用於核酸的振蕩擴增反應的製作方法

2023-05-22 01:51:06

用於核酸的振蕩擴增反應的製作方法
【專利摘要】本發明的一個實施方案提供擴增包含在樣品中的核酸靶序列的模板的方法。該方法包括將所述樣品與擴增反應混合物接觸，所述擴增反應混合物含有與核酸靶序列的模板互補的引物。所述反應的溫度在高溫和低溫之間振蕩，其中在多個溫度循環期間，溫度的變化不大於約20℃。核酸靶序列的模板被擴增。
【專利說明】用於核酸的振蕩擴增反應
[0001]對相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求於2011年4月20日提交的名稱為「用於核酸的振蕩擴增反應」的美國臨時專利申請號61 / 477，437的優先權和利益，並且其說明書和權利要求通過引用引入本文。
[0003]本申請要求於2011年4月20日提交的名稱為「用於核酸檢測和鑑定的集成設備」的美國臨時專利申請號61 / 477，357的優先權和利益，並且其說明書和權利要求通過引用引入本文。
[0004]關於聯邦資助的研究或開發的申明
[0005]不適用。
[0006]在光碟上遞交的材料的通過引用的結合
[0007]不適用。
[0008]授予版權的材料
[0009]不適用。
[0010]關於序列表、表格或電腦程式
[0011] 申請人:在此遞交 序列表，其為文本文件，題為041812_ST25.txt,創建於2012年4月20日，具有IOK千字節，符合ASCII，並且通過引用引入本文。
[0012]發明背景
[0013]發明領域(【技術領域】):
[0014]本發明的實施方案涉及通過在任意給定的熱聚合循環期間使反應溫度在小範圍內振蕩，優選地在不大於20°C的範圍內振蕩進行核酸靶序列的依賴於模板的擴增的方法和設備。
【背景技術】:
[0015]注意，以下討論引用多篇出版物和文獻。本文中給出對這些文獻的討論是為了科學原理的更完全的背景，並且不被視為是承認這些出版物是用於確定專利性的現有技術。
[0016]在分子生物學中核酸的擴增是最必不可少的技術之一，其在研究、遺傳測試、農業和法醫學中廣為使用。最常見的擴增方法是聚合酶鏈反應(PCR)，其中，特異性核酸靶序列的優勢在溶液中呈指數增加(參見美國專利號4，683，195,4, 683，202和4，800，159)。PCR反應採用兩種寡核苷酸引物，所述引物雜交待擴增的靶序列的上遊(5，)或下遊(3』 )的DNA雙螺旋的相反鏈。(通常熱穩定的)DNA聚合酶用於在5』 一 3』方向通過添加脫氧核苷三磷酸(dNTPs)使雜交的引物延伸，以便「拷貝」靶序列並且產生雙鏈DNA產物。通過循環反應混合物的溫度(典型地攝氏95°C )，DNA的兩條鏈可以在高溫分離，這允許它們充當模板以用於進一步的引物結合以及在較低溫度(例如55 1:和60 °C)聚合。在重複該過程多次後，單個靶序列可以被擴增成數十億的拷貝。
[0017]雖然PCR是裝備精良的實驗室中的金標擴增方法，但是它相當複雜，需要具有主動加熱和冷卻加熱元件和精確溫度控制的昂貴且複雜的熱循環裝置，並且需要訓練有素的技術人員收集有意義的結果。例如，大多數PCR反應需要在至少兩個溫度(例如95度和57度)之間的快速且精確的循環，這典型地導致使用昂貴和效能低的Peltier發動機(熱電冷卻機制)和精確的溫度控制元件。這樣的固有限制使得PCR不適宜於開發具有成本效益的、護理位點(point-of-care)的核酸診斷(這在缺乏支持性實驗室基礎設施的情況中是有用的)。為了排除一些PCR的大量資源需求，在過去數十年中開發了多種「等溫」擴增技術。在這樣的反應中，可以在單個溫度擴增核酸，不需要昂貴的熱循環儀，並且使得它們更適用於低成本診斷設備。實例包括基於核酸序列的擴增(NASBA)，解旋酶介導的擴增，鏈置換擴增，環介導的等溫擴增(LAMP)等。然而，這些等溫擴增方法通常需要60-90分鐘的擴增時間(由於緩慢的體外動力學酶促過程所致)和在單一溫度點的精確的溫度控制以適應極端嚴格的擴增反應，同樣缺少當場診斷應用所需的穩健性和速度。
[0018]依賴模板的核酸擴增是基於核酸的分子診斷的基礎。在衛生保健、農業中，以及在生物學領域和戰爭的情境中，急切需要穩健的、低成本的、快速的、護理位點的核酸診斷。然而，與現有的PCR或等溫擴增相關的測定化學策略具有顯著的工程和穩健性限制，這使得這樣的擴增方法昂貴且對於資源有限的情況(其中基於核酸的分子可以最大地影響緊急疾病預防和控制)是不實用的。必須對核酸擴增進行相當大的改進以為缺少專門實驗室基礎設施的情況提供可負擔的且穩健的診斷。
[0019]常規PCR依賴高特異性和快速熱循環，通常使溫度變化多達40°C。這樣的擴增方法需要昂貴的儀器以便快速地加熱和(尤其地)冷卻PCR反應混合物，此外還要精確地保持溶液溫度。等溫核酸擴增方法，雖然不需要複雜的熱循環裝置，但是通常是緩慢的(至少60分鐘的反應時間)，不可靠的，並且需要精確的溫度校準。
[0020]在PCR熱循環方法中，PCR循環儀必須具有良好的溫度控制以保持樣品內的溫度均勻性和至少2°C /秒的典型的樣品加熱(和/或冷卻)速率。溫度控制典型地通過反饋迴路系統實現，而溫度均一性通過高導熱性但是體積大的材料如銅實現。高加熱速率通過執行比例積分微分(PID)控制方法實現，這受最大耗散功率和熱容量的限制。高冷卻速率相當難實現並且大體積系`統需要藉助熱電元件(P.Wilding, M.A.Shoffner和L.J.Kricka, Clin.Chem.，1994，40，1815-1817.)(通常稱為 Peltier 元件)或其他手段如 7jC (J.B.Findlay, S.M.Atwood, L.Bergmeyer, J.Chemelli, K.Christy, T.Cummins,W.Donish，T.Ekeze，J.Falvo, D.Patterson，J.Puskas，J.Quenin，J.Shah, D.Sharkey,J.W.H.Sutherland, R.Sutton，H.Warren 和 J.Wellman，Clin.Chem.，1993，39，9，1927-1933)的強制冷卻。這些PCR機是複雜且耗電量大的設備。因為系統體積大，所以其熱時間常數是以分鐘計而不是以秒計，這導致長的過渡時間和不需要的PCR副產物。高的能耗使得不可能製備電池供電的和便攜的PCR系統。
