具有肌醇六磷酸酶活性且該酶活性的溫度穩定性增強的多肽及編碼所述多肽的核苷酸序列的製作方法

2023-05-13 18:58:01

專利名稱：：具有肌醇六磷酸酶活性且該酶活性的溫度穩定性增強的多肽及編碼所述多肽的核苷酸序列的製作方法
技術領域：
：本發明涉及編碼一多肽的重組DNA分子以及^^皮編碼多肽自身，所述多肽具有肌醇六磷酸酶活性並且該酶活性的溫度穩定性增強且蛋白水解穩定性增強。具體而言，本發明涉及編碼一多肽的重組DNA分子，所述多肽具有肌醇六磷酸酶活性並且該酶活性的溫度穩定性被增強且蛋白水解穩定性被增強，其中所述DNA序列通過改變成熟的野生型大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列獲得，該DNA序列與野生型序列相比，確定胺基酸位置發生改變或者使該序列分別具有N端和/或C端延長。本發明還涉及一種表達重組肌醇六磷酸酶的方法及該肌醇六磷酸酶在食品和動物飼料技術中的用途。
背景技術：
：肌醇六磷酸或肌醇-l，2,3，4，5,6-六磷酸二氫鹽(縮寫為肌醇-六磷酸鹽)是植物種子中肌醇的主要來源以及磷酸鹽的主要貯藏形式。在豆科植物的種子中，磷酸鹽含量的約70%以肌醇六磷酸的鉀鹽、鎂鹽和鈣鹽的混合物形式存在。種子、穀類和豆科植物是食品和飼料製品尤其是動物祠料製品的重要組成，同時在人類營養學中，穀類和豆科植物也變得越來越重要。肌醇六磷酸的磷酸單位與二價和三價的陽離子(即營養生理學上重要的離子例如鈣、鐵、鋅和鎂以及微量元素錳、銅和鉬)結合成為複合物。此外，肌醇六磷酸還經由靜電相互作用結合某些範圍內的蛋白。通常，由於肌醇六磷酸及其鹽肌醇六磷酸鹽不會被代謝，因為它們不會被胃腸道吸收；也就是說，從營養生理學層面上講，不管是其中所含有的磷還是被螯合的金屬離子還是所結合的蛋白均得不到利用。由於磷是所有生物體生長的必需元素，因而必須向食品和動物飼料中補充無機磷。通常，還必須補充營養生理學方面必需的離子，如鐵或6鈣。另外，由於蛋白被肌醇六磷酸結合，因而每種飲食在營養生理學層面上的價值有所減少。因此，肌醇六磷酸通常被描述為營養對抗因子。另外，由於肌醇六磷酸不會被代謝，因此肌醇六磷酸鹽的磷經由動物的胃腸道被排出，致使對環境造成不受歡迎的磷酸鹽汙染，這會引起例如水體富營養化並造成海藻的過度生長。肌醇六磷酸或肌醇六磷酸鹽(除非另外指出，否則這些術語在下文中用作同義詞)可由肌醇六磷酸酶分解。肌醇六磷酸酶催化肌醇六磷酸鹽水解成為肌醇和/或單磷酸鹽、二磷酸鹽、三磷酸鹽、四磷酸鹽和/或五磷酸鹽以及無機磷酸鹽。人們區分出兩種不同形式的微生物肌醇六磷酸酶1)3-肌醇六磷酸酶/肌醇六磷酸鹽-3-磷酸水解酶，EC3.1.3.8;2)6-肌醇六磷酸酶/肌醇六磷酸鹽-6-磷酸水解酶，EC3.1.3.26。3-肌醇六磷酸酶優選地首先水解3位的酯鍵，而6-肌醇六磷酸酶優選地首選水解6位的酯鍵。含有肌醇六磷酸的植物種子含有內源性肌醇六磷酸酶。在消化該植物種子時，食品或動物祠料中的肌醇六磷酸鹽理論上能被內源性植物肌醇六磷酸酶、來自腸內孩i生物區系的肌醇六磷酸酶以及來自腸黏膜的肌醇六磷酸酶水解。然而，事實上，內源性植物肌醇六磷酸酶和存在於腸內的肌醇六磷酸酶一一如若存在一一的水解潛力顯然不足以顯著地確保肌醇六磷酸鹽所結合的磷的生物利用度。因此，通常將外源性肌醇六磷酸酶加入食品和動物飼料中。肌醇六磷酸酶可由植物和微生物產生。在微生物中，產生肌醇六磷酸酶的細菌以及產生肌醇六磷酸酶的真菌和酵母是已知的。然而，天然存在的肌醇六磷酸酶生產者具有這樣的缺點，即肌醇六磷酸酶僅以一定的量並以確定的特徵形成。但是，正如上文所述，對肌醇六磷酸酶的需求尤其是食品和動物飼料產業對其的需求正與日俱增。儘管食品和動物飼料產業對肌醇六磷酸酶的需求與日俱增，並且肌醇六磷酸酶的使用也可能是有利的，但是僅有少數已知的肌醇六磷酸酶廣為食品和動物銅料產業所接受。普遍的關注點涉及到相對高的生產成本和/或該酶在所需施用環境中的穩定性或者活性較差。此外，為了在工業上得到使用，這類酶不得不達到某些標準。這些標準包括高度特異的總體活性、較低的最佳pH、對胃腸蛋白酶的抗性以及溫度穩定性即熱穩定性。溫度穩定性是工業應用成功的一個重要先決條件，這是因為例如在制粒過程中酶會被暴露於溫度60。C-95。C之間。所有已知的微生物肌醇六磷酸酶在溫度56°C-78°C之間會解摺疊(Lehmanetal.，2000)，因而它們會喪失活性。因此，特別需要在較高溫度下也具有技術上足夠的活性或者不會失活的肌醇六磷酸酶。
發明內容因此，本發明的一個目的在於提供具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，所述多肽具有得到增強的熱穩定性，或者在較高溫度下它具有技術上足夠的活性。此外，具有肌醇六磷酸酶活性的多肽還應該具有得到增強的蛋白水解穩定性。需要以經濟的方式產生該多肽。具體而言，該肌醇六磷酸酶應該較野生型酶具有更高的熱穩定性。此外，肌醇六磷酸酶應該保留天然大腸桿菌野生型肌醇六磷酸酶的基本特徵，但是也要具有得到增強的熱穩定性這一特徵。天然野生型肌醇六磷酸酶的基本特徵具體有通過其作為肌醇六磷酸酶和磷酸酶的活性增強磷酸鹽在體內外的利用度的能力、其在酸性環境中的最佳pH(在高度酸化的環境中具有更高的殘留活性)以及作為烘焙添加劑的可利用性。本發明的一個目的還在於提供一多肽的基因，所述多肽具有肌醇六磷酸酶活性，並具有得到增強的熱穩定性以及得到增強的蛋白水解穩定性。該多肽應以經濟的和具有成本效益的方式生產。具體而言，該多肽在真核微生物中的表達應該得到這樣的多肽，即該多肽與以相似方式產生的野生型肌醇六磷酸酶相比具有得到增強的熱穩定性。還提供了編碼該多肽的DNA序列，相應的DNA構建體和載體以及適合在工業加工中商業化應用於食品和動物銅料的重組酶源和含有本發明酶的組合物。現意外地發現，在大腸桿菌野生型肌醇六磷酸酶序列某些位置的突變會本質上增強蛋白肌醇磷酸酶的熱穩定性即溫度穩定性，並且會增強其蛋白水解穩定性，而不會不利地影響野生型大腸桿菌肌醇六磷酸酶的其他效用和基本特徵。意外地發現，在大腸桿菌野生型肌醇六磷酸酶的胺基酸序列第74位(K74D)的突變和/或第139位(N139R)和笫142位(D142E)的突變組8合，和/或第145位(L145I)和第198位(L198I)的突變組合和/或第200位(V200P)的突變以及這些突變的組合會增強蛋白肌醇六磷酸酶的熱穩定性，而不會損害野生型大腸桿菌肌醇六磷酸酶的有利效用和基本特徵。還發現，大腸桿菌肌醇六磷酸酶在N端或C端或者在N端和C端兩端延伸出黑麴黴(y^7e/^7/"sw/gw)變種泡盛黑麴黴(awamori)的酸性磷酸酶序列並同時具有上述突變時，該酶的熱穩定性和蛋白水解穩定性會增強。因此，本發明涉及一重組DNA分子以及由此DNA編碼的多肽序列，該重組DNA分子在原核宿主細胞或真核宿主細胞中表達之後編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其中所述重組DNA分子包括選自以下的DNA序列a)編碼一具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列，該DNA序列通過改變成熟的野生型大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列獲得，其中所述改變選自i)第74位賴氨酸—天冬氨酸(K74D)的突變，和/或ii)第139位的天冬醯胺—精氨酸(N139R)和第142位的天冬氨酸—穀氨酸(D142E)的組合突變，和/或iii)第145位的亮氨酸—異亮氨酸(L145I)和第198位的亮氨酸—異亮氨酸(L198I)的組合突變，和/或iv)第200位的纈氨酸4脯氨酸(V200P)的突變，和/或v)N端或C端或者N端和C端兩端增加黑麴黴變種泡盛黑麴黴的酸性磷酸酶的序列片段或黑麴黴的肌醇六磷酸酶的序列片段，b)與a)列出的序列具有70-100%同源性的DNA序列，c)因遺傳密碼子的簡併性而與a)和b)列出的序列有關的DNA序列，其中所述重組DNA分子在合適的宿主細胞中表達時，會使如此編碼得到的蛋白的酶活性具有增強的溫度穩定性和蛋白酶穩定性，其中改變iii)和iv)僅與改變i)、ii)和v)聯合提供。文獻中記載了幾種來自大腸桿菌的肌醇六磷酸酶，如來自大腸桿菌K-12的編碼肌醇六磷酸酶的appA-gene((Dassaetal.，J.Bacteriol.172:5497-5500(19卯))。該基因編碼既具有酸性磷酸酶活性又具有肌醇六磷酸酶活小生的周質酶(參見Greineretal.,Arch.Biochim，Biophys.303:107-113(1993))。該酶的天然突變體是已知的(參見例如Rodriguezetal"Biochem.Biophys.Res.Comm.257:117-123(1999))。還描述了大腸桿菌肌醇六磷酸酶經遺傳修飾使溫度穩定性增強和/或比活性增強的突變體。Rodriguez等人(Arch.Biochem.Biophys.382:105-112(2000))對巴斯德畢赤酵母(戶/c/n'fl/7flWoWs)試驗了野生型AppA和幾種通過定點誘變形成的突變體，其目的是確定N糖基化對AppA蛋白的溫度穩定性的影響。儘管糖基化作用並未得到增強，但是突變體在pH3.5-5.5之間活性更強，並且在熱處理之後具有與在巴斯德畢赤酵母中產生的野生型蛋白相比更高的活性。WO03/057248的同族專利包括專利申請US2003/0170293Al和US2003/0157646Al。其中記載了用於動物祠料的耐熱肌醇六磷酸酶的微生物生產法。大腸桿菌菌林B肌醇六磷酸酶(appA)的突變體(Nov9X)在大腸桿菌、巴斯德畢赤酵母和粟酒裂殖酵母(ScA/wsflcc"ra附K^戶w&)中表達。與野生型酶相比，突變體Nov9X具有8個胺基酸突變。與野生型酶相比，液體形式的突變體在70。C下具有更好的熱穩定性。產生酶的宿主同樣對其熱穩定性有影響，正如同一研究小組在美國專利申請US2003/0157646Al所指出的那樣。其中NOV9X的胺基酸位置計數方法比本發明中要高兩位(W48NOV9X對應本發明中的W46)。在專利申請WO02/095003和WO2004/015084中，記載了大量大腸桿菌肌醇六磷酸酶的點突變，然而，其中沒有一個增強了熱穩定性。與本發明相比，WO2004/015084中的編號高出30個胺基酸位置。公開文獻DE102004050410也記載了大腸桿菌肌醇六磷酸酶突變體，但是其目的是提高絲狀真菌生產過程中的分泌效率。該文獻並未給出有關增強該突變體熱穩定性的信息。此夕卜，文獻Garrettetal.;AppliedEnviron.Microbiol"2004，70(5)，3041-3046記載了熱穩定性和胃腸穩定性增強的大腸桿菌肌醇六磷酸酶突變體。幾乎不可能預測一種或多種突變體對酶活性在較高溫度條件下的特徵的影響。較高溫度通常會導致蛋白的二級結構和三級結構變性或者解摺疊。蛋白的溫度穩定性或熱穩定性有賴於多種相互作用。蛋白的構象可通過繁多的弱相互作用來維持。穩定性可包括所有等級的蛋白結構多肽鏈的局部堆積、二級和超二級結構單元、結構域和多亞基蛋白(multimericprotein)的亞基。所記載的有關蛋白溫度穩定性增強的原因有很多，其中最常見的是(a)亞基內和/或亞基之間離子對的締合；(b)得到改善的疏水核心堆積(範德華相互作用)；(c)其他氫鍵網絡；(d)形成二級結構的趨勢增加；(e)螺旋內偶極穩定性的增強；(f)極性表面增加；(g)空腔的數量減少及總體積減少；(h)構象壓力(環穩定性)降低以及(i)針對化學修飾(甲硫氨酸殘基的氧化和/或天冬氨酸殘基和穀氨酸殘基的去氨基化)的抗性。現有技術並未提供有關如何更可取地改變大腸桿菌野生型肌醇六磷酸酶序列從而增強熱穩定性的暗示。此外，現有技術也沒有提供大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列中的上述突變方面的暗示。具體而言，現有技術並未提供這樣的暗示在大腸桿菌野生型肌醇六磷酸酶的胺基酸序列第74位(K74D)的突變或者第139位(N139R)和第142位(D142E)的突變組合或者第145位(L145I)和第198位(L1981)的突變組合或者第200位(V200P)的突變或者這些突變的組合會增強蛋白肌醇六磷酸酶的熱穩定性，而不影響野生型大腸桿菌肌醇六磷酸酶的有利效用和基本特徵。此外，現有技術也沒有提供這樣的暗示通過將黑麴黴變種泡盛黑麴黴的酸性磷酸酶序列加到大腸桿菌肌醇六磷酸酶的N端或C端或者N端和C端兩端，同時結合上述突變，會增強該酶的熱穩定性。具有本發明的成熟的野生型大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列變體的優選的本發明重組DNA分子為構建體PhyM2、PhyM3、PhyM9和PhyMlO。它們在下表1中給出。構建體PhyMl被選作參照產物。表1:突變的基因型PhyMl、PhyM2、PhyM3、PhyM7、PhyM9和PhyMlOtableseeoriginaldocumentpage12根據布達佩斯條約的規定，以下質粒於2006年10月18日保藏在德國微生物與細胞培養物保藏中心(DSMZ,MascheroderWeglb，38124Braunschweig)。