼α-瓊脂糖酶1-7胺基酸序列(SEQ ID NO14)第28至925號胺基酸的胺基酸序列。
使用pAA401轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，用獲得的轉化體如以上實施例8所述測定α-瓊脂糖酶活性，不同的是用氨苄青黴素代替卡那黴素作為藥物。然後觀測到提取物的活性。100ml所述培養物含有的活性比TKR1-7AGα的活性高約100倍。
實施例11構建表達α-瓊脂糖酶4-3的質粒合成具有SEQ ID NO21序列的引物13和具有SEQ ID NO22序列的引物14。
引物13是這樣一種引物它在第12至17號鹼基具有限制酶NdeI識別序列，在第18至29號鹼基具有與對應於α-瓊脂糖酶4-3胺基酸序列(SEQ ID NO15)第184至187號胺基酸的胺基酸序列的核苷酸序列。
引物14是這樣一種引物它在第8至13號鹼基具有限制酶BamHI識別序列，並且具有與克隆獲得的α-瓊脂糖酶4-3基因的讀框下遊區雜交的序列。
利用引物13和14並使用野生型菌株TKR4-3AGα的染色體DNA作為模板進行PCR。製備PCR反應混合物，它含有引物13和14各10皮摩爾、10ng用作模板的用限制酶BamHI消化的野生型菌株TKR4-3AGα的染色體DNA和ExTaq(Takara Shuzo)。於94℃變性2分鐘後，進行25個PCR循環。每個循環包括94℃1分鐘，50℃2分鐘以及72℃3分鐘。通過乙醇沉澱濃縮PCR產物，用限制酶NdeI(Takara Shuzo)和BamHI(Takara Shuzo)雙重消化。在1.0％瓊脂糖凝膠中電泳分離NdeI-BamHI消化產物，提取以及純化。如實施例8所述構建具有pKF19k的雜種質粒，並轉化大腸桿菌JM109。用獲得的轉化體製備質粒，選擇所述PCR產物以正確方向插入的的質粒，命名為pAH101。pAH101是編碼α瓊脂糖酶4-3胺基酸序列(SEQ ID NO15)第184至951號胺基酸的胺基酸序列的質粒。
用質粒pAH101轉化的大腸桿菌命名並表示為大腸桿菌JM109/pAH101，於2000年1月27日根據布達佩斯條約以保藏號FERM BP-7008保藏於日本國際貿易和工業部工業科技局的國立生命科學和人體技術研究所(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)。
如以上實施例8所述測定具有pAH101的轉化體的α-瓊脂糖酶活性。然後觀測到所述提取物的活性。100ml培養物含有的活性比野生型菌株TKR4-3AGα的活性高約15倍。
實施例12利用pET16b表達α-瓊脂糖酶4-3的系統合成具有SEQ ID NO23序列的引物15。
引物15是這樣一種引物它在第10至15號鹼基具有限制酶BamHI識別序列，在第18至35號鹼基具有與對應於α-瓊脂糖酶4-3胺基酸序列(SEQ ID NO15)第945至950號胺基酸的胺基酸序列的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
利用引物13和15並使用實施例11所述的野生型菌株TKR4-3AGα的染色體DNA作為模板，在實施例8所述的條件下進行PCR。通過乙醇沉澱濃縮所擴增的PCR片段，用限制酶NdeI和BamHI消化，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，提取以及純化。使所述產物連接到用NdeI和BamHI消化的pET16b(Takara Shuzo)中。獲得的雜種質粒命名為pAH201。pAH201是編碼α瓊脂糖酶4-3胺基酸序列(SEQ ID NO15)第184至950號胺基酸的胺基酸序列的質粒。
用pAH201轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，獲得的轉化體用來如以上實施例8所述測定α-瓊脂糖酶活性，不同的是用氨苄青黴素代替卡那黴素作為藥物。然後觀測到所述提取物的活性。100ml培養物含有的活性比TKR4-3AGα活性高約75倍。
實施例13修飾蛋白的活性如下所述通過基因工程製備修飾蛋白。測定修飾蛋白的α-瓊脂糖酶活性。
合成具有SEQ ID NO24序列的引物16。
引物16是這樣一種引物它在第3至11號鹼基具有對應於α瓊脂糖酶1-7胺基酸序列(SEQ ID NO14)的第172至174號胺基酸的胺基酸序列的核苷酸序列，在第18至32號鹼基具有對應於α-瓊脂糖酶1-7胺基酸序列(SEQ ID NO14)的第177至181號胺基酸的胺基酸序列的核苷酸序列，並且在第12-17號鹼基具有限制酶NdeI識別序列。
利用引物16和引物2(SEQ ID NO4)並使用pAA1作為模板進行PCR。使所述產物連接到pKF19k，如實施例8所述轉化大腸桿菌JM109。用獲得的轉化體製備質粒。通過證實連接位點的DNA序列獲得的雜種質粒命名為pAA501。pAA501是編碼缺失α-瓊脂糖酶1-7直至第176號胺基酸的部分的多肽(即SEQ ID NO14第177至925號胺基酸的胺基酸序列)的質粒。
如實施例8所述培養用pAA501轉化的大腸桿菌JM109，並用IPTG誘導pAA501編碼的蛋白的表達，然後觀測提取物的α-瓊脂糖酶活性。隨後觀察到所述提取物的α-瓊脂糖酶活性。
