脂醯輔酶a脂肪醇o-醯基轉移酶的製作方法

2023-05-13 08:24:21

專利名稱：脂醯輔酶a脂肪醇o-醯基轉移酶的製作方法
本申請是申請日為91年11月20日的USSN07/796，256和申請日為92年8月21日的USSN07/923，411的部分後續申請。
本發明涉及酶，純化和得到這些酶以及與其相關的胺基酸和核酸序列的方法，以及在基因工程應用中使用這些組合物的方法。
由於植物基因工程技術的發展，使我們有可能轉化和再生多種植物品類，以提供具有新的和所希望的特徵的植物。對這種植物基因工程技術有興趣的領域之一是在植物組織中製備有價值的產物。這些應用要求使用各種各樣的DNA結構和核酸序列，用於轉化過程，以便生成能產生所需產物的植物。例如，需要用植物功能啟動子來使基因序列獲得適當的表達，這種表達可以在整個植物中或者在經過選擇的植物組織中。另外，選擇性標記序列經常被用於識別轉化了的植物材料。這些植物啟動子和選擇性標記物提供了有價值的工具，這些工具在獲得新植物方面非常有用。
涉及這些基團工程技術的一個所希望的目標是能夠提供具有便利的蠟酯來源的作物。在許多工業應用中均需要蠟酯，這些應用包括藥品、化妝品、洗滌劑、塑料和潤滑劑。這些產品，特別是長鏈蠟酯以前一直從巨頭鯨(一種瀕臨滅絕的物種)或從沙漠灌木、希蒙德木屬(最近)中獲得。而這些來源均不能便利地提供蠟酯。因此，為了獲得這種化合物的可靠來源，轉化的作物是人們所期待的，因為作物就培養、收穫和產品提取方面來說易於操作。
然而，為了獲得這些轉化植物，首先必須獲得負責生物合成所需蠟酯產物的基因。蠟酯的製備起因於至少兩種酶活性的作用，即脂肪醯基還原酶和脂醯基脂肪醇醯基轉移酶，或蠟合酶。對這些酶的初步研究和對脂肪醯基還原酶的廣泛分析及純化過程表明，這些蛋白與膜有關，可是在蠟生物合成中負責脂肪醯基脂肪醇連結反應的酶卻一直沒有被很好地表徵過。因此，還需要對這種酶進行進一步的研究和最終的純化，以便可以獲得編碼該酶活性的基因序列。
因此，人們希望設計出一種純化方案，通過該方案獲得蠟合酶蛋白、以及獲得確定的胺基酸序列和/或對蠟合酶特異的抗體。在該方案中，可將庫篩選、聚合酶鏈反應(PCR)或免疫技術用於識別表達蠟合酶蛋白的克隆。可以將由此獲得的克隆分析，從而識別出與蠟合酶活性有關的核酸序列。然後，可以將蠟合酶核酸序列與脂肪醯基還原酶蛋白(這些蛋白或者是轉基因宿主細胞天生的或者是用重組技術提供的)用於在宿主細胞中產生蠟酶。
據報導由正在生長的希蒙德木屬胚芽得到的無細胞組織勻漿具有醯基輔酶A脂肪醇醯基轉移酶活性。該活性與在差速離心時形成的漂浮蠟墊有關，(Pollard等人(1979)Supra;Wu等人(1981)Supra)。
Wildner和Halliek(AbstractformTheSouthwestConsortiumFifthAnnualMeeting，April22-24，1990，LasCruces，NM.)報導了由具有脂醯基S輔酶A轉醯酶活性的股薄肌裸藻得到的多酶複合物的溶解進程。
Pushnik等人(AbstractfromTheSouthwestConsortiumFourthAnnualMeeting，February7，1989，Riverside，Ca.)報導了希蒙德木屬醯基輔酶A醇轉醯酶蛋白的10倍純化過程。


圖1-圖1提供了希蒙德木屬脂肪醯基還原酶的核酸序列和轉譯的胺基酸序列(正如由cDNA序列所確定的)。
圖2-圖2提供了希蒙德木屬蠟合酶cDNA克隆的核酸序列和轉譯的胺基酸序列。
本發明提供了一種部分純化的脂醯輔酶A脂肪醇O-醯基轉移酶蛋白，其中所說的蛋白在由脂肪醇和脂肪醯基底物形成蠟酯的過程中具有活性。該脂肪醯輔酶A脂肪醇O-醯基轉移酶在本文中也被稱作「蠟合酶」。本發明的蠟合酶可以與許多脂醯基和脂肪醇底物(包括醯基輔酶A和醯基載體蛋白)具有活性。這些底物的碳鏈長度可以變化，儘管一種給定的蠟合酶可能對具有特定鏈長的醯基和醇底物有優先性，或者可能與具有寬範圍碳鏈長度的醯基和醇底物具有活性。
一般來說，本發明的蠟合酶至少對那些鏈長在12至24碳的醯基和醇底物具有活性，其中該碳鏈長度可以用式「C2x」表示，其中「x」是6至12中間的一個數，當然其它的醯基或醇底物也可以被試驗並發現有活性。另外，由於獲得了本發明蠟合酶蛋白，才使下文中所詳細描述的進一步的操作過程成為可能。這些操作可以導致其它有關的蠟合酶的製備和發現。
因此，在第一方面，本發明涉及具有蠟合酶酶活性的蛋白製劑，並以一種種子植物蛋白製劑作為示例。這種製劑是通過分餾希蒙德木屬胚芽以產生微粒體膜製劑、將來自該膜製劑的蠟合酶蛋白溶解並採用色譜分析法將其進一步純化而製成的。本文中的希蒙德木屬蠟合酶可以接受寬範圍的醯基和醇底物，它們可以是飽和的也可以是不飽和的(含有一個或多個碳間雙鍵)。在EnzymeNomenclature°1984中希蒙德木屬蠟合酶的活性用E、C、2、3、1、75表示，其推薦名稱為「長鏈醇脂肪醯基轉移酶」。
通過這些過程，得到一種部分純化的蛋白製劑，該製劑含有表觀分子量約為57KD的蠟合酶蛋白。因此，本文除了提供了獲得這些蠟合酶蛋白的胺基酸序列的方法之外，還提供了通過純化從種子植物源獲得蠟合酶蛋白的方法。
另外，通過本文所述的方法還可以提供來自其它生物體源的蠟合酶蛋白。例如，可以得到不動細菌蠟合酶的部分純化製劑，其中我們發現該蠟合酶活性與約45KD的肽帶有關。同樣，本發明還提供了股薄肌裸藻蠟合酶蛋白製劑，其中41KD肽與蠟合酶活性有關。
在本發明第二方面，還涉及到與本發明蠟合酶有關的核酸序列。本文還描述了一些方法，由此可以從本發明的蠟合酶蛋白的胺基酸序列中識別並獲得這些序列。本文還描述了這些結構基因序列在分離其它蠟合酶序列中的應用，以及它們在重組結構中的運用，從而在宿主細胞中轉錄蠟合酶酸序列和/或表達蠟合酶蛋白。本發明還涉及與蠟合酶蛋白有關的其它核酸序列的應用，例如5』和3』非編碼區的應用。
在本發明的第三方面，還涉及到含有編碼有意和反意蠟合酶序列的重組結構的細胞。特別是涉及到那些含有優選的希蒙德木屬蠟合酶醯基輔酶A底物的細胞，如芸苔屬植物胚芽中的那些細胞。
另外，本發明還涉及到作為本發明重組結構的表達產物的含有本發明的蠟合酶蛋白的細胞，並且提供了在宿主細胞中產生蠟合酶的方法。此外，本發明還涉及到由於該蛋白在宿主細胞中發生表達而回收到的蠟合酶蛋白。
進一步地，還應該認識到，本發明的蠟合酶也可以用於在那些含有蠟合酶的脂肪醯基和脂肪醇底物的宿主細胞中以製備蠟酯。這些宿主細胞可以天然存在或者通過用編碼脂肪醯基還原酶的核酸結構進行轉化而獲得。脂肪醯基還原酶，或稱「還原酶」在催化脂肪醯基基團還原成相應的醇的過程中具有活性。共同未決美國專利申請07/659，975和07/767，251(將它們引入本文作為參考)描述了這些還原酶蛋白。該情報登載於已公開的PCT專利申請WO92/14816中。此外，本文還描述了其它一些蠟合酶蛋白源，它們也是所需的還原酶蛋白源。
在本發明這個方面，還特別涉及到含有本文所述的希蒙德木屬蠟合酶的優選的醇底物的植物細胞。還涉及到製備具有這種醇底物的植物細胞的方法，其中所說的細胞用編碼脂肪醯基還原酶核酸序列的重組核酸結構轉化。因此，那些通常不含有足夠量的、被蠟合酶採用的醇底物的宿主細胞可用還原酶結構進行轉化以產生醇。由此方法，在宿主細胞中存在的脂肪醯基基團將也提供在蠟酯合成中為蠟合酶所利用的脂肪醇底物源。依靠蠟合酶和還原酶蛋白的特異性，人們確認，用該方法可以獲得能產生多種所需要的蠟酯產品的植物細胞。這些產品根據其脂肪醇和脂醯基基團的飽和度和鏈長不同而具有不同的特性。所以，按照本文方法生產的蠟酯產品可以從宿主細胞中回收並包括在本發明中。
本發明的脂肪輔酶A脂肪醇醯基轉移酶包括任意一種氨基序列、如蛋白、多肽或肽片斷，該序列在催化由脂肪醯基基團酯化脂肪醇以產生蠟酯的酯化過程中具有活性。本發明的酯醯輔酶A醇醯基轉移酶在下文中也被稱作「蠟合酶」。
儘管典型地被說成是醯基輔酶A醇醯基轉移酶，但是本發明的蠟合酶對許多醯基底物(包括脂醯輔酶A和脂醯基載體蛋白分子)也具有活性。另外，受到蠟合酶作用的醯基和醇底物可能都具有可變的碳鏈長度和飽和度，儘管該蠟合酶可能對某些分子具有優選活性。
許多不同的生物體都可以由醇或醯基底物產生蠟酯，並且都是本發明的蠟合酶蛋白的合適來源。例如，植物產生表皮或角質層蠟(Kolattukudy(1980)TheBiochemistryofPlants(Stumpf，P.K.和Conn，E.E.，等.)Vol.4，P.571-645)，沙漠灌木，希蒙德木屬產生種子貯藏蠟(Ohlrogge等人(Lipids(1978)13203-210)。在各種細菌中也觀察到了蠟合成，例如不動細菌屬(Fixter等人(1986)J.Gen.Microbiol.1323147-3157)和微球菌(Lloyd(1987)Microbios5229-37)，以及通過單細胞生物體，裸藻(Khan和Kolattukudy(1975)Arch.Biochem.Biophys.170400-408)。另外，在牛瞼板腺(Kolattukudy等人(1986)J.LipidRes.27404-411)、鳥尾脂腺，以及多種昆蟲和海洋生物的微粒體製劑中也報導了蠟生產和蠟合酶活性。因此，具有不同特性的許多不同的蠟酯可以通過本發明的蠟合酶來生產，而且酶的活性以及所產生的蠟酯的類型取決於所獲得的底物或特定的蠟合酶的底物特異性。
為了獲得用於酯化反應的蠟合酶蛋白的可靠來源，最好是分離出與蠟合酶有關的核酸序列，以便使這些序列能被克隆到產生蠟合酶的宿主細胞中。例如，可以克隆編碼蠟合酶蛋白的核酸序列到表達於大腸桿菌細胞中的載體中，以提供方便的蠟合酶蛋白來源。如此產生的蠟合酶蛋白也可以用於培養抗蠟合酶蛋白的抗體，以便用於從不同源、特別是從植物中識別和純化出類似的蠟合酶蛋白。另外，對蠟合酶的進一步研究可能導致位點特異誘變反應，從而使其催化特性進一步特徵化和得到改善或改變其脂肪醇或脂肪醯基底物特異性。改變了底物特異性的蠟合酶可以與其它FAS酶一起應用。
在本發明之前，蠟合酶蛋白的胺基酸序列不是已知的。因此，為了獲得與蠟合酶有關的核酸序列，有必要首先從可獲得的源中純化出蛋白並且至少確定其部分胺基酸序列，以便可以製備用於分離蠟合酶核酸序列的合適探針。
沙漠灌木、Simmondsiachinensis(希蒙德木屬)被確定作為候選的蠟合酶蛋白源。開始的研究表明，希蒙德木屬蠟合酶是一種整合膜蛋白並且在自然條件下厭水。一般來說，與膜有關的蛋白都難於純化，因為當將它們溶解時，即從膜環境(在此它們具有正常功能)中分離時，它們容易失去酶活性。已經使用的溶解整合膜蛋白的技術包括向適當的膜部分(frlction)製劑中添加洗滌劑或有機溶劑。如果想要的蛋白仍可用特異酶分析測量的保持功能活性，然後可以使用其它常用的純化技術，如沉澱、離子交換、凝膠過濾和親合色譜法。
一般來說，作為獲得溶解的膜蛋白的第一個步驟需要具有蠟合酶活性的微粒體膜製劑。標準微粒體膜製劑採用無細胞均漿(CFH)的差速離心產生不含完整細胞，核以及可溶蛋白的膜部分。(例如參見Moore等人(1987)BiologicalMembranesAPracticalApproach.pp37-72，eds，FinalayandEvans.)使用油料種子(oilseeds)，初始離心步驟一般產生粒物、上清液和一種漂浮脂肪墊，然後通過對上清液進行進一步的離心可以回收微粒體膜。
在1991.2.22申請的共同未決申請USSN07/659，975中描述了一種方法，通過該方法獲得具有良好酶活性回收的希蒙德木屬膜部分，該酶活性與脂肪醯基還原酶(在希蒙德木屬中形成蠟合酶所涉及的另一種酶)有關。該方法還提供了具有蠟合酶活性的膜部分(如在以下實施例中所詳述的)。其它方法對於本領域普通專業人員來說都是已知的，並且可以用來製備類似的膜製劑。另外，用於在這些製劑中分析蠟合酶活性的方法描述於實施例1中。
對酶進行進一步特徵化和純化的關鍵步驟是獲得溶解的蠟合酶蛋白，使它從其天然雙層膜環境中分離，同時保持一定量的可測蠟合酶活性。儘管在少數情況下可使用有機溶劑，但一般來說採用雙親洗滌劑水溶液來使整個膜蛋白從雙層膜中分離。許多溶解膜蛋白的不同洗滌劑和方法對本領域專業人員來說是已知的，並且Neugebauer(MethodsEnzymol.(1990)182239-253)和Hjelmiland(MethodsEnzymol.(1990)182253-264)對此亦進行了評述。
人們常發現用於溶解膜蛋白的洗滌劑會抑制所需要的蛋白的酶活性。有幾種洗滌劑被試驗用於希蒙德木屬蠟合酶的溶解，其中包括CHAPS(3-[3-膽醯氨基丙基)-二甲基-氨溶]-1-丙烷磺酸鹽)，該物質在共同未決申請USSN07/659，975中被證實在由希蒙德木屬純化脂肪醯基還原酶的過程中是用的。研究發現所有這類物質會抑制蠟合酶活性。儘管在濃度高於CMC時CHAPS會引起強烈的抑制作用，但是我們發現添加磷脂如L-磷脂醯膽鹼，以及將CHAPS濃度從0.75%調至0.3%(即低於CMC)可以使部分蠟合酶蛋白活性再生。再生蠟合酶活性的基本條件是在洗滌劑去除或稀釋過程中有磷脂存在，以便將蠟合酶蛋白引入磷脂氣孔中。該方法不同於再生希蒙德木屬還原酶活性所採用的方法，該方法不需加入磷脂。因此，如果在蠟合酶製劑(如由微粒體膜部分製成的製劑)中存在磷脂，通過去除或稀釋洗滌劑可以簡單地檢測活性。然而，在進一步純化的蠟合酶製劑中，必需加入磷脂才能檢測活性。如果高水平(即大於約2%W/V)的磷脂被使用，則通過簡單地稀釋溶解用的洗滌劑就可以使蠟合酶活性再生。實施例1描述了在溶解的蠟合酶製劑中再生和測定蠟合酶活性的方法。