質粒獲取號pET-PhyM2DSM18715pUC-PhyM3DSM18717pET-PhyM7DSM18716pUC-PhyM9DSM18718pUC-PhyM10DSM18719pPhy2005DSM18720pPhy2006DSM18721出人意料的是，影響蛋白疏水表面的突變(PhyM3、PhyM7和PhyM9)以及在螺旋D中插入離子鍵的突變(PhyM2)或經由離子鍵穩定環B4的突變(PhyM7)均明顯有助於大腸桿菌肌醇六磷酸酶熱穩定性的增強。同時，黑麴黴變種泡盛黑麴黴酸性磷酸酶的序列部分的加入可導致形成酸性磷酸酶的二聚體和四聚體，這一序列部分的加入對大腸桿菌肌醇六磷酸酶有穩定作用。黑麴黴肌醇六磷酸酶的序列部分的加入有著異曲同工之妙。本發明具有肌醇六磷酸酶活性的多肽與大腸桿菌野生型酶相比，其酶活性的溫度穩定性或熱穩定性增強。熱穩定性的這一增強可通過以液體形式經由差示掃描量熱法(DSC)測量。具體而言，熱穩定性的這一增強可顯現於以下》見察結果在暴露於熱應力(thermalstress)時，例如^^動物飼料粒化而使用的熱應力時，與野生型酶相比，酶突變體的殘留活性顯著增強。另外，本發明的多肽針對蛋白水解性分解(尤其是出現在家禽和單胃動物的胃中的蛋白水解性分解)有著得到增強的穩定性。由於在動物營養攝入中，尤其是在通過胃期間，肌醇六磷酸酶需從肌醇六磷酸及其分解產物中釋放磷酸，因此所迷穩定性尤其受到關注，其目的是保持酶的劑量儘可能低。由於溫度和/或蛋白水解穩定性增強，本發明的肌醇六磷酸酶尤其適合應用於溫度升高的條件或預計蛋白水13解性分解會增加的條件。應用實例有生產必須使其免受宿主菌抹的蛋白酶^5皮壞的酶、生產顆粒化的動物飼料，同時還可在顆粒化的動物飼料的粒化後應用中用作液體酶。溫度穩定性增強使得可以更早地將酶施用到尚未被冷卻的顆粒上，這一舉措縮短了被施用液體的蒸發時間。同時，從微生物學的角度上來看也有優點，原因是，藉此，高的水含量僅在大部分病原菌都不能生長的高溫下暫時存在。本發明編碼肌醇六磷酸酶的DNA序列包含以下突變或者突變組合和/或被編碼多肽的N端或C端或者N端和C端兩端增加中的至少一者i)第74位賴氨酸—天冬氨酸(K74D)的突變，和/或ii)第139位的天冬醯胺—精氨酸(N139R)和第142位的天冬氨酸—穀氨酸(D142E)的組合突變，和/或iii)第145位的亮氨酸—異亮氨酸(L145I)和第198位的亮氨酸—異亮氨酸(L198I)的組合突變，和/或iv)第200位的纈氨酸—脯氨酸(V200P)的突變，和/或v)在N端或C端或者N端和C端兩端增加黑麴黴變種泡盛黑麴黴的酸性磷酸酶序列片段或黑麴黴的肌醇六磷酸酶的序列片段。本發明的肌醇六磷酸酶序列優選地包含至少一個上述改變，並且非常優選地包含至少兩個上述改變。為了使肌醇六磷酸酶的熱穩定性適應本發明的上述具體的應用條件，突變變體的任何組合都是可能存在的。優選的可能的組合是i)、ii)和iv)的組合，該組合在下文被稱為基因型PhyMlO。此外，除了上述突變或突變組合之外，或者替代上述突變或突變組合，可在N端或C端或N端和C端兩端增加黑麴黴變種泡盛黑麴黴的酸性磷酸酶序列片段。當只存在這些序列部分時，熱穩定性也能得到增強。黑麴黴變種泡盛黑麴黴的酸性磷酸酶N端部分為成熟蛋白的前51個胺基酸(FSYGAAIPQSTQEKQFSQEFRDGYSILKHYGGNGPYSERVSYGIARDPPTS)。該多肽的後四個胺基酸代替了成熟大腸桿菌肌醇六磷酸酶的前4個胺基酸(QSEP)。此外，酸性磷酸酶的這些片段的多個部分的增加也是可能的。或者，可使用黑麴黴肌醇六磷酸酶的成熟蛋白的前40個胺基酸(SCDTVDQGYQCFSETSHLWGQYAPFFSLANESVISPEVPA)的N端部分或其多個部分。只要酶活性得到維持，還可在所述第4位以外的其他位點實行對大腸桿菌肌醇六磷酸酶的增加。對於C端伸長，黑麴黴變種泡盛黑麴黴酸性磷酸酶的後29個胺基酸(LSFWWNYNTTTELNYRSSPIACQEGDAMD)直接融合在大腸桿菌肌醇六磷酸酶的C端上。這一融合或這些融合還可伴有大腸桿菌肌醇六磷酸酶的其他突變，且不局限於本申請所述的其他突變。突變Lys43Cys會在新的C端部分和大腸桿菌肌醇六磷酸酶核心之間形成二發u鍵，並因此增強二聚化作用。其他有利於或可穩定範德華力、疏水性或離子型分子間鍵位並由此增強或進一步提高熱穩定性的突變也是可能的。N端或C端序列伸長的實例可參見下文所述的實施方案Phy2005和Phy2006。本發明肌醇六磷酸酶的熱穩定性可在產品中進一步增強，例如通過在乾燥或粒化之前向超濾濃縮物中添加物質來實現。例如，本發明肌醇六磷酸酶的穩定製劑可通過如下方式產生將由液體酶溶液製成的混合物噴於填充材料如麥芽糊精之上，然後乾燥所述混合物；或者在乾燥之前向該液體酶溶液中加入20%-60%的脫脂奶粉(w/w,以酶溶液的總蛋白為基準)和/或1。/。-5。/。的丙酸釣(w/w，以酶溶液的總蛋白為基準)，並將pH值調至一確定值，具體調至pH5.2士0.5。除了由結構確定的穩定性之外，溼度的降低以及肌醇六磷酸酶與填充材料的結合相互作用還可保護該酶由其結構確定的穩定性，使其免受環境影響，例如在動物飼料生產期間可能產生的極端溫度。如果降低潛在蛋白水解酶的活性，乾粉製劑和液體製劑可被進一步穩定，所述蛋白水解酶可以作為用於產生本發明酶的液體發酵混合物的副產物形式存在。對應於本發明的突變的肌醇六磷酸酶序列的DNA序列可通過使用任何密碼子用法來產生。例如，可以使用表達用的微生物的密碼子用法，還可使用大腸桿菌密碼子用法或其變化形式。另外，本發明被突變的大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列還可含有其它序列改變。因此，除了上述突變之外的任何改變形式均可實行，只要對得到增強的穩定溫度性這一性質沒有不利影響並且只要大腸桿菌野生型肌醇六磷酸酶的酶活性和其他基本特徵得以維持。相應的改變為重組DNA
技術領域：
的技術人員所熟知，它們包括上述突變以及下述示例性改變。根據本發明，可使用本發明經修飾得到的多肽的增加和/或缺失分子。因此，依據本發明修飾的具有肌醇六磷酸酶活性的多肽可通過在N端和/或C端增加其他的序列得以延長。因此，可產生具有其他有利特徵的雜合分子。例如，可添加融合蛋白或天然的強分泌蛋白，由此提高分泌效率。基於此目的，優選使用來自裡氏木黴(TWc/io&nw")的CBH2蛋白Met1至Ser86的胺基酸部分。根據本發明，只要在保持肌醇六磷酸酶的活性的同時不影響增強的溫度穩定性這一性質，還可使得具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的序列片段缺失。突變、延長以及縮短可通過公知手段以及特定領域所熟知的方法來實現。對具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的上述改變對應於相應DNA分子的相應突變或修飾。根據本發明，甚至還考慮到了在寬鬆和嚴格條件下與本發明的序列雜交的那些序列。嚴格條件如下在硫酸葡聚糖溶液(GenescreenPlus，DuPont)中於65。C雜交18小時，然後清洗濾器，每次30分鐘，即在65。C下先用6xSSC清洗，2xSSC清洗兩次，含0.1%SDS的2xSSC清洗兩次，然後用0.2xSSC清洗(轉膜和檢測方法，Amersham)。此外，本發明還涉及那些包含與要求保護的核苷酸序列或其要求保護的部分具有至少70%、優選至少80%、更優選至少卯％並且尤其優選至少95%同源性的那些序列，只要相應的序列會使其所編碼的具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的溫度穩定性增強。優選地，同源性為70%至100%。同源性被定義為同一程度。基於此目的，同一程度優選地以這樣的方式確定，即確定參與比較並在其他序列中具有"相應"互補序列的較短序列的殘基數。就本發明的目的而言，同源性通常優選通過使用普通算法確定。依據本發明，僅相應的成熟蛋白的cDNA被考慮用於比較。依據本發明，相似的優選同一的互補序列藉助於已知的電腦程式被確定為同源序列。這種程序的一個實例是程序CloneManagerSuite,它包括程序部分AlignPlus,並由Scientific&EducationalSoftware,Durham,NC，USA發布。基於此目的，對兩條上文定義的DNA序列的比較是經由方法FastScan-MaxScore或經由方法Needleman-Wunsch在可選的局部比對條件下使用默認值進行的。根據本發明,具有函數"CompareTwoSequences/LocalFastScan-MaxScore/CompareDNAsequences"的程序版本"CloneManager7AlignPlus5，，已被特別地用於確定同源性。基於此目的，使用了獲自以下來源的算法Hirschberg，D.S.(1975)Alinearspacealgorithmforcomputinglongestcommonsubsequences,CommunAssocComputMach18:341-343;Myers，E.W.andW.Miller.(1988)Optimalalignmentsinlinearspace,CABIOS4:1，11-17;Chao,K-M，W.R.PearsonandW.Miller.(1992)Aligningtwosequenceswithinaspecifieddiagonalband,CABIOS8:5，481-487。本發明還涉及這樣的DNA序列，其由於遺傳密碼子的簡併性而涉及本發明的序列及其等位基因的變化形式。遺傳密碼的筒並性是由天然的簡併性所致或是由於專門選擇的密碼子用法所致。天然存在的等位基因變體可通過使用分子生物學中的已知技術例如聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交技術來筌定。可使用編碼本發明多肽的DNA序列來轉化任何宿主細胞，例如真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞、植物細胞或哺乳動物細胞。這類被轉化的細胞可能會產生並分泌熱穩定性得到增強的肌醇六磷酸酶。以這種方式產生的熱穩定性得到增強的肌醇六磷酸酶還可從肌醇六磷酸鹽有效地釋i丈出磷酸。術語蛋白、肽或多肽可互換使用。具有肌醇六磷酸活性的多肽或酶或肌醇六磷酸酶各自可為能使無機磷酸從各種肌醇磷酸鹽中釋放出來的酶。這類肌醇磷酸鹽(肌醇六磷酸酶)底物的實例為肌醇六磷酸及其各種鹽，例如肌醇六磷酸鈉或肌醇六磷酸鉀或混合的鹽。另外，肌醇的二磷酸鹽、三磷酸鹽、四磷酸鹽或五磷酸鹽的各種位置異構體也可作為肌醇六磷酸酶的底物。肌醇六磷酸酶活性可通過使用任何採用這其中的一種底物的分析法來確定。本發明肌醇六磷酸酶變體包括通過如下方式自特定的肌醇六磷酸酶獲得的多肽變體通過在天然蛋白的N端和/或C端缺失或增加一個或多個胺基酸，通過在天然蛋白的一個或多個位點上缺失或增加一個或多個胺基酸，或者在肌醇六磷酸酶上的一個或多個位點上替換一個或多個胺基酸。這類變體的產生通常是本領域所熟知的。例如，該多肽的胺基酸序列變體通過在DNA中進行突變來產生。誘變方法和核苷酸序列改變方法為本領域所熟知(參見例如Kunkel，Proc，Natl.Acad.Sci.USA,82:488(1985)，Kimkeletal"MethodsinEnzymol.，154:367(1987)，美國專利4，873，192，WalkerundGaastra，eds.，TechniquesinMolecularBiology,MacMiHanPublishingCompany,NewYork(1983))。有關合適的胺基酸替換——其不會影響目的蛋白的生物學活性——的指示可參見Dayhoff等人(Dayhoffetal.，AtlasofProteinSequenceandStructure,Natl.Biomed.Res.Found"Washington,D.C.(1978))的模型。優選保守替換，例如用一胺基酸來置換具有相似特徵的另一胺基酸。在某一組內可以互換的胺基酸包括但不限於下表所示例的胺基酸tableseeoriginaldocumentpage18本發明還涉及分離的或基本純化的核酸或蛋白組合物。因此，分離的和純化的多核苷酸/多肽或其區段是指從其天然環境分離出的多核苷酸或多肽或其片段。分離的多核酸區段或多肽可以以純化形式存在，或者存在於非天然環境如轉基因宿主細胞中。例如，分離的或純化的多核苷酸片段或蛋白或其具有生物學活性的部分基本不含重組技術製備中的任何其他細胞物質或培養基，或者基本不含化學前體或其他化合物。優選的是一不含下述序列(優選編碼蛋白的序列)的分離的多核苷酸，所述不含的序列天然地位於核酸來源生物體的基因組DNA的核酸(即位於所述核酸序列5，端和3，端的序列)的側翼。例如，根據不同的實施方案，分離的核酸分子可含有少於約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然地位於核酸分子所來源的細胞的基因組DNA的核酸分子的側翼。