生產胺基酸的微生物以及胺基酸的生產方法

2023-05-13 20:06:36 2

專利名稱：生產胺基酸的微生物以及胺基酸的生產方法
技術領域：
本發明涉及生產L-胺基酸的微生物以及L-胺基酸的生產方法。L-賴氨酸、L-蘇 氨酸和L-色氨酸被廣泛地作為飼料添加劑等使用。此外，L-苯丙氨酸被作為甜味劑原料 使用。L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸可用於胺基酸輸液、滋補品。此外，L-絲氨酸可 以用作食品添加劑、化妝品的原料等。
背景技術：
為了通過使用微生物的發酵法生產L-胺基酸等目的物質，可以採用使用野生型 微生物(野生株)的方法、使用從野生株衍生的營養缺陷型株的方法、使用從野生株作為各 種藥物抗性突變株衍生的代謝調節突變株的方法、使用兼具營養缺陷型株和代謝調節突變 株二者的性質的菌株的方法等。近年來，在目的物質的發酵生產中採用了重組DNA技術。例如，人們通過增強L-氨 基酸生物合成體系酶編碼基因或涉及L-胺基酸的分泌或抗性的蛋白質的編碼基因的表 達、或者增強L-胺基酸生物合成體系的碳源流入來提高微生物的L-胺基酸生產性能。作為如上所述技術，例如，就L-賴氨酸而言，已知可以增強二氫吡啶二羧酸合酶、 天冬氨酸激酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫氫酶等酶的 編碼基因的表達(專利文獻1)，降低高絲氨酸脫氫酶、賴氨酸脫羧酶(專利文獻2)和蘋果 酸酶(malic enzyme)(專利文獻3)的活性等。就L-蘇氨酸而言，作為賦予L-蘇氨酸和/或L-高絲氨酸抗性的基因，可以列舉 下列rhtA基因(專利文獻4)、rhtB基因(專利文獻5)、rhtC基因(專利文獻6)、yfiK、 yeaS基因(專利文獻7)。此外，還包括增強編碼天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、高絲 氨酸激酶、蘇氨酸合酶、以及天冬氨酸氨基轉移酶(天冬氨酸轉氨酶)的基因的表達(專利 文獻8)，降低蘇氨酸脫氫酶的活性(專利文獻9)等。就L-色氨酸而言，已知有解除磷酸甘油酸脫氫酶、鄰氨基苯甲酸合酶的反饋抑制 (專利文獻10)，缺損色氨酸酶(專利文獻11)等。就L-苯丙氨酸而言，已知有解除分支酸變位酶_預苯酸脫水酶的反饋抑制(專利 文獻12)，以及缺損分支酸變位酶_預苯酸脫氫酶以及酪氨酸阻遏物(專利文獻13)等。就L-纈氨酸而言，已知有生長需要核酸和/或缺失H+-ATP酶的突變株(專利文獻 14)等；對於L-亮氨酸，已知有解除異丙基蘋果酸合酶的反饋抑制(專利文獻15)等；對於 L-異亮氨酸，已知有強化編碼蘇氨酸脫氨酶、乙醯羥酸合酶的基因等的表達(專利文獻16)寸。就L-絲氨酸而言，已知有攜帶降低了由絲氨酸導致的反饋抑制的3-磷酸甘油酸 脫氫酶的菌株(專利文獻17)，具有L-絲氨酸生產能力且增強了磷酸絲氨酸磷酸酶活性或 磷酸絲氨酸轉氨酶活性中的至少一種的細菌，缺失L-絲氨酸分解能力的細菌(專利文獻 18)，以及具有偶氮絲氨酸或β - (2-噻吩基)-DL-丙氨酸抗性且具有L-絲氨酸生產能力的 細菌(專利文獻19)等。
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專利文獻1美國專利第6，040, 160號專利文獻2美國專利第5，827，698號專利文獻3W02005/010175專利文獻4美國專利第6，303，348號專利文獻5歐洲專利申請公開第0994190號專利文獻6歐洲專利申請公開第1013765號專利文獻7歐洲專利申請公開第1016710號專利文獻8W02006/123專利文獻9美國專利第7，179，623號專利文獻10美國專利第6，180，373號專利文獻11美國專利第4，371，614號專利文獻12美國專利第5，354，672號專利文獻13W003/04419專利文獻14美國專利第5，888，783號專利文獻15美國專利第6，403，342號專利文獻16美國專利第5，998，178號專利文獻17美國專利第5，618，716號專利文獻18美國專利第6，037，154號專利文獻19美國專利第6，258，573號

發明內容
發明所要解決的問題本發明的課題是提供能夠高效生產L-胺基酸的菌株，以及提供使用該菌株高效 生產L-胺基酸的方法。解決問題的手段傳統的L-胺基酸生產主要是以糖類作為碳源，利用丙酮酸脫氫酶為TCA循環提供 乙醯CoA來實現的。但是，丙酮酸脫氫酶的反應伴有脫碳酸，必然要釋放1分子的C02。因此， 本發明人等認為，為了進一步提高生產力，必須要減少這種脫碳酸。於是，本發明人等為解 決上述課題進行了深入研究，結果發現以乙醇、脂肪酸等能提供乙醯CoA的物質為碳源， 通過提高催化碳酸固定反應的酶一丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的酶活性，進 一步通過增強鐵氧還蛋白-NADP+還原酶的活性(該酶具有分別從氧化型鐵氧還蛋白或氧 化型黃素氧還蛋白生成對丙酮酸合酶的酶活性而言必要的還原型鐵氧還蛋白或還原型黃 素氧還蛋白的活性)、或者通過提高鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白產生能力，能夠提高L-氨 基酸的生產力，從而完成了本發明。S卩，本發明如下述。(1). 一種微生物，其具有生產選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、 L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸中的L-胺基酸的能力，且經過修飾而增強 了丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性。(2).上述的微生物，其經過修飾而增強了丙酮酸合酶的活性。
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(3).上述的微生物，其經過修飾而增強了丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性。(4).上述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性是通過 增加編碼丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因的表達量和/或增加所述基因的 翻譯量而增強的。(5).上述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性是通過 提高編碼丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因的拷貝數或修飾所述基因的表達 調節序列而增強的。(6).上述的微生物，其中，所述編碼丙酮酸合酶的基因編碼下述㈧ ⑶中任一 項所示的多肽，或下述(E)、(F)、(G)和(H)的多肽，或下述(E)、(F)、(G)、(H)、(I)和(J) 的多肽(A)包含SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列的多肽；(B)包含在SEQ ID NO 2中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的氨 基酸序列，並且具有丙酮酸合酶活性的多肽；(C)包含SEQ ID NO 4所示的胺基酸序列的多肽；(D)包含在SEQ ID NO 4中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的氨 基酸序列，並且具有丙酮酸合酶活性的多肽；(E)下述(El)或(E2)的多肽(El)包含SEQ ID NO 57所示的胺基酸序列的多肽；(E2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的 胺基酸序列，並且能夠與至少(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 質複合體的多肽；(F)下述(Fl)或(F2)的多肽(Fl)包含SEQ ID NO 57所示的胺基酸序列的多肽；(F2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的 胺基酸序列，並且能夠與至少(E)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 質複合體的多肽；(G)下述(Gl)或(G2)的多肽(Gl)包含SEQ ID NO 57所示的胺基酸序列的多肽；(G2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的 胺基酸序列，並且能夠與至少(E)、(F)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 質複合體的多肽；(H)下述(Hl)或(H2)的多肽(Hl)包含SEQ ID NO 57所示的胺基酸序列的多肽；(H2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的 胺基酸序列，並且能夠與至少(E)、(F)和(G)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 質複合體的多肽；(I)下述(Il)或(12)的多肽(Hl)包含SEQ ID NO 65所示的胺基酸序列的多肽；(H2)包含在SEQ ID NO 65中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的
7胺基酸序列，並且能夠與至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的 蛋白質複合體的多肽；(J)下述(Jl)或(J2)的多肽(Jl)包含SEQ ID NO 67所示的胺基酸序列的多肽；(J2)包含在SEQ ID NO 67中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的 胺基酸序列，並且能夠與至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的 蛋白質複合體的多肽。(7).上述的微生物，其中，所述編碼丙酮酸合酶的基因包含下述(a) (d)中任 一項的 DNA，或下述(e)、(f)、(g)和(h)的 DNA，或下述(e)、(f)、(g)、(h)、⑴和(j)的 DNA (a)具有SEQ ID NO 1所示的鹼基序列的DNA ；(b)與SEQ ID NO :1所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的探 針在嚴格條件下雜交，並且編碼具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA ；(c)具有SEQ ID NO 3所示的鹼基序列的DNA ；(d)與SEQ ID NO 3所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的探 針在嚴格條件下雜交，並且編碼具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA ；(e)下述(el)或(e2)的 DNA (el)具有SEQ ID NO 56所示的鹼基序列的DNA ；(e2)與SEQ ID NO 56所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的 探針在嚴格條件下雜交，並且能夠與至少(f)、(g)、以及(h)所示的DNA—起編碼具有丙酮 酸合酶活性的蛋白質複合體的DNA ；(f)下述(f 1)或(f2)的 DNA (fl)具有SEQ ID NO 58所示的鹼基序列的DNA ；(f2)與SEQ ID NO 58所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的 探針在嚴格條件下雜交，並且能夠與至少(e)、(g)、以及(h)所示的DNA—起編碼具有丙酮 酸合酶活性的蛋白質複合體的DNA ；(g)下述(gl)或(g2)的 DNA (gl)具有SEQ ID NO 60所示的鹼基序列的DNA、(g2)與SEQ ID NO 60所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的 探針在嚴格條件下雜交，並且能夠與至少(e)、(f)、以及(h)所示的DNA—起編碼具有丙酮 酸合酶活性的蛋白質複合體的DNA ；(h)下述(hi)或(h2)的 DNA (hi)具有SEQ ID NO 62所示的鹼基序列的DNA、(h2)與SEQ ID NO 62所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的 探針在嚴格條件下雜交，並且能夠與至少(e)、(f)、以及(g)所示的DNA—起編碼具有丙酮 酸合酶活性的蛋白質複合體的DNA ；⑴下述(il)或(i2)的DNA (hi)具有SEQ ID NO 64所示的鹼基序列的DNA ；(h2)與SEQ ID NO :64所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的
8探針在嚴格條件下雜交，並且能夠與至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA —起編碼具有丙 酮酸合酶活性的蛋白質複合體的DNA ；(j)下述(jl)或(j2)的 DNA (jl)具有SEQ ID NO 66所示的鹼基序列的DNA ；(j2)與SEQ ID NO 66所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的 探針在嚴格條件下雜交，並且能夠與至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA —起編碼具有丙 酮酸合酶活性的蛋白質複合體的DNA。(8).上述的微生物，其中，編碼丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因編碼下述(A)或 ⑶所示的多肽(A)包含SEQ ID NO 6所示的胺基酸序列的多肽；(B)包含在SEQ ID NO 6中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的氨
基酸序列，並且具有丙酮酸NADP+氧化還原酶活性的多肽。(9).上述的微生物，其中，編碼丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因包含下述(a)或 (b)的 DNA (a)具有SEQ ID NO 5所示的鹼基序列的DNA ；(b)與SEQ ID NO 5所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的探 針在嚴格條件下雜交，並且編碼具有丙酮酸NADP+氧化還原酶活性的多肽的DNA。(10).上述的微生物，其經過修飾而增強了鐵氧還蛋白-NADP+還原酶的活性。(11).上述的微生物，其經過修飾而提高了產生鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的能 力。(12).上述的微生物，其經過修飾而降低了蘋果酸酶的活性。(13).上述的微生物，其經過修飾而降低了丙酮酸脫氫酶活性。(14).上述的微生物，其經過修飾從而能夠以需氧方式同化乙醇。(15).上述的微生物，其中，所述微生物是屬於選自埃希氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌 屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬中的屬的細菌。(16).上述的微生物，其中，該微生物的NAD型蘋果酸酶和NADP型蘋果酸酶二者的 活性均已降低。(17).上述的微生物，其中，所述微生物為棒狀桿菌型細菌。(18). 一種生產L-胺基酸的方法，其中，在培養基中培養上述的微生物，使該培養 基中或菌體內生成並蓄積選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、 L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸中的L-胺基酸，並從該培養基或菌體收集L-胺基酸。(19).上述的方法，其中，所述培養基的特徵在於含有乙醇或脂肪酸作為碳源。


[圖1]顯示源自纖細裸藻(Euglenagracilis)的丙酮酸NADP+氧化還原酶 (PNO)基因的表達的Western印跡照片。泳道1 分子量標記，泳道2 :WC196 Δ cadA Δ IdcC/ pCABD2/pMW-Pthr 的粗酶抽提液，泳道 3 :WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2/pMW-Pthr-PN0 的粗 酶抽提液發明的具體實施方式
