由在其分子中具有包含芳環的殘基的烷烴製備聚羥基鏈烷酸酯的方法

2023-05-22 04:02:41

專利名稱：由在其分子中具有包含芳環的殘基的烷烴製備聚羥基鏈烷酸酯的方法
技術領域：
本發明涉及使用取代的烷烴衍生物作為原料製備用作聚酯的聚羥基鏈烷酸酯(在下文中可簡寫為「PHA」)的方法。更具體來說，本發明涉及通過使用取代的烷烴衍生物作為原料，並使用能夠在細胞中產生PHA並積聚PHA的微生物來製備PHA的方法。
背景技術：
據報導，有許多微生物在細胞中產生聚-3-羥基丁酸(在下文中可簡寫為「PHB」)或其它PHA，並積聚這些聚合物(「Biodegradable Plastic Handbook」，Society ofBiodegradable Plastic Research編寫，N.T.S.Co.，Ltd.，pp.178-197(1995))。象常規塑料一樣，這些聚合物可用於通過熔化加工等生產多種產品。此外，這些聚合物是生物可降解的，因此能由自然界中的微生物完全分解，這是很有利的。所以，與合成聚合物不同，這些聚合物不會汙染環境。上述聚合物還具有優良的生物相容性。因此，預計它們可形成軟醫療材料等。
已知，根據生產所用的微生物的類型、培養基組成、培養條件等，可由微生物產生的PHA具有不同組成和結構。因此，已經進行了研究來控制PHA的組成和結構，這主要是為了改善它們的物理性質。
例如，據報導，通過在培養物中使用不同的碳源，真養產鹼菌(Alcaligenes eutropus)H16(ATCC No.17699)或其突變體產生具有不同組成比例的3-羥基丁酸(「3HB」)與3-羥基戊酸(「3HV」)的共聚物(日本專利出版物6-15604、7-14352和8-19227)。
日本專利出版物2642937公開了向食油假單胞菌(Pseudomonasoleovorans)ATCC 29347菌株中加入非環脂族烴作為碳源，來產生具有包含6-12個碳原子的3-羥基鏈烷酸酯作為單體單元的PHA。
日本專利特開平5-7492公開了一種方法，其中是將甲基桿菌屬(Methylobacterium sp.)、副球菌屬(Paracoccus sp.)、產鹼菌屬(Alcaligenes sp.)和假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)微生物與具有3-7個碳原子的伯醇接觸來產生3HB和3HV的共聚物。
日本專利特開平5-93049和7-265065公開了將豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)與作為碳源的油酸和橄欖油一起培養來產生3HB與3-羥基己酸(「3HHx」)的二元共聚物。
日本專利特開平9-191893公開了將食酸叢毛單胞菌(Comamonasacidovorans)IFO 13852菌株與作為碳源的葡糖酸和1，4-丁二醇一起培養來產生具有3HB和4-羥基丁酸作為單體單元的聚酯。
上述PHA在側鏈中具有烷基，即「普通PHA」。然而，考慮到可由微生物產生的PHA的廣泛應用，預計具有引入到側鏈中的除烷基以外的取代基例如苯基等的PHA將是有用的聚酯。其它取代基的實例包括不飽和烴、酯基、烯丙基、氰基、滷代烴、環氧化物等。特別是對具有芳環的PHA進行了充分研究。
(a)具有苯基或部分取代的苯基的PHA據Macromolecules，24，5256-5260(1991)中報導，通過使用5-苯基戊酸作為底物，食油假單胞菌產生了具有3-羥基-5-苯基戊酸作為單元的PHA。
更具體來說，其報導，通過使用5-苯基戊酸(在下文中簡寫為「PVA」)和壬酸作為底物(摩爾比為2∶1；總濃度為10mmol/L)，食油假單胞菌以160mg/升培養基的量(相對於細胞31.6％的乾重比例)產生了含有比例為0.6∶16.0∶41.1∶1.7∶40.6的3HV、3-羥基庚酸、3-羥基壬酸、3-羥基十一烷酸和3-羥基-5-苯基戊酸(作下文中縮寫為「3HPV」)作為單體單元的PHA。其還報導，通過使用PVA和辛酸作為底物(摩爾比為1∶1；總濃度為10mmol/L)，食油假單胞菌以200mg/升培養基的量(相對於細胞39.2％的乾重比例)產生了含有比例為7.3∶64.5∶3.9∶24.3的3HHx、3-羥基辛酸、3-羥基癸酸和3HPV作為單體單元的PHA。
除了上述報導以外，相關描述還可參見Makromol.Chem.，191，1957-1965(1990)和Chirality，3，492-494(1991)，其中認識到了由於存在3HPV單元，聚合物物理性質發生了改變。
據Macromolecules，29，1762-1766(1996)中報導，通過使用5-(4』-甲苯基)戊酸作為底物，食油假單胞菌產生具有3-羥基-5-(4』-甲苯基)戊酸作為單元的PHA。
據Macromolecules，32，2889-2895(1999)中報導，通過使用5-(2』，4』-二硝基苯基)戊酸作為底物，食油假單胞菌產生具有3-羥基-5-(2』，4』-二硝基苯基)戊酸和3-羥基-5-(4』-硝基苯基)戊酸作為單元的PHA。
(b)含有苯氧基或部分取代的苯氧基的PHA據Macromol.Chem.Phys.，195，1665-1672(1994)中報導，通過使用11-苯氧基十一烷酸作為底物，食油假單胞菌產生3-羥基-5-苯氧基戊酸與3-羥基-9-苯氧基壬酸的PHA共聚物。
據Macromolecules，29，3432-3435(1996)中報導，食油假單胞菌由6-苯氧基己酸產生含有3-羥基-4-苯氧基正丁酸和3-羥基-6-苯氧基正己酸作為單元的PHA，由8-苯氧基辛酸產生含有3-羥基-4-苯氧基正丁酸、3-羥基-6-苯氧基正己酸和3-羥基-8-苯氧基正辛酸作為單元的PHA，以及由11-苯氧基十一烷酸產生含有3-羥基-5-苯氧基正戊酸和3-羥基-7-苯氧基正庚酸作為單元的PHA。在該報導中，摘錄了聚合物的產率並如表1所示。表1

日本專利出版物2989175公開了涉及下述內容的發明由3-羥基-5-(一氟苯氧基)戊酸酯(3H5(MFP)P)或3-羥基-5-(二氟苯氧基)戊酸酯(3H5(DFP)P)組成的均聚物，由至少3H5(MFP)P或3H5(DFP)P組成的共聚物，和通過使用惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)-用於合成聚合物的假單胞菌屬來產生這些聚合物的方法。
這些聚合物是通過下述兩階段培養方法製備的。
培養時間第一個階段，24小時；第二個階段，96小時在每個階段使用的底物和所得聚合物如下。
(1)所得聚合物3-羥基-5-(一氟苯氧基)戊酸酯均聚物第一個階段中的底物檸檬酸、酵母提取物第二個階段中的底物一氟苯氧基十一烷酸(2)所得聚合物3-羥基-5-(二氟苯氧基)戊酸酯均聚物第一個階段中的底物檸檬酸、酵母提取物第二個階段中的底物二氟苯氧基十一烷酸(3)所得聚合物3-羥基-5-(一氟苯氧基)戊酸酯共聚物第一個階段中的底物辛酸或壬酸、酵母提取物第二個階段中的底物一氟苯氧基十一烷酸(4)所得聚合物3-羥基-5-(二氟苯氧基)戊酸酯共聚物第一個階段中的底物辛酸或壬酸、酵母提取物第二個階段中的底物二氟苯氧基十一烷酸對於效果，具有被1-2個氟原子取代的側鏈末端的含有苯氧基的聚合物可通過具有取代基的中鏈脂肪酸的同化作用來合成，並且可給聚合物賦予立體有規性和斥水性，同時保持高熔點和良好的可加工性。
除了被氟取代的聚合物以外，還已經研究了氰基或硝基取代的聚合物。
Can.J.Microbiol.，41，32-43(1995)和PolymerInternational，39，205-213(1996)公開了含有3-羥基對氰基苯氧基己酸或3-羥基對硝基苯氧基己酸作為單體單元的PHA是通過使用食油假單胞菌ATCC 29347和惡臭假單胞菌KT 2442菌株和作為底物的辛酸以及對氰基苯氧基己酸或對硝基苯氧基己酸製得的。
與在側鏈中具有烷基的一般的PHA不同，在該報導中公開的PHA在側鏈中具有芳族基團，因此有利於獲得具有源自芳環的物理性質的聚合物。
(c)預計具有包含環己基的單體單元的PHA會表現出不同於具有包含通常的脂族羥基鏈烷酸的單體單元的PHA的聚合物物理性質。Macromolecules，30，1611-1615(1997)中報導了用食油假單胞菌生產的實例。
在該報導中，將食油假單胞菌菌株在含有壬酸和環己基丁酸或環己基戊酸的培養基中培養，以獲得具有包含環己基的單元和衍生自壬酸的單元(比例是未知的)的PHA。
至於產率，其報導在20mmol/L的總底物濃度條件下改變壬酸與環己基丁酸的比例，獲得了如表2所示的結果。表2

CDW幹的細胞重量(mg/L)，PDW幹的聚合物重量(mg/L)，產率PDW/CDW(％)然而，在該實例中，每升培養基所產生的聚合物是不足的，並且所得PHA自身在單體單元中含有衍生自壬酸的脂族羥基鏈烷酸。