基本不含細胞物質的蛋白包含具有少於約70%、50%、30%、20%、10%、5%(以乾重為基準)的汙染蛋白的蛋白或多肽組成。本發明蛋白或其活性片段以重組方式產生時，所述培養基優選地含有少於約70%、50%、30%、20%、10%或5%(以乾重為基準)的化學前體物或非蛋白化學物質。本發明還包括本發明核苷酸序列的片段和變體及其所編碼的蛋白或蛋白區段。片段是指核苷酸序列的一部分或者胺基酸序列的一部分，因而也指其所編碼的多肽或蛋白的一部分。本發明還涉及可用於將編碼本發明肌醇六磷酸酶的開放閱讀框引入宿主細胞的表達盒。它們優選地包含與開放閱讀框連接的轉錄起始區域。這種表達盒可含有多個插入開放閱讀框和/或其他DNA例如轉錄調控區域和/或選擇性遺傳標記的限制性酶切位點。轉錄盒從轉錄的5，—3，方向包含在微生物細胞中發揮功能的轉錄和翻譯起始區域、目的DNA序列以及轉錄和翻譯終止區域。終止區域可相對於轉錄起始區域而言為天然的，可相對於目的DNA序列為天然的，或者可來源於任何其他來源。術語"開放閱讀框"(ORF)是指編碼序列的翻譯起始密碼子和終止密碼子之間被編碼的胺基酸序列。術語"起始密碼子"和"終止密碼子"是指限定了蛋白合成(mRNA翻譯)的鏈起點和終點的編碼序列中的三個鄰接核苷酸單位(密碼子)。就核酸而言，"功能性連接"或"有效連接"是指以相對於啟動子的轉錄起始合適的位置和方向、作為核酸分子的一部分與該核酸分子連接。與啟動子有效連接的DNA受到啟動子的轉錄起始調控。編碼序列可與調控序列以正義或反義方向有效連接。就多肽而言，"功能性連接/有效連接"是指作為同一多肽的一部分的連接，即通過多肽連接。根據本發明，可使用任何啟動子。啟動子通常是指位於編碼序列上遊(5，)的核苷酸序列，它通過識別正確轉錄所需的RNA聚合酶和其他因子來控制編碼序列表達。本發明的啟動子可包括最小啟動子，即來自TATA盒的短DNA序列和其他增加了控制表達的調控單元的表示轉錄起始位點的序列。本發明啟動子還可包含含有可控制編碼序列或功能性RNA表達的最小啟動子和調控單元的核酸序列。這類啟動子序列由近端和遠端上遊單元組成，其中遠端上遊單元通常被稱為增強子。因此，增強子為這樣的DNA序列，即它可刺激啟動子活性，並可為一種本質上是啟動子的單元或插入的異源單元，以增強表達峰或啟動子的組織特異性。它在兩個方向均起作用，甚至本身在置於啟動子的上遊或下遊時也會起作用。^合蛋白。完整的啟動子可來源^天然基因或由來自不同的天然啟動子的不同單元構成，或者甚至可由合成DNA區段構成。啟動子還可含有參與了與針對生理或發育條件來控制轉錄起始效率的蛋白因子連接的DNA序列。啟動子單元，尤其是沒有活性或者缺少上遊活性的具有嚴重降低的啟動子活性的TATA單元，被稱為最小啟動子或核心啟動子。在分別存在一個或多個合適的轉錄因子的情況下，最小啟動子能啟動轉錄。因此，最小啟動子或核心啟動子僅由轉錄起始所必需的所有基本單元如TATA盒和/或抑制子組成。本發明還涉及含有本發明DNA的載體。這些載體包括雙鏈或單鏈、線性或環狀形式的各種質粒、粘粒、噬菌體和其他載體，如果需要，它們自身是可轉化的或可移動的，並且能通過整合到細胞基因組來轉化原核或真核宿主，或者以染色體外形式存在(如具有複製起點的自動複製的質粒)。用於細胞轉化的載體、質粒、粘粒、人工酵母染色體(YAC)、人工細菌染色體(BAC)和DNA區段通常包含本發明編碼肌醇六磷酸酶的DNA以及其他DNA如cDNA、應被引入細胞中的一個或多個基因。這些DNA構建體可包含其他的結構例如啟動子、增強子、聚合接頭，或者，如果需要時還可含有調控基因。被選擇來進行細胞導入的DNA區段的一種或基因通常編碼一種這樣的蛋白，其在由此得到的轉化(重組)細胞中表達並賦予一個可篩選或可選擇的特徵，並且/或者為所述被轉化的細胞提供了一個更好的表型。本發明中可以使用的載體構建方法在本領域的技術人員在參閱現有公開的情況下是可獲悉的(參見例如Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual(2.ed.，ColdspringHarborLaboratoryPress,Plainview，N.Y.(1989))。本發明的表達盒可含有一個或多個限制性酶切位點，其目的是使編碼肌醇六磷酸酶的核苷酸受調控序列的調控。表達盒還可舍有與多核苷酸和多核苷酸正確翻譯所需的調控序列有效連接的終止信號。含有本發明多核苷酸的表達盒可以為嵌合的，即其至少一個組件相對於至少一種其他組件而言是異源的。多核苷酸在表達盒中的表達可由組成型啟動子、誘導型啟動子、受調控啟動子、病毒啟動子或合成啟動子控制。載體可含有調控單元如啟動子，或者，可對本發明的DNA序列進得處理使其含有這類單元。可被使用的合適的啟動子單元為本領域所知，如裡氏木黴的cbh1或cbh-2啟動子，或米麴黴(^5^rgz7/"sorj;z"e)的amy啟動子，黑麴黴的xyl、glaA、alcA、aphA、tpiA、gpdA、sucl和pkiA啟動子。可用於在酵母中表達的合適的啟動子單元為本領域所知悉,如用於在釀酒酵母菌(5"flCc/^/Y附j;cescerev/s/fle)中表達的pho5啟動子或gap啟動子，對於巴斯德畢赤酵母，如aoxl啟動子或find啟動子，或者用於在漢森酵母(雙/;o/j;/Mw/^fl)中mox啟動子。除了本發明所述的DNA之外，適合導入細胞的DNA還包括來源於任何來源或從其中分離得到的DNA。所來源的DNA的一個實例是被鑑定為給定生物體中的有用片段並且可以基本上純的形式經化學合成的DNA序列。這類DNA的一個實例這樣的合適的DNA序列，其例如通過使用限制性內切酶獲得，從而使其可依據本發明被進一步處理例如被擴增。這種DNA通常被稱為重組DNA。因此，合適的DNA包括全合成DNA、半合成DNA、從生物來源分離的DNA以及來源於被引入的RNA的DNA。通常，被引入的DNA沒有受體DNA基因型的原始組分，但是依據本發明，來自給定基因型的基因可被分離並最終被改變，並且在此之後可將多個拷貝的該基因引入同一基因型，例如為了加強給定基因產物的產生。被引入的DNA包括但不限於來自例如細菌、酵母、真菌或病毒的基因的DNA。被引入的DNA可包含經修飾基因或合成基因、包括來自相同或來自不同基因型的基因在內的基因或嵌合基因的一部分。本發明用於轉化的DNA可為環形或線形、雙鏈或單鏈的。通常，該DNA以嵌合DNA例如質粒DNA的形式存在，所述質粒DNA含有編碼區域，該編碼區域的側翼具有支持轉化細胞中所含的重組DNA表達的調控序列。例如，DNA自身可含有一種啟動子或由該啟動子組成，所述啟動子在細胞中有活性，或者來源於不同於該細胞的來源，或者可使用業已包含在細胞即轉化靶細胞中的啟動子。通常，被引入的DNA相對較小，不到30kb，其目的是使針對物理、化學或酶學分解的敏感度降至最低，所述分解隨著DNA的大小增力口而增加。合適表達載體的選擇取決於宿主細胞。酵母或真菌表達載體可包括複製起點、合適的啟動子和增強子，還可包括各種所需核糖體結合位點、多腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉錄終止序列和非轉錄的5，側翼序列。合適宿主細胞的實例有真菌類麴黴屬(4印wg/〃船)、根黴屬(及A/zo/7ms)、木黴屬(7V/cAode屍附tf)、務^孢黴屬(A^""Ay/wtf)、毛黴屬(Mmcw)、青黴屬(i^附'"7/紐w)等的細胞，例如克魯維酵母菌屬(jK7"yvm附yce)、酵母屬(iS"flcc/iflr歸j;ce)、裂殖酵母屬(iS^/f/卿tf"/^柳j;")、絲孢酵母屬(7Wc/ro5/7o/wi)、5^/M^i朋/o附j;ce、漢森酵母屬(醜做se"m/fl)、畢赤酵母屬(jR/c/hVi)等的酵母。合適的宿主系統有例如真菌如麴黴(如黑麴黴(ATCC9142)或無花果麴黴04s/;e/^7/"^/kw"柳)(NRLL3135))、或木黴(如裡氏木黴QM6a)、以及酵母如酵母屬如釀酒酵母、或畢赤酵母例如巴斯德畢赤酵母、或漢森酵母如漢森酵母(DSMZ70277)。這類微生物可通過得到公認的保藏機構例如美國典型培養物保藏中心(ATCC)、荷蘭真菌保藏所(CBS)或德國微生物與細胞培養物保藏中心(DSMZ)或任何其他保藏機構獲得。在5，—3'轉錄方向，表達盒可含有本發明多核苷酸的轉錄和翻譯起始區域以及在體內或體外起作用的轉錄和終止區域。相對於轉錄起始區域而言，終止區域可以是天然的，或者，相對於該多核普酸，終止區域可以是天然的或者來自不同來源。調控序列可位於編碼序列的上遊(5，非編碼序列)、編碼序列內(內含子)或編碼序列下遊(3，非編碼序列)，並且可影響相關編碼序列的轉錄、RNA加工或穩定性和/或翻譯。調控序列可不受限制地包括增強子、啟動子、阻遏蛋白結合位點、翻譯前導序列、內含子或多腺苷酸化信號序列。它們可包括天然序列或合成序列以及合成序列和天然序列結合的序列。著稱的啟動子。可使用具有在絲狀真菌中表達的能力的各啟動子。實例有受澱粉或纖維素強烈誘導的啟動子，例如來自麴黴屬的葡糖澱粉酶或a-澱粉酶或者來自木黴屬的纖維素酶(纖維二糖水解酶)的啟動子，糖酵解代謝中的酶的啟動子，所述酶例如磷酸甘油酸激酶(PGK)和甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GPD)等。優選纖維二糖水解酶I的啟動子、纖維二糖水解酶II的啟動子、澱粉酶的啟動子、葡糖澱粉酶的啟動子、木聚糖酶的啟動子或者烯醇酶的啟動子。兩種控制表達的主要方法是已知的，即過表達和低表達。過表達可通過插入一個或多個額外拷貝的所選基因來實現。低表達有兩種主要的方法，它們在本領域通常被稱為"反義下調，，和"正義下調"。通常，這些方法均被稱為"基因沉默"。兩種方法均會抑制靶基因的表達。除了使用特定啟動子之外，其他類型的單元也可影響轉基因表達。具體而言，已表明內含子具有強化轉基因表達的潛力。表達盒可包含其他單元，例如受內源性或外源性單元例如鋅指蛋白(包括天然存在的鋅指蛋白或嵌合型鋅指蛋白)調控的那些單元。此外，本發明所使用的表達盒可含有增強子單元或上遊啟動子單元。用於本發明的載體可構建成含有增強子單元。因而，本發明構建體可包含目的基因以及3，-DNA序列，所述3，-DNA序列起到終止轉錄並使由此獲得的mRNA多腺苷酸化的信號序列的作用。任何可使所選宿主生物體能夠進行分泌的信號序列均可使用。優選的信號序列為黑麴黴的肌醇六磷酸酶信號序列或者來自絲狀真菌的分泌信號序列。因為轉錄起始位點和編碼序列的起點之間的DNA序列即非翻譯前導序列可影響基因的表達，還可使用特定的前導序列。優選的前導序列可包含對所連接基因的最佳表達進行調控的序列，即它們包含增強或維持mRNA穩定性並防止不合適翻譯起始的優選共有前導序列。對於這類序列的選擇是本領域技術人員所熟知的。為了提高鑑定轉化體的機率，可將可選擇或可篩選的遺傳標記引入(插入)表達盒內。這類遺傳標記為本領域技術人員所熟知。將表達盒或含有該表達盒的載體構建體引入宿主細胞中。為將構建體引入宿主細胞領域中，可利用本領域技術人員所熟知的多種技術。微生物細胞的轉化可通過使用聚乙二醇、氯化鈣、病毒感染、DEAE-葡聚糖、噬菌體感染、電穿孔和其他本領域已知的方法來實現。真菌的轉化可依據Pentt服etai.，Gene61:155-164，1987所述內容來實現。將重組載體引入酵母可通過包括電穿孔、使用原生質體、醋酸鋰等的已知方法來實現。一旦獲得本發明表達盒或DNA序列，即可依據已知方法將其插入載體中，從而使被編碼的多肽在合適的宿主系統中過表達。然而，也可以同樣方式使用DNA序列來轉化本發明的合適的宿主系統，以實現被編碼多肽的過表達。一旦本發明的DNA序列在合適培養基中在合適宿主細胞中表達，即可依據已知方法，使被編碼的肌醇六磷酸酶從培養基(在肌醇六磷酸酶被分泌到培養基的情況下)或從宿主生物體(在肌醇六磷酸酶以胞內形式存在即存在於周質空間的情況下)富集和/或分離。可先使用分離培養基和生物量的不可溶組分的已知方法，然後使用富集肌醇六磷酸酶的方法，產生肌醇六磷酸酶的濃縮液，或者產生肌醇六磷酸酶的乾粉製劑。例如，可先將過濾方法或離心方法用於分離不可溶組分，然後將超濾方法用於濃縮，或者使用錯流式過濾法。千燥可通過冷凍乾燥和噴霧千燥、粒化過程、擠壓法或其他方法來實現。已知的蛋白純化方法可用於分離本發明的肌醇六磷酸酶。例如，可分別地或彼此結合地使用不同的色譜法或凝膠色諉法。根據重組生產方法中所使用的宿主細胞，可通過糖基化以共價方式來修飾本發明的酶或對其不作糖基化修飾。在真核細胞中，被分泌蛋白的糖基化起到調控蛋白摺疊、構象穩定性、熱穩定性以及蛋白水解抗性的作用。就肌醇六磷酸酶的特定用途來看，與該酶的非糖基化變體相比，其糖基化變體是優選的。例如，在動物飼料中使用糖基化的肌醇六磷酸酶可起到使該酶免受飼料粒化期間的熱變性以及通過胃期間的蛋白水解失活的作用，從而使得活性酶在腸道中以及抵達作用位點的的分布是有利的。關於在食品加工中的使用(其中僅在加工期間需要而在終產品中不需要酶活性)，不耐熱即非糖基化並且對蛋白水解性分解/消化敏感的肌醇六鱗酸酶是優選的。本發明還涉及含有本發明多肽的肌醇六磷酸酶組合物。