以下，對本發明進行具體說明。本發明的微生物本發明的微生物是具有生產選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、 L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、以及L-絲氨酸中的L-胺基酸的能力，且經過了修飾而 增強了丙酮酸合酶或丙酮酸=NADP+氧化還原酶的活性的微生物。在本發明中，如無特殊說明，"L-胺基酸」是指所述的L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色 氨酸、L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、和/或L-絲氨酸。「L-胺基酸生產能力」是指當在培養基中培養本發明的微生物時，以可從細胞或培 養基中回收的程度在細胞或培養基中生成、蓄積L-胺基酸的能力。本發明的微生物所生產 的L-胺基酸可以是1種胺基酸，也可以是2種或2種以上的L-胺基酸。作為具備L-氨基 酸生產能力的微生物，可以是本身具備L-胺基酸生產能力的微生物，也可以是通過利用突 變法或重組DNA技術對如下文所述的微生物進行修飾而具備了 L-胺基酸生產能力的微生 物，或者可以是通過導入本發明的基因而被賦予了 L-胺基酸生產能力的微生物。此外，「增強丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性」包括如下兩方面含 義在本身具有丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的微生物中，增強所述兩種酶中的 至少一種的活性；以及，對於賦予不具有丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的微生物， 賦予其所述兩種酶中的至少一種酶的活性。L-胺基酸生產能力的賦予本發明的微生物可以通過以具有L-胺基酸生產能力的微生物作為親本株，對其 進行修飾以增強丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶或這兩者的活性來獲得。本發明 的微生物還可以通過以經過了修飾使得丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性增 強的微生物作為親本株，並對其賦予或增強L-胺基酸生產能力來獲得。以下，示例說明對微生物賦予L-胺基酸生產能力的方法以及能夠在本發明中使 用的被賦予了 L-胺基酸生產能力的微生物。但是，微生物只要具有L-胺基酸生產能力，並 不限於此。作為用於本發明的微生物，可以列舉例如，屬於埃希氏菌屬(Escherichia)、 腸桿菌屬(Enterobacter)、泛菌屬(Pantoea)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙雷氏 菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、摩根氏菌屬 (Morganella)等Y -變形細菌的腸桿菌科細菌，屬於短桿菌屬(Brevibacterium)、棒杆 菌屬(Corynebacterium) ^WtfMM (Microbacterium)的所謂棒狀桿菌型(coryneform) 細菌，屬於脂環酸桿菌屬(Alicyclobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、酵母屬 (Saccharomyces)等的微生物。Y -變形細菌可以使用依據NCBI (National Center for Biotechnology Information)分類學資料庫 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Taxonomy/ Browser/wwwtax. cgi · id = 91347)公布的分類法歸屬的微生物。作為埃希氏菌屬細菌，可以列舉大腸桿菌(Escherichia coli)等。在採用基因工 程方法選育大腸桿菌時，可以使用大腸桿菌K-12株及其衍生物大腸桿菌MG1655株(ATCC 47076)和W3110株(ATCC 27325)。大腸桿菌K-12株是在1922年由史丹福大學分離出來 的，它是λ噬菌體的溶原菌，具有F因子，是一種能夠通過接合等手段來構建遺傳重組體 的、通用性高的菌株。此外，大腸桿菌Κ-12株的基因組序列已經測定，其基因信息也可以自
10由地使用。大腸桿菌K-12株及其衍生株可以從例如美國典型培養物保藏中心(ATCC)零售 獲得(住所ATCC，地址P. O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States of America)。特別是，泛菌屬細菌、歐文氏菌屬細菌和腸桿菌屬細菌是分類為Y-變形細 菌(γ -Proteobacteria)的細菌，它們在分類學上的親緣關係非常近(J. Gen. Appl. Microbiol. 1997,43 :355_361 ；Int. J. Syst. Bacteriol. 1997,47 :1061_1067)。近年來， 依據DNA-DNA雜交實驗等，屬於腸桿菌屬的細菌中，有些被重新分類為成團泛菌(Pantoea agglomerans)或分散泛菌(Pantoeadispersa)等(Int.J. Syst. Bacteriol. 1989, 39 337-345)。此外，屬於歐文氏菌屬的細菌中，有些被重新分類為菠蘿泛菌(Pantoea ananas)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)(參照 Int.J. Syst. Bacteriol. 1993,43 162-173)。腸桿菌屬細菌包括例如成團腸桿菌(Enterobacter agglomerans)和產氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes)等。具體地，可以使用歐洲專利申請公開952221號說明書示例 的菌株。作為腸桿菌屬的代表性菌株，可以列舉成團腸桿菌ATCC12287株。作為泛菌屬細菌的代表性菌株，可以列舉Pantoea ananatis、斯氏泛菌、成團泛 菌、檸檬泛菌(Pantoea citrea)。具體地，可以列舉下述菌株。Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)(歐洲專利申請公開0952221 號說 明書)Pantoea ananatis AJ13356株(FERM BP-6615)(歐洲專利申請公開0952221 號說 明書)而且，所述菌株在歐洲專利申請公開0952221號說明書中記載為成團腸桿菌，但 現在，如上文所述，依據16S rRNA鹼基序列分析它們已被重新分類為Pantoea ananatis。作為歐文氏菌屬細菌，可以列舉解澱粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)、胡蘿蔔 軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)；作為克雷伯氏菌屬細菌，可以列舉植生克雷伯氏菌 (Klebsiella planticola)。具體地，可以列舉下述菌株。解澱粉歐文氏菌ATCC15580株胡蘿蔔軟腐歐文氏菌ATCC15713株植生克雷伯氏菌AJ13399株(FERM BP-6600)(歐洲專利申請公開955368號說明 書)植生克雷伯氏菌AJ13410株(FERM BP-6617)(歐洲專利申請公開955368號說明 書)本發明所稱的棒狀桿菌型細菌包括這樣的微生物，它們是在《Bergey』 sManual of Determinative Bacteriology》第8版599頁(1974)中定義的一組微生物，包括為需氧性、 革蘭氏陽性、非耐酸性、無芽孢形成能力的桿菌，曾經歸類於短桿菌屬(Brevibacterium) 但現在已經統一歸類於棒桿菌屬(Corynebacterium)的那些細菌(Liebl，W. et al. 1991， Int. J. Syst. Bacteriol. 41 :255_260)，還包括與棒桿菌屬極其近緣的短桿菌屬細菌和微杆 菌屬細菌。作為適於在L-穀氨酸類胺基酸的生產中應用的棒狀桿菌型細菌，可以列舉例如 以下所示的菌株。口譽乙酉先乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)0128]醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
0129]g醇棒桿菌(Corynebacterium alkanolyticum)
0130]^^llfiif (Corynebacterium callunae)
0131]穀氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)
0132]百合花棒桿菌(Corynebacterium lilium)
0133]棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)
0134]嗜熱 產氨棒 桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes) Corynebacteriumefficiens)
0135]力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)
0136]二歧短桿菌(Brevibacterium divaricatum)(谷M基酸棒杆lif (Corynebacterium glutamicum))
0137]H fe ^S ff Ir (Brevibacterium flavum) ( # M Sl # ff ^ Corynebacteriumglutamicum))
0138]Brevibacterium immariophilum
0139]乳發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)(穀氨基酸棒桿菌 Corynebacterium glutamicum))
0140]玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)
0141]角軍H短桿菌(Brevibacterium saccharoIyticum)
0142]生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)
0143]產氛短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)(產氛棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes))
0144]白fe棒桿菌(Brevibacterium album)
0145]賭狀短桿菌(Brevibacterium cerinum)
0146]^mMMMM (Microbacterium ammoniaphilum)
0147]具體地，可以列舉諸如下述的菌株。
0148]嗜熱產氨棒桿菌AJ12340(FERM BP-1539)
0149]穀氨酸棒桿菌ATCC13032
0150]黃色短桿菌(穀氨酸棒桿菌)ATCC13826、ATCC14067
0151]乳發酵短桿菌(穀氨酸棒桿菌)ATCC13665、ATCC13869
0152]產氨短桿菌(產氨棒桿菌)ATCC6871
0153]用於本發明的細菌可以是具有乙醇同化性的細菌。作為這樣的細菌，可以是本來 具有乙醇同化性的細菌，也可以是被賦予了乙醇同化性的重組菌株，還可以是提高了乙醇 同化性的突變菌株。在大腸桿菌中，作為在厭氧條件下生成乙醇的酶，已知有可逆地催化以 下反應的具有乙醛脫氫酶和醇脫氫酶活性的AdhE的存在。乙醯-CoA+NADH+H+ —乙醛 +NAD++CoA乙醛 +NADH+H+ —乙醇 +NAD+大腸桿菌在需氧條件下不能同化乙醇，但已知其通過AdhE的突變，可變得能夠以 需氧方式同化乙醇(Clark D. P.，and Cronan, J. Ε. Jr. 1980. J. Bacteriol. 144 :179-184 ； MembrilΙο-Hernandez, J. et al. 2000. J. Biol. Chem. 275 =33869-33875)。作為這樣的具有
12突變的AdhE突變體，具體地有大腸桿菌AdhE的第568位的穀氨酸殘基被穀氨酸和天冬氨 酸以外的胺基酸殘基、例如賴氨酸取代而得到的突變體(Glu568Lys、E568K)。而且，所述AdhE突變體還可以包含以下的附加突變。A)第560位的穀氨酸殘基被其它胺基酸殘基、例如賴氨酸殘基所取代；B)第566位的苯丙氨酸殘基被其它胺基酸殘基、例如纈氨酸殘基所取代；C)第22位的穀氨酸殘基、第236位的甲硫氨酸殘基、第461位的酪氨酸殘基、第 554位的異亮氨酸殘基以及第786位的丙氨酸殘基被其它胺基酸殘基、例如分別被甘氨酸 殘基、纈氨酸殘基、半胱氨酸殘基、絲氨酸殘基以及纈氨酸殘基所取代；或D)上述突變的組合。已知穀氨酸棒桿菌具有多種醇脫氫酶，能夠以需氧方式同化乙醇(Pelechova， J. et al. 1980. Folia Microbiol (Praha) 25 :341_346)。用於本發明的細菌還可以是具有油脂或脂肪酸同化性的細菌。這樣的細菌可 以是本來就具有油脂或脂肪酸同化性的細菌，也可以是賦予了油脂或脂肪酸同化性的 重組菌株，還可以是提高了油脂或脂肪酸同化性的突變菌株。已知在大腸桿菌中能夠 同化鏈長 12 以上的長鏈脂肪酸(Clark，D. P. and Cronan, J. Ε. 1996. In Escherichia coli and Salmonella :Cellular andMolecular Biology/Second Edition(Neidhardt, F. C. Ed.) pp. 343-357)。而且，已知能夠利用中鏈、短鏈脂肪酸的大腸桿菌突變株(Nunn, W. D. et al. 1979. J. Biol. Chem. 254 :9130_9134 ；Salanitro, J. P. and Wegener, W. S. 1971. J.Bacteriol. 108 :885_892)。在本發明中，具有L-胺基酸生產能力的細菌是指具有下述能力細菌當在培養基 中進行培養時，能夠生產L-胺基酸、並能夠使L-胺基酸在培養基中蓄積到可從培養基回收 的程度。優選能夠使目的L-胺基酸以優選0. 5g/L以上、更優選1. 0g/L以上的量在培養基 中蓄積的細菌。L-胺基酸包括L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、 L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸。特別是，優選L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-色 氨酸。以下，說明對如上所述的細菌賦予L-胺基酸生產能力的方法，或增強如上所述的 細菌的L-胺基酸生產能力的方法。為了賦予L-胺基酸生產能力，可以使用在棒狀桿菌型細菌或埃希氏菌屬細菌等 胺基酸生產菌的選育中沿用至今的方法，如獲取營養缺陷突變株、L-胺基酸類似物抗性菌 株或代謝調節突變菌株，創建L-胺基酸生物合成系統酶表達增強的重組菌株等等(參見 《7 S 7酸発酵》，(株)學會出版中心，1986年5月30日第一版發行，第77-100頁)。這 裡，在L-胺基酸生產菌的選育中，被賦予的營養缺陷性、類似物抗性或代謝調節突變等性 質可以是單獨一種，也可以是兩種或者三種以上。此外，表達增強的L-胺基酸生物合成系 統酶可以是單獨一種，也可以是兩種或三種以上。另外，營養缺陷突變、類似物抗性或代謝 調節突變等性質的賦予與生物合成系統酶的增強可以組合進行。具有L-胺基酸生產能力的營養缺陷突變體菌株、類似物抗性菌株或代謝調節突 變菌株可如下地獲得對親本菌株或野生型菌株施以常規突變處理，即χ-射線或紫外線照 射或用誘變劑例如N-甲基-N』 -硝基-N-亞硝基胍等處理；其後，從所得的突變菌株中選 擇顯示營養缺陷性、類似物抗性或代謝調節突變並且還具有L-胺基酸生產能力的菌株。
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此外，可以通過進行基因重組增強酶活性，來賦予或增強L-胺基酸生產能力。就 酶活性的增強而言，包括例如通過修飾細菌以增強編碼與L-胺基酸的生物合成相關的基 因的表達的方法。增強基因的表達的方法可以通過下述方式實現導入通過將包含所述基 因的DNA片段導入合適的質粒(例如至少包含負責質粒在微生物內的複製增殖功能的基因 的質粒載體)而得到的擴增質粒；或者通過接合、基因轉移等使所述基因在染色體上多拷 貝化；抑或在這些基因的啟動子區域導入突變等(參考國際公開小冊子W095/34672號)。當向上文所述的擴增質粒或者染色體上導入目的基因時，用於表達所述基因的啟 動子可以是任何能夠在屬於腸桿菌科的細菌中發揮功能的啟動子，可以是所使用的基因自 身的啟動子，也可以是經過修飾的啟動子。也可以通過適當地選擇在L-胺基酸生產菌中強 力發揮功能的啟動子，或者通過使啟動子的-35、-10區域與共有序列接近，來進行基因表 達量的調節。如上所述的增強酶基因表達的方法，在W000/18935號小冊子、歐洲專利申請 公開1010755號說明書等中有記載。下面，對於給細菌賦予L-胺基酸生產能力的方法、以及被賦予了 L-胺基酸生產能 力的細菌進行示例。L-賴氨酸生產菌屬於埃希氏菌屬的L-賴氨酸生產菌的實例可以列舉出對L-賴氨酸類似物具有 抗性的突變株。L-賴氨酸類似物可抑制屬於埃希氏菌屬的細菌的生長，但是這種抑制在當 L-賴氨酸共存於培養基中時會被全部或部分解除。L-賴氨酸類似物的實例可以列舉出、但 不限於，氧代賴氨酸，賴氨酸氧肟酸(lysine hydroxamate), S_(2_氨乙基)_L_半胱氨酸 (AEC)，γ -甲基賴氨酸，α-氯代己內醯胺等。這些賴氨酸類似物具有抗性的突變株可以通 過對屬於埃希氏菌屬的細菌進行常規的人工誘變處理來得到。可用於L-賴氨酸生產的菌 株的具體實例可以列舉出大腸桿菌AJ11442(參考FERMBP-1543，NRRL B-12185 ；參見美國 專利第4，346，170號)和大腸桿菌VL611。在這些微生物中，L-賴氨酸對由天冬氨酸激酶 的反饋抑制已被解除。WC196株可以用作大腸桿菌的L-賴氨酸生產菌。該菌株是通過對大腸桿菌K_12 來源的W3110株賦予AEC抗性來選育獲得的。該菌株被命名為大腸桿菌AJ13069，於1994 年12月6日保藏在工業技術院生命工學工業技術研究所(現為獨立行政法人產業技術綜 合研究所專利生物保藏中心，〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第 6)，保藏號FERMP-14690，並於1995年9月29日轉為基於布達佩斯條約的國際保藏，保藏號 FERM ΒΡ-5252 (美國專利第 5，827，698 號)。作為L-賴氨酸生產菌或用於衍生L-賴氨酸生產菌的親本株，可以列舉出L-賴 氨酸生物合成系統酶的1種或者2種以上的活性被增強的菌株。相關的酶包括，但不限 於二氫吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(IysC)、二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB)、二 氨基庚二酸脫羧酶(IysA)、二氨基庚二酸脫氫酶(ddh)(美國專利第6，040, 160號)、磷酸 烯醇丙酮酸羧化酶(PPC)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspC)、天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)、二氨 基庚二酸差向異構酶(dapF)、四氫吡啶二羧酸琥珀醯酶(dapD) (tetrahydrodipicolinic acidsuccinylase)、琥拍酉先二氨基庚二酸脫酉先酶(dapE) (succinyl diamino pimelicacid deacylase)以及天冬氨酸酶基因(aspA) (EP 1253195A)。酶名稱後的括號內為基因名稱 (下同)。在這些酶中，特別優選為二氫吡啶二羧酸還原酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氨基庚二酸脫氫酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基轉移酶、二氨基庚二酸差向異構酶、 天冬氨酸半醛脫氫酶、四氫吡啶二羧酸琥珀醯酶、以及琥珀醯二氨基庚二酸脫醯酶。