吡啶並[2,3－d]嘧啶和嘧啶並[4,5－d]嘧啶核苷的製作方法

2023-05-15 22:19:16 2

專利名稱：吡啶並[2,3－d]嘧啶和嘧啶並[4,5－d]嘧啶核苷的製作方法
本申請要求2000年7月6日提交的美國臨時申請號60/216,418的權益，該申請通過引用全部結合到本文中。
而且，核苷類似物還可以以非DNA和/或RNA的合成的方式幹擾細胞。例如，一些核苷類似物可引起癌細胞的編程性細胞死亡，或抑制某些非聚合酶的酶。然而在另外的選擇性的生物作用中，已知一些核苷類似物可調節免疫系統。核苷類似物的生物作用的典型實例包括5-氟尿苷對胸苷酸合酶的抑制，或2-氯腺苷對腺苷脫氨基酶的抑制。另外的實例包括planocin A對S-腺苷基高半胱氨酸水解酶(hydrolasene)的抑制。
可是，不幸的是，大多數抑制腫瘤生長或病毒感染的已知核苷類似物也意味著威脅正常的哺乳動物細胞，主要是因為此類類似物在正常細胞和病毒或腫瘤細胞之間缺少足夠的選擇性。因此，還需要提供具有改良的特異性和降低的毒性的核苷類似物的方法和組合物。
更具體地說，本發明提供具有按照式(I)結構的核苷 其中A為O、S、CH2；R2、R2′、R3和R3′獨立選自H、F、OH、NH2、CN、N3、CONH2和R，其中R為低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基或低級醯基，並且任選含有至少一個雜原子和官能團；或R2和R2′一起，或R3和R3′一起選自＝CH2、＝CHR″、＝CR″2、＝NR″，其中R″為H、F、OH、CN、N3、CONH2、低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基或低級醯基；R4和R5′獨立選自H、低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基或芳烷基，並任選含有至少一個雜原子和一個官能團；R5為H、OH、OP(O)(OH)2、P(O)(OH)2、OP(O)(OR)2或P(O)(OR)2，其中R為掩蔽基團；而B選自式(II)、(III)、(IV)和(V)的雜環基團 其中X為H、NH2或OH；Y為H、NH2或滷素；在式(II)和(IV)中的Z1，和在式(III)和(V)中的Z3為O、S、NR″、CHM或CM2；在式(III)和(V)中的Z1，和在式(II)和(IV)中的Z3為N、CH或CM；Z2為N、CH或CM；其中M為F、Cl、Br、OH、SH、NH2、CN、COOR″、C(＝NH)NH2、低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基、芳烷基或芳基。
在一個特別優選的方面中，所述核苷類似物具有按照式(VI)的結構 在本發明主題的其它設計方面，所述核苷類似物可以被修飾形成各自的藥物前體，並且特別設計的修飾包括在糖部分的C5位上的磷酸化作用或加上膦酸基團、在糖部分上的羥基基團的修飾和在核酸鹼(nucleobase)上的氨基基團上的修飾。特別優選在靶室、靶細胞或靶器官中由設計的化合物脫除這些修飾物。
在本發明主題的另外一個方面，抑制腫瘤細胞生長的方法包括將按照式(I)的設計的化合物給予一個系統，優選為哺乳動物，而更優選為人類的步驟。特別設計的腫瘤細胞包括結腸癌細胞、乳腺癌細胞、黑素瘤細胞、神經膠質瘤細胞和前列腺癌細胞。另外設計所述生長抑制包括抑制RNA聚合酶I、RNA聚合酶II和/或RNA聚合酶III，和/或誘導編程性細胞死亡，所述編程性細胞死亡至少部分由MEK-磷酸化作用觸發。
圖譜簡述

圖1為描述一種示例性設計的化合物對各種癌細胞的細胞毒性的比較圖。
圖2為描述示例性設計的化合物抑制各種癌細胞增殖的比較圖。
圖3為描述示例性設計的化合物在各種癌細胞中的抗-促克隆形成的活性的比較圖。
圖4A和4B為描述示例性設計的化合物在各種癌細胞中誘導死亡的比較圖。
圖5為描述示例性設計的化合物抑制K562細胞RNA合成的圖。
圖6為描述示例性設計的化合物抑制RNA聚合酶IIII的圖。
圖7為描述示例性設計的化合物抑制RNA聚合酶II的柱圖。
圖8為描述示例性設計的化合物引起的MEK-ERK磷酸化作用的放射性自顯影圖。
本發明詳述預期化合物通常設計按照本發明主題的化合物具有按照式(I)的結構 其中A為O、S、CH2；R2、R2′、R3和R3′獨立選自H、F、OH、NH2、CN、N3、CONH2和R，其中R為低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基或低級醯基，並且任選含有至少一個雜原子和官能團；或R2和R2′一起，或R3和R3′一起選自＝CH2、＝CHR″、＝CR″2、＝NR″，其中R″為H、F、OH、CN、N3、CONH2、低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基或低級醯基；R4和R5′獨立選自H、低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基或芳烷基，並任選含有至少一個雜原子和官能團；R5為H、OH、OP(O)(OH)2、P(O)(OH)2、OP(O)(OR)2或P(O)(OR)2，其中R為掩蔽基團；而B選自式(II)、(III)、(IV)和(V)的雜環基團 其中X為H、NH2或OH；Y為H、NH2或滷素；在式(II)和(IV)中的Z1，和在式(III)和(V)中的Z3為O、S、NR″、CHM或CM2；在式(III)和(V)中的Z1，和在式(II)和(IV)中的Z3為N、CH或CM；Z2為N、CH或CM；其中M為F、Cl、Br、OH、SH、NH2、CN、COOR″、C(＝NH)NH2、低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基、芳烷基或芳基。
在本發明主題的一個優選方面，設計的化合物具有按照式(II)的雜環基團，A為核苷類似物的糖部分中的氧，而更優選在此核苷類似物中X為NH2，Z1為O，而Z2和Z3為CH。同時不限制本發明的主題，還進一步優選在該糖部分R4和R5′為氫，而R5為OH。
另外在本發明主題的特別優選的方面，設計的核苷類似物具有按照式(VI)的結構 關於設計的化合物的立體化學構型，應該理解，所述糖不需要限制於D-構型，而且也可以為L-構型。類似地，設計適宜的分子可包括一個或多個手性中心，它們可為對映體純的(即為R-或S-構型)或為外消旋混合物(即為R-和S-構型)。同樣，其中取代基(如鹼或OH基團)可以定向在α-或β-位，兩個位置均被考慮。
而且，應該理解，設計的化合物可以修飾為它們的對應的藥物前體。當在此使用時，術語「藥物前體」指設計的化合物的任意修飾，(a)改變設計的化合物的分子量和/或(b)改變設計的化合物對靶細胞和非靶細胞的生物有效性。例如，通過設計的化合物的羥基基團與有機酸的酯化作用(從而改變分子量，但是不必要改變對靶細胞的生物有效性)可以製備藥物前體。另一方面，設計化合物可以轉化為包括環狀膦酸酯的藥物前體(從而增加對肝細胞的生物有效性)。
此外，應該特別注意到，設計的化合物的藥物前體形式在靶器官、靶細胞或靶室(或在任何非靶環境中)可以全部或部分再轉化為設計的化合物。再轉化可以包括各種機制，而特別設計的機制為酶轉化、氧化和/或還原。
也可以應用藥物前體以便增加設計的化合物對靶器官、靶細胞或靶室的特異性。例如，設計的化合物可以與膽固醇(或膽固醇衍生物)偶合以便增加設計的化合物在肝-膽循環中的濃度。作為選擇，設計的化合物可以偶合在一種化合物上，該化合物在靶細胞上具有相應的受體，從而增加設計化合物在靶細胞上或靶細胞內的濃度。在另一個實例中，設計的化合物可以與一種核易位信號偶合以便增加設計的化合物在細胞核內的濃度。
另外，可以應用藥物前體以便減少設計的化合物在非靶器官、非靶細胞或非靶室的聚集。例如，可以修飾設計的化合物，以便當將此類化合物修飾為藥物前體時，非靶細胞吸收設計的化合物的速率將顯著降低。因此，尤其當設計的化合物對非靶細胞呈現細胞毒性時，可以應用藥物前體以便降低設計的化合物在除了靶細胞或靶器官之外的細胞或器官中的細胞毒性。