通常，肌醇六磷酸酶組合物為液體或乾粉。液體組合物優選地含有純化或富集形式的肌醇六磷酸酶。但是，可加入助劑例如穩定劑(如甘油、山梨醇或丙二醇)、添加劑(如鹽、糖)、防腐劑、pH值調節劑、蛋白和肌醇六磷酸鹽或肌醇磷酸鹽(肌醇六磷酸酶的底物)。常規的液體組合物為水性或油性懸液。液體組合物可於可能的粒化步驟或加工步驟之前或之後加入食品或動物飼料中。千粉組合物可為冷凍乾燥的、噴霧乾燥的、顆粒化的或擠壓得到的只含有該酶的組合物。在乾燥之前，還可加入調節pH值的物質以及其他的添加劑和填充材料如麥芽糊精、乳糖、脫脂奶粉、二價陽離子例如Mg、Ca、Zn等的鹽。乾粉組合物可為容易與例如食品或飼料組分混合的顆粒，或者，優選地，可形成預混料的組分。酶顆粒的顆粒大小優選地與混合物的其他組分相一致。這使其成為將酶摻入被加工食品、預混料或動物飼料中的安全有益的試劑。例如，本發明肌醇六磷酸酶的穩定製劑可通過將液體酶溶液的混合物噴於填充材料如麥芽糊精之上並在之後千燥該混合物來產生，或者通過在乾燥之前向液體酶溶液中加入20%-60%的脫脂奶粉(w/w，以酶溶液的總蛋白為基準)和/或1%-5%的丙酸鉀(w/w，以酶溶液的總蛋白為基準)，並將pH值調至一確定值，具體調至pH5.2土0.5。除了由結構確定的穩定性之外，溼度的降低以及肌醇六磷酸酶與填充材料的結合相互作用也會使該酶免受環境，例如在動物飼料生產期間可能出現的極端溫度的破壞。乾粉製劑和液體製劑可通過降低潛在蛋白水解酶的活性而被進一步穩定，所述蛋白水解酶可能是用於產生本發明酶的液體發酵混合物中的副產物。由此產生的幹酶混合物可用作用於家禽飼養和豬飼養中的動物飼料添加劑。另外，磷補充的減少會減少磷汙染，從而顯著減少由於集約家畜飼養所引起的環境汙染。一旦獲得幹酶製劑，即可在其他步驟中產生結塊顆粒。基於此目的，使用具有高剪切力的攪拌機，由此填充材料和酶發生凝聚並形成顆粒。可通過用本發明的酶包被載體核心來產生吸附顆粒。常用的填充材料為鹽例如硫酸二鈉鹽。其他填充材料包括高冷土、滑石、矽酸鎂鋁和纖維素纖維。如果需要，還可將結合材料如葡聚糖摻入凝聚顆粒中。常規載體包括澱粉，其形式為例如木薯澱粉、土豆澱粉和穀物澱粉，尤其是玉米澱粉、稻澱粉和小麥澱粉或者含有蛋白如大豆蛋白的產品。還可使用鹽。如果需要，顆粒可由包被混合物包被。這種混合物包括包被材料，優選疏水性包被材料、無水棕櫚油和滑石，並且如果需要，可包括其他添加劑例如碳酸鈞或高呤土，其目的是增強在作用位點的生物利用度。此外，含有肌醇六磷酸酶的混合物可舍有其他物質如著色劑、調味劑、穩定劑、維生素、礦物質、其他食品酶或動物飼料酶等。具體而言，這涉及到所謂的預混料。食品添加劑或動物祠料添加劑為適合被添加到食品或動物飼料中的基本純的化合物或者幾種化合物的組合物。具體而言，它是依據其指定目的成為食品或動物飼料的組分或者影響食品或動物飼料產品的特徵的物質。因此，肌醇六磷酸酶添加劑應該指這樣的肌醇六磷酸酶，其不是主要用於食品和動物祠料中的天然組分，或者其並不以其天然濃縮物的形式存在於食品和動物飼料中。例如，肌醇六磷酸酶與動物飼料物質分開被單獨加至動物飼料中或與其他動物飼料添加劑結合加入動物飼料中。一種典型的預混料通常包含一種或幾種化合物如維生素、礦物質或飼料強化酶和合適的載體和/或賦形劑。即用型肌醇六磷酸酶添加劑為並非是在動物飼料或加工食品中原位產生的添加劑。可將即用型肌醇六磷酸酶添加劑直接地給予人類或動物，或者優選地，在與動物飼料或食品的其他組分混合之後直接給予人類或動物。例如，本發明這一方面的動物飼料添加劑與其他動物飼料和動物飼料添加劑混合，從而獲得預混料或補充型動物祠料。這類其他動物銅料組分包括一種或多種其他(優選熱穩定的)酶補充物、其他動物飼料添加劑、礦物質性動物飼料和胺基酸。由此獲得的(相結合的)動物飼料添加劑可包括幾種不同類別的化合物，並且隨後可通過形成複合型動物飼料將其以合適的量與動物飼料如穀物和蛋白載體混合。在混合之後可通過已知的加工設備例如雙造粒機(doublepelletizer)、蒸汽造粒機(steampelletizer)、膨脹器(expander)或擠壓機(extruder)來將這些組分加工成為動物飼料。類似地，本發明這一實施方案的食品添加劑可與其他食品組分混合，由此產生加工得到的食品產品。這類其他食品組分包括一種或多種酶補充物、維生素、礦物質和微量元素。然後將由此獲得的結合型食品添加劑以合適的量與其他食品組分如穀物和植物蛋白混合，從而提供加工食品。可通過使用已知的加工設備將這些組分加工成為加工食品。在一個優選的實施方案中，本發明的肌醇六磷酸酶組合物可另外包括有效量的一種或多種用於食品或動物伺料的酶，所述酶優選地選自a-半乳糖苷酶、p-半乳糖苷酶、漆酶(laccase)、其他肌醇六磷酸酶、磷酸酶、內切葡聚糖酶(尤其是內切型-P-l，4-葡聚糖酶、內切型-p-l，3(4)-葡聚糖酶、內切型-l，2-p-葡聚糖酶和內切型-l，3-cc-葡聚糖酶)、纖維素酶、木糖酶、半乳聚糖酶(尤其是阿拉伯半乳聚糖-內切型-l，4-p-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖-內切型-l,3-p-半乳糖苦酶)、果膠降解酶(尤其是果膠酶、果膠酯酶、杲膠裂解酶)、聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙醯酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-a-鼠李糖香酶、果膠酸裂解酶(pectatelyase)和oc-半乳糖醛酸酶(alpha-galacturonidase)、甘露聚糖酶、p-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙醯酯酶、木聚糖乙醯酯酶、蛋白酶、木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶和脂肪水解酶如脂肪酶、磷酸酯酶和角質酶(cutinase)。本發明動物飼料添加劑在飼料之前或與祠料一起被給予動物。優選地，本發明動物飼料添加劑與祠料一起被給予動物。食品或動物飼料中有效量的肌醇六磷酸酶由約10-20.000PPU/kg、優選地約10-15.000PPU/kg、更優選地約10-10.000PPU/kg、甚至更優選地約50-5.000PPU/kg、尤其是50-2.000PPU/kg的動物飼料或食品組成。本發明還涉及肌醇六磷酸酶用於加工和生產食品和動物飼料的用途。食品用穀物和麵粉可用肌醇六磷酸酶進行酶學處理，以減少原料中肌醇六磷酸鉤鎂的含量。肌醇六磷酸鉀鎂含量的減少通過增加必需礦物質如鐵、鈣和鋅的利用度來提高食品質量。除了食品質量的改進之外，在加工期間使用肌醇六磷酸酶還可提高食品生產的整體效率。例如，在生產大豆蛋白分離物期間將肌醇六磷酸酶添加到白色大豆薄片中，可顯著地提高可提取蛋白的產量和質量。因此，肌醇六磷酸酶僅在生產和加工期間有活性，而在終產品中不再有活性。對於生產生麵團和烘焙以及生產其他基於穀物的即食型產品而言，這一方面尤其重要。類似地，動物飼料組分如烤制大豆粉或芸苜(canola)粉可在實際生產過程之前用肌醇六磷酸酶預處理。在生產之前消除動物飼料組分中的營養對抗因子會在生理學層面上提高質量，並且會使得動物飼料成分得到富集/更有價值。在此加工期間，肌醇六磷酸酶在生產期間是有活性的，並且通常在動物攝取經處理的動物飼料之後在其腸道中不再有活性。除了將肌醇六磷酸酶用作動物祠料加工助劑之外，本發明還涉及將本發明肌醇六磷酸酶用作消化助劑。片劑形式的肌醇六磷酸酶可與營養品一起被攝入，目的是將活性酶分布到胃腸道內。本發明肌醇六磷酸酶還可優選地用於單胃動物和多胃動物，尤其優選地用於牛犢。還可向魚飼料和甲殼動物銅料補充肌醇六磷酸酶，從而提高動物銅料的利用度，並減少集約型動物飼養中分泌磷的含量。還可將本發明動物飼料給予動物如家禽如肉雞、火雞、鵝、鴨，並且還可給予豬、馬、牛、綿羊、山羊、狗和貓，以及魚類和曱殼類。尤其優選的是將本發明動物飼料給予豬和家禽。本發明肌醇六磷酸酶製劑還可與其他成分組合，從而形成新的並且特別有利的動物飼料組合物。正如此前所述，由於大豆粉和穀物中的植物性磷的利用度因與肌醇六磷酸的連接而較低，所以將無機磷加入動物飼料中，從而使得能夠為動物提供充足的磷。但是，這些動物飼料總磷酸鹽含量太高，因而導致對環境的磷酸鹽汙染。具體而言，本發明動物銅料含有本發明肌醇六磷酸酶與動物飼料成分的組合，其目的是獲得所添加的無機磷的含量顯著較低的動物飼料。在一個優選的實施方案中，本發明動物祠料含有常規動物飼料成分、微量營養素、微量元素、維生素等以及有效量的肌醇六磷酸酶和無機磷，其中肌醇六磷酸酶和磷的含量為介於50-20.000單位的肌醇六磷酸酶/kg動物伺料和低於0.45。/o的無機磷，優選地含量介於100-10.000單位的肌醇六磷酸酶/kg動物飼料和低於0.225%的無機磷，更優選地含量為150-10.000單位的肌醇六磷酸酶/kg動物飼料和低於0.15%的無機磷，甚至更優選地含量為200-20.000單位的肌醇六磷酸酶/kg動物飼料並且沒有額外添加無機磷。本發明還涉及促進動物營養學中的增重和提高飼料轉化率(FCR)的方法，以及本發明肌醇六磷酸酶在該方法中的用途。本發明肌醇六磷酸酶能促進增重，並且使飼料轉化率能夠得到提高，尤其是針對幾乎不含無機磷的動物飼料而言。根據本發明的方法，動物飼料中的無機鱗含量可降低至含量低於0.45%，優選地低於0.255%。優選地，不加入無機磷。通過添加本發明的酶來提高磷酸鹽的利用度，動物的骨骼礦化可被顯著增強，這對於快速生長的動物而言尤其重要。根據另一個實施方案，本發明涉及本發明酶在烘焙中的用途，其中涉及生麵團的成形、彈性和/或穩定性和/或烘焙產品的體積、團粒結構和/或腐敗抗性。儘管本發明酶製劑可用於生產由麵粉得到的任何類型的生麵團或烘焙產品，如黑麥粉、大麥粉、燕麥粉或玉米粉，但是已經發現本發明的酶製品尤其適用於生產由小麥製成或主要由小麥製成的生麵團或烘焙產品。可通過使用本發明酶製品生產的烘焙產品包括麵包、小麵包、法棍麵包等。對於烘焙而言，可使用除了具有肌醇六磷酸酶活性之外還具有另一酶活性例如木聚糖酶、脂肪酶、澱粉酶、氧化酶或漆酶的本發明酶製品，或者本發明酶製品可與其他酶例如脂肪酶、澱粉酶、氧化酶(如葡萄糖氧化酶、過氧化物酶)聯合使用。附圖將進一步闡述本發明圖l:pET-PhyM2的質粒圖圖2:pAB490-PhyM2的質粒圖圖3:pUC-PhyM3的質粒圖圖4:pAB489-PhyM3的質粒圖圖5:pUC-PhyM10的質粒圖圖6:pAB600-PhyM10的質粒圖圖7:pPhy2005的質粒圖圖8:pAB-Phy2005的質粒圖圖9:pPhy2006的質粒圖圖10:pAB-Phy2006的質粒圖圖11:本發明的單突變體以及以野生型序列(Dassa)為基礎的變體之間的序列比較。突變或變體被標識。具體實施例方式以下實施例對本發明進行進一步闡釋。實施例實施例1-肌醇六磷酸酶活性的測定肌醇六磷酸酶的活性在由0.5。/。的肌醇六磷酸(約5mM)、200mM檸檬酸鈉(pH5.0)製得的分析混合物中測量。在37。C溫育15分鐘之後，通過加入等體積15%的三氯乙酸來終止反應。所釋放出的磷酸根離子通過將100jil的分析混合物與900pl的H20和lml的0,6MH2S04、2%的抗壞血酸和0.5%的鉬酸銨混合，之後於50。C下溫育20分鐘在820nm處進行了定量測量。使用磷酸鉀標準溶液作為參照。實施例2—質粒PET-PhyM2和pAB4卯-PhyM2(基因型PhyM2)的構建通過以下步驟來實現質粒pAB490-PhyM2的構建1.pET-PhyM2的構建質粒pET-PhyM2含有使用裡氏木黴的密碼子用法(http:〃www.kazusa.or.ip/codon)並具有額外胺基酸變化N139R和D142E的大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列(Dassaetal.19卯，獲取號為M58740,具有V200Y)。通過使用裡氏木黴的密碼子用法(http:〃www，kazusa.or，jp/codon)，將這樣的一種DNA序列插入質粒pET26b(+)(Novagen，Germany,經Brain，Germany改進)中該DNA序列含有1230bp的開放閱讀框且第一位為CAG(Gln)密碼子，並且編碼具有410個胺基酸的酶。為實現誘變，使用了基於PCR的寡核普酸指導的方法。在含有野生型Dassa胺基酸序列的編碼基因的質粒的基礎上，針對每個待置換的三聯體，合成了具有相應突變的兩個互補引物，其中所述突變總是位於引物中間。通過這兩個引物對整個質粒進行了擴增。所獲得的具有針對基因型M2的突變的質粒;陂稱為pET-PhyM2。為了構建，使用了以下引物。a)對於第139位的突變ccaactggataacgcccgggtgaccgacgccat(SEQIDNO:l)atggcgtcggtcacccgggcgttatccagttgg(SEQIDNO:2)b)對於隨後在第142位插入的額外突變gcccgggtgaccgaggccatcctcagc(SEQIDNO:3)gctgaggatggcctcggtcacccgggc(SEQIDNO:4)質粒示於圖1，並且已於2006年10月18日保藏，獲取號為DSM18715。