一種微生物發酵生產丁二酸的菌種和方法
2023-05-13 23:45:21 1
專利名稱：一種微生物發酵生產丁二酸的菌種和方法
技術領域：
一種微生物發酵生產丁二酸的菌種和方法，屬於生物工程技術領域。具體涉及用一種厭氧微生物發酵生物質原料生產丁二酸的菌種和方法。
背景技術：
丁二酸，又稱琥珀酸(succsinic acid)，分子式為C4H6O4，分子量為118.09，是一種常見的天然有機酸，廣泛存在於人體、動物、植物和微生物中。
丁二酸是工業上一種重要的四碳化合物，它作為有機合成原材料、中間產物或專業化學製品廣泛應用於食品、醫藥、農藥、染料、香料、油漆、塑料和材料工業。它最大的市場是表面活性劑、清潔劑、綠色溶劑、離子鰲合劑、生物可降解塑料等領域。在食品行業中作為酸化劑、pH改良劑、風味物質和抗菌劑，以及作為原料或中間體用於醫藥、抗生素、胺基酸和維生素的生產(ApplMicrobiol Biotechnol，1999，51545-552)。此外，丁二酸鹽還可以用做反芻動物和單胃動物如豬的飼料添加劑以及植物的助長劑。目前，丁二酸和它的大多數衍生物的生產還處在進一步研究和開發階段。
目前已開發出多項技術將丁二酸轉化為重要的工業化學品，包括N-甲基吡咯烷酮、1，4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內酯、聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT樹脂)、己二酸等。其中許多化工產品都是以苯為原料合成的，苯是石油或煤化工產品，資源緊缺，不可再生。目前已大約有250種以苯為原料的化工產品可以通過丁二酸為原料來生產。因此，全球對丁二酸的需求不斷增加。
工業上丁二酸的生產方法主要為化學方法，主要有石蠟氧化法、輕油氧化法、丁烷氧化法、丁二腈水解法、催化加氫法以及以乙烯和一氧化碳為原料的電解氧化法。目前，國內外主要使用的是催化加氫法。
以化學方法獲得丁二酸，不可避免地要消耗大量不可再生的石化原料，還對環境造成嚴重汙染，存在轉化率低，易汙染環境等弊端。
丁二酸的生產可通過化學合成方法或者發酵方法來進行，由於石化原料的日趨減少，用微生物發酵碳水化合物生產丁二酸的方法日益受到人們的重視。由於發酵法生產丁二酸是以可再生糖源(如葡萄糖)和二氧化碳作為主要原料，因此微生物發酵法生產丁二酸，具有成本低和擺脫對石化原料依賴的優點，而且開闢了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，更加顯示了環境友好特徵。
丁二酸是繼檸檬酸後最具市場潛力的發酵有機酸產品，但目前大都還是用化學方法生產。1999年全球丁二酸的需求量為27萬噸，2001年為48萬噸，2002年的市場需求量為59萬噸。以大約10萬噸/年的幅度遞增。根據美國Michigan大學MBI研究所的估計，在未來幾年內，丁二酸的年需求將達到100萬噸的水平。
丁二酸是許多嚴格厭氧菌和兼性厭氧菌代謝的重要中間產物。產丁二酸的微生物有丙酸產生菌，例如Propionibacterium sp.；典型的腸桿菌，例如E.coli、Pectinatus sp.；瘤胃菌，例如Actinobacillus succinogenes、Bacteroides amylophilus、Brebibacterium divaricatum、Succinimonas amylolytica、Succinivibriodextrinisolvens、Wolinella succinogenes、Ruminococcus flavefaciens等。此外，一些乳酸菌的菌株也可產生少量的丁二酸。
其中產丙酸菌可積累低濃度的丁二酸，從瘤胃中分離出來的瘤胃菌如琥珀酸絲狀菌Fibrobacter Succinogenes(Weimer，1993)、琥珀酸弧菌Succinivibriodextrinisolvens(O』Herrin and Kenealy，1993)、Bacteroides ruminicola(Howlett，1976)、Bacteroides amylophilus(Caldwell，1969)等也可產丁二酸，且產量比丙酸菌高。但瘤胃菌發酵有許多低產量的副產物，發酵不穩定，多數菌株在生產上不能滿足工業生產在經濟上的要求。