此外， 可以增強親本株中下述基因的表達水平與能量效率相關的基因(cyo) (EP 1170376A)、 編碼煙醯胺核苷酸轉氫酶的基因(PntAB)(美國專利第5，830，716號)、ybjE基因 (W02005/073390)、或所述基因的組合。作為L-賴氨酸生產菌或用於衍生L-胺基酸生產菌的親本株的例子，還可以列舉 催化通過從L-胺基酸生物合成途徑分支而生成L-賴氨酸以外的化合物的反應的酶的活性 減少或者缺損的菌株。作為催化通過從L-賴氨酸生物合成途徑分支而生成L-賴氨酸之 外的化合物的反應的酶的例子，可以列舉出高絲氨酸脫氫酶、賴氨酸脫羧酶(美國專利第 5，827，698 號)、和蘋果酸酶(W02005/010175)。作為優選的L-賴氨酸生產菌，可以列舉出大腸桿菌WC196 Amez/ pCABD2(W02005/010175)、WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2 (W02006/078039)等。WC196Amez/ PCABD2株是通過在WC196 Amez株中導入美國專利第6040160所述的質粒pCABD2而獲得的 菌株，所述WC196 Δ mez株是通過破壞WC196株的編碼蘋果酸酶的sfcA和b2463基因而制 作的。WC196Amez株的詳細情況在W02005/010175中有記載。sfcA基因和b2463基因的 鹼基序列、以及各基因編碼的胺基酸序列如SEQ ID N0:52 55所示。WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2株是通過在編碼賴氨酸脫羧酶的cadA以及IdcC基因 被破壞的WC196株中導入美國專利第6040160所述的質粒pCABD2而獲得的菌株。pCABD2 包含編碼具有解除了由L-賴氨酸導致的反饋抑制的突變的大腸桿菌來源二氫吡啶二羧 酸合成酶(DDPS)的突變型dapA基因、編碼具有解除了由L-賴氨酸導致的反饋抑制的突變 的大腸桿菌來源天冬氨酸激酶III的突變型IysC基因、編碼源自大腸桿菌的二氫吡啶二羧 酸還原酶的dapB基因、以及編碼源自乳發酵短桿菌的二氨基庚二酸脫氫酶的ddh基因。L-蘇氨酸生產菌作為具有L-蘇氨酸生產能力的微生物優選實例可以列舉出增強了 L-蘇氨酸生物 合成系統酶的1種或2種以上的活性的細菌。作為L-蘇氨酸生物合成系統酶，可以列舉出 天冬氨酸激酶III (IysC)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因(asd)、thr操縱子所編碼的天冬氨酸 激酶I基因(thrA)、高絲氨酸激酶基因(thrB)、蘇氨酸合酶(thrC)、天冬氨酸氨基轉移酶 (天冬氨酸轉氨酶)(aspC)。括號裡為該基因的簡寫符號(下同)。這些酶中特別優選天 冬氨酸激酶III、天冬氨酸半醛脫氫酶、天冬氨酸激酶I、高絲氨酸激酶、天冬氨酸氨基轉移 酶、以及蘇氨酸合酶。也可以將L-蘇氨酸生物合成系統基因導入蘇氨酸分解受到抑制的埃 希氏屬細菌中。作為蘇氨酸分解受到抑制的埃希氏菌屬細菌，例如可以列舉出蘇氨酸脫氫 酶活性缺損的TDH-6菌株(特開2001-346578號、美國專利第7，179，623號)。L-蘇氨酸生物合成系統酶的酶活性受最終產物L-蘇氨酸的抑制。因此，為了構建 L-蘇氨酸生產菌，優選對L-蘇氨酸生產菌合成系統基因進行修飾以使所述酶不受L-蘇氨 酸的反饋抑制。此外，上述thrA、thrB和thrC基因組成蘇氨酸操縱子，蘇氨酸操縱子形成 弱化子(attenuator)結構，蘇氨酸操縱子的表達受到培養液中異亮氨酸和蘇氨酸的抑制， 並且表達受到弱化作用的抑制。這種修飾可通過去除弱化區中的前導序列或弱化子來實現 (參照 Lynn，S. P. et al.，J. F. J. Mol. Biol. 194 :59_69 (1987)；國際公開第 02/26993 號小 冊子；國際公開第2005/049808號小冊子)。
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蘇氨酸操縱子的上遊存在天然啟動子，但可以用非天然啟動子將其取代(參考 W098/04715號小冊子)，也可以構建蘇氨酸操縱子使得蘇氨酸生物合成的相關的基因的表 達受到λ噬菌體的阻遏物Oppressor)和啟動子的調控(參考歐洲專利第0593792號說 明書)。此外，為了對細菌進行修飾使其不受L-蘇氨酸的反饋抑制，可以通過選擇對α -氨 基-β-羥基戊酸(AHV)有抗性的菌株來實現。對於如上所述經修飾而不受L-蘇氨酸的反饋抑制的蘇氨酸操縱子而言，優選的 是其在宿主內的拷貝數有所提高、或者是其連接於強啟動子而表達量有所增加。除了通過 使用質粒的擴增來提高拷貝數之外，還可以通過使用轉座子、Mu噬菌體等向基因組中轉移 蘇氨酸操縱子來提高拷貝數。理想的是，除了 L-蘇氨酸生物合成系統酶之外，還增強與糖酵解系統、TCA循環或 呼吸鏈相關的基因或調控基因表達的基因，或者糖攝取基因。這些在L-蘇氨酸生產中有效 的基因的實例可以列舉出，轉氫酶基因(PntAB)(歐洲專利733712號說明)、磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶基因(PepC)(國際公開95/06114號小冊子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(歐 洲專利877090號說明書)、棒狀桿菌型細菌或者芽孢桿菌屬細菌的丙酮酸羧化酶基因(國 際公開99/18228號小冊子、歐洲申請公開1092776號說明書)。此外，強化賦予L-蘇氨酸抗性的基因、賦予L-高絲氨酸抗性的基因的表達，或對 宿主賦予L-蘇氨酸抗性、L-高絲氨酸抗性，也是合適的。作為可以賦予抗性的基因的實例， 可以列舉出rhtA基因(Res. Microbiol. 154 123-135 (2003) )、rhtB基因(歐洲專利申請 公開第0994190號說明書)、rhtC基因(歐洲專利申請公開第1013765號說明書)、yfiK、 yeaS基因(歐洲專利申請公開第1016710號說明書)。此外，關於對宿主賦予L-蘇氨酸抗 性的方法，可以參考歐洲專利申請公開第0994190號說明書、國際公開第90/04636號小冊 子中所記載的方法。作為L-蘇氨酸生產菌或用於衍生L-蘇氨酸生產菌的親本株的例子，可以列 舉大腸桿菌TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)(美國專利第5，175，107號、美國專利第 5，705，371 號)、大腸桿菌 472T23/pYN7 (ATCC 98081)(美國專利第 5，631，157 號)、大 腸桿菌NRRL-21593 (美國專利第5，939，307號)、大腸桿菌FERM BP-3756 (美國專利第 5，474，918 號)、大腸桿菌 FERM BP-3519 和 FERM BP-3520 (美國專利第 5，376，538 號)、大 腸桿菌 MG442 (Gusyatiner etal.，Genetika (俄語)，14，947-956 (1978))、大腸桿菌 VL643 和VL2055(EP1149911A)等屬於埃希氏菌屬的菌株，但不限於此。TDH-6菌株在thrC基因有缺陷，是蔗糖同化型，並且ilvA基因有洩漏突變(leaky mutation) 0該菌株的rhtA基因也有賦予對高濃度蘇氨酸或高絲氨酸的抗性的突變。 B-3996菌株包含pVIC40，pVIC40是通過將含有突變的thrA基因的thrA*BC操縱子插入到 由RSF1010獲得的載體中而獲得的。這種突變的thrA基因編碼的天冬氨酸激酶高絲氨酸 脫氫酶I對蘇氨酸的反饋抑制基本上已解除。B-3996菌株在1987年11月19日被保藏於 All-UnionScientific Center of Antibiotics (全聯盟抗生素禾鬥學中心)(Nagatinskaya Street3-A, 117105 Moscow，Russia)，保藏號為 RIA 1867。該菌株也在 1987 年 4 月 7 日 保藏於俄羅斯國立工業微生物保藏中心(Russian National Collectionof Industrial Microorganisms)(VKPM)(1 Dorozhny proezd. ,1 Moscowll7545, Russia),保藏號為 B-3996。
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還可以使用大腸桿菌VKPM B-5318(EP 0593792B)作為L-蘇氨酸生產菌或用於 衍生L-蘇氨酸生產菌的親本株。B-5318菌株是異亮氨酸原養型的，並且PVIC40質粒中 的蘇氨酸操縱子的調控區域被置換為溫度敏感的λ噬菌體Cl阻遏物和冊啟動子。VKPM B-5318菌株在1990年5月3日保藏於俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM，1 Dorozhny proezd.，1 Moscowll7545, Russia)，保藏號為 VKPM B-5318。編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的大腸桿菌thrA基因已經闡明(核苷酸編 號 337 至 2799，GenBank 登錄號 NC_000913. 2，gi 49175990)。thrA 基因位於大腸桿菌 K-12 染色體上thrL基因和thrB基因之間。大腸桿菌的編碼高絲氨酸激酶的thrB基因已經闡明 (核苷酸編號 2801 至 3733，GenBank 登錄號 NC_000913. 2，gi 49175990)。thrB 基因位於大 腸桿菌K-12染色體上的thrA基因和thrC基因之間。大腸桿菌的編碼蘇氨酸合酶的thrC 基因已經闡明(核苷酸編號3734至5020，GenBank登錄號NC_000913. 2，gi =49175990)。 thrC基因位於大腸桿菌K-12染色體上thrB基因和yaaX開放閱讀框之間。所述3個基因 全部作為一個單獨的蘇氨酸操縱子發揮功能。為增強蘇氨酸操縱子的表達，優選從操縱子 中將影響轉錄的弱化子區域去除(W02005/049808，W02003/097839)。編碼對蘇氨酸的反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA 基因，以及thrB和thrC基因可以作為一個操縱子從熟知的PVIC40質粒中獲得，該質粒存 在於蘇氨酸生產株大腸桿菌VKPM B-3996菌株中。pVIC40質粒在美國專利5，705，371中有 詳述。大腸桿菌的rhtA基因存在於大腸桿菌染色體上的ISmin處，靠近編碼穀氨醯 胺轉運系統的成分的glnHPQ操縱子。rhtA基因與0RFl(ybiF基因，核苷酸編號764至 1651，GenBank 登錄號 AAA218541，gi =440181)相同，位於 pexB 與 ompX 基因之間。表 達由ORFl編碼的蛋白的單元稱為rhtA基因(rht:對高絲氨酸和蘇氨酸抗性)。此外， 已經證明rhtA23突變是在相對於ATG起始密碼子的_1位置用G — A取代(ABSTRACTS of the 17thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugationwith Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and MolecularBiology(第17界國際生物化學與分子生物學大會暨美國生物化學與分子生 物學協會年會摘要)，San Francisco, California, 1997 年 8 月 24-29 日，摘要號 457，EP 1013765A)。大腸桿菌的asd基因已經闡明(核苷酸編號3572511至3571408，GenBank登錄 號NC_000913. l,gi :16131307)，並且可以根據該基因的鹼基序列利用引物通過PCR來獲得 (參見White，T.J.等，Trends Genet.，5，185 (1989))。其它微生物的asd基因可以通過類 似方式獲得。此外，大腸桿菌的aspC基因已經闡明(核苷酸編號983742至984932，GenBank登 錄號NC_000913. 1，gi :16128895)，並且可以通過PCR獲得。其它微生物的aspC基因可以 通過類似方式獲得。L-色氨酸生產菌L-色氨酸生產菌或用於衍生L-色氨酸生產菌的親本株的實例包括、但不限於 下述屬於埃希氏菌屬的菌株，如可以使用由突變的trpS基因編碼的色氨醯-tRNA合成 酶缺陷的大腸桿菌 JP4735/pMU3028(DSM10122)和 JP6015/pMU91 (DSM10123)(美國專利
175，756，345)；具有編碼不受絲氨酸反饋抑制的磷酸甘油酸脫氫酶的serA等位基因和編碼 不受色氨酸反饋抑制的鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因的 大腸桿菌SV164(pGH5)(美國專利6，180，373)；色氨酸酶缺陷的大腸桿菌AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)和 AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264)(美國專利 4，371，614)；產生磷 酸烯醇丙酮酸的能力增強的大腸桿菌AGXl7/pGX50，pACKG4-pps (W09708333，美國專利 6,319,696)等等。此外，還可以使用由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白活性增加的產生 L-色氨酸的屬於埃希氏菌屬的細菌(美國專利申請2003/0148473A1和2003/0157667A1)。L-色氨酸生產菌和用於衍生L-色氨酸生產菌的親本株的實例還可以列舉出下述 菌株，該菌株的選自鄰氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脫氫酶(serA)、3-脫氧-D-阿 拉伯庚酮醛酸-7-磷酸合酶(3- r才# * -D- 7，7 7 口 >酸-7-〗J >酸* >夕一 七)(aroG)、3_脫氫奎寧酸合酶(aroB)、莽草酸脫氫酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇 丙酮酉先莽草酸 3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase) (aroA)、分 支酸合酶(aroC)、預苯酸脫水酶、分支酸變位酶以及色氨酸合酶(trpAB)中的1種或2種以 上的酶的活性被增強。預苯酸脫水酶以及分支酸變位酶作為雙功能酶(CM-PD)，由pheA基 因編碼。在這些酶中，特別優選磷酸甘油酸脫氫酶、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮醛酸-7-磷酸 合酶、3-脫氫奎寧酸合酶、莽草酸激酶、5-烯醇丙酮醯莽草酸3-磷酸合酶、分支酸合酶、預 苯酸脫水酶、分支酸變位酶_預苯酸脫氫酶。鄰氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脫氫酶兩者 均受L-色氨酸和L-絲氨酸的反饋抑制，因此也可以向這些酶中導入使反饋抑制解除的突 變。具有此類突變的菌株的具體實例包括具有脫敏型鄰氨基苯甲酸合酶的大腸桿菌SV164 和通過將質粒PGH5 (W0 94/08031)轉入大腸桿菌SV164獲得的菌株，所述質粒pGH5包含突 變的serA基因，該突變的serA基因編碼反饋抑制被解除了的磷酸甘油酸脫氫酶。L-色氨酸生產菌或者用於衍生L-色氨酸生產菌的親本株的實例還可以列舉出， 導入了包含編碼抑制解除型鄰氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操縱子的菌株(特開昭 57-71397號，特開昭62-244382號，美國專利4，371，614)。此外，可以也通過增強色氨酸操 縱子(trpBA)中編碼色氨酸合酶的基因的表達來賦予L-色氨酸生產能力。色氨酸合酶由 α和β亞基組成，這兩種亞基分別由trpA和trpB基因編碼。另外，還可以通過增強異檸 檬酸裂解酶_蘋果酸合酶操縱子的表達來改進L-色氨酸生產能力(W02005/103275)。L-苯丙氨酸生產菌L-苯丙氨酸生產菌或者用於衍生L-苯丙氨酸生產菌的親本株的實例，可以列 舉出，但不限於下述屬於埃希氏菌屬的菌株，分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶以及酪氨酸阻 遏物缺損的大腸桿菌 AJ12739(tyrA: :Tnl0，tyrR) (VKPM B-8197) (W003/044191)，攜帶了 編碼解除了反饋抑制的分支酸變位酶_預苯酸脫水酶的突變型pheA34基因的大腸桿菌 HW1089(ATCC55371)(美國專利第 5，354，672 號)，大腸桿菌MWEC101_b (KR8903681)、大腸杆 菌 NRRL B-1214UNRRL B_12145、NRRL B-12146 以及 NRRLB-12147 (美國專利第 4，407，952 號)等。此外，也可以使用攜帶有編碼解除了反饋抑制的分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基 因的大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAB] (FERM BP-3566)、大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (FERM BP-12659)、大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERMBP-12662)以及 命名為 AJ 12604 的大腸桿菌 K-12[W3110 (tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB] (FERM BP-3579)作 為親本株(EP 488424B1)。此外，還可使用由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白質的活性增強的屬於埃希氏菌屬的L-苯丙氨酸生產菌(美國專利申請公開2003/0148473A1以及 2003/0157667AUW003/044192)。L-纈氨酸生產菌L-纈氨酸生產菌或用於衍生L-纈氨酸生產菌的親本株實例包括、但不限於經修 飾從而過表達ilvGMEDA操縱子的菌株(美國專利5，998，178)。理想的是將ilvGMEDA操縱 子中對於衰減作用而言必要的區域移除，以使操縱子的表達不會被產生的L-纈氨酸所削 弱。此外，理想的是將操縱子中的ilvA基因破壞從而降低蘇氨酸脫氨酶的活性。