2.pAB4卯-PhyM2的構建為了構建質粒pAB490-PhyM2，已通過PCR從質粒pET-PhyM2對編碼大腸桿菌肌醇六磷酸酶的PhyM2編碼基因進行了擴增。PCR產物由限制性內切酶Spel和Pacl進行了剪切，並且插入到質粒pAB4卯中裡氏木黴cbhll基因片段之後的Spel和Pacl限制性酶切位點中。由此形成了編碼融合蛋白CBHII曙Kexll-PhyM2的開放閱讀框。所獲得的質粒淨皮稱為pAB4卯-PhyM2(圖2)，且已通過限制性內切酶製作了圖譜。該肌醇六磷酸酶序列已通過測序進行確認。質粒pAB4卯的基礎是pUC18,並且含有cbhll基因片段(核苷酸1-307對應於胺基酸M1-S86,Teerietal，1987，Gene51:43-52,獲取號為161卯)，由來自質粒pALK487(WO94/28117)的cbhl啟動子和cbhl終止子控制。質粒pALK424(WO93/24621)的長度為4，78kb、含有amdS遺傳標記和3，cbhl側翼序列的平頭EcoRI/Spel片段被插入至cbhl終止子3，末端的Stul限制性位點。另夕卜，還將其他限制性位點(Spel和Pacl)插入到cbhII-基因片段的下遊。這些限制性位點已被用於直接克隆肌醇六磷酸酶變體。自質粒pAB490-PhyM2分離的表達盒含有以下遺傳物質cbhl(纖維二糖水解酶I)啟動子該含有cbhl啟動子的2.2kbEcoRI/SacII片段來源於裡氏木黴QM6a。該啟動子區域(連同cbhl3，片段；參見下文)還起同源DNA的作用，從而控制轉化的DNA向cbhl基因座中的引入。cbhll基因片段具有其信號序列的307bpcbhll基因片段直接由cbhl啟動子控制。含有胺基酸突變N139R和D142E和V200Y的大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列藉助於KexII限制性酶切位點被融合至cbhll基因片段的3，端。kex序列含有以下胺基酸RTLVKR。cbhl終止子含有cbhl終止子的長度為0.75kb的BamHI/StuI片段被添加至大腸桿菌肌醇六磷酸酶之後，目的是確保轉錄的終止。amdS基因該基因(包括其啟動子和終止子)分離自構巢麴黴(^y/7^g/〃附mV/w/flws)VH1-TRSX6,編石馬乙醯胺酶(acetamidase)(Hynesetal"1983，Mol,Cell.Biol.3:1430-1439;KellyandHynes，1985，EMBOJ.4:475-479)。乙醯胺酶使得菌林能夠通過使用作為唯一氮源的乙醯胺來生長，並且這一特徵已被用於篩選轉化體。cbhl3，片段該片段(1，7kb，BamHI/EcoRI,始於該基因終止密碼子之後的1.4kb處)分離自裡氏木黴ALK02466。菌林ALK02466來源於菌林ALK0233(Harkkietal.，1991，EnzymeMicrob.Technol.13:227-233)。該3，片段連同啟動子區域一起用於經由同源重組將肌醇六磷酸酶表達盒靶向整合至cbhl基因座。31質粒pAB490-PhyM2的序列通過採用限制性酶製作圖i普以及測序來確認。'實施例3-質粒pET-PhyM7和pAB490-PhyM7(基因型PhyM7)的構建質粒pET-PhyM7含有通過使用裡氏木黴的密碼子用法(http:〃www.kazusa.or.ip/codon)修飾並且具有額外突變K74D的大腸桿菌肌醇六磷酸酶(Dassaetal.1990，獲取號為M58740,具有V200Y)序列。質粒pET-PhyM7的構建和克隆的實現與實施例2中所述的質粒pET-PhyM2的產生相似。用於將突變引入第74位胺基酸的引物為cggactcctggctgacaagggatgcccgc(SEQIDNO:5)gcgggcateccttgtcagccaggagtccg(SEQIDNO:6)已在2006年10月18日保藏了質粒pET-PhyM7,獲取號為DSM18716。質粒pAB4卯-PhyM7的構建和克隆的實現類似於實施例2所述質粒pAB4卯-PhyM2的產生。質粒pAB4卯-PhyM7的序列已經通過測序確認。因而，分離自質粒pAB490-PhyM7的表達盒含有與實施例2所述相同的單元，不同的是含有基因型PhyM7的新的特異性肌醇六磷酸酶序列。實施例4—質粒pUC-PhyM3和pAB489-PhyM3(基因型PhvM3)的構建肌醇六磷酸酶變體PhyM3含有使用裡氏木黴的密碼子用法(http:〃www.kazusa.or.ip/codon)且具有突變V200P的大腸桿菌肌醇六磷酸酶(Dassaetal.1990，獲取號為M58740)序列。在第1位具有CAG(Gln)密碼子的DNA序列含有具有1230bp的開放閱讀框，並編碼具有410個胺基酸的酶。黑麴黴肌醇六磷酸酶的長度為18個胺基酸的信號肽被用於從裡氏木黴分泌大腸桿菌的肌醇六磷酸酶突變體。在含有編碼野生型Dassa胺基酸序列的基因的質粒的基礎之上，可經由與Tomicetal.(1990，NucleicAcidsResearch,18(6)，1656)和Valletteetal.(1989，NucleicAcidsResearch,17(2)，723畫733)所述的原理類似的PCR來實現突變V200P。PCR產物由AvrII和PacI剪切，並且^C插入質粒pAB489中的裡氏木黴cbhl啟動子之後的Spel和Pad限制性酶切位點內。在新獲得的質粒pAB489-PhyM3中，大腸桿菌肌醇六磷酸酶變體PhyM3的具有經改變的黑麴黴肌醇六磷酸酶信號序列-MGVSAILLPLYLLSGVTS-(Mullaneyetal"ApplMicrobiolBiotechnol，1991，35(5)，611-614，獲取號為M94550)的基因直接由cbhl啟動子控制。黑麴黴肌醇六磷酸酶的長度為18個胺基酸的信號肽被用於自裡氏木黴分泌大腸桿菌的肌醇六磷酸酶突變體。起始密碼子上遊的屬於裡氏木黴啟動子(Shoemakeretal.1983，Bio/Technology1，691-696)的16個鹼基對(CCGCGGACTGCGCATCatg)在將AvrII-PacI肌醇六磷酸酶片段引入質粒pAB489中的Spel和Pad限制性酶切位點內後變成CCGCGGACTAGGCATCatg。已通過製作圖譜和測序確認了構建體pAB4S9-PhyM3(圖4)。可通過如下步驟來實現質粒pAB489的構建通過將其他限制性酶切位點(Spel和Pad，CCGCGGACTAGTCCTTAATTAACCGCGG)插入cbhl啟動子和cbW終止子之間的SacII位置，可由質粒pALK487(W094/28117)產生質粒pAB487。Spel-Pacl限制性酶切位點用於直接克隆肌醇六磷酸酶變體。質粒pALK424(WO93/24621)的長度為4.78kb、含有amdS遺傳標記和3，側翼的cbhl序列的平頭EcoRI/Spel片段^皮插入至pAB487的Stul限制性酶切位點，由此獲得了載體pAB489。自pAB489-PhyM3分離的表達盒含有以下遺傳物質cbhl(纖維二糖水解酶I)啟動子該含有cbhl啟動子的2.2kbEcoRI/SacII片段來源於裡氏木黴QM6a。該啟動子區域(連同cbhl3，片段；參見下文)還起同源DNA的作用，從而控制轉化DNA在cbhl基因座中的引入。信號序列黑麴黴肌醇六磷酸酶的經修飾的信號肽已被用於從裡氏木黴分泌大腸桿菌肌醇六磷酸酶。具有突變V200P的大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列(包含黑麴黴肌醇六磷酸酶信號序列)已被插入cbhl啟動子和cbhl終止子之間。cbhl終止子含有cbhl終止子的長度為0.75kb的BamHI/StuI片段被添加到大腸桿菌肌醇六磷酸酶之後，其目的是確保轉錄的終止。amdS基因包括其啟動子和終止子在內的基因分離自構巢麴黴VH1-TRSX6，並編碼乙醯胺酶(Hynesetal"1983,Mol.Cell.Biol.3:1430-1439;KellyandHynes，1985，EMBOJ.4:475-479)。乙醯胺酶使菌林能夠通過使用作為唯一氮源的乙醯胺來生長，並且這一特徵已被用於篩選轉化體。cbhl3，片段該片段(1.7kb，BamHI/EcoRI，始於該基因終止密碼子之後的1.4kb處)分離自裡氏木黴ALK02466。菌株ALK02466來源於菌林ALK0233(Harkkietal"1991，EnzymeMicrob.Technol.13:227-233)。該3，片段連同啟動子區域一起用於通過同源重組將肌醇六磷酸酶表達盒靼向整合至cbhl基因座。已將肌醇六磷酸酶變體PhyM3Gen克隆至質粒pAB2004。所獲得的質粒被稱為pUC-PhyM3(圖3)，並根據上述條件保藏，獲取號為DSM18717。質粒pAB2004以質粒pUC18為基礎，通過將其他限制性酶切位點插入HindIII-EcoRI位點來產生。實施例5-對質粒pUC-PhyM9和tAB489-PhyM9〖基因型PhyM9)的構建肌醇六磷酸酶變體PhyM9含有通過^f吏用裡氏木黴的密碼子用法(http:〃www.kazusa.or.ip/codon)的作為合成基因並具有突變L145I和L198I的大腸桿菌肌醇六磷酸酶(Dassaetal.1990,獲取號為M58740)序列。在第一位具有CAG(Gln)密碼子的DNA序列含有具有1230bp的開放閱讀框，並編碼具有410個胺基酸的酶。在質粒pAB489-PhyM9中，具有黑麴黴肌醇六磷酸酶信號序列(MGVSAVLLPLYLLSGVTS)的編碼大腸桿菌肌醇六磷酸酶變體PhyM9(Mullaneyetal"ApplMicrobiolBiotechnol，1991，35(5)，611-614，獲取號為M94550)的基因直接由cbhl啟動子控制。黑麴黴肌醇六磷酸酶的長度為18個胺基酸的信號肽被用於從裡氏木黴分泌大腸桿菌的肌醇六磷酸酶突變體。pAB489-PhyM9和pUC-PhyM9的構建可以以與實施例4中的質粒pAB489-PhyM3和pUC-PhyM3的構建方法相似的方法實現，因此除黑麴黴信號肽和特殊的大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列之外，含有相同的遺傳單元。質粒pUC-PhyM9保藏於2006年10月18日，獲取號為DSM18718。實施例6-對編碼多種突變體的質粒DUC-PhyMlO和pAB600-PhyM10(基因型PhyMlO)的構建質粒pAB600-PhyM10含有具有胺基酸變化K74D、N139R、D142E和V200P的大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列。以類似於Tomic等人(19卯，NucleicAcidsResearch,18(6)，1656)和Vallette等人(1989，NucleicAcidsResearch,17(2)，723-733)的原理通過PCR法從質粒pAB490-PhyM2、pAB490-PhyM7和pAB489-PhyM3產生編碼肌醇六磷酸酶變體PhyMlO的基因。PCR產物由Spel和Pad切割，並被插入質粒pAB600的Spel和Pad限制性酶切位點。已通過製作圖謙和測序確認了所獲得的質粒pAB600-PhyM10(圖6)。在質粒pAB600-PhyM10中，大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列已通過kexll限制性酶切位點被融合至CBHII基因片段的3，末端。kex序列含有如下胺基酸RTLVKR。質粒pAB600的構建通過如下步驟來實現質粒pAB1280以pUC18為基礎，含有cbhll基因片段(核苷酸1-307對應於胺基酸M1至S86，Teerietal，1987，Gene51:43-52，獲取號為161卯)，由來自質粒pALK487(WO94/28117)的cbhl啟動子和cbhl終止子控制的。另外，還已將其他限制性酶切位點(Spel和Pad)插入cbhll基因片段的下遊。這些限制性酶切位點被用於直接克隆肌醇六磷酸酶變體。已經通過PCR方法從質粒p3SR2(Hynesetal.，1983，Mol.Cell.Biol.3，1430-1439;KellyandHynes,1985，EMBOJ.4，475-479)分離出Ascl-Nrul片段形式的乙醯胺酶(amdS)基因，並將其插入至由Ascl/Stul切割的質粒pAB1280中。對於amdS基因的擴增而言，以下引物得自構巢麴黴乙醯胺酶基因的序列信息AmdS-AscIaggcgcgccctagtcatcattggataggcagattactcag(SEQIDNO:7)AmdS-NruIggaattctcgcgaaaggcaacaaccagctcacccctgag(SEQIDNO:8)所獲得的質粒被稱為pAB600,並已通過製作圖諉和測序確認。