活性試劑的多級遞送的製作方法

2023-05-21 23:38:46

專利名稱：：活性試劑的多級遞送的製作方法活性試劑的多級遞送關於聯邦政府資助的研究和發展的聲明美國政府在本發明中擁有完全付清的特許權和在有限情況下要求本專利所有人以合理條件許可他人的權利，如DOD撥款No.W81XWH-04-2-0035項目16、NASA撥款No.SA23-06-017、和NIH撥款No.NCI1R21CA122864-01的條款所提供。
背景技術：
：本發明總體上涉及納米
技術領域：
，具體地說，涉及利用微米粒子和/或納米粒子遞送活性試劑(例如治療劑和成像劑)的組合物，以及製備所述組合物的方法和使用所述組合物的方法。過去25年對健康和疾病的基本理解的進展還未轉化為臨床醫學的同等進步。不能施用治療部分而使其選擇性到達期望的靶標而僅具有邊際的或無間接損害很大程度上是導致了上述矛盾，例如參考Langer，R.Nature392,5-10(1998)、和Duncan,R.NatureRev.DrugDiscov.2，347—360(2003)。理想地，活性試劑，例如治療劑或成像劑，應穿過血管，以完全濃度到達目的靶標，然後僅選擇性作用於患病細胞和組織而不產生不希望的副作用。遺憾的是，即使目前最好的治療也不能大幅度達到此理想性能。納米級和微米級藥物遞送系統，也稱為"納米載體"，是為優化治療的治療指數的問題，即功效最大化而減少不利健康的副作用提供解決方案的有希望的候選物。即使朝向這一目標的不多的進展也在歷史上產生了跨越多個醫學領域的實質利益，具有例如，從腫瘤學的子域13到遠至傳染性疾病的治療的領域的可轉化性，這是因為該進展在潛在科技平臺具有單一的共同特徵這一事實。例如脂質體，這個超過10年前用於治療卡波氏肉瘤的第一個達到保健成就的納米栽體療法，也使乳腺癌和卵巢癌以及真菌感染的治療產生了進步。如今，成百上千的不同的納米載體科技平臺已加入脂質體，各自具有不同特性、長處和缺點。不同的納米栽體平臺包括基於聚合物的平臺、樹狀聚體、金納米殼、半導體納米晶體、富勒烯、生物來源的納米結構物、基於矽和二氧化矽的納米系統和超順^f茲納米粒子在文獻49-75中有描述。發明概述某些實施方案中提供包含至少一種一級粒子的組合物，所述一級粒子為微米粒子或納米粒子，並且具有(i)主體、(ii)至少一個表面、以及(iii)至少一個位於主體內的貯存器，所述貯存器含至少一種包含至少一種活性試劑的二級粒子。某些實施方案中提供包含將組合物施用於受試者的方法，所述組合物包含至少一種為微米粒子或納米粒子並且其具有(i)主體、(ii)至少一個表面、以及(iii)至少一個位於主體內的貯存器，所述貯存器含至少一種包含至少一種活性試劑的二級粒子。另一個實施方案中還提供製備多級遞送系統的方法。所述方法包含(A)提供至少一種為微米粒子或納米粒子並且其具有(i)主體、(ii)至少一個表面、以及(iii)至少一個位於主體內的貯存器；(B)提供至少一種二級粒子以及(C)將所述至少一種二級粒子裝載入所述一級粒子的貯存器內。參考如下說明書和附圖，顯示這些以及其他實施方案、特點和優勢。圖l顯示根據本發明的一個實施方案的多級遞送栽體。一級粒子內部含二級粒子。所述二級粒子含至少一種活性試劑，例如治療劑或成像劑。所述一級粒子內部也含另外的試劑，例如滲透增強劑或可以為成像劑或治療劑的另外的活性試劑。任選地，所述二級粒子含三級粒子。乾向部分，例如抗體、適體或配體，連接至一級粒子表面，促進定位於選定的身體位點。圖2顯示根據一個實施方案，血管內施用多級遞送載體的操作的原理。一級粒子定位於靼向的血管位置。一旦定位，所述粒子釋放滲透增強劑，在血管上生成窗口。二級粒子攜帶靶向部分，例如抗體。二級粒子通過窗口滲透並使用抗體靶向攜帶表面標誌物抗原的特定細胞。圖3，A區描述氨基和羧基修飾量子點(q-點)在APTES修飾的"大孔，，LP和"小孔，，納米多孔矽一級粒子中的時間依賴性。圖3，B區展示二級PEG-FITC-SWNT納米粒子濃度對其裝栽入納米多孔矽一級粒子的影響。在A區和B區，Y軸讀數為平均螢光。圖4(A區-D區)展示二級納米粒子裝載入納米多孔矽一級粒子的時間動態。A區為"大孔"(LP)氧化的矽一級粒子；B區為LPAPTES修飾的矽一級粒子；C區為"小孔，，(SP)氧化的矽一級粒子；D區為SPAPTES修飾珪一級粒子。A-D區中，Y軸讀數為平均螢光。圖5展示從LP氧化的納米多孔矽一級粒子(A區)和LPAPTES修飾的納米多孔矽一級粒子(B區)釋放二級納米粒子的時間動態。A區和B區中，Y軸讀數為釋放的有效栽荷。圖6A，A區呈現裝載羥基修飾的量子點和FITC-綴合的單壁碳納米管(SWNT)的濃度效應。A區中Y軸讀數為平均螢光(％)。圖6A，B區展示異硫氰酸螢光素(FITC)綴合的單壁碳納米管(SWNT)的螢光淬滅。圖6B涉及將二級粒子裝載入納米多孔矽粒子的化學條件的最優化。將納米多孔矽粒子在濃度漸增的TRIS的存在下與二級納米粒子混合(圖6B，C區和D區中Q-點、E區和F區中PEG-FITC-SWNT)。高濃度TRIS有利於增加裝載入一級矽粒子的Q-點的量(C區和D區)。與此相反，PEG-FITC-SWNT的裝載效率在20MmTRIS達到峰值然後在更高的TRIS濃度下降，E區和F區。B-F區中Y軸讀數15為平均螢光。圖7展示分別向LP納米多孔矽一級粒子裝栽和釋放FITC綴合的SWNT二級粒子的數據。A區呈現裝載柱，對應於在暴露於FITC-SWNT溶液之後洗滌之前最初裝載入納米多孔矽一級粒子的FITC-SWNT的量。A區中洗滌柱對應於洗塗一級粒子後FITC-SWNT的量。一級粒子中FITC-SWNT的實際裝載量為洗滌後保留於一級粒子中的FITC-SWNT的量，即裝載柱和洗滌柱中相應數值間的差額。B區顯示隨著時間從一級粒子釋放FITC-SWNT的數據。隨著時間從一級粒子釋放的FITC-SWNT的總量，即B區中所有柱的總和，實質上與A區中相應裝載柱和洗滌柱的差額吻合。A和B區中Y軸讀數為FITC-SWNT的量(ng)。圖8A-B呈現基於脂質的二級粒子裝栽入納米多孔矽一級粒子的數據。圖8A中，A-C區顯示裝栽入1微米納米多孔矽一級粒子的陽離子和中性脂質體的數據。A區顯示中性脂質體(左)和陽離子脂質體(右)的共聚焦顯微圖像。B和C區分別呈現中性和陽離子脂質體裝載入1微米納米多孔矽一級粒子的FACS分析和Excel定量。B區中Y軸讀數為粒子數，C區中Y軸讀數為綠色螢光(對數值)。圖8B中，D區顯示將含Alexa555標記的SiRNA的脂質體裝載入3.5微米納米多孔氧化的矽一級粒子的時間動態。D區中Y軸讀數為螢光。E區和F區呈現螢光顯微圖像，顯示與裝載入3.5微米納米多孔矽一級粒子的含有Alexa555標記的SiRNA的脂質體所關聯的萸光。圖9，A-D區展示"大孔，，(LP)納米多孔矽一級粒子的掃描電鏡(SEM)圖像。圖10，A-D區展示"小孔，，(SP)納米多孔矽一級粒子的掃描電鏡(SEM)圖像。圖11，A-D區展示用Z2Coulter粒子計數器測量的納米多孔矽粒子的降解。A和B區中Y軸讀數為粒子數。C和D區中Y軸讀數為粒子的體積。圖12A-B展示使用電感耦合等離子體發射光i普(InductiveCoupledPlasma-AtomicEmissionSpectrometry)測量的納米多孑L矽粒子的降解。圖12A,A區為LP氧化的矽粒子；B區為SP氧化的矽粒子；圖12B,C區為LPAPTES修飾的矽粒子。D區為APTES修飾的SP珪粒子。圖12A-12B中Y軸讀數為矽的濃度(ng/mL)。圖13通過呈現選定的納米多孔矽粒子和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的明場顯微圖像展示納米多孔矽一級粒子的生物相容性。具體地說，A區展示小孔氧化的矽納米粒子的圖像；B區展示小孔APTES修飾的矽納米粒子的圖像；C區展示大孔氧化的矽納米粒子的圖像；D區展示大孔APTES修飾的矽納米粒子的圖像。在A-D區每一個中，從左至右第一張圖像第0天(粒子加入後2hrs)、第二張圖像第1天、第三張圖像第2天、第四張圖像第3天。圖14A-B通過呈現對與納米多孔矽粒子一起孵育的HUVEC細胞的乳酸脫氬酶(LDH)毒性分析的數據展示納米多孔矽粒子的生物相容性。A-F區中Y軸讀數為490nm處吸光度。圖15A-B呈現與納米多孔矽粒子一起醉育的HUVEC細胞的MTT增殖分析的數據。圖15A，A-B區和圖15B，C-F區中Y軸讀數為570nm處吸光度。圖16，A-C區呈現與納米多孔珪粒子一起孵育的HUVEC細胞並分析了它們的尺寸和形狀的FACS3D圖譜。圖17A-17D呈現與納米多孔珪一級粒子一起孵育的HUVEC細胞並用碘化丙啶染色以研究細胞周期的FACS3D圖鐠。圖18A-C呈現暴露於納米多孔矽一級粒子的細胞的細胞周期的不同階段的統計分析。圖18A，A-C區、圖18B，D-G區、和圖18C，H-K區中Y軸讀數為總細胞群的百分比。圖19，a和b區展示多孔矽粒子的SEM圖像。"大孔"(LP，圖19a)和"小孔，，(SP，b區)粒子圖像顯示(從左至右)背面、正面、截面、背面上的孔和截面中的孔的更近距離觀察。LP和SP粒子的尺寸和形狀相同，孔的尺寸和結構顯著不同。圖20呈現螢光標記的Q-點和PEG-FITC-SWNT裝載入納米多孔矽粒子的流式細胞儀和螢光顯微鏡分析的結果。裝栽液中納米粒子的數量的增加導致通過流式細胞術測量的矽粒子的平均螢光的增加(A區和B區)(LPAPTES+羧基q-點*LP氧化的+氨基Q-點■SPAPTES+羧基q-點ASP氧化的+氨基Q-點)。焚光顯微鏡檢查(C和D區)證實了當使用的納米粒子的量更低時與一級粒子關聯的焚光更弱。A和B區中Y軸讀數為平均螢光。圖21呈現納米多孔矽一級粒子中二級粒子的時間依賴的裝栽和釋放。以不同的二級納米粒子(羧基q-點，《氨基q-點，▲PEG-FITC-SWNT)裝載四種不同類型的納米多孔矽一級粒子(LPIU匕的(a區)、LPAPTES(b區)、SP氧4匕的(c區)、和SPAPTES(d區)並用流式細胞術測量它們的螢光。e-h區中柱狀圖表示隨著時間的推移從一級矽粒子釋放的二級粒子的比例。圖22呈現展示Q-點集中裝栽於矽粒子的背面的高度多孔區域的共聚焦顯微圖像。a區顯示在一系列3維投影中重建的共聚焦顯微圖像，顯示旋轉單個多孔矽粒子以展示不同的觀察點。b區顯示計算機生成的3維模型，圖解說明如a區中所示的粒子的旋轉。圖23A-23C顯示納米多孔矽一級粒子中Q-點和PEG-FITC-SWNT二級粒子的同步裝載和釋放。流式細胞術分析顯示LPAPTES粒子的背景綠色和紅色焚光(未裝載；分別為圖23A，A區和B區)以及在與PEG-FITC-SWNT(+SWNT)、Q-點(十Q-點)和兩者(+Q-dots+SWNT)—起孵育後螢光信號的變化。流式細胞術分析顯示PEG-FITC-SWNT裝載快且穩定，而Q-點逐漸裝載直到達到一個平臺，見圖23B，C區。在另一類納米粒子的存在下Q-點和PEG-FITC-SWNT的釋放圖鐠都未改變並且都隨著時間保持不變，圖23B，D區。共聚焦顯微圖像顯示Q-點(紅色)和PEG-FITC-SWNT(綠色)在單個多孔矽粒子中的定位。圖23C,E區、F區和G區分別顯示明場、綠色和紅色螢光，而h區顯示3個通道的疊加。黃色顯示表示綠色和紅色螢光信號的共定位。圖23B,D區中Y軸讀數為平均螢光；D區中Y軸讀數為釋放的有效載荷。18圖24,a-m區顯示涉及將裝載二級粒子的納米多孔矽粒子與HUVEC細胞在37"C—起孵育lh的螢光光鐠圖像。圖24，a-d區中，所述二級粒子是Q-點；e-h區中，所述二級粒子是PEG-FITC-SWNT;j-m區中，所述二級粒子是Q-點和PEG-FITC-SWNT。圖24，d、h和m區是顯示粒子具體形狀的明場圖像。圖25,A-C區呈現表現負責一級矽載體中二級納米粒子的裝載和釋放的物理、化學和靜電三個主要機制的計算機模型。(A區)尺寸依賴性孔的尺寸決定優選裝載入矽粒子的納米粒子的類型。(B區)劑量依賴性裝載液中更大量的納米粒子導致裝載入孔的粒子的數量的增加。(B區)電荷依賴性電荷相容的納米粒子將被吸引入孔，然而不相容的電荷將部分地抵制納米粒子並因而阻止它們進入孔內。圖26，A-B區，呈現裝載入納米多孔矽一級粒子的含SiRNA的脂質體的數據。A區將Alexa555焚光標記的siRNA包封於納米-脂質體再裝載入i級納米-栽體。所述數據顯示與多孔矽載體關聯的螢光隨著納米脂質體的量增加。A區中Y軸讀數為平均螢光。圖26，B區呈現顯示從一級納米多孔矽粒子釋放的脂質體的相對量的曲線圖。Y軸讀數為釋放的脂質體的總量的百分比。為了測試納米-脂質體從1級載體的釋放，將裝配好的多級粒子與10%胎牛血清(pH7.4)—起孵育，採用螢光法隨時間跟蹤納米脂質體從一級粒子的釋放。約36h達到完全卸載。圖27展示裝載量子點和PEG-FITC-SWNT的物理條件的最優化。a區和b區中Y軸讀數為平均螢光。將多孔矽粒子在乾燥器中乾燥過夜，然後與含有二級納米粒子的裝栽液混合。乾燥條件下的裝載效率與溼環境中的裝載效率無顯著差別(p值X).5)。定義除非另外說明，"一"或"一個"表示一種或多種。"乾身體位點的生化環境"指靶位點的一個或多個內在生理條件，例如pH、鹽條件、溫度、或有效發起並促進粒子內容物的釋放的靶特異部分的存在。"生物可降解，，指在生理介質中溶解或降解的材料或在生理條件下由生理的酶和/或化學條件降解的生物相容性聚合材料。"黏膜附著"指粒子能夠附著於內襯在小腸和大腸的整個表面的黏膜層。附著由嫁接到粒子表面的配體介導，所述配體結合存在於粘液素中或腸內皮細胞表面的化學受體。"靼向部分"是促進粒子靶向特定位點的任何因素。例如，靶向部分可以是化學靶向部分、物理靶向部分、幾何學靶向部分或其組合。化學乾向部分是粒子表面上的化學部分或分子；物理靶向部分是粒子的特定物理性質，例如疏水表面；幾何學靶向部分包括粒子的尺寸和形狀。"微米粒子，，意為具有從i微米到iooo微米、或從1微米到100微米的最大特徵尺寸的粒子。"納米粒子"意為具有不到l微米的最大特徵尺寸的粒子。"生物相容的，，指當暴露於活細胞時，支持細胞的適當細胞活性而不在細胞內產生不希望的作用，例如所述細胞的生命周期的改變、所述細胞的增殖率的改變以及細胞毒性作用的材料。發明詳述本發明的實施方案中，包含兩級或更多級粒子的組合物，例如後級的粒子(較小尺寸的粒子)包含於前級的粒子中(較大的粒子)，將潛在地為治療、預防和/成像受試者中的生理狀態，例如疾病提供一種或多種益處，所述受試者為任何具有血液系統的動物(例如，所述受試者為溫血動物，例如包括人類的哺乳動物)。所述多級組合物的實施方案提供一種或多種以下特點或益處(l)將活性試劑，例如治療劑或成像劑，優先遞送到和/或定位於受試者體內的特定的靶位點。優先遞送和/或定位意為遞送到或定位於靶位點的活性試劑的數量或濃度高於遞送到或定位於受試者體內的其他位點的活性試劑的數量或濃度；(2)連續克服受試者體內的多重生物屏障的多級組合物；和(3)允許同步遞送和定位於多個活性試劑的相同或不同靶位點的多級組合物。200780037424.3蘭浙翁施用後，以傳統方法或於納米載體中配製的活性試劑，例如治療或成像劑，遭遇對所述試劑以期望的濃度到達預期靶標的能力造成不利影響的多種生物屏障。所述生物屏障位，例如，表皮或內皮屏障，例如基於緊密連接、阻止或限制活性試劑的細胞旁路轉運的血-腦屏障或腸腔內皮。每個內皮/表皮屏障包括多個連續亞屏障，例如其分子辨別歸功於一種或多種緊密連接蛋白的緊密連接屏障、以及一種或多種其他的生物膜，例如血管內皮基底膜或腸內皮的黏膜層。網狀內皮系統(reticulo-endothdialsystem)的細胞也針對包封於納米粒子的活性試劑起生物屏障的作用，因為這些細胞捕獲/攝取納米粒子。生物屏障也表現為活性試劑必須通過的細胞膜或細胞內的核膜。因為生物屏障是連續的，克服或繞過這類屏障也必須為連續的。因此，開發了一種遞送載體，在實施方案中，其以多級形式發揮作用。所述栽體的每一級由具有單獨預期功能的粒子定義，所述功能不同於其他級的粒子的預期功能。例如，設計某一級的粒子使其靶向不同於由其他級的粒子靶向的位點的特定身體位點，因而克服或繞過不同於其他級的粒子克服或繞過的生物屏障的特定生物屏障。每個隨後級的粒子包含於緊臨於其前的級的粒子中。任何特定級的粒子包含旨在用於此特定級的活性試劑，例如治療劑或成像劑。一個優選實施方案中，最後一級的粒子是配製為納米粒子的活性試劑或者備選地，最後一級的粒子內部含所述活性試劑，然而任何之前的級的粒子本身可能包含或可能不包含活性試劑。一些實施方案中，除靶向特定的身體位點以外，以某種方式設計每一級的粒子使其能夠進行其內容物的靶向釋放。在實施方案中，多級遞送載體中級的數量和類型取決於幾個參數，包括施用途徑和活性試劑的最終預期靶標。多級遞送栽體的一個實施方案在圖1中顯示。一些實施方案中，一級粒子為微米粒子或納米粒子。一些實施方案中，一級粒子具有至少500微米或至少lmm的特徵尺寸。配置所述粒子使其內部含至少一種微米粒子或納米粒子，後者反過來內部含至少一種更小尺寸的粒子。一級粒子是能夠在內部含更小尺寸的粒子的任何粒子。一些實施方案中，一級粒子為自頂向下製作的粒子，即通過自頂向下微米加工或納米製作方法，例如光刻(photolithography)、電子束光刻、X-射線光刻、深度紫外光刻或納米壓印光刻製備的粒子。使用所述自頂向下製作法的潛在優勢是這些方法提供尺寸一致的粒子的放大的生產。配置一級的粒子以克服至少一種以下生物屏障血液流變學屏障、網狀內皮系統屏障、內皮屏障、血腦屏障、肺瘤相關的滲透性間質壓力屏障、離子和分子泵屏障、細胞膜屏障、酶降解屏障、核膜屏障或其組合。