另外在本發明主題的其它設計方面，適宜的化合物可以與藥理學上的活性或非活性部分共價偶合。例如，藥理學上的活性部分包括抗腫瘤細胞的藥物如抗代謝劑(如噴司他丁TM)、DNA聚合酶抑制劑(如GemzarTM)、RNA聚合酶抑制劑(如ECydTM)、鉑衍生物(如ParaplatinTM)、抗雌激素劑(如NolvadexTM)、Taxanes(如TaxotereTM)、GnRH類似物(如LupronTM)、DNA聚合酶抑制劑(如GemzarTM)、拓撲異構酶抑制劑(如HycamptinTM)、雙膦酸酯(如ArediaTM)、生長激素釋放抑制因子(如SandostatinTM)、幹擾素(如IntronATM)、核苷類似物(如利巴韋林TM)，和IMPDH-抑制劑(如噻唑呋林TM)。
藥理學上的非活性部分包括生物學的或非生物學的部分。例如，其中的靶特異性是特別需要的，設計的化合物可以與一種抗體、抗體碎片或合成的抗體(如scFv)偶合。在另外的實例中，設計的化合物可以與一種螯合劑偶合(如結合一种放射性核酸金屬化合物)。作為選擇，特別優選延長血清半衰期或降低免疫原性，設計的化合物可以與惰性的或可生物降解的聚合物(如右旋糖苷、聚乙二醇等)偶合。
至於將設計的化合物與其它部分偶合的方法，認為所有已知的偶合方法是適宜的並且尤其包括共價偶合(具有或不具有單獨的接頭分子)、氫鍵合和疏水的/親水的相互作用。
在本發明主題的另一方面，設計的化合物也可以為它們的各自的鹽的形式，其中所述鹽可以為一種有機或無機酸或鹼的鹽(如乙酸鹽或嗎啉代鹽，HCl鹽)。在本領域已知有許多藥理學上可接受的鹽，所有這些已知的鹽被認為是適宜與在此提出的相關技術結合使用。
設計的化合物的合成修飾的呋喃核糖的合成以下示例性方案顯示一些設計的化合物的合成途徑。按照一種公開的方法(Jones等，碳水化合物化學的方法(Methods in CarbohydrateChemistry)(Whistler和Moffat編輯)VI卷，315-322頁，Academic Press，New York，(1972))製備的化合物1用多種親核試劑如格利雅試劑處理得到2，使2苯甲醯化或乙醯化，隨後用三氟乙酸處理，得到化合物4。在硫酸的存在下，進行苯甲醯化，隨後用乙酸酐/乙酸處理，得到化合物6，使用化合物6與吡啶並[2，3-d]嘧啶或嘧啶並[4，5-d]嘧啶鹼縮合。 6aR＝Me 6bR=乙炔基 6cR=乙烯基 6dR＝烯丙基將化合物2a(5(R)-C-甲基衍生物)轉化為磺酸酯7，使磺酸酯7進行親核取代得到構型上轉化的化合物8。使該異亞丙基去保護和接著乙醯化得到四乙酸酯9。 在氫氧化鈉水溶液中用甲醛處理化合物1得到4』-羥基甲基衍生物10，選擇性地保護化合物10得到化合物11。
隨後用DMT保護並除去TBS得到化合物13，化合物13可轉化為多種取代物。使該4-C-取代的衍生物進行與5-C-取代的呋喃核糖類似的轉化，可轉化為化合物17，化合物17可用於與核苷鹼縮合。 aR＝甲基 bR＝乙烯基 cR＝乙基 dR＝HOCH2將化合物13轉化為18，使化合物18進行維悌希(Wittig)反應得到19。19經鈀氫化得到20。將化合物13轉化為4-C-苯氧基硫代羰氧基甲基衍生物21，使21與三(三甲基甲矽烷基)矽烷(9.0ml，29mmol)反應，然後與1，l，-偶氮二(環己基腈)反應得到22。 其中設計的化合物含有在C4′或C5′位上沒有修飾的糖部分(如L-呋喃核糖，2′-羥基-2′-乙炔基-L-呋喃核糖)，按照本領域熟知的方法進行相應的保護的糖部分(以D-或L-構型)的縮合。
修飾的吡啶並嘧啶核苷的合成由甲矽烷基化的吡啶並[2，3-d]嘧啶鹼與適當保護的，修飾的呋喃核糖縮合製備5′-取代的核苷類似物。以下方案顯示4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶25的合成。按照報導的方法(Archive der Pharmazie 1985，318，481-486)製備的化合物23與氯三甲基矽烷和碘化鈉在乙腈中回流得到24，使24與乙酸甲脒在回流下反應得到化合物25。 以下方案顯示吡啶並[2，3-d]嘧啶25與修飾的呋喃核糖6和17的縮合。用雙(三甲基甲矽烷基)乙醯胺處理化合物25得到甲矽烷基化的吡啶並嘧啶，使該化合物與6或17反應得到26或28。除去苯甲醯基分別得到吡啶並[2，3-d]嘧啶核苷27和29。
R＝甲基，乙基，乙烯基，丙基，烯丙基，羥基甲基其它糖-修飾的吡啶並嘧啶或嘧啶並嘧啶核苷可以通過核苷鹼和修飾的糖的縮合或通過核苷的修飾進行製備。例如，通過類似於對2′-脫氧腺苷所描述的方法，將4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶核糖核苷(27或29R＝H)轉化為2′-脫氧衍生物30，並通過縮合製備4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶木糖苷34。 通過Vorbrüggen反應使4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶與各種1-O-乙醯化戊糖縮合。所述核苷經進一步衍生化提供另外一類吡啶並[2，3-d]嘧啶核苷。
修飾的嘧啶並嘧啶核苷的合成由甲矽烷基化的嘧啶並[4，5-d]嘧啶鹼與適當保護的、修飾的呋喃核糖縮合製備5′-取代的核苷類似物。按照基本類似於上述合成方法的方案合成嘧啶並[4，5-d]嘧啶核苷。
根據用於將糖部分偶合到吡啶並[2，3-d]嘧啶或嘧啶並[4，5-d]嘧啶鹼上的縮合反應的反應條件，可以將對應的核苷類似物連接在所述鹼的N1或N8原子上。在任何情況下，所述鹼的糖基化位置通過X-射線晶體結構確定。
設計的化合物的用途通常應該認識到，設計的化合物可以用於對給予設計的化合物呈正反應的系統的任何處理或治療。可是，特別優選所設計的化合物可用於抗腫瘤治療和抗病毒治療(作為一種直接的抗病毒化合物和/或間接的抗病毒化合物)，以及用於調節免疫系統的治療。
抗腫瘤的治療一般預期按照本發明主題的化合物可以用作抗腫瘤劑，它們可直接或間接抑制腫瘤細胞或細胞群的生長、侵入和/或擴散。特別設計的一種治療腫瘤疾病患者的方法包括以抑制腫瘤細胞生長的有效劑量的設計的化合物給予患者的步驟，並且特別優選的化合物為按照式(VI，見上文)的化合物。設計的劑量在0.01-100mg/kg之間的範圍內，而更優選在5-50mg/kg之間。然而，也設計了可供選擇的劑量、途徑、時間進度表和製劑，並且適宜的其它給藥方法描述如下。同時設計的化合物的用途不限於一種具體的腫瘤細胞或腫瘤疾病，特別提及的腫瘤細胞包括結腸癌細胞、乳癌細胞、黑素瘤細胞、神經膠質瘤細胞，和前列腺癌細胞。
抗病毒治療通常考慮到按照本發明主題的化合物在病毒感染中可以用作直接和/或間接的抗病毒劑。特別設計了一種治療病毒感染患者的方法，該方法包括以抑制病毒傳播(即包圍宿主細胞的過程，其中一種或一種以上的病毒引起宿主細胞產生一種或多種病毒複製體，其中術語「產生」指核苷酸合成、蛋白質處理和蛋白質裝配)的有效劑量的設計的化合物給予患者的步驟，並且其中組合物包含至少一種所設計的化合物。設計的劑量在0.1-100mg/kg之間的範圍內，更優選在5-50mg/kg之間。然而，也設計了可供選擇的劑量、途徑、時間進度表和製劑，並且適宜的其它給藥方法描述如下。同時設計的化合物的用途不限於在一種具體的病毒感染中的具體病毒。特別提及的病毒感染為HIV感染、HCV感染、HBV感染、RSV感染、流感病毒感染和副流感病毒感染。
免疫調節通常考慮到按照本發明主題的化合物可用作免疫調節化合物，並且特別設計了此類化合物可用於調節免疫活性細胞(即T-細胞)對攻擊的1型反應和2型反應之間的平衡。更具體地說，設計了按照本發明主題的化合物相對於2型反應可以增加1型反應(通過增加1型反應或通過降低2型反應)，可是，也設計了本發明主題的化合物相對於1型反應而言可以增加2型反應(通過增加2型反應或通過減少1型反應)。另外還設計了按照本發明主題的化合物的用途，應該理解，設計的化合物以抑制1型和2型反應的有效濃度也可以用作免疫抑制劑。
設計的化合物的給藥方法關於設計的化合物的給藥方法，應該理解，可以在任意適宜的方案下以任意適宜的藥用製劑給予所述化合物。可是，一般優選口服給予設計的化合物。在本發明主題的另一方面，應該理解，各種可供選擇的給藥方法也是適宜的，並且還應該進一步認識到，一種特別的給藥方法通常取決於設計的化合物的化學穩定性、生物利用度、劑量、製劑和/或所需要的藥代動力學/藥效學性質。因此，適宜的給藥方法將包括口服給藥(如片劑、糖漿劑等)、局部傳遞(如軟膏劑、噴霧劑、乳膏等)、胃腸外體系傳遞(如吸入)和直接或間接傳遞到血流中(如靜脈或肌內注射等)。