雖然有報導琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenesATCC55618(US 5,504,004，1996；US 5,723,322，1998)產丁二酸含量70g/L，產率80％以上、厭氧螺菌Anaerobiospirillumsucciniciproducens ATCC 29305(US 5,143,833，US 5,143,834和US 5,168,055，1992)產丁二酸43g/L，產率91％。基因工程菌E.coli AFP111/pTrc99A-pyc產丁二酸99.2g/L，產率110％(Vemuri，J.Industrial Microbiology Biotechnology，2002)。但在國內，這些菌株不容易獲得，並且培養發酵條件要求高，不宜用於國內的工業生產。因此，在國內自主創新地篩選能耐受高濃度丁二酸的微生物菌株，並且研究出一種能夠生產高濃度丁二酸的發酵方法是很有必要的。
發明內容
本發明的目的是提供一種微生物發酵生產丁二酸的菌種和方法，該菌株是一株能有效生產丁二酸的新菌株，用該菌株發酵廉價的糖質原料生產丁二酸的方法。
以下是本發明技術方案的詳細描述。
微生物菌株的篩選與鑑定在本發明中，建立了一個快速有效的篩選高產丁二酸菌株的模型。根據產丁二酸菌株其細胞代謝過程中產生較高的富馬酸脫氫酶(Van der Werf，ArchMicrobiol，1997)這一點特性，設計出以富馬酸鈉為唯一碳源的選擇性平板，篩選出能夠利用富馬酸的菌株。由於富馬酸脫氫酶能夠將富馬酸轉化丁二酸，而富馬酸在酸性條件下呈渾濁狀，因此可以挑選透明圈較大的菌落以篩選出富馬酸脫氫酶較高的菌株。
本發明從牛、羊等食草反芻類動物的瘤胃中採樣，取瘤胃消化物於含富馬酸的富集培養基中厭氧富集培養2-4次，再塗布於以富馬酸鈉為唯一碳源的選擇性分離平板上，在充滿CO2的環境中培養。挑選透明圈較大的菌落，再用裝有發酵培養基的試管，厭氧發酵初篩，2-3天後取清液，點樣到矽膠層析薄板上，於苯∶乙酸乙酯∶乙酸體積比為2∶1∶0.03系統中展層，用溴酚蘭顯色。將保留有丁二酸顯色斑點的菌株再轉接於裝有發酵培養基的三角瓶中進行厭氧發酵復篩，36-72h，用HPLC法(Lichrospher C18 250×4.6mm，5μm；流動相50mmol/L KH2PO4，pH 2.8，紫外檢測波長210nm)測定丁二酸的含量。經過對多個瘤胃樣品的大量菌株篩選工作，從分離出來的近數百株瘤胃細菌中共初篩選出近幾十株產丁二酸的菌株，最後復篩得到雜酸較少，遺傳穩定性好的產丁二酸菌株SW0580菌株。
本發明篩選得到的能有效積累丁二酸的微生物SW0580，經16S rRNA基因測定和按《伯傑氏細菌鑑定手冊(第八版)》生理生化鑑定，認為屬巴斯德菌科(pasteurellaceae)放線桿菌屬(Actinobacillus)的琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)。該菌的細胞成棒狀，不運動，無芽孢，在營養肉湯培養基中可見典型的放線桿菌特徵，即散開的類球顆粒組成貌似「密碼」的桿菌(摩爾斯電碼和鏈狀呈摩爾斯電碼形)。格蘭氏陰性，兼性厭氧。100％CO2環境下，菌體單獨生長、成群生長和成鏈生長。在TSB瓊脂培養基上的菌落成環形、完整、灰色、半透明，在有CO2存在時，37℃條件下培養24h後，直徑可達1～1.5mm。在空氣中培養時菌體黏著在平板上。菌株在平板、斜面上保存一周後，有明顯的衰亡現象。
微生物菌株的種子培養與發酵種子培養基的組成為葡萄糖5-15g/L，酵母膏5-10g/L，玉米漿5-15g/L，Na2HPO4·12H2O 0.5-2.0g/L，NaH2PO4·2H2O 0.2-2.0g/L，混合維生素1-10ml/L，pH 6.0-7.0。
發酵培養基糖質原料20-100g/L，氮源1-50g/L，酵母膏5-25g/L，Na2HPO4·12H2O 1.0-5.0g/L，NaH2PO4·2H2O 1.0-5.0g/L，NaCl 1.0-5.0g/L，MgCl20.1-5.0g/L，CaCl20.1-5.0g/L，乙酸鈉0.1-5.0g/L，生物素1-5ml/L，混合維生素1-10ml/L，培養基pH3～8。
所述混合維生素組成為B125mg，B6100mg，葉酸20mg，核黃素20mg，硫胺素20mg，煙酸20mg，泛酸50mg，對氨基苯甲酸50mg，蒸餾水定容至1000ml。
種子培養基和發酵培養基的滅菌溫度為115-121℃，15min。維生素等熱敏性材料配製後0.2μ膜濾除菌，接種前加入。
將實驗菌株接種到種子培養基中，100ml三角瓶裝液20～80ml，於30-40℃在充滿CO2的環境中靜止、或在有氧的條件下震蕩，培養24-48h。
