保幼激素或其激動劑之一作為以受體介導的反式激活控制植物基因表達的化學配體的製作方法

2023-05-15 09:50:21 3

專利名稱：：保幼激素或其激動劑之一作為以受體介導的反式激活控制植物基因表達的化學配體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及植物基因表達的化學控制。具體地說，它涉及保幼激素或其激動劑之一用作化學配體調節植物細胞，及轉基因植物細胞，植物材料或植物及其含合適表達盒的後代中靶多肽受體介導的表達的方法。在某些情況下，需要控制植物，植物細胞或植物組織中表型性狀表達的時間或程度。理想的情況是該性狀表達的調節由容易施用到田間作物，裝飾灌木等的化學藥品觸發。可用於實現該理想狀態的調節基因表達的一個這類系統(尚未了解是否在植物中天然存在)是核受體的類固醇和甲狀腺激素總科。核受體的類固醇和甲狀腺激素總科在哺乳動物和昆蟲中發現，它由100個以上的已知蛋白質組成。在哺乳動物內發現的該總科內的一些受體是視黃酸受體(RAR)，維生素D受體(VDR)，甲狀腺激素受體(T3R)和視黃酸X受體(RXR)。該總科的這些和其它受體與靶基因5′調節區結合，當化學配體與受體結合時，反式激活靶基因表達。除了如上所述的在哺乳動物中發現的受體外，在昆蟲果蠅屬中已鑑定了相似結構和活性的受體。Koelle等，細胞6759(1991)；Christianson和Kafatos，生物化學和生物物理研究通訊，1931318(1993)；Henrich等，核酸研究，184143(1990)。蛻皮激素受體(EcR)結合昆蟲類固醇激素20-羥基蛻皮激素，當與Ultraspiracle基因(USP)產物形成雜二聚體時，反式激活基因表達。除20-羥基蛻皮激素外的其它化學配體(如激素激動劑)在相似條件下也與EcR結合併引起靶基因的反式激活。已顯示USP是核受體類固醇和甲狀腺總科的一個成員，儘管認為它是一種「孤獨」受體，因為其配體尚未鑑定(Seagraves，細胞，67225-228(1991))。USP在序列上與RXRα相關(Oro等，自然，347298-301(1990))，RXR能與EcR形成雜二聚體(Thomas等，自然362471-475(1993))。已顯示甲氧普林和其衍生物甲氧普林酸(它們是保幼激素的激動劑)通過RXRα作用而轉錄激活昆蟲和哺乳動物細胞中的重組報導基因(Harmon等，美國科學院學報926157-6160(1995))。然而，保幼激素不能誘導RXRα介導的反式激活(Harmon等)。至今尚沒有核保幼激素受體的明確證據(Harmon等；Henrich和Brown，昆蟲生化及分子生物學，25881-897(1995))，儘管已表明孤獨受體USP可能是一種侯選物(Harmon等；也見Seagraves；Oro等，遺傳學和發育現況2269-274(1992))。保幼激素和其激動劑提供了以前未認識到的化學控制植物基因表達的機會，因為已知這些化學藥品在農業上的用途。至今缺乏的是可使用這些化學藥品誘導轉基因植物中靶基因反式激活的方法。本文顯示了保幼激素和其激動劑是孤獨受體USP的配體。該發現允許利用一種在天然狀態下不存在於植物中的核受體實施植物基因控制的方案。這意味著應用保幼激素或其激動劑之一的唯一作用是誘導遺傳改造的靶基因的表達。正如本發明所證實的，已形成了USP受體多肽和編碼它們的植物表達基因，它們在植物細胞中發揮功能以控制靶多肽的表達，其中USP受體多肽在保幼激素或其激動劑之一存在的條件下激活靶表達盒5′調節區。這種控制植物基因表達的方法對於控制各種重要的農學性狀，如植物生育力，有用。本發明描述了控制植物基因表達的方法。具體地說，該方法包括用編碼USP受體多肽的USP受體表達盒，至少一種編碼靶多肽的靶表達盒，可選擇的編碼不同於USP受體多肽的第二受體多肽的第二受體表達盒轉化植物。在所說的USP受體多肽存在的條件下所說的轉化植物與保幼激素或其激動劑之一的接觸激活或抑制靶多肽的表達。可選擇的是，可使用另一「第二」受體表達盒，其中第二受體表達盒編碼不同於USP的受體多肽。該方法對於控制各種重要的農學性狀，如植物生育力，有用。本發明還描述了包含能被保幼激素或其激動劑之一激活的USP受體表達盒和靶表達盒的轉基因植物。本發明還包含鑑定以前未知的，在植物細胞環境中有效的USP配體的方法。經過將它們與用USP受體表達盒和靶表達盒轉化的植物細胞接觸鑑定待試驗的物質。靶表達盒編碼報導多肽，可定量或定性測定其表達，從中將試驗物質鑑定為USP配體。圖1給出了含有VP16-USP受體表達盒及在5′調節區具有直接重複反應元件的靶表達盒的植物細胞的示意圖。在保幼激素或其激動劑之一存在的條件下，VP16-USP受體激活靶多肽的表達。圖2給出了含有USP-VP16和GAL4-EcR受體表達盒的植物細胞的示意圖。當與保幼激素或其激動劑之一接觸時，逆轉由GAL4-EcR和USP-VP16受體多肽組合引起的靶多肽表達的激活。圖3與圖2相對應，除了存在化學配體，tebufenozide(也稱為RH5992)。在保幼激素或其激動劑之一存在的條件下，在這些情況下也逆反式激活。「保幼激素」指由昆蟲產生的一類化學化合物。保幼激素經過引起保持昆蟲的幼態特徵且從而防止成熟而控制幼蟲的變態。保幼激素的作用在生物學上被證明為行為，生化或分子影響。已分離並鑑定了一些天然存在的保幼激素。保幼激素的激動劑指一類表現出保幼激素的一種或多種生物學活性的化合物。保幼激素激動劑可以是或不是保幼激素的結構類似物。還包括在本說明書內的是那些可直接產生上述保幼激素類生物學效應的化合物的代謝前體的化合物。例如，甲氧普林是甲氧普林酸的代謝前體，而後者直接產生在應用甲氧普林時觀察到的保幼激素類生物學效應。本文使用的「受體多肽」指與所施用的化學配體反應能激活或抑制靶多肽表達的多肽。受體多肽由配體結合區，DNA結合區和反式激活區組成。配體結合區包含其結構非共價結合互補的化學配體的胺基酸序列。因此，配體結合區和其化學配體形成互補結合對。DNA結合區包含非共價結合稱為反應元件(RE)的特異性核苷酸序列的胺基酸序列。有一個或多個反應元件位於靶表達盒的5′調節區。各RE包含一對半位點，各半位點具有5-6個鹼基對核心，其中單一DNA結合區識別單一半位點。該半位點可以互相以直接重複，回文重複或反向重複在相對線型定向上排列。半位點的核苷酸序列；間隔和線型定向決定哪一個或多個DNA結合區與反應元件形成互補結合對。反式激活區包含一個或多個胺基酸序列，充當在起始前期間影響轉錄因子操縱並在TATA盒中裝配的亞功能域。反式激活區域的作用是允許發生重複轉錄起始事件，導致更高水平的基因表達。「受體表達盒」包括與編碼受體多肽的核苷酸序列和未翻譯的3′終止區(終止密碼子和多聚腺苷酸化序列)有效連接的5′調節區核苷酸序列。5′調節區能促進植物的表達。「USP」指在果蠅屬中發現的受體Ultraspiracle。它也稱為「XR2C」，已被分離和克隆，經過與已知配體結合區的序列同源性鑑定了其配體結合區(Henrich等，核酸研究184143-4148(1990))，儘管至今未知與其結合的化學配體。本文所用的名稱「USP」指該受體的天然形式及其突變或嵌合形式。這包括但不限於本文公開的那些突變或嵌合形式，以及最少包含天然USP配體結合區的USP嵌合形式及其突變體。在本發明中可以同時使用一種以上形式的USP。「第二受體表達盒」包括有效連接到編碼不同於USP的受體多肽的，與3′終止區有效連接的核苷酸序列上的5′調節區的核苷酸序列。該第二受體表達盒包括但不限於EcR，RXR，DHR38(Kafatos等，美國科學院學報927966-7970(1995)以及其突變體和嵌合形式。「部分分子」指來自所示來源的部分受體多肽。例如，「USP-部分分子」指來自天然Ultraspiracle受體的部分受體多肽。本文所用的部分分子包括一個或多個區域，最少包括命名該部分分子的受體的配體結合區。術語「嵌合體」用於指由多個區域組成的受體多肽，其中至少一個區域具有與其它所存在的區域異源的起源。「異源性」指存在於受體多肽的一個或多個區域與所存在的其它區域的天然起源不同。例如，如果來自單純皰疹VP16蛋白的反式激活區域與來自果蠅屬的USP受體有效連接，那麼VP16反式激活區與USP-部分分子是異源性的。而且，如果USP的一個區域與RXR的一個區域有效連接產生一個功能性受體，那麼嵌合融合體具有互相異源的區域。這些嵌合受體多肽由已有效連接產生在天然狀態下不存在的編碼序列的核苷酸序列編碼。本發明的嵌合受體多肽參照從多肽N-端到C-端部分的線型命名法。使用該命名法，具有添加到USP受體N端區域的VP16反式激活區的嵌合受體多肽命名為VP16-USP。相反，如果VP16加到USP受體C端區，則該嵌合受體多肽可命名為USP-VP16。命名涉及5′調節區及其有效連接的編碼序列的基因構建體時，5′調節區在斜線號(/)前命名，編碼序列在斜線號後命名。例如，基因構建體35S/USP-VP16命名與編碼嵌合受體USP-VP16的DNA序列有效相連的花椰菜花葉病毒的35S啟動子，其中VP16反式激活區已經加到USP的C-端區。當針對受體多肽時，不命名啟動子。例如，上述基因構建體編碼USP-VP16多肽。「靶表達盒」包括與編碼靶多肽的核苷酸序列有效連接的5′調節區的核苷酸序列，其表達在化學配體存在的條件下被受體多肽激活或抑制。靶基因的5′調節區包括核心啟動子序列，轉錄序列的起點和反應元件或為受體多肽互補結合所必需的反應元件。5′調節區能促進植物的表達。靶表達盒還具有3′終止區(終止密碼子和聚腺苷酸化序列)。保幼激素I，II，III和O是已知的，它是I的取代形式，例如，昆蟲生理學基礎，M.S.Blum編輯，JohnWileySons，紐約，1985。保幼激素I的結構式為甲基10，11-環氧-7-乙基-3，11-二甲基-反式-2，6-十三碳二烯酸。保幼激素的結構如下所示保幼激素激動劑是表現出保幼激素的一種或多種生物學活性的化合物。具有該特徵且攜帶與保幼激素相關的結構的化合物包括但不限於丙炔保幼素，甲氧普林，hydroprene和甲氧普林酸。作為這些保幼激素激動劑的一個例子的丙炔保幼素的結構如下所示在結構上與保幼激素不相關的保幼激素激動劑也是已知的。該化合物包括，但不限於多環非類異戊二烯化合物非諾碳氧化物，它是熟知的保幼激素激動劑。非諾碳氧化物的結構式為[2-(4-苯氧基苯氧基)乙基]氨基甲酸乙酯。非諾碳氧化物的結構如下所示在本發明中有用的另一保幼激素激動劑是化合物diofenolan，二苯醚化合物。diofenolan的結構式為4-(2-乙基-1，3-二氧戊環-4-基甲氧基)苯基苯醚。該化合物具有已知保幼激素活性且預期以類似於化合物非諾碳氧化物或甲氧普林的方式發揮功能。在本發明中保幼激素激動劑的使用提供了一些優勢。首先，該化合物是合成的且容易獲得。第二，許多這類化合物具有已檢驗適用於農業生產的益處，使這類化合物對作物的田間應用是「隨時可用的」。本發明利用的發現是保幼激素或其激動劑之一充當USP受體的化學配體。以前未知的一種USP的化學配體已用於本發明與植物可表達的USP受體表達盒和合適的靶表達盒結合以建立一種控制植物基因表達的新方法。已發現許多昆蟲生長調節劑抑制昆蟲的蛻皮且很可能直接作用於涉及啟動蛻皮的受體。