血小板活化因子受體在治療黃病毒科病毒引起的感染中的用途的製作方法

2023-05-22 05:48:16 3

專利名稱：血小板活化因子受體在治療黃病毒科病毒引起的感染中的用途的製作方法
技術領域：
本發明提出了一個在醫療救助中使用的已知產品的新藥用於治療由黃病毒科病 毒引起疾病，主要用於治療登革熱和出血性登革熱(HDF)。
背景技術：
登革熱由包膜病毒中的黃病毒科的病毒引起。黃病毒屬是重要的人類病原體，它 在世界各地普遍存在。至少有39種黃病毒屬病毒與人類疾病有關，包括登革熱和黃熱病。 相關病理引起出血、休克、腦炎和發熱性疾病。具體到登革熱而言，其有四個血清型，且該基因組由約11000鹼基的單鏈RNA構 成。翻譯的基因組產生一個大的多蛋白，它由病毒酶和宿主進行共同翻譯加工生成三個結 構蛋白(C，M和E蛋白)和七個非結構蛋白(NSl，NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5)參 與病毒複製(Chambers TJ, Hahn CS, Galler, R, Rice, CM. (1990).黃病毒基因組組構、表 達禾口複製(Flavivirus genome organization, expression and replication). Annu. Rev. Microbiol. ,44 =649-688)。人類是登革熱病毒的主要宿主，其主要通過有傳染性的伊蚊屬 ±矣及伊蚊的雌性蚊子叮咬傳播(Mukhopadhyay S,Kuhn RJjRossmann MG. (2005).黃病毒屬 生命周其月的結構透視(A structural perspective of the flavivirus life cycle). Nat Rev Microbiol. 3，13-22)。登革熱的臨床表現有兩個最相關的形式，典型形式和出血形式。恢復可持續幾個 星期，在此期間，患者表現出乏力的現象。典型登革熱可能無症狀，或者患者可能存在包括 發高燒、頭痛、後眼窩痛、肌肉痛、關節痛、噁心和嘔吐、腹瀉、體位性低血壓、腹痛、腰痛和下 肢疼痛症狀。典型登革熱普遍被稱為「破骨熱」。此外，可能會發生皮膚和黏膜的改變，如瘀 斑。即使是在典型形式病例中，也可出現出血，例如鼻出血、牙齦出血和消化道出血。典型 形式通常持續6至8天(從米納斯吉拉斯州國家健康秘書處獲得的數據)。登革出血熱和登革休克症候群是最嚴重的登革熱感染表現，且起初表現出與典型 形式相同的症狀。出血現象發生在疾病第二或第三天，並主要表現為皮膚和消化道出血； 子宮出血、鼻出血、牙齦出血且也可能發生其他部位的出血。內皮細胞損傷和感染繼發的白 細胞及血小板活化形成了出血性登革熱的病理生理基礎。白細胞、血小板和內皮細胞的活 化導致血小板減少和血管通透性增加。後者導致血細胞比容增加和血壓下降和低血容量性 休克。因此，與重症登革熱相關的主要問題——休克和失血性表現——是感染過程中先天 免疫系統的過度激活(Halstead，SB. (2003).抗體、巨噬細胞、登革病毒感染、休克和出血 致病串聯(Antibody, macrophages, dengue virus infection, shock and hemorrhage -.a pathogenic cascade) · Rev. Infect. Dis. 11 :S830_S839) (Rothman A. L. (2003).登革熱疾 病的免疫學禾口免疫發病機理(Immunology and immunopathogenesis of dengue disease). Adv. Virus Res. 60 :397_419)。登革熱病是目前影響人類的最重要的蟲媒病毒病，代表了世界上嚴重的公共衛生 問題。據來自世界衛生組織(WTO)的估計，除了歐洲，每年在各個大洲的100多個國家有5000萬至1億人受到感染。約55萬名病人需要住院，且20000人死於登革熱。在巴西對於埃及伊蚊擴張的有利的社會環境條件使傳染媒介的傳播以及疾病的 發展成為可能，自從它於1976年被重新傳入該國。在該國和該大洲採用傳統的針對媒介傳 染病的化學防治方法未能對其重新傳入進行充分的控制。其後在1996年，巴西衛生部回顧 了其政策戰略，並提出了一個叫做 Programa de ErradicaDaO do Aedes Aegypti-PEAa 的根除計劃(埃及伊蚊的根除方案)。