因此，設計的化合物的製劑可以在很大程度上變化。例如，所述藥物或藥物組合物呈現足夠的穩定性，以便通過胃腸道系統而沒有不需要的化學修飾或酶修飾，口服製劑可以包括糖漿劑、片劑、膠囊劑(gel caps)、散劑等。另一方面，設計的化合物經過胃腸道進入血流的吸收或通過是一個問題，適宜的製劑特別包括可注射的溶液或懸浮液(如約7.2-7.5的pH的緩衝生理鹽水溶液)。
關於設計的化合物的劑量，應該理解，各種劑量是適當的，典型的設計劑量在0.1mg/kg到幾個100mg/kg的範圍內，甚至更多。例如，當設計的化合物以相對低的速率排洩或代謝，或需要長期的治療時，典型的劑量在0.5mg-10mg/kg之間的範圍內。另一方面，當設計的藥物的生物利用度相對低，或當代謝作用的轉化相對快時，典型的劑量將在10mg-100mg/kg之間的範圍內。
關於設計的化合物的劑量，應該理解，至少按照本發明主題的一些化合物在體內可以被磷酸化。因此，尤其是當需要瞬間生物利用度時，可以減少以磷酸化形式給予設計的化合物的劑量。
給藥的時間表可以在很大程度上變化，並且設計的時間表包括在整個治療過程中的單一劑量、在整個治療過程中每日多個單一劑量、每日多個劑量和至少部分治療過程持久給藥(如持續輸注、植入滲透泵等)。通常優選適宜的時間表持續恆定地傳遞設計的化合物，脈衝傳遞(即至少一次首次劑量給藥後，隨後以比首次劑量較低的劑量多次給藥)，這也是適宜的。關於治療持續時間，可以認為，適宜的持續時間可以在單次給藥和數天、數周、數年，甚至更長的時間之間變化。例如，當設計的化合物用於細胞培養時，單次給藥，或相對短時間的給藥可能是足夠的。另一方面，當給予設計的化合物治療一種急性期疾病時，適宜的治療持續時間可以在幾天和幾周之間。類似地，通過給予設計的化合物治療慢性疾病，延長給藥一年或多年可能是適宜的。
在本發明主題的另一個選擇的方面，設計的化合物可以與其它的藥用活性物質聯合以有助於治療各種疾病，特別是腫瘤疾病。其它的藥用活性物質可以分開給藥或一起給藥，並且當分開給藥時，可以以任意的順序同時或分別給藥。具體地說，其它的預期的藥用活性物質包括通常用作癌症治療的化療劑的藥物和免疫調節的物質。例如，化療劑包括抗代謝劑(如噴司他丁TM)、DNA聚合酶抑制劑(如GemzarTM)、RNA聚合酶抑制劑(如ECydTM)、鉑衍生物(如ParaplatinTM)、抗雌激素劑(如NolvadexTM)、Taxanes(如TaxotereTM)、GnRH類似物(如LupronTM)、DNA聚合酶抑制劑(如GemzarTM)、拓撲異構酶抑制劑(如HycamptinTM)、雙膦酸酯(如ArediaTM)、生長激素釋放抑制因子(如SandostatinTM)、核苷類似物(如利巴韋林TM)，和IMPDH-抑制劑(如噻唑呋林TM)。設計的免疫調節物質包括細胞因子(如幹擾素α和γ、IL2、IL4、IL6、IL8、IL10和IL12)，細胞分裂素(如激動素)和趨化因子(如MIP-1)。
合成製備2，3-O-異亞丙基-5(R，S)-C-乙炔基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖在氬氣下，於-42℃，向攪拌的4-C，5-O-二脫氫-2，3-O-異亞丙基-β-D-甲基呋喃核糖苷(Jones等，碳水化合物化學的方法第1卷，315-322頁(1972)，4.00g，19.78mmol)的無水THF(20ml)溶液中滴加入溴化乙炔基鎂(0.5M在THF中，80ml，40mmol)。加完後，將產生的混合物緩慢地溫熱到0℃(～90分鐘)。通過加冰(50g/水(50ml淬滅該反應並攪拌該混合物30分鐘。在用10％乙酸水溶液中和後，用乙酸乙酯提取該混合物兩次。乾燥合併的有機層(Na2SO4)並濃縮。在矽膠上層析(乙酸乙酯-己烷1∶4)得到3.48g標題化合物(R/S比率1∶1)，為一種白色固體。類似地，製備以下化合物從4-C，5-O-二脫氫-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖和溴化甲基鎂製備1-O，5(R)-C-二甲基-2，3-O-異亞丙基-β-D-呋喃核糖；從4-C，5-O-二脫氫-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖和溴化乙烯基鎂製備2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖；從4-C，5-O-二脫氫-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖和溴化烯丙基鎂製備5(R)-C-烯丙基-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖。
製備5-O-乙醯基-1-O，5(S)-C-二甲基-2，3-O-異亞丙基-β-D-呋喃核糖在0℃下，向攪拌的1-O，5(R)-C-二甲基-2，3-O-異亞丙基-β-D-呋喃核糖(7.24g，33.17mmol)的無水吡啶(50ml)溶液中加入甲磺醯氯(3.1ml，39.92mmol)。在室溫下攪拌產生的混合物1小時，冷卻到0℃，加水(1.0ml)淬滅並在室溫下攪拌30分鐘。蒸發溶劑並將殘餘物溶解於乙酸乙酯中，用鹽水洗滌三次，乾燥(Na2SO4)並濃縮。經矽膠層析(30％EtOAc在已烷中)得到8.62g甲基化物，為一種無色的漿狀物。
在氬氣下，於125℃，加熱1-O，5(R)-C-二甲基-2，3-O-異亞丙基-5-O-甲磺醯基-β-D-呋喃核糖(8.62g，29.1mmol)和NaOAc(無水，3.5g，42.5mmol)在無水DMF(350ml)中的攪拌懸浮液4天。蒸發溶劑並使該殘餘物在矽膠上層析(25％EtOAc在已烷中)得到4.0g標題化合物，為一種白色固體。
製備5-脫氧-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖在10℃下，向攪拌的2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(14.2g，70.0mmol)的無水吡啶(250ml)溶液中分批加入(30分鐘以上)對甲苯磺醯氯(19.1g，100mmol)。在室溫下攪拌產生的混合物18小時，冷卻到0℃，加水(5.0ml)淬滅，並在室溫下攪拌30分鐘。蒸發溶劑。將該殘餘物溶解於乙酸乙酯中，用鹽水洗滌三次，乾燥(Na2SO4)並濃縮至幹。經矽膠層析(乙酸乙酯-己烷1∶3)得到24.1g甲苯磺酸酯，為一種白色固體。
向LiAlH4(4.58 g，120.5mmol)在無水乙醚(120ml)中的攪拌懸浮液中加入在乙醚-甲苯(2.5∶1，140ml)中的所述甲苯磺酸酯(13.1g，36.55mmol)。回流所產生的混合物22小時，冷卻到室溫，用乙酸乙酯(25ml)稀釋，加水(5.0ml)淬滅。蒸發該溶劑。將該殘餘物溶解於乙酸乙酯，用鹽水洗滌三次，乾燥(Na2SO4)並濃縮至幹。經矽膠層析(乙酸乙酯-己烷1∶3)得到3.58g標題化合物，為一種無色液體。
製備5(R)-C-烯丙基-5-O-苯甲醯基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖在0℃下，向攪拌的5(R)-C-烯丙基-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(4.49g，18.38mmol)的無水吡啶(40ml)溶液中加入苯甲醯氯(2.7ml，23.0mmol)。在室溫下攪拌產生的混合物18小時，用冰冷卻，加水(1ml)淬滅，並在室溫下攪拌30分鐘。蒸發該溶劑。將該殘餘物溶解於乙酸乙酯中，用鹽水洗滌三次，乾燥(Na2SO4)並濃縮。經矽膠層析(在己烷中的12％乙酸乙酯)得到6.26g5(R)-C-烯丙基-5-O-苯甲醯基-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖，為一種無色的漿狀物。