該昆蟲生長調節劑包括但不限於triflu-muron((1-(2-氯苯甲醯)-3-(4-三氟甲氧苯基)脲)，hexam-flumuron(1-[3，5-二氯-4-(1，1，2，2-四氟乙氧基)苯基]-3-(2，6-二氟苯甲醯)脲)，teflubenzuron(1-(3，5-二氯-2，4-二氟苯基)-3-(2，6-二氟苯甲醯)脲)，flufenoxuron(1-[4-(2-氯-α，α，α-三氟-對甲苯氧基)-2-氟苯基]-3-(2，6-二氟苯甲醯)脲)，flucycloxuron(1-[α-(4-氯-α-環丙基亞苄基氨基-氧基)-對甲苯基]-3-(2，6-二氟苯甲醯)脲)，和lufenuron(1-[2，5-二氯-4-(1，1，2，3，3，3-六氟丙氧基)苯基]-3-(2，6-二氟苯甲醯)脲)。其它的苯甲醯苯脲殺蟲劑，包括但不限於diflubenzuron和chlorfluzuron，也可用於本發明。視黃酸或其衍生物也可以是控制轉基因植物中基因表達的有用配體。最近已顯示視黃酸激活培養的哺乳動物細胞系中異源性表達的USP基因產物(Harmon等)。因此，昆蟲受體可經過向攜帶受體和靶基因構建體的合適組合的轉基因植物施用視黃酸衍生物來調節，如下所述。天然來源也可充當在諸如轉基因玉米或小麥的轉基因植物中表達的昆蟲受體的配體。已發現許多植物合成加速或抑制昆蟲蛻皮的化合物。例如，從植物來源分離出一種最具活性的蛻皮甾類，muris-terone。已知許多科的植物產生蛻皮甾類或保幼激素活性。保幼激素激動劑也可用作調節轉基因植物中基因表達的配體。該配體的例子有4-[2-叔丁基羧氧基]-苯甲酸乙酯；雙硫代氨基甲酸酯，5-甲氧基-6-[1-(4-甲氧苯基)乙基]-1，3-苯並間二氧雜環戊烯或E-3-甲基-2-十二碳烯酸乙酯。該激動劑配體可用於激活轉基因的低水平表達或抑制表達修飾昆蟲受體的異源性植物系統中的高水平基因表達。本發明的方法包括用USP受體表達盒和靶表達盒轉化植物細胞或植物。在保幼激素或其激動劑之一存在的條件下，在所得的植物細胞，植物或其後代中表達USP受體多肽激活轉基因細胞或植物內靶表達盒的5′調節區(圖1)。保幼激素或其激動劑之一由於被認為與USP配體結合區結合，因此對本發明是必需的。經過任選在植物體內表達另一第二受體多肽或不同於USP的多肽也可實現控制靶表達盒的表達(圖2和3)。本發明包含的另一第二受體多肽的例子包括但不限於EcR，RXR，DHR38(Kafatos等，美國科學院學報927966-7970(1995))以及其突變體或嵌合體形式。介導配體誘導的反式激活的這些受體的應用在1996年2月19日申請的國際申請號PCT/EP96/00686中進行了描述，本文引用以供參考。USP受體多肽的配體結合區提供了用保幼激素或其激動劑之一化學控制靶表達盒5′調節區的激活的方法。USP相似於類固醇受體RXRα，它具有作為化學配體的9-順式視黃酸。已顯示USP與EcR受體多肽形成雜二聚體並在轉化的小鼠腎細胞中對蛻皮激素的施用作出反應調節靶多肽的表達，蛻皮激素是結合EcR的一種昆蟲激素，與保幼激素和其激動劑無關(WO94/01558)。在本發明中已發現受體USP和其配體結合區對於對施用保幼激素或其激動劑之一作出反應而控制植物靶多肽表達特別有用，如下面實施例所述。USP受體多肽的嵌合形式也可在本發明中用於在保幼激素或其激動劑之一存在的條件下激活靶多肽的表達。可以以其反式激活或DNA結合的效力為基礎從異源性來源選擇嵌合USP受體多肽的DNA結合區或反式激活區。可從諸如具有相似轉錄調節功能的植物，昆蟲和哺乳動物的任何生物獲得嵌合受體多肽的所說區域。在本發明的一個實施方案中，從核受體的類固醇和甲狀腺激素總科的其它成員中選擇這些區域。嵌合受體多肽的使用具有組合不同來源的區域的益處。本文提供的嵌合USP受體多肽提供了組合最佳反式激活活性或改變的與作為配體的保幼激素或其激動劑之一的特異性反應元件的RE結合或識別的優勢。因此，可構建嵌合多肽，它是為了某一特殊目的而特製的。這些嵌合受體多肽也提供了在植物細胞異源性環境中改善的功能。還認為本發明的一部分在於反式激活，配體結合和DNA結合區可在嵌合受體多肽中以任何功能性排列來組裝。例如，如果在天然存在的受體N端部分發現一個反式激活區的亞區，則本發明的嵌合受體多肽在C端可包括一個反式激活亞區代替N端的亞區或作為除該N端亞區外的又一亞區。本文所公開的嵌合受體多肽還可具有相同類型的多個區域，例如，每個受體多肽超過一個反式激活區(或兩個亞區)。因此，本發明的一個實施方案提供了一種USP受體多肽，它在保幼激素或其激動劑之一存在的條件下激活靶多肽的表達且也具有反式激活的優異特性。反式激活區可定義為增強RNA聚合酶的生產性轉錄起始的胺基酸序列。(一般見Ptashne，自然335683-689(1988))。已知不同的反式激活區在其增強轉錄起始的能力上具有不同程度的效力。在本發明中需要使用在植物細胞中具有優異反式激活效力的反式激活區以便對保幼激素或其激動劑之一的存在作出反應產生高水平的靶多肽表達。在本發明的方法中顯示出特別有效的反式激活區包括但不限於VP16(從單純皰疹病毒分離)。在本發明的一個優選的實施方案中，VP16的反式激活區有效連接到USP-部分分子上以產生嵌合USP受體多肽，用於控制植物中的靶多肽的表達。其它反式激活區也是有效的。DNA結合區是具有某種功能性特徵的胺基酸序列，它負責USP受體多肽與存在於靶表達盒5′調節區的稱為反應元件的特異性核苷酸序列的結合。核受體的類固醇和甲狀腺總科的DNA結合區的結構在種間高度保守，因此在用於形成互補結合對的反應元件中變化有限(Evans，科學240889-895(1988))。然而，可在使用反應元件控制基因表達的方法中以其它方式導入相當大的可變性。在本發明的優選的實施方案中，多拷貝的且優選1至11拷貝的合適反應元件放在5′調節區中，產生結合USP或任選的第二受體多肽的多個位點，導致更大程度的激活。經過改變在5′調節區中反應元件的線型取向或位置可實現基因控制方法中的其它可變性。由II型受體蛋白質識別的反應元件具有由兩個「半位點」組成的「二重」對稱性。(Evans，科學240889-895(1988))。每個受體多肽結合一個「半位點」。這些「半位點」可以以直接重複，反向重複或回文方式取向。在本發明的一個實施方案中，超過一個USP受體多肽分子識別直接重複(DR)反應元件，從而在保幼激素或其激動劑之一存在下實現靶表達盒的激活。經過使用來自包括但不限於LexA或GAL4蛋白質的其它轉錄激活物的DNA結合區和反應元件可獲得在用本發明控制基因表達中的其它變化。可使用來自大腸桿菌的LexA基因編碼的LexA蛋白質的DNA結合區和其互補結合位點(Brent和Ptashne，細胞43729-736，(1985)，它描述了LexA/GAL4轉錄激活物)。另一有用的來源是來自酵母的GAL4蛋白質(Sadowski等，自然335563-564(1988)，它描述了一種GAL4-VP16轉錄激活物)。在本發明的一個優選的實施方案中，經過將GAL4DNA結合區融合到含EcR配體結合區的部分分子上構建任選的第二受體多肽的嵌合形式。USP和任選的第二受體表達盒的5′調節區還包含允許在植物組織和細胞中表達的啟動子。選擇用於受體表達盒的合適的啟動子，使受體多肽的表達可以是組成型的，發育調節的，組織特異性的，細胞特異性的或細胞分室特異性的。也可選擇啟動子使受體多肽本身的表達可在植物中經化學誘導，從而增加配體的啟動子誘導水平。經過組合提供特異性表達的啟動子元件與提供化學誘導表達的啟動子元件，可以對化學藥品的應用作出反應在植物的特異性細胞或組織中表達或激活受體多肽。可修飾編碼受體多肽的核苷酸序列以改善在植物中的表達，改善功能或兩者均有。該修飾包括但不限於改變密碼子的使用，插入內含子或產生突變。在本發明的一個實施方案中，使用包含有效連接到編碼USP受體多肽的核苷酸序列上的花葯特異性或雌蕊特異性啟動子的表達盒在保幼激素或其激動劑之一存在下激活靶多肽的表達。還公開了在保幼激素或其激動劑之一存在的條件下其表達被受體多肽激活的靶多肽。可用本發明控制任何編碼序列的表達，只要將有效連接到所說編碼序列上的啟動子改造成含有與USP受體的DNA結合區互補的一個或多個反應元件，且可任選的是為第二受體所需要的一個或多個反應元件。例如，在保幼激素或其激動劑之一存在的條件下可用USP受體多肽激活對控制植物生育力有用的靶多肽。本發明還包含USP受體多肽的突變體。可製備具有靶表達盒背景激活水平減少的特性的突變體，使誘導相對於未誘導的背景表達要大。而且，可形成其與保幼激素或其激動劑之一的結合改變的突變體。具有改變的結合特性的突變體以對這些激動劑專一性的方式對不同激動劑作出反應。例如，可形成僅對激動劑非諾碳氧化物作出反應而不對hydroprene作出反應的突變USP受體，從而區分類異戊二烯和非類異戊二烯保幼激素激動劑。諸如化學誘變或定點誘變的有用的誘變方法是本領域中已知的。在另一種方法中，以PCR誘變編碼USP的配體結合區的核苷酸序列製備突變受體多肽。這些突變受體多肽在諸如酵母的適宜於常規篩選和分離技術的宿主生物中表達。然而，在該宿主生物中篩選表現出基礎活性減小且誘導倍數更大的突變受體多肽僅提供了進一步在植物細胞中試驗的候選物，因為從以糖皮質激素受體(GR)進行的工作中很清楚，儘管類因醇和甲狀腺激素總科的受體可在酵母中發揮功能，但不能預期在轉基因植物中發揮功能(Lloyd等，科學，226436(1994))。觀察到的進一步限制應用來自酵母的結果是表達GR的酵母細胞對常用的化學配體地塞米松沒有反應，而該配體在其它異源性系統中具有功能(Schena等，美國科學院學報8810421-10425(1991))。經過製備編碼突變受體多肽的受體表達盒並將其與靶表達盒結合轉化進植物細胞中可實現在植物細胞中的進一步試驗。試驗轉化的植物細胞在保幼激素或其激動劑之一存在的條件下突變受體多肽對靶表達盒5′調節區的激活。在缺乏保幼激素或其激動劑之一時誘導靶多肽的較低基礎表達而在保幼激素或其激動劑之一存在時誘導靶多肽高水平表達的突變受體多肽對於控制在植物中的基因表達是有用的。如上所述，本發明的方法可用於在統計學上增加相對於最低基礎水平的基因表達。然而，本發明還可用於在統計學上減小或抑制由諸如USP和EcR的受體形成的複合物介導的基因表達的激活。由該受體複合物介導的在植物中基因表達的控制是1995年3月3日申請的PCT/EP96/00686的主題，本文引用以供參考。在保幼激素或其激動劑之一(它們是USP受體多肽的化學配體)存在的條件下引起這些受體複合物介導的激活逆轉(見圖2和3)。在保幼激素或其激動劑之一存在的條件下，破壞了USPEcR複合物，從而逆轉該激活。例如，在表達USP和GAL4-EcR-C1受體多肽並包含具有GAL4結合位點元件的靶表達盒的轉基因植物中，逆轉由複合物引起的靶多肽基因表達的激活。這一逆轉可在tebufenozide(也稱為RH5992)或結合EcR配體結合區的其它化學配體存在的條件下或在缺乏該化學配體的條件下發生。為了在植物中表達，必須選擇可同時用於受體表達盒和靶表達盒的合適的啟動子。除非另有說明，下面討論的啟動子可用於指導受體多肽或靶多肽在植物中的表達。這些啟動子包括但不限於組成型，可誘導的，暫時調節的，發育調節的，化學調節的，組織優選的和組織特異性的啟動子。優選的組成型啟動子包括但不限於CaMV35S和193啟動子(美國專利號5,352,605)。