已經研究了一類新的PHA，其中產生在側鏈中具有適當官能團的PHA，以便不僅簡單地改變物理性質，而且還通過使用官能團產生新的官能團。
例如，據Macromolecules，31，1480-1486(1996)和Journalof Polymer SciencePart A；Polymer Chemistry，36，2381-2387(19998)中報導，合成具有在側鏈末端包含乙烯基的單元的PHA，然後用氧化劑環氧化，以合成在側鏈末端具有高反應性環氧基團的PHA。
預計產生高反應性的、具有包含硫化物基團而不包含乙烯基的單元的PHA的合成實例是在Macromolecules，32，8315-8318(1999)中報導的PHA，其中通過使用11-苯硫基戊酸(11-phenylsulfanylvaleric acid)作為底物，惡臭假單胞菌27N01菌株產生3-羥基-5-(苯硫基)戊酸與3一羥基-7-(苯硫基)庚酸的PHA共聚物。
如上所述，具有不同組成和結構的可由微生物產生的PHA可通過改變用於生產的微生物的類型、培養基組成以及培養條件來獲得。然而，生產上述PHA僅是為了改善作為塑料的物理性質。
另一方面，由於所引入的取代基的性質，預計具有引入到側鏈中的取代基的上述「不普通的PHA」可用作具有有用功能和性質的「功能高分子」。因此，據信將非常有用和重要的是，開發具有上述功能和生物可降解性的優良聚合物，能夠在細胞中產生聚合物並積聚聚合物的微生物，以及有效地生產高純度聚合物的生物合成方法。
用微生物生產具有引入到側鏈中的任何各種基團的「不普通的PHA」，即具有式(7)所代表的單體單元的PHA的方法一般包括，化學合成具有欲引入的取代基的式(8)所代表的取代的脂肪酸，將所述脂肪酸提供給微生物以進行培養，然後提取所產生的PHA，例如在上述關於食油假單胞菌的實例報導中公開的方法。
其中R代表至少一個選自具有芳環的殘基的殘基，且r代表1-8的任何整數。

其中R代表至少一個選自具有芳環的殘基的殘基，且r代表1-8的任何整數。
然而，在包括化學合成作為底物的取代的脂肪酸並將該取代的脂肪酸提供給微生物的上述一般PHA製備方法中，取代的脂肪酸的羧基是化學反應中的活性基團，因此脂肪酸的化學合成受到了所引入的取代基的類型、數目和位置的很大限制。所以經常需要在化學合成的反應步驟中將活性羧基保護起來，和將羧基脫保護這樣的複雜操作，並因此需要包括幾個步驟的化學反應。因此工業生產水平上的合成很困難，或者合成需要大量時間、勞動和成本。
然而，如果「不普通的PHA」可通過使用與取代的脂肪酸相比更易於化學合成的取代的烷烴作為原料製得，則可以解決上述問題。
由烷烴衍生物製備PHA的常規實例包括使用下述物質作為原料通過微生物來生物合成PHA的實例直鏈烷烴和烯烴(含有雙鍵的烷烴)(Appl.Environ.Microbiol.，54，2924-2923(1988))、氯代烷烴(Macromolecules，23，3705-3707(1990))、氟代烷烴(Biotechnol.Lett.，16，501-506(1994))和含有乙醯氧基殘基的烷烴(Macromolecules，33，8571-8575(2000))。沒有關於使用具有包含芳環作為取代基的殘基的烷烴來合成PHA的實例的報導。

發明內容
為了開發使用與取代的脂肪酸相比易於合成或獲得的原料製備「不普通的PHA」的方法，本發明人們進行了悉心的研究，結果發現，「不普通的PHA」可通過使用與取代的脂肪酸相比易於化學合成的取代的烷烴作為原料製得。該發現導致獲得了使用取代的烷烴製備PHA的新方法。
本發明的使用微生物製備聚羥基鏈烷酸酯的方法包括將能夠產生聚羥基鏈烷酸酯的微生物在包含至少一種選自式(1)所代表的取代的烷烴的原料化合物的培養基中培養，以產生在其分子中具有至少一個選自式(2)所代表的3-羥基取代的鏈烷酸酯單元的單元的聚羥基鏈烷酸酯
R-(CH2)n-CH2-CH2-CH3(1)其中R代表含有取代的芳環的殘基，且n代表1-8的任何整數； 其中R代表含有取代的芳環的殘基，且m代表1-8的任何整數。
在式(1)和(2)中，含有取代的芳環的殘基R是至少一個選自下列的殘基式(3)所代表的取代的苯硫基殘基和式(4)所代表的(取代的苯基甲基)硫基殘基 其中R1代表芳環的取代基，並選自H原子、滷素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C； 其中R2代表芳環的取代基，並選自H原子、滷素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C。
通過下面結合附圖的優選實施方案的描述，本發明的其它目的、特徵和優點將變得顯而易見。
附圖簡述附

圖1是表明在本發明的實施例1中製得的聚羥基鏈烷酸酯的1H-NMR光譜的圖。
具體實施例方式
作為在本發明中用作原料化合物的化合物的第一個實例，至少一種化合物選自式(9)所代表的1-[(取代的苯基)硫基]烷烴。在這種情況下，製得了在其分子中具有至少一個選自式(10)所代表的3-羥基-ω-[(取代的苯基)硫基]鏈烷酸酯單元的聚羥基鏈烷酸酯。
其中R1代表芳環的至少一個取代基，並選自H原子、滷素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C，且n代表1-8的任何整數。

其中R1代表芳環的至少一個取代基，並選自H原子、滷素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C，且m代表1-8的任何整數。
作為在本發明中用作原料化合物的化合物的第二個實例，至少一種化合物選自式(11)所代表的1-{[(取代的苯基)甲基]硫基}烷烴。在這種情況下，製得了在其分子中具有至少一個選自式(12)所代表的3-羥基-ω-{[(取代的苯基)甲基]硫基}鏈烷酸酯單元的聚羥基鏈烷酸酯。
其中R2代表芳環的至少一個取代基，並選自H原子、滷素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C，且n代表1-8的任何整數。

其中R2代表芳環的至少一個取代基，並選自H原子、滷素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C，且m代表1-8的任何整數。
下面詳細地描述本發明方法。本發明製備方法包括這樣一個步驟將微生物在含有至少一種式(9)和(11)所代表的化合物的培養基中培養，以產生在其分子中具有至少一個式(10)和(12)所代表的3-羥基鏈烷酸單元的聚羥基鏈烷酸酯。
在包括培養微生物的步驟，即用微生物產生聚羥基鏈烷酸酯的步驟的上述製備方法中，式(9)或(11)所代表原料的亞甲基鏈長度「h」和存在於通過本發明方法製得的聚羥基鏈烷酸酯分子中的式(10)或(12)所代表單元的亞甲基側鏈長度「m」具有下述關係(1)m＝n-21...(1)其中1是0≤1＜(1/2)n的任何整數。
例如，當使用式(13)所代表的7-(苯硫基)庚烷作為原料時，所製得的聚羥基鏈烷酸酯具有式(14)所代表的3-羥基-7-(苯硫基)庚酸單元和式(15)所代表的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元。

通過本發明方法製得的PHA可在其聚合物分子中含有至少一個式(5)所代表的3-羥基鏈烷酸單元 其中p代表0-8的任何整數，且p在聚合物中可以是一個或多個值，或式(6)所代表的3-羥基烷-5-烯酸單元(6) 其中q代表3-5的任何整數，且q在聚合物中可以是一個或多個值。
通過本發明方法製得的PHA的數均分子量為約5000-1000000。
下面描述本發明中的微生物、培養步驟和收集步驟。
微生物作為本發明方法中使用的微生物，可使用任何微生物，只要滿足下述條件即可通過使用具有式(3)或(4)所代表的含有取代的芳環的殘基的式(1)所代表的取代的烷烴作為原料，即底物原料，可產生在其分子中具有式(2)所代表的3-羥基取代的鏈烷酸酯單元，並且所述單元的側鏈中包含式(3)或(4)所代表的具有芳環的殘基的聚羥基鏈烷酸酯。依據該要求，可以使用可實現本發明目的的多種類型的微生物。
在本發明方法中使用的微生物需要至少具有將烷烴轉化成鏈烷酸的能力，以及還具有由鏈烷酸產生PHA的能力。將烷烴轉化成鏈烷酸的能力一般是由使用烷烴單加氧酶作為引發酶的一組酶體系表現出來的。
假單胞菌屬微生物已知是用於本發明中的微生物。更具體來說，微生物的實例包括由土壤中分離出來的微生物，例如在日本專利特開平2002-178484中公開的菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)YN2菌株，和在日本專利特開平63-226291中公開的食油假單胞菌ATCC 29347。所述YN菌株於1999年6月3日保藏在國立生命科學與人體技術研究所，日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號(郵編306-8566)，保藏號為FERM BP-7375。