在實施例4中描述了利用洗滌劑CHAPS溶解希蒙德木屬蠟合酶活性的方法。從微粒體膜製劑中獲得了約15%的蠟合酶活性。同樣，通過對其它洗滌劑的顯性蠟合酶抑制劑的可逆性進行研究可以識別出能溶解希蒙德木屬或其它候選蠟合酶的其它一些有用的洗滌劑。由於由微粒體膜製劑溶解的蠟合酶活性的百分比較小，因此我們研究一些方法來增加以溶解的形式獲得的蠟合酶的百分比。然而，按所述方法得到的溶解的蠟合酶的比例對於進行下文所述的進一步純化、特徵化以及蠟合酶排序是足夠的。
由於得到了溶解的蠟合酶蛋白，現在我們可以進行進一步的實驗，就底物特異性、輔助因子需要量以及可能的活性抑制方面將該酶特徵化。例如，研究發現本發明的希蒙德木屬蠟合酶具有寬範圍的醯基底物，包括醯基ACP和醯基輔酶A分子。另外，醯基和脂肪醇底物在碳鏈長度方面具有較寬的大小範圍。例如，可以用具有碳鏈長度為C12至C24的底物來測試活性，並且結果表明它們都能被酶利用。此外，具有不同飽合度的脂肪醯基和脂肪醇都能顯示活性。
已經證明對使本發明的蠟合酶進一步特徵化非常有用的方法是它能特異標記蠟合酶蛋白。例如，研究發現可以將具有蠟合酶活性的膜製劑與帶有放射標記的棕櫚醯輔酶A(該蠟合酶的一種底物)一起培養，從而通過SDS聚丙烯醯胺電泳(PAGE)和隨後的放射自顯影法可以檢測到表觀分子量約為57KD的帶有放射標記的肽帶。另外，溶解的蠟合酶蛋白(該蛋白不再顯示酶活性)可以被類似地標記，以提供一種可以通過進一步的純化步驟而跟蹤蠟合酶蛋白的便利方法。在實施例2中描述了這些標記方法的細節。
因此，具有本發明的蠟合酶活性的製劑可以作進一步技術處理，例如進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)和隨後的染色、或在用棕櫚醯輔酶A放射標記之後進行SDSPAGE和後續的放射自顯影法。用此方法可以證明有約57KD蛋白存在於這些製劑中，並且該蛋白的染色強度與蠟合酶活性水平一致。在進行棕櫚醯輔酶A放射標記之後，SDSPAGE和放射自顯影法證實標記帶跟蹤著蠟合酶活性。在下面的實施例中描述了一些實驗，這些實驗從尺寸排它性(Siyeexclusion)、親和和反應染色色譜方面，證實57KD肽帶局部跟蹤著蠟合酶活性。
此外，色譜技術可用來提供植物蠟合酶的濃縮製劑。這類純化步驟涉及在固定的反應染色基質，例如本發明所用的CibacronBlueF3GA(BlueA)上進行色譜。活性希蒙德木屬蠟合酶粘接到裝在含約0.4MNacl的緩衝液中的柱上，同時大約85%以上的其它蛋白通過或在隨後清洗中去除。正如在共同未決申請USSN07/767.251中所述，在此條件下還原酶蛋白也會粘接在BlueA柱上。本文發現約有20%的載於BlueA柱上的蠟合酶活性可以通過洗脫而回收。有少部分該蠟合酶活性可以用1.0MNacl緩衝液洗脫，它還含有大部分從該柱上回收的活性還原酶，通過用1.5MNacl緩衝液洗脫獲得大部分的所回收的還原酶活性，洗液中也含有少量還原酶活性。因此，大部分的可回收的蠟合酶活性是從大部分還原酶蛋白中分離得到的，儘管製劑中的主要蛋白不是57KD蠟合酶，而是56和54KD還原酶蛋白。
在BlueA色譜後對蠟合酶進行的進一步研究表明蠟合酶可以在該柱上進行聚焦。例如，在Superosel2(Pharmacia)上具有蠟合酶活性的BlueA部分的尺寸排它性色譜致使在該柱中空隙部分中的大部分蠟合酶活性被洗脫(排斥限量約為5百萬道爾頓)，這表明蠟合酶是聚集形式的。重要的是在保留的部分中檢測到少量(～5%)蠟合酶活性，並且通過與蛋白標準比較估計該峰值活性分子的尺寸在～55KD。這一點進一步證明了57KD標記帶是蠟合酶，而且還說明蠟合酶活性是由單多肽提供的。
使用這些標記和純化技術，希蒙德木屬蠟合酶蛋白可以以基本純化的蛋白製劑的形式回收，並且獲得胺基酸序列。同樣的，由於蠟合酶的脂肪醇底物的厭水特性，還可以推斷其它的蠟合酶也與其本來細胞中的膜有關，因此，這裡所述的用於希蒙德木屬蠟合酶的純化技術也可用於其它蠟合酶蛋白純化製劑的回收。
例如，通過肪醯輔酶A還原酶和肪醯輔酶A醇轉移酶或蠟合酶的酶作用由股薄股裸藻產生蠟。一般，在該生物體中可以檢測到碳鏈長度為24-32的蠟。正如上文談到希蒙德木屬時所述的，裸藻蠟合酶可用CHAPS/Nacl溶液溶解，並且通過BlueA色譜得到部分純化的蠟合酶製劑。用該方法可以將與蠟合酶活性有關的41KD肽帶識別出來。
另外，我們還知道不動細菌屬物種也產生蠟酯組合物，儘管其機理還不十分明確。如本文所述在不動細菌屬中也測定脂醯輔酶A醇轉移酶或蠟合酶活性。將蠟合酶活性在CHAPS/Nacl中溶解，用BlueA柱色譜法濃縮，並且可以使用如尺寸排它性色譜之類的技術，將其進一步純化。通過這些方法，可以在部分純化的製劑中獲得與蠟合酶活性有關的約45KD肽帶。
儘管這些蠟合酶蛋白的厭水特性對純化過程是個麻煩，但是使用許多方法都可以實現將基本純化的蛋白回收。例如，可以將採用連續洗脫電泳工藝的製備性電泳裝置用於純化由BlueA柱得到的57KD蠟合酶。用該方法，可以將在水溶液中含有基本純化形式的蠟合酶蛋白的凝膠部分識別出來。然後，如果需要可以對蠟合酶蛋白樣品進行滲析，並濃縮以提供用於胺基酸排序技術的便利蛋白源。
另外，也可以採用聚丙烯醯胺凝膠並且將蛋白轉移到一種膜基上，例如硝化纖維素或聚偏氟己烯(PVDF)。然後可以獲得含有蠟合酶蛋白的膜部分，以使蠟合酶基本上不含其它蛋白。然後可將蠟合酶蛋白從膜上取下並做進一步處理，從而確定胺基酸序列。由於本發明的蠟合酶蛋白不能很好地轉移到硝化纖維素膜上，故PVDF對排序方法來說是優選的。
通過將來自整個蛋白的N-端胺基酸區域排序，或製備所需蛋白的片斷(通過用化學溴化氰消化，或通過用蛋白酶進行酶分裂)可確定蠟合酶的胺基酸序列，適用的蛋白酶的例子包括胰蛋白酶和內蛋白酶lysC，gluC，AspN和argC。然後可將按該方法獲得的蠟合酶肽按照本領域專業人員所熟悉的方法排序和純化。然後可將這些肽序列用於基因分離技術，包括PCR法和cDNA和基因庫篩選。
為了證實蠟合酶的一致性還可以進行進一步的實驗，例如在大腸桿菌中進行蛋白表達。隨後蠟合酶可以在這些細胞中與脂肪醯基和脂肪族醇底物作用產生蠟酯，該蠟酯可以用各種分析方法檢測。如果宿主細胞不含蠟合酶醇底物，那麼可以通過分析細胞提取物而證實其活性。另外，通過用蠟合酶核酸序列和可購買到的轉譯箱進行體外轉譯也可製備蠟合酶蛋白。如果膜插入是活性的關鍵，那麼為了獲得活化的蠟合酶蛋白就必須向體外轉譯樣品中添加微粒體膜製劑。其它的試驗可以包括免疫分析，此時應製備對候選蛋白特異的抗體而且它在蛋白製劑中可以抑制蠟合酶活性。
因此，需要使用在與蠟合酶活性有關的蛋白質中確定的胺基酸序列來分離核酸序列，從而既可證實蠟合酶蛋白的一致性又可在宿主細胞(原核的或真核的)中使該序列轉錄和/或使其蛋白表達。
因為蠟合酶是一種被膜束縛的蛋白，所以需要在植物細胞中表達一種候選蛋白以證實其活性。電泳或轟擊植物組織使其發生瞬時表達可用於此目的。最後，還需要在植物中(該植物產生可被該酶識別的底物)進行穩定的植物表達。如果用於用蠟合酶序列進行轉化的植物不自然地含有該酶的脂肪醇和脂肪醯基酯底物，那麼需要製備植物提取物並通過向該提取物中添加蠟合酶底物而測定蠟合酶活性。在下文化中將詳細討論用於用蠟合酶序轉化植物宿主的結構和方法。
本發明的核酸可以是基因組或cDNA，並且可以從cDNA或基因庫分離或者直接從分離的植物DNA中分離。一但蛋白被純化和/或得到該蛋白的胺基酸序列，那麼那些獲得基因序列的方法對於本領域專業人員來說都是已知的。
例如，可以對分離的蛋白培養抗體並用於篩選表達庫，從而識別產生植物蠟合酶蛋白或其抗原片段的克隆。另外，可以從該胺基酸序列合成低聚核苷酸，並用於核酸序列的分離過程。該低聚核苷酸可用於PCR以產生核酸片段，然後可將這些核酸片斷用於篩選cDNA或基因庫。在另一方法中，低聚核苷酸可被直接用於分析Northern或Southern斑點，以識別有用的探針和雜交條件，在該條件下這些低聚核苷酸可用於篩選cDNA或基因庫。
本發明的蠟合酶核酸序列包括那些與希蒙德木屬蠟合酶蛋白相應的序列，以及可以由希蒙德木屬蛋白或者核酸序列得到的序列。「相應的」是指核酸序列，或者是DNA或者是RNA，包括那些編碼希蒙德木屬蛋白或其一部分的核酸序列，在所說的編碼序列的5'端或3'端發現的調節序列，該調節序列在希蒙德木屬胚芽中指導蠟合酶的轉錄或轉錄和翻譯(表達)、不存在在cDNA中的基因內區序列，以及編碼前體蠟合酶蛋白的任何前導肽或信號肽的序列(該前體蠟合酶蛋白對於插入到內質網膜中是需要的，但在成熟的蠟合酶中卻沒有發現)。
由希蒙德木屬序列或蛋白「可得到」的序列是指任何與所要的蠟合酶蛋白有關的核酸序列，該序列可由希蒙德木屬蠟合酶胺基酸序列合成，或者在不同生物體中識別得到，以及用希蒙德木屬蠟合酶核酸序列或者用所製成的對希蒙德木屬蠟合酶蛋白的抗體作為探針而分離得到。用該方法，可以發現那些其它的蠟合酶序列同樣的可用來分離其它源中的與蠟合酶蛋白有關的核酸序列。
為了分離核酸序列，可採用質粒或病毒載體和本領域專業人員熟知的技術來製備cDNA或基因庫。適用的核酸雜交和免疫方法(可用於篩選所要的序列)對於本領域專業人員來說是已知的，並且在例如Maniatis，等人(MolecularClonlngALaboratoryManuul，SecondEdition(1989)ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork)中得到介紹。
一般，使用核酸探針獲得的序列在靶序列和給定的編碼所述的蠟合酶的序列之間將存在60～70%序列一致性。然而，也可能獲得序列一致性50～60%的長序列。核酸探針可以是核酸序列的長片斷，也可以是較短的、低聚核苷酸探針。當將較長的核酸片斷用作探針時(大於約100bp)，可在低嚴格的條件下進行篩選，以便從靶樣品中獲得序列，這些序列與用作探針的序列有20～50%變異(即50～80%序列同源)。低聚核核苷酸探針可以明顯地短於編碼蠟合酶的整個核酸序列，但至少是約10個，優選至少約15個，更優選至少約20個核苷酸。當用較短區域對較長區域時，則需要更高的序列一致性。因此，希望識別胺基酸序列同一性高的酶活性位點，以便設計低聚核苷酸探針檢測同源基因。
為了確定與給定的序列雜交是否可以分離有關的基因，需將該序列標記以便測定(一般使用放射性，儘管其它方法也可以)。將標記的探針加入雜交溶液中，並用含有所需核酸或者Northern或者Southerng斑點(篩選所需的同源源)的濾器進行培養，或用含有cDNA或要篩選的基因克隆的濾器進行培養。雜交和衝洗條件可以變化，以便使該探針雜交所述序列的雜交過程最佳化。較低的溫度和較高的鹽濃度適合於相關性更小的序列的發生雜交(低嚴格度)。如果在低嚴格條件下背景雜交存在問題，可在雜交步驟或衝洗步驟升高溫度，和/或降低鹽含量以改進特異雜交序列的測定。正如Beltz，等人所討論的(MethodsinEnzymology(1983)100266-285)，根據所估計的探針熔點可以調節雜交和衝洗溫度。
由於適用的探針和適當的雜交以及衝洗條件已按上文所述被識別，因此可以用標記的序列和最佳化的條件篩選cDNA或基因庫。首先將庫放在固體瓊脂培養基上，並且將該DNA送到一種適當的膜(通常是硝化纖維素或尼龍濾器)上。然後用標記過的探針將這些濾器雜交並按上文所述進行衝洗以識別含有有關序列的克隆。
為了進行免疫篩選，可通過用純化蛋白注射免子或小鼠(或其它適當的小型哺乳動物)以製備希蒙德木屬蠟合酶的抗體。製備抗體的方法對本領域專業人員來說是眾所周知的，而且可以找到專門從事抗體生產的公司。儘管多克隆抗體一般更適用於基因分離，但是不管是單克隆還是多克隆抗體都可以被生產。
為了篩選想要的植物品種，需要進行Western分析以確定在想要的植物品種的粗提物中存在有關的蛋白，該蛋白與希蒙德木屬蠟合酶的抗體發生交叉反應。這一點可以通過將植物提取物蛋白在膜(一般為硝化纖維素)上的制動、隨後進行電泳以及用抗體進行培養來完成，有許多不同的系統可用於在硝化纖維素濾器上檢測抗體/蛋白複合物，其中包括抗體放射標記和第二抗體/酶軛合系統。Oberfelder已經描述了一些可獲得的系統(Focus(1989)BRL/LifeTechnolgies，Inc.111-5)。如果初始的實驗不能檢測有關的蛋白，那麼可使用其它的檢測系統和阻斷劑。當交叉反應發生時，通過篩選表達庫(代表想要的植物品種)可以分離編碼相關蛋白的基因。表達庫可以在許多商購的載體包括λgtll)中構建，如Maniatis等人所述(上文)。
然後將按上文所述的用DNA雜交或免疫篩選技術識別的克隆純化並進行DNA分離，以及用已知技術對其進行分析。用該方法可以證實該克隆編碼了相關的蠟合酶蛋白。通過與希蒙德木屬蠟合酶所用的方法相同的方法使用「新」蠟合酶可以得到其它的蠟合酶。