一級粒子具有由所述粒子的尺寸和形狀以及體內的一種或多種貯存器定義的主體。所述貯存器內部包含一種或多種二級粒子。一級粒子的主體包含任何適當的材料。優選地，一級粒子的主體的材料是生物相容的。一些實施方案中，一級粒子的主體包含氧化物材料例如氧化矽、氧化鋁、氧化鈦或氧化鐵；半導體材料，例如矽；聚合物或氧化聚合物材料；或陶瓷材料。一些實施方案中，一級粒子的主體包含生物可降解的材料，例如，納米多孔矽。所述生物可降解的材料為一種當暴露於生理介質例如矽酸時其發生降解的材料。一些實施方案中，一級粒子的主體的材料在主體的不同區域實質上相同。一級粒子的形狀取決於施用途徑。例如，配置所述形狀使一級粒子和耙位點的表面之間的接觸最大化，例如血管內施用時的內皮表面或口服施用時的腸上皮。因此，對於口服和血管內施用，將一級粒子配置成具有使所述粒子和內皮表面之間的接觸最大化的選定的非球形的形狀。適當的形狀的實例包括，但不限於，扁球形或圓盤形。對於肺部施用，即向受試者的肺施用，也將一級粒子配置成具有使所述粒子和肺內一種表皮組織之間的接觸最大化的選定的非球形的形狀。對於肺部施用，即一種涉及粒子通過受試者的肺的施用途徑，一級粒子也具有針狀的形狀，其促進粒子不一定通過血循環而從肺進入身體組織。儘管自頂向下加工允許製作具有範圍大到從50nm多至幾釐米的尺寸的粒子，對於一些施用途徑優選特定的粒子尺寸。例如，對於血管內施用，粒子的最大特徵尺寸，例如，圓盤形粒子的直徑，優選足夠小於最小的毛細血管的半徑。在人中，所述半徑約為4或5微米。因此，在一些實施方案中，粒子的最大特徵尺寸為小於約3微米、小於約2微米或小於約l微米。實施方案中，一級粒子的最大特徵尺寸為從500nm到3微米、或從700nm到2微米。然而在關於腫瘤學應用中血管內施用的一些實施方案中，一級粒子的最大特徵尺寸為能使其定位於靶血管位點而不穿過癌症血管內皮上的窗口。對於上述應用，一級粒子的最大特徵尺寸為大於約100nm、或大於約150nm、或大於約200nm。然而在關於血管內施用的一些實施方案中，一級粒子的尺寸使其可穿過所述窗口。因此，在上述應用中最大特徵尺寸優選為小於約200nm、或小於約150nm、或小於約200nm。一些實施方案中，為了靼向已開窗的血管，可選擇一級粒子的尺寸，選定為正常的未開窗的血管的臨界半徑，如屬於PaoloDecuzzi和MauroFerrari於2006年9月27日提交的PCT專利申請號PCT/US2006/038916"MethodsandCompositionsforTargetingFenestratedVasculature"中詳細描迷。對於口服施用，優選使用最大特徵尺寸為大於約2微米、或大於約5微米或大於約10微米的一級粒子。採用上述尺寸的一級粒子用於口服施用的優勢是這樣的粒子太大而不能被腸表皮細胞吞噬。腸表皮細胞吞噬至少有兩個潛在缺點1)在到達期望的耙標之前由內皮細胞處理時，一級粒子的內容物可能失活；2)特定載體的潛在毒性，例如粒子的材料的毒性，如果其被吞噬比如果其被清除出胃腸道更加備受關注。2一些實施方案中，對於口服施用，一級粒子具有從500微米到幾釐米、或從lmm到2cm範圍的尺寸。對於肺部施用，如果耙位點位於肺的氣道，一級粒子的最大特徵尺寸優選為小於約20微米但大於約5微米。為靶向肺泡內位點，最大特徵尺寸為小於約5微米。一些實施方案中，對於皮下施用，一級粒子的最大特徵尺寸為從約50微米到lmm;或從100微米到lmm。實施方案中，一級粒子的一項功能是定位於特定的靶位點。對於血管內施用，所述靶位點為特定的血管位點。例如，在抗癌應用中，所述耙向的血管位點是腫瘤血管，例如新生血管、共擇的(coopted)血管或再正常化的(renormalized)血管。一級粒子對靶位點的定位受到幾何學因素的促進，例如粒子的尺寸和形狀。對於血管內施用，一級粒子的表面上的一種或多種識別因子促進對靶位點的定位。所述識別因子為化學靶向部分，例如樹狀聚體、抗體、適體(例如石危醇適體(thioaptamer))、結合乾向的位點上特定受體的配體或生物分子。對於口腔遞送，如U.S.專利號6，355，270的表1中所描述，所述化學部分包含一種或多種黏膜附著配體。通過改變粒子的表面的化學部分調節靶向的選擇性。例如，使用血管生成素2(angi叩oietin2)的抗體特定地靶向共擇的血管；使用血管內皮生長因子(VEGF)、鹼性成纖維細胞生長因子(FGFb)或內皮標誌物(例如v3整合素)的抗體識別新生血管，而使用癌胚抗原相關細胞附著分子1(CEACAM1)、內皮素-B受體(ET-B)、血管內皮生長因子抑試劑gravin/AKAP12、蛋白激酶A和蛋白激酶C的腳手架蛋白識別再正常化的血管，參考例如RobertS.Korbel"AntiangiogenicTherapy:AUniversalChemosensitizationStrategyforCancer",Science26May2006，vol312，no.5777，1171-1175。為靼向非循環的血管細胞，一級粒子和靼向的血管位點的分子標誌物之間的結合應足夠堅固以克服由流動的血液施加的阻力。通過擁有對於特定結合的相對大的平面表面積和在毛細血管的血流空間內相對小的外形，即擁有選定的非球形，例如扁球形或圓盤形的粒子實現此目標。識別因子也可為物理識別部分，例如表面電荷。在粒子的製作期間使用化學處理例如特定的洗滌引入所述電荷。例如，將多孔二氧化矽或氧化的矽表面浸入水中導致表面上獲得負電荷，參考例如Behrens和Grier，J.Chem.Phys.115(14)，(2001).P.6716-6761。也可由粒子的表面上的附加層或化學鏈，例如聚合物鏈提供表面電荷。例如，聚乙二醇鏈是表面上負電荷的來源。將聚乙二醇鏈包被或共價結合於表面，如P.K.Jal，S.Patel，B.K.Mishra，Talanta62(2004)P1005-1028、S.W.MetzgerandM.Natesan，J.Vac.Sci.Technol.A17(5),(1999)P2623-2628、以及M.Zhang，T.A.DesaiandM.Ferrari,Biomaterials,19，(1998)，p953中所描述。通過例如，以鹼性聚合物例如多聚賴氨酸包被表面，或通過將含氨基的分子例如3-氨丙基三乙氧基矽烷共價結合到表面上引入正電荷。一些實施方案中，基於選定的靶位點的一種或多種性質，將建模方法應用於選擇幾何學因素，例如粒子的尺寸和形狀，以及/或表面修飾，例如化學修飾和靜電修飾。所述建模方法公開於，例如，l)屬於PaoloDecuzzi和MauroFerrari於2006年10月11日提交的U.S.臨時專利申請號60/829，075"ParticlesforCellTargeting";2)屬於PaoloDecuzzi和MauroFerrari於2007年2月26日提交的U.S.臨時專利申請號60/891,584"Endocytoticparticle";3)Decuzzi，P"Causa,F.,Ferrari,M.&Netti，P.A.Theeffectivedispersionofnanovectorswithinthetumormicrovasculature.AnnBiomedEng34,633-41(2006);4)Decuzzi,P.&Ferrari,M.Theadhesivestrengthofnon-sphericalparticlesmediatedbyspecificinteractions.Biomaterials27，5307-14(2006);5)Decuzzi，P.&Ferrari,M.Theroleofspecificandnon-specificinteractionsinreceptor-mediatedendocytosisofnanoparticles.Biomaterials28，2915-22(2007);6)Decuzzi,P,，Lee，S.，Bhushan,B.&Ferrari,M.Atheoreticalmodelforthemarginationofparticleswithinbloodvessels.AnnBiomedEng33，179-90(2005);Decuzzi，P.，Lee,S.，Decuzzi，M.&Ferrari,M.Adhesionofmicrofabricatedparticlesonvascularendothelium:aparametricanalysis.AnnBiomedEng32，793-802(2004)。一些實施方案中，配置一級粒子使其在耙位點從其貯存器釋放二級粒子。二級粒子的釋放根據多種機制進行，包括，但不限於，二級粒子通過連接^存器和一級粒子的表面的通道擴散以及一級粒子的主體的降解和侵蝕。為了上述目的，配置一級粒子使其特徵釋放時間長於當施於受試者時一級粒子到達其靶位點的特徵遞送時間。一些實施方案中，配置一級粒子使其執行從其貯存器釋放二級粒子，其持續時間長於當施於受試者時一級粒子到達其靶位點的特徵遞送時間。一些實施方案中，配置一級粒子使其在長於至少0.5hr、或長於至少1hr、或長於至少2hr、或長於至少8hr、或長於至少15hr、或長於30hr的時間段釋放二級粒子。一些實施方案中，由靶位點的一種或多種內在生理條件例如pH、鹽濃度或溫度觸發一級粒子的物理定位和/或靶向的釋放。一些實施方案中，由外源刺激觸發一級粒子的物理定位和/或靶向的釋放。外源刺激的實例包括機械性激活，例如由超聲激活；電磁激活，例如由可見光、紫外光、近紅外或紅外光、射頻或X-射線輻射、電磁輻射激活。例如，一級粒子包含智能聚合物，即響應特定刺激，例如光、溫度或pH收縮或膨脹的聚合物。智能聚合物在例如"InSituActivationofMicroencapsulatedDrugs(MSC畫22866)，"NASATechBriefs,Vol.24，No.9(September2000)，第64頁、"ExternallyTriggeredMicrocapsulesReleaseDrugsInSitu(MSC-22939),NASATechBriefs,(April2002)，第50頁、以及於2000年8月8日屬於Morrison和Mosier的U.S.專利號6,099,864中描述。在一些情況下，聯合使用超過一個外源刺激以激活釋放。為提高定位/靶向效率，一級粒子利用多個，即超過一個優選彼此互不幹擾的識別/定位/靼向因子。例如，一級粒子擁有如上論述的選定的非球形形狀，同時在其表面上攜帶腫瘤-靶向抗體。一些實施方案中，以聚合物鏈部分地或全部地包被一級粒子的表面。在製作血管內級粒子後添加聚合物鏈。聚合物鏈可為親水鏈，例如聚乙二醇(PEG)鏈或合成的glycocalix鏈，用於克服網狀內皮系統的細胞對粒子的攝取，從而延長血管內級粒子的血循環。親水基團也用作增強多級遞送器的溶解度。以聚合物鏈衍生出多種材料。例如，當粒子的表面材料包含聚合物時，通過連接聚合物的羧基和聚合物鏈中的氨基或羥基附上聚合物鏈；如果粒子的表面材料包含金屬例如金，經由硫醇化學將聚合物鏈連接於表面；當粒子的表面材料包含氧化物，例如氧化矽、氧化鈦或氧化鋁，使用矽烷化學附上聚合物鏈。除一種或多種二級粒子外，一級粒子的貯存器含一種或多種另外的試劑。所述另外的試劑包括另外的活性試劑，例如治療劑或成像劑，靶向劑，一種或多種滲透增強劑或其任意組合。所述滲透增強劑包括一種或多種表l中所列化合物。表1滲透增強劑促進劑的種類特定實例膽汁鹽甘氨脫氧膽酸鹽牛磺脫氧膽酸鹽牛磺鵝脫氧膽酸鹽甘氨鵝脫氧膽酸鹽牛磺膽酸鹽甘氨膽酸鹽甘氨熊膽酸鹽牛磺熊膽酸鹽脫氧膽酸鹽非離子表面活性劑陰離子表面活性劑磷酯醯中鏈甘油酯或中鏈脂肪酸水楊酸鹽醯基肉鹼醯基膽鹼醯基胺基酸鈣螯合劑肽鵝脫氧膽酸鹽膽酸鹽熊膽酸鹽聚氧乙烯(POE)醚(例如，Brij、Texaphor)烷基苯氧基國POEs(Triton、Igepal、磺)十二烷基磺酸鈉丁二酸二辛酯磺酸鈉溶血卵磷脂C8、C10或C12脂肪酸的單、二或三甘油酯辛酸鈉癸酸鈉月桂酸鈉水楊酸鈉癸基肉鹼月桂醯肉鹼肉豆蔻醯肉鹼月桂醯膽鹼棕櫚醯膽鹼N-月桂苯甘氨酸N-棕櫚甘氨酸乙二胺四乙酸CEDTA)PZ-肽封閉帶毒素(ZOT)對於血管內施用，滲透增強劑包括作用於基底膜的基底膜滲透增強劑，和/或一種或多種作用於緊密連接蛋白(TJP)的滲透增強劑。所述基底膜促進劑的實例是金屬蛋白酶，例如膠原酶IV、MMP-2、以及MMP-9。所述抗-TJP滲透增強劑的實例是封閉帶毒素。抗-TJPS.J.Membr.Biol"2005.207(2):p.55-68中詳細描述。圖2A-B顯示根據一個實施方案，當一級粒子定位於靶向的血管位點時滲透增強劑的作用。一級粒子釋放滲透增強劑，在靶向的血管上生成一種或多種窗口，二級粒子通過此窗口穿入血管。一些實施方案中，一級粒子擁有一種或多種將貯存器與接觸內皮或表皮細胞的表面液態連接的通道。對於血管內施用，所述一級粒子為微米製作或納米製作的粒子，例如在U.S.專利申請公布號2003/0114366和U.S.專利號6,107,102中詳細描述的那些，對於口服施用，所述一級粒子為孩i米或製作的粒子，例如在U.S.專利號6,355,270中/>布的那些。一些實施方案中，貯存器和通道是一級粒子的主體內的孔。在所述情況下，一級粒子含有多孔或納米多孔材料。優選地，控制多孔或納米多孔材料的孔以獲得下一級粒子的期望的裝載量和期望的釋放率。具有可控制的孔尺寸的納米多孔材料為氧化物材料，例如氧化矽、氧化鋁、氧化鈦或氧化鐵。納米多孔氧化物粒子(也稱為溶膠凝膠粒子)的製作，在例如PaikJ.A.et.al.J.Mater.Res.，Vol.17，Aug2002.Thenanoporousmaterialwithcontrollableporesizemaybealsonanoporoussilicon中詳細描述。具有可控制的孔尺寸的納米多孔材料也可為納米多孔矽。關於納米多孔矽粒子的製作的細節，參考CohenM.H.et.al.BiomedicalMicrodevices5:3，253-259，2003。通過在從無孔矽形成納米多孔矽的過程中改變電流和蝕刻時間實現孔密度、尺寸、形狀和/或定位的控制。也可通過改變用作形成納米多孔矽的無孔矽中的摻雜物實現孔密度、尺寸、形狀和/或定位的控制。因而，可配置納米多孔的孔尺寸、密度、尺寸、形狀和/或定位使其有效裝栽二級粒子。一些實施方案中，納米多孔一級粒子的孔尺寸為，例如，從約lnm到約200nm;或從約2nm到約100nm。一些情況下，納米多孔一級粒子的孔尺寸為從約3到約10nm或從約5到約7nm。然而在一些情況下，納米多孔一級粒子的孔尺寸為從約10到約60nm、或從約20到約40證。一些實施方案中，為了促進二級粒子裝載入多孔或納米多孔的孔中，將所述材料進行化學和/或靜電修飾使其與二級粒子的化學和/或靜電錶面特性相容。例如，為裝載帶負電的二級粒子，優選使用帶正電的孔表面。通過，例如，在孔表面安置含氨基的分子，例如3-氨丙基三乙氧基矽烷實現正電荷。為裝載帶正電的二級粒子，優選使用帶負電的孔表面。通過，例如，用水氧化孔表面實現孔表面的負電荷。一些實施方案中，一級粒子完全沒有通道。所述粒子含有，例如，生物可降解的材料。對於口服施用，將材料設計為在胃腸道中消蝕。例如，一級粒子由金屬組成，例如鐵、鈦、金、銀、鉑、銅、及其合金和氧化物。所述生物可降解的材料也是生物可降解的聚合物，例如聚原酸酯、聚酸酐、聚醯胺、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚磷腈、以及聚酯。生物可降解的聚合物的實例在，例如，U.S.Pat.Nos.4,933,185,4,888,176和5,010,167中詳細描述。所述生物可降解的聚合物的特定實例包括聚(乳酸)、聚羥基乙酸、聚己內酯、聚羥基丁酸、聚(N-棕櫚醯-反式-4-羥基-L-脯氨酸酯)和聚(DTH碳酸鹽)。一些實施方案中，一級粒子的主體包括兩個或更多配置成含二級粒子的不同群體的區域。例如，一級粒子的主體具有配置成含二級粒子的第一群體的第一區域和配置成含二級粒子的第二群體的第二區域。例如，由多孔的納米多孔材料組成的一級粒子為其體具有兩個或更多彼此互不相同的多孔區域。納米多孔一級粒子的主體包括至少在一個特性例如孔密度、孔幾何學、孔電荷、孔表面化學、孔定向或其任意組合上彼此互不相同的第一多孔區域和第二多孔區域。將所述第一和第二區域分別配置成含二級粒子的第一和第二群體。一些實施方案中，二級粒子的第一和第二群體在至少一個特性例如尺寸、形狀、表面化學修飾、表面電荷或其組合上不同。一些實施方案中，二級粒子的第一和第二群體含相同的活性試劑。然而，一些實施方案中，二級粒子的第一和第二群體分別含彼此互不相同的第一活性試劑和第二活性試劑。配置二級粒子的笫一和第二群體使其執行不同功能。例如，一些實施方案中，配置第一和第二群體使其分別靶向彼此互不相同的第一和第二靶位點。一些實施方案中，配置第一群體使其靶向受試者體內的特定位點，而配置第二群體使其在受試者的血液系統中自由循環。一些實施方案中，第一和第二群體靶向受試者體內的相同靶位點但在所述體位點執行不同功能。例如，第一群體含待遞送至靶位點的治療劑，而第二群體含待遞送至耙位點以使耙位點成像或顯現的成像劑。一級粒子的主體的第一和第二區域為至少它們中的一個是生物可降解的區域。優選地，一級粒子的主體的第一和第二區域均為生物可降解。一級粒子的主體的第一和第二區域具有釋放二級粒子的第一和第二群體的不同的特徵時間。一些實施方案中，從第一區域釋放二級粒子的第一群體的特徵時間和從第二區域釋放二級粒子的第二群體的特徵時間均大於當施用於受試者時一級粒子到達靶位點的遞送和/或定位的特徵時間。