[0021 ] 在基於娃技術的顯微機械加工和生物學微電機系統(bioMEMS)有最近發展的情況下，全世界很多課題組已經開始開發microPCRhPCR)，其是晶片實驗室(lab-on-a-chip)或微型全分析系統(U TAS)的中心部分。研究者遵循兩個基本途徑:使溫度循環的固定系統，具有處於不同溫度的三個區的流動系統。這兩種系統都具有其優點和缺點。固定系統使腔室的溫度循環以便改變PCR溶液的溫度。其不需要泵送系統或其他用於來回移動PCR樣品的裝置。流通系統典型地具有處於三個恆定溫度的區。樣品僅通過在不同溫度的區之間移動來改變溫度。這種PCR系統比第一種更快速，但是它需要執行機制以來回移動樣品。在兩種情況中，加熱器與PCR系統集成，所以丟棄設備以避免在僅進行單次測試後的交叉汙染是不經濟的。這兩種形式展現的主要優點是:與常規設備相比，循環時間減少，並且使用的樣品體積減小。然而，這些PCR晶片使用需要採用昂貴和複雜製造工藝的基質材料如矽，導致非常高的單價。此外，由於獲得提高的表面/體積比所需的極小的反應體積(〈ill)以及用於y PCR晶片的材料的類型，與常規PCR不甚相同的一些效果變得明顯，這包括生物樣品的非特異性吸附、抑制、樣品蒸發和形成氣泡。目前的其他努力還涉及開發溫度循環反應微晶片，所述微晶片集成了固定室和連續流動PCR以進行流通微通道PCR晶片的有效溫度循環，同時具有改變循環數和PCR晶片中的固定室中的溫度區的數目的靈活性。然而，混合PCR設備的有效性仍然正在被確認，並且與所述y PCR晶片方法相關的涉及樣品抑制、吸附和氣泡形成的問題仍然給所有在前面的樣品製備/核酸分離方法以及擴增試劑和反應條件(例如極高的聚合酶濃度、PCR引物濃度等)施加顯著的嚴格性。
[0022]發明概沭
[0023]本發明的一個實施方案提供擴增包含在樣品中的核酸靶序列的模板的方法。所述方法包括將樣品與擴增反應混合物接觸，所述擴增反應混合物包含與核酸靶序列的模板互補的引物。反應溫度在上限溫度和下限溫度之間振蕩，其中在多個溫度循環期間溫度變化不大於約20°C。核酸靶序列的模板被擴增。
[0024]本發明的一個實施方案提供在多個溫度循環期間溫度變化不大於約15°C。另一個實施方案提供在多個溫度循環期間溫度變化不大於約10°c。還一個實施方案提供在多個溫度循環期間溫度變化不大於約5°c。根據本發明的一個實施方案，對於給定的溫度和/或範圍，溫度可以波動(+ / _2°C )。
[0025]本發明的另一個實施方案提供一旦達到上限溫度或下限溫度，在溫度波動內保持溫度達一段時間。備選地，一旦達到溫度範圍內的上限或下限溫度，溫度變化為其它溫度。在一個實施方案中，下限溫度不小於約50°C。在另一個實施方案中，上限溫度不大於約85°C。根據一個實施方案，上限和下限溫度可以變化約+ / _5°C。
[0026]根據本發明的一個實施方案，核酸靶序列的模板可以是單鏈DNA或RNA，雙鏈DNA或RNA，RNA，DNA或其任意組合。靶核酸的長度可小於lOOObp，小於250bp，小於150bp或小於 IOObp0
[0027]一個或多個實施方案可以包括引物對，所述引物對結合核酸模板的相反鏈。該引物對可以具有這樣的長度和GC含量以致解鏈溫度> 65°C。在另一個實施方案中，引物對具有這樣的長度和GC含量以致解鏈溫度≥70°C。例如，引物對中的每個引物獨立地具有35-70個鹼基對的長度。根據本發明的一個實施方案，引物對中的每個引物的解鏈溫度為70-80 0C。在優選的實施方案中，引物對包括正向引物和反向引物，其各自的長度為40-47個鹼基對。
[0028]本發明的另一個實施方案提供擴增包含在樣品中的核酸靶序列的模板的方法。所述方法包括將樣品與擴增反應混合物接觸，所述擴增反應混合物包含長度為35-70個鹼基對並且互補於核酸靶序列的模板的引物或引物對，並且其中引物對中的每個引物的解鏈溫度為70— 80°C。擴增反應混合物也包含DMS0、一價陽離子、二價陽離子、dNTPs和DNA聚合酶。反應溫度在上限溫度和下限溫度之間振蕩，其中在多個溫度循環期間溫度變化不大於約20°C，以及擴增所述核酸靶序列的模板。在優選的實施方案中，二價陽離子選自由以下各項組成的組:鎂，錳，銅，鋅或其任意組合，而一價陽離子選自由以下各項組成的組:鈉，鉀，鋰，銣，銫，銨或其任意組合。在另一個優選的實施方案中，擴增反應混合物包含核酸去穩定劑。在更優選的實施方案中，反應包含DNA聚合酶,所述DNA聚合酶可以是熱穩定的DNA聚合酶。DNA聚合酶可以選自由以下各項組成的組=TAQDNA聚合酶、VentR DNA聚合酶和DeepVentR DNA聚合酶但是不限於此，因為可以包括本文公開的以及本領域已知的其他聚合酶。DNA聚合酶可以包括鏈置換活性。在另一個實施方案中，DNA聚合酶不具有3』 ->5』外切核酸酶活性。在另一個實施方案中，擴增模板的方法還包括加入逆轉錄酶和DNA聚合酶。例如，逆轉錄酶是熱穩定的逆轉錄酶。逆轉錄酶可以選自:AMV-RT、Superscript II逆轉錄酶、Superscript III逆轉錄酶或MMLV-RT,但是不限於此，因為可以使用本領域已知的其他逆轉錄酶。本發明的另一個實施方案還包括向反應混合物添加單鏈結合蛋白，如所公開的。例如，單鏈結合蛋白是熱穩定的單鏈結合蛋白或單鏈結合蛋白是非熱穩定的單鏈結合蛋白。
[0029]本發明的另一個實施方案提供混合物，所述混合物包含單鏈或雙鏈核酸去穩定劑。例如二甲基亞碸(DMSO)或甲醯胺，但是不限於此，因為可以加入其他試劑如甘油用於相同目的。[0030]本發明的另一個實施方案提供這樣的方法，其中樣品不是無醇的，和或樣品不是無鹽的。
[0031 ] 本發明的另一個實施方案提供擴增包含在樣品中的核酸靶序列的模板的方法，其中擴增反應混合物包含單鏈或雙鏈核酸去穩定劑；一價陽離子；二價陽離子；dNTPs和被緩衝在支持活性的PH的DNA聚合酶。