在0℃下，攪拌5(R)-C-烯丙基-5-O-苯甲醯基-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(6.2g，17.8mmol)在TFA-H2O(9∶1)混合物中的溶液90分鐘並在0℃濃縮至幹。將該殘餘物溶解於甲醇-甲苯混合物(20ml，1∶1)中並濃縮至幹。在矽膠上層析(乙酸乙酯-己烷1∶1)得到3.70g標題化合物，為一種白色固體。類似地，製備以下化合物從5-O-苯甲醯基-5(R，S)-C-乙炔基-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖製備5-O-苯甲醯基-5(R，S)-C-乙炔基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(R/S比率1∶1)；從5-O-苯甲醯基-4-C-苯甲醯氧基甲基-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖製備5-O-苯甲醯基-4-C-苯甲醯氧基甲基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖；從2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖製備5-O-苯甲醯基-1-O-甲基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖。
製備1-O-乙醯基-5(R)-C-烯丙基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-D-呋喃核糖在0℃下，向攪拌的5(R)-C-烯丙基-5-O-苯甲醯基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(3.60mg，11.68mmol)的無水吡啶(80ml)溶液中加入苯甲醯氯(3.0ml，25.84mmol)。在室溫下攪拌產生的混合物18小時，用冰冷卻，加水(1ml)淬滅，在室溫下攪拌30分鐘。濃縮該混合物，用乙酸乙酯稀釋，用鹽水洗滌三次，乾燥(Na2SO4)並濃縮至幹。在矽膠上層析(在己烷中的15％乙酸乙酯)得到5.3g標題化合物，為一種無色的漿狀物。
在0℃下，向5(R)-C-烯丙基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(4.0g，7.74mmol)在乙酸(14ml)和乙酸酐(1.75ml，18.36mmol)中的攪拌溶液中加入濃硫酸(200ul，3.79mmol在4.0ml乙酸中)。在室溫下攪拌產生的混合物20小時，冷卻到0℃，用冷乙酸乙酯稀釋，用水、稀NaHCO3，然後用鹽水洗滌，乾燥(Na2SO4)並濃縮。在矽膠上層析(乙酸乙酯-己烷1∶4)得到2.82g標題化合物(α/β比率1∶2)，一種無色的泡沫狀物。類似地，製備以下化合物從5(R，S)-C-乙炔基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-β-D-甲基呋喃核糖苷製備1-O-乙醯基-5(R，S)-C-乙炔基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-β-D-呋喃核糖(R/S比率1∶1和α/β比率1∶2)；從4-C-苯甲醯氧基甲基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-β-D-甲基呋喃核糖苷製備1-O-乙醯基-4-C-苯甲醯氧基甲基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-D-呋喃核糖(α/β比率1∶3)；從1-O，5(R)-C-二甲基-2，3-O-異亞丙基-β-D-呋喃核糖製備5(R)-C-甲基-1，2，3，5-四-O-乙醯基-β-D-呋喃核糖；從5-O-乙醯基-1-O，5(R)-C-二甲基-2，3-O-異亞丙基-β-D-呋喃核糖製備5(S)-C-甲基-1，2，3，5-四-O-乙醯基-β-D-呋喃核糖；從5-O-乙醯基-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖製備5-脫氧-1，2，3-三-O-乙醯基-β-D-呋喃核糖；從1-O-甲基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖製備1-O-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-5(R)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖。
製備1-O-甲基-5-O-苯甲醯基-4-C-苯甲醯氧基甲基-β-D-呋喃核糖在0℃下，向攪拌的4-C，5-O-二脫氫-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖1(20.22g，100mmol)的二噁烷(380ml)溶液中滴加入甲醛(37％溶液，76ml)，然後加入2M NaOH(188ml)。在室溫下攪拌該產生的混合物20小時，冷卻到0℃，中和(10％乙酸)，濃縮(～50％)並用二氯甲烷提取兩次。合併的有機層經Na2SO4乾燥並濃縮至幹。在矽膠上層析(在氯仿中的4％甲醇)得到20.2g 1-O-甲基-5-O-苯甲醯基-2，3-O-異亞丙基-4-C-苯甲醯氧基甲基-β-D-呋喃核糖，為一種白色固體。
在0℃下，攪拌1-O-甲基-5-O-苯甲醯基-2，3-O-異亞丙基-4-C-苯甲醯氧基甲基-β-D-呋喃核糖(2.0g，4.5mmol)在9∶1(v/v)的三氟乙酸和水的混合物(11ml)中的溶液2小時並蒸發至幹。將該殘餘物溶解於甲醇中並蒸發(3次)，然後溶解於吡啶中並蒸發。使該殘餘物經矽膠層析[在二氯甲烷中的甲醇(0-0.5％)]得到1.7g標題化合物，為一種油狀物。
製備1-O-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-苯甲醯氧基甲基-β-D-呋喃核糖向1-O-甲基-5-O-苯甲醯基-4-C-苯甲醯氧基甲基-β-D-呋喃核糖(1.7g，4.2mmol)的吡啶(14ml)溶液中加入苯甲醯氯(1.2ml，10mmol)。在25℃下，攪拌該反應混合物16小時並加入甲醇(5ml)。蒸發溶劑並將該殘餘物溶解於乙酸乙酯(20ml)和水(10ml)中。有機層經硫酸鈉乾燥，過濾，蒸發濾液至幹。使該殘餘物進行矽膠層析[在二氯甲烷中的甲醇(0-0.5％)]得到2.4g1-O-甲基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-苯甲醯氧基甲基-β-D-呋喃核糖，為一種白色固體。
在0℃下，將硫酸(97％，75ml)加入到1-O-甲基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-(苯甲醯氧基甲基)-β-D-呋喃核糖(1.7g，2.8mmol)在乙酸(6.7ml)和乙酸酐(0.67ml)的混合物中的溶液中。在25℃下，攪拌該反應混合物15小時並用乙酸乙酯(50ml)和水(10ml)稀釋。用鹽水(3次)、飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌該溶液，經硫酸鈉乾燥，過濾，蒸發該濾液至幹。使該殘餘物經矽膠層析[在二氯甲烷中的乙醇(0-2％)]得到1.4g標題化合物，為一種白色固體。
製備4-C-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖在0℃下，將4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(6.0g，18mmol)的吡啶(18ml)溶液加入到攪拌的4-C-羥基甲基-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(3.5g，15mmol)的吡啶(60ml)溶液中。在室溫下攪拌該反應混合物18小時，冷卻到0℃。加入甲醇(6ml)，並在減壓下蒸發溶劑。加入乙酸乙酯和鹽水，並用鹽水洗滌有機提取液，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發至幹。使該殘餘物進行矽膠層析[在己烷中的乙酸乙酯(20-25％)]得到6.2g標題化合物，為一種白色固體。