一些實施方案中，配置一級粒子使其在暴露於生理介質，例如存在於一級粒子的耙位點的介質時分成包含第一區域的第一組分和包含第二區域的第二組分。所述暴露在，例如，將粒子施於受試者時發生。一些實施方案中，配置一級粒子的主體的第一和第二區域使其在將粒子施於受試者時執行不同的功能。例如，配置一級粒子的主體的第一和第二區域使其分別克服彼此互不相同的第一和第二生物屏障。所述生物屏障每一個選自，例如，血液流變學屏障、網狀內皮系統屏障、內皮屏障、血腦屏障、腫瘤相關的滲透性間質壓力屏障、離子和分子泵屏障、細胞膜屏障、酶降解屏障、核膜屏障或其組合。二級粒子為任何適合裝入一級粒子的貯存器的微米粒子或納米200780037424.3配置二級粒子使其克服至少一個選自血液流變學屏障、網狀內皮系統屏障、內皮屏障、血腦屏障、腫瘤相關的滲透性間質壓力屏障、離子和分子泵屏障、細胞膜屏障、酶降解屏障、核膜屏障或其聯合的屏障。二級粒子的組成、尺寸和形狀無特別限制。例如，對於多種施用途徑，二級粒子為基於脂質的粒子，例如脂質體、膠束或脂質包封的全氟化碳乳劑；醇質體(ethosome);碳納米管，例如單壁碳納米管；富勒烯納米粒子；金屬納米粒子，例如金納米殼或三角形銀納米粒子；半導體納米粒子，例如量子點或摻硼矽納米線；聚合物納米粒子，例如由生物可降解的聚合物製成的粒子和摻離子的聚丙烯醯胺粒子；氧化物納米粒子，例如氧化鐵粒子、聚合物包被的氧化鐵納米粒子或氧化矽粒子；病毒粒子，例如工程病毒粒子或工程病毒-聚合物粒子；聚離子粒子，例如受束leashed聚陽離子；陶瓷粒子，例如基於二氧化矽的陶瓷納米粒子；或其組合。一些實施方案中，設置二級粒子使其靶向受試者體內的特定靶位點。所述靶位點與一級粒子靶向的靶位點相同或不同。例如，二級粒子的表面具有一種或多種與某些類型細胞的表面標誌物抗原綴合的抗體。因而，二級粒子選擇性靶向攜帶所述標誌物抗原的細胞。攜帶標誌物抗原的細胞的實例包括幹細胞或成克隆細胞和腫瘤細胞。CD33抗體靶向幹細胞或成克隆細胞上的表面標誌物抗原。有許多針對腫瘤特異抗原的單克隆抗體可用，參考，例如《癌症》，第3版，DeVita等人編輯，pp.301-323、Janeway等人《免疫學》第5版，Garland出版社，NewYork,2001、A.N.Nagappa,D.Mukherjee&K.Anusha"治療用單克隆抗體"，PharmaBiz.com，星期三，9月22，2004。表2呈現FDA批准的用於癌症的治療的單克隆抗體。表2單抗名稱商品名用以治療批准間利妥昔單抗Ritux3n非霍奇金淋巴瘤1997曲妥珠單抗Hcrccptin乳腺癌1998吉妥單抗奧佐米星*Mylotarg急性粒細胞白血病(AML)2000阿侖單抗Campath慢性淋巴細胞白血病(CIX)2001替伊莫單抗tiuxetan*Zevalin非霍奇金淋巴瘤2002託西莫單抗*非霍奇金淋巴瘤2003西妥昔單抗Erbitux結直腸癌頭頸癌20042006貝伐珠單抗Avastin結直腸癌2004時一些實施方案中，配置二級粒子使其在從一級粒子釋放時在受試者的血液系統中自由循環。在一些情況下，所述二級粒子具有無靶標部分(例如抗體)的表面。自由循環的二級粒子用於，例如，報告與一級粒子本身關聯的治療劑的治療作用。一些實施方案中，二級粒子的表面沒有親水聚合物鏈，例如安置於其上的聚乙二醇(PEG)。在某些情況下，這是多級遞送載體的一個優點，因為PEG鏈通常連接於脂質體和其他納米粒子以延遲網狀內皮系統的巨噬細胞的識別和捕獲。遺憾的是，PEG鏈也掩蓋納米粒子表面的抗體因而抑制抗體的靼向/定位能力。多級遞送栽體中，連接於一級粒子的PEG執行對RES巨噬細胞的屏蔽。儘管PEG掩蓋一級粒子上的抗體，一級粒子的識別/定位能力不限於抗體，因為其他因素例如粒子的尺寸和形狀也有助於所述能力。一些實施方案中，二級粒子的表面具有親水聚合物鏈，例如安置於其上的PEG鏈。一些實施方案中，修飾二級粒子的表面，例如，以增強二級粒子裝載入一級粒子的Ji&存器的能力和/或增強二級粒子到達其耙位點的能力。所述表面修飾包括二級粒子的表面的化學修飾和/或二級粒子的表面的靜電修飾。例如，為促進二級粒子裝載入多孔或納米多孔一級粒子中，修飾二級粒子的表面以使其特性與多孔或納米多孔一級粒子的孔的表面特性相容。例如，當多孔或納米多孔一級粒子的孔帶正電時，優選修飾二級粒子的表面以使其為靜電中性或帶負的表面電荷；而當多孔或納米多孔一級粒子的孔帶負電時，優選修飾二級粒子的表面以使其為靜電中性或帶正的表面電荷。釆用上文詳述的與一級粒子相同的方法進行二級粒子的化學和/或靜電錶面修飾。對於含脂質的二級粒子，例如脂質體或膠束，通過在它們的脂質層內合併入影響脂質體的靜電電荷的脂質進行靜電修飾。例如，為形成含帶正電的陽離子脂質的粒子，使用陽離子脂質，例如1，2-二油醯-3-三曱基銨丙烷(DOTAP);為形成含帶負電的陰離子脂質的粒子，使用陰離子脂質，例如二油醯磷脂醯甘油(DOPG);為形成含中性脂質的粒子，使用中性脂質，例如DOPC。一些實施方案中，一旦結合於靶向的一個細胞或多個細胞，二級粒子即將其內容物釋放到細胞的細胞質中。一些實施方案中，所述釋放由外源因子激活，例如電磁輻射。對於富勒烯納米粒子和碳納米管，所述輻射為射頻輻射，而對於金殼納米粒子，所述輻射為近紅外輻射。外源輻射對納米粒子的激活在，例如，Hirsch，L.R.，Halas,N.J.&West,J.L.Anal.Chem.75，2377—2381(2003)、Hirsch，L.R.，Halas，N.J.&West,J.L.Proc.NatlAcad.Sd.USA100，13549—13554(2003)、以及O，Neal，D.P.，Halas，N.J.&West,J.L.CancerLett.209，171-176(2004)中詳細描述。一些實施方案中，二級粒子的內容物為一種或多種活性試劑本身。一些實施方案中，二級粒子內部含三級粒子，其自身內部含一種或多種活性試劑。所述三級粒子為，例如，小到足以能夠通過靶向的細胞的核膜的粒子。因而，三級粒子用於向細胞的核遞送活性試劑，為能通過核膜，三級粒子範圍從約3nm到約10nm。在3nm到10nm尺寸範圍內遞送納米粒子的能力是多級遞送載體的優點之一，因為所述粒子經由注射的傳統施用通常導致它們的立即完全清除。一些實施方案中，多級栽體包括第三級。第三級為任何適合裝入二級粒子的納米粒子。和二級粒子一樣，三級粒子為基於脂質的粒子，例如脂質體、膠束或脂質包封的全氟化碳乳劑；醇質體；碳納米管，例如單壁碳納米管；富勒烯納米粒子；金屬納米粒子，例如金納米殼或三角形銀納米粒子；半導體納米粒子，例如量子點或摻硼矽納米線；聚合物納米粒子，例如以生物可降解的聚合物製成的粒子和摻離子的聚丙烯醯胺粒子；氧化物納米粒子，例如氧化鐵粒子、聚合物包被的氧化鐵納米粒子或氧化矽粒子；病毒粒子，例如工程病毒粒子或工程病毒-聚合物粒子；聚離子粒子，例如受束聚陽離子；陶瓷粒子，例如基於二氧化矽的陶瓷納米粒子；或其組合。一些實施方案中，三級粒子為核酸納米粒子，例如小幹擾RNA(siRNA)粒子。摔後^在於襲我入#效農f時肅存器#通過任何適當的技術將後級粒子引入前級的前級粒子中。一些實施方案中，將製作的納米多孔前級粒子浸泡在含攜載液和後級粒子的溶液中，後級粒子通過毛細管作用和/或擴散進入前級粒子的孔。所述攜栽液為生物無害的並相對於前級粒子的材料為中性的液體。攜栽液(carryingfluid)的實例為磷酸緩衝鹽水(PBS)或去離子水。所述溶液也含一種或多種期望引入一級粒子中的另外的試劑，例如一種或多種另外的治療劑和一種或多種適當的滲透增強劑。為最大化裝栽入後級粒子，使用具有後級粒子的飽和濃度的溶液。以懸浮液的形式將前級粒子引入所述溶液。多孔粒子懸浮液的製備在，例如，美國專利申請號2003/0114366中詳細描述。在浸入含後級粒子的溶液之前將納米多孔粒子的孔乾燥。一些實施方案中，在引入前級粒子之前將含後級粒子孔的溶液脫氣。然後，在密封室內將前級粒子浸入脫氣的溶液中。將前級粒子置於降低的壓力下以保證將留存的空氣從粒子中的孔驅逐出來。然後將前級粒子完全浸沒於溶液中並將密封室中的壓力提高至稍高於大氣壓以保證溶液進入前級粒子的孔。然後用濾網截獲前級粒子並使用下述三種方法中的一種乾燥。一些實施方案中，為除去留存於浸泡的前期粒子的貯存器中的空氣，將容器中的壓力降低然後提高至稍高於大氣壓。一些實施方案中，在把溶液灌入前級粒子的孔中之後，通過以下三種方法中的一種或更多實現乾燥。在真空室中於降低的壓力下通過蒸發、或通過將一股暖空氣或惰性氣體例如氮氣吹過收集於濾網上的表面粒子、或通過冷凍乾燥將水除去。在冷凍乾燥的情況下，將平的換熱器放置於收集有前級粒子的濾網的良好熱接觸位置，例如直接置於其下。將溫度範圍為-20。C到-60。C的製冷液，例如氟利昂，或冷的液體，例如液氮，通過換熱器的流入口和排出口以使保留於孔內的任何水凍結。然後將壓力降低直到所有水升華。一些實施方案中，為了將後級粒子裝載入納米多孔前級粒子中，配置含前級納米多孔粒子、後級粒子和栽體液(carrierliquid)的溶液。所述栽體液為生理緩衝液，例如Tris-HCl。通過使用標準技術選擇載體液的濃度以將後級粒子最大化地裝載入納米多孔前級粒子。例如，一些實施方案中，對於Tris-HCl，最佳濃度選自從1到500mM。選擇後級粒子的幾何學特性，例如尺寸和形狀，使其與納米多孔前級粒子的孔特性，例如孔密度、孔尺寸、和孔定向相容。一些實施方案中，通過攪動含後級粒子和前級粒子兩者的溶液促進後級粒子對納米多孔前級粒子的裝載入。通過在轉輪內旋轉溶液進行所述攪動。使用標準技術使攪動條件，例如轉輪的旋轉速度最優化，以獲得期望的裝載程度和/或裝栽時間。一些實施方案中，通過改變溶液中後級粒子的濃度控制後級粒子對納米多孔前級粒子的裝載入。一些實施方案中，通過釆用後級粒子在溶液中的更高濃度獲得更高的裝載量。然而，一些實施方案中，通過採用低於後級粒子在溶液中的最高的可能濃度的後級粒子的濃度，獲得更高的後級粒子的裝栽量。使用標準方法測定使後級粒子對納米多孔前級粒子的裝載入最大化的濃度。一些實施方案中，通過修飾納米多孔前級粒子的孔表面和/或後級粒子的表面以使它們更加相容來控制後級粒子對納米多孔前級粒子的裝栽入。通過修飾兩者中任一個表面上的表面化學基團和/或修飾兩者中任一個表面上的電荷進行所述修飾。例如，一些實施方案中，為獲得後級粒子的更高的裝載量，使用後級粒子的帶負電的表面和前級納米多孔粒子的帶正電的多孔表面或後級粒子的帶正電的表面和前級納米多孔粒子的帶負電的多孔表面。一些實施方案中，以彼此相容的化學部分修飾納米多孔前級粒子的孔表面和後級粒子的表面。例如，以羧基修飾納米多孔前級粒子的孔表面和後級粒子的表面中的一個，而以氨基修飾另一個。活#試浙活性試劑為治療劑、成像劑或其組合。活性試劑為任何從含其的粒子釋放的適當試劑。活性試劑的選擇取決於應用。當活性試劑不是任何級的粒子本身時，使用任何適當的技術將其引入粒子。例如，當所述活性試劑為多柔比星時，使用工作實施例4中詳細描述的方法將其引入脂質體粒子。當活性試劑為多級遞送載體的某一級的粒子時，使用上述方法中的一種將所述活性試劑引入。浴#浙治療劑為任何在動物，例如哺乳動物或人類中的靶向的位點引起期望的生物效應的生理上或藥理上的活性物質。治療劑為無限制的任何無機或有機化合物，包括任何已鑑定或未鑑定的肽、蛋白質、核酸、和小分子。治療劑以多種形式存在，例如未改變的分子、分子複合物、藥學可接受的鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、月桂酸鹽、棕櫚酸鹽、磷酸鹽、亞硝酸鹽、硝酸鹽、硼酸鹽、醋酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、水楊酸鹽、以及類似的物質。對於酸性治療劑，使用金屬的鹽，胺或有機陽離子，例如，季銨。藥物的衍生物，例如鹼、酯和醯胺也用作治療劑。以其水溶性衍生物、或其鹼衍生物的形式使用非水溶性的治療劑，在兩者之中任一種情況下，其或通過其遞送，由酶轉化、由身體pH水解、或通過其他代謝過程使其達到最初的治療上的活性形式。治療劑為化療試劑、免疫抑試劑、細胞因子、細胞毒性試劑、溶核化合物、放射性同位素、受體、以及天然的或通過合成或重組方法製備的藥物前體活化酶、或其任何組合。受典型的多藥耐藥影響的藥物，例如長春花生物鹼類(例如，長春鹼和長春新鹼)、蒽環類(例如，多柔比星和柔紅黴素)、RNA轉錄抑試劑(例如，放線菌素-D)以及微管穩定藥物(例如，紫杉醇)作為治療劑具有特定用途。癌症化療試劑為優選的治療劑。可用的癌症化療藥物包括氮芥、亞硝基脲、次乙亞胺、烷基磺酸鹽、四溱、鉑化合物、嘧啶類似物、噪呤類似物、抗代謝藥、葉酸類似物、蒽環類、紫杉烷類、長春花生物鹼類、拓樸異構酶抑試劑和激素試劑。化療藥物的實例是放線菌素-D、愛克蘭、阿糖胞苷、阿那曲唑、天冬醯胺酶、BiCNU、比卡魯胺、博萊黴素、白消安、卡培他濱、卡鉑、碳鉑(Carboplatinum)、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、CPT-ll、環磷醯胺、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷(Cytosinearabinoside)、環磷醯胺、達卡巴嗪、放線菌素D、柔紅黴素、右雷佐生、多西他賽、多柔比星、DTIC、表阿黴素、次乙亞胺、依託泊苷、氟尿苷、氟達拉濱、氟脲嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他濱、赫賽汀、六曱銨、羥基脲、伊達比星、異環磷醯胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、美法侖、巰基噤呤、曱氨喋呤、絲裂黴素、米託坦、米託蒽醌、奧沙利鉑、紫杉醇、帕米膦酸、噴司他丁、普卡黴素、丙卡巴肼、利妥昔單抗、類固醇、鏈佐星、STI-571、鏈佐星、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四溱、硫鳥嘌呤、塞替派、拓優得、拓樸替康、曲奧舒凡、三甲曲沙、長春鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞濱、VP-16和希羅達。可用的癌症化療藥物也包括烷基化試劑，例如塞替派和環磷醯胺；烷基磺酸鹽例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶例如苯佐替哌(Benzodopa)、卡波醌、美妥替艱(Meturedopa)和烏瑞替哌(Uredopa);次乙亞胺和methylamelamines，包括六甲蜜胺、三亞乙基蜜胺，三亞乙基磷醯胺、三亞乙基硫代磷酸胺和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、環磷醯胺、雌莫司汀、異環磷醯胺、氮芥、鹽酸氧氮芥、美法侖、新氮芥、膽甾醇對苯乙酸氮芥、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲例如Cannustine、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素例如阿克拉黴素、放線菌素、Authramycin、重氮絲氨酸、博萊黴素、放線菌素C、加利車黴素、Carabicin、洋紅黴素、嗜癌菌素、Chromoinycins、放線菌素C、柔紅黴素、地託比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表阿黴素、依索比星、依達比星、麻西羅黴素、絲裂黴素、黴酚酸、諾加黴素、橄欖黴素、培洛黴素、紫菜黴素(Potfiromycin)、噪呤黴素、三鐵阿黴素、羅多比星、鏈黑黴素、鏈佐星、殺結核菌素、烏本美司、淨司他丁和佐柔比星；抗代謝藥例如甲氨喋呤和5-氟脲嘧啶(5-FU);葉酸類似物例如二甲葉酸、甲氨喋呤、蝶羅呤和三曱曲沙；噪呤類似物例如氟達拉濱、6-巰基噤呤、硫咪噪呤和硫鳥嘌呤；嘧啶類似物例如安西他濱、阿扎胞苷、6-阿扎胞苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷和5-FU;雄激素例如卡魯睪酮、丙酸屈他雄酮、環硫雄醇、Rnepitiostane和睪內酯；抗腎上腺藥物例如氨魯米特、米託擔和曲洛司坦；葉酸補充物例如亞葉酸；醋葡醛內酯；醛磷醯胺糖苷；氨基酮戊酸；安吖咬；Bestrabucil;比生群；依達曲沙；Defofamine;秋水仙胺；地吖醌；Elfornithine;依利醋銨；依託格魯；硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖、氯尼達明、米託胍腙、米託蒽醌、莫哌達醇、硝氨丙吖啶；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基醯肼；丙卡巴肼；PSK;雷佐生；西佐喃(Sizofrran);鍺螺胺；替奴佐酸；三亞胺醌；2,2，，2，，-三氯三乙胺；烏拉坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露醇氮芥、二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌泊溴烷；Gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C，，)；環磷醯胺；噻替哌；紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOL,Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ)和多西紫斥》醇(TAXOTERE,Rhone-PoulencRorer，Antony,France);苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥噪呤；巰基噪呤；甲氨喋呤；鉑類似物例如順鉑和卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16);異環磷醯胺；絲裂黴素C;米託蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；諾維本；Novantrone;替尼泊戒；柔紅黴素；氨基喋呤；希羅達；伊班膦酸；CPT-11;拓樸異構酶抑試劑RFS2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);視黃酸；Esperamicins、卡培他濱和以上任何一種的藥學可接受的鹽、酸或衍生物。