已將肌醇六磷酸酶變體PhyMlO的基因克隆至質粒pAB2004中。質粒pUC-PhyM10示於圖5,並與2006年10月18日保藏，獲取號為DSM18719。實施例7-質粒uPhy2005和pAB-Pliy2005(基因型Phy2005)的構建質粒pAB-Phy2005的構建可通過如下步驟來實現1.pPhv2005的構建質粒pPhy2005含有黑麴黴變種泡盛黑麴黴的酸性磷酸酶(ap)基因(Piddingtonetal"1993，Gene133(1)，55-62;獲取號為L02420)和通過^吏用裡氏木黴的密碼子用法(h加:〃ww.kazusa.or.ip/codon)的大腸桿菌肌醇六磷酸酶基因(Dassaetal.1990，獲取號為M58740)的融合物。由此獲得了編碼具有457個胺基酸的肌醇六磷酸酶變體的開放閱讀框，其中該大腸桿菌肌醇六磷酸酶基因的前四(4)個胺基酸由酸性磷酸酶基因的前五十一(51)個胺基酸替代。為了在裡氏木黴中分泌由酸性磷酸酶和大腸桿菌肌醇六磷酸酶的融合物組成的蛋白，使用了該酸性磷酸酶的信號序列。合成了黑麴黴變種泡盛黑麴黴的酸性磷酸酶Up)序列和通過使用裡氏木黴的密碼子用法產生的大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列的融合物，並已將其克隆至質粒pUC18中。所獲得的質粒pPhy2005通過測序確認。該質粒示於圖7,並於2006年10月18日保藏，獲取號為DSM18720。2.pAB-Phv2005的構建為構建質粒pAB-Phy2005,將來自質粒pPhy2005的磷酸酶-肌醇六磷酸酶的融合物序列用AvrII和Pacl限制性酶切，並將其插入至質粒pAB489中的裡氏木黴cbhl啟動子之後的Spel和Pacl限制性酶切位點。所獲得的質粒;故稱為pAB-Phy2005(圖8)，並已通過限制性內切酶製作圖譜，並通過測序確認。分離自pAB-Phy2005的表達盒含有如下遺傳物質cbhl(纖維二糖水解酶I)啟動子該含有cbhl啟動子的2.2kbEcoRI/SacII片段來源於裡氏木黴QM6a。該啟動子區域(連同cbhl3，片段；參見下文)還起同源DNA的作用，從而控制轉化的DNA向cbhl基因座中的整合。酸性磷酸酶基因片段具有其信號序列的酸性磷酸酶基因片段直接受控於cbhl啟動子。起始密碼子上遊的屬於裡氏木黴啟動子(Shoemakeretal.1983，Bio/Technology1，691-696)的16個鹼基對(CCGCGGACTGCGCATCatg)在摻入AvrII-PacI融合磷酸酶肌醇六磷36酸酶片段內後變成CCGCGGACTAGGCATCatg。大腸桿菌肌醇六磷酸酶基因合成的大腸桿菌肌醇六磷酸酶基因直接融合至酸性磷酸酶序列3，末端形成一個開放閱讀框。cbhl終止子含有cbhl終止子的長度為0.75kb的BamHI/StuI片段被添加至大腸桿菌肌醇六磷酸酶之後，目的是確保轉錄的終止。amdS基因該基因(包括其啟動子和終止子)分離自構巢麴黴VH1-TRSX6，編碼乙醯胺酶(Hynesetal.，1983，Mol.Cell.Biol.3:1430-1439;KellyandHynes，1985，EMBOJ.4:475-479)。乙醯胺酶使得菌林能夠通過使用乙醯胺作為唯一氮源來生長，並且這一特徵已被用於篩選轉化體。cbhl3，片段該片段(1.7kb，BamHI/EcoRI,始於該基因終止密碼子之後的1.4kb處)分離自裡氏木黴ALK02466。菌林ALK02466來源於菌林ALK0233(Harkkietal"1991，EnzymeMicrob.Technol.13:227-233)。該3'片段連同啟動子區域一起用於經由同源重組將肌醇六磷酸酶表達盒靶向整合至cbhl基因座。實施例8-質粒pPhy2006和pAB-Phy2006(基因型Phy2006)的構建質粒pAB-Phy2006的構建已通過如下步驟實現1.pPhy2006的構建為構建質粒pPhy2006，、將用於編碼屬於黑麴黴泡盛黑麴黴的酸性磷酸酶ap-基因C端的29個胺基酸的長度為87bp的ap-基因片段直接融合至質粒pPhy2005中編碼大腸桿菌肌醇六磷酸酶的DNA序列的最後一個胺基酸(亮氨酸)上。藉此，獲得了具有486個胺基酸的開放閱讀框。黑麴黴變種泡盛黑麴黴的酸性磷酸酶序列和通過裡氏木黴的密碼子用法產生的大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列的融合體Phy2006被合成，並被克隆至質粒pUC18。包含在所獲得質粒pPhy2006中的新序列通過測序確^人。該質粒示於圖9，並於2006年10月18日保藏，獲取號為DSM18721。2.pAB-Phy2006的構建質粒pAB-Phy2006的構建以及克隆與實施例7所述質粒pAB-Phy2005的產生相同。肌醇六磷酸酶變體pAB-Phy2006(圖10)的序列已通過測序確認。實施例9-裡氏木黴的轉化裡氏木黴RH3780d已分別由分離自質粒pAB489-PhyM3、pAB4卯畫PhyM2、pAB490-PhyM7、pAB489-PhyM9、pAB600-PhyM10、pAB-Phy2005和pAB-Phy2006的線化表達盒轉化。用於轉化和操縱裡氏木黴的技術是依據Penttim等人(1987，Gene61:155-164)的那些技術。已通過單孢子分離對轉化體進行了兩輪篩選和純化。在所有轉化體中選出了分泌效能最高的轉化體，並在實施例10中進一步用於產生酶物質。所使用的轉化體列於下表2。表2:用於在實施例10-13中進行進一步實驗的轉化體列表tableseeoriginaldocumentpage38實施例10-使用各突變體產生酶A)通過在振蕩培養瓶中發酵來產生酶溶液攜帶實施例2-8的表達盒的轉化體，或者具有源於DE102004050410的質粒pKDa2(Ml)和pKDa4(Dassa的野生型大腸桿菌肌醇六磷酸酶的胺基酸序列)的轉化體，在DASGIP^S司的具有pH控制的振蕩培養瓶中培養，培養基為纖維素酶誘導的具有如下組成的培養基乳糖10.5%(w/v)、DSG5.25%(w/v)、(NH4)2S040.63%(w/v)、餘量為自來水，滅菌之前先將該培養基的pH值調為4.5。接種之後，5小時內振蕩培養瓶中的pH增加升高到pH為3.3。在pH值^f皮控制為3.3的情況下培養6天之後所獲得的培養物濾液用於確定肌醇六磷酸酶的活性，並用於通過差示掃描量熱儀(DSC)分析熱穩定性(實施例11)。B)通過在30L生物反應器中發酵並在ProCel15中乾燥來生產酶顆粒將實施例IOA)的轉化體在30L生物反應器中於實施例10A中的培養基中培養，pH值為pH3.2±0.2，200至400upm，並且通氣速率為0.5wm。6天發酵結束時，通過過濾分離生物量，並通過超濾(30kDa的截留膜)將澄清的培養剩餘物濃縮六倍。將濃縮物無菌過濾，然後用於後續酶顆粒的生產。通過在型號為ProCel15的噴霧制粒器(FirmaGlattSystemtechnikGmbH，Dresden,Germany)中乾燥從而由UF濃縮物生產顆粒。為此，將UF濃縮物的pH值調至pH5.2,並且在乾燥之前，加入乳糖含量為30%的50%(w/w)脫脂奶粉和9.2%(w/w)的丙酸鈣(兩種成分均以UF濃縮物的總蛋白含量為基準)。在80。C-卯。C的進氣溫度下，通過氣壓從1.2巴升至2.2巴的直徑為1.2mm的二元噴嘴來乾燥混合物。乾燥時的活性產率範圍在89至99%內。由此生產的顆粒已被用於實施例12中的測試。實施例11-通過DSC確定溫度穩定性通過一個PD10柱(Pharmacia)，將實施例IOA)的樣本緩衝至100mM乙酸鈉緩衝液(pH5.2)中。為此，使用1.5ml的樣本，並依據生產商的說明書由3.5ml的緩衝液進行洗脫。所有DSC測試均在VP-DSC設備(MicroCalInc.,Northampton,MA,USA)上進行，並將數據輸入PC中，其目的是通過軟體Originv7.0383(OriginLabCorp.Northampton,MA，USA)來進行評估。測量之前，用ThermoVac2(MicroCalInc.,Northampton,MA;USA)對樣本脫氣20分鐘並使樣本在水浴中於25。C回溫。測量可通過如下參數實現A)恆定設備參數樣品池體積0.51231ml參照熱阻1009.1歐樣品池熱阻1002.7歐絕熱率0.88181厶T讀數3.676B)VP-DSC掃描參數如下掃描速率(上行和下行)1°Cmhf1掃描循環之前的溫度25°C循環之前的平衡時間15min循環之後的平衡時間0min過濾10s反饋無起始溫度25°C結束溫度105°C樣品池壓力26.1至28.7psi下表3給出了突變型大腸桿菌肌醇六磷酸酶(依據上述實施例產生)、與之作比較的野生型大腸桿菌肌醇六磷酸酶(Dassaetal.，1990，由與產生突變型大腸桿菌肌醇六磷酸酶變體相同的宿主系統產生)和具有非本發明的突變(Ml)的大腸桿菌肌醇六磷酸酶(同樣由與產生本發明突變型大腸桿菌肌醇六磷酸酶變體相同的宿主系統產生)的熔融溫度Tm(攝氏度)和熔融溫度的偏移AT(攝氏度)。表3:與野生型蛋白相比，大腸桿菌肌醇六磷酸酶突變體的熔融溫度Tm[。C和熔融溫度的偏移AT[°C],它們全都根據實施例IOA在裡氏木黴中產生。40tableseeoriginaldocumentpage41結果表明，本發明的任一突變體中蛋白的熔融溫度升高，這表明熔點溫度的正偏移。熔點溫度的升高等價於溫度穩定性的增強。因此，雙突變M2的熱穩定性得到最大程度增強，AT=+1.11°C。相反，在DE102004050410中描述的用於增強分泌豐度的突變(V200Y=Ml)表現出熱穩定性下降(AT=-0,63°C)。N端或N端和C端的延長也表現出熱穩定性得到增強，其數量級與點突變M3的相同。實施例12-粒化法中熱穩定性的測量依據實施例10B)生產的酶顆粒與550型小麥粉預先混合，其目的是為了獲得300g含有酶的預混料。在丹麥Kolding的食品和分子生物技術研究所的生物技術所內，將該預混料與15kg動物飼料混合，其目的是確保添加物在285kg的動物飼料中的最佳稀釋度，以及可容易地確定粒化物質中酶的活性。所使用的酶顆粒的量使在進行測試之前混合物中的肌醇六磷酸酶活性為約3至6酶單位/克動物飼料。已在中試粒化設備中處理的300kg動物飼料具有表4的組成。表4:準備粒化的動物飼料的組成tableseeoriginaldocumentpage42*含有基因型為野生型、PhyMl、PhyM2、PhyM3、PhyM7、PhyM9、Phy2005或Phy2006的肌醇六磷酸酶粒化條件體積為700L、48upm的水平攪拌機。用於混合的量範圍在80至300kg/h。與攪拌機連接的是用於清空攪拌機的水平輸送螺杆，調整該輸送螺杆的速度使其適應後續步驟。在水平攪拌機中混合之後，在長度為130cm、直徑為30cm、155upm並具有37個小室的KaW階式攪拌機(Conditioner)中進行熱處理。吞吐量為300kg/h。動物銅料和酶與飽和蒸氣接觸約30s，因而被加熱至70。C和95。C之間的溫度。由DanStoker高壓汽鍋提供的蒸氣以2巴的超壓流過階式攪拌器中的壓力調節閥。該岡調節流入階式攪拌機中並將動物伺料(包括酶)加熱的蒸氣量。經處理的物質由SimonHeesen壓力機粒化，之後在以1500m3!^1灌流的多孔盒中經空氣冷卻。粒化壓力機以500upm運行，輸入功率為7.5kW，因而產得3x20mm的顆粒。在階式攪拌機中的處理致使對包含在粒化物質中的酶進行了熱負載。在產生顆粒之後，測定了粒化動物飼料中肌醇六磷酸酶活性回收率。在下表5中，示出了粒化動物飼料中與處理期間溫度相關的肌醇六磷酸酶活性回收率。表5:在70。C至95。C下處理並接著進行粒化之後動物飼料中肌醇六磷酸酶活性回收率。所有的酶均使用裡氏木黴進行重組表達。tableseeoriginaldocumentpage43結果表明，藉助於DSC在液體測量時發現的熱穩定性的改變也在"幹"粒化測試中發現。因此，相對於野生型酶，並非所有突變體的熱穩定性改善在整個測量的溫度範圍內是恆定不變的。M2已在DSC測試中表現出最高的溫度穩定性。同樣在粒化測試中，最佳穩定性通過在分離區域中由雙突變M2實現，所述突變向大腸桿菌肌醇六磷酸酶的螺旋D中插入離子鍵/橋。與在裡氏木黴中表達的野生型酶相比，非本發明的突變體Ml表現出正如在DSC測試中示出的熱穩定性下降。突變3,其自身也並非依據本發明，表現出與野生型酶相似的熱穩定性特徵。只有N端延長具有由黑麴黴變種泡盛黑麴黴的酸性磷酸酶的相應部分的變體Phy2005在較高溫度下不如既有N端延長又有C端延長的Phy2006那樣穩定。這可被認為提示了，這些延長可有助於大腸桿菌肌醇六磷酸酶分子以與正常條件下酸性磷酸酶的二聚化相似的方式進行締合，從而增強熱穩定性。實施例13-體外法測量蛋白水解穩定性為了測定蛋白水解的體外穩定性，使用了實施例10A)的酶樣本，即轉化體M1(非本發明的突變)、M2、M3、M7、Phy2005和Phy2006的樣本，以及由表2轉化體產生的樣本。