在實施計劃時，短期和中期根除蚊子在技術上被證明 不可行，因為PEAa對疾病的流行病學複雜性完全無法反應。在巴西和其他國家獲得的結果——沒有證據顯示在短期內根除傳染媒介——這 已引起巴西衛生部著手進行對這種政策的進展和障礙的新的評估，以建立一個新的包括其 他元素例如社會動員和社區承擔的計劃，對充分防治一種高度地以家庭為基地的傳染媒介 來說，這被認為是必不可少的。在上世紀90年代，血清型3型傳入了巴西，在僅僅三個月期間迅速傳播到巴西八 個州。高流行性風險，伴隨出血性登革熱(HDF)的發病率升高，顯示了新的血清型和病毒品 種如何輕易地隨著日常移動人口循環的。本領域技術狀況是能夠提供對傳染媒介的控制技術——該傳染煤介也傳播黃熱 病一以及與登革熱相關症狀的治療方法。巴西專利PI023907-9提出了蚊子傳播登革熱的監測系統，採用陷阱、軟體和掌上 電腦用於捕獲和分析風險地區的昆蟲。在陷阱裡——叫做蚊子陷阱(mosquitrap)——一種 人工合成的氣味釋放物質atraedes放置在裝有水的黑色瓶子的底部，用以模仿蚊子的溫 床，以吸引雌蚊產卵。當被Atraedes吸引，昆蟲進入陷阱，並被瓶壁的黏蟲卡捕獲。一個星 期後，受過訓練能夠鑑定埃及伊蚊成體的衛生人員計算捕獲蚊子的數量。不需要昆蟲的實 驗室鑑定。專利W02004037272描述了旨在作為登革熱感染抑制劑的藥物，其特徵是作為活 性成分的碳水化合物分子的基本組分是寡糖鏈。申請號W02005/069717的專利提出了一種登革出血熱的治療技術，能立即導致血 小板的增加。美國專利6，696，281描述了一種針對黃病毒屬的含有減毒病毒的疫苗。在WO 2003/049672描述了用於治療黃病毒屬介導疾病的方法和化合物。WO 2004/084796提供了用於黃病毒科感染治療的組分及其治療方法。US 6，172053專利報告 了用於治療病毒性疾病的治療化合物及其配方。美國專利號7，148，248介紹了治療或抑制炎症或敗血症發展的方法。該技術旨在 用作白三烯C4和D4拮抗劑，通過增加毛細血管通透性和血液中白細胞外溢來治療或抑制 炎症或敗血症。專利US 7，151，082提出用於治療炎症狀況的一種HMGl拮抗劑。這項技術包括藥 物化合物和敗血症治療方法，包括感染性休克和急性呼吸窘迫症候群，以及監測或診斷敗 血症的嚴重程度或潛在致死率的方法。對登革熱病例的臨床操作可歸納為如下順序i)呈現毛細血管脆性試驗陽性 和/或其他輕度出血表現的病人在實驗室有人協助，並進行血小板計數， )檢測到血細 胞比容增加和/或血小板計數減少(<或等於100.000/mm3)；治療包括胃腸外補水聯合 dipir0ne(僅在巴西使用)和對乙醯氨基酚給藥；持續評估任何惡化跡象，如果有必要臨床評價至少每小時6次和實驗室檢驗(HT，血小板計數，胸部X光透視)；c)患者呈現低血壓、 意識喪失或休克跡象給予胃腸外再補水的流動救助和具體的血清學分析。由於沒有登革熱的特異療法，對醫療救助的方案僅限於檢查疼痛和發燒，補水的 流動救助和鎮痛，同時通知VigilSncia Epidemiol □ gica Distrital (地區流行病學警 戒機構)。對這種疾病發病機制的知識缺乏阻礙了登革熱的特異療法的發展。事實上， 通過這樣的病毒感染導致該疾病的出血型的主要機制是有爭議的。對比假說將病情 的嚴重程度既歸因於病毒因素，也歸因於宿主因素(Rosen，L. (1997).皇帝的新裝重 訪，或登革出血熱發病機制的回聲(The Emperor『 s New Clothes revisited, or the reflections on the pathogenesis of dengue hemorrhagic fever). Am. J. Trop. Med. Hyg. 26 :337-343.Halstead, S. B. (1979).恆河猴體內被動轉移抗體增強的登革病毒感染 (In vivo enhancement of dengue virus infection in rhesus monkeys by passively transferred antibody). J. Infect. Dis. 140 :527_533 ；Rothman A. L(2003).