也包括作用以調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素試劑，例如抗雌激素藥物包括例如他莫昔芬、雷洛西芬、芳香化酶抑制4(5)-咪唑、4羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛西芬、奧那司酮、和託瑞米芬(法樂通)；和抗雄激素藥物例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林、和戈舍瑞林；和以上任何一種上述物質的藥學可接受的鹽、酸或衍生物。細胞因子也作為治療劑使用。所述細胞因子的實例是淋巴因子、單核因子、以及傳統的多肽激素。細胞因子中包括的有生長激素例如人類生長激素、N-曱硫氨醯人生長激素以及牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素例如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH);肝細胞生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-a和-p;繆勒管抑制物質；鼠促性腺激素相關肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO);神經生長因子例如NGF-p;血小板生長因子；轉化生長因子(TGFs)例如TGF-a和TGF-p;胰島素樣生長因子-I和-II;促紅細胞生成素(EPO);成骨因子；幹擾素例如幹擾素-a、-p和-y;集落刺激因子(CSFs)例如巨噬細胞-CSF(M-CSF);粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF);以及粒細胞-CSF(GCSF);白細胞介素(ILs)例如IL隱1、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL畫9、IL-ll、IL-12、IL-15;腫瘤壞死因子例如TNF-a或TNF-(3;以及其他多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。如此處所用，術語細胞因子包括源於天然或來自重組細胞培養和天然序列細胞因子的生物活性等同物的蛋白質。成像劑為提供關於動物例如哺乳動物或人的體內靶向的位點的成像信息的任何物質。成像劑包含磁性材料，例如氧化鐵用以磁共振成像。對於光學成像，活性試劑為，例如，半導體納米晶體或量子點。對於光學相干斷層掃描成像，成像劑為金屬，例如，金或銀、納米籠狀粒子。成像劑也可為超聲造影劑，例如微米氣泡或納米氣泡或氧化鐵微米粒子或納米粒子。滋y^為了治療、預防和/或監測生理狀態，例如疾病，將多級遞送栽體作為包括多個所述載體的組合物的一部分通過任何合適的施用方法施用於受試者，例如人類。用於特定應用的具體方法由主治醫師決定。一般來說，組合物通過以下途徑中的一種施用局部、胃腸外、吸入/肺部、口服、陰道或直腸。多級遞送載體的實施方案對腫瘤學應用，即對治療和/或監測癌症或狀態，例如與癌症相關的腫瘤尤其有用。例如，通過局部施用，優選粘性懸浮液，治療和/或監測皮膚癌；通過吸入霧化水相微裝置懸浮液治療和/或監測肺癌；通過微裝置懸浮液的陰道施用治療和/或監測宮頸癌；以及通過所述懸浮液的直腸施用治療和/或監測直腸癌。治療應用的多數涉及胃腸外施用的一些類型，包括靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)和皮下(s.c.)注射。多級遞送載體為全身或局部施用。上述非胃腸外施用的實例，以及i.m.和s.c.注射，為局部施用的實例。血管內施用為局部或全身。通過使用導管系統，例如CAT-掃描導管，採用局部施用將治療物質送達已知病灶的附近。常規注射，例如推注i.v.注射或連續/滴流補給的i.v.輸液一般為全身的。對於靜脈施用，將多級遞送載體配置為含多個所述載體的懸浮液。優選地，所述載體在它們的尺寸和它們的內容上是統一的。將上述栽體懸浮於任何合適的水相攜載栽體中以形成懸浮液。合適的藥物載體為在所用的劑量和濃度下對接受者無毒的並與配方中其他成分相容的載體。微米製作的粒子的懸浮液的製備公開於，例如，us專利申請公開號20030114366。對於口服施用，將多級遞送載體以由多個載體組成的口服組合物施用。優選地，組合物中的載體在尺寸上是統一的，即每個載體的一級粒子具有相同的或基本相同的尺寸；每個載體的二級粒子具有相同的或基本相同的尺寸。通過將載體與合適的非水相栽體例如油或微粉化的粉末混合，以單位劑量的量填入標準的腸溶膠嚢或，備選地，壓製成片並以腸溶包衣材料包被以製備所述組合物。腸溶包衣確保載體以幹的形式在胃的低(酸性)pH環境中轉運並在小腸或大腸的預先選定的區域釋放。以保護性的聚合物包被所述組合物。通過薄膜包衣工藝將此材料應用於片劑或膠嚢以保護產品不受胃環境的作用或防止藥物在胃環境中釋放。所述包衣為那些在胃中保持完整，但一旦其到達小腸就溶解並釋放劑型的內容物的物質。腸溶包衣的目的是延遲一級粒子的內容物的釋放。使用最廣泛的一種腸溶聚合物是鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)。另外一種有用的聚合物是聚醋酸乙烯苯二甲酸酯(PVAP)，它比CAP更不易滲透水分、更不易水解以及能在更低的pH電離。這些特性允許在十二指腸更多可靠的釋放。目前使用的聚合物的另外一個實例是那些基於帶酸性可電離部分的甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物的物質。這些中的代表是可從RohmPharma購得的商品名為Eudragit的聚合物。通常，以片劑或膠嚢的從約0.5%重量到約10%重量應用腸溶包衣。一些實施方案中，使用水溶性較小的聚合物，例如曱基纖維素，以延遲粒子於十二指腸釋放之後藥物從小室的釋放。採用由ALZA公司(Mt.View,Calif.)開發的ChronSetRTM技術在經過胃進入小腸說放一團多級遞送栽體。在此情況下，將載體的懸浮液裝載入ChronSet膠嚢。吞服以後，膠囊通過胃而保持完整。設計外殼以調控系統的滲透性可滲透部分的水吸收的比率。滲透機制擴張推動並使膠囊的兩半分離。將膠囊一半設計為特定的長度以在預先選定的時間產生分離。在施用後2到20小時每個膠囊的內容物被排出至腸腔內。在15分鐘時間範圍內超過80%的內容物(在此情況下為藥物填充的微米製作的粒子的懸浮液)被排出。此方法提供在小腸或大腸的預先選定的區域釋放載體的懸浮液的手段。使用所述系統在小腸或大腸中最適於結合的位點，例如，含針對嫁接於粒子上的黏膜附著配體的受體的區域，和/或最適於吸收的位點，例如對一級粒子中所含的滲透增強劑敏感的腸上皮的區域釋放多級遞送栽體。此處所述實施方案通過，但絕不限於，以下工作實施例進一步闡明。工作實施例1進行了以下實驗研究選定的二級粒子對納米多孔矽一級微米粒子的裝載入和從其釋放。也研究了納米多孔矽一級粒子的生物降解和生物相容性。材料和方法》、浙將粒子於Z2Coulter⑧粒子計數器和尺寸分析儀(BeckmanCoulter)中計數。用於粒子分析的孔尺寸為50pm。將分析的尺寸下限和上限設定在1.8和1.6pm。為了分析，將粒子懸浮於儀器(ISOTONIIDiluent)的平衡的電解質溶液中並計數。粒子的初始懸浮液的總體積不超過最終分析體積的0.3%。在凝末在f^真/A將IPA中的矽微米粒子在保持於熱臺(80-90°C)上的玻璃燒杯中乾燥。將矽粒子在piranha(1體積11202和2體積H2S04)中氧化。加入11202後將粒子超聲處理然後加入酸。將懸浮液加熱至100-110°C並維持2小時，間斷超聲處理以使粒子分散。然後將懸浮液在DI水中洗滌直至懸浮液的pH為5.5-6。然後將粒子轉移至適當的緩衝液、IPA或保存於水中並冷凍直到進一步使用。4在f^爿pr^y面發謬在矽烷化過程之前，將氧化的粒子在1.5M硝酸中羥化大約1.5小時(室溫)。將粒子在DI水中洗滌3-5次(洗滌包括懸浮於水中和離心，之後去除上清以及所述步驟的重複)。通過在IPA中將它們洗滌兩次將粒子懸浮於IPA(異丙醇)中。然後在室溫下將它們懸浮於含0.5。/。(v/v)的APTES(3-氨丙基三乙氧基矽烷)的IPA中維持45分鐘。然後通過離心將粒子用IPA洗滌4-6次並保存於IPA中並冷凍。備選地，將它們等分成小份，乾燥並在真空和乾燥劑下保存直至進一步使用。遽凝於AP7^5"發謬種在子將PEG連接於微米粒子，為進一步與抗-VEGFR2抗體綴合提供間隔子。使用Fmoc-PEG-NHS，其為快速綴合於胺基提供NHS酯以及Fmoc基團以保護PEG上的胺。將106-109個粒子/ml的APTES修飾的微米粒子重懸於PBS(pH~7.2)中，並以1-10mM的濃度將PEG-NHS加到粒子中。綴合於室溫下進行30min到lh，然後通過在PBS中離心3-5次洗滌未反應的Fmoc-PEG-NHS部分。用哌啶將綴合於矽微米粒子的PEG的遠端上的Fmoc基團脫保護(20%v/v，30min),為進一步與抗體綴合提供PEG上的自由胺。使用來自InvitrogenCorp.的抗體標記試劑盒將VEGFR2的抗體與Alexa488綴合。通過依照該試劑盒的手冊中提供的步驟將螢光標籤綴合於抗體。4吏用1mg/ml的抗體進行標記。通過採用DU730UV/Vis分光光度計(BeckmanCoulterInc.,CA，USA)在280和494nm分析抗體測定綴合於焚光標籤上的抗體的量。測定綴合的抗體的量為407^g/ml。摔戎-綴合f屍五G夢謬#農子將重懸於PBS的矽粒子用異質雙功能的交聯劑ANB-NOS(溶於DMF並加至lOmM的最終濃度)處理30min到1h。反應在黑暗中進行以防止交聯劑上的苯硝基疊氮部分的光解。然後用PBS將粒子洗滌以除去未反應的交聯劑並與螢光標記的抗-VEGFR2混合。每個實驗點使用4.6x106個粒子。使用的不同的抗體的量為0.814、0.407和0.163jig，分別相當於2.7、1.35和0.54ng/ml，暴露於UV光10-15分鐘將抗體上存在的胺基綴合於附著的交聯劑。灣定摔^差-/^(7量f-,《(^-^袁我入多《在凝末在fW凝^遂求在低結合的微量離心管中，將3.0xlS個大孔(LP)和小孔(SP)氧化的矽(以300xl(^個粒子/ml的濃度保存)或APTES修飾的微米粒子(以200xl(^個粒子/ml的濃度保存)和2pM氨基-PEGQ-點或羧基q-點在含10、20、50、100或200mM的TRIS-HC1pH7.3的溶液中進行組合。以每個實驗點20nl的終體積將樣品在轉輪"0rpm)內於25。C孵育15分鐘。孵育後，用Tris20mM,pH7.3將樣品稀釋至150nl並迅速在FACScalibur流式細胞儀上讀取螢光強度。圖3，A區呈現將羧基修飾的量子點和氨基修飾的量子點裝載入APTES修飾的LP和SP矽粒子的時間動態的結果。圖4，A-D區呈現將羧基修飾的量子點和氨基修飾的量子點裝載入LP氧化的矽粒子(A區)、LPAPTES修飾的矽粒子(B區)、SP氧化的矽粒子(C區)、APTES修飾的SP矽粒子(D區)的時間動態的結果。A-D區的每一個也呈現裝載PEG-FITC單壁碳納米管的時間動態，如下所述。W定^f,f袁裁^我差-i^G和凌差&,《在低結合的微量離心管中，將3.0xl5個LP和SP氧化的矽或APTES修飾的微米粒子分別與0.01、0.1、1、10、100、1000和2000nM氨基-PEG或羧基Q-點在200mM的TRIS-HClpH7.3中進行組合。以每個實驗點2(^1的終體積將樣品在轉輪(20rpm)內於25。C孵育15分鐘。孵育後，用Tris20mM，pH7.3將樣品稀釋至150^1並迅速在FACScalibur流式細胞儀上讀取螢光強度。都定摔^差-屍￡(7和凌差^^襲4'入多《磁微末在fW^W在低結合的微量離心管中，以8(HU終體積將1.2x106個LP和SP氧化的矽或APTES修飾的微米粒子與2nM氨基-PEGQ-點或羧基Q-點在200mMTRIS-HC1pH7.3中進行組合。將粒子和Q-點在轉椒20rpm)內於25。C孵育並在15、30、45、和60分鐘從瓶中採樣。孵育後，用Tris20mM，pH7.3將樣品稀釋至150^1並迅速在FACScalibur流式細胞儀上讀取螢光強度。摔減差-Z^C7*凌差0-^袁裁入歲^W^爿P7^S1修謬^^^在凝末在將2.1xl06個氧化的或LPAPTES修飾的矽微米粒子分別與2pM氨基-PEGQ-點或羧基Q-點在TRIS-HC1200mMpH7.3溶液中進行組合。最終孵育體積為140^1。將樣品在轉輪(20rpm)內於25。C孵育15分鐘。然後在1.4mL去離子水(10倍稀釋)中洗滌微米粒子，並在BeckmanCoulterAllegraX-22離心機中以4200RPM離心5分鐘。將粒子團塊重懸於70^1的去離子水中並從瓶中取出lOpl,用TRIS20mM，pH7.3溶液稀釋至150nl終體積。立即用BectonDickinsonFACScalibur流式細胞儀讀取樣品的螢光並記錄為時間0或裝載螢光。^C處必W^^屍r五s發謬^多孔在微採在f犖放^差-屍五G和戎^2-,威將剩餘的60^il稀釋10倍至600pL的TRIS-HCL20mMNaCl0.9%釋放緩衝液中。從此溶液中取出IO(HU並通過將樣品等分到預先裝有400pLTRIS-HCL20mMNaCl0.9%釋放緩衝液的管中再稀釋5倍。在該點最終稀釋為500倍。將樣品置於轉輪(20rpm)中於37。C轉動一定量的時間(15、45、90、180、360和1200分鐘)。在每一個時間點將等分在BeckmanCoulterAllegraX-22離心機中以4200RPM離心5分鐘。將每個團塊重懸於150^1的TRIS20mM中並立即用BectonDickinsonFACScalibur流式細胞儀讀取螢光。圖5A呈現從LP氧化的矽粒子釋放氨基-修飾的量子點的時間動態。圖5B呈現從LPAPTES修飾的矽粒子釋放羧基-修飾的量子點的時間動態。浙定^f摔,f乙二寧,(^iG^(^77TJ綏合村卓^減韻^15"W^7V7V襲我入/《症凝^在fW凝^遂求,在低結合的微量離心管中，將3.0xlS個大孔氧化的矽或APTES修飾的微米粒子與20ng/nlPEG-FITC-SWNT在含不同摩爾濃度(20、100、200mM)的TRIS-HC1pH7.3的溶液中進行組合。每個實驗點的終體積為20jil。將樣品在轉輪(20rpm)內於25。C孵育15分鐘。孵育後，將樣品重懸於150nlTris20mM中並迅速在FACScalibur流式細胞儀上讀取螢光強度。浙;C摔i^G-F/7T-Sffwr袁我入,X在凝,在fW^A7在低結合的微量離心管中，以80pl終體積將1.2乂106個大孔氧化的矽或APTES修飾的微米粒子與20ng/filPEG-FITC-SWNT在20mMTRIS-HClpH7.3中進行組合。將粒子和SWNT在轉輪(20rpm)內於25。C孵育並在15、30、45和60分鐘從瓶中採樣。孵育後，用Tris20mM，pH7.3將樣品稀釋至150jil並迅速在FACScalibur流式細胞儀上讀取螢光強度。f,《在微,在於袁4'^/^G-F/7T-s『ATW《產在低結合的微量離心管中，以每個實驗點20nl終體積將3.0x10s個LP或SP氧化的矽或APTES修飾的微米粒子與1、10、20和SOng/^UPEG-FITC-SWNT在20mMTRIS誦HC1pH7.3中進行組合。孵育後，用Tris20mM,pH7.3將樣品稀釋至150^1並迅速在FACScalibur流式細胞儀上讀取螢光強度。^^j^^^^/^PEG-F/rC^^AT^處^強^和浮^炎^"使用SPECTRAmaxA螢光計測定PEG-FITCSWNT在20mMTRIS-HCLpH7.3中的濃度曲線。進行連續稀釋，以35ng/pl起始以1:2的係數向下進行到最小可檢測到的量107pg/pl。將等分試樣置於96孔板中並使用在485激發和在520發射讀取螢光。如通過它們的較弱的螢光所顯示，在SWNT的較高濃度觀察到螢光淬滅。