L-纈氨酸生產菌或用於衍生L-纈氨酸生產菌的親本株的實例還包括具有氨醯 t-RNA合成酶中的突變的突變株(美國專利5，658，766)。例如，可以使用大腸桿菌VL1970， 該菌株在編碼異亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突變。已將大腸桿菌VL1970在 1988年6月24日保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM) (Russia, 113545 Moscow, 1 Dorozhny Proezd.)，保藏號為 VKPM B-4411。此外，還可以使用生長需要核酸和/或缺失H+-ATP酶的突變株(W096/06926、美國 專利第5，888，783號)作為親本株。此外，作為屬於埃希氏菌屬的L-纈氨酸生產菌，還可以使用H-81(VKPMB_8066)、 NRRL B-12287 和NRRL B-12288 (美國專利 4，391，907)、VKPMB_4411 (美國專利 5，658，766)、 VKPM B-7707(歐洲專利申請1016710A2)等。H-81株於2001年1月30日保藏於俄羅斯國 立工業微生物保藏中心(VKPM) (1 Dorozhny proezd. , 1 Moscow 117545，Russia)，保藏號 VKPM B-8066，並於2002年2月1日轉為基於布達佩斯條約的國際保藏。L-亮氨酸生產菌L-亮氨酸生產菌或者用於衍生L-亮氨酸生產菌的親本株的實例可以列舉出、 但不限於下述屬於埃希氏菌屬的菌株，如對亮氨酸有抗性的大腸桿菌菌株(例如，菌株 57 (VKPM B-7386，美國專利第6，124，121號))或對β _2_噻吩基丙氨酸、3-羥基亮氨 酸、4-偶氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸等亮氨酸類似物有抗性的大腸桿菌菌株(特公昭 62-34397號和特開平8-70879號)、通過W096/06926中描述的基因工程方法獲得的大腸杆 菌菌株、大腸桿菌Η-9068 (特開平8-70879號)等。可以通過增加涉及L-亮氨酸生物合成的1種以上的基因的表達來改進本發明的 細菌。這些基因的實例可優選列舉IeuABCD操縱子中的基因，所述操縱子中的基因以突變 的IeuA基因為代表，該基因編碼對L-亮氨酸反饋抑制具有抗性的異丙基蘋果酸合酶(美 國專利6，403，342)。此外，可以通過增強編碼從細菌細胞分泌L-胺基酸的蛋白的1種以上 的基因的表達來改進本發明的細菌。這類基因的實例包括b2682和b2683基因(ygaZH基 因)(EP1239041A2)。L-異亮氨酸生產菌L-異亮氨酸生產菌或用於衍生L-異亮氨酸生產菌的親本株的實例可以列舉出、 但不限於對6- 二甲基氨基嘌呤有抗性的突變株(特開平5-304969號)，對異亮氨酸類似 物如硫代異亮氨酸(thiaisoleucine)和異亮氨酸氧肟酸具有抗性的突變株，以及對DL-乙 硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突變株(特開平5-130882號)。 此外，還可以使用以編碼蘇氨酸脫氨酶、乙醯羥酸合酶(acetohydroxate synthase)等涉及 L-異亮氨酸生物合成的蛋白質的基因轉化的重組 株(特開平2-458號，FR 0356739，和美國專利第5，998，178號)作為親本株。L-絲氨酸生產菌作為L-絲氨酸生產菌或用於衍生L-絲氨酸的親本株的例子，可以列舉出攜帶 絲氨酸反饋抑制減弱的3-磷酸甘油酸脫氫酶的大腸桿菌(專利2584409號、美國專利第 5，618，716號)。此外，還可以使用具有L-絲氨酸生產能力且磷酸絲氨酸磷氧化酶活性或 磷酸絲氨酸轉氨酶活性中的至少一種增強的棒狀桿菌型細菌、L-絲氨酸分解能力缺失的 棒狀桿菌型細菌(特開平11-253187號、美國專利第6，037，154號)、以及偶氮絲氨酸或 β -(2-噻吩基)-DL-丙氨酸抗性的具有L-絲氨酸生產能力的棒狀桿菌型細菌(特開平 11-266881號、美國專利第6，258，573號)。當通過基因重組來選育上述L-胺基酸生產菌時，所使用的基因不限於具有上述 基因信息的基因或具有公知序列的基因，在不損害所編碼的蛋白質的功能的前提下，也可 以使用這些基因的同源物、人工修飾體等具有保守突變的基因。即，還可以是編碼具有在公 知蛋白質的胺基酸序列中在1個或數個位置上取代、缺失、插入或添加1個或者數個胺基酸 而得到的序列的蛋白質的基因。關於「保守突變」，在後面關於丙酮酸合酶等的內容中有描 述，其也適用於上述基因。丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶活性的增強本發明的微生物是對諸如上述的具有L-胺基酸生產能力的微生物進行了修飾使 得其丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性增強而得到的微生物。對於增強丙酮 酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶活性的修飾而言，優選進行修飾使得與親本株例如野生 株、非修飾株相比，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶活性增強。而且，正如所述，當 微生物本來不具有丙酮酸合酶活性時，通過修飾而具有了該酶活性的微生物，其丙酮酸合 酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶活性與非修飾株變得更強。可以先對細菌進行修飾使得其丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的酶活性 提高，然後再賦予L-胺基酸生產能力。而且，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶活性 的增強可以採用如前文所述的增強基因表達的方法來進行。即，可以通過以啟動子修飾為 代表的表達調節區域修飾等來增強內源性丙酮酸合酶基因或丙酮酸NADP+氧化還原酶基 因的表達，也可以通過在細菌中導入包含丙酮酸合酶基因或丙酮酸NADP+氧化還原酶基因 的質粒或通過在細菌染色體上導入所述基因等來增強外源性丙酮酸合酶基因的表達。本發明中的「丙酮酸合酶」是指在電子供體存在下，例如在鐵氧還蛋白或者黃 素氧還蛋白存在下，可逆地催化由乙醯基-CoA和CO2生成丙酮酸的下述反應的酶(EC 1. 2. 7. 1)。丙酮酸合酶也可簡稱為PS，或者有些情況下還被命名為丙酮酸氧化還原酶、丙酮 酸鐵氧還蛋白氧化還原酶、丙酮酸黃素氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸氧化還原酶。作為電 子供體，可以使用鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白。還原型鐵氧還蛋白+乙醯_CoA+C02 —氧化型鐵氧還蛋白+丙酮酸+CoA丙酮酸合酶的活性增強的確認，可以通過從增強前微生物和增強後的微生物製備 粗酶液、並比較它們的丙酮酸合酶活性來實現。丙酮酸合酶的活性可以按照例如Yoon等的 方法(Υοοη, K. S. et al. 1997. Arch. Microbiol. 167 :275_279)來測定。例如，向包含作為 電子受體的氧化型甲基紫精、CoA和粗酶液的反應液中添加丙酮酸，採用光譜學方法測定因 丙酮酸的脫碳酸反應而增加的還原型甲基紫精的量，這樣就可以測定丙酮酸合酶的活性。1個酶活性單位(U)表示為每1分鐘1 μ mol甲基紫精的還原量。當親本株具有丙酮酸合 酶活性時，理想的是，與親本株相比較，酶活性上升優選1. 5倍以上、更優選2倍以上、更優 選3倍以上。此外，當親本株不具有丙酮酸合酶活性時，只要通過導入丙酮酸合酶基因生 成丙酮酸合酶即可，但理想的是，優選酶活性被增強到可測定的程度，優選0. 001U/mg (菌 體蛋白)以上、更優選0.005U/mg以上、更優選0.01U/mg以上。丙酮酸合酶對氧敏感，通常 來說其活性表達和測定也往往較為困難(Buckel，W. and Golding，B. Τ. 2006. Ann. Rev. of Microbiol. 60 27-49)。因此，在測定酶活性時，優選如實施例中描述的那樣，降低反應容器 中的氧濃度來進行酶反應。作為編碼丙酮酸合酶的基因，可以利用綠硫菌(Chlorobium t印idum)、嗜熱氫杆 菌(Hydrogenobacter thermophilus)等具有還原性TCA循環的細菌的丙酮酸合酶基因。 此外，也可以利用以大腸桿菌(Escherichia coli)代表的屬於腸桿菌科細菌群(腸內細菌 群)的細菌來源的丙酮酸合酶基因。而且，作為編碼丙酮酸合酶的基因，還可以利用海藻甲 ；求胃(Methanococcusmaripaludis)、；氏甲;求胃(Methanocaldococcus jannaschii)、 高溫彎曲甲燒熱桿菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)等自養型產甲燒古細 菌(autotrophic methanogens)的丙酮酸合酶基因。具體地，作為綠硫菌(Chlorobium t印idum)的丙酮酸合酶基因，可以列舉出具 有位於綠硫菌基因組序列(GenBank登錄號NC_002932)的鹼基序號1534432 1537989 的、SEQ ID NO :1所示的鹼基序列的基因。SEQ ID NO :2中示出了該基因編碼的氨基 酸序列(GenBank登錄號AAC76906)。此外，已知嗜熱氫桿菌的丙酮酸合酶由δ亞基 (GenBank 登錄號ΒΑΑ95604)、α 亞基(GenBank 登錄號 ΒΑΑ95605)、β 亞基(GenBank 登 錄號:ΒΑΑ95606)、γ亞基(GenBank登錄號:ΒΑΑ95607)這4個亞基的複合體形成(Ikeda， Τ. etal. 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340 :76_82)。而且，還可以示例出由位於幽 門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)基因組序列(GenBank登錄號NC000915)的鹼基序 號1170138 1173296的HP1108、HP1109、HP1110、HPllll這4個基因構成的丙酮酸合 酶基因，由硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)基因組序列(GenBank登錄號NC 002754)的鹼基序號 1047593 1044711 所示的 SS01208、SS07412、SS01207、SS01206 這 4 個基因編碼的丙酮酸合酶基因。而且，丙酮酸合酶基因還可以基於與上述示例的基因的同 源性，從綠硫菌屬(Chlorobium)、脫硫菌屬(Desulfobacter)、產液菌屬(Aquifex)、氫桿菌 屬(Hydrogenobacter)、熱變形菌屬(Thermoproteus)、熱棒菌屬(Pyrobaculum)細菌等中 克隆。在大腸桿菌中，ydbK基因(bl378)位於K_12株基因組序列(GenBank登錄號 U00096)的鹼基序號1435284 1438808，具有SEQ ID NO 3所示的鹼基序列；從序列同源 性推測，其編碼丙酮酸黃素氧還蛋白氧化還原酶、即丙酮酸合酶。SEQ ID NO :4中示出了該 基因編碼的胺基酸序列(GenBank登錄號AAC76906)。如實施例所示，證實了該基因產物具 有丙酮酸合酶活性，通過強化該基因的表達，能夠提高L-胺基酸生產能力。而且，丙酮酸合 酶基因還可以是與大腸桿菌丙酮酸合酶基因(ydbK)具有高同源性的、屬於埃希氏菌屬、沙 門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、志賀氏菌屬 (Shigella)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)等腸桿菌科細菌群的丙酮酸合酶基因。海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)的丙酮酸合酶由位於海沼甲
21燒球菌基因組序列(GenBank 登錄號NC_005791) (Hendrickson, Ε. L. et al. 2004. J. Bacteriol. 186 -.6956-6969)的鹼基序號 1462535 1466397 的 porCDABEF 操縱子編碼 (Lin, W. C. et al. 2003. Arch. Microbiol. 179. 444-456)。已知該丙酮酸合酶包含 Y、α、 β和δ這4個亞基，除了所述亞基之外，PorE和PorF對丙酮酸合酶的活性而言也是重要 的(Lin，W. and Whitman, W. B. 2004. Arch. Microbiol. 181 :68_73)。γ 亞基由基因組序列 的鹼基序號1465867 1466397 (互補鏈)的porA基因編碼，SEQ ID NO :56中示出了其鹼 基序列，SEQ ID NO 57中示出了該基因編碼的胺基酸序列(GenBank登錄號NP_988626)。 δ亞基由基因組序列的鹼基序號1465595 1465852 (互補鏈)的porB基因編碼，SEQ ID NO :58中示出了其鹼基序列，SEQ ID NO :59中示出了該基因編碼的胺基酸序列(GenBank 登錄號ΝΡ_988627)。α亞基由基因組序列的鹼基序號1464410 1465573 (互補鏈)的 porC基因編碼，SEQ ID NO :60中示出了其鹼基序列，SEQ ID NO :61中示出了該基因編碼的 胺基酸序列(GenBank登錄號ΝΡ_988625)。β亞基由基因組序列的鹼基序號1463497 1464393(互補鏈)的porD基因編碼，SEQ ID NO :62中示出了其鹼基序列，SEQ ID NO 63 中示出了該基因編碼的胺基酸序列(GenBank登錄號NP_988624)。PorE由基因組序列鹼 基序號1462970 1463473 (互補鏈)的porE基因編碼，SEQ ID NO :64中示出了其鹼基序 列，SEQ ID NO :65中示出了該基因編碼的胺基酸序列(GenBank登錄號NP_988623)。PorF 由基因組序列鹼基序號1462535 1462951 (互補鏈)的porF基因編碼，SEQ ID NO 66中 示出了其鹼基序列，SEQ ID NO :67中示出了該基因編碼的胺基酸序列(GenBank登錄號 NP_988622)。已知自養型的甲烷生成古細菌詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcusjannaschii)、 高溫彎曲甲烷熱桿菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)等也具有相同基因結 構的丙酮酸合酶基因，可以加以利用。本發明中，「丙酮酸NADP+氧化還原酶」是指在電子供體存在下，例如在NADPH或 者NADH存在下，可逆地催化由乙醯-CoA和CO2生成丙酮酸的下述反應的酶(EC 1. 2. 1. 15)。 丙酮酸NADP+氧化還原酶有時簡稱為ΡΝ0，有些情況下還被命名為丙酮酸脫氫酶。然而， 本發明中在提及「丙酮酸脫氫酶活性」時，是指如文後述的催化丙酮酸氧化脫碳酸生成乙 醯-CoA的反應的活性，催化該反應的丙酮酸脫氫酶(PDH)與丙酮酸NADP+氧化還原酶不 是同一種酶。丙酮酸NADP+氧化還原酶可以利用NADPH或者NADH作為電子供體。NADPH+ 乙醯 _CoA+C02 — NADP++ 丙酮酸 +CoA丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性增強這一事實的確認，可以通過從增強前的微生 物和增強後的微生物製備粗酶液、並比較它們的丙酮酸NADP+氧化還原酶活性來實現。丙 酮酸NADP+氧化還原酶的活性可以按照例如Inui等的方法(Inui，H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262 =9130-9135)來測定。例如，向包含作為電子受體的氧化型甲基紫精、CoA和粗酶 液的反應液中添加丙酮酸，採用光譜學方法測定由於丙酮酸的脫碳酸反應而增加的還原型 甲基紫精的量，這樣就可以測定丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性。1個酶活性單位(U)表 示為每1分鐘1 μ mol甲基紫精的還原量。當親本株具有丙酮酸NADP+氧化還原酶活性時， 理想的是，與親本株相比較，酶活性上升優選1. 5倍以上、更優選2倍以上、更優選3倍以 上。此外，當親本株不具有丙酮酸NADP+氧化還原酶活性時，只要通過導入丙酮酸NADP+ 氧化還原酶基因可生成丙酮酸NADP+氧化還原酶即可，但理想的是，優選酶活性被強化到