本領域普通專業人員應該明白本發明的蠟合酶核酸序列可用位點特異誘變或PCR標準技術進行修飾，或者可以在生產在合成核酸序列的過程中完成對序列的修飾。這些修飾過的序列仍涉及本發明的蠟合酶核酸序列。例如，在密碼子上的擺動位置可以改變，結果該核酸序列編碼相同的胺基酸序列，另外，還可以改變密碼子從而產生保守的胺基酸取代物。在每種情況中該肽或蛋白都保持了所需的酶活性，因此它們應被認為是本發明的一部分。
本發明蠟合酶核酸序列可以是DNA或RNA序列、它們由基因DNA。cDNA、mRNA衍生，或者可以是整個或部分合成得到的。該基因序列可以被克隆，例如通過從一種適當的源中分離出基因DNA，以及用聚合酶鏈反應(PCR)擴增和克隆所述的序列。另外，可以完整地或部分的合成該基因序列，尤其是在需要提供植物優選序列的場合。因此，採用所選定的宿主優選的密碼子可以合成全部或部分所需的結構基因(該部分基因編碼蠟合酶蛋白)。例如可以將宿主優選的密碼子從在所需的宿主品種中表達的蛋白使用最多的密碼子中確定出來。
與蠟合酶蛋白有關的核酸序列會有許多用途。例如，可以製備重組結構，該結構可用作探針或者在宿主細胞中使蠟合酶蛋白表達。按照所預定的用途，該結構可以含有編碼整個蠟合酶或其一部分的序列。例如，可以識別蠟合酶的關鍵區域如活性位點。由此，還可以製備僅含有一部分蠟合酶序列的結構，其中所說的一部分蠟合酶序列編碼所需的蠟合酶活性所必需的胺基酸。
適用於表達本發明的蠟合酶序列的系統包括原核細胞如大腸桿菌，酵母細胞、以及植物細胞、維管植物和非維管植物細胞均是理想的宿主。用該方法可以製備蠟合酶蛋白用來做進一步的研究，如編碼序列的位點特異誘變以分析特異突變對蠟合酶蛋白反應特性的影響。
編碼本發明的蠟合酶的DNA序列可以以多種方式與外源DNA結合。外源DNA是指任何與蠟合酶序列無天然連接的DNA序列，它包括來自相同生物體但與酶序列無天然連接的DNA序列。本發明還涉及用於蠟合酶編碼序列的有意和反意結構，其中有意序列可用於在宿主細胞中表達蠟合酶，而反意序列可用於降低由靶生物體自然生產的同源蠟合酶蛋白的內源水平。另外，本發明的蠟合酶基因序列可以和全部或部分通常與蠟合酶有關的序列(如調節或膜靶序列)一起用於外源宿主中。
以其部分成份，編碼蠟合酶的DNA序列被結合在重組結構中，該結構在5'到3'轉錄方向上具有一種轉錄起始控制區，該控制區能夠促進在宿主細胞中的轉錄及翻譯過程、編碼蠟合酶的核酸序列以轉錄終止區。根據宿主情況，調節區可以變化，並且可以包括來自病毒、質粒或染色基因或類似物的區域。為了在原核或真核微生物，特別是單細胞宿主中進行表達，可以採用多種組成的可調節的啟動子。在微生物中的表達能夠提供植物酶的便利源。在所述的轉錄起始區中有來自細菌和酵母宿主(如大腸桿菌，枯草桿菌，啤酒酵母)的區域，包括基因如β-半乳糖苷酶、T7聚合物、色氨酸E及其類似物。
多數情況下，該重組結構會包含在植物中起作用的調節區，該調節區可以使蠟合酶基因發生表達以產生功能性蠟合酶蛋白。編碼植物蠟合酶或其功能片斷的開放式解讀密碼將在其5'端轉錄起始調節區(例如在蠟合酶結構基因的5'上遊處自然發現的野生型序列)相連接。可從天然植物基因中獲得許多其它的啟動子區，該區可以使結構基因序列發生多種組成或可調節的、例如可誘發的表達。
除了來自天然植物基因的序列之外，其它序列也可以在植物中使組成基因表達，例如與土壤桿菌屬基因有關的調節區，包括與nopaline合酶(Nos)、mannopine合酶(Mas)、或真硝鹼合酶(Ocs)基因有關的區。有些控制病毒基因表達的區域。例如花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S和19S區也是有用的。本文所用的術語「組成」並非一定是指基因在全部細胞類型中以相同的水平進行表達，但是該基因確實是在寬範圍的細胞類型中表達的，儘管某些豐富的變異經常是可測得的。其它適用的轉錄初始區可以在某些組織中或在一定培養條件下導致優先轉錄，例如那些來自napin、種子或葉ACP，較小亞單位的RUBISCO、及類似物的區域。
在希望將蠟合酶蛋白表達在植物宿主中的具體方案中，需要使用完整的植物蠟合酶基因的全部或部分基因，也就是所需要採用與結構基因序列在一起的5'上遊非編碼區和3'下遊非編碼區。如果需要不同的啟動子，例如所述植物宿主天生的啟動子或改性的啟動子、即具有由一種基因源產生的轉錄起始區和由另一種基因源產生的翻譯起始區的啟動子或增強啟動子，如雙35SCaMV啟動子，則可採用標準技術將這些序列結合在一起。
能在植物中導致蠟合酶表達的DNA結構可用於許多種植物，特別是產生蠟合酶脂醯輔酶A底物的植物，如芸苔。還有一些其它植物能產生所需的脂肪醯基底物，如中等或長鏈脂肪醯基分子，這些植物包括(但不限於)油菜子(Canola種)、向日葵、紅花、棉花、萼距花、大豆、花生、椰子和油棕櫚，和玉米。
作為蠟合酶脂肪醇底物(除了希蒙德木屬外)，人們尚不知道種子植物可以產生大量脂肪醇，儘管該合酶可以採用少量的這種底物。因此，與本發明的蠟合酶結構結合在一起，就可以獲得一種靶宿主細胞，該細胞能夠由宿主細胞中的脂肪醯基分子產生脂肪醇。例如在共同未決申請USSN07/767，251中描述了植物脂肪及醯基還原酶和在植物細胞中表達還原酶的方法。圖1提供了希蒙德木屬還原酶的核酸序列和轉譯的胺基酸序列。因此，通過向宿主植物細胞提供蠟合酶和還原酶蛋白，可以由脂肪醇和脂醯底物產生蠟酯。
除了希蒙德木屬還原酶之外，還可將其它生物潛在的還原酶源包括裸藻、不動細菌屬、細球菌、某些昆蟲和海洋生物，特異化的哺乳動物或鳥的組織(已知這些組織含有蠟酯)、例如牛瞼板腺或鳥尾脂肪腺。利用它們產生脂肪醇或蠟酯(如果還存在蠟合酶)的能力，可以識別其它潛在源。
在同一轉化過程中可提供蠟合酶和還原酶序列，另外，通過用各種結構進行轉化可產生兩種不同的轉基因植物系，其中一種具有蠟合酶結構，另一種具有還原酶結構。然後可以用已知的植物培養技術將這些植物系雜交，以產生供蠟酯產物製備用的含蠟合酶和還原酶的植物。
為了產生蠟酯，需要從在種子成熟期間經過調節的基因中得到的5'上遊非編碼區，特別是在植物胚芽組織中優先表達的那些區，如由ACP和napin調節區獲得的區。在種子組織中導致優先表達的轉錄起始區(即在植物其它部分不可測的)被認為適合蠟酯生產，以便使在其它植物部分中的基因產物的任何岐化或副作用降至最小。將這些植物種子收穫，並且回收這些種子的脂儲備物以提供便利的蠟酯源。因此，在油種子植物中可以生產新的種子產物，該油種子植物在不進行本文所述的蠟合酶結構轉化時人們並不知道它們可以以它們的種子脂儲備物組份的形式產生蠟酯。
這些「種子特異啟動子」可以按照以下技術獲得和使用，這些技術是US申請號07/147，781，申請日88年1月25日(現在US申請號07/742，834，申請日81年8月8日)，和US申請號07/492，722申請日90年3月16日名稱為「NovelSequencesPreferentiallyExpressedInEarlySeedDevelopmontandMethodsRelatedThereto」，所有這些共同未決申請都引入本文作為參考。
在本發明的重組結構中還可以提供調節轉錄終止區。轉錄終止區可通過編碼植物蠟合酶的DNA序列提供，或者由一種不同的基因源產生一種便利的轉錄終止區，特別是那些與轉錄起始區天然有關的轉錄終止區。該轉錄終止區將含有至少約0.5Kb，最好約1-3Kb結構基因3'序列(由該序列得到該終止區)。
根據將DNA表達結構導入宿主細胞的方法，還需要其它DNA序列。重要的是本發明能同樣的應用於雙子葉和單子葉品種，並且很容易應用到新的和/或改進的轉化和再生技術中。
在發展該重組結構的過程中，可以將該結構或其片斷的各種組份插入到一種便利的克隆載體中，該載體能在細胞宿主(如大腸桿菌)中複製。有許多載體已被文獻描述。每次克隆後，可將質粒分離，並進行進一步處理，如限制、新片斷插入、連接、缺失、插入、切除等，以便修整所需序列的組成。一但該結構完成後，就可將其轉移到適當的載體上，以便按照該宿主細胞的轉化方式做進一步處理。
通常該重組結構中包括一種結構基因，該基因具有在宿主中表達所需的調節區並使轉化細胞具有選擇。該基因可以對細胞毒素劑，如抗生素、重金屬、毒素等產生抗性，並且附加地對營養缺陷性細胞提供原型、病毒免疫性或類似特性。同樣的，編碼酶的基因是有用的，該酶可用來製備可通過顏色變化如GUS或發光，如蟲螢光素酶而識別的化合物。根據引入表達結構或其組成的不同宿主品種的數目，可以使用一種或多種標記，此時對不同的宿主選用不同的條件。
除了供蠟合酶序列轉錄的序列以外，本發明的DNA結構還可使附加基因或基因獲得表達，該基因的蛋白產物可與蠟合酶一起作用產生有價值的最終產品。例如，如上所述，在本發明中還研究了DNA結構，該結構可以使蠟合酶和一種脂肪醯基還原酶獲得表達從而可以在轉化的宿主中產生蠟合酶。此外，還需要產生具有不同碳鏈長度和飽和度的不同蠟酯，並且可以通過轉化具有不同碳鏈長度的脂枋醇或脂肪醯基底物的宿主植物來提供。這些植物例如可以通過國際專利申請PCTWO91/16421中公開的方法來獲得，該文獻描述了各種硫酯酶基因以及使用這些基因在轉化的植物宿主中生產具有不同鏈長的脂肪醯基底物。
此外，為了使油料種子植物宿主中的蠟酯的製備過程最佳化，可考慮降低三醯基甘油酯油的產生(該油一般在這些植物的種子中產生)。一種實現該目的方法是使對該方法起關鍵作用、但並不是生產蠟酯所必需的基因失去意義。這些基因靶包括二醯基甘油醯基轉移酶，和其它催化三醯基甘油合成的酶。另外，可以向油料種子植物提供酶，該酶可用於降解蠟酯作為營養源，例如可以從希蒙德木屬或其它各種產生蠟的生物體中分離。用該方法，可以在種子植物中獲得最高蠟酯產量。
採用由希蒙德木屬中提取蠟的技術或者利用從各種油料種子作物中製取油產物的各種製備方法，可以收穫按本文所述方法生產的蠟酯。由此獲得的蠟可用於許多工業中，其中包括藥物、化妝品、洗滌劑、塑料和潤滑劑。應用將隨蠟酯組成的鏈度和飽和度而變化。例如，在每個碳鏈上具有雙帶的長鏈蠟在室溫條件下是液體，而具有飽和碳鏈組成的蠟在室溫條件下可能是固體(尤其是當飽和碳鏈是較長碳鏈時)。
轉化方法並非是本發明的關鍵，多種植物轉化方法都可以使用。當可用較新手法來轉化作物時，則可以將它們直接應用於下文中。例如，藉助於以土壤桿菌為介質的三元或二元載體轉化法可以成功地將對土壤桿菌感染具有天然感受性的許多植物品種轉化。用於使核酸序列轉移宿主植物細胞中的其它序列可以從植物病原病毒或植物可移位部分中獲得。另外，我們發展了顯微注射、DNA顆粒轟擊、電泳技術，使它們能夠轉化各種單子葉和雙子葉植物種類。
當將土壤桿菌用於植物轉化時，則希望它在與下-DNA接壤的一端或兩端，優選地在左和右邊緣區，更優選地至少在右邊緣區具有想要的核酸序列。當採用其它轉化方法時，這些邊緣區也是有用的。
在將土壤桿菌或根瘤基因(Rhizogenes)序列用於植物轉化過程中時，可使用一種載體，該載體可以被導入土壤桿菌中從而與在位於宿主細胞中的Ti或Ri質粒上的T-DNA進行同源重組。含有重組用T-DNA的Ti-或Ri-可以被防護起來(能引起菌癭形成)或解除防護(不能引起菌癭形成)，後者只要Vir基因的功能補體存在於轉化的土壤桿菌屬宿主中就可以容許，所述的Vir基因編碼將DNA轉移到植物宿主細胞中所必需的執行因子(transactingfactors)。使用防護的土壤桿菌菌株可以得到一種正常植物細胞(其中的一些細胞含有想要的核酸序列)和由於存在瘤形成基因而能形成菌癭的植物細胞的混合物。含有想要的核酸序列但缺少腫瘤基因的細胞可以從該混合物中選出，從而獲得正常的轉基因植物。
在優選的採用土壤桿菌作為轉化宿主細胞的載體的方法中，與T-DNA接壤的表達或轉錄結構邊緣區可以被插入到一種廣宿主範圍載體中，該載體能在大腸桿菌和土壤桿菌中進行複製，其中的廣宿主範圍載體已在文獻中有所介紹。通常使用的是pRK2或其衍生物。例如，參見Ditta，等人(Prc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.(1980)777347-7351)和EPA0120515所述，這些文獻引入本文作為參考。另外，可將在植物細胞中表達的序列插入含有分離的複製序列的載體中，這些序列中有一種能在大腸桿菌中使載體穩定，其它序列則在土壤桿菌中使載體穩定。例如，參見McBride和Summerfelt(PlantMol.Biol.(1990)14269-276)，其中採用了pRHRI(Jouanin等人，Mol.Gen.Genet.(1985)201370-374)複製源而且它使得在宿主土壤桿菌細胞中的植物表達載體更加穩定。
優選地是利用如上所述可在土壤桿菌中複製的載體。在該方法中不需要質粒重組，而且宿主土壤桿菌Vir區可以提供將T-DNA鄰接序列轉移到植物宿主細胞中所需要的執行因子。為了轉化芸苔細胞，可採用土壤桿菌轉化法。例如，Radke等人(Theor.Appl.Genet.(1988)75685-694)描述了一種該方法。
此外，現在已對本發明進行了概括性的描述，而參考以下實施例將使發明更加易懂。提供這些實施例的目的僅僅是為了說明而並非打算對發明進行限制(除非另有所注)。
實例實例1-蠟合酶試驗下列將描述在微粒體膜製劑或溶解的蛋白質製劑中進行蠟合酶活性試驗的方法。