登革熱病的免 疫學禾口免疫發病機理(Immunology and immunopathogenesis of dengue disease). Adv. Virus Res. 60 :397_419)。秘魯和斯裡蘭卡最近的研究表明了出血型與病毒基因型之間的關聯。一些特定的 解釋這種關聯的遺傳標記被繪製(Watts DM, Porter KR, Putvatana P, Vasquez B, Calampa C, Hayes CG, Halstead SB. (1999).美洲登革熱基因型2繼發感染的失敗引起登革出血 熱(Failure of secondary infection with American genotype dengue 2 to cause dengue hemorrhagic fever). Lancet 354 :1431-1434 ;Messer, WB, Gubler, DJ.Harris, E.，Sivananthan, K.，da Silva, A.M. (2003).登革熱血清型3型，子集病毒III的出現和 全球蔓延(Emergence and global spread of dengue serotype 3, subset III virus). Emerg. Infect. Dis. 9 :800_809 ；Messer WB, Vitarana UT, Sivananthan K, Elvtigala J, Preethimala LD, Ramesh R, Withana N, Gubler DJ, De Silva AM. (2002).在斯裡蘭卡出 現登革出血熱的疫情前後的登革熱流行病學(Epidemiology of dengue in Sri Lanka before and after the emergence of epidemic dengue hemorrhagic fever). Am. J. Trop. Med. Hyg. 66 :765_773)。然而，要考證登革熱毒力真正取決於這種遺傳因素或其他機制證明是困難的。流 行病學研究發現，登革出血熱臨床毒現風險增加和另一種登革病毒株繼發感染之間存在關 聯(Halstead 等，1979 ；Guzman 等，1990，Rothman A. L. (2003)。這一流行病學發現表明，宿主免疫應答在決定疾病嚴重形式的發展中起著重要的 病理生理學作用。已經提出的由不同血清型首次感染後促進病重的幾種機制包括免疫複合 物沉積、抗體與血管內皮交叉的反應、抗體介導的感染的加強、補體系統及其產物的激活， 可溶性介質的加劇釋放，如細胞因子(Chatuverdi等，2000 ；Lin等，2005 ；Halstead, 1979 ； Halstead, 1989 ；Morens,1994 ；Theofipoulos 等，1976 ；Bokisch 等，1973 ；Malasit,1987 ； Chungue 等，1994，Falconar, 1997 ；Markoff 等，1991 ；Libraty,等，2002 ；Kurane 等，1994 ； Mangada 等，2004)。其他研究研究了與疾病嚴重程度相關的因素，包括年齡、遺傳和宿主的營養狀況； 雖然解釋病重的機制尚未研究(Rothman，2003)。因此，對登革熱感染和疾病的發病機制的更好了解在探索其特異並有效的治療方法中是不可缺少的。研究採用登革熱的實驗模型——該實驗模型模擬了嚴重型的幾個方面，包括致 死、組織出血、血小板減少和血液濃縮——用於發現本發明所述PAF受體拮抗劑的新用途。本分析旨在有助於表明，登革熱出血熱的病理生理學表現(異常免疫應答伴隨血 管通透性增加、血細胞比容增加、血壓降低、低血容量性休克和血小板減少)與感染性休克 中所觀察到的表現非常相似(Halstead，2003 ；Rothman, 2003 ；Sommers, M. S. (2003).感染 性休克的細胞基礎(The cellular basis of septic shock)Crit. Care Nurs Clin. North. Am. 15(1) :13-25)。因此，研究在登革熱感染的發病機制中出現的全身炎症應答症候群的有 關介質的作用是恰當的。在這些介質中，應加以強調血小板活化因子(PAF)。