按1％-10％的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，培養溫度30～40℃，發酵在通CO2或N2的厭氧條件下，厭氧培養1-4d。
用於發酵的糖質原料碳源可以是葡糖糖，果糖，麥芽糖，木糖，蔗糖，乳糖，半乳糖，乳清，及木薯、玉米、甜菜或木質纖維素的水解物或糖漿。豆餅粉、玉米漿、尿素、或硫酸銨等無機銨鹽可作為培養基的氮源，發酵培養基中還含有磷酸鹽、乙酸鈉等無機鹽和生物素及混合維生素。發酵在通CO2或N2氣體的厭氧環境下進行，30-40℃靜止或攪拌培養，並用碳酸鹽、或氨水、或液鹼維持發酵液中的pH在5.5-7.0。
本發明的有益效果本發明的特點是從新鮮瘤胃中分離了有效產生丁二酸的琥珀酸放線桿菌CGMCC 1593，其在厭氧等適合條件下，能顯著地積累丁二酸，產丁二酸達到10-50g/L，最高達到40g/L以上，可滿足實現工業生產在經濟上要求。
本發明突出的優點是利用廉價的玉米、木薯等可再生的農副產品為原料發酵生產丁二酸，是一種可持續的生產方法，可緩解丁二酸化學合成的石化資源緊張問題，對環境友好。
以下是琥珀酸放線桿菌CGMCC 1593篩選、鑑定及發酵生產丁二酸的實施例。但本發明並不限於所列出的幾個實例。
生物材料樣品保藏琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)SW0580菌株已於2006年1月23日保存在中國北京中關村中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No1593。
具體實施例方式
實施例1從無錫市某肉牛屠宰場剛宰殺牛的新鮮瘤胃中採樣，取瘤胃中消化物，接種於裝有80mL含富馬酸鈉的富集培養基的三角瓶中，37℃厭氧培養約36-48h，按10％的接種量再進行兩次富集。取富集培養物用PBS(0.145mol/L氯化鈉，0.01mol/L磷酸鈉水溶液)稀釋並塗布於以富馬酸鈉為唯一碳源的平板篩選培養基的選擇性平板上，培養48h。挑選透明圈較大的菌落，接種至裝有5mL發酵培養基的試管中，厭氧培養36h。用TCL法測定上清液，160個菌落中共選出72株類似丁二酸斑點的菌落。
其中富集培養基(g/L)玉米漿20，葡萄糖15，富馬酸鈉5.88，CaCl20.2，MgCO310，K2HPO43.0，NaCl 1.0，(NH4)2SO41.0，MgCl20.2。
平板篩選培養基(g/L)富馬酸鈉25，蛋白腖10，酵母膏5，NaCl 5，NaHCO32，半胱氨酸鹽酸鹽1，瓊脂20。種子培養基(g/L)葡萄糖5，酵母膏5，玉米漿5，Na2HPO4·12H2O 0.5，NaH2PO4·2H2O 0.5，混合維生素1ml/L，pH 6.5。
初篩發酵培養基(g/L)葡萄糖20，酵母膏5，NaCl21，MgCl22，Na2HPO40.5，NaH2PO40.5，MgCO310，混合維生素1ml/L。pH值均調為6.5。
實施例2將保留的菌株轉接於裝有5mL上述發酵培養基的試管中，37℃厭氧培養36h。取5mL培養液轉接到裝有80ml同樣發酵培養基的三角瓶中，並補加滅過菌的碳酸鈣，控制pH6.5，37℃厭氧培養48h後，過濾，用HPLC法測定上清液中丁二酸的含量。多數菌株乳酸含量較高，僅有II-80號(實驗室編號為SW0580)產丁二酸顯著。
表1部分試驗菌株的產酸情況
實施例3對篩選的SW0580菌株按《伯傑氏細菌鑑定手冊(第八版)》進行生理生化特性鑑定(見表2)，並按精編分子生物學實驗指南的方法提取染色體DNA，以Y1和Y2為正向和反向引物(Y1ATTGAACGCTGGCGGCAGGC，Y2CGGGCGGTGTGTACAAGGCC)，用PCR擴增16S rRNA基因，委託上海申能博生物科技有限公司進行16S rDNA測序，得到本菌株部分16S rRNA基因片斷後，在NCBI網站上用BLAST檢索GenBank中相關菌株的16S rRNA基因序列，並進行同源性比對(表3)。基於16S rDNA序列分析和生理生化特性鑑定，結合對該菌的生長和發酵特性進行研究，與最接近(或同源性最高)的菌株Actinobacillus succinogenes ATCC 55618比較，其生理生化特性中利用檸檬酸鹽、H2S反應、色氨酸(吲哚)有不同，因此認為是琥珀酸放線桿菌的變種，擬命名為琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)SW0580，此菌株已保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1593。