A、放射性標誌材料一般在蠟合酶試驗中使用的底物，[1-14C]棕櫚醯基-輔酶A，是從Amersham(Arlington Heights，IL)購得的。為了進行鏈長度特性研究其它鏈長度底物則也被合成。長鏈[1-14C]脂肪酸(比活性為51-56Ci/mole)，即11-順式-二十碳烯酸、13-順式-二十二烯酸和15-順式-二十四碳烯酸是通過將相應的醇甲磺醯酯與[14C]氰化鉀反應隨後將醇腈加鹼水解變成游離脂肪酸而製成的。該游離脂肪酸用醚重氮甲烷轉化成它們的甲酯，且用製備性硝酸銀薄層色譜法(TLC)純化。將該脂肪酯甲酯水解回到游離脂肪酸。其放射化學純度是用三種TLC方法來鑑定的常規相二氧化矽TLC、硝酸銀TLC、和C18反相TLC。用這些方法測得的放射化學純度92～98%。長鏈[1-14C]醯基-輔A從其相應的[1-14C]游離脂肪酸製得，製備方法採用Young和Lynen所述的方法(J.Bio.Chem.(1969)244377)其比活性為10Ci/mole.[1-14C]十六醛(hexadecanal)是通過將[1-14C]十六-1-醇進行重鉻酸鹽氧化作用而製成的，它是按照Pletcher和Tate所述的微量修飾法(Amiczo-scalemodification)進行的。(Tet.Lett.(1978)1601-1602)將該產品用製備性二氧化矽TLC進行純化，且以一種己烷溶液形式在-70℃條件下貯存直至使用。
B、對在微粒體膜中的蠟合酶活性的試驗製備在微粒體膜製劑中的蠟合酶活性是通過將該樣品與40m[1-14C]醯基-A(一般為棕櫚醯基-輔A，比活性為5.1-5.6mCi/mmol)和200mM油醇一起培養而測量出的，其中試樣的總體積為0.25ml。該培養混合物含有20%(w/v)甘油、1mM DTT、0.5M Nacl並且用25mM HEPES(4-[2-羥基乙基]-1-哌嗪乙烷-磺酸)來進行緩衝。HEPES(這裡和下面所提及的)是從一個被調至pH為7.5的1M儲液中加入的。
在玻璃管瓶中製備一種底物混合物，在使用前快速加入油醇，且將其加入到樣品中。在30℃條件下進行1小時培養。通過將試管放置在冰上且立刻加入1.25ml異丙醇，乙酸(4∶1 V∶V)來終止該試驗。將未標記的蠟酯(0.1mg)和油醇(0.1mg)作為載體加入。將[14C]類酯用Hara和Radin所述的縮減方法來萃取(Anal.Biochem.(1978)90∶420)。將4ml的己烷/異丙醇(3∶2V/V)加入到該終止的試驗中。將該樣品旋轉攪拌，加入2ml硫酸鈉水溶液(6.6%W/V)，且再次旋轉攪拌該樣品。
C、對溶解的蠟合酶活性進行試驗對溶解的蠟合酶活性進行試驗，需要重組該蛋白質。通過將磷脂(SigamP-3644，～40%L-磷脂醯膽鹼)加入到0.75%CHAPS-溶解的樣品中(其濃度為2.5mg/ml)，隨後將洗滌劑稀釋到0.3%(低於CMC)而實現重組。估計活性的重組取決於把蠟合酶引入磷脂泡中的情況。人們應該認識到在蠟合酶重組之後檢測的蠟合酶的活性值會受到許多因素的影響(如磷脂與蛋白質的比率，和蠟合酶蛋白物理狀態(如聚集和分散的))。
D、試驗產物的分析為了對微粒體膜製劑蠟合酶試驗產物或溶解的蠟合酶試驗產物進行分析，兩種方案均已得到發展。第一種方案(下面將稱之為「廣泛試驗」)較為耗時，但可產生大量的定量結果。而另一方案(下面將稱之為「快速試驗」)也能提供蠟合酶活性測量，且速度更快，更方便，但是不太定量。
1、廣泛分析加入硫酸鈉在將樣品旋轉攪拌之後去掉上部的有機相，並用4ml己烷/異丙醇7∶2V/V)洗滌下部的水溶液相。把其有機相收集且在氮氣條件下蒸發至乾燥狀。該類脂剩餘物在少量己烷中重新懸浮，且對一份等分試樣通過液體閃爍計點進行放射活性檢驗。其餘樣品可用於對標記的種類進行TLC分析，從而對所產生的總蠟量給出測量結果。
為了進行液體種類分析，要將樣品放在一塊二氧化矽TLC板，將該板在己烷/二乙基醚/乙酸(80∶20∶1V/V/V)中培養。在類指種類、大量的蠟酯、游離脂肪酸、脂肪酯和原生處的極性類脂之間的放射活性分布將使用AMBIS放射分析圖象系統(ABISSystemsInc.，SanDiego，CA)來進行測量。若需要，可以將個別類脂種類從TLC板上回收以進行進一步分析。採用在甲醇中培養成的C18板的反相TLC系統也已用於該分析。
2、快速分析在加入硫酸鈉並旋轉攪拌樣品之後，將給定百分比的有機相去掉，且通過液體閃爍計點法來計數。這種計算用於估計在該有機相中的總計數。然後去掉其有機相的另一部分，在氮氣條件下乾燥，在己烷中將其再次溶解且點濺在TLC板上，且用對詳細試驗所述的方法進行顯示和掃描。以此方式來確定與蠟相關的總計數的百分比。
實例2-放射性標誌蠟合酶蛋白質將用放射性標記過的[1-14C]棕櫚醯基-輔酶A(Amersham)加入到一種蠟合酶製劑中，該製劑既可以是溶解的也可以是一種微粒體膜部分，其比率為5μl標記對40μl蛋白質樣品。該樣品在進一步處理之前至少在室溫條件下培養15分鐘。為了進行SDS-PAGE分析，該樣品可以用SDS樣品緩衝液直接進行處理且將其放在凝膠上進行電泳。
實施例3-為使蠟合酶活性特性化而作的進一步研究A、種子的生長和蠟合酶活性圖在地處Davis，CA的5種植物上對胚胎生長過程跟蹤兩個夏天以上。發現新鮮胚胎和幹胚胎的重量在約80天至約130天中以相當平穩的比率增加。類脂萃取結果表明當新鮮胚胎重量達到約300mg(約80天)時，類脂重量與幹胚胎重量的比率達到50%的最高水平。
如實施例1中所述的那樣在生長的胚胎中測量蠟合酶活性。當希蒙德木屬種子表皮被確定為是抑制因子的源時，在用液氮冷凍該胚胎並貯存於-70℃下之前去掉該種子表皮。
正如在無細胞勻漿或在膜部分中測得的蠟合酶活性的生長圖所示，它表明有一個大的活性誘導，基峰值處在開花期之後約110-115天的時候。因此，要在開花期後約90至110天之間收穫用於酶學研究的胚胎，在這個時期內蠟合酶的活性很高，類脂沉積還未達到最大水平，且該種子表皮易於去掉。蠟合酶活性的最高增加速度是出現在開花期後80天至90天之間。因此，用於cDNA庫構建的胚胎要在花開期後80至90天之間收穫，這時估計蠟合酶蛋白質的合酶比率是最高的。相對應地，編碼蠟合酶的mRNA水平估計在這個階段也是最高的。
B、底物的特異性將具有不同碳鏈長度和不飽和度的醯基-輔酶A和醇底物加入到具有蠟合酶活性的微粒體膜部分中，從而確定通過希蒙德木屬蠟合酶所識別的底物的範圍。按照實施例1中所述的測量蠟合酶，使用80μM的醯基-輔酶A底物和100μM經過放射性標記的油醇來測定醯基特異性。使用100μM的醇底物和40μM的用放射性標記的二十碳醯基-輔酶A來測量醇特異性。這些實驗結果列於下面的表1中。
表1希蒙德木蠟合酶的醯基和醇底物的特異性底物蠟合酶活性(pmoles/min)結構醯基基團醇基團12:01210014:09514516:08110718:0515620:0492122:04617
表1(續)希蒙德木蠟合酶的醯基和醇底物的特異性底物蠟合酶活性(pmoles/min)結構醯基基團醇基團18:12211018:2712320:11227222:1394124:13524以上結果表明該希蒙德木蠟合酶可利用廣泛範圍的脂肪醯基-輔酶A和脂肪醇底物。
另外，對於各種醯基-硫代酯底物的蠟合酶活性可以進行類似的測試，此時使用棕櫚醯基-輔酶A、棕櫚醯基-ACP和λ-乙醯基-S-棕櫚醯基半胱胺作醯基底物。用醯基輔酶A底物可以觀察到最大的活性。用醯基-ACP可以觀察到明顯活性(是用醯基輔酶A的活性的～10%)，但用N-乙醯基-S-棕櫚醯基半胱胺則看不到活性。
C、活性的效應物根據對蠟合酶活性的影響對各種硫氫試劑進行篩選。有機汞製劑顯示出能強烈地抑制活性，碘乙醯胺和N-乙基馬來醯胺則不太有效。對-羥基汞基苯甲酸酯的抑制作用可以觀察到，但這種抑制可通過隨後加入的DTT而被逆轉。這些結果表明對-羥基汞基苯甲酸酯的抑制作用涉及阻滯一種主要的硫氫基基團。
D、尺寸排它性色譜法用Sephacry1-200(Pharmacia，粒度範圍5，000～250，000道爾頓)填充一種柱(1.5cm×46cm)且用含有0.5M Nacl的柱緩衝液(25mM HEPES，20%甘油，0.75%CHAPS，1mM EDTA)將其平衡。將約2ml通過用1.5Nacl洗脫一次BlueA柱(參見實例4C)而收集的濃縮液裝入，且以0.5mg/min的速度從柱中流過。將該洗脫部分按照實施例1中所述的重組方法進行蠟合酶活性分析。蠟合酶活性在空白部分顯示出很寬的峰值而在其餘部分則全部下降。將具有蠟合酶活性的部分在室溫下用1-14C16∶O-輔酶A(0.0178μM)處理15分鐘。加入SDS至2%且將該凝膠點濺到Problott上(Applied Biosystems，Foster City，CA)且通過放射自顯影儀分析其乾燥的斑點膜。此外，還可對該斑點使用一種自動掃描系統(AMBIS，San Diego，Ca.)進行放射活性掃描。以這種方式，可觀察到57KD經過放射性標記的帶跟蹤著分析部分中的蠟合酶活性。
將與蠟合酶活性有關的蛋白質通過在第二種尺寸排它性介質上進行色譜而進一步特徵化。將一部分含有蠟合酶活性的通過用1.5MNacl洗脫(而後用1.0MNall洗脫)BlueA柱而獲得的10×濃縮的洗脫液(100μl)放在Superose12HR10/30柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)上進行色譜分析，並且通過在一個用分子重量標準(MWGF-70和MWGF-1000，Sigma)校準的柱上進行快速蛋白質液體色譜分析(FPLC)而對其進行分析。在洗脫的部分上完成活性測試。在空白部分中回收的蠟合酶活性最多為53%，但按照校準曲線在位於～55Kd處的洗脫液中發現一個容易檢測到的活性。這些數據表明活性天然蠟合酶蛋白質的最小尺寸與標記帶的57KD的尺寸非常相近，由此可以證實蠟合酶的活性是由一種多肽提供的。在空白部分中觀察到的蠟合酶活性部分估計是一種酶的聚集形式。
E、棕櫚醯基-輔酶A瓊脂糖色譜法用16∶0-輔酶A瓊脂糖(Sigma P-5297)填充一種柱(1.0×3cm)且用含有0.2MNacl的柱緩衝液(參見實施例1，D)將其平衡。將從Blue A柱上通過用1.5M Nacl洗滌而收集到的約4ml濃縮物融化，且在用0.2M Nacl柱緩衝液平衡的一種PD-10(Pharmacia)脫鹽柱上通過該濃縮物以減少該鹽的濃度。將該降低的鹽樣品(5ml)以0.15ml/min的流速裝入160 CoA瓊脂糖柱中。該柱用0.5M Nacl柱緩衝液洗滌，然後用1.5M Nacl柱緩衝液洗滌。雖然一些蠟合酶活性流過該柱或在0.5M Nacl洗滌時被去掉，但大部分所回收的活性(裝載活性的21%)在1.5M Nacl洗脫中被回收。將證明蠟合酶活性的那部分如實例2中所述的那樣用[14C]棕櫚醯基-輔酶A來進行放射性標記，且通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(Laemmli，Nature(1970)227680-685)來進行分析。再一次觀察到約57KD經過放射性標記的蛋白帶跟蹤著蠟合酶活性。
實例4希蒙德木蠟合酶的純化本實例描述了一些方法，它們可用在具有蠟合酶活性的希蒙德木膜製劑的分離過程、蠟合酶活性的溶解過程和進一步的蠟合酶蛋白的純化過程中。
A、微粒體膜製劑通過對希蒙德木胚胎中的水含量進行測量(45～70%)，在花期之後約90-100天時收穫希蒙德木胚胎。去掉外殼和種子表皮，且將該葉子在液氮中快速冷凍，在-70℃條件下貯存以備用。為了製備初始蛋白，在液氮溫度下在一個鋼臼中把冷凍胚胎搗成粉末，在典型的實驗中，要用70g胚胎。
將該粉末以每70克胚胎對280ml溶液的比率加至下列高鹽溶液中3MNaCl、0.3MM蔗糖、100mMHEPES、2mMDTT、和蛋白酶抑制劑、1mMEDTA、0.7μg/ml亮肽素、0.5μg/ml胃酶抑制素和17μg/mlPMSF。一種無細胞勻漿(CFH)通過用一種組織均化器(Kinematica，Switzerland，modelPT10/35)在緩衝液中將該粉末胚胎分散約39秒鐘然後使其通過三層Miracloth(CalBiochem，LaJolla，CA)過濾而形成。將該濾液在100，00xg下離心1小時。
所得到的樣品中包括粒丸、上清液、和一種漂浮脂肪層。去掉該脂肪層且收集該上清液部分且對一種含有1MNacl、100mMHEPES、2mMDTT和0.5MEDTA的溶液進行一整套滲析(換三次緩衝溶液)。將該滲液在200，000xg條件下離心1個半小時，從而得到一種粒丸，DPZ。將該粒丸在25mMHEPES和10%甘油中懸浮，其體積是原始CFH的1/20，以此得到微粒體膜製劑。
按實例1中所述的那樣進行活性測試。所回收的蠟合酶活性估計是無細胞勻漿中原活性的34%。當將其貯存在-70℃條件下時這種製劑中的蠟合酶活性是穩定的。
B、蠟合酶蛋白質的溶解過程將CHAPS(3-[(3-膽醯氨基丙基)-二甲基-氨溶的]-1-丙烷磺酸酯)和NaCl加入到微粒體膜製劑中，從而使其最終濃度分別為2%和0.5M。將該樣品在冰上培養約1小時，然後用25mMHEPES、20%甘油、0.5MNacl稀釋，從而降低CHAPS的濃度至0.75%。然後將該樣品在200，000xg條件下離心作用1小時，收集其上清液，且如實施例1、C、中所述那樣對蠟合酶活性進行試驗。通常，在其上清液部分回收的蠟合酶活性是從微粒體膜製劑中回收到的活性的11%。溶解的蠟合酶活性當貯存在-70℃時是穩定的。