通過使用對血小板活化因子受 體(PAFR)具有拮抗作用的化合物可以阻斷PAF的功能。除了這些PAFR拮抗劑，PAF的功 能可以通過給予一種叫做PAF乙醯水解的重組酶來阻止。這種酶代謝PAF，從而防止代謝掉 的PAF與其PAFR結合。全身給予血小板活化因子的主要蚊應是血管舒張和增加血管通透性，這會導致低 血壓和血小板減少。這些發現與登革出血熱中的發現類似。此外，先前的研究表明，在登革 熱感染人巨噬細胞時PAF被釋放，因此提出了介質在人類疾病中的假定作用(Yang KD, Lee CS, Shaio MF.體外異源繼發登革2型病毒感染時血小板活化因子更高的產生量(A higher production of platelet activating factor in ex vivo heterologously secondary dengue-2 virus infections). Acta Microbiol Immunol Hung. 1995 ；42 (4) :403_7)。血小板減少普遍發現存在於登革病毒感染患者中。事實上，一些研究表明，在所有 受感染病人中有70%患者在疾病過程中呈現血小板減少。血小板計數最低的病人似乎存在 發展為該疾病更嚴重型的更高的風險。受體拮抗劑治療顯著地抑制了血小板減少和血液濃 縮在受感染動物中的發展。PAF受體拮抗劑治療也有效阻斷了登革病毒引起的實驗性感染 的致死可能性。這些數據表明，由於觀察到其防止登革熱感染更嚴重的形式，PAF受體拮抗 劑治療對於所有這些感染者的治療可能是有益的。最後，數據表明，PAF受體拮抗劑治療——即使在感染數天後——能夠防止動物死 亡並阻礙頻繁的臨床改變，如血小板減少和血液濃縮。這樣的結果支持了 PAF受體在登革熱感染髮病機制中的參與，也支持了炎症介質 在該病中的參與。在其各種生物效應中，已知PAF誘導血小板聚集以及白細胞和內皮細 胞的活化。這些參數是宿主對登革病毒感染反應的重要特徵(HalStead，2003 ;Rothman， 2003)。因此，對於本發明，通過實驗以證實PAFR拮抗劑用於登革熱感染的治療的新用 途。動物分別用載體或血小板活化因子受體拮抗劑治療，並評估感染和炎症參數，如以下的 實施例所示。實施例1實驗室研究表明，感染登革病毒的小鼠(登革熱血清型_2，GeneBank登錄號 AY927231)顯示的臨床表現和實驗室變化與嚴重型登革熱病人中的發現類似，包括登革熱 引起的出血熱和休克症候群。可以看出，小鼠在受到更多的病毒接種時，死亡與病毒接種量 呈現依賴性(

圖1所示為CFU-菌落形成單位)。
實施例2登革病毒感染引起的血小板減少和血液濃縮(圖2)，這在登革熱患者中，主要是 發展為更嚴重疾病形式的患者中經常發現。實施例3除了上述表現，登革熱感染的小鼠表現出了與人類感染相一致的其他改變，包括 循環細胞因子，特別是名為腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和幹擾素-γ (IFN-γ )的細胞因子 水平的提高(圖3)。實施例4登革病毒感染的動物的組織也有明顯改變，包括受感染動物的肝臟。圖4中，受感 染的動物的肝實質觀察到大量的血細胞(用箭頭表示)，這與人類出血性登革熱觀察到的 出血是一致的。實施例5感染後第7天或8天時出現死亡，此時是機體免疫反應的頂峰。另一方面，感染病 毒後第三天動物顯示了可察覺的疾病症狀形式。圖5顯示，動物對疼痛刺激的敏感度明顯 提高，這與報導的人類登革熱的疼痛是密切相關的。登革熱公知為「破骨熱」。同樣，用PAF 受體拮抗劑治療部分預防了受登革病毒感染的動物死亡。實施例6使用動物模型以驗證通過特異性的PAF受體拮抗劑進行阻斷將能夠改善登革熱 病毒實驗性感染的假說。初步研究表明，每日用血小板活化因子受體拮抗劑(aPAFR)治療 能夠防止該病毒引起的死亡。這明顯表明，感染開始後3天(3-10)或者5天(5-10)內每 日用血小板活化因子受體拮抗劑治療與感染前(0-1)開始治療同樣能夠有效地防止動物 死亡。感染後7天(7-10)開始治療時，這時已觀察到一些致死，能夠部分有效地防止動物 死亡。總之，該數據表明PAF受體拮抗劑治療能夠防止受感染動物的死亡，不僅是在預防給 藥方式中給予，還是在治療時給予，即在症狀出現後給藥(圖6)。正如圖5所示，從感染開 始的第三天動物的症狀就顯著了。