培養步驟在本發明製備聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的方法的培養步驟中，在其分子中具有至少一個選自式(2)所代表的3-羥基取代的鏈烷酸酯單元的單元的聚羥基鏈烷酸酯是通過使用能夠產生聚羥基鏈烷酸酯的微生物，由至少一種選自式(1)所代表的取代的烷烴的取代的烷烴產生的。
為了正常地培養在培養步驟中使用的微生物，例如為了製備原料菌株並增殖微生物以獲得產生PHA所需的微生物數目並保證其活性狀態，適當地選擇含有增殖所用微生物所必需的組分的培養基。例如，可以使用任何培養基，例如一般的天然培養基(肉湯培養基、酵母提取物等)、含有營養源的合成培養基等，只要培養基對微生物的生長和存活沒有任何不利影響即可。依據所用的微生物適當地選擇溫度、換氣、攪拌等培養條件。
另一方面，在使用上述產生PHA的微生物產生在其分子中具有至少一個選自式(1)所代表的3-羥基取代的鏈烷酸酯單元的單元的目標PHA的培養步驟中，可使用無機培養基，所述培養基含有至少一種選自相當於單體單元的式(1)所代表的取代的烷烴的取代的烷烴作為產生PHA的原料和用於增殖微生物的碳源。至少一種式(1)所代表且用作原料的取代的烷烴的初始含量優選為佔培養基的0.01％-1％(v/v)、更優選為0.02％-0.2％(v/v)。
作為培養步驟，製備方法可包括在作為烷烴氧化系統誘導物質的二環丙基酮存在下培養微生物的步驟。通常已知的是，烷烴氧化系統是由用作代謝途徑底物的直鏈烷烴例如辛烷、壬烷等有效地誘導的。然而，當使用上述直鏈烷烴作為誘導物質時，必須小心中鏈脂肪酸PHA單元在所生成的PHA中的比例增加這一現象。這是因為直鏈烷烴被烷烴氧化系統轉化成直鏈鏈烷酸，並經由β氧化系統變成PHA單體底物。
用作本發明單體底物的取代的烷烴還可以誘導烷烴氧化系統，並且可作為象直鏈烷烴的PHA單體單元引入。已經開發了烷烴氧化系統作為直鏈烷烴的代謝系統，但是用於本發明的取代的烷烴在某些情況下不足以誘導烷烴氧化系統。
雖然二環丙基酮在烷烴氧化系統中起誘導物質的功能，其不會變成氧化系統的底物(其不被烷烴單加氧酶氧化)。即，已知二環丙基酮已知是不可代謝的誘導物質(Journal of Bacteriology，123，546-556(1975))。因此，在本發明製備方法中，當烷烴氧化系統受誘導不足時，或當希望進一步改善激活時，或者當希望中鏈脂肪酸PHA單元在目標PHA中的比例較低時，二環丙基酮可用作烷烴氧化系統的優選誘導物質。在這種情況下，烷烴氧化系統是通過二環丙基酮有效地誘導，並且底物代謝被完全利用以轉化用於本發明的取代的烷烴。結果可有效地生成源自取代的烷烴的單體單元，從而提高PHA產率以及源自取代的烷烴的單體單元的比例。
二環丙基酮可以與用於本發明的取代的烷烴一起加到培養基中，或者單獨加到培養基中。在這種情況下，二環丙基酮的含量可依據條件例如培養基中增殖底物的類型、存在的取代的烷烴、取代的烷烴的濃度、培養類型(單階段培養或多階段培養)、多階段培養的階段數目等適當地選擇。其含量優選為佔每升培養基的0.001％-1％(v/v)、更優選為0.01％-0.1％(v/v)。
式(1)所代表且用作原料的取代的烷烴一般是疏水性的，並因此無需具有高的水溶解度。然而，上述微生物具有將其中取代的烷烴用作底物的性質，因此即使當取代的烷烴的量超過其溶解度從而在培養的初始階段產生部分懸浮液部分時，在連續的培養期間，取代的烷烴也能逐漸被微生物吸收，從而逐漸溶解在培養基中，所以不會有任何問題。而且，微生物分泌表面活性劑樣物質以將取代的烷烴有效地吸收，因此有助於被用作底物的取代的烷烴的攝取。
為了改善可分散性，根據具體情況，可將式(1)所代表且用作原料的取代的烷烴溶解在溶劑例如1-十六碳烯或正十六碳烷中，或者可作為細分散的懸浮液加到培養基中。在這種情況下，溶劑例如1-十六碳烯或正十六碳烷的濃度必須是3％(v/v)或更低，其中所述百分比是相對於培養基計的。
此外，將由微生物用於增殖的增殖底物單獨加入到培養基中。作為增殖底物，可使用營養物如酵母提取物、蛋白腖或肉提取物。同樣，作為有用碳源，增殖底物可適當地選自糖類、在TCA循環中作為中間物產生的有機酸、在TCA循環中由單階段或二階段生化反應產生的有機酸或其鹽、胺基酸或其鹽、具有4-12個碳原子的直鏈烷烴或其鹽，等等。它們的選擇依所用菌株而定。
作為這些增殖底物的糖類，至少一種化合物優選選自醛糖例如甘油醛、赤蘚糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等；糖醇例如甘油、赤蘚醇、木糖醇等；醛糖酸例如葡糖酸等；醛糖酸例如葡糖酸等；糖醛酸例如葡糖醛酸、半乳糖醛酸等；二糖例如麥芽糖、蔗糖、乳糖等。
作為有機酸或其鹽，至少一種化合物優選選自丙酮酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸及其鹽。作為胺基酸或其鹽，至少一種化合物優選選自穀氨酸、天冬氨酸及其鹽。
在多種增殖底物當中，優選使用多腖(polypeptone)或糖類，特別是，至少一種化合物優選選自葡萄糖、果糖和甘露糖，並用作所述糖類。增殖底物的含量優選為佔培養基的0.1％-5％(w/v)、更優選為0.2％-2％(w/v)。
進行在微生物中產生和積聚PHA的培養步驟的另一方法包括將微生物充分增殖，將細胞轉移到其中限制了氮源例如氯化銨的培養基中，然後將細胞在含有作為目標單元的底物加入的化合物的培養基中進一步培養。在該方法中可提高生產率。例如，可使用包括在不同培養條件下進行的多個步驟的多步驟系統。
更具體來說，優選的兩步培養法包括將微生物在含有式(1)所代表的取代的烷烴和多腖作為碳源的培養基中培養直至達到指數生長後期或穩定期，並通過離心收集細胞的步驟1-1，和將在前一步驟1-1中培養和增殖的微生物細胞在含有式(1)所代表的取代的烷烴以及有機酸或其鹽作為碳源，且不含氮源的培養基中進一步培養的步驟1-2。另一優選的兩步培養法包括將微生物在含有式(1)所代表的取代的烷烴和葡萄糖作為碳源的培養基中培養直至達到指數生長後期或穩定期，並通過離心收集細胞的步驟1-3，和將在前一步驟1-3中培養和增殖的微生物細胞在含有式(1)所代表的取代的烷烴以及葡萄糖作為碳源，且不含氮源的培養基中進一步培養的步驟1-4。另一優選的兩步培養法包括將微生物在含有式(1)所代表的取代的烷烴和多腖作為碳源的培養基中培養直至達到指數生長後期或穩定期，並通過離心收集細胞的步驟1-5，和將在前一步驟1-5中培養和增殖的微生物細胞在含有式(1)所代表的取代的烷烴和糖類作為碳源，且不含氮源的培養基中進一步培養的步驟1-6。
在每一個這些兩步培養法中，在第一個步驟，由式(1)所代表且在細胞增殖期間用作原料的相應的取代的烷烴產生在其分子中含有至少一個選自式(2)所代表的3-羥基取代的鏈烷酸酯單元的單元的PHA。然後在第二個步驟中，將培養的細胞置於主要用於在不含氮源的培養基中產生PHA的培養條件下，由此進一步增加PHA在細胞中積聚的量。
作為有效地誘導包含烷烴單加氧酶作為引發酶的烷烴氧化途徑的物質的二環丙基酮可在步驟1-1和1-2、步驟1-3和1-4或步驟1-5和1-6當中的至少一個步驟中加入，以有效地促進取代的烷烴代謝來產生相應的取代的鏈烷酸，由此提高PHA產率和目標PHA單體單元的比例。
此外，在主要誘導烷烴氧化系統的第一個培養步驟，即步驟1-1、步驟1-3或步驟1-5中，可單獨加入二環丙基酮以代替取代的烷烴。
在培養步驟中，可將溫度設定為足以增殖菌株的溫度。例如，培養溫度適當地為15℃-40℃、更優選為20℃-35℃、最優選為20℃-30℃。
可使用任一種液體培養方法、固體培養方法等，只要所用的微生物可以增殖以由至少一種選自式(1)所代表的取代的烷烴且用作包含在培養基中的原料的取代的烷烴產生在其分子中含有至少一個選自式(2)所代表的3-羥基取代鏈烷酸酯單元的單元的PHA即可。此外，可使用任一種分批培養、補料分批培養、半連續培養、連續培養等，只要適當地供給原料、碳源和氧即可。液體分批培養方法的實例包括其中通過搖動搖瓶來供氧的方法，和其中在使用廣口瓶發酵器的攪拌加氣系統中供氧的方法。
作為用於培養方法的無機培養基，可使用任何培養基，只要其含有增殖微生物所必需的組分即可，例如磷源(例如磷酸鹽等)、氮源(例如銨鹽、硝酸鹽等)等。例如可使用MSB培養基或M9培養基。
下面描述用於本發明方法中的M9培養基的組成。
Na2HPO46.2g
KH2PO43.0gNaCl0.5gNH4Cl 1.0g(每升培養基，pH7.0)為了進一步改善增殖和PHA產量，例如必須加入約0.3％(v/v)的下述微量組分溶液以補償必需的微量元素。