其它優選的啟動子包括但不限於已知在大多數細胞類型中表達的一些肌動蛋白基因之一。由McElroy等，普通分子遺傳學231150-160(1991)所述的啟動子可較容易地摻入本發明的受體表達盒且特別適用於單子葉植物宿主。還有另一個優選的組成型啟動子，來自遍在蛋白，它是另一種已知在許多細胞類型中積累的基因產物。已從一些用於轉基因植物的物種中克隆了遍在蛋白啟動子(例如，向日葵-Binet等，植物科學7987-94(1991)；玉米-Christensen等，植物分子生物學12619-632(1989))。已在轉基因單子葉植物系統中形成玉米遍在蛋白啟動子，在EP-A-342926中公開了為轉化單子葉植物構建的其序列和載體。遍在蛋白啟動子適用於本發明的轉基因植物，特別是單子葉植物。其它有用的啟動子是來自玉米的U2和U5snRNA啟動子(Brown等，核酸研究178991(1989))和來自乙醇脫氫酶的啟動子(Dennis等，核酸研究123983(1984))。在本發明的植物，特別是玉米中有用的組織特異性或組織優選性啟動子是那些指導在根，髓質，葉或花粉中表達的啟動子。這類啟動子在WO93/07278中公開，本文引用其全文作為參考。其它有用的是提供種子特異性表達的啟動子，如Schernthaner等，EMBOJ.71249(1988)公開的那些啟動子，EP-A-578611中公開的花葯特異性啟動子ant32和ant43D(本文引用其全文作為參考)，花葯(絨氈層)特異性啟動子B6(Huffman等，細胞生化雜誌17B摘要#D209(1993))；髓質特異性啟動子，如修飾的S13啟動子(Dzelkalns等，植物細胞5855(1993))。在本發明中也有用的是化學誘導性啟動子。在這一類型中對於指導植物中受體多肽或靶多肽表達有用的具體啟動子在例如EP-A-332104中公開，本文引用其全文作為參考。受體表達盒或靶表達盒的5′調節區也可包括其它增強序列。已發現許多序列增強轉基因植物中的基因表達。例如，已知許多來自病毒的非翻譯先導序列增強表達。具體地說，來自菸草花葉病毒(TMV，「Ω序列」)，玉米褪綠斑駁病病毒(MCMV)和苜蓿花葉病毒(AMV)的先導序列已顯示在增強表達中有效(例如，Gallie等，核酸研究158693-8711(1987)；Skuzeski等，植物分子生物學1565-79(1990))。本領域已知的其它先導序列包括但不限於細小核糖核酸病毒先導序列，例如，EMCV先導序列(腦心肌炎病毒5′非編碼區)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.，和Moss，B.PNASUSA866126-6130(1989))；·馬鈴薯Y病毒組先導序列，例如，TEV先導序列(菸草蝕刻病毒)(Allison等，(1986)；MDMV先導序列(玉米矮縮花葉病毒)；病毒學，1549-20)；·人免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)先導序列，(Macejak，D.G.，和Sarnow，P.，自然，35390-94(1991)；·來自首蓿花葉病毒衣殼蛋白mRNA的未翻譯先導序列(AMVRNA4)，(Jobling，S.A.，和Gehrke，L.，自然，325622-625(1987)；·菸草花葉病毒先導序列(TMV)，(Gallie，D.R.等，RNA的分子生物學，第237-256頁(1989)；和·玉米褪綠斑駁病病毒先導序列(MCMV)(Lommel，S.A.等，病毒學，81382-385(1991)。也見Della-Cioppa等，植物生理學，84965-968(1987)。已顯示各種內含子序列當加到5′調節區，特別是在單子葉植物細胞中時增強表達。例如，已發現玉米Adh1基因內含子當導入玉米細胞時明顯增強在其同源啟動子下的野生型基因的表達(Callis等，基因發育11183-1200(1987))。除了向靶表達盒5′調節區摻入一個或多個上述元件外，也可摻入靶表達盒特有的其它元件。該元件包括但不限於最小啟動子。以最小啟動子使基礎啟動子元件因缺乏上遊激活物的結合位點而無活性或幾乎無活性。這種啟動子當不存在反式激活物或缺乏增強子或反應元件結合位點時在植物中具有較低的背景活性。對於植物靶基因特別有用的一個最小啟動子是從玉米bronze1基因獲得的Bz1最小啟動子。經過在位於-53到-58的NheI位點切割從「myc」突變Bz1-螢光素酶構建體pBz1LucR98獲得Bz1核心啟動子(Roth等，植物細胞3317(1991))。由此產生的Bz1核心啟動子片段從-53延伸到+227，當用於轉基因玉米時包括在5′非翻譯區的Bz1內含子-1。除了啟動子外，各種3′轉錄終止子也可用於本發明。轉錄終止子負責轉錄的終止和正確的mRNA聚腺苷酸化。合適的轉錄終止子和已知在植物中發揮功能的終止子包括CaMV35S終止子，tml終止子，胭脂氨酸合成酶終止子，豌豆rbcSE9終止子和本領域已知的其它終止子。這些可用於單子葉植物和雙子葉植物。可以以許多本領域已知的方式將本發明的表達盒導入植物細胞中。本領域的技術人員可預料到方法的選擇取決於靶向轉化的植物類型，即，單子葉植物或雙子葉植物。轉化植物細胞的合適的方法包括，但不限於顯微注射(Crossway等，生物技術4320-334(1986))，電穿孔(Riggs等，美國科學院學報835602-5606(1986))，土壤桿菌屬介導的轉化(Hinchee等，生物技術6915-921(1988))，直接基因轉移(Paszkowski等，EMBOJ.32717-2722(1984))，和使用可從Agracetus公司，Madison，Wisconsin和BioRad.Hercules，California獲得的裝置的彈道微粒加速(例如，見Sanford等，美國專利4,945,050；和McCabe等，生物技術6923-926(1988))。也見Weissinger等，遺傳學年鑑22421-477(1988)；San-ford等，微粒科學和技術527-37(1987)(洋蔥)；Christou等，植物生理學87671-674(1988)(大豆)；McCabe等，生物/技術6923-926(1988)(大豆)；Datta等，生物/技術8736-740(1990)(水稻)；Klein等，美國科學院學報，854305-4309(1988)(玉米)；Klein等，生物/技術6559-563(1988)(玉米)；Klein等，植物生理學91440-444(1988)(玉米)；Fromm等，生物/技術8833-839(1990)(玉米)；和Gordon-Kamm等，植物細胞2603-618(1990)(玉米)；Svab等，美國科學院學報878526-8530(1990)(菸草葉綠體)；Koziel等，生物技術11194-200(1993)(玉米)；Shimamoto等，自然338274-277(1989)(水稻)；Christou等，生物技術9957-962(1991)(水稻)；EP-A-332581(Orchardgrass和其它Pooideae)；Vasil等，生物技術111553-1558(1993)(小麥)；Weeks等，植物生理學1021077-1084(1993)(小麥)。用於將本發明的表達盒以微粒轟擊導入玉米的一套特別優選的實施方案在Koziel等，生物/技術11194-200，1993中描述，本文引用其全文以供參考。另一個優選的實施方案是在EP-A-292435中公開的用於玉米的原生質體轉化方法，本文引用其全文以供參考。以微粒轟擊將本發明的表達盒導入小麥中的一套特別優選的實施方案可見於WO94/13822，本文引用其全文以供參考。可用單個DNA分子或多個DNA分子(即，共轉化)進行植物的轉化，這些技術均適用於本發明的表達盒。可獲得許多轉化載體用於植物轉化，本發明的表達盒可與任何這類載體結合使用。載體的選擇取決於優選的轉化技術和轉化的靶種類。有許多用於使用根癌土壤桿菌轉化的載體。它們典型地攜帶至少一個T-DNA邊界序列且包括諸如pBIN19的載體(Bevan，核酸研究(1984))。在一個優選的實施方案中，本發明的表達盒可插入二元載體pCIB200和pCIB2001中用於與土壤桿菌屬使用。以下列方式構建用於土壤桿菌介導的轉化的表達盒。經過Narl消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski，細菌學雜誌164446-455(1985))使切下四環素抗性基因，隨後插入來自攜帶NPTII的pUC4K的AccI片段(Messing和Vierra，基因19259-268(1982)；Bevan等，自然304184-187(1983)；McBride等，植物分子生物學14266-276(1990))來產生pTJS75kan。將XhoI接頭連接到含左右T-DNA邊界，植物可選擇的nos/nptII嵌合基因和pUC多接頭的pCIB7EcoRV片段上(Rothstein等，基因53153-161(1987))，將XhoI消化的片段克隆進SaII消化的pTJS75kan中以產生pCIB200(也見EP-A-332104，實施例19)。pCIB200含有下列單一的多接頭限制性位點EcoRI，SstI，KpnI，BgIII，XbaI和SaII。質粒pCIB2001是pCIB200的衍生物，後者經過將另外的限制性位點插入多接頭中產生。在pCIB2001的多接頭中的單一限制性位點有EcoRI，SstI，KpnI，BgIII，XbaI，SaII，MluI，BcII，AvrII，ApaI，HpaI和StuI。除含有這些單一限制性位點外，pCIB2001還具有植物和細菌卡那黴素選擇基因，用於土壤桿菌屬介導的轉化的左右T-DNA邊界，來自RK2的用於在大腸桿菌和其它宿主間遷移的trfA功能，也來自PK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接頭適合於克隆含其自身調節信號的植物表達盒。對於土壤桿菌屬介導的轉化有用的另一載體是二元載體pCIB10，它含有用於在植物中選擇的編碼卡那黴素抗性的基因，T-DNA右和左邊界序列以及插入來自廣譜宿主質粒pRK252的序列，使其在大腸桿菌和土壤桿菌中均可複製。Rothstein等，基因53153-161(1987)描述了其構建。已構建了pCIB10的各種衍生物，其中插入了Gritz等，基因25179-188(1983)所述的潮黴素B磷酸轉移酶的基因。這些衍生物使得能夠僅在潮黴素(pCIB743)或在潮黴素和卡那黴素兩者(pCIB715，pCIB717)上選擇轉基因植物細胞。使用直接基因轉移或土壤桿菌介導的轉移形式的方法通常但不是必須用可提供對抗生素(例如，卡那黴素、潮黴素或氨甲蝶呤)或除草劑(例如，phosphinothricin)抗性的選擇標記來進行。然而，選擇用於植物轉化的選擇標記對本發明不是關鍵的。對於某些植物種類，可優選不同的抗生素或除草劑選擇標記。