C、BlueA柱色譜製備床體積約30ml的柱(2.5×8cm)，其中含有BlueA(CibacromBlueF3GA;AmiconDivision，W.R.GraceCO.)，且用含有0.4MNaCl的柱緩衝液(25mMHEPES，20%甘油，0.75%CHAPS1mMEDTA)對柱進行平衡。向溶解的蠟合酶製劑中加入柱緩衝液(25mMHEPES、20%甘油、0.75%CHAPS、1mMEDTA)使之稀釋到0.4MNaCl，且將其裝入BlueA柱。
該柱用含有0.5MNacl的柱緩衝液進行洗滌，直到在流過柱的緩衝液中沒有蛋白質能被檢測出來(通過在280nm處的吸收率來測量)。大於93%的蠟合酶活性附著於柱上，而大於83%的其它蛋白質則通過。一般，通過洗脫可回收約20%的裝載的蠟合酶活性。將一部分回收的活性(17%)用1.0MNacl柱緩衝液洗液洗脫，而將約75%的回收活性用1.5MNacl柱緩衝液在150ml洗滌液中洗脫(以很寬的峰值)。從1.5M洗液中回收5ml部分，且如實例1中所述的那樣對其蠟合酶進行測試。將含有蠟合酶活性的部分收集起來，且使用一種Amicon攪拌細胞單元和YM30膜將其濃縮十倍。這種濃縮的蠟合酶製劑可在-70℃條件下儲存。
D、SDSPAGE分析將從活性Blue A柱部分中得到的樣品在SDS PAGE樣品緩衝液中(1×緩衝液＝2%SDS、30mM DTT、0.001%溴酚藍)稀釋，且通過將它在來自NOVEX(San Diego，CA)的12%tris/甘氨酸預製凝膠上進行電泳來對其進行分析。將凝膠於恆壓150V下進行約1.5小時。通過銀著色法(Blum等人，Electrophoresis(1987)8∶93-99)檢測蛋白質。對該凝膠進行仔細檢測，結果發現只有少數幾種多肽，其中包括的57KD中的一種，它們在各個部分中的著色強度能夠與在那些部分中檢測到的蠟合酶活性的量相互關聯。進一步，若將經過放射性標記[1-14C]棕櫚醯基-輔酶A在進行SDS PAGE分析之前加入到該蛋白製劑中，則該凝膠的放射自顯影將顯示該57KD標記帶跟蹤著這些部分中的蠟合酶活性。其它蛋白質在該製劑中也存在，其中包括56和54KD還原酶蛋白，該蛋白質描述於未決申請USSN 07/767，251申請案中。
E、連續相洗脫將蠟合酶蛋白質分離以進行胺基酸排序，此時使用一種SDS-PAGE設備，Model491PrepCell(Bio-RadLaboratories，Inc.，Richmond，CA)，且按照製造者的說明書來進行。將從BlueA柱的1.5MNacl洗脫液中得到的蠟合酶活性的一部分(15ml)在Centricon30(AmiconDivision，W.R.GraceCO;Beverly，MA)中濃縮10倍，且在PharmaciaPD-10脫鹽柱上用柱緩衝液去鹽。將該樣品用2%SDS和少量的溴酚藍示蹤染料處理，並將其放在5ml、4%丙烯醯胺疊層凝膠上(該凝膠位於在PrepCell設備中的20ml，12%丙烯醯胺運行凝膠上)。將該樣品在10W下電泳，且在從凝膠中洗脫時通過PrepCell連續收集其蛋白。然後用一種部分收集器以7.5～10ml部分收集該洗脫的蛋白質。將在所述區域(取決於所預測的蠟合酶蛋白的57KD尺寸)內的每種部分的1μl在Centricon30中濃縮至40μl，且用2%SDS處理。在12%丙烯醯胺小型凝膠(Novex)上處理該樣品，並用銀將其著色。為了使蠟合酶的回收達到最佳可以對連續相洗脫工藝進行多種修改。這些修改包括調整在凝膠體積中的丙烯醯胺百分比，和對用於凝膠的蠟合酶的量進行調整。例如，為了分離更多的蠟合酶蛋白，該BlueA柱分餾物可以以每20ml凝膠約1mg蛋白的濃度施加到更大體積的、22-55ml丙烯醯胺凝膠上。然後可以將從這些凝膠中洗脫的蛋白部分施加到10-15%梯度的丙烯醯胺凝膠上以增加帶分離。
對每個部分的蛋白含量用肉眼進行估算，且將含有蠟合酶蛋白的部分收集起來並將其濃縮以用於胺基酸排序。為了最大量地收集蠟合酶，在收集的製劑中包括含有56KD還原酶蛋白帶的部分。由於還原酶蛋白的序列是已知的(參見圖1)故在應用胺基酸序列技術(參見實例5)之前沒有必要對收集製劑中的蠟合酶蛋白進行進一步純化。
G、將蛋白點濺到膜上此外，該蠟合酶蛋白可以通過轉移到PVDF膜上(在SDS-PAGE之後，該膜可以是Immobilon-P(Millipore;Bedford，MA)也可以是ProBlott(AppliedBiosystems;FosterCity，CA)而獲得，進一步分離以進行胺基酸排序。雖然轉移到硝化纖維素上也是有用的，但初始研究表明只有很少一些蛋白會轉移到硝纖維素膜上，這很可能是由於這種蛋白的疏水性能。優選地是在不同方法中使用PVDF膜，如ProBlott和Immobilon-P，這取決於所用的胺基酸排序技術。例如，轉移到ProBlott上對於N-末端排序方法是有用的，而對於從溴化氰化過程中得到肽的過程的來說，最好是用ImmobiIon-P。
1、點濺到硝化纖維素上當蛋白質被電濺射到硝化纖維素上時，該濺射時間在一種緩衝液中(如在5～20%甲醇中的25mMTris，192mM甘氨酸)一般是1-5小時。電濺射後，將膜在0.1%(W/V)的PorceauS(在1%(V/V)乙酸中)進行2分鐘著色，且在0.1%(V/V)乙酸中進行2-3次退色，每次進行2分鐘。然後這些膜在熱封塑膠袋中在-20℃條件下溼法儲存。若時間允許，該斑點可不用冷凍，而是立即用於消化以產生肽，從而按下面所描述的進行胺基酸排序。
2、點濺到PVDF上當將蛋白質電濺射到ImmobilonPPVDF上時，該濺射時間在一種緩衝液中(如在20%(V/V)甲醇中的25mMTris/192mM甘氨酸)一般為1-2小時。在電濺射到PVDF上之後，膜在0.1%(V/V)CoomassieBlue(在50%(V/V)甲醇/10%(V/V)乙酸中)中進行5分鐘著色，且在50%(V/V)甲醇/10%(V/V)乙酸中，進行2-3次退色，每次進行2分鐘。然後讓PVDF膜進行30分鐘空氣乾燥，隨後在熱封塑膠袋中在-20℃條件下乾燥儲存。點濺到PVDF膜(如ProBlott)上的蛋白可以直接用於確定完整蛋白質上的N-未端順序。對於將蛋白質點濺到ProBlott的一種方法將在下列實例5A中描述。
實例5-胺基酸順序的確定在這個實例中，所描述的是與蠟合酶有關的植物蛋白質的胺基酸順序的確定方法。
A、蛋白質的溴化氰裂解和肽分離溴化氰裂解是在所述的蛋白質上進行的，其中所用的方法已描述於Probe-DesignPeptideSeparationSystemTechmicalManual(出自Promega，Inc、(Madison，WI)中。將蠟合酶蛋白質(若不能在純化的液體樣品中得到)如上述所述點濺到PVDF膜。將來自PVDF斑點的純化的蠟合酶蛋白或蠟合酶帶放置在溴化氰在70%(V/V)甲酸中的溶液中，且在室溫下培養過夜。培養之後去掉溴化氰溶液，收集並用一種Reacti-VapEvaporator(Pierce，Rockfond，IL)在連續氮氣流條件下乾燥。將來自PVDF的溴化氰肽進行再一次洗脫，以確保完全去除，其中使用的肽洗脫溶劑例如為70%異丙醇、0.2%(V/V)三氟乙酸、0.1mM賴氨酸、和0.1mM巰基乙酸。然後去除洗脫溶劑，且加到含有幹溴化氰溶液的試管中，並如上所述進行乾燥。該洗脫過程可用新鮮的洗脫溶液重複進行。然後將50μl的HPLC級水加到該乾燥的肽中，且在Speed-Vac(Savant，Inc.，Farmingdale，NY)中通過蒸發去掉上述水。
將通過溴化氰裂解而產生的肽分離，其中使用的是與Schaegger和VonJagow(Anal.Biochem.(1987)166368-379)所述相同的一種Tris/TricineSDS-PAGE系統。將凝膠在恆壓125-150V的條件下處理約1小時或直到示蹤染料已開始流出凝膠的底部邊緣。將凝膠在轉移前在轉移緩衝液(125mMTris，50mM甘氨酸、10%(V/V)甲醇)中浸泡15-30分鐘。將凝膠在恆壓50V條件下向ProBlott排序膜(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)濺射2小時。該膜用Coomassie藍(在50%(V/V)甲醇/10%(V/V)乙酸中，0.1%)著色，且在50%(V/V)甲醇/10%(V/V)乙酸中退色3×2分鐘。在-20℃乾燥貯存之前，將該膜用空氣吹乾。
被濺到ProBlott上的肽無需加入到塗有Polybrene的玻璃纖維過濾器，就可直接裝到蛋白質順序器的順序盤上。利用由AppliedBiosystems提供的經過稍微改進的反應環，BLOT-I對肽進行排序。另外將溶液53(丁基氯)用S1和S2(正庚烷和乙酸乙酯)50∶50的混合物取代。只要對濺射到ProBlott上的樣品進行排序，均需使用這兩種修飾。
B、蛋白酶消化和肽分解在液體溶液中提供的純蠟合酶蛋白或濺射到硝化纖維素上的蠟合酶蛋白為了獲得排序用的肽均需用蛋白酶進行消化。所用的方法是Aebersold等人的方法(PNAS(1987)846970)。
對於在硝化纖維素上所提供的蛋白質，從硝化纖維素膜上切下蠟合酶蛋白質帶以及作為對照物的等量的空白硝化纖維素，用HPLC級水將其洗滌幾次，以便去除PonceauS。在洗滌之後，將1.0ml，0.5%聚乙烯基吡咯烷酮(PVP-40，Aldrich，Milwaukee，WI)在0.5%乙酸中加到該膜片中，且將這種混合物在37℃條件下培養30分鐘。為了完全去除PVP-40將硝化纖維素片用大量HPLC級水(8×5ml)洗滌，在光譜儀上214nm處檢測該洗滌物的吸收值。同樣，如果在PVP-40處理和洗滌之後蛋白帶尚未被切成小片，則PVP-40仍較容易被除去。
然後，將在溶液或硝化纖維片中的蛋白質懸浮在一適當的消化緩衝液中，例如胰蛋白酶消化緩衝液、100mM碳酸氫鈉，pH8.2、或由蛋白酶gluC緩衝液、25mM碳酸銨/1mMEDTA，pH7.8。將乙腈加到該消化混合物中，使其濃度為5～10%(V/V)。在消化緩衝液中稀釋蛋白酶，且將其加到該消化混合物中，一般蛋白酶與蛋白質的比率為1∶10(W/W)。將消化緩衝液培養18-24小時。例如，將胰蛋白酶消化液在37℃條件下培養，且將內蛋白酶gluC消化液在室溫下培養。同樣，其他蛋白酶也可用於消化蠟合酶蛋白質，其中包括lysC和aspN。儘管各個消化緩衝液條件可以不同，但用於消化、肽分解、純化和順序排列的方法基本上與用胰蛋白酶和gluC進行消化時所述的方法相同。
過夜培養之後，將消化反應通過加入10μl10%(V/V)的三氟乙酸(TFA)或1μl100%TFA而停止。當在硝化纖維上提供蛋白質時，該硝化纖維素片要用1-5100μl具有5～10%乙腈的消化緩衝液進行洗滌，且將這些體積在Speed-Vac中濃縮至小於100μl體積。
將從消化過程中得到的肽用安裝在AppliedBiozystems(FostCity，CA)Model130HyghPezfozmerccLiquidChromatogzaph(HPLC)中的一種Vydac反相C18柱(2.1mm×100mm)分離。用於洗脫肽的流動相是緩衝液A0.1mM磷酸鈉，pH2.2;緩衝液B在0.1mM磷酸鈉中的70%乙腈，pH2.2。使用3級梯度即兩小時內為10-55%緩衝液B，5分鐘內的為55～75%緩衝液B，和用75%緩衝液B同溶劑進行15分鐘，其流速為50μl/分鐘。在214nm處對肽進行檢測，用手將其收集，然後貯存在-20℃條件下。
由於蠟合酶蛋白質的疏水性能，在酶消化緩衝液中添加一種洗滌劑將是有用的。例如，將從上述連續相洗脫過程中得到含有希蒙德木蠟合酶的部分在100mM NaHCO3/1.0%CHAPS溶液中、在Centricon30裝置中濃縮至最終體積為110μl。將在5μl、100mMNaHCO3/10%CHAPS中的2μg胰蛋白酶加到該蛋白溶液中，且在37℃條件下過夜培養該混合物，並通過加入三氟乙酸(TFA)終止該消化過程。稍微離心該樣品，且在Vydac C18柱上分離該肽並如上所述對其進行洗脫。在此過程中，CHAPS在～40-53%緩衝液B條件下洗脫，並遮住了該肽在這個區域中的峰。
當初級分離產生一種複合肽圖，例如使用過量的蛋白質或存在著汙染(如希蒙德木還原酶蛋白質)時，肽峰可使用一種柱進一步進行色譜分析，但是此時採用不同的梯度系統。對於上述的希蒙德木蠟合酶製劑，親水峰分離所使用的梯度是60分鐘的0～40%緩衝液B，35分鐘的40-75%B和10分鐘的75～100%B。疏水峰分離使用的梯度是40分鐘的0-40%緩衝液B、60分鐘的40-80%B和10分鐘的80-100%B。對於這些分離過程，緩衝液A是0.1%TFA而緩衝液B是在乙腈中的0.1%TFA。