(微量組分溶液)氨三乙酸 1.5gMgSO43.0gMnSO40.5gNaCl 1.0gFeSO40.1gCaCl20.1gCoCl20.1gZnSO40.1gCuSO40.1gAlK(SO4)20.1gH3BO30.1gNa2MoO40.1gNiCl20.1g(每升微量組分溶液，pH7.0)作為上述培養方法，可使用用於培養微生物的任一常規方法，例如成批培養、流動成批培養、半連續培養、連續培養、反應器系統培養、固體培養等。
提取/純化步驟依據本發明，可使用任何常規方法來從產生並積聚PHA的微生物細胞中獲得PHA。通過用有機溶劑提取來從培養的微生物細胞中回收PHA是最簡單的方法。有機溶劑的實例包括氯仿、二氯甲烷、丙酮、二氧雜環己烷、四氫呋喃、乙腈等。
在其中難以使用有機溶劑的環境中，可使用化學處理方法。
在這種情況下，可通過用下述物質處理將除PHA之外的細胞組分除去來回收PHA表面活性劑例如SDS等；酶例如溶菌酶等；或化學物質例如EDTA、氨等。還可以通過用次氯酸鈉將除PHA之外的細胞組分除去來回收PHA，但是結構可能發生改變。此外，可通過物理破碎微生物細胞將除PHA之外的細胞組分除去來回收PHA。在這種情況下，可使用任一種方法例如超聲破碎法、勻化器法、壓力破碎法、玻珠衝擊法、研製法、研磨法和冷凍融解法。
在本發明中，微生物培養、使用微生物產生PHA、PHA在細胞中積聚和從細胞中回收PHA不限於上述方法。
實施例下面描述本發明的實施例。在下面的描述中，除非另有說明，否則「％」是按重量計的。
實施例1製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器除菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中之後以125次衝程/分鐘的速度在30℃培養。48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了96mg PHA。
通過凝膠滲透色譜法(GPC；Toso HLC-8220，柱；Toso TSK-GELSuper HM-H，溶劑；氯仿，聚苯乙烯轉化)測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝125000，且Mw＝278000。用核磁共振儀在下列測定條件下分析PHA測定儀器FT-NMRBruker DPX400
共振頻率1H＝400MHz測定儀器測定核種類1H所用溶劑CDCl3參照物毛細管密封的TMS/CDCl3測定溫度室溫附圖1是1H-NMR光譜圖，表3顯示了鑑定結果(稱為式(16)) 表3化學位移(ppm)積分比例分裂類型鑑定結果1.872H m d2.41-2.56 2H m b2.78-2.91 2H m e5.251H m c6.93-7.14 2H m i7.20-7.45 5H m g，h，j，k
如表3所示，證實了PHA是含有97％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元的PHA。
實施例2製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，並以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了52mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝135000，且Mw＝324000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有63％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例3製備含有0.5％(w/v)穀氨酸鈉的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了200mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝122000，且Mw＝278000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有10％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例4製備含有0.1％(v/v)壬酸的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了70mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝135000，且Mw＝324000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有8％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例5製備含有0.5％(w/v)酵母提取物的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了45mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝138000，且Mw＝331000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有61％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包括具有4-12個碳原子的飽和/不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例6製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下繼續培養90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了65mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝121000，且Mw＝281000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有92％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例7製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下繼續培養48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了58mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝108000，且Mw＝245000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有70％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例8製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖、並且不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了125mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝125000，且Mw＝272000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有87％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例9製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，並通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，向該培養基中加入用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以使得其濃度為0.1％(v/v)，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了147mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝129000，且Mw＝286000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有89％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例10製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了70mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝138000，且Mw＝298000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有96％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例11製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下繼續培養14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖、並且不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了8mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝128000，且Mw＝278000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有94％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例12製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下繼續培養14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖、並且不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了14mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝125000，且Mw＝282000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有88％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例13製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下繼續培養14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了90mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝138000，且Mw＝298000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有90％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例14製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下繼續培養14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷0.1％(v/v)的比例和二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了51mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝121000，且Mw＝283000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有80％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例15製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下繼續培養14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖、並且不含有作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了14mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝119000，且Mw＝245000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有89％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例16製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下培養14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了65mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝137000，且Mw＝299000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有72％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例17製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下繼續培養14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖、並且不含有作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了5mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝118000，且Mw＝262000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有89％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例18製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下繼續培養14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了60mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝110000，且Mw＝262000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有78％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例19製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下繼續培養14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖、並且不含有作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了8mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝121000，且Mw＝278000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有89％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例20
製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下繼續培養14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了30mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝122000，且Mw＝269000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有72％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例21製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。將培養物繼續搖動48小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖、並且不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了121mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝121000，且Mw＝278000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有94％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例22製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。將培養物繼續搖動48小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了115mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝121000，且Mw＝282000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有93％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例23製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。將培養物繼續搖動48小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了51mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝119000，且Mw＝278000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有96％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例24製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下繼續培養14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖、並且不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了160mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝140000，且Mw＝308000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有85％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例25製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。將培養物繼續搖動14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了118mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝138000，且Mw＝312000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有93％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例26製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。在搖動下繼續培養14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖、並且不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了160mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝139000，且Mw＝309000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有86％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例27製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。將培養物繼續搖動14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，之後通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了121mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝141000，且Mw＝302000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有85％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例28製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。將培養物繼續搖動48小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)丙酮酸鈉、並且不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了145mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝135000，且Mw＝288000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有72％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例29製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。將培養物繼續搖動14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)丙酮酸鈉、並且不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了80mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝129000，且Mw＝288000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有81％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例30製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。將培養物繼續搖動14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)丙酮酸鈉、並且不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了80mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝131000，且Mw＝289000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有80％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例31製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。當培養基在600nm的濁度為0.1時，將二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到培養基中，並充分攪拌。將培養物繼續搖動14小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)丙酮酸鈉、並且不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例和二環丙基酮以0.05％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了75mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝131000，且Mw＝292000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有78％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例32將在含有0.1％(w/v)壬酸的M9瓊脂培養基上的YN2菌株的菌落懸浮在無菌生理鹽水中，並將在600nm的濁度控制為1.0。