在轉化中常規使用的選擇標記包括提供對卡那黴素和有關抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因19259-268(1982)；Bevan等，自然304184-187(1983))，提供對除草劑phosphinothricin抗性的bar基因(White等，核酸研究181062(1990)，Spencer等，遺傳學理論及應用79625-631(1990))，提供對抗生素潮黴素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子細胞生物學42929-2931)，提供對氨甲蝶呤抗性的dhfr基因(Bourouis等，EMBO雜誌21099-1104(1983))。對於直接基因轉移技術與除草劑Basta(或phosphinothricin)選擇組合有用的一個這類載體是pCIB3064。該載體以質粒pCIB246為基礎，包含與大腸桿菌GUS基因和CaMV35S轉錄終止子有效融合的CaMV35S啟動子，並在WO93/07278中描述，本文引用以供參考。提供對phosphinothricin抗性有用的一個基因是來自綠色產色鏈黴菌的bar基因(Thompson等，EMBOJ.62519-2523(1987))。該載體適於克隆含其自身調節信號的植物表達盒。另一轉化載體是利用大腸桿菌基因二氫葉酸還原酶(DHFR)作為提供對氨甲蝶呤抗性的選擇標記的pSOG35。使用PCR擴增35S啟動子(～800bp)，玉米Adh1基因內含子6(～550bp)和18bp的pSOG10的GUS非翻譯先導序列。還使用PCR擴增了編碼大腸桿菌二氫葉酸還原酶II型基因的250bp的片段，將這兩個PCR片段與來自含pUC19載體骨架和胭脂氨酸合成酶終止子的pBI221(Clon-tech)的SacI-PstI片段組裝。這些片段的組裝產生pSOG19，它含有與內含子6序列，GUS先導序列，DHFR基因和胭脂氨酸合成酶終止子融合的35S啟動子。用來自玉米褪綠斑駁病病毒check(MCMV)的先導序列取代pSOG19的GUS先導序列產生載體pSOG35。pSOG19和pSOG35攜帶來自pUC的氨苄青黴素抗性基因，並具有可克隆外源序列的HindIII，SphI，PstI和EcoRI位點。本發明的一個優勢方面是其在野外條件控制植物生育力中的應用。有效受精由形成存活的合子引起且可作為形成存活合子的種子百分數測量。根據本發明，可經過將編碼合適靶的核苷酸序列摻入靶表達盒中來控制受精，其中所說的靶多肽的表達幹擾植物受精，即它在統計學上減少或增加植物受精。在本發明的一個優選的實施方案中，所說的靶多肽導致受精過程無效，即妨礙或防止形成存活的合子。該無效受精可作為不形成存活合子的種子百分數測量且可由各種方式引起。這些包括但不限於，1)破壞或改變對形成存活配子關鍵的那些過程，2)花粉或胚珠(如果形成)無功能，或3)胚囊，雌蕊，柱頭或傳導管的正常發育失敗。在本發明中，將保幼激素或其激動劑之一施用到野外條件下的轉基因植物上或與其接觸，其中靶多肽的表達被激活，從而導致受精失效。在本發明的另一實施方案中，所說的靶多肽的表達增強或恢復植物的生育力。應認識到使用本發明可實現不同程度的有效或無效受精。在一個優選的實施方案中，可實現超過80％且更優選超過95％的無效受精。提供生育力水平可變性的能力使本發明可適應各種農學目的。靶多肽有用的編碼序列包括但不限於編碼能導致受精無效的產物的任何序列。這些編碼序列可以是同源或異源性來源。這些編碼序列的基因產物包括但不限於·白喉毒素A-鏈(DTA)，它抑制蛋白質合成，Greenfield等，美國科學院學報，806853(1983)；Palmiter等，細胞，50435(1987)；·來自菊歐文氏桿菌EC16的果膠酸裂解酶pelE，它降解果膠，引起細胞裂解。Keen等，細菌學雜誌，168595(1986)；·來自cms-T玉米線粒體基因組的T-urf13(TURF-13)；該基因編碼命名為URF13的多肽，它破壞線粒體或胞質膜。Braun等，植物細胞，2153(1990)；Dewey等，美國科學院學報，845374(1987)；Dewey等，細胞，44439(1986)；·β-1，3-葡聚糖酶，它引起小孢子胼胝質壁的成熟前溶解，Worral等，植物細胞4759-771(1992)；·來自噬菌體Mu的Gin重組酶，該基因編碼位點特異性DNA重組酶，它引起基因組重排並且當在植物細胞中表達時喪失細胞活性。Maeser等，分子普通遺傳學，230170-176(1991)；·來自丁香假單胞菌的吲哚乙酸賴氨酸合成酶(iaaL)，它編碼連接賴氨酸與吲哚乙酸(IAA)的酶。當在植物細胞中表達時，由於經連接從細胞中去掉了IAA，它引起發育改變。Romano等，基因和發育，5438-446(1991)；Spena等，分子普通遺傳學，227205-212(1991)；Roberto等，美國科學院學報，875795-5801；·來自解澱粉芽孢桿菌的核糖核酸酶，也稱為芽孢桿菌RNA酶，在其表達的細胞中消化mRNA，導致細胞死亡。Mariani等，自然347737-741(1990)；Mariani等，自然357384-387(1992)；和·來自Bacillusthuringiensisisraeliensis的CytA毒素基因，它編碼殺蚊蟲的且溶血的蛋白質。當在植物細胞中表達時，由於破壞細胞膜而引起細胞死亡。McLean等，細菌學雜誌，1691017-1023(1987)；Ellar等，美國專利號4,918,006(1990)。·這類多肽還包括腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(APRT)，Moffatt和Somerville，植物生理學，861150-1154(1988)；DNA酶，RNA酶，蛋白酶，水楊酸羥化酶等。還應認識到，該靶表達盒可包括與一個核苷酸序列有效連接的5′調節區，當轉錄時，該核苷酸序列產生對形成活配子關鍵性的編碼序列(如APRT)的反義形式。或者，可利用核酶，它靶向對配子形成或發揮功能關鍵的基因的mRNA。該核酶包括大約9個核苷酸的雜交區，在核苷酸序列上它與至少部分靶RNA和適於裂解靶RNA的催化區互補。核酶在EP-A-321201和WO88/04300中描述，本文以參考文獻引用。也見Haseloff和Gerlach，自然，334585-591(1988)；Fedor和Uhlenbeck，美國科學院學報，871668-1672(1990)；Cech和Bass，生化年鑑，55599-629(1986)；Cech，T.R.2361532-1539(1987)；Cech，T.R.基因，73259-271(1988)；和Zang和Cech，科學，231470-475(1986)。應認識到編碼靶多肽的上述核苷酸序列也可有效連接到以組織或細胞特異性方式指導其表達的5′調節序列上。提供該組織-或細胞-特異性表達的方式已在上面描述。在表達中的這種特異性保證了靶多肽的效力僅作用於對活合子形成所必需的那些組織或細胞而除影響生育力外不會對植物有害。在本發明範圍內應認識到可控制轉基因植物的雄性生育力，轉基因植物的雌性生育力，或兩者。雄性不育是產生功能性或存活的花粉失敗或無能。雄性不育可由導致不形成花粉或形成時花粉缺乏功能的缺陷引起。因此，或者花粉不能形成，或者如果形成，它無活力或在正常條件下不能有效受精。雌性不育是產生功能性或活的大孢子或胚囊或其它為花粉萌發，生長或受精所需的組織失敗或無能。雌性不育可由導致不能形成大孢子或胚囊或子房，胚珠，雌蕊，柱頭或傳導管正常發育失敗的缺陷引起。因此，或者活胚囊不能發育，或者如果形成，在正常條件下不能有效受精。例如，可獲得轉基因植物，它使用有效連接到合適的核苷酸序列上的花葯特異性啟動子在花葯中表達USP受體多肽或多肽。另外，該轉基因植物還包含具有5′調節序列的靶表達盒，該5′調節序列包含與核糖核酸酶芽孢桿菌RNA酶編碼序列有效連接的，具有來自Bz1的核心啟動子元件的合適的反應元件序列。當表達USP受體多肽的轉基因植物施用保幼激素或其激動劑之一時，靶表達盒的5′調節序列的激活導致隨後產生靶多肽芽孢桿菌RNA酶。在花葯中特異性表達芽孢桿菌RNA酶引起細胞死亡，因此引起雄性不育。使用與編碼受體多肽的核苷酸序列有效連接的雌蕊特異性啟動子，同樣組合受體多肽和靶表達盒可產生雌性不育。或者，可改造植物，其中靶多肽的表達恢復了雄性不育或雌性不育的植物的生育力。例如，可獲得一種植物，它在Ant43D，Ant32或B6啟動子的控制下表達芽孢桿菌RNA酶基因，或者如Mariani等，自然347737-741(1990)和Mariani等，自然，357384-387(1992)所述在TA29啟動子的控制下表達。這些植物還包含USP受體多肽的受體表達盒和來自相同花葯特異性啟動子或諸如玉米遍在蛋白的組成型啟動子，35S或水稻肌動蛋白啟動子的任何任選的第二受體多肽。這些植物進一步包括具有5′調節序列的靶表達盒，該5′調節序列包含有效連接到芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列上的具有Bz1核心啟動子元件的合適的反應元件序列。該植物是雄性不育的，但當施用保幼激素或其激動劑之一時，靶表達盒的5′調節序列的激活導致隨後產生靶多肽芽孢桿菌RNA酶抑制劑。芽孢桿菌RNA酶抑制劑抑制芽孢桿菌RNA酶多肽的核糖核酸酶活性，花葯和花粉進行正常發育。從而恢復生育力。可使用相似的方法控制雌性不育。經過用在雌性生殖組織中特異性表達的啟動子代替花葯特異性啟動子來啟動芽孢桿菌RNA酶表達，可獲得雌性不育的植物。以保幼激素或其激動劑之一誘導包含芽孢桿菌RNA酶抑制劑編碼序列的靶表達盒導致恢復雌性生育力。上述方法可利用能設計恢復基因的任何雌性或雄性不育基因。非芽孢桿菌RNA酶抑制劑的潛在的恢復基因在EP-A-412911中描述。改造進上述轉基因植物和其種子中的遺傳特性經有性生殖或無性生長傳遞且因此在後代植物中維持和繁殖。一般所說的維持和繁殖利用了為適應特殊目的而形成的已知農業方法，如耕種，播種或收穫。也可應用諸如水栽法或溫室技術的特殊方法。由於生長的作物易受昆蟲引起的襲擊和損傷或感染，以及受到雜草植物的競爭，採用了一些方法控制雜草，植物病害，昆蟲，線蟲和其它有害條件以增加產量。這些方法包括機械方法，如土壤耕作或去掉雜草及感染植物，以及應用農藥，如，除草劑，殺真菌劑，殺配子劑，殺線蟲劑，生長調節劑，催熟劑和殺蟲劑。還可利用根據本發明的轉基因植物和種子的有益遺傳特性進行植物育種，以形成具有改進特性的植物，如耐受害蟲，除草劑，或逆境，改進營養價值，增加產量，或改進結構以引起減少倒伏或落葉。以成熟的人類幹預方法鑑定各種育種步驟，如選擇待雜交的品系，指導親代品系的授粉或選擇合適的後代植物。根據所需的特性採取不同的育種措施。有關技術是本領域中熟知的且包括但不限於雜交，近交，回交，混系雜交；品種融合，種間雜交，非整倍體技術等。因此，根據本發明的轉基因植物和其種子可用於培育改良的植物品系，例如，增強常規方法(如除草劑或殺蟲劑處理)的效力或由於其修飾的遺傳特性而允許省去所說方法。或者，可獲得具有增強逆境耐受性的新作物，由於其優化的遺傳「裝備」，可產生與不能耐受相當有害發育條件的產品相比質量更好的收穫產品。在種子生產中，種子的萌發質量和均一性是基本的產品特徵，而農民收穫和銷售的種子的萌發質量和均一性並不重要。由於難以使作物不含其它作物和雜草的種子，為控制種子先天疾病並產生具有較好萌發力的種子，種子生產者已形成了相當廣泛和明確限定的種子生產實踐，他們是在純種子的生長，適應和銷售領域中有經驗的人。