製備2，3，5-三-O-苯甲醯基-1-O-甲基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖在0℃下，將苯甲醯氯(1.5ml，13mmol)的吡啶(6ml)溶液加入到攪拌的4-C-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(6.2g，12mmoD的吡啶(52ml)溶液中。於室溫下攪拌反應混合物15小時，然後冷卻0℃。加入甲醇(5ml)，並在減壓下蒸發溶劑。加入乙酸乙酯和鹽水，用鹽水洗滌有機提取液，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發至幹。使該殘餘物與甲苯共蒸發並溶解於80％的乙酸水溶液(174ml)中。在室溫下攪拌該反應混合物2小時，然後在減壓下蒸發該溶劑。將該殘餘物進行矽膠層析[在氯仿中的甲醇(1-2％)]以便移去大多數雜質，並將獲得的白色泡沫狀物溶解於乙腈(174ml)中。在0℃下攪拌該溶劑，然後加入N，N-二甲基氨基吡啶(4.3g，35mmol)和苯氧基硫代碳醯氯(2.4ml，17mmol)。在室溫下再攪拌該反應混合物2小時並蒸發溶劑。用二氯甲烷和水溶解該殘餘物，並且用0.5 N鹽酸溶液，然後用水，最後用鹽水洗滌所產生的有機提取液。經硫酸鈉乾燥、過濾並在減壓下蒸發濾液。用甲苯溶解該殘餘物並加入三(三甲基甲矽烷基)矽烷(9.0ml，29mmol)和1，1′-偶氮雙(環己腈)(0.71g，2.9mmol)。在100℃下攪拌該反應混合物15小時，然後冷卻至室溫並在減壓下蒸發溶劑。將該殘餘物進行矽膠層析[在二氯甲烷中的甲醇(1-2％)]以便移去大多數雜質，並將獲得的油狀物溶解於-15℃的三氟乙酸水溶液(90％v/v，21ml)中。在-10℃攪拌該反應混合物1小時，然後在高真空和低溫下蒸發溶劑。使該殘餘物與甲醇共蒸發並經矽膠層析[在二氯甲烷中的甲醇(0-3％)]以便移去大多數雜質。用吡啶(18ml)溶解獲得的油狀物並在0℃攪拌該溶液。加入苯甲醯氯(14ml，12mmol)並在室溫下攪拌該反應混合物16小時，然後冷卻到0℃。加入甲醇並在減壓下蒸發溶劑。將乙酸乙酯、己烷和鹽水加入到該殘餘物中，用硫酸鈉乾燥所產生的有機提取液，過濾並蒸發濾液至幹。使該殘餘物進行矽膠層析[在己烷中的乙酸乙酯(25％)]得到1.8g(32％，6步)標題化合物，為一種漿狀物。
製備1-O-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖在0℃下，將濃硫酸(97％，99ml)加入到2，3，5-三-O-苯甲醯基-1-O-甲基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖(1.8g，3.6mmol)在乙酸(9.0ml)和乙酸酐(0.9ml)的混合物中的溶液中。在25℃攪拌該反應混合物16小時並用乙酸乙酯(50ml)和鹽水(10ml)稀釋。用鹽水(3次)，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌該有機提取液，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發濾液至幹。用乙酸乙酯和己烷(1∶4，v/v)的混合物溶解該殘餘物並且該標題化合物的b端基異構體立即結晶。過濾該白色的晶體得到1.1g(56％)的為純的b端基異構體形式的標題化合物。使濾液進行矽膠層析[在己烷中的乙酸乙酯(20％)]得到0.6g(32％)的標題化合物，為一種油狀物(3∶1的a/b端基異構體混合物)。
製備5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-4-C-羥基甲基-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖在0℃、攪拌下，將叔丁基二甲基甲矽烷基氯(3.4g，23mmol)的吡啶(16ml)溶液加入到4-C-羥基甲基-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(4.5g，19mmol)的吡啶(80ml)溶液中。然後在室溫下攪拌該反應混合物24小時，然後冷卻至0℃。加入水(5ml)並在減壓下蒸發溶劑。加入乙酸乙酯和鹽水，用鹽水洗滌該有機提取液，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發濾液至幹。將該殘餘物溶解於吡啶中並在0℃攪拌該溶液。加入4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(8.4g，25mmol)，並在室溫下攪拌該反應混合物16小時，然後冷卻至0℃。加入甲醇(10ml)並在減壓下蒸發溶劑。加入乙酸乙酯、己烷和鹽水，並用0.5N鹽酸溶液，然後用鹽水洗滌該有機提取液，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發濾液至幹。將該殘餘物溶解於四氫呋喃(57ml)中並加入氟化四丁基銨溶液(TBAF，在四氫呋喃中的1M溶液，23ml)。在室溫下24小時後，加入0.2當量的TBAF並攪拌該混合物另外的36小時。蒸發溶劑並使該殘餘物進行矽膠層析[在己烷中的乙酸乙酯(50％)]得到6.6g(65％，3步)的標題化合物，為一種白色固體。
製備5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-4-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖在5℃、攪拌下，將三氟乙酸(0.49ml，6.4mmol)和吡啶(1.6ml，19mmol)的二甲基亞碸(11ml)溶液加入到5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-4-C-羥基甲基-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(6.9g，13mmol)和N，N′-二環己基碳化二亞胺(6.6g，32mmol)在甲苯(26ml)和二甲基亞碸(66ml)的混合物中的溶液中。然後在室溫下攪拌該反應混合物8小時，然後冷卻至0℃。加入乙酸乙酯(80ml)和草酸(1.8g，19mmol)的甲醇(10ml)溶液，並在室溫下攪拌該反應混合物15小時。過濾沉澱並用己烷和乙酸乙酯的1∶1混合物洗滌。用鹽水、飽和的碳酸氫鈉水溶液洗滌濾液，再用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發濾液至幹。使該殘餘物進行矽膠層析[在己烷中的乙酸乙酯(25％)]得到6.1g(89％)的5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-4-C-甲醯基-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖，為一種白色固體。
在室溫、攪拌下，將五氧化鈉(2.5g，22mmol)的苯(34ml)溶液加入到溴化甲基鏻(8.8g，25mmol)在乙醚中的懸浮液中。在室溫下攪拌該混合物6小時，並加入5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-4-C-甲醯基-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖(6.0g，11mmol)的乙醚(30ml)溶液。在室溫下攪拌產生的混合物18小時，然後冷卻至0℃。加入鹽水(100ml)，隨後加入乙酸乙酯(300ml)。用鹽水洗滌該有機提取液，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發濾液至幹。使該殘餘物進行矽膠層析[在己烷中的乙酸乙酯(25％)]得到5.9g(99％)的標題化合物，為一種白色固體。