[0032]本發明的另一個實施方案提供擴增反應混合物緩衝劑，其包含以下一項或多項:單鏈或雙鏈核酸去穩定劑；一價陽離子；二價陽離子；dNTPs ;和被緩衝在支持活性的pH的DNA聚合酶。DNA聚合酶可以是熱穩定的DNA聚合酶。DNA聚合酶可以選自由以下各項組成的組:TAQ DNA聚合酶、VentR DNA聚合酶和De印VentR DNA聚合酶，但是不限於此。DNA聚合酶可以具有鏈置換活性。可以選擇不具有3』 ->5，外切核酸酶活性的DNA聚合酶。混合物還可以包含以下一項或多項:單鏈結合蛋白，去穩定劑是二甲基亞碸(DMSO)或甲醯胺；二價陽離子，其可以是選自由鎂、錳、銅、鋅或其任意組合組成的組的鹽；以及一價陽離子，其是選自由以下各項組成的組的鹽:鈉、鉀、鋰、銣、銫、銨或其任意組合。
[0033]本發明的目的、優點和新特徵以及進一步的適用性範圍將結合附圖部分描述於以下詳述中，並且部分地將在以下檢驗後對本領域技術人員來說變得明顯，或者可以通過實踐本發明了解到。本發明的目的和優勢可以通過在所附權利要求中特別地指出的手段和組合來實現和獲得。
[0034]附圖簡沭
[0035]結合到本說明書中並且形成其部分的附圖例示了本發明的實施方案並且，與說明書一起，用於說明本發明的原理。附圖僅用於例示本發明的優選實施方案，並且不被認為是限制本發明。在附圖中:
[0036]圖1顯示根據本發明的一個實施方案的振蕩PCR擴增反應的示意圖圖A表示與常規兩步PCR反應(黑線)相比的在數個OPCRar循環期間觀察到的熱波動的跡線(灰線)，而圖B顯示根據本發明的一個實施方案的核苷酸擴增方法。[0037]圖2.圖A-E表示根據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的一系列照片，所述照片顯示用於產生153個鹼基對(bp)的產物不同聚合酶。
[0038]圖3.圖A-B表示根據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的一系列照片，所述照片顯示乙醇對核酸擴增的作用。
[0039]圖4是根據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的照片，所述照片顯示支持有效擴增的退火溫度和引物解鏈溫度的差異。
[0040]圖5是根據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的照片，所述照片顯示熱啟動DNA聚合酶對引物二聚體形成的作用。
[0041]圖6是根據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的照片，所述照片顯示GC和AT夾環(clamp)對引物-二聚體形成的作用。
[0042]圖7是根據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的照片，所述照片顯示單鏈結合蛋白對產物形成的作用。
[0043]圖8.圖A-B表示根據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的照片，所述照片顯示T4基因蛋白32導致引物-二聚體形成的量下降。
[0044]圖9是根據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的照片，所述照片顯示存在於擴增的雙鏈DNA中的特異性靶序列。
[0045]圖10是根據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的照片，其顯示存在於ssDNA中的特異性靶序列的擴增。
[0046]圖11是根 據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的照片，其顯示存在於質粒DNA中的特異性靶序列的擴增。
[0047]圖12是根據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的照片，其顯示單鏈RNA的擴
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[0048]圖13根據本發明的一個實施方案的是丙烯醯胺凝膠的照片，其顯示細菌基因組DNA中的特異性靶序列的擴增。
[0049]圖14是根據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的照片，其顯示存在於葉綠體NDA中的特異性靶序列的擴增。
[0050]圖15是根據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的照片，其顯示測序的兩個靶標的擴增。
[0051]圖16圖A-B表示根據本發明的一個實施方案的丙烯醯胺凝膠的照片，所述照片顯示在SSB存在下在較低的解鏈溫度的靶序列的擴增。
[0052]圖17圖A-B表示丙烯醯胺凝膠的照片，所述照片顯示以典型的PCR熱循環儀中需要的精確的溫度控制和/或快速變溫(ramping)參數擴增靶標。
[0053]圖18是丙烯醯胺凝膠的照片，其顯示在不具有變溫或精確的溫度控制的低成本加熱器中擴增的靶標Rbcl的擴增。
[0054]發明詳沭
[0055]當在整個說明書和權利要求中使用時，術語「核酸」是指單鏈或雙鏈DNA、RNA或DNA / RNA雜交分子。單鏈核酸可以具有二級結構如髮夾、環和莖元件。雙鏈或單鏈核酸可以是線性的或環形的。雙鏈核酸可以是完整的或有切口的。雙鏈分子可以是具有鈍端的或具有單鏈懸垂端。核酸樣品可以分離自細胞或病毒並且可以包括染色體DNA，染色體外DNA,包括質粒DNA，重組DNA，DNA片段，信使RNA，核糖體RNA，轉運RNA，雙鏈RNA或存在於細胞或病毒中的其他RNA。核酸可以分離自任意數目的源，如農業、食品、環境、發酵或生物流體如唾液、血液、鼻或肺吸出物、腦脊液、痰、大便、奶、黏膜組織的拭樣、組織樣品或細胞。核酸可以在體外分離、克隆或合成。在以上所述的核酸內，可以對個體核苷酸進行修飾或化學改變如甲基化。這些修飾或改變可以自然地發生或通過體外合成產生。