因此，農民通常購買滿足特定質量標準的驗證的種子而不使用從自己的作物中收穫的種子。用作種子的繁殖材料通常用包含除草劑，殺蟲劑，殺真菌劑，殺細菌劑，殺線蟲劑，殺軟體動物劑或其混合物的保護劑包被物處理。通常使用的保護劑包被物包括諸如環己烯亞胺，carboxin，二硫化四甲秋蘭姆(TMTDR)，methalaxyl(ApronR)和pirimiphos-methyl(ActellicR)的化合物。如果需要，可將這些化合物與組合物領域常用的其它載體，表面活性劑或應用促進佐劑一起配製以提供對細菌，真菌或動物害蟲引起的損害的保護。可用液體配製品浸滲繁殖材料或用組合的溼或幹配製品包被來施用保護劑包被物。也可應用其它方法，如直接在芽或果實上處理。本發明的另一方面是提供新的農藝方法，如上面舉例的方法，其特徵在於使用根據本發明的轉基因植物，轉基因植物材料或轉基因種子。本發明可用於能被轉化且再生成轉基因植物的任何植物。經過施用合適的化學配體可控制雄性不育，雌性不育或兩者。植物生育力的控制對於生產雜交種子特別有用。為了產生未受自交種子汙染的雜交種子，必須實施傳粉控制法以保證雜交傳粉而不進行自花傳粉。這通常以機械，遺傳或化學雜交劑(CHA)來完成。例如，在玉米中，目前的做法是對雌性(或種子)親本機械摘去穗狀雄花，這是一個耗時且費力的過程。在小麥中，在種子生產規模上以機械方法控制生育力是不能實現的，且沒有建立生育力控制的遺傳來源。在生產雜交種子中使用本發明提供了可靠，易於使用且可控制雄性或雌性生育力的優勢。可使含有合適受體表達盒和靶表達盒的轉基因植物成為純合的並無限保持。為了獲得雜交種子，將親本1和親本2的純合品系雜交。在使用本發明生產雜交種子的一個例子中，親本1改造成在保幼激素或其激動劑之一存在下雄性不育，而親本2改造成在保幼激素或其激動劑之一存在下雌性不育。將親本1和親本2均與保幼激素或其激動劑之一接觸，唯一成功的種子生產由親本2的花粉使親本1的胚珠受精產生。在使用本發明的第二個實施例中；親本1改造成在缺乏保幼激素或其激動劑之一時雄性不育，而親本2改造成在缺乏保幼激素或其激動劑之一時雌性不育。將親本1和親本2與保幼激素或其激動劑之一接觸，通過自花受精維持各品系。為了生產雜交種子，將兩種親本品系套種，僅獲得雜交種子。經過導入的恢復基因使後代雜種植物恢復生育力。以這些方法可生產任何所需的雜交種子。植物轉基因表達的化學控制對於調節靶作物中顯著的發育改變，將莊稼植物改變成更適應於惡劣環境，改變特定代謝途徑的流動或者簡單地誘導單個所需蛋白質產物的高水平表達有用。植物發育程序的化學控制使農民能支配何時開始特定的事件，如花發育，葉或果實的採摘或其它重要發育階段。對特定發育事件的化學控制使農民在種植和收穫時間上有更大的彈性以及使他們能對特定環境條件作出反應，如早冬或多雨的春季的預測。經過控制對發育或條件反應途徑關鍵的基因可實現該變化，類似於果蠅的同源異型基因。控制代謝途徑的基因表達也是有用的。據信植物僅能消耗固定量的能量，且諸如貯存蛋白生物合成的特定途徑的任何增強會導致同時減少通過能量競爭途徑的生物合成量，如澱粉或脂的合成。在只有在植物達到某種發育階段(即，成熟與生長)後才可接受生物合成途徑的該變化的情況下，基因表達的化學調節對於實現特定生物合成變化是有用的或甚至也許是必需的。基因表達的化學調節對於高水平地過度表達特定蛋白質是有用的。已知某些蛋白質當在異源性宿主，外源亞細胞分室中表達時或甚至以異常高水平表達時對細胞是有毒的。化學控制該蛋白質的表達對於正常植物生長是有優勢的或甚至對獲得足夠的植物量以證實使用植物作為生物合成的蛋白質工廠是必需的。對於在植物中大規模生物合成有用的蛋白質包括工業酶，藥用蛋白質，抗原以及其它蛋白質。已知用於鑑定類固醇激素受體的配體的生物測定(Evans等，美國專利號5,298,429)。公開的受體局限於糖皮質激素，礦質類皮質激素，雌激素相關激素和甲狀腺激素受體。將這些受體轉化進了小鼠腎細胞培養物(CV-1或COS細胞系)並在合適的哺乳動物激素存在下試驗了其反式激活嵌合CAT基因表達的能力。但沒有公開用這些受體轉化植物細胞或構建植物表達基因，或不是具有哺乳動物激素作為配體的受體的那些受體。在Oro和Evans，WO91/14695中認為USP是一種「昆蟲視黃酸類受體」。在一個預言性的實施例中，將編碼USP的XR2C轉化進昆蟲細胞培養物(S2細胞系)中對視黃酸的加入作出反應而反式激活嵌合CAT基因。該文獻認為用該「昆蟲視黃酸類受體」轉化的昆蟲或動物細胞可用於篩選能導致受體激活的化合物。然而，Oro等後來報導了在果蠅細胞培養試驗中USP不被視黃酸激活，且在RXR反應的條件下，USP不對所試驗的任何視黃酸類或保幼激素類，包括甲氧普林酸作出反應(Harmon等及其中的參考文獻)。由於本文揭示了保幼激素和其激動劑是USP的配體，且在保幼激素或其激動劑之一存在下USP可用於激活植物細胞中的靶基因表達，因此現在可能發現在植物細胞環境中有效的USP受體的新配體。篩選以編碼受體調節的報導基因的靶表達盒在轉基因植物或植物細胞中的表達為基礎，其中該轉基因植物或植物細胞也表達轉基因USP受體多肽及可任選的一種不同於USP受體多肽的第二受體多肽。將待檢驗其誘導靶多肽表達的USP受體介導的激活能力的化學物質以各種濃度與轉基因植物或植物細胞接觸，然後進行報導基因表達的測定以確定靶多肽的表達。將顯示激活或在統計學上顯著增加靶多肽表達的試驗物質以及顯示抑制或在統計學上顯著減少靶多肽表達的試驗物質鑑定為USP受體多肽的配體。該方法允許將以前不知道是植物細胞環境中的USP配體的試驗物質鑑定為其配體或將懷疑是植物細胞環境中的USP配體的試驗物質證實為其配體。因此現在可能經過進行如下方法步驟產生USP受體多肽的配體。—根據化學領域已知的常規方法合成新試驗物質；—用編碼USP受體多肽的USP受體表達盒和編碼靶多肽的靶表達盒轉化植物細胞；—培養所說的轉化植物細胞的後代細胞；—在後代細胞中表達USP受體多肽；—將後代細胞與如上合成的新試驗物質接觸；—確定靶多肽的表達；—用其它新試驗物質重複以上兩個方法步驟；—選擇顯著激活或抑制靶多肽表達的試驗物質；和—重複所選物質的化學合成。按上述方法步驟可獲得的USP受體多肽的配體構成本發明的另一主題。另外，該方法可用於鑑定靶多肽表達的USP受體介導的激活的拮抗劑或抑制劑。該拮抗劑以其減少靶多肽表達的配體誘導活性的能力來鑑定。不同的報導基因可用作篩選方法中的靶表達盒。一個有用的報導基因是螢火蟲螢光素酶。其在靶表達盒中的應用在下面實施例7和9中描述。另一有用的報導基因是GUS或葡糖苷酸酶，它催化諸如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸或鄰硝基苯基-β-D-葡糖苷酸的生色底物的裂解。GUS報導基因具有產生生色反應產物的優勢，該產物可經過例如分光光度計法定量或以肉眼觀察定性檢測。在篩選方法中有用的受體表達盒是USP，或USP的嵌合形式，如USP-VP16或VP16-USP。由於USP與哺乳動物RXRα受體在序列上相關，且RXR能與EcR形成雜二聚體(Thomas等，自然362471-475(1993))，所以編碼RXR的受體表達盒也可用於該篩選方法。以這種方式可發現USP配體用作植物細胞中的RXR配體的有用程度，或可將非保幼激素或其激動劑之一的化學物質鑑定為植物細胞中的RXR的合適的化學配體。實施例下面的實施例進一步描述了用於實施本發明的材料和方法以及所得的結果。它們以舉例說明的方式提供，且其描述不應看作是對本發明的限制。實施例1構建編碼蛻皮激素受體的植物可表達的受體表達盒從來自CantonSpupae(6天)的在λgt11(Clontech，Cat.no.IL1005b)中製備的cDNA文庫和從用EcRB1同種型的公開序列(Koelle等，細胞6759，1991)設計的寡核苷酸經基因組PCR產生的片段分離果蠅蛻皮激素受體(EcR)的DNA編碼區。使用標準方法經自動序列分析及與公開的序列進行序列對比證實B1同種型EcR序列(Talbot等，細胞，731323，1993)。使用寡核苷酸SF43(5′-CGCGGATCCTAAACAATGAAGCGGCGCTGGTCGAACAACGGC-3′；SEQIDNO1)在PCR反應中將表達的全長EcR編碼區修飾成剛好在起始密碼子的上遊含有一個BamHI位點。植物表達載體pMF6和pMF7含有一個花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)，玉米Adh1內含子1，和胭脂氨酸合成酶多聚腺苷酸化和終止信號(見Goff等，基因及發育5298，1991)。載體pMF6和pMF7的區別僅在於用於插入所需編碼序列的多接頭的取向不同。經過使用側翼BamHI限制性位點將全長EcR編碼序列連接到植物CaMV35S表達載體pMF6上。該受體表達盒稱為35S/EcR。實施例2構建編碼Ultraspiracle受體的植物可表達的受體表達盒Henrich等，核酸研究184143(1990)描述了編碼果蠅天然Ul-traspiracle受體(USP)的cDNA。將具有側翼5′和3′非翻譯區的全長USP編碼序列使用側翼EcoR1限制位點連接到植物表達載體pMF7(在實施例1中描述)上。該受體表達盒稱為35S/USP。實施例3構建具有GAL4的DNA結合區和EcR的配體結合區的受體表達盒構建受體表達盒，其中EcR的DNA結合區被融合到N端位置的GAL4的DNA結合區代替。按實施例1所述獲得果蠅EcR的DNA編碼區。從質粒pMA210亞克隆GAL4的DNA結合區的編碼序列，Ma和Ptashne，細胞，48847(1987)。經過將GAL4的DNA結合區融合到EcR的配體結合區和羧基末端來構建編碼GAL4-EcR嵌合受體多肽的受體表達盒。為了製備融合體，寡核苷酸SF23，(5′-CGCGGGATCCATGCGGCCGGAATGCGTCGTCCCG-3′；SEQIDNO2)用於經PCR將BamHI位點導入EcR的cDNA序列的相當於胺基酸殘基330的核苷酸位置(剛好在EcRDNA結合區之後)。將所得的截短的EcR編碼序列(EcR330-878)亞克隆進質粒pKS+(Stratagene)。經過按以前所述(Goff等，基因和發育5298，1991)將GAL4的編碼氨基末端的DNA序列到ClaI位點亞克隆進pSK+(Strata-gene)，從含DNA結合區(胺基酸1-147)的編碼序列的質粒pMA210獲得GAL4亞克隆。該質粒命名為pSKGAL2，並用ClaI和KpnI切割，插入如下雙鏈寡核苷酸5′-CGGGGGATCCTAAGTAAGTAAGGTAC-3′(SEQIDNO3)||||||||||||||||||||3′-CCCCTAGGATTCATTCATTC-5′(SEQIDNO4)所得的質粒命名為pSKGAL2.3。使用pSK+中GAL4的DNA結合區及pKS+中EcR330-878部分分子側翼的多接頭中的BamHI位點產生完全融合體35S/GAL4-EcR330-78。經過使用側翼EcoRI限制性位點將這些編碼序列連接進單子葉植物表達載體pMF6(在實施例1中描述)。這一受體表達盒稱為35S/GAL4-EcR330-878。實施例4構建具有Ultraspiracle的配體結合區及VP16的反式激活區的植物可表達的受體表達盒構建受體表達盒，它含有USP的配體結合區且VP16的反式激活區融合到USP多肽的N端或C端。