摔屍五G-F/7T-S『AT袁我入真必W#^屍7^S滲謬W^/乙在凝術在子將1.8xl6個"大孔"(LP，大約30nm)矽微米粒子與20ng/nlPEG-FITC-SWNT在20mMTRIS-HC1pH7.3溶液中進行組合。最終孵育體積為120pl。將樣品在轉輪(20rpm)內於25。C孵育15分鐘。然後在1.2mL去離子水(10倍稀釋)中洗滌微米粒子，並在BeckmanCoulterAllegraX-22離心機中以4200RPM離心5分鐘。孵育後，將上清取出並置於96孔板中用SPECTRAmax板讀數器讀取螢光。將粒子團塊重懸於6(HU的去離子水中並從瓶中取出l(HU，用TRIS20mM，pH7.3溶液稀釋至150^1終體積。立即用BectonDickinsonFACScalibur流式細胞儀讀取樣品的螢光並記錄為時間0或裝栽螢光。^C處^^和/4戶7^S夢伴W多#乙^微術在#"放屍EC-FJTC-SffWr將剩餘的50^1稀釋10倍至500nL的TRIS-HCL20mMNaCl0.9%釋放緩衝液中。從此溶液中取出100nl並通過將樣品等分到預先裝有400nLTRIS-HCL20mMNaCl0.9%釋放緩沖液的管中再稀釋5倍。在該點最終稀釋為500倍。將樣品置於轉輪(20rpm)中於37。C轉動一定量的時間(15、45、120、240和1200分鐘)。在每一個時間點將等分試樣在BeckmanCoulterAllegraX-22離心機中以4200RPM離心5分鐘。將上清取出並置於96孔板中用SPECTRAmax板讀數器讀取螢光。然後將每個團塊重懸於150^1的TRIS20mM中並立即用BectonDickinsonFACScalibur流式細胞4義讀取螢光。圖5A呈現從LP氧化的矽粒子釋放PEG-FITC-SWNT的時間動態。圖5B呈現從APTES修飾的LP珪粒子釋放PEG-FITC-SWNT的時間動態。摔韻^廟V^傳襲我入真^^^^屍7^S滲謬^^/乙在凝末在f將1.5x106個LP和SP氧化的矽微米粒子與lOng/pl含Alexafluo555綴合的siRNA的脂質體在20mMTRIS-HC1pH7.3溶液中進行組合。將粒子和納米脂質體在轉輪(20rpm)內於25。C孵育並於15、30和60分鐘後從瓶中釆樣。孵育後，用Tris20mM，pH7.3將樣品稀釋至150^1並迅速在FACScalibur流式細胞儀上讀取螢光強度。48將5xl06個LP和SP氧化的矽微米粒子在含2.5mMTRIS和0.9%NaClpH7.3(鹽水)的溶液或補充了10%FBS(CCM)的細胞培養基中混合。將混合物在轉輪(8rpm)內於37。C孵育並在時間0和6、18和24小時之後取SEM、Z2和ICP的樣。如此設計該實驗是為了有足夠的材料以在同時平行地進行降解研究的三種分析，從而避免由未受控或忽視的變化引起的差異。因此該方法應用於獲得的SEM、Z2和ICP樣品。進行了另外的降解實驗，為HUVEC細胞的毒性實驗提供材料。對於每一個實驗點，我們將3xl(^個LP氧化的或APTES修飾的、或SP氧化的或Aptes修飾的矽粒子置於COM中在轉輪(8rpm)內於37。C賻育24。TT屍為了解多孔矽粒子是否從溶液中消失，將它們孵育於，將多孔矽粒子溶解於矽酸中並通過名為電感耦合等離子體發射光譜(ICP-AES)的技術進行研究。該方法學允許對存在於溶液中的任何給定元素的絕對數量進行定量。在同一時間點收回樣品，Z2和SEM分析並將它們離心以使還未降解的粒子沉降下來。用ICP對通過0.450nm過濾單元過濾的上清進行分析。將50萬個新鮮分離的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)(CloneticsTMCambrexBioScienceWalkersville，Inc)4甫植於稱為完全培養基的^卜充了10。/。胎牛血清(FCS，Gibco)、含100IU/ml青黴素(Sigma)、100g/ml鏈黴素(Sigma)、7.5IU/ml肝素(Sigma)、2ng/ml表皮生長因子(EGF)(R&Dsystem)和250pg/ml內皮細胞生長因子(-ECGFXBioSource，USA)的M199培養基(Gibco/LifeTechnologiesInc.)中。用胰蛋白酶(Sigma)將匯合細胞分開用於傳代培養。將細胞擴大培養直至第6代並用於生物相容性研究。用帶有40X放大鏡頭的OlympusCKX41顯微鏡在明場對比分析細胞。用SP-350OlympusTrue-PicTURBO圖像處理器相機採集圖像。丄冊顛為、#為了毒性分析的校準，將不同數量的細胞(125、250、500、1000、2000)接種於三個96孔板中。12、24和48小時後，將細胞培養基用含1%Triton的新鮮培養基置換。將細胞在室溫(RT)孵育10分鐘然後以1200rpm旋轉3分鐘使細胞沉降，將細胞培養基轉移到放置於冰上的複製板中。將10(Hil含重組催化劑和染料(BiovisionLDH細胞毒性分析試劑盒)的溶液加到每個孔中，將板轉移到軌道震蕩器上，以箔片覆蓋並在RT震蕩20分鐘。然後將板轉移到SPECTRAmax螢光計中並讀取490nm處的吸光度。所有實驗都進行三次重複，結果以平均值和標準偏差表示。就該實驗，將1000個細胞接種，在細胞附著於表面後(約6小時)，向培養基中加入重懸於20nl滅菌的去離子H20中的不同量的LP氧化的、SP氧化的、LPAPTES和SPAPTES矽粒子(1000、5000和10000，相當於l:l、1:5、1:10的細胞粒子比)。作為陽性對照，向細胞中加入20nl滅菌的去離子H20而作為陰性對照我們向細胞培養基中加入50jng/ml的順鉑。將板於37。C孵育，在12、24、48和72小時的時間點，除不加Triton以外，如校準分析中所述進行毒性分析。所有實驗都進行三次重複，結果以平均值和標準偏差表示。M7T為、浙為了MTT分析的校準，將不同數量的細胞(125、250、500、1000、2000)接種於三個96孔板中。12、24和48小時後，將細胞培養基用含的MTT染料的新鮮培養基置換。將細胞在37。C孵育4小時然後除去培養基和MTT，向每個孔中加入200^1的DMSO和25^1的0.1M甘氨酸、0.1MNaCl，pH10.5溶液，將板在RT孵育10分鐘。然後將板轉移到SPECTRAmax螢光計中並讀取570nm處的吸光度。5所有實驗都進行三次重複，結果以平均值和標準偏差表示。就該實驗，將1000個細胞接種，在細胞連接於表面並生成50%匯合的細胞床後(約6小時)，向培養基中加入重懸於2(^1滅菌的去離子H20中的不同量的LP氧化的、SP氧化的、LPAPTES和SPAPTES矽粒子(1000、5000和10000，相當於1:1、1:5、1:10的細胞粒子比)。作為陽性對照，向細胞中加入20nl滅菌的去離子H20而作為陰性對照我們向細胞培養基中加入50ng/ml的順鉑。將板於37。C孵育，在12、24、48和72小時的時間點，從孔中移出培養基並用滅菌的PBS將細胞廣泛洗滌以除去矽粒子。然後如校準分析中所述進行增殖分析。所有實驗都進行三次重複，結果以平均值和標準偏差表示。^必《定襲^將0.6x106個細胞接種於25cm2的燒瓶中，當細胞連接(約6小時後，當細胞生成60。/。匯合的細胞床)，向每個燒瓶的培養基中加入重懸於20nl滅菌的去離子H20中的3義106個LP氧化的、SP氧化的、LPAPTES或SPAPTES矽粒子(1:5比)。作為陽性對照，向細胞中加入滅菌的去離子H20，而作為陰性對照我們向細胞培養基中加入50fig/ml的順鉑。作為額外的對照，將同樣數量的HUVEC細胞接種於75cm"的燒瓶中以允許它們自由生長，在此實驗期間不達到匯合。12、24、48和72小時後，用5ml的滅菌的PBS將細胞洗滌3次，然後用胰蛋白酶處理、收集並離心。在進行額外的PBS洗滌步驟後，將每個細胞團塊重懸於250nl的PBS中，在輕輕旋轉中向細胞懸浮液中加入750fil的冰冷的甲醇。繼續進行固定20分鐘然後將細胞離心使其沉降下來，用PBS洗滌兩次。然後向細胞團塊加入含(溶於10mMTris的50ng/ml碟化丙咬、5mMMgCl2，pH7.3和75pg/mlRNAse)的溶液，將懸浮液在轉輪(5rpm)上於黑暗中孵育60分鐘。然後將樣品轉移到FACs管中並立即用BectonDickinson流式細胞儀讀數。諒式勿應農設_￡使用FACSCalibur(BectonDickinson)評價粒子的焚光。使用二元點-圖定義的logSSC對logFSC來評估所用矽粒子(直徑3微米，高度1.5微米)的尺寸和形狀並將非-特異的事件從分析中排除。將對照彩虹BDCalibriteTM珠(尺寸為3.5孩￡米)作為標準進行分析。圍繞群體的中心定義一個多邊形區域(Rl)，排除離儀器的噪聲信號太近的事件。對於每個樣品，在Rl區域檢測到的粒子的數量超過80%。對於平均螢光強度(MFI)測定，通過控制落入定義的區域(Rl)的事件產生logFLl和FL2對logFSC點-圖。在相應的螢光柱狀圖中分析由每個樣品生成的峰並記錄幾何學的平均值。對於粒子檢測，使用的檢測儀為電壓設置在474V的前向散射(FSC)E-l和側向散射(SSC)。螢光檢測儀FL1設置在800V。使用FLl，530/30nm帶通濾波器檢測緣色螢光(FITC和Q-點525)。使用FL2檢測橙色和紅色螢光(Q-點D565和碘化丙啶)。當只分析單色檢測時將補償設置在零。使用彩虹BDCalibriteTM珠在每一系列的獲取之前、之間和之後進行儀器校準。對於細胞檢測，使用的檢測儀為有4.59的放大增益的線性前向散射(FSC)E00和有1.07的放大增益的電壓設置在474V的線性側向散射(SSC)。將焚光檢測儀FL2設置在449V,其具有1.32的放大增益。基於散射特性，細胞和粒子碎片被電子地排除於分析之外。在所有實驗中，至少分析了20,000個粒子或細胞。所有實驗都進行三次重複。結果以完整粒子或僅活細胞的平均螢光強度給出。用CellQuestsoftware(BDBiosciences)進行數據分析。炎^j凝裙趁查使用帶有保持在-30.1。C的DQC-FSNikonCCD相機的NikonEclipseTE2000-E進行粒子的螢光成像。在緊接分析之前所將有樣品固定，用63X油浸物鏡獲取圖像。所有實驗過程中顯微鏡設置保持不，曝光時間設置在500ms，讀取速度設置在10MHz以及將轉換增益設置在1/6x。用NISElementsAR2.3軟體分析和測量圖像。結果用於將APTES修飾的粒子與抗-VEGFR2綴合的粒子的總數為7.03X106。如下面的表3所列，為此綴合使用了兩個不同量的抗-VEGFR2。表3.tableseeoriginaldocumentpage53在一個不同的實驗中，綴合後，將粒子在含0.5%TritonX-100的磷酸緩沖液中洗滌和離心6次，之後在普通的磷酸緩衝液中洗滌4次，然後在平板讀數器上讀數。如下面的表4所列，為此綴合使用了兩個不同量的抗-VEGFR2。表4.基於抗-VEGFR2的焚光分析由平板讀數器檢測的綴合於粒子的抗-VEGFR2的量tableseeoriginaldocumentpage53如圖4所示，在綴合期間在所有情況下都存在粒子的數量的顯著降低。這可能是由於在涉及將未結合的抗體從溶液中去除的許多洗滌步驟期間遭受的損失。表5.裝載實驗中使用的微米粒子和納米粒子的Zeta電位粒子納米孔的Zeta電位在pH~7.3*尺寸(隨)(mV)緩衝液條件LP氧化的矽20-40-10.120mMTris1.31200mMTrisLPAPTES修飾的珪20-406.5220mMTris5.19200mMTrisLPMPTMS修飾的矽20-40-16.920mMTris-6.17200mMTrisSP氧化的珪5-7-11.1520mMTris-13200mMTrisSPAPTES修飾的珪5-76.4220mMTris-7.42200mMTrisSPMPTMS修飾的矽5-7-18.320mMTris-8.21200mMTris氨基q點NA-1.2120mMTris1.3200mMTris羧基q點NA-32.820mMTris-10.1200mMTrisSWNTNA-9.2120mMTris襄裁和斧放因它們的獨特的和優秀的特性，量子點(Q點)和單壁碳納米管(SWNT)用作二級納米載體。Q-點是發光半導體納米晶體(CdSe或CdTe)，由於它們的高亮度、光穩定性和多元顏色編碼的能力，在體外和體內分子的和細胞的成像進行了很多研究。以親水的聚乙二醇(PEG)包被Q-點以增加生物相容性。20mMTrs緩衝液中氨基-PEGQ點的zeta電位是-lmV，羧基PEGQ-點的為-32.8mV。使用散射光動態光散射技術通過膠體在溶液中的擴散係數測量流體力學尺寸。氨基和羧基Q-點顯示相似的流體力學尺寸(分別為13和17nm)。SWNT是井然有序的中空"巻起"結構，具有高長寬比、高表面積、高機械強度、超輕重量、優秀的化學/熱穩定性。研究了很多以肽、蛋白質和藥物功能化SWNT表面的方法。本研究中，SWNT為直徑2-4nm長度介於30和100nm之間，以PEG-胺功能化表面，提供在水中和生理鹽水中的溶解性並進一步連接到FITC用於螢光成像。Zeta電位測量表明在20nMTRIS緩衝液中為-9.2mV。首次研究了THs濃度對量子點裝栽入大孔粒子的影響。選擇Tris作為緩衝劑，因為與其它緩衝劑相比其給予量子點(Q-點)最高的穩定性。以Tris濃度的功能研究Q-點裝栽的粒子的平均螢光。當Tris濃度增加時粒子上的螢光信號增加。就裝載而言200mM濃度的Tris產生了最好效果，因此選擇其用於所有後面的實驗。使用"小孔"矽粒子作為對照評估"大孔，，矽粒子的裝栽能力。Q-點的流體力學尺寸是13-15nm，不能進入小孔(〈5nm)而是留在它們的表面上。通過將Q-點的量從10皮摩變為2毫摩並將所有反應孵育於相同的終體積(20|il)進行Q-點對裝載的濃度作用。在FACS上分析樣品的裝載，2nM濃度的量子點導致最高水平的裝載，因此用於所有後面的實驗。通過不同的孵育時間(15分鐘、30分鐘和60分鐘)研究了粒子裝載Q-點的時間/動態。Q-點對粒子的裝栽是一個非常快的過程，在15分鐘內達到其最大值。之後，如圖21,a-d區所示，螢光信號隨時間慢慢下降。證明粒子的表面特性也在裝載動力學中有重要作用。如圖21，a-d區所示，羧基PEGQ-點表現出對氧化的粒子很少的裝載。這歸結於靜電力因為兩種粒子都帶負電。當以氨基(APTES)修飾矽粒子的表面時，如圖5所示zeta電位變為正(+5+6mV)。羧基Q-點對APTES處理的粒子的裝載顯著增加。氨基PEGQ-點的電荷幾乎為中性(zeta電位-l+lmV)，矽粒子的APTES處理對裝栽僅有輕微影響(zeta電位從-llmV變為+6mV)。氨基量子點從LP氧化的粒子的釋放的動力學是指數式的，20分鐘後裝載的粒子的量降低33%，45分鐘後降低67.5%。20小時後發現僅有剩餘的初始螢光的1%與粒子關聯，說明從納米多孔矽粒子釋放所有量子點。測量含35fig/ml的FITC綴合的單壁碳納米管(FITC-SWNT)的溶液以及它們的一系列milliq超純水稀釋液(範圍從1:2到1:2048)的螢光(圖6A，A區)。前3個和濃度更高的樣品(分別為35、17.5和8.725pg/ml)的螢光值低於濃度較低的溶液的值。這是稱為焚光淬滅的現象。作為對照對一系列範圍從8^M到4nM的羧基聚乙二醇化的量子點的溶液進行同樣的讀取，其顯示螢光值隨著稀釋線性降低。評估APTES修飾的LP粒子裝栽FITC-SWNT的螢光淬滅動態。如上所述進行此實驗。曲線的外形提示較高量的FITC-SWNT的裝栽引起螢光淬滅因而導致矽粒子的螢光減少。選擇20ng/ml的濃度用於所有後面的實驗(圖6A，B區和圖20，B區)。也研究了Tris濃度對大孔粒子裝載PEG-FITC-SWNT和q-點的影響，見圖6B,C-F區。E區和F區以Tris濃度的函數顯示LPAPTES修飾的和LP氧化的矽粒子中PEG-FITC-SWNT裝栽的粒子的平均螢光。粒子上的焚光信號隨著Tris濃度增加而減少。就裝栽而言20mM濃度的Tris產生了最好效果，因此選擇其用於所有後面的實驗。建韻術資袁4'評估以FITC-SWNT裝載氧化的和APTES修飾的LP和SP粒子的動態。使用20ng/ml的螢光納米粒子如上所述進行此實驗(見圖4，A-D區)。在此實驗設置下，LPAPTES粒子的裝載時間動態快，其在後面的時間點顯示相似的減少(圖4，B區、和圖21)。觀察到LP氧化的粒子裝載的不同的動力學，其在整個實驗期間增加並在60分鐘時間點達到其最大值(圖4，A區、和圖21)。在小孔粒子(SP)的裝載期間發生相同的裝載模式。APTES修飾的粒子裝載的非常快然後隨著時間丟失一些它們的關聯的螢光(圖4，D區、和圖21)，然而如發生在LP粒子上的一樣，氧化的SP裝載隨著時間增加，提示APTES修飾在裝載過程中起關鍵作用(圖4,C區、和圖21)。PEG-FITC-SWNT從LP氧化的粒子的釋放的動力學在第一時間點是指數式的。在後面的時間點釋放變慢下來。20小時後發現僅有剩餘的初始焚光的20%與粒子關聯，提示有效載荷的一些保留於納米多孔矽粒子中(圖7B和圖21)。納米脂質體也以與上述相同的動態裝載入LP粒子。通過螢光顯微鏡檢查的方法觀察與矽粒子關聯的螢光(圖8A，A和B區、圖8B，E和F區)。7>知多孔珪(Psi)為可完全生物降解(Mayne2000;Low,Williamsetal.2006)和生物相容(Canham1995)。根據已述的針對珪片的方法(Canham1997)進行的氧化過程，在暴露的矽表面引入羥基(OH)，這些基團在水的存在下易於水解從而將固體矽轉化為高度可溶的矽酸。