實施例14DNA印跡雜交用插入α-瓊脂糖酶4-3克隆pAH101的片段作探針，針對野生型菌株TKR1-7AGα的染色體DNA進行DNA雜交。按照DIG DNA標記/檢測試劑盒(Roche)的方案進行以下步驟。在這種情況下，用限制酶NdeI和BamHI消化pAH101。通過瓊脂糖凝膠電泳分離產生的約2.4kb片段，提取和純化。按照上述試劑盒的方案標記約1.0μg所述純化片段並用作探針。
用BamHI消化約2.0μg TKR1-7AGα的染色體DNA，在1.0％瓊脂糖凝膠中電泳。按照常規方法用0.4N氫氧化鈉將DNA片段轉移到硝酸纖維素膜(Amersham)上。然後於68℃預雜交1小時。熱變性標記探針，並加入其中。用含6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt’s和100mg/ml鯡魚精子DNA的溶液於68℃雜交過夜。所述膜用2×SSC、0.1％(w/v)SDS中於室溫下洗滌2次，每次5分鐘，然後用0.1×SSC、0.1％(w/v)SDS於68℃洗滌2次，每次15分鐘，以去除過量的探針。然後按照所述方案進行檢測反應。結果在相應於約7.2kb的位置觀測到一條帶。如上所述，通過利用α-瓊脂糖酶4-3基因作探針在嚴格條件下進行檢測，能夠檢測到編碼活性α-瓊脂糖酶的基因，即野生型菌株TKR1-7AGα的α-瓊脂糖酶的基因。比較瓊脂糖酶1-7和瓊脂糖酶4-3讀框的完整序列揭示，它們的胺基酸序列和基因的核苷酸序列的同源性分別為51％和61％。
工業實用性本發明提供新型α-瓊脂糖酶。可利用所述酶直接由瓊脂糖產生在其還原末端具有3，6-脫水-L-半乳糖的低聚合程度的瓊脂寡糖(例如瓊脂二糖和瓊脂四糖)。用本發明的α-瓊脂糖酶產生的瓊脂寡糖具有生理活性，例如誘導細胞凋亡活性、抑癌活性、各種抗氧化劑活性、免疫調節活性和抗過敏活性。因此，它們可用於藥用組合物、食品和飲料領域。
本發明首次公開了α-瓊脂糖酶的胺基酸序列和核苷酸序列。因此，可提供編碼具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的基因。本發明還提供利用所述基因通過基因工程生產具有α-瓊脂糖酶活性的多肽的工業上有用的方法。
此外，在利用所述基因的基因工程生產方法中，不需要在培養基中加入瓊脂糖誘導產生α-瓊脂糖酶。因此，認為培養時能夠節省力而且所述酶容易純化。
另外，基於本發明首次提供α-瓊脂糖酶基因的事實，根據所述基因的信息，本發明提供所述基因編碼的重組多肽、特異性結合所述多肽的抗體或其片段、以及特異性雜交α-瓊脂糖酶的探針或引物。
序列表獨立文本SEQ ID NO1瓊脂糖酶1-7的N-末端胺基酸序列。
SEQ ID NO2瓊脂糖酶4-3的N-末端胺基酸序列。
SEQ ID NO3設計用於利用pAA1作為模板進行PCR的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO4設計用於利用pAA1作為模板進行PCR的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO5設計用於對pAA1進行DNA測序的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO6設計用於擴增DNA片段4-3N的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO7設計用於擴增DNA片段4-3N的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO8設計用於克隆DNA片段4-3UN的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO9設計用於克隆DNA片段4-3UN的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO10設計用於克隆DNA片段4-3C的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO11設計用於克隆DNA片段4-3C的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO12瓊脂糖酶1-7基因中的ORF核苷酸序列。
SEQ ID NO13瓊脂糖酶4-3基因中的ORF核苷酸序列。
SEQ ID NO14瓊脂糖酶1-7的胺基酸序列。
SEQ ID NO15瓊脂糖酶4-3的胺基酸序列。
SEQ ID NO16設計用於擴增16S核糖體的DNA片段的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO17設計用於擴增16S核糖體的DNA片段的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO18設計用於構建表達瓊脂糖酶1-7的質粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO19設計用於構建表達瓊脂糖酶1-7的質粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO20設計用於構建表達瓊脂糖酶1-7的質粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO21設計用於構建表達瓊脂糖酶4-3的質粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO22設計用於構建表達瓊脂糖酶4-3的質粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO23設計用於構建表達瓊脂糖酶4-3的質粒的寡核苷酸。