表2生理生化特性鑑定結果對照表
CGMCC 1593菌株的16S rDNA序列(1289bp)CGGTAACGGG TGGAAAGCTT GCTTTCCATG CTGACGAGTG GCGGACGGGT GAGTAATGCT 60TGGGGATCTG GCTTATGGAG GGGGATAACG ACGGGAAACT GTCGCTAATA CCGCGTAATG 120TCTAAGGACT AAAGGGTGGG ATTTTCGGAC CGCCCGCCAT AAGATGAGCC CAAGTGGGAT 180TAGGTAGTTG GTGGGGTAAA GGCCTACCAA GCCGACGATC TCTAGCTGGT CTGAGAGGAT 240GACCAGCCAC ACTGGAACTG AGACACGGTC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA 300TATTGCGCAA TGGGGGCAAC CCTGACGCAG CCATGCCGCG TGAATGAAGA AGGCCTTCGG 360GTTGTAAAGT TCTTTCGGTG GTGAGGAAGG CGGATAAGTT AACAGCTTAT TCGATTGACG 420TTAGCCACAG AAGAAGCACC GGCTAACTCC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGGAGGGTG 480CGAGCGTTAA TCGGAATAAC TGGGCGTAAA GGGCACGCAG GCGGCTATTT AAGTGAGATG 540TGAAATCCCC GGGCTTAACC TGGGAACTGC ATTTCAGACT GGGTAGCTAG AGTACTTTAG 600GGAGGGGTAG AATTCCACGT GTAGCGGTGA AATGCGTAGA GATGTGGAGG AATACCGAAG 660GCGAAGGCAG CCCCTTGGGA ACGTACTGAC GCTCATGTGC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA 720GGATTAGATA CCCTGGTAGF CCACGCTGTA AACGCTGTCG ATTTGGGGAT TGGGCGATAA 780GCCTGGTGCC CGAAGCTAAC GTGATAAATC GACCGCCTGG GGAGTACGGC CGCAAGGTTA 840AAACTCAAAT GAATTGACGG GGGCCCGCAC AAGCGGTGGA GCATGTGGTT TAATTCGATG 900CAACGCGAAG AACCTTACCT ACTCTTGACA TCCTCAGAAT CCGGTAGAGA TATCGGAGTG 960CCTTCGGGAA CTGAGAGACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTT GTGAAATGTT 1020GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT ATCCTTTGTT GCCAGCATGT AGAGATGGGA 1080ACTCAAAGGA GACTGCCGGT GATAAACCGG AGGAAGGTGG GGATGACGTC AAGTCATCAT 1140GGCCCTTACG AGTAGGGCTA CACACGTGCT ACAATGGCGT ATACAGAGGG AAACGAGCCC 1200GCGAGGGGGA GTGAATCTCA GAAAGTGCGT CGTAGTCCGG ATTGGAGTCT GCAACTCGAC 1260TCCATGAAGT CGGAATCGCT AGTAATCGC 1289其中，組成為A25.7％；C21.3％；G32.6％；T20.4％；)
表3 16SrDNA序列同源性(或相似性)比較