為了構建編碼在C端位置具有VP16的反式激活區的嵌合多肽的受體表達盒，使用在編碼序列USP核苷酸號1471的XhoI位點經過亞克隆進pKS+(Stratagene)取出受體USPcDNA的羧基末端和終止密碼子(在實施例2中描述)。使用USP亞克隆的側翼KpnI限制性位點和編碼VP16羧基末端80個胺基酸的pSJT1193CRF3的KpnI位點(Triezenberg等，基因和發育2718-729(1988))將所得的編碼胺基酸1至490的USP亞克隆融合到VP16的反式激活區。使用USP-VP16編碼序列側翼的EcoRI和BamHI限制性酶切位點將所得的USP-VP16融合體克隆進CaMV35S植物表達載體pMF7(在實施例1中所述)。這些受體表達盒稱為35S/USP-VP16。經過使用寡核苷酸SF42(5′-CGCGGATCCATGGACAACTGCGACCAGGAC-3′；SEQIDNO5)在PCR反應中首先改造相鄰於USP起始密碼子的BamHI位點來構建具有融合到氨基末端的轉錄激活區的USP衍生物。除去VP16的終止密碼子，使用寡核苷酸SA115(5′-GTCGAGCTCTCGGATCCTAAAACAATGGCCCCCCCGACCGATGTC-3′；SEQIDNO7)作引物在PCR反應中在氨基末端導入使用寡核苷酸SF37(5′-GCGGGATCCCCCACCGTACTCGTCAATTC-3′；SEQIDNO6)導入的側翼BamHI位點和剛好在起始密碼子上遊具有植物共有序列的起始密碼子以及BamHI位點。以相鄰的BamHI位點將所得的VP16激活區和USP編碼序列(編碼胺基酸1到507)連接進框架中，以5′BamHI和3′EcoRI位點將VP16-USP編碼序列插入CaMV35S植物表達載體pMF7。該受體表達盒稱為35S/VP16-USP。實施例5構建具有EcR的DNA結合區和配體結合區及玉米C1調節基因的反式激活區的受體表達盒經過用在PCR反應中所用的寡核苷酸SF30(5′-CGC-GGA-TCC-ATG-GGT-CGC-GAT-GAT-CTC-TCG-CCF-TC-3′；SEQIDNO8)將起始密碼子放在全長EcR編碼序列上緊接EcRDNA結合區之前產生EcR227-825-C1融合體。玉米C1蛋白質轉錄激活區(胺基酸219-273)的編碼序列(Goff等，基因及發育5298-309(1991))在閱讀框中與EcR胺基酸51至825的編碼序列(在EcRKpnI限制性酶位點)融合。以編碼VPGPPSRSRV-SISLHA(SEQIDNO9)的多接頭將C1反式激活區連接到EcR上。經過將攜帶編碼序列的BamHI片段插入到pMF7載體上構建35S/EcR227-825-C1植物表達載體融合體。該受體表達盒稱為35S/EcR227-825-C1。實施例6構建具有GAL4的DNA結合區，EcR的配體結合區和玉米C1調節基因的反式激活區的受體表達盒使用實施例3所述的GAL4-EcR330-878構建體和實施例5的EcR227-825-C1構建體構建GAL4-EcR330-825-C1融合物。EcR編碼區的序列(在胺基酸456處開始)在AatII位點交換。該受體表達盒稱為35S/GAL4-EcR330-825-C1。實施例7構建具有GAL4DNA結合區反應元件的編碼螢火蟲螢光素酶的植物可表達的靶表達盒按如下方式構建具有GAL4DNA結合區的反應元件的編碼螢火蟲螢光素酶的植物可表達的靶表達盒。經NheI和SphI位點從Bz1報導基因pBz1LucR98(Roth等，植物細胞3317，1991)中去掉啟動螢火蟲螢光素酶合成的玉米Bronze-1(Bz1)核心啟動子並放入攜帶螢光素酶基因的pUC6S衍生的質粒中。修飾的Bz1核心啟動子含NheI位點(GCTAGC)和達到核苷酸位置-53的Bz1啟動子序列(Roth等，植物細胞3317，1991)。經過用EcoRI和PstI消化以GAL4調節的報導基因pGALLue2(Goff等，基因和發育5298，1991)去掉10個GAL4結合位點並使用相同的限制性酶位點插入pBlueScript(Stratagene)中。經過插入HindIII/BamHI/HindIII銜接頭將GAL4結合位點5′端的HindIII位點變成BamHI位點，去掉含GAL4結合位點的所得的BamHI片段並放入啟動螢光素酶的Bz1核心啟動子上遊的BglII位點。這一靶表達盒稱為(GAL4b.s.)10-Bz1TATA/Luc。實施例8構建具有直接重複反應元件的編碼螢火蟲螢光素酶的植物可表達的靶表達盒按下面方式構建具有含EcRE半位點和RXR-優選半位點的直接重複(DR)反應元件的編碼螢火蟲螢光素酶的植物可表達的靶表達盒在如實施例7中所述的來自pUC6S的質粒中的玉米Bz1核心啟動子螢光素酶構建體用作起點。合成具有BamHI和BglII粘性末端的含DRRE和間隔半位點的3個鹼基對的雙鏈合成寡核苷酸(SF775′-GATCCGTAGGGGTCACGAAGTTCACTCGCA-3′；SEQIDNO10)(SF785′-GATCTGCGAGTGAACTTCGTGACCCCTACG-3′；SEQIDNO11)，將其磷酸化，退火併經插入單一BglII位點將其連接到Bz1核心啟動子上遊。經過順序BglII消化並插入另一雙鏈寡核苷酸獲得3個拷貝的RE。這一靶表達盒稱為(OR3)3-Bz1TATA/Luc。實施例9植物細胞的轉化並在化學配體存在的條件下以受體多肽控制靶多肽的表達經過使用高速微粒轟擊以必需的基因構建體同時轉化植物細胞，接著對靶多肽的存在進行生化測定可顯示以包括本發明的嵌合受體多肽的各種受體多肽控制靶多肽的表達。該必需基因構建體包含編碼USP受體多肽的USP受體表達盒(圖1)。可任選的是，該USP受體表達盒可與編碼不同於USP的受體多肽的第二受體表達盒一起轉化(圖2和3)。另外，編碼靶多肽的靶表達盒也是必需的。使用在微粒上的DNA沉澱及由壓縮氦驅動的高速轟擊(PDS-100/He，BioRad，Hercules，CA)的標準技術經高速微粒轟擊將表達盒同時傳遞給在液態N6培養基中培養的玉米懸浮細胞(Chu等，Sci-entiaSinicaXVIII，659-668，1975)。在合適的化學配體存在下以液體懸液在N6培養基中培養轉染的細胞約48小時。培養後，收穫轉化的細胞，然後在0℃勻漿。經過以10,000g在4℃離心5分鐘去掉提取物中的碎片。經過測定提取物中靶表達盒編碼的產物的存在檢測靶多肽的表達。在化學配體存在下檢驗受體多肽的表達控制時一個常用的靶多肽的編碼序列是熒火蟲螢光素酶。使用分析發光2001型發光計使用ATP作底物(Promega螢光素酶試劑盒，目錄號E1500)經過定量由螢光素酶催化螢光素磷酸化產生的化學發光測定熒火蟲螢光素酶活性。實施例10受體多肽GAL4-EcR330-825-C1和USP-VP16激活植物細胞中靶多肽的表達且激活由保幼激素激動劑抑制使用實施例9的轉化方法，將受體表達盒35S/GAL4-EcR330-825-C1(實施例6)，受體表達盒35S/USP-VP16(實施例4)和靶表達盒(GAL4b.s.)10-Bz/TATA/Luc(實施例7)共同轉化進玉米細胞。在作為化學配體的10μM非諾碳氧化物或甲氧普林存在下培養轉化的細胞約48小時。按實施例9所述進行螢光素酶測定。結果在表1中提供。表1上面結果表明，含有GAL4反應元件的靶表達盒5′調節區可在植物細胞中被受體多肽GAL4-EcR-C1和USP-VP16激活，且在保幼激素激動劑存在的條件下逆轉該激活。在保幼激素激動劑存在的條件下與其不存在的條件下相比靶多肽螢光素酶的表達水平低3.5到31倍。實施例11受體多肽GAL4-EcR330-825-C1和USP-VP16激活植物細胞中靶多肽的表達且該激活被保幼激素激動劑抑制使用實施例9的轉化方法，將受體表達盒35S/GAL4-EcR330-825-C1(實施例6)，受體表達盒35S/USP-VP16(實施例4)和靶表達盒(GAL4b.s.)10-Bz1TATA/Luc(實施例7)共同轉化進玉米細胞。在10μMtebufenozide存在的條件下使用和不用10μM非諾碳氧化物或甲氧普林作為化學配體培養轉化的細胞大約48小時。按實施例9所述進行螢光素酶測定。表2上面的結果表明，含GAL4反應元件的靶表達盒5′調節區可在植物細胞中對化學配體tebufenozide作出反應被受體多肽GAL4-EcR-C1和USP-VP16激活，且在保幼激素激動劑甲氧普林存在下可抑制該激活。單獨使用時，tebufenozide誘導的螢光素酶基因表達的激活水平大約增加6倍，而在保幼激素激動劑甲氧普林存在時完全被抑制。實施例12受體多肽VP16-USP激活植物細胞中靶多肽的表達使用實施例9的轉化方法，將含受體表達盒35S/VP16-USP(實施例4)和靶表達盒(DR3)3-Bz1TATA/Luc(實施例8)的質粒共同轉化進玉米細胞。在10μM甲氧普林作為化學配體存在的條件下培養轉化細胞48小時。按實施例9所述進行螢光素酶測定。結果在表3中提供。表3上面的結果表明，含有直接重複反應元件的靶表達盒5′調節區在保幼激素激動劑存在的條件下可在植物細胞中被受體多肽VP16-USP激活。靶多肽螢光素酶的表達水平比在不存在保幼激素激動劑時觀察到的水平大約高16倍。實施例13構建表達EcR，USP或RXR衍生物且攜帶受體調節的報導基因的用於轉化擬南芥屬植物的載體從以前描述的質粒pGPTV-Kan和pGPTV-Hyg(Becker等，植物分子生物學201195-1197，(1992))構建土壤桿菌屬T-DNA載體質粒。pGPTV-Kan和pGPTV-Hyp質粒的SacI/HindIIIuidA(GUS)報導基因被來自pGEM4Zf(+)，pSPORT1，pBluescriptKS(+)，pIC20H或pUC18的SacI/HindIII多接頭取代分別產生質粒pSGCFW，pSGCFX，pSGCFY，pSGCFZ，pSGCGA，pSGCGC，pSGCGD，pSGCGE，pSGCGF和pSGCGG。經過首先將實施例7中所述的具有10GAL4結合位點和玉米Bronze-1TATA的328bpKpnI/HindIII片段亞克隆進修飾的螢光素酶報導基因質粒pSPLuc+(Promega)的KpnI/HindIII位點以產生質粒pSGCFO1而將作為靶表達盒的GAL4-調節的螢光素酶報導基因構建為T-DNA土壤桿菌屬質粒。經過連接到上面所述的pSGCFX1的7.194NdeI/SpeI片段和pSGCFZ1的4.111NdeI/KpnI片段上將來自含GAL4結合位點-Bz1TATA-螢光素酶報導基因的pSGCFO1的1.991KbKpnI/XbaI片段亞克隆進T-DNA載體。所得的質粒命名為pSGCGL1，且攜帶賦予轉基因植物卡那黴素抗性的由nos啟動子啟動的NPTII選擇標記和GAL4-調節的螢光素酶報導基因。以相似的方式構建GAL4-調節的GUS報導基因，該基因含10GAL4結合位點，35STATA區和GUS編碼區，且命名為pAT86。還以與對pSGCGL1所述相似的方式構建了具有3拷貝的DRRE，Bz1TATA，螢光素酶編碼區和類似於實施例8所述的nos終止子的直接重複(DR)反應元件報導基因，且命名為pSGCHU1。