儘管PAF受體拮抗劑治療防止死亡以及更相關的臨床和病理改變，但是在載 體一一和PAFR拮抗劑——治療動物中的病毒血症並沒有改變。事實上，數據表明，血小板 活化因子受體拮抗劑治療的動物的病毒血症較輕，這可能是繼發於與動物較好的綜合臨床 狀態相關的更好的免疫應答。實施例7受登革病毒血清型2型感染的動物用血小板活化因子受體拮抗劑治療後，與進行 了相同的接種感染的動物並用載體治療的動物相比，顯示了較輕的臨床症狀。圖7的圖表 顯示，受感染動物中血小板減少的數量和接受PAF受體拮抗劑的受感染動物中血小板減少 的預防。該圖還顯示由於血管通透性增加而引起的受感染動物血細胞比容增加，這是血液 濃縮的標誌。PAFR拮抗劑治療還防止了在血液濃縮上的變化。附圖簡述圖1 登革病毒感染誘導的小鼠接種依賴性死亡。死亡通常在感染後第7天觀察 到。該圖顯示了在感染後給定天數存活的動物數量。圖2 登革病毒感染誘導的細胞因子TNF- α和IFN- γ血清中水平的提高。細胞因
7子在血漿中首次檢測到是感染後第5天，而在第7天，即首次觀察到死亡的時間達到峰值。圖3 登革病毒感染誘導的血液中血小板減少(血小板數量下降)，以及血細胞比 容增加(血液濃縮的一種標記)。在感染後第3天首次觀察到血小板數量的下降，而在第5 天首次檢測到血液濃縮。圖4:蘇木精和曙紅染色的來自於未感染小鼠(左)和感染登革病毒的小鼠感染 後第7天的肝臟切片。注意到組織中明顯存在的紅血細胞(箭頭)，這是出血的表現。還注 意到肝變性區(依稀染色)。圖5 登革病毒感染誘導了高傷害性感受(hypernocic印tion)增加，這是疼痛的 實驗性標記，在感染後第3天首次觀察到。因此，感染導致的首個症狀是在第3天首次發現 的。圖6 用PAFR拮抗劑的治療預防了與登革病毒感染相關的死亡。該圖顯示了在感 染後給定天數存活的動物數量。圖7 用PAFR拮抗劑的治療預防了登革熱感染的動物在第7天觀察到的血小板減 少(血小板數量下降)和血液濃縮(血細胞比容增加)。
權利要求
1.血小板活化因子受體拮抗劑用於治療黃病毒科病毒引起的感染的用途，包括用在醫 療領域中已知的產品製成的新的藥物以治療由黃病毒科病毒引起的感染性疾病。
2.根據權利要求1的血小板活化因子受體拮抗劑用於治療黃病毒科病毒引起的感染 的用途，包括用在醫療領域中已知的產品製成的新的藥物，治療由黃病毒科病毒引起的感 染性疾病，包括登革熱。
3.根據權利要求1的血小板活化因子受體拮抗劑用於治療黃病毒科病毒引起的感染 的用途，包括用在醫療領域中已知的產品製成的新的藥物，治療由黃病毒科病毒引起的感 染性疾病，包括登革熱引起的登革出血熱和登革休克綜合症。
4.根據權利要求1的血小板活化因子受體拮抗劑用於治療黃病毒科病毒引起的感染 的用途，包括用在醫療領域中已知的產品製成的新的藥物給予哺乳動物。
5.根據權利要求1的血小板活化因子受體拮抗劑用於治療黃病毒科病毒引起的感染 的用途，包括用在醫療領域中已知的產品製成的新的藥物，其特徵是通過靜脈內，肌內注 射，口服，皮下，經皮或腹膜內給藥。
6.根據權利要求1的血小板活化因子受體拮抗劑用於治療黃病毒科病毒引起的感染 的用途，包括用在醫療領域中已知的產品製成的新的藥物，其特徵是在藥物配方中含有的 PAF受體拮抗劑具有足以治療來自黃病毒科病毒引起感染的有效藥濃度範圍。
7.血小板活化因子受體拮抗劑用於治療黃病毒科病毒引起的感染的用途，包括用在醫 療領域中已知的產品製成的新的藥物，其特徵是血小板活化因子受體拮抗劑可選自下列物 質 UK-74505、SDZ 64-412、SDZ 64-688、SR27417A、Y-24180、WEB2086、WEB2170、BN50730、 BN52501、SM-1066U PCA-4246、ABT-491、BB_882(來昔帕泛)、TCV-309 及其非限制性衍生 物。
8.根據權利要求7的血小板活化因子受體拮抗劑用於治療黃病毒科病毒引起的感染 的用途，其特徵是它們可以與治療黃病毒科類病毒感染的其他藥物一起給藥。
全文摘要
本發明涉及PAF受體拮抗劑在治療黃病毒科病毒引起的感染，主要是登革熱和出血性登革熱以及休克中的用途。
文檔編號A61P31/12GK102123706SQ200880130787
公開日2011年7月13日 申請日期2008年6月17日 優先權日2008年6月17日
發明者D·D·G·德蘇扎, M·M·特謝拉 申請人:米納斯吉拉斯聯合大學