SEQ ID NO24設計用於構建表達瓊脂糖酶1-7的質粒的寡核苷酸。
權利要求
1.一種具有以下物理化學特性的α-瓊脂糖酶(1)作用水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵；(2)底物特異性作用於瓊脂糖和瓊脂己糖以及比瓊脂己糖更長的瓊脂寡糖，但是對瓊脂四糖沒有作用；(3)最適溫度於55℃或更低溫度呈現其酶活性；以及(4)熱穩定性於48℃處理30秒鐘後保留其20％或更高活性。
2.按照權利要求1的α-瓊脂糖酶，它可得自微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)。
3.按照權利要求1或2的α-瓊脂糖酶，它包含SEQ ID NO14胺基酸序列的第177號胺基酸至第925號胺基酸的749個殘基組成的胺基酸序列、或在所述749個殘基組成的胺基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個胺基酸的胺基酸序列。
4.按照權利要求1或2的α-瓊脂糖酶，它包含SEQ ID NO15胺基酸序列的第184號胺基酸至第950號胺基酸的767個殘基組成的胺基酸序列、或在所述767個殘基組成的胺基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個胺基酸的胺基酸序列。
5.一種基因，它編碼權利要求1-4任一項定義的α-瓊脂糖酶。
6.按照權利要求5的基因，它可得自微生物TKR1-7AGα(FERMBP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)。
7.按照權利要求5或6的基因，它編碼一種α-瓊脂糖酶，該α-瓊脂糖酶包含SEQ ID NO14胺基酸序列的第177號胺基酸至第925號胺基酸的749個殘基組成的胺基酸序列、或在所述749個殘基組成的胺基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個胺基酸的胺基酸序列。
8.按照權利要求5或6的基因，它編碼一種α-瓊脂糖酶，該α-瓊脂糖酶包含SEQ ID NO15胺基酸序列的第184號胺基酸至第950號胺基酸的767個殘基組成的胺基酸序列、或在所述767個殘基組成的胺基酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個胺基酸的胺基酸序列。
9.按照權利要求5或6的基因，它包含SEQ ID NO12核苷酸序列的第529號鹼基至第2775號鹼基的2247個鹼基組成的核苷酸序列、或在所述2247個鹼基組成的核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個鹼基的核苷酸序列。
10.按照權利要求5或6的基因，它包含SEQ ID NO13核苷酸序列的第550號鹼基至第2850號鹼基的2301個鹼基組成的核苷酸序列、或在所述2301個鹼基組成的核苷酸序列中取代、缺失、加入和/或插入一個或多個鹼基的核苷酸序列。
11.一種基因，它可與權利要求5-10任一項定義的基因在嚴格條件下雜交並編碼具有以下物理化學特性的α-瓊脂糖酶(1)作用水解3，6-脫水-L-半乳糖和D-半乳糖之間的α-1，3鍵；(2)底物特異性作用於瓊脂糖和瓊脂己糖以及比瓊脂己糖更長的瓊脂寡糖，但是對瓊脂四糖沒有作用；(3)最適溫度於55℃或更低溫度呈現其酶活性；以及(4)熱穩定性於48℃處理30秒鐘後保留其20％或更高活性。
12.一種重組DNA分子，它包含權利要求5-11任一項定義的基因。
13.一種轉化體，它帶有權利要求12定義的重組DNA分子。
14.一種產生權利要求1-4任一項定義的α-瓊脂糖酶的方法，包括培養能夠產生權利要求1-4任一項定義的α-瓊脂糖酶的微生物以及從所述培養物收集所述α-瓊脂糖酶。
15.按照權利要求14的方法，包括培養屬於微生物TKR1-7AGα(FERM BP-6990)或微生物TKR4-3AGα(FERM BP-6991)所屬微生物屬的微生物以及從所述培養物收集所述α-瓊脂糖酶。
16.一種產生權利要求1-4任一項定義的α-瓊脂糖酶的方法，包括培養權利要求13定義的轉化體以及從所述培養物收集α-瓊脂糖酶。
17.一種產生瓊脂寡糖的方法，包括用權利要求1-4任一項定義的α-瓊脂糖酶消化瓊脂糖以及從獲得的消化物收集瓊脂寡糖。
全文摘要
具有以下物理化學特性的α－瓊脂糖酶:(1)作用:水解3,6－脫水－L－半乳糖和D－半乳糖之間的α－1,3鍵;(2)底物特異性:作用於瓊脂糖和瓊脂己糖以及更長瓊脂寡糖,而不作用於瓊脂四糖;(3)最適溫度:於55℃或更低溫度呈現其酶活性;以及(4)熱穩定性:於48℃處理30秒鐘後保有其20%或更高活性。
文檔編號C12N9/24GK1347452SQ00806331
公開日2002年5月1日 申請日期2000年2月21日 優先權日1999年2月23日
發明者友野潤, 野村佳子, 佐川裕章, 酒井武, 加藤鬱之進 申請人:寶酒造株式會社