將每亳升含有20個蛋白酶單位的20ml胃蛋白酶溶液(Merck7190，溶於甘氨酸-HCL緩衝液，pH2.5)——其中所述活性根據生產商提供的說明書是指25°C時pH為1.6的血紅蛋白的活性一一在40。C加熱。加入10ml肌醇六磷酸酶溶液(1:100稀釋)並將該溶液用緩衝液補足至50ml，之後在40。C，pH2.5溫育30分鐘。通過浸入冰/水浴中終止反應，隨即用氳氧化鈉溶液使pH值升至pH5，隨後將溶液稀釋至100ml。然後依據實施例l測量肌醇六磷酸酶的活性。將已由胃蛋白酶處理的10ml溶液調至pH為7。加入含有30個蛋白酶單位(酪蛋白，pH8.0，35°C)的30ml胰酶製劑溶液(Merck7130，溶於0.05MTris-HCl緩衝液(pH7.0))，將該溶液用Tris-HCl緩衝液(pH7)稀釋至50ml，並在40。C水浴中溫育30分鐘。通過浸入冰/水浴中終止反應，隨即用HC1使pH值降至pH5,隨後將溶液稀釋至100ml。然後依據實施例1測量肌醇六磷酸酶的活性。結果示於表6。表6.用胃蛋白酶接著用胰酶製劑處理酶突變體之後的活性回收率tableseeoriginaldocumentpage44結果表明，在體外條件，如羊胃動物例如豬的胃中的條件下，與參照突變體PhyMl相比，本發明所有突變體在存在胃蛋白酶和胰蛋白酶的情況下均表現出非常高的蛋白水解穩定性。在此表現出的高蛋白水解穩定性表明酶突變體特別適用於動物飼料領域。國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約ABEnzymesGmbHFeldbergstr.7864293Darmstadt國際表原始保藏的情況下的收據由本頁底部說明的國際保藏單位根據規則第7條第1款發布tableseeoriginaldocumentpage451如果應用規則6/4(d)，這些數據的日期是國際保藏單位收到的日期表DSMZ-BP/4(單頁)08/2006國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約國際表ABEnzymesGmbHFeldbergstr78存活證明64293Darmstadt由下述國際保藏單位根據規則第10條第2款公布1.保藏人II.所述微生物說明名稱ABEnzymesGmbHFeldbergsti'.7864293Darmstadt地址國際保藏單位給出的編號DSM18715保藏和轉移的吋間'2006年10月18日111.存活證明在2006年10月19日2,測試根據II說明的所述微生物的存活情況。在該日期，所述微生物是X存活的不存活的IV.進行的活力測試的條件4V.國際保藏單位名稱DSMZ-德國微生物菌種保藏中心地址lnhoffenstr.7BD-38124Braunschweig國際保藏單位代表人或經授權的人員的籤名日期2006年IO月24曰表示所述原保藏的日助，如果已經進行新保藏或轉移則表示最近的相關日期(所述新保藏或所述轉移的日助)。2在規則第10條第2款(a)(ii)和(iii)的轉移的情況，指的是最近的活力測試。3如果適W以十字義標記。4如果測試結^為陰性，需耍填寫相關信息。表DSMZ-BP/9(單頁)08/2006國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約國際表ABEnzymesGmbHFeidbergsti'.7864293Darmstadt原始保藏的情況下的收據由本頁底部說明的國際保藏單位根據規則第7條第1款發布1.所述的微生物的說明保藏人給出的識別參考號pET-PhyM7國際保藏單位給出的編號DSM18716II.科學描述和/或建議的分類學指定根據上文I說明的所述微生物具有-科學描述建議的分類學名稱(如果適w以十字叉標記)川.收到和確認該國際保藏單位收到根據上文I說明的所述微生物，收到日期是2006年10月18日(原保藏日期)IV.收到變換諾求該國際保藏單位收到根據上文I中說明的所述微生物的日期是(原始保藏日期)，收到所述原保藏變換成根據布達佩斯條約的保藏的請求於(收到變換請求的日期)V.國際保藏單位名稱DSMZ-德國微生物菌種保藏中心地址Inhoffenstr.7BD-38124Braunschweig國際保藏單位代表人或經授權的人員的籤名日期2006年10月24日1如果應川規則6/4(d)，這些數據的日期是國際保藏單位收到的日期表DSMZ-BP/4(單頁)08/200647國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約國際表ABEnzymesGmbHFeldbergstr.78存活證明64293Darmstadt由下述國際保藏單位根據規則第10條第2款公布L保藏人II.所述微生物說明名稱ABEnzymesGmbHFeldbergstr.7864293Darmstadt地址國際保藏單位給出的編號DSM18716保藏和轉移的時間、2006年10月18日m.存活證明在2006年10月19日2,測試根據II說明的所述微生物的存活情況。在該日期，所述微生物是X存活的不存活的IV.進行的活力測試的條件4V.國際保藏單位名稱DSMZ-德國微生物齒種保藏中心地址lnhoffenstr.7BD-38124Braunschweig國際保藏單位代表人或經授權的人員的籤名日期2006年10月24日表示所述原保藏的日朋，如果已經進行新保藏或轉移則表示最近的相關日期(所述新保藏或所述轉移的日期)。2在規則第10條第2款(a)(ii)和(iii)的轉移的情況，指的是最近的活力測試。如果適W以十字義標記。4如果測試結果為陰性，需耍填寫相關信息。表DSMZ-BP/9(單頁)08/2006國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約ABEnzymesGmbHFeldbergstr.7864293Darmstadt國際表原始保藏的情況下的收據由本頁底部說明的國際保藏單位根據規則第7條第1款發布1.所述的微生物的說明保藏人給出的識別參考號:pUC—PhyM3國際保藏單位給出的編號:DSM1871711.科學描述和/或建議的分類學指定根據上文1說明的所述微生物具有-科學描述建議的分類學名稱(如果適川以十字義標記)m.收到和確認該國際保藏單位收到根據上文i說明的所述微生物，收到日期是2006年IO月18日(原保藏日期)IV.收到變換i行求該國際保藏單位收到根據上文I中說明的所述微生物的日期是(原始保藏日期)，收到所述原保藏變換成根據布達佩斯條約的保藏的請求於(收到變換請求的日朗)V.國際保藏單位名稱DSMZ-德國微生物菌種保藏中心地址tnhoffenstr.7BD-38124Braunschweig國際保藏單位代表人或經授權的人員的籤名日期2006年10月24日'如果應W規則6/4(d)，這些數據的日期是國際保藏單位收到的曰期表DSMZ-BP/4(單頁)08/200649國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約國際表ABEnzymesGmbHFeldbei'gstr.78存活證明64293Darmstadt由下述國際保藏單位根據規則第10條第2款公布1.保藏人II.所述微生物說明名稱ABEnzymesGmbHFeldbergstr.7864293Darmstadt地址國際保藏單位給出的編號DSM18717保藏和轉移的時間、2006年10月18曰川.存活證明在2006年IO月19日2，測試根據II說明的所述微生物的存活情況。在該日期，所述微生物是X存活的不存活的IV.進行的活力測試的條刊:4V.國際保藏單位名稱DSMZ-德國微生物菌種保藏中心地址lnhoffenstr.7BD-38124Braunschweig國際保藏單位代表人或經授權的人員的籤名日期2006年10月24日表示所述原保藏的日期，如果已經進行新保藏或轉移則表示最近的相關日期(所述新保藏或所述轉移的日期)。在規則第10條第2款(a)(ii)和(m)的轉移的情況，指的是最近的活力測試。如果適W以十字義標記。如果測試結果為陰性，需耍填寫相關信息。表DSMZ-BP/9(單頁)08/2006國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約ABEnzymesGmbHFeldbergstr.7864293Da應tadt原始保藏的情況下的收據由本頁底部說明的國際保藏單位根據規則第7條第1款發布所述的微生物的說明保藏人給出的識別參考號:pUC-PhyM9國際保藏單位給出的編號:DSM18718II.科學描述和/或建議的分類學指定根據上文1說明的所述微生物具有:科學描述建議的分類學名稱(如果適川以十字叉標記)ni.收到和確認該國際保藏單位收到根據上文I說明的所述微生物，收到日期是2006年10月18日(原保藏日期)!V.收到變換諾求該國際保藏單位收到根據上文I中說明的所述微生物的日期是(原始保藏日期)，收到所述原保藏變換成根據布達佩斯條約的保藏的請求於(收到變換諾求的日期)V.國際保藏單位名稱DSMZ--德國微生物齒種保藏中心地址lnhoffensti'.7BD-38124Braunschweig國際保藏單位代表人或經授權的人員的籤名日期2006年10月24日1如果應用規則6/4(d)，這些數據的日期是國際保藏單位收到的日期表DSMZ-BP/4(單頁)08/200651國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約國際表ABEnzymesGmbHFeldbergstr.78存活證明64293Darmstadt由下述國際保藏單位根據規則第10條第2款公布1.保藏人n.所述微生物說明名稱ABEnzymesGmbHFeldbergstr.7864293Darmstadt地址國際保藏單位給出的編號-DSM腦8保藏和轉移的時間'2006年10月18日川.存活證明在2006年10月19日2，測試根據II說明的所述微生物的存活情況。在該日期，所述微生物是X存活的不存活的iV.進行的活力測試的條件4V.國際保藏單位名稱DSMZ-德國微生物菌種保藏中心地址lnhoffenstr.7BD—38124Braunschweig國際保藏單位代表人或經授權的人員的籤名日期2006年10月24曰表示所述原保藏的日期，如果已經進行新保藏或轉移則表示最近的相關日期(所述新保藏或所述轉移的日期)。在規則第10條第2款(a)(ii沐(iii)的轉移的情況，指的是最近的活力測試。如果適W以十字義標記。如果測試結果為陰性，需耍填寫相關信息。表DSMZ-BP/9(單頁)08/2006國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約ABEnzymesGmbHFeldbergstr.7864293Darmstadt國際表原始保藏的情況下的收據由本頁底部說明的國際保藏單位根據規則第7條第1款發布!.所述的微生物的說明保藏人給出的識別參考號pUC—PhyMlO國際保藏單位給出的編號:DSM1871911.科學描述和/或建議的分類學指定根據上文1說明的所述微生物具有:科學描述建議的分類學名稱(如果適W以十字叉標記)川.收到和確認該國際保藏單位收到根據上文I說明的所述微生物，收到日期是2006年10月18日(原保藏日期)IV.收到變換濟求該國際保藏單位收到根據上文I中說明的所述微生物的日期是(原始保藏日期)，收到所述原保藏變換成根據布達佩斯條約的保藏的請求於(收到變換請求的日期)V.國際保藏單位名稱DSMZ-德國微生物菌種保藏中心土也址Inhoffenstr.7BD-38124Braunschweig國際保藏單位代表人或經授權的人員的籤名曰期2006年10月24日'如果應用規則6/4(d)，這些數據的日期是國際保藏單位收到的日期表DSMZ-BP/4(單頁)08/2006國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約國際表ABEnzymesGmbHFeldbei^st「78存活證明64293Darmstadt由下述國際保藏單位根據規則第10條第2款公布1.保藏人IL所述微生物說明名稱ABEnzymesGmbHFeldbergstr.7864293D讓stadt地址國際保藏單位給出的編號DSM18719保藏和轉移的時間、2006年10月18曰m.存活證明在2006年10月19日2，測試根據n說明的所述微生物的存活情況。在該日期，所述微生物是-〉〈存活的不存活的IV.進ff的活力測試的條件4v.國際保藏單位名稱DSMZ--德國微生物菌種保藏中心地址lnhoffenstr.7BD-38〗24Braunschweig國際保藏單位代表人或經授權的人員的籤名日期2006年0月24□表示所述原保藏的日期，如果己經進行新保藏或轉移則表示最近的相關日期(所述新保藏或所述轉移的日期)。2在規則第10條第2款(a)(H)和(iii)的轉移的情況，指的是最近的活力測試。3如果適用以十字義標記。4如果測試結果為陰性，需耍填寫相關信息。