C、蛋白質和肽的N-末端順序排列所有的順序排列是通過埃德曼(Edman)降解來完成的，其中使用了一臺AppliedBiosustams477A脈衝-液相蛋白質排序器(AppliedBiosystems477APulsed-LiquidPhaseProteinSequencer);由該排序器產生的乙內醯苯硫脲(PTH)胺基酸將通過一臺聯機的AppliedBiosystems120APTH分析器(AppliedBiosystems120APTHAnalyjer)來進行分析。數據的收集和儲存使用了一種在AppleMacintosh機上的AppliedBiosystems牌號610A數據分析系統以及一臺DigitalMicrovax，它使用從PENELSON，Inc.(Cupertino，CA)得到的ACCESS☆CHROM軟體。序列數據從一種圖表記錄器中讀出，該記錄器是從上述PTH分析器中接收輸入的，並且用從上述牌號610A軟體中獲得的定量數據來確認。所有的序列數據由兩個操作員通過其數據分析系統獨立地讀出。
對於從HPLC上的峰值而獲得的肽樣品，可以將該樣品放入一個塗有Polykrene的玻璃纖維過濾器上(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)，該過濾器已在排序器中進行了3次預循環。對於已還原和己烷基化了的肽，將從每個順序器循環中獲得的PTH-胺基酸產物材料的一部分在一臺液體閃爍計數器中進行計數。對於已電濺射到Immokiton-P上的蛋白質樣品，將有用的帶切下來，然後放在塗有Polykrene的玻璃纖維過濾器上，如上所述進行安裝。對於已電濺射到ProBlott上的蛋白質樣品，則不需要使用玻璃纖維過濾器。
為了從少量樣品(5-30pmoles)中獲得蛋白質序列，可以使用由Tempst和Riviere所描述的477A轉換環和120A分析器(Anal.Biochem.(1989)183290)。
通過如上所述的胰蛋白酶消化獲得的希蒙德木蠟合酶肽的胺基酸序列在下列表2中列出。
表2希蒙德木蠟合酶胰蛋白酶肽的胺基酸序列SQ1114ETYVPESVTKKSQ1084VPXEPSIAAXSQ1083ETYVDEFvtkSQ1120DLMAVAGEAlkSQ1125MINVKPYIPDFSQ1129FLPXXVAiTGeSQ1131FGNTSSXXLyxelayakSQ1137AEAEEVMYGAIDEVLEK
蠟合酶肽的胺基酸序列用單個字母編碼來表示。「X」表示一個不能確定的胺基酸的位置，並通過小寫的字母所代表的胺基酸表示識別可信度較低殘基。
實例6-輔加的蠟合酶的純化本例所描述的是使希蒙德木蠟合酶的溶解和純化方法適用於從其他有機體中獲得部分純化的蠟合酶製劑的情況。
A、不動桿菌屬將乙酸鈣不動桿菌株BD413的細胞(ATCC＃33305)在ECLB(大腸桿菌luriab rowth)上生長，將其在對數生長期過程中收集且在含有Hepes，pH7.5、0.1M NaCl、1mM DTT和蛋白酶抑制劑的一種緩衝液中洗滌。將洗滌過的細胞在新鮮緩衝液中重新懸浮且通過將其經過一個French壓力單元(在～16000p.s.i條件下經過兩次)將其破碎。未被打破的細胞通過在5000xg條件下進行10分鐘離心作用而被去掉，而膜通過在100.000xg條件下進行1小時離心作用來收集。將該膜粒丸在儲存緩衝液中(25mM Hepes，pH7.5，10%(W/V)甘油)拌勻。在這些膜中檢測蠟合酶活性，此時使用在實例1B中所述的對於希蒙德木酶的試驗條件，用[1-14C]棕櫚醯基-輔酶A和181的醇作為底物。
如在實例4B中對希蒙德木酶所述的那樣，通過在0.5MNaCl存在的條件下用2%CHAPS對膜進行培養而溶解蠟合酶活性。通過在200，000g條件下進行1小時的離心作用之後在上清液部分中對蠟合酶酶活性進行檢測，以及通過尺寸排它性色譜法而證實該活性的溶解(即該活性是在其所剩餘的部中從柱上作為一個對稱峰而洗脫的，該溶解的酶的活性是通過簡單地將CHAPS濃度稀釋至～0.3%(即，低於其自身的CMC)而檢測的。檢測溶解的活性時無需將酶導入磷脂泡中。
為了進行純化，需將溶解的不動桿菌蠟合酶活性進行色譜法純化，其方法與對希蒙德木醯基-輔酶還原酶所述的一樣。將可溶的蛋白質製劑在低鹽條件下(在含有0.75%CHAPS、10%甘油、25mMHepes、pH7.5的柱緩衝液中的150mMNaCl)裝到BlueA瓊脂糖上，且用在該柱緩衝液中的1.0MNaCl將其從柱中洗脫。
在Superosel2(Pharmacia，Piscataway，NJ)介質上進行的尺寸排它性色譜被用於對天然的酶的尺寸獲得一個估計值並幫助確定待定的多肽。與在相同條件下由色譜法獲得的分子量標準作比較，結果得到對於天然蠟合酶活性的估計值為～46KD。具有表觀分子量的45KD、58KD、和64KD的三種多肽被識別出來，它們跟蹤著蠟合酶活性。蠟合酶最強的候選物，45KD多肽的N-末端序列被確定為XDIAIIGSGsAGLAQaxilkdag，這裡僅用一個字母編碼代替胺基酸，「X」代表一個不能被確定的胺基酸的位置，且由小寫字母代表的胺基酸代表識別可信度較小的殘基。
B、裸藻屬(Euglena)將股薄肌裸藻屬(Euglenagracilis)，菌株Z(ATCCNo、12716)在～26℃條件下以適度的振動在黑暗中異地生長(Tani等(1987)Agric.Biol.CHem.51225-230)。將細胞收集，且在含有25mMBis-Tris-Propane、pH7.0、0.25MNaCl和1mMEDTA的緩衝液中重新懸浮，且通過經過一個French壓力單元(在～16，000p.s.i條件下經過2次)而使其破裂。未破裂的細胞、細胞碎片和核通過在20，000xg條件下進行1小時的離心作用而收集微粒體膜。將該膜粒在儲存緩衝液(25mMBis-Tris-Propane，pH7.0、0.25M NaCl、10%(W/V)甘油和1mM EDTA)中拌勻。使用對希蒙德木酶所描述的試驗條件在這些膜中檢驗蠟合酶活性。經放射性標記的底物與希蒙德木例子的相同(即，[1-14C]棕櫚醯基-輔酶A)，然而，使用的醇受體是160而不是181，且採用pH7.0的Bis-Tris-Propane。
裸藻屬蠟合酶的活性是通過在0.5mMNaCl存在的條件下使用2%CHAPS將膜進行培養而溶解的。其蛋白質的溶解是通過在200，000xg條件下進行1小時離心作用之後在上清液部分中對酶活性進行檢測而證實的。該溶解的酶的活性是通過將CHAPPS濃度稀釋至～0.3%(即，低於它自身的CMC)而進行檢測的。就象對溶解希蒙德木蠟合酶所述的那樣，此時不需要把酶導入磷脂泡中。
為了進行部分純化，將該溶解的裸藻屬蠟合酶活性在BlueA瓊脂糖介質上進行色譜法分離。在一柱緩衝液中用0.1MNaCl平衡該柱，其中該緩衝液含有25mMBis-Tris-Propane，pH7.0、20%(W/V)甘油、0.75%CHAPS和1mMEDTA。將含有溶解的蠟合酶活性的樣品稀釋至0.1MNaCl且裝到一個1×7cm的柱上(5.5ml床體積)。將該柱用平衡緩衝液洗滌且在柱緩衝液中使它遭受一種線性NaCl梯度(0.1M至1.0MNaCl)。蠟合酶活性在該鹽梯度的後半部分中以一種很寬的峰被洗脫。
柱部分的SDS-PAGE分析結果表明相對於其裝到柱上的材料而言，從其柱上洗脫的活性的多肽的複雜性得到了極大的降低。可以發現一種～41KD表觀分子量的多肽跟蹤著該柱部分中蠟合酶活性。使用進一步純化技術(如對希蒙德木和不動細胞屬所描述的)可以證實～41KD肽與蠟合酶活性的聯繫。
為了對在裸藻屬中的蠟合酶活性進行進一步分析，按下面所介紹的進行尺寸排它性色譜。從在黑暗中在液體異地培養基上生長的裸藻屬細胞中獲得一種微粒體膜製劑。通過在冰上用在緩衝溶液(25mMBis-Tris，pH7.0、1mMEDTA和10%(W/V)甘油)中的2%(W/V)CHAPS和500mMNaCl對膜進行1小時的處理而溶解蠟合酶活性。在通過添加稀緩衝液使CHAPS稀釋至0.75%和使NaCl稀釋至200mM之後，將該樣品在～200，000xg條件下進行1.5小時的離心作用。將該上清液部分裝到一個用柱緩衝液(25mMBis-TrispH7.01mMEDTA，10%甘油，0.75%CHAPS)預平衡了的BlueA染色柱上，該緩衝液還含有200mMNaCl。該柱用含有200mMNaCl的柱緩衝液來洗滌，直到流出液中的A280回到其預裝填值。已粘連到柱上的蠟合酶活性通過增加柱緩衝液中NaCl的濃度至1.5M而將其釋放。將含有用1.5MNaCl(～20ml總體積)釋放的蠟合酶活性的部分(來自BlueA柱)收集在一起經過超濾作用(配有YM30膜的Amicon壓力單元)將其濃縮約30-倍。將從BlueA柱中得到的濃縮物質用作通過在Superose12培養基上(Pharmacia)進行尺寸排它性色譜而進行分離的樣品。
將約200μl樣品裝到一個Superosel2柱(HR10/30)上，該柱用含有0.5MNaCl的柱緩衝液進行了預平衡，且是在1ml/min的流速下進行的。將該蠟合酶活性從該柱中以一種光滑峰的形式洗脫。用分子量標準蛋白質的洗脫圖與該蠟合酶活性的洗脫體積相比，結果得出對於該酶的表觀分子量估計值為166KD。含有蠟合酶活性的部分通過用SDS-聚丙烯醯胺凝膠進行電泳然後再銀染色來進行分析，對各種部分的多肽圖進行的初步分析沒有觀測到任何具有100KD或更大分子量且染色強度與活性圖相匹配的蛋白質。蠟合酶多肽可以在樣品混合物中以次要成分存在，使其不易在銀染色凝膠上檢測到。另一方面，該酶可以由SDS-PAGE過程分裂的亞單位來組成。
實例7-蠟合酶核酸序列的分離本例描述的是從希蒙德木胚胎cDNA庫中或從基因組DNA中分離蠟合酶核酸序列的過程。
A、希蒙德木cDNA庫的構建採用一種多肽糖體分離方法從在開花期後80-90天時從採集到的希蒙德木胚胎中分離出RNA，該分離方法起初由Jackson和Larkins(PlantPhysiol.(1976)575-10)所描述，而後由Goldkezg等人(DevelopmentalBiot.(1981)83201-217)進行了改進。在這個過程中，所有步驟(除非特別說明)均在4℃條件下進行。將10gm組織在一臺韋林氏攙合器(WaringBlender)中在液氮中進行研磨，直到該組織變成細顆粒粉末。當液氮蒸發之後，加入170ml的萃取緩衝液(200mMTrispH9.0、160mMKCL、25mMEDTA、70mMMgC12，1%TritonX-100、0.5%脫氧膽酸鈉、1mM亞精胺、10mMβ-巰基乙醇、500mM蔗糖)且攪勻該組織約2分鐘時間。將該勻漿通過無菌的纖維布(miracloth)進行過濾且在12，000xg條件下離心20分鐘。將該上清液輕輕倒進一個500ml無菌燒瓶中，且在室溫下加入1/19體積的20%洗滌劑溶液(20%Brij35，20%Tween40，20%Noidetp-40W/V)。將該溶液在4℃條件下以適當的速度攪拌30分鐘，然後在12，000xg條件下將其上清液離心30分鐘。
約30ml的上清液等分到無菌Ti60離心管中且用7ml的一種溶液鋪在底下，其中該溶液含有40mM Tris pH9.0、5mMEGTA，20mM KCl，30mM MgCl2，1.8M蔗糖，5mM β-巰基乙醇。該管用萃取緩衝液填滿至頂部，且在一臺Ti60旋轉器上在4℃條件下以60，000rpm的轉速旋轉4小時。離心作用之後，將該上清液吸出，向每支管子中加入0.5ml再懸浮緩衝液(40mM Tris pH9.0，5mM EGTA，200mM KCl，30mM MgCl2，5mM β-巰基乙醇)。將該管放置在冰上10分鐘，然後將小粒重新完全懸浮和收集起來。然後將該上清液在120xg的條件下離心10分鐘，以去除不溶物質。將20mM Tris pH7.6，200mM EDTA、2%N-月桂基-肌氨酸酯中的一個體積的自消化的1mg/ml蛋白酶K加到該上清液中，且在室溫條件下培養該混合物30分鐘。
RNA通過加入1/10體積的乙酸鈉和2體積的乙醇來進行沉澱。在-20℃下幾小時之後通過在12，000xg和4℃條件下離心作用30分鐘使RNA粒化。將該粒丸在10mlTE緩衝液中(10mMTris、1mMEDTA)重新懸浮且用等體積的TrispH7.5飽和酚萃取。該相通過在4℃、10，000xg條件下離心作用20分鐘來分離。去掉水溶液相，並用1體積的TE緩衝液再萃取該有機相。然後收集該水溶液相且用1體積的氯仿來萃取。通過離心作用再一次分離該相，且如前所述用乙醇沉澱其水相，從而得到聚核糖體RNA。
在該聚核糖體RNA製劑中的多糖雜質是通過將該RNA在高鹽緩衝液(0.5MBNaCl，20mMTrispH7.5，1mMEDTA，0.1%SDS)中在纖維素柱(Sigma-cell50)上進行處理而去除的。該汙染物粘附在該柱上，而RNA在洗脫液中收集。將洗脫液部分收集在一起，且用乙醇將該RNA沉澱。然後所有沉澱的RNA在一個更小體積中再懸浮，並提供到一種寡d(T)纖維素柱上以分離多腺苷化的RNA。