將所得懸浮液鋪在不含碳源並預先製備的40個M9瓊脂培養基平板上，在壬烷氣氛下於30℃進行靜置培養。繼續靜置培養48小時後，收集細胞，然後懸浮在2ml生理鹽水中。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖、並且不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了10mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝128000，且Mw＝282000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有46％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例33將在含有0.1％(w/v)壬酸的M9瓊脂培養基上的YN2菌株的菌落懸浮在無菌生理鹽水中，並將在600nm的濁度控制為1.0。將所得懸浮液鋪在不含碳源並預先製備的40個M9瓊脂培養基平板上，在壬烷氣氛下於30℃進行靜置培養。培養48小時後，收集細胞，然後懸浮在2ml生理鹽水中。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了81mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝131000，且Mw＝301000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有15％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例34製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-[(4-甲基苯基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。將培養物繼續搖動90小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖、並且不含作為氮源的NH4Cl的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-[(4-甲基苯基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了74mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝72800，且Mw＝143000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有40％的3-羥基-5-[(4-甲基苯基)硫基]戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例35製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-(苯硫基)庚烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。在搖動下培養48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了84mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝128000，且Mw＝294000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有40％的3-羥基-5-(苯硫基)戊酸單元、17％的3-羥基-7-(苯硫基)庚酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例36製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-[(4-氟苯基)硫基]戊烷0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。在搖動下培養48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了80mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝118000，且Mw＝252000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有76％的3-羥基-5-[(4-氟苯基)硫基]戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例37製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-[(4-氰基苯基)硫基]戊烷0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。在搖動下培養48小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-[(4-氰基苯基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了45mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝68000，且Mw＝137000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有12％的3-羥基-5-[(4-氰基苯基)硫基]戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例38製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-[(4-硝基苯基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。將培養物繼續搖動90小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-[(4-硝基苯基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了20mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝68000，且Mw＝137000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有5％的3-羥基-5-[(4-硝基苯基)硫基]戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例39製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-[(苯基甲基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。培養48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了61mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝38000，且Mw＝75000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有72％的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫基]戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例40製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-[(苯基甲基)硫基]戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。培養48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了58mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝29000，且Mw＝57000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有81％的3-羥基-5-[(苯基甲基)硫基]戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例41製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-{[(4-氟苯基)甲基]硫基}戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。培養48小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了80mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝28000，且Mw＝55000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有73％的3-羥基-5-{[(4-氟苯基)甲基]硫基}戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例42