[0056]當在整個說明書和權利要求中使用時，術語「靶核酸」或「模板核酸」是指意在被選擇性擴增的單鏈或雙鏈DNA或RNA片段或序列。要被擴增的核酸的大小由上遊(5，)和下遊(3』 )邊界限定並且可小於500 bp，優選地小於250 bp，並且更優選地小於150 bp並更優選地小於lOObp。靶核酸可以是包含在較長雙鏈或單鏈核酸內的片段或者可以是整個雙鏈或單鏈核酸。
[0057]當在整個說明書和權利要求中使用時，術語「雙鏈體」是指作為完整或部分雙鏈的DNA或RNA核酸分子。
[0058]當在整個說明書和權利要求中使用時，術語「熱循環」是指發生核酸擴增所需的重複的溫度波動。熱循環可以包括，但不限於，高溫解鏈或變性步驟，以及低溫退火或雜交步驟。
[0059]當在整個說明書和權利要求中使用時，術語「解鏈」或「變性」是指利用高溫解離核酸雙鏈體的兩條互補鏈的全部或部分。解鏈或變性溫度可以受寡核苷酸引物的長度和序列，雙鏈體去穩定劑如DMSO和甲醯胺的濃度，以及離子強度或溶液的pH影響。
[0060]當在整個說明書和權利要求中使用時，術語「退火」或「雜交」是指寡核苷酸引物與單鏈核酸模板的序列-特異性結合。引物可以僅結合一個模板鏈上的其互補序列而不結合模板的其他區域。退火或雜交的特異性可以受寡核苷酸引物的長度和序列，進行結合的溫度，雙鏈體去穩定劑如DMSO和甲醯胺的濃度，和離子強度或溶液的pH影響。
[0061]當在整個說明書和權利要求中使用時，術語「引物」是指能夠以序列-特異性方式結合靶核酸上的單鏈區域的單鏈核酸或寡核苷酸，其允許依賴於聚合酶的靶核酸的複製。
[0062]當在整個說明書和權利要求中使用時，術語「OPCRar」是指振蕩PCR擴增反應，其是用於擴增核酸的體外技術，使用小於典型擴增技術的溫度變化，例如變性溫度和退火溫度之間小於20°C，優選地小於15°C，並且更優選地小於10°C。
[0063]當在整個說明書和權利要求中使用時，術語「輔助蛋白」是指任何能夠刺激活性的蛋白，例如，熱穩定的單鏈結合蛋白(SSB)，例如rec A或RPA(複製蛋白A)，但不限於此。
[0064]在本發明的實施方案中，提供通過熱循環指數擴增特異性核酸靶標的方法，其中溫度變化優選地小於20°C，更優選地小於15°C，並且甚至更優選地小於10°C。這包括以下步驟:提供待擴增的核酸的單鏈模板，用於與核酸模板雜交的寡核苷酸引物，使用雜交的寡核苷酸引物通過DNA聚合酶來合成互補於模板鏈的雙鏈延伸產物，並且重複以上步驟從而指數地擴增所選的核酸靶標。
[0065]現在參看圖1A，顯示了根據本發明的一個實施方案的振蕩PCR擴增反應(OPCRar)的示意圖，其中圖A顯示與常規兩步PCR反應(黑線)相比的在數個OPCRar循環期間的觀察到的熱波動的代表跡線(灰線)。注意OPCRar中溫度變化的顯著減小。圖1B顯示根據本發明的一個實施方案，雙鏈靶核酸進入解鏈階段，其中，取決於溫度，可以導致雙鏈體的部分或完全變性。雙鏈體的解旋開始於靶標的末端，並且單鏈結合蛋白(圓圈)結合併穩定單鏈核酸。反應被冷卻並進入雜交/聚合階段，其中引物以特異性方式雜交到靶標雙鏈體的每條鏈的5』端。在引物雜交後，DNA聚合酶(方塊)結合模板/引物雙鏈體並且通過引入dNTPs在5』 一 3』方向上延伸引物，複製DNA的模板鏈。如果所用的聚合酶具有鏈置換活性，則它將能夠在部分變性的複合體中置換相反的鏈。在產生新的雙鏈體DNA後，多次重複熱循環以導致靶核酸序列的指數擴增。
[0066]在本發明的另外的實施方案中，熱循環包括兩個溫度間的溫度振蕩或循環，其中A T優選地不大於20°C，更優選地不大於15°C，並且甚至更優選地小於10°C。兩個溫度中較高的那個可以足以變性雙鏈靶標DNA，或優選地僅導致雙鏈DNA靶標的部分變性。一旦達到高溫或低溫，維持所述溫度達一段時間或者，優選地，立即變為其它溫度。
[0067]在本發明的另外的實施方案中，核酸靶標可以是雙鏈核酸如雙鏈DNA，或單鏈核酸如單鏈RNA或DNA。如果靶核酸是雙鏈的，則必須通過加熱或利用酶將它完全或部分變性以形成DNA聚合酶活性和擴增所需的單鏈模板或模板區域。靶核酸的長度可小於1000 bp，優選地小於250 bp，並且更優選地小於150 bp。
[0068]在本發明的另外的實施方案中，用於靶核酸擴增的寡核苷酸引物是結合特異性雙鏈靶核酸的相反鏈的引物對，其中一個引物在靶標的上遊在5』端處結合，一個引物在靶標的下遊在3』端處結合。在多重(multiplexing)條件下，可以使用超過一對寡核苷酸引物來同時在相同的反應混合物中擴增多個核酸靶標。寡核苷酸引物可以具有這樣的長度和GC含量以致在普遍接受的PCR緩衝劑條件下，解鏈溫度大於65°C，優選地大於70°C。
[0069]在本發明的另外的實施方案中，所用的DNA聚合酶優選地選自Taq DNA聚合酶、VentR DNA聚合酶、De印VentR DNA聚合酶以及類似的熱穩定的DNA聚合酶。優選地，DNA聚合酶具有鏈置換活性並且不具有3』一 5』外切核酸酶活性(參見圖1B)。此外，如果模板核酸是單鏈RNA,則所用的逆轉錄酶將選自AMV-RT、Superscript II逆轉錄酶(Invitrogen,Carlsbad, CA)、Supersc ript III 逆轉錄酶(Invitrogen)和類似的熱穩定的酶。
[0070]其他-耐熱性聚合酶可能性
[0071]耐熱性DNA聚合酶
[0072]聚合酶和(廠商)
[0073]VeiItR'R (NEB)
[0074]VcntR (cxO-)'S' (NEB)
[0075]Deep Vent (NEB)
[0076]Deep VentR(exo_)(NEB)
[0077]Tag(NEB)
[0078]Pyro Script (Lucigen)
[0079]PyroPItagc^ 3 173，野生型(Lucigen)
[0080]LongAmp Tag(NEB)
[0081]Bst聚合酶
[0082]Phire Hot Start II(NEB)
[0083]Phusion 高保真 DNA 聚合酶(NEB)
[0084]Phusion(NEB)
[0085]Pliusion? Flash (NEB)[0086]9 Nm (NEB)
[0087]DyNAzyme II Hot Start(NEB)
[0088]DyNAzyme EXT(NEB)