S皿通過掃描電鏡(SEM)進行粒子的尺寸、形狀和總體外觀的修飾的研究(圖9和10)。圖像顯示粒子隨著時間降解，從具有高度多孔性的區域開始，然後降解擴散至多孔性較低且孔的尺寸較小的粒子邊緣。意外地注意到粒子的總體形狀幾乎保持完好直到降解過程的結束。儘管本發明不受限於它們的操作的理論，通過以下事實解釋該意外發現氧化的矽表面的侵蝕逐漸消耗介於孔之間的壁因而在粒子的中心形成缺陷和洞。相同的過程需要更長時間來溶解孔的數量較少且孔之間的壁較厚的粒子的側面。通過幾種技術進行納米多孔矽粒子降解的鑑定。以Z2Coulter⑧粒子計數器和尺寸分析儀(BeckmanCoulter)進行粒子的數量和它們的體積的減少的測量。將粒子置於兩種不同的溶液中TRIS2.5mM，0.9%NaClpH7.3(鹽水)和具有10%FBS(CCM)的細胞培養基，在轉輪(8rpm)中於37。C保持24小時。為了解孔的尺寸是否在降解動力學中起作用，使用具有7-10(SP)納米的小孔的矽粒子和具有20-30納米(LP)的大孔的珪粒子。在LP或SP的情況下，孵育於鹽水中的粒子，沒有在它們的中值尺寸分布顯示任何顯著的減少。與此相反，它們的數量隨著時間逐漸下降(圖11，A區)。這些結果結合在一起意味著對於LP和SP粒子在24hrs，50%或更高的矽粒子量的總體損失，如圖11，C區中所示。在以孵育於CCM中的粒子進行的實驗中，它們的中值尺寸和數量都減少(圖11,B區)。這些結果結合在一起顯示對於LP粒子60%的粒子量的損失以及對於SP粒子超過90。/。的損失。/CP在ICP上的讀數顯示降解後存在的矽的量的線性增加。這些數據證實ICP-AES方法用於驗證降解的能力。所述數據規整，標準偏差低，並且與測試期間的粒子計數和尺寸的Z2讀數具有強相關性。增加的降解發生在細胞培養基中而不是TRIS緩衝液中，提示在細胞培養條件中這些粒子的高的生物可降解性(圖12A，A-B區和圖12B，C-D區)。蘭浙初容嫂通過乳糖脫氫酶(LDH)毒性分析(BiovisionInc.)的方法檢測珪納米多孔粒子誘導的細胞毒性，通過MTT分析(Promega)的方法檢測細胞增殖以及通過碘化丙啶染色檢測調亡和細胞周期。勞凝^凝裙趁:^在多孔矽粒子的存在下生長的細胞未隨時間表現出任何顯著的或異常類型的形態變化(圖13，A-D區)。細胞在12小時後為50%匯合，24小時後它們幾乎達到100%匯合。在48小時可見一些調亡，或一般地說，細胞死亡的跡象，在72小時可見更多(亮的、圓的、反光的細胞或具有大的、多葉的核或細胞體高度收縮的細胞)，如圖13,A-D區中白色箭頭所示。這主要是由於細胞已經達到匯合不能找到任LDH是一種細胞裂解時釋放到細胞質中的胞質酶。因此，所述LDH分析是膜完整性的測量。LDH分析的基礎是由LDH將乳糖氧化成丙酮酸，丙酮酸與四唑鹽反應形成甲雁，以及水溶性甲雁的分光光度法檢測。(Decker,T.&LohmannMa"hes，M丄.(1988)J.ImmunolMethods15:61-69;Korzeniewski，C.&Callewaert,D.M.(1983)J.ImmunolMethods64:313-320)。作出一條毒性校準曲線(圖14A,A區)將在螢光計上讀取的吸光度值與通過1。/。Triton孵育裂解的細胞的數量關聯。從所述校準曲線得到粒子孵育期間釋放LDH酶的細胞的數量。在12和24小時，毒性信號非常低，主要歸結於未從胰蛋白酶處理和接種恢復過來的未結合細胞(背景毒性)。通過比較來自實驗板的毒性值和在對照板中測量的值對此進行證實(圖14A，B區)。在無任何粒子的96孔板中生長的HUVEC細胞的毒性(陽性對照)在72小時顯示470nm處0.496的平均吸光度。那幾乎是與來自以1:1比孵育的細胞的值相同的值(0.507)。在更高的細胞粒子比(1:5和1:10)，毒性的平均值分別為0.55和0.57(圖14A,B區和圖14B，C-F區)。在所有實驗條件中觀察到相同的毒性模式，從而說明多孔性和表面化學既不增加也不減少細胞毒性。這些結果在一起未提示任何由於將細胞暴露於粒子而產生的大規模毒性。Af7T增勤、浙MTT是一種黃色的水溶性四唑染料，由活細胞還原為不溶於水的紫色曱腯。通過將曱膽溶解於DMSO並以分光光度計對其測量來測定曱邇的量。在處理的和未處理的細胞的光譜之間比較會給出毒性的相對估算。(Alleyetal.(1988)CancerRes.48:589-601)。毒性校準曲線(圖15,A區)將在螢光計上讀取的吸光度值與生長細胞的數量關聯。從此校準曲線得到活性代謝的細胞的量。在12、24和48小時，與粒子一起孵育的細胞的增殖與對照板的完全相同(圖15,B區)。在72小時未與任何粒子一起培養的HUVEC細胞(陽性對照)在570nm處的平均吸光度是1,635，而來自以l:1比孵育的細胞的這一數值為1.623。在更高的細胞粒子比(1:5和1:10)，HUVEC分別給出相當於1.46和1.41的吸光度值(圖15，B-F區)。這些較低的值與當在大量粒子的存在下培養細胞時細胞增殖的輕度減少相關。這與在72小時以LDH分析測量的毒性的少許增加一致(圖14A，B區和圖14B,C-F區)。在所有實驗條件中觀察到相同的增殖模式，因此說明多孔性和表面化學既不增加也不減少細胞生長。這些結果在一起未提示任何由於將細胞暴露於粒子而產生的細胞活力的顯著變化。勿應y^^^;^源亡對l:5比的粒子(氧化的或APTES修飾的LP和SP)暴露12、24、48和72小時的HUVEC細胞在固定和碘化丙夂染色之後於FACS上進行分析。首先分析點圖和等值線圖中的前向散射(FSC)和側向散射(SSC)(圖16，A-C區)。FSC參數提供細胞的尺寸的信息而SSC提供細胞的形狀的信息。位於每個區的底部的3D圖在Z-軸上顯示計數或事件並且提供在FACS上分析的細胞的總體分布的信息。以紅色箭頭表示壞死的/調亡的細胞的峰，其特徵為較小且均一性較低的形狀。圖16,A-C區中報告的數據涉及與鹽水(對照)和與LP和SP氧化的矽粒子一起孵育的HUVEC細胞。細胞分布隨著時間顯著改變，在48和72小時主要積聚於低SSC、低FSC區域。在3組之間未發現細胞的分布的顯著差異，從LP和SPAPTES修飾的粒子處理的細胞獲得相同的結果。儘管本發明不受它們的操作的理論束繂，在後面的時間點的細胞死亡的誘導可歸結於過分匯合。這可以預料到，因為為了將該實驗儘可能地與生理溶液保持接近(後者中粒子接觸毛細血管的內皮壁)，接種的細胞在第0天是60%匯合。也定量地測量了處理的HUVEC細胞在細胞周期的不同階段的分布(圖17A-17D)。通過將來自對照細胞的數據(圖16A,A區，HUVEC+鹽水)與來自LP和SP處理的細胞的數據進行比較，證實了暴露於納米多孔矽粒子是無毒的並且不誘導任何細胞死亡的量的顯著增加,為了證明不僅完整的粒子，而且它們的降解產物也不誘導任何毒性，將HUVEC細胞與含所有粒子類型的降解產物的CCM—起孵育，並證實了到目前為止所描述的結果(圖17D)。當把細胞與SP氧化的以及SP和LPAPTES修飾的粒子的降解產物一起孵育72小時，在調亡區域檢測到細胞的量的少許增加。可能是在降解過程期間產生的較小的矽碎片誘導了某種毒性45—48。工作實施例2開發了一種基於含特定尺寸的納米孔的生物可降解的矽粒子作為以精確的控制向細胞中裝載、攜帶、釋放和遞送多種類型的納米粒子的一級載體的多級遞送系統。向所述一級矽納米多孔粒子同時裝栽隨時間以持續不變的方式釋放的不同類型的二級納米粒子。闡述了控制二級納米粒子的裝載和釋放的主要的物理、化學和靜電機制。最後，顯示多孔矽載體能夠局部地向細胞質中遞送二級納米粒子。合起來考慮，這些研究提供可將矽納米多孔粒子用作向細胞中同時遞送不同類型的納米載體的栽貨的證據。該系統提供前所未有的方法實現多種治療和成像劑的胞內遞送。介紹自其在過去十年的發展，納米技術已在針對疾病檢測、診斷和治療的生物醫學研究中的廣泛多樣的應用中得以採用"。許多涉及納米粒子的開發和優化的研究的目標聚焦於它們作為向器官、組織和細胞遞送治療或成像分子的試劑的使用4，5。已評估了許多治療用途的不同的納米載體，包括多種尺寸和組合的脂質體6，7、量子點(Q-點)8，9、氧化鐵1、單壁碳納米管(SWNT)u、金納米殼12，13、以及幾種其他類型的納米粒子"。該發展迄今已經促成了定義為"分子靶向的療法"的領域15-18，然而最初的目標的完成，即釆用基於納米載體的遞送系統選擇性遞送治療劑，還未得到充分實現19，2°。將納米栽體整合於納米多孔矽粒子中允許納米載體規避通常阻礙它們的治療效果的天然的生物屏障。所述方法為治療劑提供不受周圍的液體和分子通常過早地將它們降解和不被網狀內皮系統(RES)攝取的保護。這導致活性試劑的更高的穩定性，同時向靶向的組織提供治療劑的增加的遞送和濃縮的劑量。實現了將多樣的二級納米粒子同時裝載入一級矽納米多孔粒子。在足夠一級粒子到達特定的生物耙位點的整個時間周期援慢釋放二級粒子(Q-點和SWNT)。掌控裝載和釋放過程的主要的物理、化學和靜電機制。所述納米遞送系統能夠將其有效負栽局部地釋放到細胞中。結果通過Z2Coulter⑧粒子計數器和尺寸分析儀鑑定矽微米粒子以測量它們的體積、尺寸和濃度，通過掃描電鏡(SEM)詳細地評估它們的形態。圖19，a和b區分別顯示"大孔"(LP)和"小孔"(LP)珪粒子的背面和正面以及截面的代表性的SEM圖像。這些粒子為高度多孔，形狀上為半球形。LP粒子的直徑約為3.5pm，帶有直廓的具有範圍從20到30nm的孔尺寸的孔，垂直穿過粒子到達它們的外表面(圖19，a區)。SP矽粒子具有3.2nm的平均直徑，由於為使它們的孔尺寸小於10nm而使用的陽極氧化和電解拋光過程的結果具有比LP矽粒子更扁平的形狀(圖19，b區)。LP和SP矽粒子都具有0.5-0.6^1111的厚度。根據BET分析，LP粒子的表面積為156m2g-l，SP粒子的表面積為294m2g"。LP粒子的孔體積為0.542cm3g1，SP粒子的孔體積為0.383cm3g-l。通過改變批次之間可重複的電流、蝕刻時間和摻雜，精細地調節孔密度、尺寸、形狀和輪廓。未氧化的矽是疏水材料，但是有多種穩定基於矽的材料並用寡核苷酸27、生物分子28、抗體293和聚乙二醇(PEG)鏈使其功能化的表面處理方法31。由於粒子的表面上羥基的存在，氧化的矽粒子具有負的zeta電位值(LP為調IO.I、SP為-11-25)32。由於在它們的表面引入氨基的結果，以APTES修飾的粒子具有正的zeta電位值(LP為6.52、SP為6.45)。使用動態光散射技術通過膠體在溶液中的擴散係數測量Q-點的流體力學尺寸。氨基-PEGQ-點的直徑是13nm，羧基Q-點的直徑是16nm。通過AFM顯微鏡檢查評估PEG-FITC-SWNT的尺寸。未PEG化的SWNT的直徑為lnm左右，但由於納米管周圍的PEG，用於本研究的PEG-FITC-SWNT具有4nm的平均直徑和30nm的平均長度。使用PEG-胺通過經由SWNT剪切過程獲得的羧酸將SWNT功能化並綴合於FITC使它們能夠螢光成像。選擇具螢光特性的二級納米粒子使用已建立的技術，例如流式細胞術、螢光測定法、以及焚光和共聚焦顯微鏡檢查量化矽納米多孔粒子的裝栽入和從其釋放。一級和二級粒子的物理和化學總結於表6中。表6.一級粒子化學修飾孔尺寸，nmZeta電位，mV"大孔，，(LP)氣化的20-40-10.1LPAPTES20-406.52"小孑L"(SP)氧化的5-7-11.15SPAPTES5-76.42二級粒子尺寸，nmQ-點氨基PEG13-1,21Q-點羧基PEG16-32.8SWNTPEG-FITC直徑4-9.21長度30開發了有效地將納米粒子裝栽入一級矽粒子的孔中的方法。影響裝栽過程的一個因素是培養基中粒子周圍的二級粒子的量。分析了以漸增量的Q-點(圖20,A區)和PEG-FITC-SWNT(圖20，B區)裝載的矽粒子的螢光強度並證明粒子裝載與二級粒子濃度直接相關。通過逐漸地提高二級粒子的濃度，實現了如通過流式細胞術(圖20,A和B區)和通過以焚光顯微鏡檢查直接觀察(圖20，C和D區)評63價的逐漸更高水平的裝載。這些研究也證明一級矽粒子和二級粒子兩者的表面化學特性影響裝載效率和裝配的多級納米粒子栽體系統的穩定性。通過圖21，a區和c區中所示的結果證實了所述觀察，圖中將具有負的表面電荷(zeta電位-32.8mV)的羧基Q-點、以及帶負的表面電荷(zeta電位-9.21mV)的PEG-FITC-SWNT裝栽入LPAPTES修飾的矽粒子比裝栽入具有負的表面電荷的LP氧化的矽粒子的效率高。鑑於許多各種不同的方法可用於修飾多孔矽27，29—35,通過開發一級和二級表面化學有效地裝載任何種類的二級粒子是可能的。二級納米粒子的裝載是一個非常快的過程。圖21，a和c區顯示當把LP氧化的矽粒子和LPAPTES修飾的矽粒子與固定量的氨基和羧基Q-點和PEG-FITC-SWNT兩者一起孵育時獲得的結杲。如果多孔矽粒子和二級粒子的組合符合上述靜電標準，一級多孔矽粒子的完全裝載在15分鐘內發生。也評估了二級納米粒子對SP氧化的矽粒子和SPAPTES修飾的矽粒子的裝栽(圖21,分別為c和d區)。Q-點尺寸介於13和16nm所以它們不能裝栽入SP矽粒子的孔(5-7nm)中。與此相反，LP矽粒子的孔(20-40nm)大的足以允許Q-點裝載入。因此，SP粒子平均螢光僅為LP粒子的6%。相反地，PEG-FITC-SWNT的較小的尺寸與SP粒子孔相容，導致裝栽增加(25%的PEG-FITC-SWNT裝載入LP矽粒子)。一焱在在於#放二^韻末在f為了將多級遞送系統作為藥物遞送的工具進行評估，研究了二級粒子從納米多孔一級粒子釋放的動力學。為了模擬生理條件，所有實驗都在緩衝鹽水中於37。C下進行，並且在每個時間點更換釋放溶液。圖21,e-h區展示兩種類型的二級粒子都隨著時間從一級矽粒子釋放。意外地，釋放過程一直持續，20小時後達到完全釋放。另外，Q-點和PEG-FITC-SWNT的釋放動力學顯著不同，Q-點釋放顯著快於SWNT。以SP氧化的珪粒子(圖21，f區)和SPAPTES修飾的矽粒子(圖21，h區)進行的對照實驗證實了Q-點未裝載入孔中。Q-點從SP矽粒子表面的解離是大規模的和快速的(15分鐘內>80%)，暗示它們與矽粒子表面鬆散地相互作用。相比之下，PEG-FITC-SWNT二級納米載體從LP和SP矽粒子的釋放的動力學是相當的，證實PEG-FITC-SWNT裝載入了一級SP粒子的孔中。使用共聚焦顯微鏡檢查進一步鑑定二級納米粒子對矽載體的孔的裝載。圖22，a-b區顯示裝載了羧基Q-點的LPAPTES矽粒子的一系列3維投影和旋轉。在較大的孔所在的矽粒子的背面的中心區域檢測到更強的螢光信號，見圖19，a區。來自周圍區域的強度較小的信號是由於對較小的孔的部分裝栽或通過Q-點與矽粒子的表面的相互作用。將紅色螢光的Q-點(發射565nm)和綠色螢光的PEG-FITC-SWNT(發射510nm)兩者同時裝栽入相同的納米多孔矽粒子中(圖23A，A和B區)。這些研究證明兩種類型的二級粒子都能裝載入相同的納米多孔矽粒子栽體中。多重裝載的動態不同於所述的單一裝栽的動態，其在60分鐘後達到穩定的平臺。可能由於它們的較小的尺寸的結果，PEG-FITC-SWNT是首先進入孔中的，而較大的Q-點用了更長的時間但達到更高水平的裝載(圖23B,C區)。與圖21B區中顯示的釋放的觀察相比，兩種類型的二級粒子從矽栽體的釋放圖譜幾乎保持不變(圖23B,D區)。圖23C，E-H區中顯示的共聚焦顯微圖像展示兩種不同的二級納米載體優先定位於矽粒子的不同區域。鑑於它們的更大的尺寸，僅在與較大的孔關聯的中心區域發現Q-點。在整個粒子的四周都發現了PEG-FITC-SWNT,其主要沿著與較小的孔關聯的粒子的邊界積聚。當把已裝栽的矽粒子與HUVEC細胞在37。C一同孵育1h，二級粒子被局部地釋放並由一級粒子到達的細胞選擇性地內化。Q-點(圖24，a-d區)和PEG-FITC-SWNT(圖24,e-h區)進入細胞的細胞質並導致在細胞質的嚢泡中的顯著積聚。緊接著嘗試在將兩種納米粒子都裝載入一級矽粒子中後遞送它們。兩種納米粒子的內化都如螢光信號的共定位(圖24,j-m區)暗示的以相似的動力學和通過相同的機制發生。在所有情況下，在lh期間內3,5pm矽粒子沒有獨立地被細胞內化。圖24，d、h和m區中的明場圖像顯示粒子形態的具體情況暗示它們是與細胞外表面關聯而不是由細胞內化，這也通過共聚焦成像得以核實。矽在微電子工業廣泛使用，並且展示了其用於微晶片的大規模生產以及生物傳感器、植入裝置和藥物遞送系統的開發的能力36—39。儘管體矽(bulksilicon)在生理緩衝液中保持惰性，多孔矽具有高度的生物可降解性，其降解動力學可根據孔尺寸密度"'"在幾小時到幾天之間精細地調節。多孔矽粒子降解為對身體無害的矽酸，而且我們已發現整個完整的矽粒子或它們的降解產物對細胞都無細胞毒性。製作方法允許製造任何期望的形狀、尺寸(尺寸從100nm到上百nm)、孔尺寸(5-100nm)和/或孔密度的矽微米粒子。另外，已開發化學地修飾粒子例如為了減少血漿蛋白吸附、RES攝取和為了增加粒子作為藥物遞送系統的循環時間將PEG連接於矽粒子的表面的方法42(文稿準備中)。將矽粒子成功綴合於針對具治療的重要意義的配體的特定抗體，所述配體例如血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)和表皮生長因子受體(EGFR)，並如上面的工作實施例1中所述使用原代HUVEC的體外細胞培養模型評估了它們的靶向和選擇性細胞毒性。本研究提供向納米多孔矽粒子有效裝載不同性質、尺寸和形狀的二級納米粒子的能力的證據。