22可測定的程度，優選0. 001U/mg (菌體蛋白)以上、更優選0. 005U/mg以上、更優選0. 01U/mg 以上。丙酮酸NADP+氧化還原酶對氧敏感，因而其活性表達和測定通常來說也存在許多困 難(Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262 :9130_9135 ；Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18 :710-720)。在由於失活等原因無法測定活性的情況下，可以像實施例所述那樣，通 過Western印跡等方法來確認蛋白質的表達。編碼丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因除了作為光合成真核微生物(也被分類為 原生動物)的纖細裸藻(Euglena gracilis)的丙酮酸NADP+氧化還原酶基因(Nakazawa， Μ. et al. 2000. FEBS Lett. 479 155-156)、原生生物小球隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)的丙酮酸NADP+氧化還原酶基因(Rotte，C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18 710-720)之外，已知在硅藻假微型海鏈藻(Tharassiosira pseudonana)中也存在同源基 因(Ctrnacta，V.et al. 2006. J. Eukaryot. Microbiol. 53 :225_231)。具體地，作為纖細裸藻(Euglena gracilis)的丙酮酸NADP+氧化還原酶基因，可 以示例出具有SEQ ID NO :5所示的鹼基序列的基因(GenBank登錄號AB021127)。SEQ ID NO 6中示出了該基因編碼的胺基酸序列(GenBank登錄號BAB12024)。本發明的微生物還可以是經過了如下的修飾而使得丙酮酸合酶的活性增強的微 生物，所述修飾使得與親本株例如野生株或非修飾株相比，將電子供體從氧化型再生為還 原型的活性(該活性對於丙酮酸合酶的活性而言是必需的)增強。將氧化型電子供體再生 為還原型的活性包括例如鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性。此外，還可以是經過了如下的修 飾而使得丙酮酸合酶的活性增強的微生物，所述修飾除了增強電子供體的再生活性之外還 增加丙酮酸合酶基因的表達。而且，上述親本株可以是天然內在地具有編碼電子供體的再 生活性的基因的微生物，也可以是並非天然具有電子供體的再生活性，但通過導入編碼該 活性的基因而被賦予了該活性，從而L-穀氨酸生產能力變得更高的微生物。「鐵氧還蛋白-NADP+還原酶」是指可逆地催化以下反應的酶(EC1. 18. 1. 2)。還原型鐵氧還蛋白+NADP+-—氧化型鐵氧還蛋白+NADPH+H+本反應是可逆反應，能夠在NADPH和氧化型鐵氧還蛋白的存在下生產還原型鐵 氧還蛋白。鐵氧還蛋白可以替換成黃素氧還蛋白，命名為黃素氧還蛋白-NADP+還原酶 的酶也具有同等功能。已經確認鐵氧還蛋白-NADP+還原酶在從微生物到高等生物中普 遍存在(參照 Carrillo, N.和 Ceccarelli, Ε. A. 2003. Eur. J. Biochem. 270 :1900_1915 ； Ceccarelli, E. A. et al. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698 :155_165)，其也被命名為鐵氧 還蛋白-NADP+氧化還原酶、NADPH-鐵氧還蛋白氧化還原酶。鐵氧還蛋白-NADP+還原酶的活性已增強這一事實的確認，可以通過從修飾前的微 生物和修飾後的微生物製備粗酶液，並比較它們的鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性來實現。 鐵氧還蛋白-NADP+還原酶的活性可以按照例如Blaschkowski等的方法(Blaschkowski， H. P. et al. 1982. Eur. J. Biochem. 123 :563-569)來測定。例如，可以通過以鐵氧還蛋白作 為底物、採用光譜學方法測定減少的NADPH的量來測定。1個酶活性單位(U)表示為每1分 鍾1 μ moINADPH的氧化量。當親本株具有鐵氧還蛋白-NADP+還原酶活性時，如親本株的活 性充分高，則沒有增強的必要，但理想的是，與親本株相比較，酶活性上升優選1. 5倍以上、 更優選2倍以上、更優選3倍以上。已經在許多生物物種中發現了編碼鐵氧還蛋白-NADP+還原酶的基因，這些基因只要在目的L-胺基酸生產株中有活性即可加以使用。在大腸桿菌中，作為黃素氧還蛋 白-NADP+還原酶，已經鑑定出的有 fpr 基因(Bianchi，V. et al. 1993. J. Bacteriol. 175 1590-1595)。此外，已知在惡臭假單胞菌(Psuedomonas putida)中NADPH-假單胞氧還蛋 白還原酶(Putidaredoxinreductase)基因和假單胞氧還蛋白(Putidaredoxin)基因以操 縱子的形式存在(Koga, H. et al. 1989. J. Biochem. (Tokyo) 106 :831_836)。大腸桿菌的黃素氧還蛋白-NADP+還原酶包括，例如，位於大腸桿菌K-12株基因組 序列(Genbank登錄號.U00096)的鹼基序號4111749 4112495 (互補鏈)的、具有SEQ ID NO 7所示的鹼基序列的fpr基因。SEQ ID NO :8中示出了 Fpr的胺基酸序列(Genbank登錄 號.AAC76906)。此外，在穀氨酸棒桿菌基因組序列(Genbank登錄號.BA00036)的鹼基序號 2526234 2527211中發現了鐵氧還蛋白-NADP+還原酶基因(Genbank登錄號.BAB99777)。對丙酮酸合酶的活性而言，存在鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白作為電子供體是必要 的。因此，也可以是經過修飾使得鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的生產能力提高，從而丙酮酸 合酶的活性增強的微生物。此外，除了進行修飾以增強丙酮酸合酶的活性或者增強黃素氧還蛋白-NADP+還原 酶和丙酮酸合酶的活性之外，還可以進行修飾來提高鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的生產能 力。本發明中，「鐵氧還蛋白」是指含有非卟啉鐵原子(Fe)和硫原子，並結合有稱作 4Fe-4S、3Fe-4S、或者2Fe-2S簇的鐵-硫簇的蛋白質，其作為單電子傳遞體發揮功能。「黃 素氧還蛋白」是指包含FMMFlavin-mononucleotide，黃素單核苷酸)作為輔基的、發揮單 電子或者雙電子傳遞體功能的蛋白質。關於鐵氧還蛋白和黃素氧還蛋白，在McLean等的文 獻中有記載(McLean, K. J. et al. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33 :796_801)。而且，用於修飾的親本株可以是天然內在地具有編碼鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白 的基因的菌株，也可以是天然不具有鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白基因、但通過導入鐵氧還 蛋白或黃素氧還蛋白基因而被賦予了活性，從而L-穀氨酸生產能力提高的菌株。鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的生產能力與親本株(例如野生株或非修飾株)相比 有所提高的事實，可以通過將鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的mRNA的量與野生型或者非修 飾株比較來加以確認。作為表達量的確認方法，可以列舉Nothern雜交、RT-PCR(Sambrook， J. et al.1989. Molecular Cloning ALaboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork)。關於表達量，只要是與野生株或者非修飾株相比較 有所上升即可，理想的是，例如與野生株、非修飾株相比，上升1.5倍以上、更優選2倍以上、 更優選3倍以上。此外，鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的生產能力與親本株(例如野生株或非修 飾株)相比有所提高的這一事實的確認，可以通過SDS-PAGE、二維電泳或者使用抗體的 Western Ep^jft^illJ (Sambrook, J. et al. 1989. MolecularCloning A Laboratory Manual/ Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York)。關於生產量，只要與 野生株或者非修飾株相比較有所提高可以是任何量，理想的是，例如與野生株、非修飾株相 比上升1. 5倍以上、更優選2倍以上、更優選3倍以上。鐵氧還蛋白以及黃素氧還蛋白的活性可以通過將其添加至適當的氧化還原反應 體系中來測定。例如，Boyer等公開了下述方法通過鐵氧還蛋白-NADP+還原酶還原產生的鐵氧還蛋白，對由生成的還原型鐵氧還蛋白引起的細胞色素C的還原進行定量(Boyer， Μ. Ε. et al. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94 :128_138)。此外，黃素氧還蛋白的活性可以通過 使用黃素氧還蛋白-NADP+還原酶以相同的方法測定。編碼鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的基因分布廣泛，任何基因，只要其編碼出的鐵 氧還蛋白或黃素氧還蛋白能夠被丙酮酸合酶和電子供體再生系統所利用，都可以加以使 用。例如，在大腸桿菌中，作為編碼具有2Fe_2S簇的鐵氧還蛋白的基因，有fdx基因(Ta， D.T.和 Vickery，L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267 11120-11125)，而 yfhL 基因被預想是編 碼具有4Fe-4S簇的鐵氧還蛋白的基因。此外，作為黃素氧還蛋白基因，已知有fldA基 因(Osborne, C. et al. 1991. J. Bacteriol. 173 :1729_1737)和 fldB 基因(Gaudu, P.和 Weiss,B. 2000. J. Bacteriol. 182 1788-1793)。在穀氨酸棒桿菌的基因組序列(Genbank 登 錄號.BA00036)中，在鹼基序號562643 562963位發現了鐵氧還蛋白基因fdx(Genbank 登錄號.BAB97942)，而且在鹼基序號1148953 1149270位發現了 fer (Genbank登錄 號.BAB98495)。此外，在綠硫菌中，存在許多鐵氧還蛋白基因，其中，鐵氧還蛋白I以及鐵氧 還蛋白II被鑑定為作為丙酮酸合酶的電子受體的4Fe-4S型鐵氧還蛋白基因(Υοοη,Κ. S. et al. 2001. J. Biol. Chem. 276 :44027_44036)。還可以使用嗜熱氫桿菌的鐵氧還蛋白基因等來 源於具有還原型TCA循環的細菌的鐵氧還蛋白基因或黃素氧還蛋白基因。具體地，大腸桿菌的鐵氧還蛋白基因包括例如位於大腸桿菌K-12株基因組序列 (Genbank登錄號· U00096)的鹼基序號2654770 2655105位(互補鏈)的SEQ ID NO 9 所示的fdx基因、以及位於鹼基序號2697685 2697945位的SEQ ID NO 11所示的yfhL 基因。SEQ ID NO 10以及SEQ ID NO 12中示出了 Fdx以及YfhL的胺基酸序列(分別為 Genbank登錄號.AAC75578以及AAC75615)。作為大腸桿菌的黃素氧還蛋白基因，包括例如 位於大腸桿菌K-12株基因組序列(Genbank登錄號.U00096)的鹼基序號710688 710158 位(互補鏈)的SEQ ID NO :13所示的fldA基因、以及位於鹼基序號3037877 3038398位 的 SEQ ID NO 15 所示的 fldB 基因。SEQ IDNO 14 以及 SEQ ID NO 16 中示出了 fldA 基因 以及fldB基因所編碼的胺基酸序列(分別為Genbank登錄號.AAC73778以及AAC75933)。作為綠硫菌的鐵氧還蛋白基因，包括例如位於綠硫菌基因組序列(Genbank登錄 號.NC_002932)的鹼基序號1184078 1184266位的SEQ IDNO 17所示的鐵氧還蛋白I基 因、以及位於鹼基序號1184476 1184664位的SEQ ID NO :19所示的鐵氧還蛋白II基因。 SEQ ID NO 18以及SEQ IDNO 20中示出了鐵氧還蛋白I以及鐵氧還蛋白II所編碼的氨基 酸序列(分別為Genbank登錄號.AAM72491以及AAM72490)。此外，還可列舉嗜熱氫桿菌 的鐵氧還蛋白基因(Genbank登錄號.BAE02673)、硫磺礦硫化葉菌基因組序列中的鹼基序 號2345414 2345728位所示的硫磺礦硫化葉菌的鐵氧還蛋白基因。而且，還可以是基於 與上述示例的基因的同源性，從綠菌屬、脫硫菌屬(Desulfobacter)、產液菌屬(Aquifex)、 氫桿菌屬、熱變形菌屬(Thermoproteus)、熱棒菌屬(Pyrobuculum)細菌等克隆的基因， 而且還可以是從腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森菌屬等Y-變 形細菌，穀氨酸棒桿菌、乳發酵短桿菌等棒狀桿菌型細菌；銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等假單胞菌屬細菌；以及結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)等分 枝桿菌屬(Mycobacterium)細菌等中克隆的基因。這些編碼丙酮酸合酶、鐵氧還蛋白-NADP+還原酶、鐵氧還蛋白、黃素氧還蛋白的基因(以下統稱為本發明的基因)還可以使用具有保守突變的基因，如所述基因的同源物或 人工變體等，以不損害編碼的蛋白質的活性即功能為限。也就是說，可以是編碼具有在公知 的蛋白質的胺基酸序列或野生型蛋白質的胺基酸序列中的1個或者數個位置上發生1個或 者數個胺基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的胺基酸序列的保守變體的基因。這裡所 說的1個或者數個，因胺基酸殘基在蛋白質立體結構中的位置、胺基酸的種類而異，優選是 1 20個、更優選1 10個、特別優選1 5個。上述突變優選是保守取代，其是功能上無變化的中性突變。關於保守取代，當取代 位點是芳香族胺基酸時為Phe、Trp和Tyr之間的相互取代的突變；當取代位點是疏水氨基 酸時為Leu、Ile和Val之間的相互取代的突變；當取代位點是極性胺基酸時為Gln和Asn 之間的相互取代的突變；當取代位點是鹼性胺基酸時為Lys、Arg和His之間的相互取代的 突變；當取代位點是酸性胺基酸時為Asp和Glu之間的相互取代的突變；當取代位點是具 有羥基的胺基酸時為Ser和Thr之間的相互取代的突變。更具體地，可以列舉用Ser或Thr取代Ala ；用Gln、His或Lys取代Arg ；用Glu、 Gin,Lys,His 或 Asp 取代 Asn ；用 AsruGlu 或 Gln 取代 Asp ；用 Ser 或 Ala 取代 Cys ；用 Asn、 Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 取代 Gln ；用 Gly、Asn、Gln、Lys 或 Asp 取代 Glu ；用 Pro 取代 Gly ； 用 Asn、Lys, Gin、Arg 或 Tyr 取代 His ；用 Leu、Met、Val 或 Phe 取代 Ile ；用 lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu ；用 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 取代 Lys ；用 lie、Leu、Val 或 Phe 取代 Met ； 用 Trp、Tyr、Met、Ile 或 Leu 取代 Phe ；用 Thr 或 Ala 取代 Ser ；用 Ser 或 Ala 取代 Thr ；用 Phe或Tyr取代Trp ；用His、Phe或Trp取代Tyr ；和用Met、Ile或Leu取代Val。此外，這 樣的胺基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等還包括因基於攜帶本發明的基因的微生物的 個體差異、種間差異等情形而天然發生的突變(mutant或variant)而產生的那些取代、缺 失、插入、添加或倒位。此外，還可以替換成在本發明的基因所導入的各個宿主中易於使用的密碼子。同 樣地，本發明的基因只要具有功能即可，所編碼的蛋白質的N末端側和/或C末端側可以被 延長或截短。例如，延長的長度是50個以下、優選20個以下、更優選10個以下、特別優選 5個以下的胺基酸殘基。編碼如上所述的保守變體的基因，例如可以通過定點突變方法對鹼基序列進行修 飾，使得被編碼的蛋白的特定位點上的胺基酸殘基包含取代、缺失、插入或添加，來獲得這 樣的基因。此外，還可以通過傳統公知的突變處理來獲得。突變處理包括例如用羥胺等對 本發明的基因進行體外處理的方法，以及對攜帶該基因的微生物(例如埃希氏菌屬細菌) 採用紫外線照射或使用N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)等在常 規突變處理中使用的突變劑來進行處理的方法。此外，如上所述的胺基酸的取代、缺失、插 入、增加或倒位等還包括因基於攜帶本發明的基因的微生物的個體差異、種間差異等情形 而天然發生的突變(mutant或variant)而產生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。至於 這些基因是否編碼有功能的丙酮酸合酶、鐵氧還蛋白-NADP+還原酶、鐵氧還蛋白或黃素氧 還蛋白，可以通過例如將這些基因導入具有L-胺基酸生產能力的微生物，並測定各基因產 物的活性來予以確認。本發明的基因可以是能夠與具有上述鹼基序列的DNA或可由與具有所述鹼基序 列的DNA製備的探針在嚴格條件下雜交，並且編碼丙酮酸合酶、鐵氧還蛋白-NADP+還原酶、
26鐵氧還蛋白、或黃素氧還蛋白的DNA。這裡，「嚴格條件」是指形成所謂特異性雜交體而不形成非特異性雜交體的條件。 將該條件明確地數值化是困難的，舉一實例具有高同源性的DNA(例如具有70%以上，優 選80%以上，更優選90%以上，特別優選95%以上同源性的DNA)目互雜交，而同源性較 之為低的DNA則不互相雜交的條件；或者在與常規Southern雜交的洗滌條件即60°C， 1XSSC、0. 1% SDS，優選 0. 1XSSC、0. 1% SDS，更優選 68°C、0. 1XSSC、0. 1% SDS 相當的鹽 濃度、溫度下洗滌1次，優選2 3次的條件。而且，在本說明書中，「同源性」(homology) 有時是指「同一性」(identity)。探針也可以具有本發明的基因的一部分序列。這樣的探針可以採用本領域技術人 員熟知的方法，以基於各基因的鹼基序列製備的寡核苷酸為引物，以包含各基因的DNA片 段為模板進行PCR反應來加以製備。而且，當使用300bp左右長度的DNA片段作為探針時， 作為在上述條件下雜交後的洗滌條件，例如可以是50°C、2XSSC、0. 1% SDS。上述關於保守變體的描述同樣適用於所述的L-胺基酸生產能力的賦予中描述的 酶和基因。如上文所述的用於增強本發明基因之表達的修飾，可以依照賦予L-胺基酸生產 能力的相關記載中描述的增強目的基因表達的方法來進行。本發明的基因可以利用攜帶該 基因的微生物的基因組DNA為模板，通過PCR法獲得。例如，綠硫菌的丙酮酸合酶基因可以使用基於SEQ ID N0:1的鹼基序列制 備的引物，例如SEQ ID NO :35、36所示的引物，以綠硫菌的基因組DNA為模板，通過 PCR(polymerase chain reaction) Tj ^ U ( # # White, Τ. J. et al. 1989. Trends Genet. 5 :185—189)。大腸桿菌的丙酮酸合酶基因可以使用基於SEQ ID N0. 3的鹼基序列製備的引物， 使用例如SEQ ID NO :38、39所示的引物，以大腸桿菌的基因組DNA為模板，通過PCR來獲得。纖細裸藻的丙酮酸=NADP+氧化還原酶基因可以使用基於SEQ ID NO 5製備的引 物，例如如SEQ ID NO :40、41所示的引物，以纖細裸藻的基因組DNA為模板，通過PCR法來獲得。大腸桿菌的黃素氧還蛋白-NADP+還原酶基因可以使用基於SEQ IDNO 7的鹼基序 列製備的引物，例如SEQ ID NO :42、43所示的引物，以大腸桿菌的基因組DNA為模板，通過 PCR法獲得。大腸桿菌的鐵氧還蛋白基因fdx可以使用基於SEQ ID NO :9的鹼基序列製備的引 物，例如SEQ ID NO :44、45所示的引物，以大腸桿菌的基因組DNA為模板，通過PCR法獲得。大腸桿菌的黃素氧還蛋白基因fidA和黃素氧還蛋白基因fldB可以分別使用基於 SEQ ID N0:13的鹼基序列和基於SEQ ID NO 15的鹼基序列製備的引物，以大腸桿菌的基 因組DNA為模板，通過PCR法獲得。此外，綠硫菌的鐵氧還蛋白I基因和鐵氧還蛋白II基因可以分別使用基於SEQ ID NO 17和基於SEQ ID NO 19的鹼基序列製備的引物，以綠硫菌的基因組DNA為模板，通過 PCR法獲得。對來源其它微生物的本發明的基因，也可以以基於上述各基因的序列信息或該微