[0089]DreamTag(Fermentas)
[0090]Tag (非變性)(Fermentas)
[0091]Maxima? Hot Start Tag(Fementas)
[0092]Pfu (重組)，(Fermentas)
[0093]Bsm (大片段)，(Fermentas)
[0094]True StartTM Hot Start Tag (Fermentas)
[0095]Tfi(invitrogen)
[0096]AlTipi I ag^ (Invitrogen)
[0097]AmpliTag Gold? (Invitrogen)
[0098]IMaliiiimi H: Pfx
[0099]在本發明的另外的實施方案中，反應混合物優選地包含單鏈結合蛋白(SSB)如T4基因32蛋白，或分離和克隆自嗜熱生物的熱穩定的SSB。
`[0100]另外地，酶製劑包括單鏈或雙鏈核酸去穩定劑如二甲基亞碸(DMSO)或甲醯胺，優選地其濃度為總反應體積的8一15%。備選地,其他試劑如甘油deaza-dGTP, 3dazopurein,dITP可以單獨使用或與彼此或上列試劑組合使用。
[0101]本發明的實施方案理想地適用於低成本、護理位點的核酸診斷，其中微觀流動層被置於加熱元件上。通過降低溫度範圍循環需求，具有被動冷卻的相對簡單的加熱機制可以用於使反應溶液的溫度快速循環。熱循環期間較低的最大溫度使得流體蒸發(這可以對整個擴增反應有消極影響)最小化。更重要地，與常規PCR方法相比，擴增的穩健性被極大提高，說明該新方法能夠接納擴增過程期間的溫度波動(不精確的溫度控制)。證明本發明的具體的反應化學在寬的解鏈(例如70— 105°C，基本對起泡不敏感)和雜交溫度範圍內進行，從而不需要在整個反應體積內具有均勻的溫度。最後，本發明的實施方案在醇和鹽的存在下(例如~10%乙醇)進行良好，通過除去常規核酸提取化學涉及的基於醇的洗滌(例如乙醇或異丙醇)和核酸洗脫步驟之間的離心、熱幹或真空步驟，極大地降低了在前的核酸分離方法的嚴格性。
[0102]本發明的實施方案包括檢測生物樣品中的病原體，其中病原體的核酸是靶核酸。備選地，本發明可以用於檢測染色體DNA的差異，其中染色體DNA的片段是靶核酸。以此方式，在來自相同或不同來源的靶核酸中可以檢測到單核苷酸多態性。
[0103]本發明的擴增技術的實施方案被稱為「振蕩PCR擴增反應」(OPCRar)。OPCRar是基於，但不限於，組合使用降低反應解鏈溫度的雙鏈去穩定劑和極高解鏈溫度(Tm)的寡核苷酸引物來提升給定熱循環中的退火溫度。以此方式，靶核酸的體外擴增可以通過溫度間的快速熱循環進行，所述溫度優選地相差20°C，更優選地相差小於15°C，並且甚至更優選地相差小於10°C (圖1A)。對靶核酸的上遊(5，)和下遊(3』 )區域具有特異性的寡核苷酸引物雜交到模板，從而允許通過DNA聚合酶的延伸以擴增靶標。如果所用的DNA聚合酶是不具有外切核酸酶活性的鏈置換聚合酶，則雙鏈靶核酸的完全熱變性是不必要的，與雙鏈體去穩定劑一起作用以降低所需的解鏈溫度。溫度循環過程被重複並且導致特異性核酸靶序列的指數擴增(圖1B)。在OPCRar中，雙鏈靶核酸進入解鏈階段，其中，取決於溫度，可以導致雙鏈體的部分或完全變性。雙鏈體的解旋開始於靶標的末端，並且單鏈結合蛋白(圓圈)結合併穩定單鏈核酸。反應被冷卻並進入雜交/聚合階段，其中引物以特異性方式雜交到靶標雙鏈體的每條鏈的5』端。在引物雜交後，DNA聚合酶(方塊)結合模板/引物雙鏈體並且通過引入dNTPs在5』 一3』方向上延伸引物，複製DNA的模板鏈。如果所用的聚合酶具有鏈置換活性，則它將能夠在部分變性的複合體中置換相反的鏈。一旦產生新的雙鏈體DNA，多次重複熱循環以導致靶核酸序列的指數擴增。
[0104]OPCRar方法是基於，但不限於，組合使用降低反應解鏈溫度的核酸去穩定劑和極高解鏈溫度(Tm)的兩種寡核苷酸引物來提升熱循環期間的退火溫度。對於給定的靶核酸，一個寡核苷酸引物優選地雜交到含有靶序列的正義鏈的5'-端，一個引物優選地雜交到含有反向互補靶序列的反義鏈的5』 -端。OPCRar優選地利用，但不限於使用不具有外切核酸酶活性的鏈置換DNA聚合酶來進一步降低有效靶核酸擴增所需的解鏈或變性溫度。OPCRar可以在存在或不存在輔助蛋白的情況下擴增靶核酸。可以通過添加、減少或替換混合物內的組分來優化任何特異性OPCRar系統。[0105]在低成本、快速、護理位點的核酸診斷的情景中，該擴增技術相對於現有技術中報導的其他擴增方法具有改善的特性。與上述核酸擴增方法不同，OPCRar系統，其穩健的酶促過程使得低成本加熱設備的穩健、快速且耐受溫度波動成為可能，因此理想地適用於低成本、護理位點的應用。通過使熱循環期間遇到的溫度差異最小化，OPCRar將PCR的速度和可靠性與等溫擴增方法的降低的設備需要相結合。
[0106]OPCRar系統的簡化的熱循環要求理想地適用於被動-冷卻裝置,其中熱可以被施用到腔室的一個表面，並且通過散熱到空氣中在相對的表面上發生冷卻。這樣的被動-冷卻極大降低了任何核酸診斷設備的成本和複雜性。之前已經報導將被動-冷卻用於診斷設備，然而，這些設備採用常規PCR循環測定化學來擴增靶核酸，這限制了反應的速率(Luo等 Nuc Acids Res.2005 ；ffilding 等，Nuc.Acids.Res.1996 ；Burke 等，Science 1998 ；)。OPCRar的另一個優點在於有效核酸擴增可以在寬的解鏈和退火溫度範圍內發生並且因此需要較不嚴格的溫度控制機制。在小型化核酸診斷的構建中，在整個反應體積中保持均勻的溫度可能是有挑戰性的，反應室的加熱側和不加熱側之間存在的高的溫度梯度。這樣的溫度變化可能導致使用常規PCR或等溫反應化學的低效擴增。OPCRar，通過使用穩健的聚合酶、去穩定劑和其他聚合酶輔因子的組合，被設計成使與精確的溫度調控和保持相關的問題最小化；只要反應室的最冷區域遵守用於給定核酸靶標反應的最低的可能的解鏈溫度和最高的可能的退火溫度，所述反應將有效進行，即使反應體積的其他區域變化>10°C.此外，伴隨最小功率/能量消耗的擴增化學的穩健的OPCRar性質使得在更大體積(例如20U 1，而不是典型的U tPCR晶片中的以下)的快速和有效的擴增反應成為可能，這極大地放鬆了在前的樣品製備/核酸分離過程的嚴格性(就以下方面而言:獲得U I以下的輸入模板，所述輸入模板是不含任何痕量汙染物例如鹽和乙醇殘留物和抑制性物質的高度濃縮的和超純核酸)和對PCR酶和生物試劑的超高濃度和超純的要求.[0107]溶劑試劑