製備5-O-苯甲醯基-4-C-乙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖將載於活性炭上的鈀(10％Pd，50％水，508mg)加入到5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2，3-O-異亞丙基-1-O-甲基-4-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖(5.0g，9.4mmol)的甲醇(254ml)溶液中。在6小時期間、在5βsi的氫氣下，振搖該燒瓶並過濾催化劑，用甲醇洗滌。蒸發溶劑，將該殘餘物與吡啶共蒸發。然後將其溶解於吡啶(75ml)中並在0℃下攪拌。加入苯甲醯氯(1.2ml，10mmol)，在室溫下攪拌該反應混合物15小時，然後冷卻至0℃。加入甲醇(5ml)，並在減壓下蒸發溶劑。加入乙酸乙酯、己烷和鹽水，用鹽水洗滌該有機提取液，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發至幹。將該殘餘物與甲苯共蒸發並將其溶解於-15℃的三氟乙酸的水溶液(90％v/v，57ml)中。於-10℃攪拌該反應混合物2小時，然後在高真空和低溫下蒸發該溶劑。將該殘餘物與甲醇共蒸發，形成白色的沉澱。通過過濾移去該沉澱並且將含有該標題化合物的濾液蒸發至幹，並溶解於乙酸乙酯、己烷和鹽水中。用飽和的碳酸氫鈉水溶液、鹽水洗滌該有機提取液，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發該濾液至幹。使該殘餘物進行矽膠層析[在己烷中的乙酸乙酯(33％)]得到1.8g(63％，3步)的標題化合物，為一種油狀物。
製備1-O-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-乙基-β-D-呋喃核糖在0℃、攪拌下，將苯甲醯氯(1.5ml，13mmol)加入到5-O-苯甲醯基-4-C-乙基-1-O-甲基-β-D-呋喃核糖的吡啶(41ml)溶液中，並字室溫下攪拌該反應混合物18小時，然後冷卻至0℃。加入甲醇(5ml)，並在減壓下蒸發溶劑。加入乙酸乙酯、己烷和鹽水，用0.5N鹽酸溶液，然後用鹽水洗滌有機提取液，經硫酸鈉乾燥、過濾並蒸發至幹。將該殘餘物與甲苯共蒸發並將其溶解於乙酸(14ml)和乙酸酐(1.5ml)的混合物中。在5℃下，加入用乙酸(1ml)稀釋的硫酸(97％，165ml)。在25℃下攪拌該反應混合物4小時並用乙酸乙酯(50ml)和鹽水(10ml)稀釋。用鹽水(3次)、飽和的碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌該有機提取液，經硫酸鈉乾燥，過濾並將濾液蒸發至幹。使該殘餘物進行矽膠層析[在二氯甲烷中的乙酸乙酯(0-3％)]得到2.9g(92％)的標題化合物，為一種油狀物(2∶1的b/a端基異構體混合物)。
製備4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶將三甲基甲矽烷基氯(7.6ml，60mmol)加入到2-氨基-3-氰基-4-甲氧基-吡啶(Archiv der Pharmazie 1985，318，481-486；7.5g，50mmol)和碘化鈉(7.50g，50mmol)在乙腈(225ml)中的攪拌懸浮液中。在回流下加熱產生的混合物24小時。過濾沉澱並用乙酸乙酯洗滌，得到10.4g呈褐色的粉末(2-氨基-3-氰基-4-氧代-吡啶)。在減壓下乾燥該粉末，並將其懸浮在2-乙氧基乙醇(300ml)中。加入乙酸甲脒(31.2g，300mmol)，並在回流溫度下加熱該懸浮液2天，然後過濾。將該獲得的灰色殘餘物溶解於2∶1沸騰的乙酸和水的混合物中並加入木炭。過濾該黑色的懸浮液並蒸發該濾液至幹，得到一種白色固體，將該固體懸浮在熱的碳酸氫鈉飽和水溶液中。過濾該懸浮液得到4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶(2.0g)，為一種白色固體。
製備4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶將4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶(0.23g，1.4mmol)懸浮在1，2-二氯乙烷(20ml)中並在55℃攪拌該混合物。加入BSA(0.87ml，3.5mmol)，在回流溫度下攪拌該反應混合物90分鐘，然後冷卻到40℃。將在1，2-二氯乙烷(3ml)中的1-O-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖(0.60g，1.2mmol)和TMSOTf(0.42ml，2.3mmol)加入到該澄清的溶液中，並在100℃攪拌該混合物48小時。將該混合物冷卻到室溫並加入飽和的碳酸氫鈉水溶液。用乙酸乙酯(100ml)稀釋該混合物並用鹽水洗滌該有機提取液，經硫酸鈉乾燥，過濾並蒸發濾液至幹。使該殘餘物進行矽膠層析[在二氯甲烷中的丙酮(15-25％)]得到0.30g(41％)標題化合物(為一種白色固體)和0.14g(19％)4-氨基-5-氧代-1-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶(一種白色固體)。類似地，製備以下化合物由4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶和1-O-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-苯甲醯氧基甲基-β-D-呋喃核糖製備4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-苯甲醯氧基甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶，為一種白色的固體；由4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶和1-O-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖製備4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-5R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶，為一種白色的固體；由4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶和1-O-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-β-L-呋喃核糖製備4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-β-L-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶，為一種白色的固體；由4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶和1-O-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-β-D-呋喃核糖製備4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶，為一種白色的固體；由4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶和1-O-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖製備4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶，為一種白色的固體；由4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶和1