上面實施例3-6中所述的受體表達盒用於構建攜帶CaMV35S啟動子和nos多聚腺苷酸化信號的類似土壤桿菌T-DNA構建體。經過將合適的表達盒亞克隆進GAL4-螢光素酶報導基因pSGCGL1產生單個和雙重受體構建體。實施例14產生表達VP16-USP並攜帶DR-螢光素酶受體的轉基因擬南芥屬以下面的真空滲入程序用含CaMV35S啟動子和DR-螢光素酶報導基因的土壤桿菌屬載體(如上面實施例13所述)轉化Ara-bidopsisthaliana(Columbia)。經過在2xYT培養基中28℃下通氣培養GV3101土壤桿菌24-30小時至OD600為0.5-0.7單位製備電感受態GV3101土壤桿菌細胞，在冰上冷凍細胞10-30分鐘，以5,000RPM在4℃離心5分鐘。棄去上清液並將細胞沉澱重懸於1體積冰冷的10％甘油中。以5,000RPM在4℃下再次離心細胞5分鐘。棄去上清液，將細胞沉澱重懸於0.05體積冰冷的10％甘油中。將細胞再次以5,000RPM在4℃下離心5分鐘，棄去上清液，將細胞沉澱重懸於0.02體積的冰冷的10％甘油中。將細胞以5,000RPM在4℃再次離心5分鐘。棄去上清液，將細胞沉澱重懸於0.02體積冰冷的10％甘油中。將細胞以5,000RPM在4℃再次離心5分鐘。棄去上清液，將細胞沉澱重懸於0.01體積冰冷的10％甘油中。將細胞以每1.5ml微量離心管200μl的量分成等分試樣，在液N2中快速冷凍，貯存於-80℃。在-80℃貯存6周前使用電感受態細胞。在冰上復甦冷凍的電感受態細胞並將40μl轉移到預冷的1.5ml微離心管中。向復甦的細胞中加入1ml合適的土壤桿菌質粒DNA(2-10ng)並在冰上混合。將細胞/質粒混合物轉移進預冷的0.2cmBio-Rad電穿孔杯中，以2.0千伏特，600歐姆，25μ法拉及6msec的時間常數電穿孔。向電穿孔杯中加入1+ml2xYT培養基，用吸管尖混合細胞/質粒溶液，將該混合物轉移到新的1.5ml微離心管中，然後在200RFM的搖床上37℃培養細胞1小時。在Eppendorph可調速微離心機中以6檔離心細胞2分鐘，棄去上清液，將細胞沉澱重懸於剩餘液體中。將重懸細胞塗布到含合適抗生素的LB培養基平板上。平板在28-30℃培養2-3天。用單個轉化的菌落接種含100μg/ml利福平和25μg/ml慶大黴素和100μg/ml卡那黴素的在250ml瓶中的50mlLB培養基。在28℃以250RPM培養培養物24-36小時並將10ml培養物用於接種在2升瓶中的500mlLB+抗生素。以250RPM搖動在28℃下培養該培養物過夜。從該土壤桿菌屬培養物中分離質粒DNA並經限制性酶切分析證實。將擬南芥屬植物在設置為16小時光照，8小時黑暗，20℃的人工氣候室中3英寸方塑料盆中覆蓋了網的土壤上生長4-5周。使植物生長直到花分生組織為大約2英寸高。在接觸土壤桿菌屬前2天取下待轉化的擬南芥屬植物花分生組織。以5000RPM離心土壤桿菌屬培養物5分鐘，所得的沉澱重懸於500ml滲入培養基(4.3gMS鹽/升，5％蔗糖，0.01mg/ml苄氨基嘌呤，100ml/升SilwetL77，pH5.8)。將擬南芥屬植物浸泡於水中使土壤飽和。將500ml細菌細胞懸液轉移到無菌真空乾燥器底部。將在其盆中的擬南芥屬植物頂朝下放入土壤桿菌屬溶液中。使乾燥器抽真空5分鐘，然後緩慢釋放。將該真空處理重複3次，洗去植物上過多的土壤桿菌屬，返回到生長室。使真空滲入的植物成熟，開花並產生種子。將所得的種子在低溼度的乾燥室中95℃再乾燥大約5-10天。經過擠壓從乾燥的花中取出種子，然後通過425微米網篩過濾。真空滲入後大約需要花5周才能獲得種子。一旦完全乾燥，經過加入1ml70％E-tOH，徹底渦旋並在室溫下培養2分鐘滅菌大約240mg種子。在Eppendorf離心管中短暫地高速離心種子，去掉上清液。將沉澱的種子重懸於1ml滅菌緩衝液(1份10％TritonX-100，10份漂白劑，20份雙蒸水)中，渦旋並在室溫下培養30分鐘。在Eppendorph微離心機中以高速短暫地離心種子並去掉上清液。將種子重懸於1ml無菌雙蒸水中，渦旋，在微離心機中高速離心並去掉上清液。該洗滌步驟重複3次，然後將種子轉移到50ml離心管中在5ml雙蒸水中最後洗滌一次。在Beckman臺式離心機中以高速簡短地離心種子。棄去上清液，將種子重懸於24ml50℃的無菌0.8w/v％低熔點瓊脂糖中，混合，並分成8ml的等份在3隻含用於選擇的抗生素(50μg/ml卡那黴素或50μg/ml潮黴素)和500μg/ml羧苄青黴素的150mm萌發培養基(GM)平板(Murashige和Skoog，植物生理學15473-497，1962)的每個平板上。鋪板的種子在黑暗中4℃培養24小時，然後移進20℃，每天16小時光照，8小時黑暗循環的生長室中。在平板上選擇發芽的幼苗5-10天，將小植物移植到新鮮選擇平板上，5-10天後移植到土壤中再選擇。用塑料膜覆蓋新生移植小植物2-3天，然後生長到開始生出花分生組織。實施例15分離的轉基因植物組織的化學誘導以下列技術試驗轉基因植物誘導性基因表達。從轉基因植物中取出大約相同大小的兩片葉，在含50μg/ml卡那黴素(或25μg/ml潮黴素，如果轉基因攜帶該標記的話)，含0.1％乙醇或0.1％乙醇及10μM甲氧普林或非諾碳氧化物的水中培養。在實施例14所述的標準生長條件下將葉培養大約24小時。用誘導化合物培養後，經過在500μl100mMKPO41mMDTT，pH7.8緩衝液中0℃勻漿葉製備葉提取物。在Eppendorf微離心機中4℃離心提取物5分鐘，並在0℃貯存直至測定。使用分析發光型2010發光計和Promega螢光素酶測定系統根據廠家的建議測定每份提取物中的螢光素酶活性。使用PierceBCA蛋白質測定來測定提取物的蛋白質濃度(Smith等，分析生化15076-85)。螢光素酶值表示為室溫下每100μg提取蛋白質每10秒的光單位。非諾碳氧化物處理導致螢光素酶活性增加6.2倍，甲氧普林導致螢光素酶活性增加25倍，如下面表4所示。表4實施例16使用表達USP或RXR衍生物且攜帶受體調節的報導基因的轉基因植物或植物細胞篩選結合USP的新配體經過使用基於在也表達合適受體多肽的轉基因植物或植物細胞中作為靶表達盒的受體調節的報導基因的表達的篩選方法可發現在植物細胞環境中有效的USP或RXR的新配體。以這種方法，將需試驗其介導USP或RXR激活靶多肽表達的能力的化學物質以各種濃度與轉基因植物或植物細胞接觸，然後進行報導基因表達的測定。例如，1)可將攜帶作為靶表達盒的GAL4調節的螢光素酶報導基因和GAL4-EcR和USP-VP16受體表達盒的轉基因植物或植物細胞與該待試驗的物質接觸以便使用諸如Hamamatsu光檢測裝置的光放大儀器檢驗並與未接觸的植物比較，2)可將攜帶作為靶表達盒的GAL4-調節的GUS報導基因和GAL4-EcR-C1和VP16-RXR的受體表達盒的轉基因植物或植物細胞與該待試驗的物質接觸以便檢驗其催化諸如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸或鄰硝基苯基-β-D-葡糖苷酸的生色底物裂解的能力並與未接觸的植物比較，3)將攜帶DRRE-調節的螢光素酶報導基因和VP16-USP表達盒的轉基因植物或植物細胞與該待試驗的物質接觸以便使用諸如Hamamatsu光檢測裝置的光放大儀器檢測並與未接觸的植物比較。可發現在上述篩選方法中有用的陽性對照包括但不限於tebufenozide和甲氧普林。在上述每種情況下，在試驗物質存在下檢測靶多肽表達的水平比在缺乏試驗物質下的表達水平更高則表明根據在該方法中所用的受體表達盒該試驗物質是USP或RXR的配體。以這種方式，可將以前不知道在植物細胞環境中是USP配體的試驗物質鑑定為是，或將在植物細胞環境中懷疑是USP配體的試驗物質證實為是。實施例17分離基礎活性降低的受體多肽突變體使用Leung等，技術111-15(1989)所述的PCR誘變在體外產生Ultraspiracle受體(USP)的配體結合區中的突變。將突變的USP配體結合區的PCR片段克隆進有效連接到VP16轉錄激活區上的酵母表達載體中。將突變構建體轉化進酵母GAL4報導菌株GGY1171中。將酵母轉化體塗布到含指示劑X-Gal的培養基中。對雜二聚體的USP受體多肽活性的基礎水平下降的突變體在X-Gal指示劑平板上產生白色到亮藍色菌落，而表達未誘變的USP受體多肽的轉化體產生暗藍色菌落。經過在含甘油，乙醇和半乳糖作碳源的S培養基中培養代表所選擇的菌落的酵母細胞來檢驗白色到亮蘭色菌落的受體多肽活性的基礎及化學配體誘導的水平。將所得的培養物分成二部分，其一用保幼激素或其激動劑之一處理，另一個用作不存在化學配體的對照。與保幼激素或其激動劑之一接觸後，根據Miller的方法(分子遺傳學實驗，p.352-355，J.H.Miller，編輯，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1972)測定處理部分和對照部分的培養物的β-半乳糖苷酶活性。編碼以該技術分離和鑑定的突變受體多肽的核苷酸序列用作進一步檢測的候選物，因為其編碼的受體多肽在植物細胞中可能表現出基礎活性減少，在保幼激素或其激動劑之一存在時更高倍地誘導靶基因的表達或對保幼激素的不同激動劑產生不同的反應。實施例18鑑定在植物細胞中功能增強的突變受體多肽根據上面實施例2和4製備編碼實施例15的突變USP受體多肽的受體表達盒。根據實施例9的方法將這些受體表達盒與實施例8的靶表達盒組合轉化進植物細胞中。試驗轉化的植物細胞在保幼激素或其激動劑之一存在下突變受體多肽對靶表達盒5′調節區的激活。在植物細胞中，在不存在化學配體時產生低基礎表達的靶多肽且在保幼激素或其激動劑之一存在時產生高度表達的靶多肽的突變USP受體多肽對於控制植物的基因表達是有用的。實施例19培育轉基因植物的後代在實施例14中製備的Arabidopsisthaliana(Columbia)轉化植物在設置為16小時光照，8小時黑暗20℃的人工氣候室中在3英寸方的塑料盆中覆蓋了網的土壤上生長4-5周。該植物含有整合進其基因組中的根據本發明的受體和靶表達盒形式的外源DNA。由於轉化植物的生活周期，所說的整合的DNA通過受精過程從一代植物轉移到下一代。受精是雄性配子體與孢子體或配子體的雌性組織相互作用成功產生合子的過程。成熟的花粉粒在花葯中產生並貯存於柱頭表面(授粉)，在柱頭上水合併萌髮長出花粉管。在花粉管中精細胞傳遞給子房(雌蕊群)中的胚囊，在此發生實際的受精(配子融合)事件而產生合子。該合子以種子的形式得到植物品系的下一代。該下一代稱為轉化植物的「後代」。經自我受精可形成後代，其中從同一株植物產生雄性配子體和雌性配子體組織。這意味著單株植物是下一代基因組DNA的來源。另外，經過將來自一株植物的雄性配子體與另一植物的雌性孢子體組織接觸使兩株不同的植物雜交受精產生下一代植物可生產後代。在這一情況下，後代基因組DNA來自兩株不同的植物。而且，當轉化的植物與未轉化的植物雜交受精時，後代基因組DNA由來自一株植物的轉基因的基因組DNA與來自另一株植物的未轉基因的基因組DNA組成。不管轉化植物的後代是由自我受精還是由雜交受精產生，由於存在整合進基因組的外源DNA，因此一些後代將接受不等的遺傳分配。使用經典遺傳學和分子生物學技術可證實這一不等的遺傳分配。