實施例4將CGMCC No.1593接種到含不同葡萄糖濃度的上述發酵培養基中，發酵培養基組成為糖質原料20-100g/L，氮源1-50g/L，酵母膏5-25g/L，Na2HPO4·12H2O1.0-5.0g/L，NaH2PO4·2H2O 1.0-5.0g/L，NaCl 1.0-5.0g/L，MgCl20.1-5.0g/L，CaCl20.1-5.0g/L，乙酸鈉0.1-5.0g/L，生物素1-5ml/L，混合維生素1-10ml/L，培養基pH3～8；所述混合維生素組成為B125mg，B6100mg，葉酸20mg，核黃素20mg，硫胺素20mg，煙酸20mg，泛酸50mg，對氨基苯甲酸50mg，蒸餾水定容至1000ml。控制pH6.5，在充滿CO2或N2的環境中37℃靜止培養2-4天，用HPLC測定發酵液中丁二酸的含量。
當葡糖糖濃度為60g/L時，發酵4天時發酵液中丁二酸的濃度達到25.81g/L。當葡糖糖濃度為80g/L時，發酵4天時發酵液中丁二酸的濃度達到32g/L。
實施例5將60g/L乳糖、或蔗糖、或麥芽糖代替上述發酵培養基中的葡萄糖，並接入培養好的CGMCC No.1593種子，用2mol/L Na2CO3調節發酵液pH維持在6.5，按上述的條件進行發酵，發酵4天測定發酵液中的丁二酸及雜酸。結果如表4表4CGMCC No.1593菌株對不同糖的發酵產酸
實施例6將木薯或玉米磨粉，過40目篩，取木薯粉或玉米粉200g，加1L水調和，加1ml液化酶(傑能科公司，無錫)攪勻，100℃保溫1h。用木薯和玉米粉水解糖代替上述發酵培養基中的葡糖糖(含還原糖60g/L)，接入培養好的CGMCCNo.1593，按上述的條件進行發酵，發酵4天測定發酵液中的丁二酸及雜酸。結果如表5表5CGMCC 1 No 1593菌株對木薯和玉米粉水解糖的發酵產酸
實施例7按實施例6，用木薯粉水解糖作為發酵培養基中的糖源，按含還原糖20～150g/L配製不同濃度的發酵培養基，接入培養好的CGMCC 1 No.593，按上述的條件進行發酵，發酵4天後測定發酵液中的丁二酸及雜酸含量(因測出的乳酸含量都低於1g/L，所以表中未顯示)。結果如表6表6CGMCC No.1593菌株對不同濃度木薯粉水解糖的發酵產酸
權利要求
1.一種發酵生產丁二酸的微生物菌株，其分類屬巴斯德菌科(pasteurellaceae)放線桿菌屬(Actinobacillus)的琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)SW0580，保藏號為CGMCC No.1593。
2.一種微生物發酵生產丁二酸的方法，其特徵是發酵菌株為CGMCC No.1593；發酵培養基組成為糖質原料20-100g/L，氮源1-50g/L，酵母膏5-25g/L，Na2HPO4·12H2O 1.0-5.0g/L，NaH2PO4·2H2O 1.0-5.0g/L，NaCl 1.0-5.0g/L，MgCl20.1-5.0g/L，CaCl20.1-5.0g/L，乙酸鈉0.1-5.0g/L，生物素1-5ml/L，混合維生素1-10ml/L，培養基pH3～8；所述混合維生素組成為B125mg，B6100mg，葉酸20mg，核黃素20mg，硫胺素20mg，煙酸20mg，泛酸50mg，對氨基苯甲酸50mg，蒸餾水定容至1000ml；發酵培養按1％-10％的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，培養溫度30～40℃，發酵在通CO2或N2的厭氧條件下，厭氧培養1-4d；發酵過程中，用碳酸鹽、氨水或液鹼維持發酵液的pH5.5-7.0。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵是糖質原料包括葡糖糖，果糖，麥芽糖，木糖，蔗糖，乳糖，半乳糖，乳清，及木薯、玉米、甜菜或木質纖維素的水解物或糖漿。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵是氮源包括豆餅粉、玉米漿、尿素、或無機銨鹽。
全文摘要
一種微生物發酵生產丁二酸的菌種和方法，屬於生物工程技術領域。具體涉及一種發酵糖質原料產生丁二酸的微生物琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)SW0580，保藏號CGMCC No.1593，以及利用該微生物發酵生產丁二酸的方法。該微生物是從瘤胃中分離並鑑定的琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)，在通CO
文檔編號C12P7/40GK1814747SQ20061003811
公開日2006年8月9日 申請日期2006年1月24日 優先權日2006年1月24日
發明者孫志浩, 鄭璞, 劉宇鵬, 朱蕾蕾 申請人:江南大學