製備含有0.5％(w/v)多腖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-{[(4-氰基苯基)甲基]硫基}戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。將培養物繼續搖動48小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-{[(4-氰基苯基)甲基]硫基}戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了26mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝32000，且Mw＝66000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有12％的3-羥基-5-{[(4-氰基苯基)甲基]硫基}戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
實施例43製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-{[(4-硝基苯基)甲基]硫基}戊烷以0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將菊苣假單胞菌YN2菌株接種到培養基中，通過以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動來進行培養。培養90小時後，通過離心收集細胞。
然後，製備含有0.5％(w/v)葡萄糖的200mL M9培養基，置於500mL搖瓶中，然後通過高壓釜滅菌。將搖瓶冷卻至室溫後，將用濾器滅菌的1-{[(4-硝基苯基)甲基]硫基}戊烷0.1％(v/v)的比例加到該培養基中，並充分攪拌。然後將收集的細胞再懸浮在該培養基中，以125次衝程/分鐘的速度在30℃搖動培養物。90小時後，通過離心收集細胞，用冷的甲醇洗滌一次，然後冷凍乾燥。
將冷凍乾燥的離心團懸浮在20mL氯仿中，在60℃攪拌20小時以提取PHA。將所得提取物經由孔徑為0.45μm的膜濾器過濾，用旋轉蒸發儀濃縮，然後將濃縮的溶液在冷的甲醇中再沉澱。此外，僅回收沉澱物，然後真空乾燥，獲得了10mg PHA。
通過按照與實施例1所述相同的方法進行的GPC分析測定由此獲得的PHA的分子量。結果是Mn＝26000，且Mw＝53000。按照與實施例1所述相同的方法進行的PHA的1H-NMR分析的結果證實了所得PHA含有5％的3-羥基-5-{[(4-硝基苯基)甲基]硫基}戊酸單元和包含具有4-12個碳原子的飽和或不飽和3-羥基鏈烷酸的其它單元。
雖然已經用優選的實施方案描述了本發明，但是應當理解，本發明不限於這些公開的實施方案。相反，包括在權利要求書實質和範圍內的各種不同的變型和等同方案都包括在本發明範圍內。權利要求書的範圍與最寬的解釋一致，這樣包括所有這樣的變型和等同結構以及功能。
權利要求
1.使用微生物製備聚羥基鏈烷酸酯的方法，所述方法包括將能夠產生聚羥基鏈烷酸酯的微生物在包含至少一種選自式(1)所代表的取代的烷烴的原料化合物的培養基中培養，以產生在其分子中具有至少一個選自式(2)所代表的3-羥基取代的鏈烷酸酯單元的單元的聚羥基鏈烷酸酯R-(CH2)n-CH2-CH2-CH3(1)其中R代表含有取代的芳環的殘基，且n代表1-8的任何整數； 其中R代表含有取代的芳環的殘基，且m代表1-8的任何整數；其中在式(1)和(2)中，含有取代的芳環的殘基R是至少一個選自下列的殘基式(3)所代表的取代的苯硫基殘基 其中R1代表芳環的取代基，並選自H原子、滷素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C；和式(4)所代表的(取代的苯基甲基)硫基殘基 其中R2代表芳環的取代基，並選自H原子、滷素原子、CN、NO2、CH3、C2H5、CH3CH2CH2、(CH3)2CH和(CH3)3C。
2.權利要求1的方法，其中式(1)中的n與式(2)中的m具有下述關係(1)m＝n-21...(1)其中1代表0≤1＜(1/2)n的任何整數。
3.權利要求1的方法，其中所述聚羥基鏈烷酸酯在其聚合物分子中具有式(2)所代表的單元以及式(5)所代表的3-羥基鏈烷酸單元和式(6)所代表的3-羥基烷-5-烯酸單元當中的至少一個 其中p代表0-8的任何整數，且p可以是一個或多個值， 其中q代表3-5的任何整數，且q可以是一個或多個值。
4.權利要求1的方法，其中所述聚羥基鏈烷酸酯的數均分子量為5000-1000000。
5.權利要求1的方法，其中還包括將微生物在含有二環丙基酮的培養基中培養的步驟。
6.權利要求1的方法，其中所述培養基含有多腖。
7.權利要求1的方法，其中所述培養基含有酵母提取物。
8.權利要求1的方法，其中所述培養基含有糖類。
9.權利要求8的方法，其中所述糖類是至少一種選自下列的化合物甘油醛、赤蘚糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、甘油、赤蘚醇、木糖醇、葡糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、麥芽糖、蔗糖和乳糖。
10.權利要求1的方法，其中所述培養基含有有機酸或其鹽。
11.權利要求10的方法，其中包含在培養基中的有機酸或其鹽是至少一種選自下列的化合物丙酮酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸及其鹽。
12.權利要求1的方法，其中所述培養基含有胺基酸或其鹽。
13.權利要求12的方法，其中所述包含在培養基中的胺基酸或其鹽是至少一種選自下列的化合物穀氨酸、天冬氨酸及其鹽。
14.權利要求1的方法，其中所述培養基含有具有4-12個碳原子的直鏈鏈烷酸或其鹽。
15.權利要求1的方法，其中培養微生物的培養步驟包括以下兩個步驟(1)將微生物在含有至少一種選自式(1)所代表的取代的烷烴的取代的烷烴和多腖的培養基中培養；和(2)將在步驟(1)中培養的微生物在含有至少一種選自式(1)所代表的取代的烷烴的取代的烷烴和有機酸或其鹽的培養基中進一步培養。
16.權利要求1的方法，其中培養微生物的培養步驟包括以下兩個步驟(3)將微生物在含有至少一種選自式(1)所代表的取代的烷烴的取代的烷烴和糖類的培養基中培養；和(4)將在步驟(3)中培養的微生物在含有至少一種選自式(1)所代表的取代的烷烴的取代的烷烴和糖類的培養基中進一步培養。
17.權利要求1的方法，其中培養微生物的培養步驟包括以下兩個步驟(5)將微生物在含有至少一種選自式(1)所代表的取代的烷烴的取代的烷烴和多腖的培養基中培養；和(6)將在步驟(5)中培養的微生物在含有至少一種選自式(1)所代表的取代的烷烴的取代的烷烴和糖類的培養基中進一步培養。
18.權利要求15的方法，其中還包括將微生物在含有二環丙基酮的培養基中培養的步驟。
19.權利要求1的方法，其中所述微生物具有烷烴單加氧酶。
20.權利要求19的方法，其中所述微生物是菊苣假單胞菌YN2；FERM RP-7375。
全文摘要
本發明提供了有效地製備在其單體單元中具有芳族基團取代的殘基的聚羥基鏈烷酸酯的方法。在使用微生物製備聚羥基鏈烷酸酯的方法中，將能夠產生聚羥基鏈烷酸酯的微生物在包含至少一種選自式(1)所代表的取代的烷烴的原料化合物的培養基中培養，以產生在其分子中具有至少一個選自式(2)所代表的3－羥基取代的鏈烷酸酯單元的單元的聚羥基鏈烷酸酯R——(CH
文檔編號C12P7/62GK1495215SQ0312327
公開日2004年5月12日 申請日期2003年4月25日 優先權日2002年4月26日
發明者見目敬, 須川悅子, 矢野哲哉, 今村剛士, 本間務, 哉, 士, 子 申請人:佳能株式會社