[0108]已知溶劑如DMSO和甲醯胺使雙鏈體核酸的解鏈溫度降低~0.5—0.TC (每加入I %體積)。這些試劑通常用於提高含有高GC含量的靶核酸的擴增效率並且，因此，高的Tm以促進難以解旋的雙鏈模板的完全變性。通常，在將雙鏈體去穩定劑引入到PCR反應中後保持PCR熱循環溫度不變。相比之下，OPCRar優選地利用添加獨特地高濃度的DMSO以顯著降低熱循環的解鏈溫度。在常規PCR中，極少使用高於10% V / V的DMS0，原因在於與這些試劑的高濃度以及解鏈階段的高溫(通常大於90°C)相關的聚合酶活性的損失。另一方面，OPCRar系統和方法優選地使用10至15%的DMSO濃度。出乎意料地，此種量的DMSO不產生顯著的聚合酶活性損失。
[0109]現在參看圖2，取決於條件，根據本發明的一個實施方案的擴增與多種DNA聚合酶相容。將分離自含有甲型流感病毒的鼻吸出物的核糖核酸(0.3 ng / UtL)用作核酸模板，在多重反轉錄-OPCRar條件下，使用VentR聚合酶。OPCRar引物FP3和RP4用於產生153 bp的產物，該產物通過在12%聚丙烯醯胺凝膠上電泳並用溴化乙錠染色來可視化。所有反應都包含Superscript III逆轉錄酶，其中初始cDNA生成階段在55°C進行5分鐘，之後進行熱循環。凝膠道被標記以DMSO的濃度，以及所用的解鏈和雜交階段溫度；反應循環40次。
[0110]常規PCR酶，例如Taq DNA聚合酶反應混合物對於任何痕量的醇、例如乙醇是極端敏感的，而在本發明的一個實施方案中，新型反應混合物極端耐受乙醇的抑制。現在參看圖3，顯示根據本發明的一個實施方案的乙醇對核酸擴增的影響。將分離自柑橘黃龍病菌亞洲種(Candidatus.Liberibacter asiaticus)-感染的葉組織的總核酸(3.4 ng/ U L)用作啟動模板。反應在OPCRar條件下使用VentR(exo_) DNA聚合酶，Et SSB，和引物hyvl_For和hyvl_Rev，在15% DMSO存在下進行(圖3A)，或者在常規PCR條件下使用Taq聚合酶和引物HLBas-P2和HLBr-Pl進行(圖3B)。將OPCRar溶液在85°C加熱2分鐘以使模板變性，然後循環40次，在76°C、10秒和60°C、10秒之間進行振蕩以生成139 bp的產物。將常規PCR反應加熱至95°C進行2分鐘然後循環40次，在95°C、10秒和58°C、40秒之間變化以生成130 bp的產物。將擴增的產物在12%丙烯醯胺凝膠上可視化，用溴化乙錠染色。顯示包含在擴增反應混合物中的乙醇濃度。明顯的是，與常規PCR(圖3B)相比，OPCRar製劑(圖3A)對乙醇所致的失活顯著地更具有耐受性。
[0111]在典型的OPCRar條件下使用VentR(exo_)DNA聚合酶和Et SSB，在高達10%乙醇的情況中不產生活性損失。這是關於將OPCRar應用於低成本、護理位點的設備的顯著然而驚人的發現。因為PCR和等溫擴增的常規知識典型地建議使用者提供高度純化的無醇和鹽的核酸輸入。結果，幾乎所有研究者在他們對樣品進行PCR擴增過程之前、在基於醇的洗滌和自核酸親和性微珠、玻璃粉、基質或過濾器等洗脫靶核酸之間都採用某種類型的真空乾燥、風乾、旋轉沉降(spin down)或加熱步驟。對於集成的護理位點診斷設備的實例，除了擴增和檢測核酸以外，該設備也必須快速地分離靶核酸。通常，這是通過以下方式進行:將核酸與玻璃纖維基質結合併且在顯著濃度的鹽和乙醇存在下進行洗滌，隨後在含有最少的鹽且不含乙醇的緩衝劑中洗脫。在洗脫前，將保留在結合基質上的洗滌緩衝劑除去以防止轉化為洗脫體積；在商業核酸分離試劑盒中，這典型地通過離心進行。OPCRar的特異性酶混合物不需要在核酸分離期間小心的去除乙醇，使得本發明的該實施方案適合於不需要真空、離心機、風乾或加熱乾燥組件的低成本的集成的診斷。
[0112]
[0113]本文所述的寡核苷酸引物可以通過本領域中的已知方法合成和純化。(參見，例如美國專利號6，214，587)。在本實施方案中，將表示引物對的兩個序列特異性引物用於指數擴增靶核酸序列。第一引物雜交到靶核酸的上遊5'區，第二引物雜交到靶序列的下遊、3/區。所述引物雜交到存在於靶標雙鏈體中的一條鏈的5』端，並且使用靶標核苷酸序列作為模板通過聚合酶在5'至3'方向上延伸引物(圖1B)。雜交的條件是如在「MolecularCloning and Laboratory Manual (分子克隆和實驗室手冊)」, 2nd ed.Sambrook, Richand Maniatis, pub.Cold Spring Harbor (2003)中所述的標準。為了實現給定祀序列的特異性擴增，同源引物是優選的，其中引物中的每個核苷酸互補於靶序列。然而，引物可以包括與模板核酸不同源的鹼基，或與靶標核苷酸序列不互補的5'序列。可以將多對引物用於單個OPCRar實驗以便在相同的反應混合物同時擴增多個核酸靶標。所謂的多重法(multiplexing)是在單核苷酸多態性分析、病原體的檢測以及將內對照結合到個體反應中通常使用的技術。高水平的多重法也可以通過使用被引入到各個靶標-特異性3』區的5』通用標籤序列實現，所述序列允許具有不同內部病原體序列的所有靶序列的通用擴增。
[0114]寡核苷酸引物設計涉及數個參數如解鏈溫度和引物序列內和引物序列間比對。解鏈溫度受控於因素如引物長度和GC含量。引物序列間互補可能導致髮夾結構，這可能會阻止有效擴增，而引物內的同源性可能導致非所需的擴增產物複製引物-二聚體。在設計引物時，重要的是在靶標內選擇這樣的序列，其對待擴增的核酸分子具有特異性並且將最低限度地與其自身或擴增反應中存在的其他引物發生相互作用。