通過調節納米粒子的濃度和/或通過利用一級和二級粒子之一或兩者的表面化學特性調控裝載過程。本研究中已顯示納米粒子釋放的動態和探索納米多孔矽粒子同時裝載多種類型的納米粒子的能力。這些研究清楚地證明用作二級粒子的Q-點和PEG-FITC-SWNT根據二級粒子的尺寸和化學特性定位於一級矽納米多孔粒子載體的不同的室。此外，對負責裝栽和釋放過程的關鍵機制和驅動力進行鑑定了和分級。矽粒子的孔的和二級粒子的相對尺寸共同決定一級和二級粒子的組合的最成功的配置(圖25，A區)。二級納米栽體的濃度影響裝栽過程的效率，後者受二級粒子對矽粒子的納米孔的被動擴散和毛細管對流兩者調控。二級納米載體與矽粒子的納米孔的流體力學的相互作用和布朗運動影響組裝的系統的穩定性以及二級納米栽體保持裝載在一級矽粒子的納米孔中的時間(圖25，B區)。最後，需考慮的第三個機制是一級矽粒子栽體和二級納米載體之間的靜電的相互作用(圖25，C區)。合起來考慮，這些特點的每一個允許裝載入一級納米多孔矽粒子的二級納米載體的量的精細調節，從而符合在藥物遞送的未來的應用中特定的藥理學的需要。多級納米載體系統的新穎的和獨特的性質允許遞送多種治療劑、滲透增強劑或成像造影劑用於腫瘤的同步檢測和隨後破壞或者其他病理狀態的成像和隨後的治療。方法,/乙絲飾餅使用電阻率為0.005ohmcm-l的重度摻雜p十+型Si(100)片(SiliconQuestInternational,SantaClara,CA，USA)作為底物。通過低壓化學氣相沉積(LPCVD)系統沉積出200nm的氮化珪層。使用接觸校準器(contactaligner,EVG620校準器)運用標準光刻制模。通過閃光壓印光刻(lithograph)獲得小直徑(100-500隨)的矽粒子。然後通過反應離子刻蝕(RIE)選擇性去除氮化物。用piranha(H2S04:H202=3:1(v/v))去除光刻膠(photoresist)。然後將珪片置於自製的特氟隆小室內進行電化學刻蝕。通過施加25s的80mAcuT2的電流密度在氫氟酸(49%HF)和乙醇(3:7v/v)的混合液中形成具大孑L(LP)的珪粒子。通過施加6s的320mAem-2的電流密度形成高度多孔層。對於具小孔的矽粒子的製作，使用比例為1:1(v/v)的HF和乙醇的溶液，施加1.75min的6niAcnr2的電流密度。通過在比例為2:5(v/v)的HF:乙醇的混合液中施加6s的320mAcm—2的電流密度形成高度多孔層。在以HF去除氮化物層後，通過在異丙醇(IPA)中超聲處理1min釋放粒子。收集含多孔矽粒子的IPA溶液並保存於40C。在QuantachromeAutosorb-3bBET表面分析儀上測量在77K獲得的氮吸附解吸體積等溫線。將樣品在真空中於150。C烘烤過夜。通過在壓力範圍0.05到1P/P0中BET線性化獲得粒子表面積。對於LP粒子，使用氮吸附解吸體積等溫線測量，BET表面積是156m2g"，孔體積是0.54cm3g-l。估計平均孔尺寸約為24.2nm。對於SP粒子，測出的BET表面積是294m2g-1;孔體積是0.38cm3g"，平均孔尺寸是7.4nm。為V^f溶濕尹^在fx於^^i用Z2Coulter⑧粒子計數器和尺寸分析儀(BeckmanCoulter,Fullerton,CA,USA)對粒子進行計數，孔徑尺寸為50pm。將分析的尺寸上限和下限設置在1.8和3.6nm。為了分析，將粒子懸浮於平衡的電解質溶液(ISOTO腳IIDiluent,BeckmanCoulterFullerton，CA，USA)中並計數。粒子的初始懸浮液的總體積不超過最終分析體積的0.3%。粒子計數器顯示溶液中粒子的濃度以及粒子尺寸分布的分析。^微求在f#處必通過加熱(80-90°C)將IPA中的矽微米粒子在玻璃燒杯中乾燥然後將它們在piranha溶液(1:211202:濃縮的H2S04(v/v))中氧化。將粒子加入H202(30%)的溶液中，在5510R-MT超聲洗滌機(BRANSONIC,Danbury，CT，USA))中超聲處理30s然後加入H2S04(95-98%)，將懸浮液加熱至100-110。C並維持2h，間斷超聲處理以使粒子分散。然後用去離子(DI)水洗滌粒子。粒子在DI水中的洗滌包括將孩t米粒子懸浮液在4,200rpm離心5min，隨後去除上清，將粒子重懸於DI水中。將氧化的粒子置於水中在4-C保存直到進一步使用。在在子^j-^丙^2乙處JL^處^p:t五5^^面夢謬在矽烷化過程之前，將氧化的矽粒子在1.5MHN03中羥化大約1.5h。然後用DI水中將粒子洗滌3-5次，隨後用IPA洗滌2次。然後在室溫下將矽粒子懸浮於含0.5%(v/v)APTES的IPA中維持45min。然後用IPA將粒子洗滌(4,200g離心5min，5次)，並置於IPA中在4。C保存。0-,《^^資^標記^水溶'勝5*ffwrQ畫點購自Invitrogen(Carlsbad,CA，USA)。本研究中，我們使用發射波長為525nm和565nm的氨基-PEG(貨號分別為Q21541MP和Q21531MP)和發射波長為525nm和565nm的羧基Q-點(貨號分別為Q21341MP和Q21331MP)。為了生成側壁高度羧化的超短(US)-SWNT43，在氮氣下向圓底燒瓶中的純化的HiPcoSWNT(0.100g)加入發煙石危酸(20%游離S03，25mL)，將該混合物攪動過夜以使SWNT分散(HiPcoSWNT從Rice大學HiPco實驗室獲取。對於純化遵循了已建立的步驟。44在另一個燒瓶中，向濃縮的硝酸(18mL)緩慢地加入發煙石克酸(25mL，20%游離S03)。立即將該混合物加入SWNT並將SWNT加熱至60。C維持2h。然後將此溶液在水上緩慢地倒出並通過0.22pm聚碳酸酯膜過濾。用水將濾餅充分洗滌。撤銷真空，將餅溶解於最小量的甲醇中，之後加入乙醚，導致US-SWNT的絮凝，再次施加真空。不斷地加入乙醚直到洗滌液達到中性pH。將US-SWNT餅在真空下乾燥。為獲得PEG化的SWNT，使用超聲處理(水浴或振蕩槽、和Model)30min在圓底燒瓶中將US-SWNT(0.034g，3.1meqC)分散於幹DMF(30mL)中。向該溶液加入二環己基碳二亞胺(DCC)(0.32g,1.5mmol)和分子量為5,200的羥乙基鄰苯二甲醯亞胺末端化的PEG(0.32g)，將混合物在氮氣下攪動24h。將此溶液轉移到透析袋(CelluSepHI,50,000MWCO，Part#:1-5050-34，MembraneFiltrationProducts)中透析5d，將產物通過玻璃棉過濾以除去透析袋中形成的任何粒子。將透析袋的內容物進行鄰苯二曱醯亞胺部分的去除，展示出PEG-末端化的胺(H2H-PEG-US-SWNT)。加入一水合肼(10mL)，將所述溶液在氮氣下加熱至回流並維持12h以在PEG化的US-SWNT的末端上提供末端伯胺。通過在DI水中透析5天純化該產物。將所述溶液轉移到以箔片包裹的圓底燒瓶中，向H2H-PEG-US-SWNT溶液加入預先溶解於少量DMF中的FITC(0.12g)。將該反應在室溫下攪動12h。將所述溶液轉移至透析袋中並維持於黑暗中以DI水連續透析5天，隨後通過玻璃棉過濾以除去未溶解的粒子。終產物FITC-PEG-US-SWNT含一些物理吸附於而不是共價結合到PEG-US-SWNT的FITC。在水中透析數月之後大部分物理吸附的FITC仍然保持與SWNT關聯。使用ZetasizernanoZS(MalvernInstrumentsLtd.，Southborough，MA，USA)分析矽粒子、Q-點和FITC-PEG-US-SWNT的zeta電位。將粒子懸浮於20mMTris(羥曱基)氨基甲烷(TRIS-HCL)緩衝液(pH~7.3)中進行所述分析。摔^5"『AT袁戎入一焱在在f在多級納米裝置的開發中使用的矽納米多孔粒子包括LP氧化的多孔矽、SP氧化的多孔珪和APTES修飾的LP和SP粒子。二級粒子包括氨基-PEGQ-點、羧基Q-點和PEG-FITC-SWNT。進行初始實驗滴定二級粒子對一級矽粒子的裝載。對於滴定實驗的每一個實驗點，使用3.0xl0S個矽粒子，將其重懸於含3nlDI水的低結合聚丙烯微量離心管(VWRInternational,WestChester,PA，USA)中。對於每一個實驗，在pH7.3調節給定摩爾濃度的TRIS-HC1。向TRIS-HCl溶液加入2pMQ-點(5pl)或20ng/^ilPEG-FITC-SWNT(9^1)，以2(Hil作為裝載實驗的終體積。通過將樣品置於轉輪(20rpm)上將其於25。C孵育15min。孵育後，用20mMTRIS-HC1，pH7.3將樣品稀釋至150pl的體積並迅速用FACScalibur(BectonDickinson)流式細胞儀檢測螢光強度。為了評估Q-點和PEG-FITC-SWNT對珪粒子的濃度依賴的裝載入，我們使用3.0xlS個矽粒子和15min的孵育時間，配以0.01、0.1、1、10、100、l，OOO和2,000nMQ-點或0.05、O，l、2.5、10和20ng/pl的PEG-FITC-SWNT。為了評估時間依賴的裝載，使用3.0x105個一級粒子、2，000nMQ-點或20ng/pl的PEG-FITC-SWNT，配以15、30、45和60分鐘的孵育時間。對於以Q-點和PEG-FITC-SWNT兩者裝載矽粒子的評估，以相同的孵育的終濃度l吏用3.0xl05個珪粒子、1,000nMQ-點、和10ng/pl的PEG-FITC-SWNT。2國,《和swat雙一^凌在fw^"放^^f^:將氧化的或APTES修飾的LP矽粒子(2.1xl06)與2nM氨基-PEGQ-點或羧基Q-點在pH7.3的200mMTRIS-HC1溶液中，或與20ng/plPEG-FITC隱SWNT在pH7.3的20mMTRIS-HC1溶液中，或與1pMQ-點和10ng/plPEG-FITC-SWNT兩者在pH7.3的50mMTRIS-HC1溶液中進行組合。所有研究的最終孵育體積為140fil。使用轉輪(20rpm)將一級矽粒子栽體和二級粒子的樣品在25。C賻育15min。然後將含一級矽粒子和二級粒子的溶液在1.4mLDIH20中洗滌，然後在BeckmanCoulterAllegraX-22離心機中於4,200rpm離心5min。然後將離心後存在的團塊重懸於70^1的DIH20中，從每瓶中取出10^1用流式細胞術評價樣品的螢光。在時間0和之後包括30、60、90、180、360、和1,200min的6個時間點記錄螢光。將每瓶中留下的剩餘60^1稀釋於20mMTRIS-HC10.9%NaCl釋放液中至3ml,隨後用轉榭20rpm)在37。C醉育給定量的時間(30、60、90、180、360和1，200min)。在每個時間點，將樣品在4，200rpm離心5min並4吏用流式細胞術評估焚光。^<勿應僅設_￡4吏用FACScalibur(BectonDickinson)評價粒子的螢光。4吏用二元點-圖定義的對數側向散射(SSC)對對數前向散射(FSC)評估矽粒子的尺寸和形狀(直徑3pin,高度1.5)並將非特異的事件從分析中排除。使用對照彩虹BDCalibriteTM珠(尺寸為3.5)校準儀器。圍繞主要目的群體的中心定義一個多邊形區域(Rl)作為電子門，其排除離細胞儀的信噪比極限太近的事件。對於每個樣品，在Rl區域檢測到的粒子的數量超過90%。對於幾何學的平均螢光強度(GMFI)的分析，將焚光通道1(FL1)和FL2對logFSC與落入定義為Rl的門控區域的事件的分析進行比較，產生點-圖。在相應的焚光柱狀圖中分析每個樣品中鑑定出的峰並記錄幾何學的平均值。對於粒子檢測，使用的檢測儀為電壓設置在474伏特(V)的FSCE-1和SSC。螢光檢測儀FL1設置在800V。使用530/30nm帶通濾波器以FL1檢測綠色螢光(FITC和Q-點525)。使用FL2檢測紅色螢光(Q-點565)。當只分析單色檢測時將顏色補償設置在零，當進行紅-綠雙重焚光檢測時，將FL1補償設置在FL2的25%，FL2補償設置在FL1的35%。對於數據獲取，使用BDCalibriteTM珠在每一系列實驗的之前、之間和之後進行儀器校準。々潛逸裙發查使用掃描電鏡(SEM，型號LEO1530)獲取矽粒子的形態。將粒子直接置於SEM樣品臺上並乾燥。對於在高鹽緩衝液中測試的粒子，置於臺上之前進行DI水中的溫和的洗滌步驟。加速電壓為10kV。^蔬^^式^f力貞微裙趁查通過從DMF沉積到新鮮裂開的雲母表面製備AFM樣品。將樣品旋轉塗布，使用截面分析測定每個樣品的高度。使用輕敲模式獲得A兩樣品。坊場！微1^檢普用帶有40X放大鏡頭的OlympusCKX41顯微鏡在明場對比中分析粒子。用SP-350OlympusTrue-PicTURBO圖像處理器相機採集圖像。炎^貞凝裙檢普使用帶有保持在-30.1匸的DQC-FSNikonCCD相機的NikonEclipseTE2000-E進行粒子的螢光成像。在緊接分析之前所將有樣品固定，用63X油浸物鏡獲取圖像。所有實驗過程中顯微鏡設置保持不變。將數值孔徑設置在1.4，折射率設置在1.515,曝光時間設置在500ms，讀取速度設置在10MHz以及將轉換增益設置在1/6x。用NISElementsAR2.3軟體分析和測量圖^f象。^炎Jf^凝裙檢查用LEICADM6000顯微鏡進行粒子的共聚焦成像。在緊接分析之前所將有樣品固定，用HCXPLAPOCS63X油浸物鏡以1.4的數值孔徑和1.52的折射率獲取圖像。對於所有獲取，將針孔設置在95.6fim(1艾裡(Airy)單位)，488nm氬燈和561nm雷射都設置在它們的能力的15%;將掃描速度設置在400Hz。將單綠色螢光成像光電倍增器電壓設置在750V。對於雙重顏色成像，將紅色通道的PMT設置在600V而將綠色通道的PMT設置在1000V。為了提高圖像質量，在獲取期間進行了2-幀積聚、2-線積聚和4-幀平均。最終的體素寬度和高度為19.8nm。將所述圖像數碼放大(10x)，在採用LASAF1.6.2軟體後期處理期間使用中值調節(3像素，2輪)。工作實施例3丄5微末在在f^W腐^舉如C.N.LandenJr.，etal.CancerRes.2005,65(15)，6910-6918和丄Clin.CancerRes.2006;12(16)，4916-4924中詳述製備螢光標記的siRNA裝栽的1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酯醯膽鹼(DOPC)脂質體。將螢光標記的siRNA裝載的DOPC脂質體(初始siRNA濃度lOOng/pl)作為二級粒子與一級大孔"LP"氧化的矽粒子(3.5微米)混合。在20mMTrispH7.3中於室溫下進行30min孵育。將溶液在室溫下以4,200rpm離心1min使其沉降下來。回收上清，通過螢光計使用544nm/590nm(激發/發射)設置測量樣品的螢光。將含已經合併了螢光脂質體的一級粒子的粒子團塊重懸於100fil的去離子水中，獲取螢光計讀數。圖8B，D區中顯示螢光標記的siRNA裝載的DOPC脂質體對3.5微米LP和SP粒子的的裝載時間動態。圖8B中，E和F區分別顯示在白色^L野和紅色碎見野中含Alexa555標記的SiRNA的二級脂質體裝載入3.5微米納米多孔矽一級粒子LP的螢光顯微圖像。將Alexa555螢光標記的SiRNA包封於脂質體中並裝載入一級多孔矽粒子。圖26，A區中數據顯示與多孔矽載體關聯的螢光隨著納米脂質體的量增加。為了測試脂質體從一級粒子的釋放，將組裝的多級系統與10%胎牛血清(pH7.4)—起孵育，使用螢光計追蹤納米脂質體隨時間從一級粒子的釋放。在約36h內達到完全卸載，見圖26，B區。工作實施例4矽粒子中的脂質體錯輛賴備通過如下擠壓過程製備脂質組成分別為58:40:2(Mol%)DPPC:膽固醇DSPE-甲氧基PEG(2000)的脂質體簡要地說，將脂質在55。C溶解於乙醇中。然後用300mM硫酸銨溶液水合已溶解的脂質(15-30分鐘)以促進多柔比星的活性裝載，參考Li，etal.BiochimetBiophysActa1415(1998)。將脂質體通過一系列孔尺寸逐漸變小的核孔徑跡蝕刻聚碳酸酯膜擠壓。然後將脂質體通過0.2pm膜擠壓5次。然後通過O.lnm膜擠壓5次，再通過0.05nm膜5次。最後的擠壓是通過0.03pm膜10次。擠壓在55。C進行。生成的螢光標記的脂質體含30。/。的二棕櫚醯磷酯醯膽鹼(DPPC)脂質、30。/。的膽固醇、10%的螢光標記的脂質N-[7-硝基苯-2-氧雜-l，3-二唑-4-基二棕櫚醯-L-a-磷脂醯乙醇胺(NBD-PE)脂質，與30%1，2-二油醯-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)(對於陽離子脂質體)、或30%二油醯磷脂醯甘油(DOPG)(對於陰離子脂質體)、或30%二油醯基磷酯醯膽鹼DOPC(對於中性脂質體)混合。通過動態光散射(DLS)測量，中性脂質體具有47,4nm的初始平均直徑，3天後平均直徑為78.2nm。中性脂質體的zeta電位為-13.04±0.77mV。通過DLS測量，陽離子脂質體具有49.6nm的初始平均直徑，3天後平均直徑為58.2nm。陽離子脂質體的zeta電位為30.30±2.55mV。將中性和陽離子脂質體裝栽入氧化的1微米"大孔"(LP)氧化的納米多孔矽粒子以及1微米"大孔"(XLP)氧化的和APTES修飾的矽粒子。圖8A，A區顯示中性(左)和陽離子(右)螢光標記的脂質體裝載入l微米XLPAPTES修飾的矽粒子的共聚焦顯微圖像。