將多腺苷化的RNA用於在質粒克隆載體pCGN1703中構建一個cDNA庫，該克隆載體出自市售克隆載體BluescribeM13-(Stratagene.CloningSystem;SanDiego，CA)，且在下面將描述其製備過程。將BluescribeM13-的多接頭通過用BamHI進行消化，用綠豆核酸內切酶進行處理，以及進行純端連接而改性使其產生一種缺失BamHⅠ-的質粒、pCGN1700。將pCGN1700用EcoRⅠ和SstⅠ(相鄰的限制位點)消化，並用帶有BamHⅠ、PstⅠ、XbaⅠ、ApaⅠ、和SamⅠ限制位點、AATT的5′懸突，和TCGA的3′懸突的人工接頭將其退火。該接頭插入到PCGN1700中消去了EcoRⅠ位點，產生了在Bluescribe中找到的SstⅠ(有時在本文也叫做「SacⅠ」)位點，並將新的在銜接物上含有的限制位點加入其中。將所得到的質粒pCGN1702用HindⅢ消化，且用Klenow酶將其未端純化;將該線性DNA部分地用PvuⅡ消化且與在稀釋溶液中的T4DNA蠟合酶連接。從中選出具有缺失的1ac啟動子區域的轉化體(pCGN1703)且用作質粒克隆載體。
以下簡單地描述用於cDNA合成的克隆方法。將質粒克隆載體用SstⅠ消化，且均聚物T-尾端在所得的3』-懸突粘著端上產生，此時，使用未端脫氧核苷酸基轉移酶。有尾部的質粒通過寡(dA)-纖維素色譜法從未消化的或無尾質粒中分離。所得載體可用作合成cDNA第一股(與該載體質粒的一端共價相連)的引物。將cDNA-mRNA-載體絡合物在三磷酸脫氧鳥苷酯存在的條件下用未端轉移酶來處理，在cDNA股的未端產生G-尾部。將外部的cDNA-mRNA絡合物(相鄰於BamHⅠ位點)，通過用BamHⅠ消化來去除，只留下BamHⅠ粘著端在一端而G-尾部在另一端的cDNA-mRNA-載體絡合物。將這種絡合物用一種退過火的人工環接接頭環接起來，該環接接頭具有一個5'BamHⅠ粘著末端，限制酶NotⅠ、EcoRⅠ和SsiⅠ的識別序列，和一個3'C-尾部末端。在連接和修補之後，將該環形絡合物轉移到大腸桿菌株DH5α(BRL，Gaithersburg，MD)中，從而產生其cDNA庫。該希蒙德木cDNA庫含有約1.5×106克隆，其平均cDNA插段尺寸為約500鹼基對。
另一方面，還可將希蒙德木多腺苷化的RNA用於在克隆載體λZAPⅡ/EcoRⅠ(Stratagene，San Diego，CA)中構建一種cDNA庫。該庫按照由製造商提供的構建方案由DNA和細菌菌種進行製備。克隆的封裝使用Gigapack Gold封裝提取物(Stratagene)，這也要按照製造商的建議去做。該cDNA庫以這種方式來建造，則含有約1×106克隆和平均尺寸約400鹼基對的cDNA插段。
B、聚合酶鏈反應使用如實例5中所描述的那樣獲得的胺基酸序列信息，蠟合酶蛋白質的核酸序列通過聚合酶鏈反應(PCR)來獲得。將合成寡核苷酸合成，它對應於所選定的蠟合成酶肽片段的胺基酸序列。若在蠟合酶蛋白質中的片段的順序是已知的，例如當其中的一種肽是來自N-末端或所選定的肽包含在一種長肽片段上，則對於每一種所選定的肽僅需要一種低核苷酸引物。用於多個N-末端肽的寡核苷酸引物，前導引物包含有該肽的編碼序列。用於多個C-末端肽的寡核苷酸引物，反向引物是互補於所選定的肽的編碼序列。另一方面，當所選擇的肽的序列是未知的，則對於每種肽需要兩種低核苷酸引物，一種引物編碼所選擇的胺基酸序列，而另一種互補於所選擇的胺基酸的序列。任何序列確定的蠟合酶肽均可選擇用於寡核苷酸的構建，儘管更令人滿意的肽是那些含有由最少數量的密碼編碼的胺基酸，例如蛋氨酸、色氨酸、半胱氨酸和其他由少於四個的密碼編碼的胺基酸的肽。因此，當寡核苷酸是所選定的肽的所有可能序列的混合物時，退化的寡核苷酸的數目可以是很低的。
利用這些寡核苷酸引物進行PCR，此時採用本領域技術人員已知的技術。希蒙德木核酸序列，如反向轉錄的cDNA(該DNA從上述cDNA庫或基因組DNA中分離)，在這些反應中用作模板。以這種方式，產生蠟合酶DNA的片段。對該PCR產品進行凝膠電泳，以從中選出那些能產生令人滿意的蠟合酶片段的反應。
C、對庫中的蠟合酶序列進行篩選將通過PCR所獲得的蠟合酶DNA片段標記且用作探針對從上述cDNA庫中獲得的克隆進行篩選。DNA庫篩選技術是本領域中所已知的，例如參見Maniatis等人所描述的(MolecularCloningALaboratoryManual，SecondEditiion(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress)。以這種方式，可以獲得蠟合酶核酸序列，它可以用於對核酸順序進行分析，並可用於在各種宿主中表達蠟合酶，其宿主既可是原核的也可是真核的。
以此方式獲得的1500核苷酸cDNA克隆。通過與表2中所提供的蠟合酶肽片段進行比較可以發現除SQ1129之外在轉譯的序列中這些肽的每一種都存在著。對希蒙德木胚胎RNA的Northern分析結果表明蠟合酶mRNA的長度約是2Kb。其它一些蠟合酶核酸序列還可以通過進一步的PCR而獲得，如5'RACE(Frohman等人，Proc.Nat.Acad.Sci(1988)858998-9002)。另一方面，附加的序列可通過再篩選cDNA庫或從基因組DNA中獲得。希蒙德木蠟合酶基因的DNA序列在圖2中列出。含有在pCGA1703中的完整的蠟合酶序列的質粒表示為pCGN7614。
D、蠟合酶在大腸桿菌中的表達將從pCGN7614中得到的蠟合酶基因放在大腸桿菌表達載體pCDR540(Pharmacia)的Tac啟動子的控制下(下面將要描述)。將pCGN7614DNA在載體SalⅠ位點處消化，且使用DNA聚合酶Ⅰ的Klenaw片段和核苷酸TTP和dCTP填入其末端中。pDR540載體通過用BamHⅠ消化和部分地將dCTP和dATP填進末端而製備。將1.8Kb從pCGN7614得到的片段和消化了的pDR540載體使用低熔化溫度的蔗糖進行凝膠純化，並且用T4DNA連接酶將其連接到一起。將含有在相對於大腸桿菌啟動子具有意義的取向中的蠟合酶的菌落表示為pCGN7620，而含有在反向取向中的蠟合酶基因的菌落為pCGN7621。為了對蠟合酶活性進行測試，將50mlpCGN7620和pCGN7621培養物在液體培養物中對數地生長，並通過添加IPTG至1mM的濃度將其誘導2小時。通過離心作用收集細胞，且對蠟合酶活性進行如對希蒙德木提取物所述的測試。TLC分析表明從pCGN7620中得到的細胞提取物指導蠟酯的合成，而從pCGN7621中得到的對照提取物指導蠟酯合成。
實例8-用於植物表達的蠟合酶和還原酶結構下面描述的是用於在植物細胞中表達蠟合酶還原酶序列的結構的製備過程。
A、表達盒(ExpressionCassettes)表達盒含有來自種子組織中優先表達的基因的5'和3'調節區域，它可以如在WO92/03564中所述的那樣從napin、Bce4和ACP基因製得。
例如，napin表達盒可如下所述進行製備。napin表達盒pCGN1808，它可以用於表達蠟合酶或還原酶基因結構，其製備方法如Kridl等人所述(SeedScienceResearch(1991)1209-219)，該文在此列為參考文獻。
另一方面，pCGN1808可被改進，使其含有側面限制位點，從而僅允許表達序列而不允許抗生素抗性標記移動到雙重載體，如pCGN1557(McBride和Summerfelt上文)中。將含有KpnⅠ、NotⅠ和HindⅢ限制位點的合成寡核苷酸退火，且在pCGN1808中唯一的HindⅢ位點處將其連接，使其僅有一個HindⅢ位置被恢復。所得的質粒pCGN3200在napin3'-調節序列的3'末端處具有唯一的HindⅢ、NotⅠ和KpnⅠ限制位點，其順序通過順序分析來確定。
大多數napin表達盒是通過用HindⅢ和SacⅠ進行消化和與經過HindⅢ和pIC19R消化的(Marsh，等人(1984)Gene32481-485)的SacⅠ連接而從pCGN3200中亞克隆，從而製得pCGN3212。napin啟動子區域的極端5'-順序是通過PCR從pCGN1808結構重新構成的，在該PCR中，採用PCGN3200作模板和兩種在SacⅠ位點和napin5'啟動子與pCGN3200的pUC主鏈的接合處側生的引物。前導引物含有ClaⅠ、HindⅢ、NotⅠ、和KpnⅠ限制位點以及napin5'-序列(來自EcoRV位點)的核苷酸408-423，而反向引子具有與napin序列718-739互補的序列，其中包括在5'-啟動子中的唯一的SacⅠ位置。按照製造商的說明進行PCR，其中使用一臺PerkinElmer/Cetus熱循環機。將PCR片段亞克隆成為一種純端片段而進入pUC8(Vieira和Messing(1982)Genel9259-268)中，且用HincⅡ進行消化，從而得到pCGN3217。在napin插段中穿過的pCGN3217的序列證實沒有不恰當的核苷酸通過PCR引入。將在pCGN3217中的napin5-順序通過用ClaⅠ和SacⅠ進行消化和與用ClaⅠ和SacⅠ消化過的pCGN3213連接而與napin表達盒的剩餘部分連接。將所得到的表達盒pCGN3213用HindⅢ消化，將該napin表達序列凝膠純化，且與用HindⅢ消化過的pIC20H(Marsh，上文)連接。最終的表達盒是pCGN3223，它在一個氨苄青黴素抗性背景中包括和在pCGN1808中所發現的基本相同的1.725napin5'和1.2653'調節順序。該調節區域的側面有HindⅢ，NotⅠ和KpnⅠ限制位點，且唯一的SalⅠ，BglⅡ、PstⅠ、和XhoⅠ克隆位點處於5'和3'非編碼區域之間。將蠟合酶基因序列插入到這種盒中，從而為植物轉移方法提供表達結構。例如，為了進行下面要描述的以土壤桿菌作介質的轉化過程可以將這類結構插入兩重載體中。
B、用於植物轉化過程的蠟合酶結構將蠟合酶基因質粒pCGN7614用AflⅢ進行消化，且與接合體接合從而將BclⅠ位點加到AflⅢ粘性末端上，隨後用SalⅠ和BclⅠ進行消化。將含有蠟合酶基因的片段凝膠純化並克隆到經過SalⅠ/BamHⅠ(一種napin表達盒)消化的pCGN3223中。所得到的質粒在napin表達盒中在有意取向上含有蠟合酶基因，將它表示為pCGN7624。將從pCGN7624中分離出的DNA用Asp718(一種KpnⅠ同裂酶)消化，且將napin/蠟合酶融合基因克隆到經過Asp718消化的雙重載體pCGN1578中(McBride和Summerfelt，同上)。將所得到的雙重載體(表示為pCGN7626)轉化到土壤桿菌菌株EHA101中，且用於擬南芥屬和菜子外植體(rapeseedexplants)的轉化。
C、用於植物轉化過程的還原酶結構製備用於在植物細胞中表達還原酶的結構，其中使用來自napin基因的5'和3'調節區域。
將一種還原酶cDNA(在上述的pCGN1703載體中，表示為pCGN7571)用SphⅠ(在鹼基1594-1599處的3'未轉譯的序列位點中)進行消化，且在這個位點上插入一個SalⅠ接物。將所得的質粒用BamHⅠ和SalⅠ進行消化，且將該含有還原酶cDNA的片段凝膠純化和克隆到用BglⅡ/XhoⅠ消化了的pCGN3223(napin盒，如上所述)中從而得到pCGN7585。
將含有napin5'/還原酶/napin3'結構的pCGN7585的HindⅢ片段克隆到經過HindⅢ消化的pCGN1578(McBride和Summerfelt，同上)，得到pCGN7586，它是一種用於植物轉化過程的雙重載體。
植物轉化結構pCGN7589(在一種napin啟動子的表達下還含有希蒙德木還原酶基因)的製備過程如下。在體外將pCGN7571誘變從而在還原酶編碼序列的第一個ATG處引入一個NdeⅠ位點，而在緊接著NdeⅠ位點的上遊引入一個BglⅡ位點。將BamHⅠ接物引入到位於還原酶編碼區域下遊的SphⅠ位點中。將1.5KbBglⅡ-BamHⅠ片段凝膠純化並克隆到用BglⅡ-BamHⅠ消化的pCGN3686(見下面)中，結果得到pCGN7582。
pCGN3686是一種從BluescriptKS+產生的克隆載體(StratageneCloningSystem;SanDiego，(A)，但它具有一個氯黴素抗性基因和一個經過修飾的接物區域。氯黴素抗生基因，pCGN565的源是一個基於pUC12-cm上的克隆載體(K.BuckleyPh.D.Thesis，Regulationandexpressionofthephi×174lysisgene，UniversityofCalifornia，SanDiego，1985)，但是它含有pUC18接物(Yanishch-Perron等人，Gene(1985)53103-119)。將pCGN565用HhaⅠ進行消化，且將該含有氯黴素抗性基因的片段切除並通過使用綠豆核將其純化、且將其插入到BluescriptKS-的EcoRV位點中(StratageneLaJolla，CA)，從而產生pCGN2008。該pCGN2008氯黴素抗性基因通過用EcoRⅠ/HindⅢ消化而去除，在用Klenow酶處理使未端純化之後，將該片段與用DraⅠ消化的BluescriptKS+連接。從中選出具有Dral片段(其中所含的氨苄青黴素抗性被氯黴素抗性取代)的克隆，且命名為pCGN2015。將pCGN2015的接物區域修飾，從而產生pCGN3686，其中含有下列限制消化位點，在lacZ接物區域中5'至3'PstⅠ、BglⅡ、XhoⅠ、HincⅡ、SalⅠ、HindⅢ、EcoRⅤ、EcoRⅠ、PstⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ和SacⅠ。