[0115]在大多數核酸擴增策略中，引物的解鏈溫度優選為比發生雜交和擴增的溫度高約10至30°C。在PCR反應中的退火/聚合階段的溫度為55— 60°C的情況下，引物的長度典型地為I 8-30個鹼基對。使該特異性寡核苷酸長度最短以允許容易的引物結合而不損失序列特異性。然而，在OPCRar系統中，引物優選地被設計成非常長的35— 55個鹼基對，而解鏈溫度優選地為70-80°C以便提高退火階段的溫度。考慮到在典型的OPCRar反應中所用的雙鏈體去穩定劑DMSO水平(~10 —15% )，計算的OPCRar引物的Tm優選地僅比熱循環期間所用的退火溫 度高<10°C。在實驗中並且在極端長度的OPCRar引物的情況下，儘管引物Tm (補償DMSO的濃度)和退火/延長溫度的差異最小，但仍發生有效擴增。
[0116]現在參看圖4，根據本發明的一個實施方案，OPCRar引物需要退火階段溫度和引物Tm之間的最小差異以支持有效擴增。使用引物hyvl_For和hyvl_Rev來擴增包含hyvl基因序列的質粒(12 ng / UL)以生成139 bp的產物，該產物通過在12%丙烯醯胺凝膠上電泳、用溴化乙錠染色來可視化。在初始2分鐘85°C解鏈步驟後，所有反應循環40次，在指定的解鏈和雜交溫度各10秒。計算的引物hyvl_For和hyvl_Rev的Tm分別為72.2°C和70.9°C。反應在10% DMSO中進行，使有效Tm降低7°C，假定每I %體積降低0.7V。即使引物Tm和雜交溫度之間具有可忽略的差異，仍觀察到擴增反應進行得如同溫度差異低得多那般有效。
[0117]現在參看圖5，使用OPCRar，熱啟動DNA聚合酶對引物二聚體形成的作用。利用Superscript III RT和Taq或Platinum Taq DNA聚合酶在引物對FP3和 RP4(各8 ii M)以及15% DMSO存在下進行不含核酸模板的對照反應。循環參數為55°C進行5分鐘，85°C進行2分鐘，以及80°C進行I 5秒和65°C進行I 5秒的40個循環。在12%丙烯醯胺凝膠上電泳後，OPCRar產物通過用溴化乙錠染色可視化。Platinum Taq是市售的熱啟動酶(Invitrogen,Carlsbad，CA)，其與抗體綴合，所述抗體在加熱反應溶液至94°C後在正常PCR條件下解離。在模板核酸存在下，該引物對將產生153bp的產物。清楚的是，該熱啟動製劑在減少OPCRar期間的形成的〈110 bp引物二聚體方面與常規Taq—樣。OPCRar反應中所用的長引物的一個併發症是它們更傾向於產生被稱為引物二聚體的非特異性的且非所需的擴增產物。當在擴增反應開始時、在初始的溫度增加期間引物寡核苷酸的3』端瞬時結合另一個時形成引物二聚體。在此關鍵時間期間，DNA聚合酶可以使這些瞬時複合物延伸從而產生在熱循環期間與特異性靶標擴增競爭的產物，尤其是在初始模板核酸濃度非常低的情況下。通常用於減少PCR期間的引物二聚體形成的技術是利用所謂的「熱啟動^DNA聚合酶。這些市售酶非共價地結合於抑制分子如抗體。當反應溫度增加到90°C以上時，抑制分子解離，釋放聚合酶從而正常發揮功能。然而，驚人地，在我們的手中，熱啟動酶Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)未能相當地減少引物二聚體擴增的豐度，指示該常用方法對於OPCRar是不足夠的，指示OPCRar方法是比常規PCR有效得多的擴增方法，其使得源於同源和異源二聚體瞬時運動碰撞的二聚體形成成為可能，這通常不發生在常規PCR方法中。
[0118]現在參看圖6，呈現的是根據本發明的一個實施方案的顯示OPCRar期間GC和AT夾環對引物二聚體形成的作用的凝膠。在不存在啟動模板(3.5 ng / UL)的情況下使用被設計成擴增柑橘黃龍病菌亞洲種的延長因子基因的引物來確定引物二聚體形成的傾向。在存在模板的情況下，不同引物組的產物大小將為140—155 bp。引物序列可見於右側，其中AT或GC夾環為灰色。對於「mod」引物組，每個引物包含與模板不同源的鹼基(下劃線)，其增加了與第二引物的同源性。使用￥6社1?(以0-)0嫩聚合酶4七558，在15% DMSO存在下進行所有反應。將溶液在85°C加熱2分鐘以使模板變性然後循環30或40次，在80°C進行I 5秒和65°C進行I 5秒之間振蕩。擴增的產物在12%丙烯醯胺凝膠用溴化乙錠染色可視化。如清楚可見的，GC夾環引物組導致明顯的引物二聚體形成，而AT夾環引物不導致引物二聚體形成。
[0119]為了使引物二聚體形成的可能性最小化，可以將OPCRar引物設計成採用數個區別於用於產生常規PCR引物的那些的策略。首先，PCR引物通常具有被稱為「GC夾環」的富含GC的3』端，其導致與靶序列結合的較大特異性。然而，在OPCRar引物中，觀察到的是，引物的3』區域中的高GC含量導致`較多的引物二聚體形成，因此，將OPCRar引物製成含有富含AT的3』區域從而在能量方面減小產生這些非所需的擴增產物的3』-3』引物相互作用的親和性(圖6)。OPCRar引物設計的第二策略是設計包含至少5個連續核苷酸的互補5』或內部序列的引物。以此方式設計的寡核苷酸將反應溫度的初始增加期間的任何引物雜交導向對於聚合酶延伸來說不具有競爭性的雙鏈體結構。如果在靶核酸序列內不能發現合適的互補序列，則可以使用非同源的或突變的鹼基來在OPCRar引物內產生它fl]。OPCRar引物的異常長度克服了在擴增反應的早期循環期間在引物和靶標之間的微小錯配。引物組為
[0120]EU AT
[0121]正向
[0122]GTTCTTGTAG CGTTGCAGTC TTCTGCGGAA GATAAGGAAT TGCTTT (SEQ ID NO 21)反向
[0123]GGGCACGTTT ATTAGCMCA ATAGMGGAT CMGCATCTG CACAGAMT (SEQ ID NO 22) EU GC
[0124]正向
[0125]CTTGTAGCGT TGCAGTCTTC TGCGGMGAT MGGMTTGC TTTCTGCG(SEQ I D NO 23)反向
[0126]CACGTTTATT AGCAACAATA GAAGGATCAA GCATCTGCAC AGAAATCACCG(SEQ ID NO 24)
【權利要求】