27生物的公知基因或蛋白質序列信息製備的寡核苷酸為引物，通過PCR法，或者，以基於所述 序列信息製備的寡核苷酸為探針，通過雜交法，從該微生物的基因組DNA或基因組DNA文庫 獲得。而且，基因組DNA可以從作為DNA供體的微生物採用例如Saito和Miura的方法(參 M Saito, H.和 MiuraX I. 1963. Biochem. Biophys. Acta, 72,619-629 ；生物工學実験書，日 本生物工學會編，97 98頁，培風館，1992年)等來製備。本發明基因以及L-胺基酸生物合成系統基因的表達的增強，可以通過採用如上 述的方法，利用轉化或同源重組來提高本發明基因的拷貝數，或者修飾本發明基因的表 達調節序列來實現。此外，本發明基因的表達增強，可以通過擴增能夠提高本發明基因 的表達的激活子(activator)、和/或缺失或弱化能夠降低本發明基因的表達的調節子 (regulator)來實現。以下，對增強基因表達的方法進行說明。第一種方法是提高目的基因的拷貝數的方法。例如，可以通過將目的基因克隆在 適當的載體上，並用所得載體轉化宿主細菌，提高該基因的拷貝數。作為用於轉化的載體，可以列舉能夠在使用的微生物中自主複製的質粒。例如， 作為能夠在屬於腸桿菌科類細菌的微生物中自主複製的質粒，可以列舉pUC19、pUC18、 pBR322、RSFlO 10、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29 (pHSG、pSTV 可從 TAKARA Bio 公司獲得)、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW可從NIPPON GENE 公司獲得) 等。此外，作為棒狀桿菌型細菌用的質粒，可以列舉PAM330 (特開昭58-67699號公報)、 PHM1519 (特開昭58-77895號公報)>pSFK6 (參照特開2000-262288號公報)、pVK7 (美國專 利申請公開說明書 2003-0175912)、pAJ655、pAJ611、pAJ1844(特開昭 58-192900 號公報)、 pCGl (特開昭57-134500號公報)、pCG2 (特開昭58-35197號公報)、pCG4、pCGll (特開昭 57-183799號公報)、pHK4(特開平5-7491號公報)等。此外，從這些載體中取出具有使質 粒得以在棒狀桿菌型細菌中自主複製的能力的DNA片段，並將其插入到所述大腸桿菌用載 體中，可以作為能夠在大腸桿菌以及棒狀桿菌型細菌這兩者中自主複製的所謂穿梭載體來 使用。而且，還可以使用噬菌體DNA代替質粒作為載體。作為轉化方法，可以列舉例如用氯化鈣處理受體菌細胞來增加DNA的透過性的 方法，如已被報導用於大腸桿菌K-12的方法(Mandel，Μ·和Higa，A. J. Mol. Biol. 1970.53 159-162)，或者從處於增殖階段的細胞製備感受態細胞並導入DNA的方法，如已被報導用 於枯草芽孢桿菌的方法(Duncan，C. H. et al. 1997. Gene 1:153-167)。或者，還可以應用將 DNA受體菌的細胞製備成容易導入重組DNA的原生質體或原生質球的狀態，再將重組DNA 導入DNA受體菌的方法，該方法已知用於枯草桿菌、放線菌類和酵母(Chang，S. and Choen, S. N.，1979. Mol. Gen. Genet. 168 :111_115 ；Bibb, Μ. J. et al. 1978. Nature 274 :398_400 ； Hinnen, A. et al. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933)。此外，採用電脈衝法 (特開平2-207791號公報)也能夠進行微生物的轉化。提高基因的拷貝數還可以通過向微生物的基因組DNA上導入多個拷貝的目的基 因來實現。為了將多個拷貝的目的基因導入到微生物的基因組DNA上，可以利用基因組 DNA上以多拷貝存在的序列作為靶標，通過同源重組來進行(Millerl，J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, ColdSpring Harbor Laboratory) 作為基因組 DNA 上以多拷 貝存在的序列，可以利用重複DNA(repetitive DNA)、存在於轉座元件端部的反向重複序
28列。或者，還可以如特開平2-109985號公報所公開的那樣，將目的基因裝載在轉座子中，使 其發生轉移，從而將多個基因拷貝導入基因組DNA中。另外，還可以通過使用Mu噬菌體的 方法(特開平2-109985號)將目的基因整合到宿主基因組上。目的基因轉移到了基因組 上的事實，可以通過以該基因的一部分為探針進行Southren雜交來予以確認。而且，當提高基因拷貝數時，只要能夠增強目的基因的產物的活性即可，對於拷貝 數沒有特殊限制。在微生物本來就具有目的基因的情況下，優選為2個以上；此外，在微生 物本來不具有本發明的基因時，導入的基因的拷貝數可以是1個，也可以是2個以上。第2種方法是在基因組DNA上或質粒上、將目的基因的啟動子等表達調節序列替 換為適當強度的表達調節序列來增強目的基因的表達的方法。例如，thr啟動子、Iac啟 動子、trp啟動子、trc啟動子、pL啟動子、tac啟動子等是已知的常用啟動子。作為棒狀 桿菌型細菌中的高表達型啟動子，可以列舉延伸因子Tu(EF-Tu)基因tuf的啟動子，編碼 共伴侶蛋白(cochaperonin)GroES-伴侶蛋白(chaperonin)GroEL,硫氧還蛋白還原酶、 磷酸甘油酸變位酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等的基因的啟動子(W02006/028063號公報、 EP1697525號公報)。啟動子強度的評價方法和強力啟動子的例子記載於Goldstein和Doi 的論文(Goldstein,M. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev.，1，105-128)等中。此外，可以如國際公開W000/18935所描述的那樣，通過在基因的啟動子區域導 入數個鹼基的鹼基取代將其修飾成強度合適的啟動子。表達調節序列的取代例如可以像 使用溫度敏感型質粒的基因取代那樣進行。作為可以在大腸桿菌或Pantoea ananatis中 使用的、具有溫度敏感型複製起點的載體，可以列舉例如WO 99/03988號國際公開小冊子 所述的溫度敏感型質粒PMAN997或其衍生質粒等。此外，表達調節序列的取代還可以通 過使用線性DNA的方法來進行，如利用λ噬菌體的Red重組酶(Red recombinase)的稱 力 「Red 馬區雲力·☆，， (Red-driven integration)白勺力夕去(Datsenko, K. A. andffanner, B. L.， 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 6640-6645)、以及將 Red 驅動整合法與 λ 噬菌體來源 的切出系統(Cho, Ε. H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184 =5200-5203)聯合使用的方法(參照 W02005/010175號)等。而且，表達調節序列的修飾可以與如上所述的提高基因的拷貝數的 方法聯合使用。而且，已知對核糖體結合位點(RBS)與起始密碼子之間的間隔序列中，特別是對 起始密碼子緊鄰上遊的序列中的數個核苷酸的取代，對mRNA的翻譯效率有非常大的影響， 可以對所述序列進行修飾來提高翻譯量。當丙酮酸合酶由多個亞基構成時，可以分別增強編碼各亞基的基因的表達，也可 以以多順反子的形式同時增強這些基因的表達。此外，當使用載體將基因導入微生物時，編 碼各亞基的基因可以同時擔載在單一載體分子上，也可以分別擔載在不同載體分子上。此 外，當將基因插入基因組時，編碼各亞基的基因可以同時插入到基因組上的同一位點，也可 以分別插入到不同位置上。此外，本發明的微生物優選除了丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性增 強之外，其蘋果酸酶活性也已降低。當本發明的微生物是屬於埃希氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌 屬、克雷伯氏菌屬或沙雷氏菌屬的細菌時，特別優選降低蘋果酸酶的活性。本發明中，蘋果酸酶的活性是指可逆地催化蘋果酸氧化脫碳酸生成丙酮酸的反應的活性。上述反應由以NADP為電子受體的NADP型蘋果酸酶(也記作蘋果酸脫氫酶 (malate dehydrogenase) ( ^-Wc^MM^'li. (oxaloacetate-decarboxylating)) (NADP+)) (EC :1. 1. 1. 40 b2463基因(也記作maeB基因)SEQ ID NO 54)、或者以NAD為電子受體的 NAD型蘋果酸酶(也記作蘋果酸脫氫酶(草醯乙酸脫羧性)(NAD+)) (EC :1· 1. 1. 38 sfcA基 因(也記作maeA基因)SEQ ID NO :52)這2種酶來催化。蘋果酸酶活性的確認可以按照 Bologna 等的方法(Bologna, F. P. et al. 2007. J. Bacteriol. 2007 189 :5937_5946)來測 定。NADP依賴型蘋果酸酶NADP+(NADP-依賴性蘋果酸酶NADP+) +蘋果酸 (malate) — NADPH+C02+ 丙酮酸(pyruvate)NAD依賴型蘋果酸酶NAD+ (NAD-依賴性蘋果酸酶NAD+) +蘋果酸一NADH+C02+丙 酮酸酶活性的降低可以像後述的丙酮酸脫氫酶活性的降低那樣進行。在本發明中，更優選使NADP型蘋果酸酶與NAD型蘋果酸酶這兩者的活性均降低， 特別是，當本發明的微生物是屬於埃希氏菌屬、腸桿菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬或沙雷氏 菌屬的細菌時，優選降低這兩種類型的蘋果酸酶的活性。此外，本發明的微生物優選除了增強丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活 性之外，還降低丙酮酸脫氫酶活性。在本發明中，丙酮酸脫氫酶(以下也稱「PDH」)活性是指催化丙酮酸氧化脫 碳酸、生成乙醯-CoA(acetyl-CoA)的反應的活性。上述反應由PDH(Elp pyruvate dehydrogenase, EC :1· 2. 4. 1 aceE 基因 SEQ ID NO 46)、二氫硫辛醯基乙醯轉移酶(E2p dihydrolipoyltransacetylase,EC 2. 3. 1. 12 aceF 基因 SEQ ID NO 48)、二氫硫辛醯胺脫 氫酶(E3 :dihydrolipoamide dehydrogenase ；EC :1· 8. 1. 4 IpdA 基因 SEQ ID NO 50)這 3 種酶來催化。即，這3種亞單位分別催化以下反應，而將催化這3個反應合起來的反應的 活性稱為PDH活性。PDH活性的確認可以採用Visser和Strating的方法(Visser，J. and Strating, Μ. 1982. Methods Enzymo 1. 89 :391_399)來測定。Elp 丙酮酸+[ 二氫硫辛醯賴氨酸殘基琥珀醯轉移酶]硫辛醯賴氨酸一[二氫硫 辛醯賴氨酸殘基乙醯轉移酶]S-乙醯二氫硫辛醯賴氨酸+CO2E2p =CoA+酶N6_ (S-乙醯二氫硫辛醯)賴氨酸一乙醯-CoA+酶N6- ( 二氫硫辛醯) 賴氨酸E3 蛋白N6- ( 二氫硫辛醯)賴氨酸+NAD+ —蛋白N6-(硫辛醯)賴氨酸+NADH+H+酶活性的降低具體地可以通過下述方法實現使染色體上的PDH編碼基因，具體 地說是aceE、aceF和IpdA中的1個或2個以上基因的編碼區域的一部分或全部缺損，或 者對啟動子、shine-dalgarno (SD)序列等表達調節序列進行修飾，等等。此外，對表達調節 序列以外的非翻譯區的修飾也可以降低基因的表達量。而且，還可以缺失包括染色體上的 基因的前後的序列在內的整個基因。此外，所述修飾還可以這樣完成通過基因重組向染 色體上的酶編碼區域中導入胺基酸取代(錯義突變)、或者導入終止密碼子(無義突變)、 或者導入添加或缺失一 二個核苷酸的移碼突變(Wang，J. P. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54 :9405_9410 ；Winkler, W. C. 2005. Curr. Opin. Chem. Biol. 9 :594_602 ；Qiu, Z. and Goodman, M. F. 1997. J. Biol. Chem. 272 :8611—8617 ；ffente, S. R. and Schachman, H. K. 1991.J. Biol. Chem. 266 :20833_20839)。在本發明中，優選通過利用同源重組，使染色體上的基因表達調節序列例如啟動 子區域、或編碼區域、或非編碼區域的一部分或全部缺損，或者在所述區域中插入其它序 列，來降低細胞內的酶活性。然而，只要是降低PDH活性的修飾即可，也可以是通過X射線 或紫外線照射、或者N-甲基-N』 -硝基-N-亞硝基胍等突變劑進行的常規突變處理引起的 修飾。就表達調節序列的修飾而言，優選為1個鹼基以上，更優選為2個鹼基以上，特別 優選為3個鹼基以上。此外，在缺失編碼區域時，只要產生的酶蛋白質的功能降低或缺失即 可，缺失的區域可以是N末端區域、內部區域、C末端區域中的任何區域，也可以是整個編碼 區域。通常，缺失的區域越長，越能夠切實地使基因失活。此外，優選的是被缺失區域的上 遊或下遊的讀碼框不一致。在編碼區域中插入其他序列時，可以為基因的任何區域，但插入的序列越長越能 夠切實地使編碼酶的基因失活。優選的是插入部位前後的序列的讀碼框不一致。對於其他 序列沒有特殊限制，只要是能夠降低或缺損酶蛋白質的功能即可，包括例如攜帶有抗生素 抗性基因或對L-胺基酸生產有用的基因的轉座子等。對染色體上的基因如上述地進行修飾，可以通過下述方法實現例如，製備缺失型 基因(其經過了修飾使得基因的部分序列缺失、不產生正常功能的酶蛋白質)，用包含該基 因的DNA轉化細菌，通過使缺失型基因與染色體上的基因發生同源重組，從而將染色體上 的基因替換成缺失型基因。缺失型基因所編碼的酶蛋白質即使能夠產生，其與野生型酶蛋 白質的立體結構也不同，其功能降低或消失。這種基於利用同源重組進行的基因取代的基 因破壞，還可以採用下述方法進行前述的Red驅動整合方法、組合使用Red驅動整合法與 λ噬菌體來源的切出系統的方法等使用線性DNA的方法，或者使用含溫度敏感型複製起點 的質粒、可接合轉移的質粒的方法，利用在宿主內不含複製起點的自殺載體的方法(美國 專利第6303383號說明書，或特開平05-007491號)等。上述關於降低PDH活性的描述同樣適用於前述的其它酶「活性的降低」、或其它基 因的「破壞」。此外，在厭氧或微需氧的條件下進行培養的場合，本發明的微生物還可以是經過 修飾，使得除了丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性被增強之外，不在厭氧或微 需氧的條件下產生有機酸或乙醇的微生物。這裡，作為有機酸，可以列舉出乳酸、甲酸、乙 酸。作為進行修飾使得不生產有機酸或乙醇的方法，包括例如破壞編碼乳酸脫氫酶的基因 的方法(Verumi，G. N. et al. 2002. J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 28 :325_332 ；特 開 2005-95169)。此外，當在包含脂肪酸作為碳源的培養基中進行培養時，還可以提高本發明的微 生物的脂肪酸同化能力。提高脂肪酸同化能力的手段包括例如弱化或缺損fadR基因 的表達，增強涉及脂肪酸同化的fadL、fadE、fadD、fadB和/或fadA基因的表達，或增強 編碼細胞色素bo型氧化酶複合體(cytochrome bo terminal oxidase complex)的各亞 基的基因群(Gennis, R. B. and Stewart, V. 1996. p. 217-261. In F. D. Neidhardt (ed.)， Escherichia coli andSalmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Societyfor Microbiology Press, Washington, D. C；Chepuri et al. 1990.J. Biol. Chem. 265 11185-11192)即 cyoABCDE 的表達等。"fadR基因」是編碼FadR的基因，所述FadR是在腸桿菌科細菌群中發現的調節脂 肪酸代謝並具有DNA結合能力的轉錄因子(DiRusso，C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267 8685-8691 ；DiRusso, C. C. et al. 1993. Mol. Microbiol. 7 :311_322)，大腸桿菌的 fadR 基因可以示例出具有位於大腸桿菌的基因組序列(Genbank登錄號U00096)鹼基序號 1234161 1234880的SEQ ID NO 82所示的鹼基序列的基因。SEQ ID NO 83中示出了該 基因編碼的胺基酸序列。本發明的L-胺基酸生產方法本發明的方法是以用培養基培養本發明的微生物，在培養基中或菌體內生成並蓄 積L-胺基酸，並從該培養基或菌體收集L-胺基酸為特徵的L-胺基酸生產方法。這裡，本發明的方法可以採用分批培養(batch culture)、流加培養(Fed-batch culture)、連續培養法(continuous culture)中的任何方法，培養基中的乙醇或脂肪酸可 以包含在初始培養基中，也可以包含在流加培養基中，或者包含於這兩者中。這裡，在本發明中，上述流加培養是指下述培養方法將培養基連續地或間歇地添 加至培養容器中，並且在培養完成之前不從容器中取出培養基。此外，連續培養指下述培養 方法連續地或間歇地將培養基流加至培養容器中，同時從容器中取出培養基(通常而言， 等於所流加的培養基的量)。「初始培養基」的意思是在流加培養或連續培養中，流加流加 培養基之前的分批培養中所用的培養基(培養開始時的培養基)；「流加培養基」的意思是 在進行流加培養或連續培養時，提供至發酵罐的培養基。此外，分批培養(batchculture) 是指每批製備一次新的培養基，將菌株接種到其中，並且直至收穫都不加入培養基。作為碳源，優選是能夠產生乙醯CoA但不伴隨發生脫碳酸反應的碳源，具體地可 以列舉出乙醇、脂肪酸、或者、通過分解可產生脂肪酸的脂肪酸酯包括油脂等。以下，就使 用乙醇或脂肪酸作為所述碳源的情況進行示例說明。乙醇是以分子式C2H5OH表示的一元醇，可以利用純乙醇，也可以直接利用含乙醇 的混合物，如乙醇發酵等中產生的培養液中的乙醇等。脂肪酸是以通式CmHnCOOH表示的一元羧酸。只要能夠被具有L-胺基酸生產能力 的細菌利用即可，可以是任何鏈長的脂肪酸，也可以以任意比例含有任何鏈長的脂肪酸。優 選的脂肪酸是油酸(C17H33COOH)以及棕櫚酸(C15H31COOH),特別優選油酸。關於油酸，可以 通過油脂的水解來獲得包含油酸的長鏈脂肪酸混合物。用於本發明的油酸可以以棕櫚油等 油脂的水解物的形式獲得，可以使用從動物油、植物油、廢食用油、其它混合油脂或巧克力 等包含脂肪成分的食品中提取的油酸。此外，脂肪酸可以以游離酸的形式利用，也可以以與 鈉、鉀等鹼金屬的鹽或者銨鹽的形式加以利用。本發明的方法中使用的培養基中所含的乙醇或脂肪酸的量可以是任意的，只要本 發明的方法中使用的細菌能夠作為碳源加以同化即可，當作為單獨的碳源添加到培養基中 時，優選包含20w/v %以下、優選1 Ow/v %以下、更優選2w/v %以下。此外，培養基中包含的 乙醇或脂肪酸可以是任意的，只要在其含量下能夠作為碳源被同化即可，當作為單獨的碳 源添加到培養基中時，希望包含0. 001w/v%以上、優選0. 05w/v%以上、更優選0.以 上。此外，在作為流加培養基使用的情況下，當作為單獨的碳源添加乙醇或脂肪酸時，