-O-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖製備4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶，為一種白色的固體；由4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶和1-O-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-乙基-β-D-呋喃核糖製備4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶，為一種白色的固體；由4-氨基-5-氧代-吡啶並[2，3-d]嘧啶和1-O-乙醯基-2，3，5-三-O-苯甲醯基-5(R，S)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖製備4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-5(R，S)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶，為一種白色的固體。
製備4-氨基-5-氧代-8-(4-C-羥基甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶在25℃下，在一個密封的燒瓶中攪拌4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-苯甲醯氧基甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶(0.82g，1.1mmol)的甲醇氨(在0℃飽和)溶液15小時。蒸發溶劑，並使該殘餘物進行矽膠層析[在二氯甲烷中的甲醇(30％)]得到0.36g(41％)標題化合物，一種白色固體。類似地，製備以下化合物從4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶製備4-氨基-5-氧代-8-(5(R)-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶；從4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶製備4-氨基-5-氧代-8-(5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶；從4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶製備4-氨基-5-氧代-8-(5(R，S)-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶；從4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-5(R，S)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶製備4-氨基-5-氧代-8-(5(R，S)-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶；從4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶製備4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶；從4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-β-L-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶製備4-氨基-5-氧代-8-(β-L-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶；從4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶製備4-氨基-5-氧代-8-(4-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶；從4-氨基-5-氧代-8-(2，3，5-三-O-苯甲醯基-4-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶製備4-氨基-5-氧代-8-(4-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶。
製備4-氨基-5-氧代-8-(5(R，S)-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶將載於活性炭上的鈀(10％Pd，200mg加入到4-氨基-5-氧代-8-(5-C-乙炔基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶(0.14g，0.45mmol)的甲醇(50ml)溶液中。在2小時期間，在3psi的氫氣下振搖該燒瓶，過濾催化劑並用甲醇洗滌。蒸發該溶劑，並使該殘餘物進行矽膠層析[在二氯甲烷中的甲醇(10％)]得到0.12g標題化合物，為一種白色固體。類似地，製備以下化合物從4-氨基-5-氧代-8-(5(R)-C-烯丙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶製備4-氨基-5-氧代-8-(5(R)-C-丙基-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶。
製備4-氨基-5-氧代-8-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶在室溫下攪拌4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶(1.8g，6.20mmol)和1，3-二氯-1，1，3，3-四異丙基二矽氧烷(2.15ml，6.73mmol)在無水吡啶(25ml)中的反應混合物20小時並用冰冷卻。加入水(0.5ml)，並在環境溫度下攪拌該混合物30分鐘並濃縮。將該殘餘物溶解於乙酸乙酯中，用稀的碳酸氫鈉洗滌，經硫酸鈉乾燥並濃縮。在矽膠上層析(EtOAc-己烷3∶2)得到2.0g的4-氨基-5-氧代-8-[3，5-O-(1，1，3，3-四異丙基二甲矽烷氧基)-β-D-呋喃核糖基]吡啶並[2，3-d]嘧啶。
向4-氨基-5-氧代-8-[3，5-O-(1，1，3，3-四異丙基二甲矽烷氧基)-β-D-呋喃核糖基]吡啶並[2，3-d]嘧啶(650mg，1.21mmol)和DMAP(295mg，2.42mmol)的乙腈(10ml)溶液中加入氯硫代甲酸苯酯(185ml，1.33mmol)。在室溫下攪拌該混合物2小時並濃縮至幹。將該殘餘物溶解於氯仿中，用水洗滌，乾燥(硫酸鈉)並濃縮。在真空下乾燥該殘餘物30分鐘，然後溶解於甲苯(10ml)中。加入1，1′-偶氮二(環己腈)(74mg，0.30mmol)，向產生的溶液中鼓泡通入氬氣30分鐘。加入三(三甲基甲矽烷基)矽烷(0.56ml，1.82mmol)並在80℃攪拌該產生的混合物2小時，然後在105℃過夜。蒸發溶劑並將殘餘物溶解於THF(5ml)中。加入TBAF(在THF中1.0M，2.5ml)，在室溫下放置該產生的溶液2小時並濃縮。在矽膠上層析(在二氯甲烷中的10％MeOH)得到240mg的標題化合物。
體外/體內實驗除非另外說明，用4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶進行以下實驗。
測定EC50用各種濃度的4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶孵育癌細胞至少24小時並測定EC50。表1給出4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶在nM濃度時的體外活性。