1.擴增包含在樣品中的核酸靶序列的模板的方法，所述方法包括: 將所述樣品與擴增反應混合物接觸，所述擴增反應混合物包含與所述核酸靶序列的模板互補的引物； 使所述反應的溫度在上限溫度和下限溫度之間振蕩，其中在多個溫度循環期間溫度變化不大於約20°C ;以及 擴增所述核酸靶序列的模板。
2.權利要求1的方法，其中在多個溫度循環期間所述溫度變化不大於約I5°C。
3.權利要求1的方法，其中在多個溫度循環期間所述溫度變化不大於約10°C。
4.權利要求1的方法，其中在多個溫度循環期間所述溫度變化不大於約5°C。
5.權利要求1的方法，其中一旦達到所述上限溫度或所述下限溫度，將所述溫度保持在溫度波動內一段時間。
6.權利要求1的方法，其中一旦達到所述溫度範圍內的上限或下限溫度，將所述溫度變化為其它溫度。
7.權利要求1的方法，其中所述下限溫度不小於約50°C。
8.權利要求1的方法，其中所述上限溫度不大於約85°C。
9.權利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是單鏈DNA或RNA。
10.權利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是雙鏈DNA或RNA。
11.權利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是RNA。
12.權利要求1的方法，其中所述核酸靶序列的模板是DNA。
13.權利要求1的方法，其中所述靶核酸的長度可小於lOOObp。
14.權利要求1的方法，其中所述靶核酸的長度可小於250bp。
15.權利要求1的方法，其中所述靶核酸的長度可小於150bp。
16.權利要求1的方法，其中所述靶核酸的長度可小於約lOObp。
17.權利要求1一16的方法，其中所述擴增反應混合物包含結合所述核酸的模板的相反鏈的引物對。
18.權利要求17的方法，其中所述引物對具有長度和GC含量以致解鏈溫度>65°C。
19.權利要求17的方法，其中所述引物對具有長度和GC含量以致解鏈溫度>70°。
20.權利要求17的方法，其中所述引物對具有35—70個鹼基對的長度。
21.權利要求17的方法，其中所述引物對中每個引物的解鏈溫度為70-80°C。
22.權利要求17的方法，其中所述引物對包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物各自具有40-47個鹼基對的長度。
23.擴增包含在樣品中的核酸靶序列的模板的方法，所述方法包括: 將所述樣品與擴增反應混合物接觸，所述擴增反應混合物包含 引物或引物對，所述引物或引物對具有35-70個鹼基對的長度並且與所述核酸靶序列的模板互補，並且其中所述引物對中每個引物的解鏈溫度為70-80°C ；
DMSO ； 一價陽離子； 二價陽離子； dNTPs ;和DNA聚合酶； 使所述反應的溫度在上限溫度和下限溫度之間振蕩，其中在多個溫度循環期間溫度變化不大於約20°C ;以及 擴增所述核酸靶序列的模板。
24.權利要求23的方法，其中所述二價陽離子是選自由以下各項組成的組的鹽:鎂、錳、銅、鋅或其任意組合。
25.權利要求23的方法，其中所述一價陽離子是選自由以下各項組成的組的鹽:鈉、鉀、鋰、銣、銫、銨或其任意組合。
26.權利要求1的方法，其中所述擴增反應混合物包含核酸去穩定劑。
27.權利要求1的方法，其中所述擴增反應包含DNA聚合酶。
28.權利要求23或27的方法，其中所述DNA聚合酶是熱穩定的DNA聚合酶。
29.權利要求23或27的方法，其中所述DNA聚合酶選自由以下各項組成的組:TAQDNA聚合酶、VentR DNA聚合酶和DeepVentR DNA聚合酶。
30.權利要求23或27的方法，其中所述DNA聚合酶包含鏈置換活性。
31.權利要求23或27的 方法，其中所述DNA聚合酶不具有3』->5』外切核酸酶活性。
32.權利要求11的方法，其中所述擴增反應混合物包含逆轉錄酶和DNA聚合酶。
33.權利要求32的方法，其中所述逆轉錄酶是熱穩定的逆轉錄酶。
34.權利要求32的方法,其中所述逆轉錄酶選自:AMV-RT、SuperscriptII逆轉錄酶、Superscript III 逆轉錄酶或 MMLV-RT。
35.權利要求1或23的方法，其中所述擴增反應混合物包含單鏈結合蛋白。
36.權利要求35的方法，其中所述單鏈結合蛋白是熱穩定的單鏈結合蛋白。
37.權利要求35的方法，其中所述單鏈結合蛋白是非熱穩定的單鏈結合蛋白。
38.權利要求1的方法，其中所述去穩定劑是二甲基亞碸(DMSO)或甲醯胺。
39.權利要求1或23的方法，其中所述樣品不是無醇的。
40.權利要求1或23的方法，其中所述樣品不是無鹽的。
41.權利要求1的方法，其中所述擴增反應混合物包含權利要求42的擴增反應混合物緩衝劑。
42.擴增反應混合物緩衝劑，其包含: 單鏈或雙鏈核酸去穩定劑； 一價陽離子； 二價陽離子； dNTPs ;和 DNA聚合酶，其被緩衝在支持活性的pH。
43.權利要求42的擴增反應混合物，其還包含單鏈結合蛋白。
44.權利要求42的方法，其中所述去穩定劑是二甲基亞碸(DMSO)或甲醯胺。
45.權利要求42的方法，其中所述二價陽離子是選自由以下各項組成的組的鹽:鎂，錳，銅，鋅或其任意組合。
46.權利要求42的方法，其中所述一價陽離子是選自由以下各項組成的組的鹽:鈉，鉀，鋰，銣，銫，銨或其任意組合。
47.權利要求42的方法，其中所述DNA聚合酶是熱穩定的DNA聚合酶。
48.權利要求42的方法，其中所述DNA聚合酶選自由以下各項組成的組:TAQDNA聚合酶、VentR DNA聚合酶和De印VentR DNA聚合酶。
49.權利要求42的方法，其中所述DNA聚合酶包含鏈置換活性。
50.權利要求42`的方法，其中所述DNA聚合酶不具有3』->5』外切核酸酶活性。
【文檔編號】C12Q1/48GK103608467SQ201280030581
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年4月20日 優先權日:2011年4月20日
【發明者】蔡紅, 內森·J·科布 申請人:梅撒技術國際公司