32培養基中優選包含10w/v%以下、優選5w/v%以下、更優選以下，優選包含0. OOlw/ 以上、優選0. 05w/v%以上、更優選0.以上。而且，乙醇的濃度可以採用各種方法來測定，酶法測定是簡便且常規的(Swift， R. 2003. Addiction 98:73-80)。脂肪酸的濃度可以採用氣相色譜或HPLC等常規方法來 測定(Lehotay, S. J. and Hajslova, J. TrAC Trends Anal. Chem. 2002. 21 :686_697 ；Lin, J. T. et al. 1998. J. Chromatogr. A. 808 :43_49)。而且，還可以將乙醇和脂肪酸混合後添加到本發明的培養基中。乙醇和脂肪酸的 添加濃度可以是任意的，只要本發明的方法中使用的細菌能夠作為碳源同化所述脂肪酸即 可，當在培養基中僅添加乙醇和脂肪酸的混合物作為碳源時，優選合計包含20w/v%以下、 優選10w/v%以下、更優選2w/v%以下。此外，培養基中的乙醇和脂肪酸的混合物的含量可 以是任意的，只要在其含量下本發明中使用的細菌能夠作為碳源加以同化即可。當培養基 中僅添加乙醇和脂肪酸的混合作為碳源時，優選與油酸合在一起包含0. 001w/v%以上、優 選0. 05w/v%以上、更優選0.以上。此外，乙醇與脂肪酸的混合比例可以是任意的，只要為本發明的方法中使用的細 菌能夠作為碳源同化的濃度即可，可以以相對於乙醇1脂肪酸為2以下、優選1. 5以下、特 別優選1以下左右的比例來進行混合。作為下限，只要混合了脂肪酸即可，優選相對於乙醇 1，混合0. 05以上、優選0. 1以上的脂肪酸。而且，本發明的方法中使用的培養基中除了乙醇或脂肪酸或乙醇和脂肪酸這兩者 之外，還可以添加其它碳源。優選的是葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、廢糖蜜、澱粉水解 物等糖類，甘油等多元醇類，富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸類。特別優選葡萄糖、蔗糖、果 糖、甘油。作為甘油，也可以使用在生物柴油燃料生產中產生的粗甘油。碳源可以是1種， 也可以是2種以上的混合物。在使用其它碳源的情況下，碳源中的乙醇或脂肪酸、或乙醇和 脂肪酸的混合物的比例優選為10重量％以上、優選30重量％以上、更優選50重量％以上。而且，在本發明中，可以在培養的所有步驟中均包含一定濃度的乙醇或者脂肪酸， 也可以僅在流加培養基或初始培養基中添加有乙醇或者脂肪酸，如果其它碳源充足，則也 可以存在乙醇或脂肪酸不足的一定時間。所謂「暫時性的」，意思是，例如，在發酵總時間的 10%、20%、最大至30%的時間內脂肪酸處於不足的狀態。就培養基中添加的其它成分而言，可以使用除碳源外還含有氮源、無機離子和視 需要而定的其它有機成分的常規培養基。本發明的培養基中包含的氮源可以使用氨、硫酸 銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨、醋酸銨、尿素等銨鹽或硝酸鹽等，PH調整中使用的氨氣、氨水也 可作為氮源利用。此外，還可以利用蛋白腖、酵母提取物、肉提取物、麥芽提取物、玉米漿、大 豆水解物等。培養基中也以只含這些氮源中的1種，也可以含有這些氮源中的2種以上。這 些氮源可以用於初始培養基，也可以用於流加培養基。此外，初始培養基、流加培養基中可 以使用相同的氮源，也可以將流加培養基的氮源改變為與初始培養基不同。本發明的培養基中，除了碳源、氮源之外，優選還包含磷酸源、硫源。作為磷酸源， 可以利用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、焦磷酸等磷酸多聚物等。此外，作為硫源，只要包含硫原 子即可，優選硫酸鹽、硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽等硫酸鹽，半胱氨酸、胱氨酸、穀胱甘肽等含硫 胺基酸，這其中優選硫酸銨。此外，培養基除碳源、氮源、硫源之外，還可以包含生長促進因子(具有生長促進效果的營養素)。能夠使用的生長促進因子包括微量金屬、胺基酸、維生素、核酸以及含有所 述物質的蛋白腖、酪蛋白胺基酸、酵母提取物、大豆蛋白降解產物等。作為微量金屬，可以列 舉鐵、錳、鎂、鈣等；作為維生素，可以列舉維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、煙醯胺、維 生素B12等。這些生長促進因子可以包含在初始培養基中，也可以包含在流加培養基中。此外，在使用其生長需求胺基酸等的營養缺陷型突變株時，優選在培養基中添補 所需求的營養素。特別是，可在本發明中使用的L-賴氨酸生產菌中大多如後述地強化了 L-賴氨酸生物合成途徑，而弱化了 L-賴氨酸分解能力，因此，優選添加選自L-蘇氨酸、 L-高絲氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸中的1種或2種以上。初始培養基和流加培養基的 培養基組成可以相同，也可以不同。此外，初始培養基與流加培養基的培養基組成可以相 同，也可以不同。而且，當流加培養基的流加分多個階段進行時，各流加培養基的組成可以 相同，也可以不同。培養優選在發酵溫度20至45°C，特別優選33至42°C的通氣條件下進行。這裡， 將氧濃度調節到5至50%，優選至大約10%來進行發酵。此外，優選將pH控制在5至9進 行通氣培養。如果在培養期間PH降低，可例如添加碳酸鈣或鹼例如氨氣和氨水以中和培 養物。在這些條件下，進行優選大約10至120小時的培養，從而在培養液中蓄積顯著量的 L-胺基酸。蓄積的L-胺基酸的濃度只要是高於野生型菌株中的濃度並且在該濃度下能夠 將L-胺基酸從培養基收集和回收即可，可以是50g/L以上，理想的是75g/L以上，更理想的 是100g/L以上。當目的胺基酸為鹼性胺基酸時，可以採用通過下述方法進行發酵、並回收目的鹼 性胺基酸的方法來進行生產(參照特開2002-065287號)將培養中的pH控制在6. 5 9. 0、培養結束時的培養基的pH控制在7. 2 9. 0、發酵中的發酵槽內壓力控制為正的方法， 或者，向培養基供給二氧化碳或含二氧化碳的混合氣體，使得存在培養基中的碳酸氫根離 子和/或碳酸根離子為至少2g/L以上的培養期，並以所述碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 作為以鹼性胺基酸為主的陽離子的抗衡離子的方法。就培養結束後從培養液中收集L-胺基酸的方法而言，可以按照公知的回收方法 來進行。例如，在採用離子交換樹脂法、沉澱法，或通過離心分離等從培養液中除去菌體後， 進行濃縮晶析來進行收集。在本發明中，為了確保高於一定水平的L-胺基酸蓄積，微生物的培養可以分為種 子培養(seed culture)和主培養(main culture)來進行，種子培養可通過使用培養瓶等 的搖動培養或通過分批培養來進行，而主培養可以以流加培養或連續培養的形式進行。或 者，種子培養和主培養均可以以分批培養的方式進行。在本發明中，當進行流加培養或連續培養時，可以以間歇的方式流加流加培養基， 使乙醇或脂肪酸或其它碳源的流加發生暫時的停止。優選的是，停止流加培養基供給的時 間為流加進行時間的至多30%，理想的是至多20%，特別理想的是至多10%。當間歇流加 流加培養液時，可添加一定時間的流加培養基，並如下控制第二次及以後的添加在某個添 加期前面的添加停止期中發酵培養基內碳源耗盡時PH的上升和溶氧濃度的上升通過計算 機被檢測到時，即開始添加；從而培養罐(culture tank)中的基質濃度總是自動保持在低 水平(美國專利5，912，113號說明書)。流加培養中使用的流加培養基，優選採用含乙醇或脂肪酸和其它碳源、以及具有生長促進效果的營養素(生長促進因子)的培養基，並且可以進行控制，使得發酵培養基中 的脂肪酸濃度在一定濃度以下。這裡，所謂一定濃度以下，是指製備添加10w/v%以下、優選 5w/v%以下、更優選以下的培養基。作為其它碳源，優選葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油；作為生長促進因子，優選氮源、磷 酸、胺基酸等。作為氮源，可以使用氨、硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨、醋酸銨、尿素等銨鹽 或硝酸鹽等。此外，作為磷酸源，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，作為胺基酸，在使用營 養缺陷型突變株的場合，優選添補所需求的營養素。此外，流加培養基可以是1種，也可以 混合2種以上的培養基。在使用2種以上的流加培養基時，這些培養基可以混合起來通過 1個補料罐流加，也可以用多個補料罐流加。在將連續培養方法用於本發明時，可以同時進行取出和流加；也可以取出一部分 後再進行流加。此外，所述方法也可以是將包含L-胺基酸和細胞的培養液取出，然後僅將 細胞再循環回發酵罐，對菌體進行再利用的連續培養方法(參照法國專利號2669935說明 書)。作為連續或間歇流加營養源的方法，可以使用與流加培養中所用的相同方法。再利用菌體的連續培養方法是如下所述的方法在胺基酸濃度達到預定水平時， 將發酵培養基間歇或連續地取出，僅取出L-胺基酸，並且將包含菌體的過濾殘餘物再循環 到發酵罐中，這種方法可通過參考例如法國專利號2669935說明書來實施。其中，將培養液間歇取出時，可以在L-胺基酸濃度達到預定濃度時取出部分L-氨 基酸，並且新流加培養基來繼續培養。此外，至於添加的培養基的量，優選進行設定使其最 終與取出之前的培養液的量為等量。這裡，「等量」的意思是取出之前培養液量的大約93 107%的量。在將培養液連續取出時，優選在流加營養培養基的同時或之後開始取出。例如，開 始取出的時間是添加開始之後的5小時之內，優選3小時之內，更優選1小時之內。此外， 至於培養液的取出量，優選取出的量和流加的量為等量。
實施例以下，通過實施例更具體地說明本發明，但本發明不受其限制。〔實施例1〕為了使大腸桿菌能夠以需氧方式同化乙醇，獲取了醇脫氫酶AdhE突變體。大腸杆 菌來源的野生型AdhE基因(adhe)的鹼基序列及其編碼的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO 21 禾口 SEQ ID NO :22。 大腸桿菌 MG1655: :PL_tacadhE 株的構建通過 Datsenko 禾口 Wanner 開發的稱為"Red—driven integration，，的方法 (Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 :6640_6645)禾口 λ 噬菌體來源的切出系統(Cho, Ε. H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184 =5200-5203)將大腸桿菌 adhE基因的啟動子區域替換成Pptac;。通過本方法，使用以5'側設計有目的基因的一部分、3'側設計有抗生素抗性基 因的一部分的合成寡核苷酸作為引物而得到的PCR產物，可以一步式地構建基因重組株。 進而，結合使用λ噬菌體來源的切出系統，可以將整合到基因重組株中的抗生素抗性基因 除去。
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包含I\_ta。和編碼氯黴素抗性(CmK)基因的cat基因的片段，以國際專利申請 W02006/043730記載的大腸桿菌MG1655PL_ta。xylE株的基因組為模板，使用SEQ ID NO :23和 SEQ ID NO :24所示的引物，通過PCR法來進行擴增。SEQ ID NO :23的引物包含adhE基因 的上遊區域的互補序列，SEQID NO 24的引物包含adhE基因的5'區域的互補序列。PL_tac 的序列如 SEQ ID NO 25 所示。PCR 中使用了 Gene Amp PCRSystem 2700 擴 增儀(Applied Biosystems)和Taq DNA聚合酶(Fermentas公司)。所得擴增片段採用瓊 脂糖凝膠電泳來進行純化、回收。通過電穿孔將片段導入攜帶具有溫度敏感型的複製能力 的質粒 PKD46 的大腸桿菌 MG1655/pKD46 株中。質粒 pKD46 (Datsenko，K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 :6640-6645)中包含 λ 噬菌體的總計 2154 個鹼基 的DNA片段(GenBank/EMBL登錄號J02459，第31088位 33241位)，該片段中包含阿拉伯 糖誘導性ParaB啟動子控制下的編碼λ Red同源重組系統的Red重組酶的基因(γ、β、exo 基因)。質粒PKD46對於將PCR產物整合至MG1655株的染色體上而言是必要的。對於擴增得到的PCR產物，採用瓊脂糖凝膠電泳進行純化，通過電穿孔將其導入 到包含具有溫度敏感型的複製能力的質粒PKD46的大腸桿菌MG1655株中。電穿孔用感受態 細胞按下述製備。具體地，將在含100mg/L的氨苄青黴素的LB培養基(胰蛋白腖10g/L、酵 母提取物5g/L、NaCl 10g/L)中30°C培養過夜的MG1655/pKD46株用含氨苄青黴素(lOOmg/ L)和L-阿拉伯糖(IOmM)的5mL的LB培養基稀釋100倍。對於所得稀釋物，於30°C在通氣 條件下使其生長至0D600為約0. 6後，100倍濃縮，用10%甘油洗滌3次，從而使其能夠用於 電穿孔。電穿孔使用70 μ L的感受態細胞與約IOOng的PCR產物來進行。在電穿孔後的杯 子中力口入 ImL 的 SOC 培養基(Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/SecondEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York),於 37°C培養 1小時後，於37°C在含Cm(氯黴素)(40mg/L)的LB瓊脂培養基(胰蛋白腖10g/L、酵母提取 物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂15g/L)上進行平板培養，選擇出Cm抗性重組體。將Cm抗性株接種到含2 %乙醇的M9平板培養基(Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York)上，從37°C、培養2-3日所生長出的菌株中選取約100個克 隆，再於含2%乙醇的M9平板培養基上37°C進行培養，選擇36小時以內生長出的菌株。為 了考察所述菌株的CmK基因與啟動子區域的序列，使用SEQ ID NO 26和SEQ ID NO :27所 示的引物通過PCR法進行了擴增。對於經確認adhE基因的啟動子區域中包含0^基因的一 個克隆，於37°C進行培養來除去溫度敏感型質粒pKD46，從而得到了 MG1655: :PL_tacadhE株。大腸桿菌MG1655 Δ adhE株的構建對於大腸桿菌MG1655 (ATCC 700926)野生型的adhE基因，採用Datsenko和 Wanner開發的方法將其替換成非活性型adhE基因。以質粒pACYC177 (GenBank/EMBL accession number X06402、Fermentas 公司)為模板，使用 SEQ ID N0:28 禾口 SEQ ID NO 29 所示的引物，通過PCR法擴增了包含編碼卡那黴素抗性(KanK)基因的kan基因的片段。SEQ ID NO :28的引物包含與adhE基因318bp上遊的區域的40個鹼基互補的序列，SEQ IDNO 29 的引物包含與adhE基因3'側區域的41個鹼基互補的序列。PCR中使用了 Gene Amp PCR System 2700 擴增儀(Applied Biosystems)禾口 Taq DNA 聚合酶(Fermentas 公司)。將所 得擴增片段用瓊脂糖凝膠電泳進行純化、回收。對於該片段，通過電穿孔將其導入攜帶質粒