將XhoⅠ接物插入在pCGN7582的XbaⅠ位點處。將含有還原酶基因的BglⅡ-XhoⅠ分離且克隆到經過BglⅡ-XhoⅠ消化的pCGN3223中。將所得到的質粒(它缺少從希蒙德木基因中得到5』未轉譯的前導序列)表示為pCGN7802。將從pCGN7802中得到的napin/還原酶片段用HindⅢ切斷，且克隆到用HindⅢ消化的pCGN1578中，從而得到pCGN7589。
將pCGN7886和pCGN7589轉化到土壤桿菌細胞，如菌株EHA101中(Hood等人，J.Bacteriol(1986)1681291-1301)，其方法採用是的Holsters等人的方法(Mol.Gen.Genet(1978)163181-187)，且如下所述將其用於植物轉化過程中。
實例9-植物轉化方法在本例中發展了多種方法，用於將所要的DNA序列插入到植物宿主的基因組中，從而獲得該序列的轉錄或轉錄和轉譯，以使表型發生變化。
芸苔轉化將高芥子酸的種子，如載培品種Reston，或各種Canola類蔓菁，在95%乙醇中浸泡2分鐘，在含有一滴Tween20的次氯酸鈉的1.0%溶液中消毒其表面45分鐘，並且無菌的蒸餾水中漂洗3次。然後，把種子放置在Magenta盒子中，盒中放入1/10濃度的Murashige微型有機介質中(Gibco;GrandIsland，NY)，並用吡哆素(50μg/l)、煙酸(50μg/l)、甘氨酸(200μg/l)、和0.6%Phytagar(Gibco)pH5.8來補充。將種子在一個Percival室中於22℃下，用冷螢光和紅光(其強度約為65μ愛因斯坦每平方米每秒(μEm-2s-1))光照16小時，使其發芽。
從5-7天的種子中切下胚軸，將其切成約4mm長的碎片，裝入一個料盤上(Horsch等人，Sciene(1985)2271229-1231)。裝料盤在使用前一天準備好，此時在盤(100×25mm)上放進1.0ml的蕃茄懸浮培養液，其中含有約30ml MS鹽基(Carolina Biological，Burlington，NC)100mg/l肌醇、1.3mg/l維生素B1-HCl、具有3%蔗糖的280mg KH2PO4、2、4-D(1.0mg/l)，0.6%W/V Phytagar、並在高壓消毒之前把pH調至5.8(MS 0/1/0介質)。在使用前把無菌過濾紙盤(3mm)放置在邊料層的頂部。通過轉移10ml培養液進入100ml新鮮MS介質中，將蕃茄懸浮培養液再培養一周，此時如對裝料盤所述的那樣(帶有2.4-D(0.2mg/l)、Kinetin(0.1mg/l))。在沒有使用裝料器單元的實驗中，將胚軸外植體切下且放置在MS 0/1/0介質的頂部上的過濾紙盤上。將所有的胚軸外植體在裝料盤上預培育24小時，培養溫度為22℃，連續光照強度為30μEm-2s-1至65μEM-2s-1。
將A.tumefaciens株EHA101的單個菌落(其中含有帶有所需基因結構的雙重質粒)轉移至5ml MG/L肉湯中並在30℃生長一整液。將胚軸外植體浸在7-12ml MG/L肉湯(其中含有稀釋至1×108細菌/ml濃度的細菌)且在10-25分鐘之後將其放置在裝料盤上。每升MG/L肉湯含有5g甘露糖醇、1gL-穀氨酸或1.15g穀氨酸鈉、0.25g KH2PO4、0.10g NaCl、0.10g、MGSO4·7H2O、1mg維生素H、5g胰化腖、和2.5酵母抽提物，將該肉湯調節至pH7.0。在與土壤桿菌共同培養48小時之後，將胚軸外植體轉移至B50/1/0胼胝培養介質上，其中含有過濾夾菌的羧苄青黴素(500mg/l，在高壓消毒之後加入)和卡那黴素硫酸鹽(BuehringerMaunheim;Indianapolis，IN)其濃度為25mg/l。
在培養液中65μEM-2S-1連續光下經過3-7天之後，胼胝組織在切割表面上肉眼可見，且將胚軸外植體轉移至發芽誘導介質B5BZ上(B5鹽和補充的維生素，其中有3mg/l苄基氨基嘌呤、1mg/l玉米素、1%蔗糖、0.6%Phytagar，並將pH調節5.8)。該介質中還含有羧苄青黴素(50mg/l)和卡那黴素硫酸鹽(25mg/l)。將胚軸外植體在新鮮的苗誘導介質上每兩個星期重新培養。
一至三個月以後從胚軸胼胝組織中新苗重新長出。將至少1cm綠苗從胼胝中切下來，且放置在介質中，其中該介質含有B5鹽和維生素、1%蔗糖、羧苄青黴素(300mg/l)、卡那黴素硫酸鹽(50mg/l)和0.6%W/VPhytagar)。在2-4星期之後，將保持綠色的苗從根部上切下來，且轉移至Magenta盒中，該盒中含有根部誘導介質(B5鹽和維生素、1%蔗糖、2mg/l吲哚基丁酸、50mg/l)卡那黴素硫酸鹽和0.6%Phytagar)。對綠色的帶根苗進行硫酯酶活性測試。
Arabidposis轉化轉基因的擬南芥植物可通過以土壤桿菌為介質的轉化過程來獲得，如由Valverkens等人所述的那樣(Proc.NatAcad.Sci(1988)855536-5540)。將組構轉化到土壤桿菌細胞，如株EHA101(Hood等人，J.Bacteriol(1986)1681291-1301)中，其中用的是Holsters等人的方法(Mol.Gen.Genet.(1978)163181-187)。
花生轉化將所要的DNA序列以表達盒形式通過粒子轟擊而導入植物基因組中，該表達盒包括至少一種啟動子區域、一個所需的基因、和一個終止區域。
簡單地說，在鎢和金粒子(其粒度範圍在0.5mM-3mM之間)上塗覆一種表達盒的DNA。這種DNA可以是一種水溶液的形式或一種幹的DNA/粒子沉澱物。
用作轟擊靶的組織可以來自豬耳草外植體、苗分生組織、未成熟的葉或花葯。用Biolistics粒子槍對塗覆DNA的粒子的組織進行轟擊(Dupont;Wilmington，DE)。將粒子放進槍筒中，其距離範圍是從槍筒口至粒子1cm-14cm不等。將待轟擊的組織放在停止板下，試驗是在距離不超過20cm的組織上進行的。在發射的時候，組織通過尼龍網或網孔在10mM至30mM範圍內的尼龍的結合來進行防護。
轟擊之後，將植物按照Atreya等人的方法(PlantScienceLetter(1984)34379-383)重新生長。簡單地說，將胚胎軸組織或子葉片段放置在MS介質上(Murashige和Skoog，Physio.Plant(1962)15473)(MS加2.0mg/16-苄基腺嘌呤用於子葉片段)且將其在黑暗中在25±2℃條件下培養1周，然後將其轉移到連續地冷螢光(6.8W/m2)下。在培養的第10天，將該植物轉移至含有無菌土的盆中，在陰暗處保持3-5天，最後移至暖房。假定的轉基因苗生根固定。把外源DNA整合到植物基因組中可通過多種本領域技術人員已知的方法來確定。
實例10-對用於蠟製備的轉化的植物進行分析對粗轉化植物的種子和其它植物材料進行蠟合酶活性分析，其中使用在實例1中所述的蠟合酶測試方法。
對既有還原酶又有蠟合酶結構的植物也進行檢測以測量蠟製備過程。這類植物可通過如上所述土壤桿菌轉化方法來製備。具有兩種所需基因結構的植物可通過與還原酶和蠟合酶結構共同轉化，或通過將蠟合酶和還原酶結構結合在單個植物轉化雙重載體上而製備。另外，用編碼其他所需基因序列的結構來再次轉化蠟合酶表達植物或還原酶表達植物的過程也可以用來提供這類還原酶和蠟合酶表達植物。另一方面，還可以將通過本文所述的方法產生的表達還原酶的轉基因植物與已經同樣地產生的表達蠟合酶的植物進行雜交。以這種方式，可以將已知的植物繁育方法用於產生表達還原酶和蠟合酶的轉基因植物。
對這些植物是否存在蠟酯進行測試，例如通過從蠟酯中分離TAG，就象由Tani等人(上文)所述的那樣。GC分析方法可以用於進一步分析所得的蠟，例如就象由Pina等人(Lipids(1987)22(5)358-361)所述的那樣。
以上結果證明能夠獲得部分純化的蠟合酶蛋白質，它在由脂肪醇和脂肪醯基酶底物中形成蠟酯的過程中是活性的。本文提供了獲得蠟合酶蛋白質和其胺基酸序列的方法。另外，還提供了從胺基酸序列獲得的蠟合酶核酸序列。可以將這些核酸序列進行處理以使該序列發生轉錄和/或在宿主細胞中表達蠟合酶蛋白質，這些蛋白質可用於各種應用中。這些應用包括當蠟合酶在具有脂肪醇底物的宿主細胞中使用時製備蠟酯化合物，所述的底物對該宿主細胞有活性，或者它是通過使用重組結構而提供的，其中該結構編碼一種脂肪醯基還原酶蛋白質的，該蛋白質在由脂肪醯基底物形成醇的過程中是有活性的。
在本說明書中引用的所有出版物和專利申請在此列為參考文獻，就象每一份出版物或專利申請物均特別和單獨地表明了是作為參考文獻的那樣。
雖然出於清晰和明了的目的，上面通過說明書和實施例的方式已詳細地描述了本發明，但是不超出本發明精神和權利要求書範圍的一些變化和修改在本發明的指導下是很容易由本領域技術人員作出的。
權利要求
1.一種重組DNA結構，該結構包含一種核酸序列，該序列編碼至少一部分蠟合酶蛋白，以及一種異源的DNA序列，該序列與所說的蠟合酶編碼序列無天然聯繫。
2.按照權利要求1的結構，其中所說的蠟合酶對脂醯輔酶A底物具有活性。
3.按照權利要求1的結構，其中所說的蠟合酶對具有式C2X碳鏈的脂肪醇底物具有活性，其中X選自6-12。
4.按照權利要求1的結構，其中所說的蠟合酶對具有式C2X碳鏈的脂肪醇底物具有活性，其中X選自6-12。
5.按照權利要求1的結構，其中所說的蠟合酶編碼序列來源於一種種子植物。
6.按照權利要求1的結構，其中所說的蠟合酶編碼序列來源於希蒙德木屬。
7.按照權利要求1的結構，它還含有一種啟動子，該啟動子至少在宿主細胞中能使所說的蠟合酶編碼序列發生轉錄。
8.按照權利要求7的結構，其中所說的啟動子在植物細胞中使所說的蠟合酶編碼序列發生表達。
9.按照權利要求8的結構，其中所說的植物細胞是植物胚芽種子細胞。
10.按照權利要求7的結構，其中所說的啟動子在細菌細胞中使所說的蠟合酶編碼序列發生表達。
11.按照權利要求8的結構，其中所說的啟動子來源於在植物種子胚芽細胞中優先表達的基因。
12.一種細胞，該細胞包含按照權利要求1的結構。
13.一種植物細胞，該植物細胞包含按照權利要求1的結構。
14.一種宿主細胞，該細胞包含一種重組結構，該結構包含編碼脂肪醯基還原酶蛋白的核酸序列;以及一種重組結構，該結構包含一種編碼蠟合酶蛋白的核酸序列，其中所說蠟合酶編碼序列對所說的宿主細胞來說是異源的，而且其中所說的還原酶和蠟合酶編碼序列處於在所說的宿主細胞中起作用的啟動子的調節控制下。
15.按照權利要求14的宿主細胞，其中所說的宿主細胞是植物細胞。
16.按照權利要求15的植物細胞，其中所說的植物細胞是芸苔屬植物細胞。
17.一種芸苔屬植物細胞，該細胞包含權利要求1所述的結構。
18.一種原核生物細胞，該細胞包含一種種子植物蠟合酶。
19.一種在宿主細胞中製備蠟合酶的方法，該方法包括以下步驟培養包含一種重組結構的宿主細胞，所說的結構包含編碼蠟合酶的核酸序列，其中所說的蠟合酶編碼序列處於在所說細胞中起作用的啟動子的調節控制下，所述的培養在可以引起所說的蠟合酶編碼序列發生表達的條件下進行。
20.按照權利要求19的方法，其中所說的宿主細胞是一種原核生物。
21.按照權利要求19的方法，其中所說的宿主細胞是種子植物胚芽細胞。
22.按照權利要求21的方法，其中所說的種子植物是芸苔屬。
23.按照權利要求19的方法，其中所說的蠟合酶編碼序列來源於一種種子植物。
24.一種在宿主細胞中製備蠟酯的方法，該方法包括以下步驟培養包含一種重組結構的宿主細胞，所說的結構包含一種編碼蠟合酶的核酸序列，其中所說的蠟合酶編碼序列處於在所說的宿主細胞中起作用的調節部分的控制，所述的培養在可以引起所說的蠟合酶編碼序列發生表達的條件下進行。
25.按照權利要求24的方法，其中所說的蠟合酶的脂肪醇底物是在所說的宿主細胞中產生的，它是來自異源重組結構的脂肪醯基還原酶編碼序列表達的結果。
26.按照權利要求24或25的方法，其中所說的宿主細胞是一種植物細胞。
27.按照權利要求26的方法，其中所說的植物細胞是種子植物胚芽細胞。
28.按照權利要求27的方法，其中所說的植物是芸苔屬。
29.一種宿主細胞，該細胞包含按照權利要求24或25所述方法製成的蠟酯。
30.按照權利要求29的宿主細胞，其中所說的宿主細胞是一種植物細胞。
31.按照權利要求30的宿主細胞，其中所說的植物細胞是芸苔屬種子胚芽細胞。
32.一種芸苔屬種子細胞，其中所說的種子細胞的內脂儲備物包含蠟酯。
33.按照權利要求32的芸苔屬種子細胞，其中所說的蠟酯是長鏈蠟酯。
全文摘要
本發明提供了一種部分純化的脂醯輔酶A脂肪醇醯基轉移酶(蠟合酶)，其中所說的蛋白在由脂肪醇和脂肪醯基底物形成蠟酯的過程中具有活性。其中的一個特例是表觀分子量約為57KD的希蒙德木屬胚芽蠟合酶。本發明涉及到可以從蠟合酶蛋白獲得的胺基酸和核酸序列，並且利用這些序列產生能生產蠟酯的轉基因宿主細胞。
文檔編號C12N5/00GK1078492SQ9211482
公開日1993年11月17日 申請日期1992年11月20日 優先權日1991年11月20日
發明者J·G·美茨, K·D·拉迪扎巴爾, M·W·拉思乃 申請人:卡爾金公司