表DSMZ-BP/9(單頁)08/200654,承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約ABEnzymesGmbHFeldbergstr.7864293Darmstadt國際表原始保藏的情況下的收據由本頁底部說明的國際保藏單位根據規則第7條第1款發布I.所述的微生物的說明保藏人給出的識別參考號:pPhy2005國際保藏單位給出的編號:DSM18720U.科學描述和/或建議的分類學指定根據上文1說明的所述微生物具有科學描述建議的分類學名稱(如果適MJ以十字叉標記)111.收到和確認該國際保藏單位收到根據上文l說明的所述微生物，收到日期是2006年10月18日(原保藏日期)IV.收到變換諾求該國際保藏單位收到根據上文I中說明的所述微生物的日期是(原始保藏日期)，收到所述原保藏變換成根據布達佩斯條約的保藏的請求於(收到變換請求的日期)V.國際保藏單位名稱DSMZ-德國微生物菌種保藏中心地上l卜lnl，offensti'.7BD-38124Braunschweig國際保藏單位代表人或經授權的人員的籤名日期2006年10月24日'如果應W規則6/4(d)，這些數據的日期是國際保藏單位收到的日期表DSMZ-BP/4(單頁)08/200655國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約國際表ABEnzymesGmbHFeldbergstr78存活證明64293Darmstadt由下述國際保藏單位根據規則第10條第2款公布L保藏人II.所述微生物說明名稱ABEnzymesGmbHFeldbergstr.7864293Darmstadt地址國際保藏單位給出的編號DSM18720保藏和轉移的時間'2006年10月18日in.存活證明在2006年IO月19日2，測試根據II說明的所述微生物的存活情況。在該日期，所述微生物是X存活的不存活的IV.進行的活力測試的條件4v.國際保藏單位名稱DSMZ-德國微生物菌種保藏中心地址Inhoffenstr.7BD—38124Braunschweig國際保藏單位代表人或經授權的人員的籤名日期2006年10月24日表示所述原保藏的日期，如果已經進行新保藏或轉移則表示最近的相關日期(所述新保藏或所述轉移的日期)。2在規則第10條第2款(a)(ii)和(的的轉移的情況，指的是最近的活力測試。3如果適用以十字義標記。4如果測試結果為陰性，需耍填寫相關信息。表DSMZ-BP/9(單頁)08/2006國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約ABEnzymesGmbHFeldbergstr.7864293Dannstadt國際表原始保藏的情況下的收據由本頁底部說明的國際保藏單位根據規則第7條第1款發布tableseeoriginaldocumentpage57'如果應用規則6/4(d)，這些數據的日期是國際保藏單位收到的曰期表DSMZ-BP/4(單頁)08/2006國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約國際表ABEnzymesGmbHFeldbergstr.78存活證明64293Darmstadt由下述國際保藏單位根據規則第10條第2款公布1.保藏人II.所述微生物說明名稱ABEnzymesGmbHFeldbe餵tr.7864293Darmstadt地址國際保藏單位給出的編號DSM18721保藏和轉移的時間、2006年10月18日m.存活證明在2006年IO月19日2，測試根據II說明的所述微生物的存活情況。在該日期，所述微生物是[x]存活的_^□不存活的IV.進行的活力測試的條件4v.國際保藏單位名稱DSMZ-德國微生物菌種保藏中心地址lnhoffenstr.7BD-38124Braunschweig國際保藏單位代表人或經授權的人員的籤名日期2006年10月24日表示所述原保藏的日期，如果己經進行新保藏或轉移則表示最近的相關日期(所述新保藏或所述轉移的日助)。在規則第10條第2款(a)(ii)和(m)的轉移的情況，指的是最近的活力測試。如果適W以十字義標記。如果測試結果為陰性，需耍填寫相關信息。表DSMZ-BP/9(單頁)08/200權利要求1.重組DNA分子，其在原核宿主細胞或真核宿主細胞中表達之後編碼一具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其中所述重組DNA分子具有選自如下的DNA序列a)編碼具有肌醇六磷酸酶活性並通過改變成熟的野生型大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列所獲得的多肽的DNA序列，所述改變選自i)第74位賴氨酸→天冬氨酸(K74D)的突變，和/或ii)第139位的天冬醯胺→精氨酸(N139R)和第142位的天冬氨酸→穀氨酸(D142E)的組合突變，和/或iii)第145位的亮氨酸→異亮氨酸(L145I)和第198位的亮氨酸→異亮氨酸(L198I)的組合突變，和/或iv)第200位的纈氨酸→脯氨酸(V200P)的突變，和/或v)N端或C端或者N端和C端兩端增加黑麴黴變種泡盛黑麴黴的酸性磷酸酶或黑麴黴的肌醇六磷酸酶的序列片段，b)與a)列出的序列具有70-100％同源性的DNA序列，c)因遺傳密碼子的簡併性而與a)和b)列出的序列有關的DNA序列，其中所述重組DNA分子在合適的宿主細胞中表達時，其編碼得到的蛋白的酶活性具有增強的溫度穩定性和蛋白酶穩定性，其中改變iii)和iv)僅與改變i)、ii)和/或v)聯合提供。2.權利要求1的重組DNA分子，其特徵在於所述DNA序列包含對所述被編碼多肽的改變N139R和D142E。3.權利要求1的重組DNA分子，其特徵在於所述DNA序列至少包含所述^^編碼多肽的改變V200P。4.權利要求1的重組DNA分子，其特徵在於所述DNA序列包含所述一皮編碼多肽的改變K74D。5.權利要求1的重組DNA分子，其特徵在於所述DNA序列至少包含所述^皮編碼多肽的改變L145I和L198I。6.權利要求1的重組DNA分子，其特徵在於所述DNA序列包含所述被編碼多肽的改變K74D、N139R、D142E和V200P。7.權利要求1的重組DNA分子，其特徵在於所述被編碼多肽的N端增加包括序列FSYGAAIPQSTQEKQFSQEFRDGYSILKHYGGNGPYSERVSYGIARDPPTS。8.權利要求1的重組DNA分子，其特徵在於所述^皮編碼多肽的N端增加包括序列LSFWWNYNTTTELNYRSSPIACQEGDAMD。9.權利要求1的重組DNA分子，其特徵在於所述被編碼多肽的N端增加包括序列FSYGAAIPQSTQEKQFSQEFRDGYSILKHYGGNGPYSERVSYGIARDPPTS，並且所述4皮編碼多肽的C端增加包括序列LSFWWNYNTTTELNYRSSPIACQEGDAMD。10.權利要求l-8任一項的重組DNA分子，其特徵在於它包括選自序列SEQIDNO:9、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21的序列。11.多肽，所述多肽具有肌醇六磷酸酶活性並且由權利要求1-10任一項所述的重組DNA分子編碼，或者通過由該重組DNA分子轉化的宿主細胞表達獲得。12.權利要求ll的多肽，其特徵在於它包括選自SEQIDNO:IO、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22的序列。13.DNA構建體，所述DNA構建體具有在被引入合適的宿主細胞後控制突變的肌醇六磷酸酶基因在宿主中表達的能力，其特徵在於它任選地含有啟動子，任選含有信號序列和標記序列，含有權利要求1-10任一項所述的DNA序列，終止子，並任選地含有5，和3，側翼序列。14.權利要求13的DNA構建體，其特徵在於所述啟動子為纖維二糖水解酶-I啟動子、纖維二糖水解酶-II啟動子、澱粉酶啟動子、葡糖澱粉酶啟動子，木聚糖酶啟動子或烯醇酶啟動子。15.權利要求14的DNA構建體，其特徵在於所述信號序列和/或所述5，和3，側翼序列為來源於黑麴黴的任選被修飾的肌醇六磷酸酶信號序列。16.具有轉化宿主細胞的能力的載體，其特徵在於所述載體含有權利要求13的構建體。17.權利要求16的載體，其特徵在於它選自以獲取號DSM18715保藏的質粒pET-PhyM2、以獲取號DSM18717保藏的質粒pUC-PhyM3、以獲取號DSM18716保藏的質粒pET-PhyM7、以獲取號DSM18718保藏的質粒pUC-PhyM9、以獲取號DSM18719保藏的質粒pUC-PhyM10、以獲取號DSM18720保藏的質粒pPhy2005、以獲取號DSM18721保藏的質粒pPhy2006。18.被轉化的宿主細胞，選自真菌、酵母、細菌和哺乳動物細胞，含有權利要求1-10任一項所述的重組DNA分子，並具有表達具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的能力。19.權利要求18的被轉化的宿主細胞，其特徵在於它屬於麴黴屬、根黴屬、木黴屬、脈孢黴屬或青黴屬。20.肌醇六磷酸酶的生產方法，其特徵在於將權利要求18或19所述的被轉化的宿主細胞在有利於生產肌醇六磷酸酶的條件下培養，並分離由此產生的肌醇六磷酸酶。21.含有權利要求11或12所述的多肽並任選地含有其他輔助成分或活性成分的組合物。22.權利要求21的組合物，其特徵在於它包含脫脂奶粉和/或丙酸鈣。23.權利要求21的組合物，其特徵在於所述組合物為食品組合物和動物飼料組合物。24.權利要求21、22或23的組合物，其特徵在於所述組合物為烘焙添加劑。25.權利要求11或12的多肽在生產提高食品和動物飼料的磷酸酶利用度的製劑中的用途。26.權利要求ll或12的多肽在改進用於生產烘焙產品的生麵團的流變學特徵中的用途。27.成熟的野生型大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列的改變在生產重組DNA分子中的用途，所述重組DNA分子在原核宿主細胞或真核宿主細胞中表達後，編碼溫度穩定性和蛋白酶穩定性得到增強的肌醇六磷酸酶活性的多肽，所述改變選自i)第74位賴氨酸—天冬氨酸(K74D)的突變，和/或ii)第139位的天冬醯胺—精氨酸(N139R)和第142位的天冬氨酸—穀氨酸(D142E)的組合突變，和/或iii)笫145位的亮氨酸—異亮氨酸(L145I)和第198位的亮氨酸—異亮氨酸(L198I)的組合突變，和/或iv)笫200位的纈氨酸—脯氨酸(V200P)的突變，和/或v)N端或C端或者N端和C端兩端添加黑麴黴變種泡盛黑麴黴的酸性磷酸酶或黑麴黴的肌醇六磷酸酶的序列片段。28.權利要求27的用途，其特徵在於所述改變為K74D。29.權利要求27的用途，其特徵在於所述改變為N139R和D142E。30.權利要求27的用途，其特徵在於所述改變為L145I和L1981。31.權利要求27的用途，其特徵在於所述改變為V200P。32.權利要求27的用途，其特徵在於所迷改變為K74D、N139R、D142E、V200P。33.權利要求27的用途，其特徵在於所述改變為N端增加序列FSYGAAIPQSTQEKQFSQEFRDGYSILKHYGGNGPYSERVSYGIARDPPTS。34.權利要求27的用途，其特徵在於所述改變為C端增加序列LSFWWNYNTTTELNYRSSPIACQEGDAMD。35.權利要求27的用途，其特徵在於所述改變為N端增加序列FSYGAAIPQSTQEKQFSQEFRDGYSILKHYGGNGPYSERVSYGIARDPPTS和C端增加序列LSFWWNYNTTTELNYRSSPIACQEGDAMD。全文摘要本發明涉及一重組DNA分子，其在原核宿主細胞或真核宿主細胞中表達之後編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。所述重組DNA分子包括選自以下的DNA序列a)編碼具有肌醇六磷酸酶活性的多肽並可通過改變成熟的野生型大腸桿菌肌醇六磷酸酶序列獲得DNA序列，所述改變選自i)第74位賴氨酸→天冬氨酸(K74D)的突變，和/或ii)第139位的天冬醯胺→精氨酸(N139R)和第142位的天冬氨酸→穀氨酸(D142E)的組合突變，和/或iii)第145位的亮氨酸→異亮氨酸(L145I)和第198位的亮氨酸→異亮氨酸(L198I)的組合突變，和/或iv)第200位的纈氨酸→脯氨酸(V200P)的突變，和/或v)在N端或C端或者N端和C端兩端增加黑麴黴變種泡盛黑麴黴的酸性磷酸酶或黑麴黴的肌醇六磷酸酶的序列片段，b)與a)列出的序列具有70-100％同源性的DNA序列，c)因遺傳密碼子的簡併性而與a)和b)列出的序列有關的DNA序列。該重組DNA分子在合適的宿主細胞中表達時，其所編碼的蛋白的酶活性的溫度抗性增強並且蛋白酶穩定性增強。改變iii)和iv)僅與改變i)、ii)和v)聯合提供。本發明還涉及由此編碼得到的蛋白。文檔編號C12N9/16GK101631855SQ200780049750公開日2010年1月20日申請日期2007年11月2日優先權日2006年11月10日發明者B·溫特,K·Q·阮申請人:Ab酶有限公司