36pKD46的大腸桿菌MG1655/pKD46株。為了確認在含20 μ g/ml卡那黴素的LB平板培養基(Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York)上生長出的克隆中存在KmK基因，使用SEQ ID N0:30和SEQ ID NO :31所示的引物，採用PCR法進行了擴增。對於一個已確認在adhE基因區域中包含KmK 基因的克隆，通過在37°C進行培養，除去溫度敏感型質粒pKD46，從而得到了 MG1655AadhE 株。突變型醇脫氫酶(AdhE*)的構建為了將Glu568Lys (E568K)突變導入AdhE，使用與adhE基因的鹼基序列 1662-1701和1703-1730互補、且第1702位的鹼基引入g — a突變的SEQID NO 32所示的 引物、以及與adhE基因鹼基序列的3』末端側區域同源的SEQ ID NO :33所示的引物，以大 腸桿菌MG1655株基因組為模板，進行了 PCR。PCR中使用了 Gene Amp PCR System 2700擴 增儀(AppliedBiosystems)和Pyrobest DNA聚合酶(寶酒造)。對於所得的1. 05kbp的擴 增片段，用瓊脂糖凝膠電泳進行了純化、回收。以大腸桿菌MG1655: :PL_tacadhE株基因組為模板，使用SEQ ID NO 34所示的引物 以及導入了突變的1. 05kbp片段作為引物，進行了 PCR。SEQ IDNO 34的引物是位於adhE 基因起始密碼子上遊402-425bp的引物。PCR中使用了 Gene Amp PCR System 2700擴增 儀(Applied Biosystems)和TaKaRaLA DNA聚合酶(寶酒造)。對於所得4. 7kbp的擴增片 段，用瓊脂糖凝膠電泳進行了純化、回收。為了使野生型adhE基因區域與突變型adhE基因重組，對於包含CmK基因和Pptac 下遊的突變型adhE基因的4. 7kbp片段(cat_PL_ta。adhE*)，採用Datsenko和Wanner的方法， 通過電穿孔將其導入MG1655 Δ adhE/pKD46株。對於所得克隆，在包含2%乙醇作為唯一碳 源的M9平板培養基上進行選擇。測定了生長出的克隆的adhE基因的序列，結果鑑定出下述 引起胺基酸取代的突變Glu568Lys(gag_aag)、Ile554Ser(atc_agc)、Glu22Gly (gaa-gga)、 Met236Val (atg-gtg)、Tyr461Cys (tac-tgc)以及 Ala786Val (gca-gta)，將該克隆命名為 MG1655: :PL_ta。adhE* 株。以大腸桿菌MG1655:: PL_tacadhE*株作為供體，使P 噬菌體感染MG1655 Δ tdh rhtA* ^ 白勺 Pl ^ (Miller, J. H. (1972)Experiments in MolecularGenetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview，NY)，得到了具有乙醇同化性的L-蘇氨酸生產株 MG1655 Δ tdh rhtA*PL_tacadhE* 株。MG1655 Δ tdhrhtA* 株是這樣得到的 L-蘇氨酸生產株 從MG1655株出發，採用Datsenko和Warmer的方法破壞編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因，並 在rhtA基因中通過Pl轉導導入了來自於在極限培養基中對高濃度蘇氨酸具有抗性的菌株 VL614rhtA23 (Livshits, V. A. et al. 2003. Res. Microbiol. 154 :123-135)的 rhtA23 突變。大腸桿菌WC196 Amez株來源的醇脫氫酶(AdhE)突變株的構建為了對L-賴氨酸生產菌賦予乙醇同化性，以MG1655 Δ tdh rhtA*PL_ta。adhE*株作 為供體，對國際專利公報W02005/010175所述的L-賴氨酸生產菌WC196 Δ mez/pCABD2株進 行了 Pl轉導，得到了具有乙醇同化性的L-賴氨酸生產株WC196Amez PL_tacadhE*/pCABD2 株。WC196 Amez株是編碼蘋果酸酶(malic enzyme)的sfcA以及b2463基因被破壞的WC196 株(W02005/010175)。pCABD2是攜帶美國專利No. 6，040, 160所述的對L-賴氨酸反饋抑制呈抗性的dapA*基因、對L-賴氨酸反饋抑制呈抗性的IysC*基因、dapB基因以及ddh基因 的質粒。〔實施例2〕綠硫菌來源丙酮酸合酶基因表達質粒的構建綠硫菌是最適生長溫度為48°C的中高溫型自養細菌，綠硫菌TLS株的基因組序列 已由 Eisen 等闡明(Eisen,J. A. et al. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 :9509_9514)。從 該菌株中分離出丙酮酸合酶基因，構建了表達質粒。綠硫菌來源丙酮酸合酶基因表達株的丙酮酸合酶活性的測定以綠硫菌TLS株(ATCC49652)的染色體為模板，使用SEQ ID N0:35、36所示 的寡核苷酸進行PCR，擴增了丙酮酸合酶基因片段。將所得基因片段用SacI切割，插入 PSTV28 (TakaraBio公司製造)的SacI位點，構建了質粒，將其命名為pSTV-PS。在使用 BigDye Terminators vl. 1 Cycle SequencingKit 確認了丙酮酸合酶基因全長中沒有 PCR 錯誤後，用SacI從pSTV-PS中切出將丙酮酸合酶基因，插入到pMW_Pthr的SacI位點，構建 了丙酮酸合酶基因表達用質粒pMW-Pthr-PS。pMW-Pthr是在載體pMW219 (NipponGene公司 製造)的HindIII位點與XbaI位點之間具有大腸桿菌K-12株的蘇氨酸操縱子(thrABC) 的啟動子區域(Pthr)的質粒，可通過在該啟動子的下遊克隆基因來進行基因表達。所使用 的蘇氨酸操縱子的啟動子序列如SEQ IDNO 37所示。通過電穿孔在WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2中分別導入pMW_Pthr_PS以及比較對 照用載體pMW-Pthr，以卡那黴素抗性為指標獲得了轉化體，確認了質粒的導入。將綠硫菌來 源的丙酮酸合酶基因表達株命名為WC196 Δ cadA Δ 1 dcC/pCABD2/pMW-Pthr-PS,將對照株命 名為 WC196 Δ cadA Δ ldcC/pCABD2/pMW_Pthr。將上述菌株接種於含20mg/L鏈黴素和40mg/L卡那黴素的LB培養基，37°C振蕩培 養過夜。通過離心分離回收菌體，懸浮於50mM HEPES緩衝液(pH 8.0)中。將懸浮液用超 聲波破碎機破碎，15000rpm離心15分鐘後，以所得上清作為粗酶液。使用Protein Assay CBB溶液(Nakalai Tesque公司製造)測定粗酶液中的蛋白 質濃度，將相當於250μ g總蛋白質的粗酶液用於活性測定。活性測定如下進行。在下述反應溶液2mL中加入粗酶液進行反應。首先，將包含 除底物丙酮酸以外的所有成分的反應溶液加入光譜測定用比色皿中，用橡膠塞和鋁蓋將比 色皿密閉起來。使用注射器向比色池中吹入氬氣5分鐘，降低比色池內的氧濃度。然後，將 比色皿置於分光光度計(日立公司製造U-3210 Spectrophotometer)上，使用注射器添加 丙酮酸溶液開始反應。37°C反應30分鐘，其中通過經時測定578nm的吸光度來觀察還原型 甲基紫精(methylviologen)的量的變化。結果如表1所示。表中，比活性的單位為U/mg 蛋白。IU定義為每1分鐘還原Inmol甲基紫精的活性。〔反應液〕MgCl2ImM二硫蘇糖醇ImM甲基紫精5mMCoA0. 25mM丙酮酸IOmM(測定即將開始添加)
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HEPES (ρΗ8· 0)50mM表1表 權利要求
一種微生物，其具有生產選自L 賴氨酸、L 蘇氨酸、L 色氨酸、L 苯丙氨酸、L 纈氨酸、L 亮氨酸、L 異亮氨酸和L 絲氨酸中的L 胺基酸的能力，且經過修飾而增強了丙酮酸合酶或丙酮酸:NADP+氧化還原酶的活性。
2.權利要求1所述的微生物，其經過修飾而增強了丙酮酸合酶的活性。
3.權利要求1所述的微生物，其經過修飾而增強了丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性。
4.權利要求1 3中任一項所述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸=NADP+氧化還 原酶的活性是通過增加編碼丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因的表達量和/ 或增加所述基因的翻譯量而增強的。
5.權利要求4所述的微生物，其中，丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性是 通過提高編碼丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因的拷貝數或修飾所述基因的 表達調節序列而增強的。
6.權利要求4或5所述的微生物，其中，所述編碼丙酮酸合酶的基因編碼下述(A) (D)中任一項所示的多肽，或下述(E)、(F)、(G)和(H)的多肽，或下述(E)、(F)、(G)、(H)、 (I)和(J)的多肽(A)包含SEQID NO 2所示的胺基酸序列的多肽；(B)包含在SEQID NO 2中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的胺基酸 序列，並且具有丙酮酸合酶活性的多肽；(C)包含SEQID NO 4所示的胺基酸序列的多肽；(D)包含在SEQID NO 4中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的胺基酸 序列，並且具有丙酮酸合酶活性的多肽；(E)下述(El)或(E2)的多肽(El)包含SEQ ID NO 57所示的胺基酸序列的多肽；(E2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的氨基 酸序列，並且能夠與至少(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白質復 合體的多肽；(F)下述(Fl)或(F2)的多肽(Fl)包含SEQ ID NO 57所示的胺基酸序列的多肽；(F2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的氨基 酸序列，並且能夠與至少(E)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白質復 合體的多肽；(G)下述(Gl)或(G2)的多肽(Gl)包含SEQ ID NO 57所示的胺基酸序列的多肽；(G2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的氨基 酸序列，並且能夠與至少(E)、(F)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白質復 合體的多肽；(H)下述(Hl)或(H2)的多肽(Hl)包含SEQ ID NO 57所示的胺基酸序列的多肽；(H2)包含在SEQ ID NO 57中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的氨基 酸序列，並且能夠與至少(E)、(F)和(G)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白質複合體的多肽；(I)下述(Il)或(12)的多肽(Hl)包含SEQ ID NO 65所示的胺基酸序列的多肽；(H2)包含在SEQ ID NO 65中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的氨基 酸序列，並且能夠與至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 質複合體的多肽；(J)下述(Jl)或(J2)的多肽(Jl)包含SEQ ID NO 67所示的胺基酸序列的多肽；(J2)包含在SEQ ID NO 67中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的氨基 酸序列，並且能夠與至少(E)、(F)、(G)和(H)的多肽一起形成具有丙酮酸合酶活性的蛋白 質複合體的多肽。
7.權利要求4或5所述的微生物，其中，所述編碼丙酮酸合酶的基因包含下述(a) (d)中任一項的DNA,或下述(e)、(f)、(g)和(h)的DNA,或下述(e)、(f)、(g)、(h)、⑴和 (j)的 DNA (a)具有SEQID NO 1所示的鹼基序列的DNA ；(b)與SEQID NO :1所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的探針在 嚴格條件下雜交，並且編碼具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA ；(c)具有SEQID NO 3所示的鹼基序列的DNA ；(d)與SEQID NO :3所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的探針在 嚴格條件下雜交，並且編碼具有丙酮酸合酶活性的多肽的DNA ；(e)下述(el)或(e2)的DNA (el)具有SEQ ID NO 56所示的鹼基序列的DNA ；(e2)與SEQ ID NO :56所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的探針 在嚴格條件下雜交，並且能夠與至少(f)、(g)、以及(h)所示的DNA —起編碼具有丙酮酸合 酶活性的蛋白質複合體的DNA ；(f)下述(fl)或(f2)的DNA (Π)具有SEQ ID NO 58所示的鹼基序列的DNA ；(f2)與SEQ ID NO :58所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的探針 在嚴格條件下雜交，並且能夠與至少(e)、(g)、以及(h)所示的DNA —起編碼具有丙酮酸合 酶活性的蛋白質複合體的DNA ；(g)下述(gl)或(g2)的DNA (gl)具有SEQ ID NO 60所示的鹼基序列的DNA、(g2)與SEQ ID NO :60所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的探針 在嚴格條件下雜交，並且能夠與至少(e)、(f)、以及(h)所示的DNA —起編碼具有丙酮酸合 酶活性的蛋白質複合體的DNA ；(h)下述(hi)或(h2)的DNA (hi)具有SEQ ID NO 62所示的鹼基序列的DNA、(h2)與SEQ ID NO :62所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的探針 在嚴格條件下雜交，並且能夠與至少(e)、(f)、以及(g)所示的DNA —起編碼具有丙酮酸合酶活性的蛋白質複合體的DNA ； ⑴下述(il)或( 2)的DNA: (hi)具有SEQ ID NO 64所示的鹼基序列的DNA ；(h2)與SEQ ID NO :64所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的探針 在嚴格條件下雜交，並且能夠與至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA—起編碼具有丙酮酸 合酶活性的蛋白質複合體的DNA ； (j)下述(jl)或(j2)的 DNA: (jl)具有SEQ ID NO 66所示的鹼基序列的DNA ；(j2)與SEQ ID NO :66所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的探針 在嚴格條件下雜交，並且能夠與至少(e)、(f)、(g)和(h)所示的DNA—起編碼具有丙酮酸 合酶活性的蛋白質複合體的DNA。
8.權利要求4或5所述的微生物，其中，編碼丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因編碼下 述㈧或⑶所示的多肽(A)包含SEQID NO 6所示的胺基酸序列的多肽；(B)包含在SEQID NO 6中取代、缺失、插入或添加1個或數個胺基酸而得到的胺基酸 序列，並且具有丙酮酸NADP+氧化還原酶活性的多肽。
9.權利要求4或5所述的微生物，其中，編碼丙酮酸NADP+氧化還原酶的基因包含下 述(a)或(b)的 DNA (a)具有SEQID NO 5所示的鹼基序列的DNA ；(b)與SEQID NO :5所示的鹼基序列的互補序列或與能夠由該鹼基序列製備的探針在 嚴格條件下雜交，並且編碼具有丙酮酸NADP+氧化還原酶活性的多肽的DNA。
10.權利要求1或權利要求2 7中任一項所述的微生物，其經過修飾而增強了鐵氧還 蛋白-NADP+還原酶的活性。
11.權利要求1、權利要求2 7或權利要求10中任一項所述的微生物，其經過修飾而 提高了產生鐵氧還蛋白或黃素氧還蛋白的能力。
12.權利要求1 11中任一項所述的微生物，其經過修飾而降低了蘋果酸酶的活性。
13.權利要求1 12中任一項所述的微生物，其經過修飾而降低了丙酮酸脫氫酶活性。
14.權利要求1 13中任一項所述的微生物，其經過修飾從而能夠以需氧方式同化乙醇。
15.權利要求1 14中任一項所述的微生物，其中，所述微生物是屬於選自埃希氏菌 屬、腸桿菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬中的屬的細菌。
16.權利要求15所述的微生物，其中，該微生物的NAD型蘋果酸酶和NADP型蘋果酸酶 二者的活性均已降低。
17.權利要求1 14中任一項所述的微生物，其中，所述微生物為棒狀桿菌型細菌。
18.—種生產L-胺基酸的方法，其中，在培養基中培養權利要求1 17中任一項所述 的微生物，使該培養基中或菌體內生成並蓄積選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-苯 丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸中的L-胺基酸，並從該培養基或菌 體收集L-胺基酸。
19.權利要求18所述的方法，其中，所述培養基的特徵在於含有乙醇或脂肪酸作為碳源。
全文摘要
在培養基，例如包含乙醇或脂肪酸作為碳源的培養基中培養具有選自L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸和L-絲氨酸中的L-胺基酸的生產能力、且經過修飾而增加了丙酮酸合酶或丙酮酸NADP+氧化還原酶的活性的微生物，使該培養基中或菌體內生成並蓄積所述L-胺基酸，並從該培養基或菌體採集L-胺基酸。
文檔編號C12P13/06GK101939412SQ200880105639
公開日2011年1月5日 申請日期2008年9月3日 優先權日2007年9月4日
發明者伊裡納·B·奧爾特曼, 勞尼德·R·普蒂辛, 塔蒂亞納·A·亞姆波爾斯卡亞, 寺下優, 松井和彥, 納塔利亞·S·厄米納, 納塔利亞·V·斯託諾瓦, 臼田佳弘 申請人:味之素株式會社