為了產生含根據本發明的受體和靶表達盒的下一代植物，在控制的環境條件下使原始轉化植物成熟，開花並產生種子。所得的種子在95°F，低溼度的乾燥室中進一步乾燥大約5-10天。經過擠壓長角果，然後通過425μm網篩過濾從其它植物材料中分離種子從乾花中取出種子。該種子可用於繁殖後代植物。儘管針對擬南芥屬植物進行了描述，產生下一代轉化植物的該方法一般可應用於具有整合進其基因組的根據本發明的受體和靶表達盒的所有被子植物。本說明書提到的所有出版物和專利申請表明了與本發明有關的本領域的技術人員的技術水平。本文引用所有出版物和專利申請作為參考，如同參考所引用的具體和分別所述的各出版物或專利申請。儘管為了理解清楚而以舉例說明和實施例的方式在某些細節上描述了上述發明，但在所附權利要求的範圍內可實施某些改變和修飾是顯而易見的。序列描述(1)一般信息(i)申請人(A)名稱CIBA-GEIGYAG(B)街道Klybeckstr.141(C)城市Basel(E)國家Switzerland(F)郵編4002(G)電話+4161691111(H)傳真+41616967976(I)電傳962991(ii)發明題目保幼激素或其激動劑之一作為以受體介導的反式激活控制植物基因表達的化學配體(iii)序列數11(iv)計算機可讀形式(A)媒體類型Floppy盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentInRelease#1.0，Version#1.30B(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特徵(A)長度42個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸SF43」(iii)假定無(xi)序列描述SEQIDNO1CGCGGATCCTAAACAATGAAGCGGCGCTGGTCGAA-CAACGGC42(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特徵(A)長度34個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸SF23」(iii)假定無(xi)序列描述SEQIDNO2CGCGGGATCCATGCGGCCGGAATGCGTCGTCCCG34(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特徵(A)長度26個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「用於建立pSKGAL2.3的正鏈寡核苷酸」(iii)假定無(xi)序列描述SEQIDNO3CGGGGGATCCTAAGTAAGTAAGGTAC26(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「用於建立pSKGAL2.3的互補鏈寡核苷酸」(iii)假定無(xi)序列描述SEQIDNO4CTTACTTACTTAGGATCCCC20(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸SF42」(iii)假定無(xi)序列描述SEQIDNO5CGCGGATCCATGGACAACTGCGACCAGGAC30(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特徵(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸SF37」(iii)假定無(xi)序列描述SEQIDNO6GCGGGATCCCCCACCGTACTCGTCAATTC29(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特徵(A)長度45個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「寡核苷酸SA115」(iii)假定無(xi)序列描述SEQIDNO7GTCGAGCTCTCGGATCCTAAAACAATGGCCCCCCCGACCGATGTC45(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特徵(A)長度35個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝」寡核苷酸SF30」(iii)假定無(xi)序列描述SEQIDNO8CGCGGATCCATGGGTCGCGATGATCTCTCGCCTTC35(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特徵(A)長度16個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲線型(ii)分子類型肽(iii)假定無(v)片段類型內部(xi)序列描述SEQIDNO9ValProGlyProProSerArgSerArgValSerIleSerleuHisAla151015(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「引物SF77」(iii)假定無(xi)序列描述SEQIDNO10GATCCGTAGGGGTCACGAAGTTCACTCGCA30(2)SEQIDNO11的信息(i)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線型(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「引物SF78」(iii)假定無(xi)序列描述SEQIDNO11GATCTGCGAGTGAACTTCGTGACCCCTACG30權利要求1.一種轉基因的植物細胞，植物材料或植物及其後代，包括a)編碼USP受體多肽的USP受體表達盒，和b)編碼靶多肽的靶表達盒。2.根據權利要求1的植物細胞，植物材料或植物，其中靶表達盒的表達幹擾植物生育力。3.一種生產根據權利要求1的植物細胞或植物的方法，包含用a)編碼USP受體多肽的USP受體表達盒，和b)編碼靶多肽的靶表達盒，轉化植物細胞或植物。4.根據權利要求3的方法，包含獲得用所說的表達盒轉化的植物細胞或植物的後代。5.根據權利要求1的植物，其中所說的植物是玉米。6.根據權利要求1的植物，其中所說的植物是小麥。7.一種控制根據權利要求1的植物或另外還包含編碼不同於USP受體多肽的第二受體多肽的第二受體表達盒的這類植物中基因表達的方法，包含a)在所說的植物中表達一個或多個該受體多肽，和b)將所說的植物與保幼激素或其激動劑之一接觸。8.根據權利要求7的方法，其中在保幼激素或其激動劑之一存在下該靶多肽的表達增加或被激活。9.根據權利要求7的方法，其中在保幼激素或其激動劑之一存在下靶多肽的表達減少或受抑制。10.根據權利要求7的方法，其中USP受體多肽包括異源反式激活區。11.根據權利要求10的方法，其中所說的異源反式激活區是來自單純皰疹VP16蛋白的反式激活區。12.根據權利要求7的方法，其中所說的第二受體多肽選自EcR，DHR38和RXR。13.根據權利要求7的方法，其中所說的激動劑選自非諾碳氧化物，diofenolan，丙炔保幼素甲氧普林，hydroprene，diofenolan，甲氧普林酸triflumuron，hexamflumuron，teflubenzuron，flufenoxuron，flucycloxuron，和lufenuron，diflubenzuron和chlorfluzuron。14.根據權利要求7的方法，其中所說的靶表達盒包括含有1至11拷貝的反應元件的5′調節區。15.一種控制根據權利要求2的植物或另外還含有編碼第二受體多肽的第二受體表達盒的該植物的生育力的方法，包含a)在所說的植物中表達一種或多種受體多肽；及b)將所說的植物與保幼激素或其激動劑之一接觸。16.根據權利要求15的方法，其中在保幼激素或其激動劑之一存在下增加或激活靶多肽的表達。17.根據權利要求15的方法，其中在保幼激素或其激動劑之一存在下靶多肽的表達減少或受抑制。18.根據權利要求15的方法，其中USP或第二受體表達盒包含有效連接到受體多肽編碼序列上的花葯特異性啟動子。19.根據權利要求15的方法，其中USP或第二受體表達盒包含有效連接到受體多肽編碼序列上的雌蕊特異性啟動子。20.根據權利要求15的方法，其中靶多肽是核糖核酸酶芽孢桿菌RNA酶。21.根據權利要求15的方法，其中靶表達盒編碼導致受精無效的反義序列。22.根據權利要求15的方法，其中靶多肽恢復有效受精。23.根據權利要求22的方法，其中靶多肽是核糖核酸酶抑制劑芽孢桿菌RNA酶抑制劑。24.一種鑑定在植物細胞環境中激活或抑制靶表達盒表達的USP受體多肽的配體的方法，包含下列步驟a)用編碼USP受體多肽的USP受體表達盒與編碼靶多肽的靶表達盒轉化植物細胞；b)在所說的植物細胞中表達USP受體多肽；c)將植物細胞與試驗物質接觸；d)檢測靶多肽的表達；和e)鑑定明顯激活或抑制靶多肽表達的試驗物質。25.根據權利要求24的方法，進一步包含用編碼不同於USP受體多肽的第二受體多肽的第二受體表達盒轉化所說的植物細胞並表達該第二受體多肽。26.根據權利要求24的方法，其中定性測定靶多肽的表達。27.根據權利要求24的方法，其中靶多肽的表達經定量測定。28.一種生產USP受體多肽的配體的方法，包括下列步驟a)根據本領域已知的方法合成新的試驗物質；b)用編碼USP受體多肽的USP受體表達盒和編碼靶多肽的靶表達盒轉化植物細胞；c)培養所說的轉化植物細胞的後代細胞；d)在後代細胞中表達USP受體多肽；e)將後代細胞與步驟a)的試驗物質接觸；f)測定靶多肽的表達；g)用根據步驟a)的不同試驗物質重複步驟e)和f)的方法；h)選擇明顯激活或抑制靶多肽表達的試驗物質；和i)對於在步驟h)中選擇的物質重複步驟a)的方法。29.以根據權利要求28的方法可獲得的USP受體的配體。30.一種農學方法，其中利用包含下列物質的轉基因植物材料或植物a)編碼USP受體多肽的USP受體表達盒；和b)編碼靶多肽的靶表達盒。31.保幼激素或保幼激素激動劑在根據權利要求1的植物中控制靶多肽表達的應用。全文摘要本發明描述了控制植物中基因表達的方法。具體地說,該方法包括用編碼USP受體的USP受體表達盒和編碼靶多肽的至少一種靶表達盒轉化植物。所說的轉化植物與保幼激素或其激動劑之一的接觸在所說的USP受體多肽存在時激活靶多肽的表達。可任選的是,可使用另一種「第二」受體表達盒,其中第二受體表達盒編碼不同於USP的受體多肽。該方法對於控制各種重要的農學性狀,如植物生育力,有用。還公開了鑑定以前未知的USP配體的方法。經過將待試物質與用USP受體表達盒和靶表達盒轉化的植物細胞接觸來鑑定它們。靶表達盒編碼報導基因多肽,其表達可定量或定性測定,從而將試驗物質鑑定為USP配體。文檔編號C12N15/09GK1202202SQ96198263公開日1998年12月16日申請日期1996年9月27日優先權日1995年10月10日發明者L·D·克羅斯蘭德,S·A·高夫申請人:諾瓦提斯公司