設計的化合物，尤其是4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶的較高功效在一系列的實驗中得到進一步的反映，在所述實驗中與商業上可獲得的細胞抑制劑比較了對各種癌細胞系的細胞毒性和增殖的抑制。實驗結果顯示於圖1和2中。
設計的化合物的抗-促克隆發生(clonogenic)的活性為了測定設計的化合物在各種癌細胞中的抗-促克隆形成的活性而進行了實驗。這些實驗的結果顯示於圖3，清楚地指出設計的化合物呈現顯著的抗-促克隆形成活性，尤其是在黑素瘤B16和140細胞、白血病細胞(K562，M)，和結腸HT-29細胞中。再有，使用4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶作為代表性的設計的化合物並與Ecyd和Gemzar進行比較。
誘導編程性細胞死亡為了測定設計的化合物怎樣與癌細胞相互作用，將NB4細胞(白血病的)和前列腺81(前列腺癌細胞)細胞與4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶、Ecyd和Gemzar一起孵育，並通過組蛋白-DNA ELISA監測編程性細胞死亡。該結果顯示於圖4A和4B中，並且提示設計的化合物以劑量依賴方式誘導編程性細胞死亡。
抑制RNA合成在K562細胞中用H3-尿苷結合以下描述的普通方案監測RNA合成。圖5顯示示例性的設計的化合物(此處由4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶代表)在各時間段和各種濃度下對RNA合成的抑制。
抑制RNA聚合酶I、II和III為了進一步研究設計的化合物(此處也由4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶代表)對取決於RNA聚合酶I、II和III的RNA合成的影響，而進行了實驗。這些實驗的結果示於圖6和7中，並且該結果提示設計的化合物可以抑制28S和18S rRNA的加工，可是，不能顯著抑制RNA聚合酶III。該實驗進一步表明設計的化合物以濃度依賴方式抑制依賴於RNA聚合酶II的RNA合成。
MEK-ERK磷酸化最近已經證明[Wang等，JBC27539435-43(2000)；Pavlovic等，Eur.Cytokine Netw 2267-74(2000)]可以通過MEK-ERK信號轉導途徑誘導編程性細胞死亡。為了研究通過設計的化合物激活MEK-ERK信號轉導途徑的可能性，進行了一個實驗。圖8為一個放射自顯影圖，顯示了由設計的化合物(由4-氨基-5-氧代-8-(β-D-呋喃核糖基)吡啶並[2，3-d]嘧啶代表)在NB4白血病細胞中引起的MEK和ERK的磷酸化作用，但是沒有Raf的磷酸化作用。這個實驗和其它的實驗提示設計的化合物提高MEK的磷酸化作用(這與Ecyd和Gemzar形成對比)，可是，它們沒有提高Raf的磷酸化作用。因此，預期按照本發明主題的化合物可以通過激活MEK誘導編程性細胞死亡(它可以通過MEK-ERK途徑的抑制劑而阻止)。
設計的化合物的代謝物許多實驗(未顯示數據)提示設計的化合物在(腫瘤)細胞內磷酸化，並且該產物包括單、雙和三磷酸化的形式(如通過LC-MS檢測)。進一步預測所述代謝物可具有顯著的(或甚至增加的)生物活性。
因此，已經公開了吡啶並[2，3-d]嘧啶和嘧啶並[4，5-d]嘧啶核苷的具體實施方案和中請。可是，顯而易見，對於本領域的技術人員而言，除了那些已經描述的修飾之外，還可能有更多的修飾而不違背本發明的概念。因此，本發明的主題除了所附的權利要求之外不受限制。此外，在解釋說明書和權利要求書時，所有的術語應該用與上下文一致的最廣泛的可能方式進行解釋。具體地說，術語「包擴」和「包含」應該解釋為指元素、成分或在一種非唯一的方式中的步驟，表明所涉及的元素、成分或步驟可以存在或利用，或與其它沒有特別提及的元素、成分或步驟聯合。
權利要求
1.一種根據式(I)的核苷類似物 其中A為O、S、CH2；R2、R2′、R3和R3′獨立選自H、F、OH、NH2、CN、N3、CONH2和R，其中R為低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基或低級醯基，並且任選含有至少一個雜原子和官能團；或R2和R2′一起，或R3和R3′一起選自＝CH2、＝CHR″、＝CR″2、＝NR″，其中R″為H、F、OH、CN、N3、CONH2、低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基或低級醯基；R4和R5′獨立選自H、低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基或芳烷基，並任選含有至少一個雜原子和官能團；R5為H、OH、OP(O)(OH)2、P(O)(OH)2、OP(O)(OR)2或P(O)(OR)2，其中R為掩蔽基團；而B選自式(II)、(III)、(IV)和(V)的雜環基團 其中X為H、NH2或OH；Y為H、NH2或滷素；在式(II)和(IV)中的Z1，和在式(III)和(V)中的Z3為O、S、NR″、CHM或CM2；在式(III)和(V)中的Z1，和在式(II)和(IV)中的Z3為N、CH或CM；Z2為N、CH或CM；其中M為F、Cl、Br、OH、SH、NH2、CN、COOR″、C(＝NH)NH2、低級烷基、低級鏈烯基、低級鏈炔基、芳烷基或芳基。
2.權利要求1的核苷類似物，其中A為O，而B為根據式(II)的雜環基團。
3.權利要求2的核苷類似物，其中X為NH2，Z1為O，而Z2和Z3為CH。
4.權利要求3的核苷類似物，其中R4和R5′為氫，而R5為OH。
5.權利要求1的核苷類似物，它具有根據式(VI)的結構
6.一種藥物前體，它包含權利要求5的核苷類似物。
7.權利要求6的藥物前體，其中所述藥物前體包括共價偶合於核糖的C5原子上的磷酸酯或膦酸酯。
8.權利要求6的藥物前體，其中該藥物前體包含一個部分，所述部分共價結合到所述核糖的至少一個羥基基團上，並且所述部分在靶細胞內從至少一個羥基基團上脫除掉。
9.權利要求6的藥物前體，其中該藥物前體包含一個部分，所述部分共價結合到所述鹼的氨基基團上，並且所述部分在靶細胞內從所述的氨基基團上脫除掉。
10.一種抑制腫瘤細胞生長的方法，該方法包括提供一種根據權利要求1的化合物；並以有效抑制細胞生長的劑量給所述細胞提供所述化合物。
11.權利要求10的方法，其中A為O，而B為根據式(II)的雜環基團。
12.權利要求11的方法，其中X為NH2，Z1為O，而Z2和Z3為CH。
13.權利要求12的方法，其中R4和R5′為氫，而R5為OH。
14.權利要求10的方法，其中所述化合物具有根據式(VI)的結構
15.權利要求14的方法，其中所述化合物包括共價偶合到核糖的C5原子上的磷酸酯或膦酸酯。
16.權利要求14的方法，其中所述化合物包含一個部分，所述部分共價結合到所述核糖的至少一個羥基基團上，並在靶細胞內從所述的羥基基團上脫除掉。
17.權利要求14的方法，其中所述化合物包含一個部分，所述部分共價結合到所述鹼的氨基基團上，並且所述部分在靶細胞內從所述的氨基基團上脫除掉。
18.權利要求14的方法，其中所述腫瘤細胞選自結腸癌細胞、乳腺癌細胞、黑素瘤細胞、神經膠質瘤細胞和前列腺癌細胞。
19.權利要求14的方法，其中所述細胞生長的抑制包括編程性細胞死亡。
20.權利要求19的方法，其中所述編程性細胞死亡至少部分由MEK-磷酸化作用觸發。
21.權利要求14的方法，其中所述細胞生長的抑制包括RNA聚合酶I、RNA聚合酶II和RNA聚合酶III中的至少一種被抑制。
全文摘要
一種嘌呤核苷類似物包括吡啶並[2，3－d]嘧啶或嘧啶並[4，5－d]嘧啶並且還含有一個糖部分，所述糖部分任選在C2′、C3′、C4′和/或C5′上被修飾。特殊的設計的化合物也包括所述嘌呤核苷類似物的藥物前體形式，並且嘌呤核苷類似物和相應的藥物前體用於降低腫瘤細胞的生長。
文檔編號C07D471/04GK1440292SQ01812327
公開日2003年9月3日 申請日期2001年7月3日 優先權日2000年7月6日
發明者G·王, J·L·吉拉德特, E·古尼克, J·勞, Z·皮特爾茨科夫斯基, Z·洪 申請人:裡巴藥品公司