圖8A,B區顯示中性和陽離子螢光標記的脂質體裝載入1微米XLP氧化的和APTES修飾的矽粒子和1微米LP氧化的粒子的FACS分析。圖8A，C區顯示螢光標記的脂質體裝載的Excel定量。多柔比星作為活性試劑的裝載將脂質體對150mMNaCl透析過夜除去未包封的石克酸銨，從而製造一個跨膜質子梯度。在60。C向脂質體加入多柔比星(~10mg/ml)維持lhr。藥物脂質比為0.2:1.0，最終的脂質濃度為25mM。將所得的脂質體製劑在水上保持15分鐘以停止微弱的裝載過程。將脂質體對150mMNaCl透析過夜除去未包封的多柔比星。通過以甲醇(30%的最終體積)裂解並在480nm測量UV吸光度測定最終的包封的多柔比星濃度。參考文獻上文中引用了以下參考文獻1.Cheng，M.M.etal.Nanotechnologiesforbiomoleculardetectionandmedicaldiagnostics.Cm/tC7re附10,11-9(2006).2.Ferrari,M.Cancernanotechnology:opportunitiesandchallenges.淑及evC羅w5，161-71(2005).3.Moghimi，S.M.,Hunter,A.C.&Murray,J.C.Nanomedicine:currentstatusandfutureprospects.F"se6/19，311-30(2005).4.Sullivan,D.C,&Ferrari,M.Nanotechnologyandtumorimaging:seizinganopportunity.A/o//附flg/wg3,364-9(2004).5.Wang，M.D.,Shin,D.M.，Simons,丄W.&Nie,S.Nanotechnologyfortargetedcancertherapy.￡"x/7eWZev77^7，833-7(2007).6.Lasic，D.D.Doxorubicininstericallystabilizedliposomes.380，561-2(1996).7.Uziely，B.etal.Liposomaldoxorubicin:antitumoractivityanduniquetoxicitiesduringtwocomplementaryphaseIstudies./a,"O,/13，1777-85(1995).8.Kim,S.etal.Near-infraredfluorescenttypeIIquantumdotsforsentinellymphnodemapping.7V"zJ/o^:Awo/22，93-7(2004),9*So，M.K.，Xu，C.，Loening，A.M.，Gambhir，S.S.&Rao，J.Self-illuminatingquantumdotconjugatesforinvivoimaging.TVfl/5/0,ec/mo/24，339-43(2006).10.Corot,C.，Robert,P.，Idee,J.M.&Port,M.Recentadvancesinironoxidenanocrystaltechnologyformedicalimaging.恭D，De//vWev58，1471-504(2006).11.Liu,Z.etal.Invivobiodistributionandhighlyefficienttumourtargetingofcarbonnanotubesinmice.tV"/w/t7V"w^cA"o/0^2，47-52(2007).12.Hirsch，L,R.etal.Nanoshell-mediatednear-infraredthermaltherapyoftumorsundermagneticresonanceguidance./VocA^/爿c^/Sc/C/S爿100，13549-54(2003).13.Bradbury,J.Nanoshelldestructionofinoperabletumours.丄騰W0腳/4，711(2003),14.Torchilin,V.P.Multifunctionalnanocarriers.je//v及ev58，1532-55(2006).15.Bianco,R.，Daniele,G.，Ciardiello,F.&Tortora，G.Monoclonalantibodiestargetingtheepidermalgrowthfactorreceptor.6，275-87(2005).16.Ciardiello,F.&Tortora,G.Anovelapproachinthetreatmentofcancer:targetingtheepidermalgrowthfactorreceptor.C7/rtifes7，2958-70(2001).17.Hobday,T.J.&Perez,E,A.Molecularlytargetedtherapiesforbreastcancer.CVwcerCVm^y^12，73-81(2005).18.Druker，B.J.Perspectivesonthedevelopmentofamolecularlytargetedagent.CVm"rCW/1,31-6(2002).19.Sakamoto,J"Annapragada,A"Deeuzzi,P.&Ferrari,M.Anti-BiologicalBarrierNanovectorTechnologyforCancerApplicationsOp/wZ)r"gZ)e//v(InPress:AcceptedMay2007)(2007).20.Ferrari,M.Nanovectortherapeutics.C"/rCAe附9，343-6(2005).21.Decuzzi,P.&Ferrari,M.Fantasticvoyages.AfecA"w/c<z/五wg/weerZwg128，24-27(2006).22.Decuzzi,P.，Causa,F.，Ferrari,M.&Netti，P.A.Theeffectivedispersionofnanovectorswithinthetumormicrovasculature.J朋5,V附^/五wg34，633-41(2006).23.Decuzzi,P.&Ferrari,M.Theadhesivestrengthofnon-sphericalparticlesmediatedbyspecificinteractions,5/o附a&Wfl/s27，5307-14(2006).24.Decuzzi，P.&Ferrari,M.Theroleofspecificandnon-specificinteractionsinreceptor-mediatedendocytosisofnanoparticles.^歸/m'a/s28，2915-22(2007).25.Decuzzi,P.,Lee,S.，Bhushan，B.&Ferrari,M.Atheoreticalmodelforthemarginationofparticleswithinbloodvessels,j/im33，179-90(2005).26.Decuzzi,P.，Lee，S.，Decuzzi,M.&Ferrari,M.Adhesionofmicrofabricatedparticlesonvascularendothelium:aparametricanalysis,yiww^附e^wg32，793-802(2004).27.Corrie，S.R.，Lawrie，G.A.&Trau，M.Quantitativeanalysisandcharacterizationofbiofunctionalizedfluorescentsilicaparticles.Z^"g附w/r22，2731-7(2006).28，Mansur，H,S.，Orefice，R.L.,Vasconcelos，W,L.，Lobato，Z*P.&Machado,L.J.Biomaterialwithchemicallyengineeredsurfaceforproteinimmobilization.JAf"^rAf"/cAf^/16，333-40(2005).29.Shriver-Lake,LC.etal.Antibodyimmobilizationusingheterobifunctionalcrosslinkers.JZo5^ws5/oe/e"w12，1101-6(1997).30.Starodub,N.F.，Pirogova,L.V，，Demchenko,A.&Nabok，A.V.Antibodyimmobilisationonthemetalandsiliconsurfaces.Theuseofself-assembledlayersandspecificreceptors,^/oe/e",oc/re附/s外66，111-5(2005).31.Lan，S.，Veiseh，M.&Zhang,M.Surfacemodificationofsiliconandgold-patternedsiliconsurfacesforimprovedbiocompatibilityandcellpatterningselectivity,5^sewsjB,W/ec加w20，1697-708(2005).siliconandgermaniumsurfaces.C7^附及ev102，1271-308(2002).34.Desai，T.A.etal.Microfabricatedimmunoisolatingbiocapsules.腸,ec/mo/57，118-20(1998).35.Schreiber，F.Structureandgrowthofself-assemblingmonolayers.5W/"ce5Wewce65，151-256(2000).36.Foraker,A.B.etal.MicrofabricatedporoussiliconparticlesenhanceparacellulardeliveryofinsulinacrossintestinalCaco-2cellmonolayers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。34.權利要求l中的組合物，其中所述二級粒子具有包含活性試劑的主體。35.權利要求l中的組合物，其中所述二級粒子具有主體和主體內的貯存器，所述二級粒子的貯存器含活性試劑。36.權利要求l中的組合物，其中所述活性試劑包括治療劑或成像劑或其組合。37.權利要求l中的組合物，包含多個一級粒子和其中懸浮了所述多個一級粒子的栽體。38.包括向受試者施用包含至少一種一級粒子的組合物的方法，所述一級粒子為微米粒子或納米粒子，並且具有(i)主體、(ii)至少一個表面、(m)至少一個位於主體內部的貯存器，所述貯存器包含至少一種含有至少一種活性試劑的二級粒子。39.權利要求38中的方法，其中配置所述一級粒子使其定位於受試者體內的第一耙位點。40.權利要求38中的方法，其中所述第一靶位點為新生血管或再正常化的血管或共擇的血管。41.權利要求38中的方法，其中配置所述二級粒子使其將活性試劑遞送至受試者體內的第二靶位點。42.權利要求41中的方法，其中所述第二靶位點為細胞。43.權利要求42中的方法，其中所述細胞為癌細胞。44.權利要求43中的方法，其中所述癌細胞為幹細胞或成克隆細胞。45.權利要求42中的方法，其中所述第二靶位點包含異化的病變。46.權利要求42中的方法，其中所述第二靶位點為細胞的核。47.權利要求38中的方法，其中所述二級粒子含至少一種含活性試劑的三級粒子。48.權利要求38中的方法，其中配置所述一級粒子使其繞過選自血液流變學屏障、網狀內皮系統屏障、內皮屏障、血腦屏障、腫瘤相關的滲透性間質壓力屏障、離子和分子泵屏障、細胞膜屏障、酶降解屏障、核膜屏障或其組合的生物屏障。49.權利要求38中的方法，其中所述一級粒子包含多孔或納米多孔材料。50.權利要求49中的方法，其中所述多孔或納米多孔材料為納米多孔矽或納米多孔的氧化物材料。51.權利要求49中的方法，其中所述一級粒子的主體包含第一多孔區域和第二多孔區域，所述第二多孔區域與第一多孔區域在至少一個選自孔密度、孔幾何學、孔電荷、孔表面化學和孔定向的特性上不同。52.權利要求38中的方法，其中所述一級粒子的主體包含含二級粒子的第一群體的第一區域和含二級粒子的第二群體的第二區域。53.權利要求52中的方法，其中所述二級粒子的第一群體含第一活性試劑，所述二級粒子的第二群體含不同於所述第一活性試劑的第二活性試劑。54.權利要求52中的方法，其中所述第一和第二群體具有特徵釋放時間，其中第一群體從第一區域的特徵釋放時間不同於第二群體從第二區域的特徵釋放時間。55.權利要求52中的方法，其中配置所述一級粒子使其施用於受試者時分成包含第一區域的第一組分和包含第二區域的第二組分。56.權利要求52中的方法，其中配置所述第一區域使其繞過第一生物屏障，配置所述第二區域使其繞過不同於所述第一生物屏障的第二生物屏障。57.權利要求38中的方法，其中所述至少一個貯存器含至少一種滲透增強劑。58.權利要求38中的方法，還包含將受試者暴露於外部刺激使從所述一級粒子釋放所述至少一種二級粒子。59.權利要求58中的方法，其中所述外部刺激為機械性激活、輻射激活或磁激活中的至少一種。60.權利要求38中的方法，其中所述至少一種二級粒子包含至少一種選自脂質體、膠束、醇質體、碳納米管、富勒烯納米粒子、金屬納米粒子、半導體納米粒子、聚合物納米粒子、氧化物納米粒子、病毒粒子、聚離子粒子和陶瓷粒子的成分。61.權利要求38中的方法，其中所迷活性試劑包含治療劑或成像劑或其組合。62.權利要求38中的方法，其中所述組合物為包含多個一級粒子的懸浮液。63.權利要求38中的方法，其中所述一級粒子的主體包含第一活性試劑，所述二級粒子含不同於所述第一活性試劑的第二活性試劑。64.權利要求63中的方法，其中配置所述一級粒子使其釋放二級粒子以在受試者體內的自由循環。65.權利要求38中的方法，其中所述施用包括血管內注射所述組合物。66.權利要求65中的方法，其中所述一級粒子具有從約700nm到約3微米的特徵尺寸。67.權利要求38中的方法，其中所述施用包括皮下注射所述組合物068.權利要求38中的方法，其中口服進行所述施用。69.權利要求38中的方法，其中所述施用包括吸入所述組合物。70.權利要求69中的方法，其中所述一級粒子具有從約5微米到約20微米的特徵尺寸。71.製備多級遞送組合物的方法，包括(a)提供至少一種一級粒子，其中所述一級粒子為微米粒子或納米粒子，並且具有(i)主體、(ii)至少一個表面和(iii)至少一個位於主體內部的貯存器；.(b)提供至少一種二級粒子；以及(c)將所述二級粒子裝載入所述一級粒子的貯存器。72.權利要求71中的方法，其中所述至少一種二級粒子含至少一種活性試劑。73.權利要求71中的方法，其中所述一級粒子的主體包含納米多孔材料。74.權利要求73中的方法，其中所述納米多孔材料為納米多孔矽或納米多孔的氧化物材料。75.權利要求73中的方法，其中提供所迷至少一種一級粒子和提供所述至少一種二級粒子包括提供含至少一種一級粒子、所述至少一種二級粒子和栽體的溶液。76.權利要求76中的方法，其中所述裝載包含通過被動擴散或毛細管對流、或通過它們的組合的裝載。77.權利要求76中的方法，還包括修飾所述一級粒子的主體的孔表面或所述二級粒子的表面中的至少一個。78.權利要求77中的方法，其中所述修飾包括化學地修飾一級粒子的主體的孔表面或二級粒子的表面中的至少一個。79.權利要求77中的方法，其中所述修飾包括修飾一級粒子的主體的孔表面或二級粒子的表面中的至少一個上面的表面電荷。80.權利要求75中的方法，其中所述裝載包括改變溶液中所述至少一種二級粒子的濃度以達到二級粒子對所述一級粒子的至少一個貯存器中的期望的裝載。81.權利要求71中的方法，其中所述至少一種二級粒子包含二級粒子的第一群體和二級粒子的第二群體，其中所述裝栽包括將二級粒子的第一群體裝載入所述一級粒子的主體的第一區域和將二級粒子的第二群體裝栽入所述一級粒子的主體的第二區域，其中所述第一區域不同於所述第二區域。82.權利要求81中的方法，其中所述二級粒子的第一群體包含第一活性試劑，所述二級粒子的第二群體包含不同於所述第一活性試劑的第二活性試劑。83.權利要求71中的方法，其中所述二級粒子包含至少一種選自脂質體、膠束、醇質體、碳納米管、富勒烯納米粒子、金屬納米粒子、半導體納米粒子、聚合物納米粒子、氧化物納米粒子、病毒粒子、聚離子粒子和陶瓷粒子的成分。84.權利要求71中的方法，還包括將至少一種另外的組分裝載入所述一級粒子的貯存器。85.權利要求84中的方法，其中所述至少一種另外的組分包括至少一種滲透增強劑或另外的活性試劑、或兩者。全文摘要公開了包括一級粒子和二級粒子的多級遞送載體。所述一級粒子是含二級粒子的微米粒子或納米粒子。所述二級粒子包括活性試劑，例如治療劑或成像劑。多級遞送載體允許生物屏障的連續的克服或繞過。將多級遞送載體作為包括多個所述載體的組合物的一部分進行施用。也提供了製備所述多級遞送載體的方法。文檔編號A61K9/14GK101652126SQ200780037424公開日2010年2月17日申請日期2007年8月8日優先權日2006年8月8日發明者E·塔斯齊奧提,J·薩卡莫託,M·菲拉裡申請人:德克薩斯大學體系董事會;俄亥俄州立大學研究基金會