結合bmp2的硫酸類肝素的製作方法

2023-05-15 15:55:26

專利名稱：結合bmp2的硫酸類肝素的製作方法
技術領域：
本發明涉及能夠結合BMP2的糖胺聚糖，包括它們的分離和鑑定，以及分離的糖胺聚糖在組織生長和/或發育中的應用。
背景技術：
糖胺聚糖(GAG)是複雜的碳水化合物大分子，其負責執行和調控多種基本細胞功能。GAG與數百種已知的肝素結合生長和粘附因子協作參與信號系統的調節或介導。 已考慮生長因子與GAG的結合通過多種作用調節它們的多種活動，如通過保護它們不被蛋白水解降解來延長它們的半衰期，調節這些細胞因子在細胞表面上的定位，介導分子相互作用和穩定配基-受體複合物。已鑑別的肝素結合生長因子的數目不斷增加，加上數百種已知的肝素結合生長因子，它們中大多數是通過肝素親合色譜純化的。它們包括較大的成纖維細胞生長因子(FGF) 家族、PDGF、多效營養因子(或多效生長因子，pleiotropin)以及細胞因子TGF-β超家族。 後一個因子家族涵蓋了骨誘導性骨形態發生蛋白(BMP)亞家族，該亞家族是根據它們誘導異位骨形成的能力命名的。GAG與生長因子間相互作用的性質和作用仍不清楚。儘管已表明FGF2與肝素內存在的特定糖序列之間的相互作用具有高親合性，但是一般來說，仍不清楚其它生長因子與類肝素之間的結合是否涉及蛋白質生長因子上的胺基酸序列或構象表位與嵌入GAG中的糖序列之間的高親合性或特異結合相互作用，或者這種結合是否是由GAG與蛋白生長因子之間的低親合性、非特異相互作用所介導的。如果GAG與存在於細胞外基質中或分泌到細胞外基質中的蛋白質之間的相互作用是特異性的，那麼需要鑑別結合配偶體(binding partner)以解釋該相互作用並理解可以如何使用或調節這些相互作用以提供新型治療。因此，所產生的主要問題是在與生長因子多肽主鏈內的一級胺基酸序列/3維三級構象匹配的GAG分子鏈中是否嵌入了糖序列，從而以絕對或至少相對的特異性控制它們的結合，並由此控制它們的生物活性。骨形態發生蛋白2 (也稱作骨形態形成蛋白2、BMP2或BMP-幻是與骨和軟骨發育密切相關的TGF-β超家族的成員。它是一種成骨蛋白，即成骨細胞分化的強效誘導劑 (Marie等人，(2002) 「 Regulation of human cranial osteoblast phenotype by FGF-2, FGFR-2and BMP_2signaling〃 . Histol. Histopathol. 17(3) :877-85)。浸漬有 BMP2 的膠原海綿的植入顯示出對新骨形成的誘導(Geiger M，Li RH,Friess W(2003年11月).Collagen sponges for bone regeneration with rhBMP-2. Adv. Drug Deliv. Rev. 55(12) :1613-29)。 在美國，重組人BMP2可用於整形外科應用(例如，INFUSE Bone Graft,Medtronic Inc, USA)。

發明內容
本發明涉及硫酸類肝素製劑、硫酸類肝素HS/BMP2。已發現HS/BMP2能夠提高結締組織的生成、修復和再生。在本發明的一個方面，提供了硫酸類肝素HS/BMP2。可以提供分離形式或基本純化形式的HS/BMP2。這可以包括提供其中硫酸類肝素組分為至少80% HS/BMP2的組合物，更優選地，為至少 85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%之一。在優選的實施方式中，HS/BMP2能夠結合具有胺基酸序列SEQ IDNO :1或6或由該胺基酸序列組成的肽或多肽。在一些實施方式中，該肽為SEQ ID NO :1或6，在其它實施方式中，它為BMP2蛋白。在一些實施方式中，HS/BMP2與具有胺基酸序列SEQ ID NO :1或 6或由該胺基酸序列組成的肽結合的Kd小於100 μ Μ,更優選地，小於50 μ Μ、40 μ m、30 μ m、 20μΜ或 10 μ M 之一。在一些優選的實施方式中，HS/BMP2為N-硫酸化的。這可以包括硫酸類肝素寡糖鏈中N-乙醯-D-葡糖胺(GlcNAc)殘基的N-硫酸化。優選地，HS/BMP2中的至少80% N-乙醯-D-葡糖胺(GlcNAc)殘基被N-硫酸化。在一些實施方式中，這可以是至少85%、90%、 95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 之一。在一些優選的實施方式中，HS/BMP2被6_0_硫酸化(N-硫酸葡糖胺(GlcNQ殘基在C6處的0-硫酸化)。優選地，HS/BMP2中的至少80 % N-硫酸葡糖胺(GlcNS)殘基被 6-0-硫酸化。在一些實施方式中，這可以是至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 之一。根據本發明人在本文中所述的方法，可以獲得、鑑定、分離或富集HS/BMP2，所述方法可以包括下列步驟(i)提供固體載體，其具有附著到該載體上的多肽分子，其中所述多肽包含具有胺基酸序列SEQ ID NO :1或6的肝素結合結構域；(ii)使所述多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸從而使得形成多肽-糖胺聚糖複合物；(iii)將多肽-糖胺聚糖複合物流分與混合物的其餘部分分開；(iv)使糖胺聚糖從多肽-糖胺聚糖複合物解離；(ν)收集解離的糖胺聚糖。在本發明人的方法中，所述混合物可以包含得自可商購來源的糖胺聚糖。一種適合來源為硫酸類肝素流分，例如，可商購的硫酸類肝素。一種適合的硫酸類肝素流分可以在從豬腸黏膜分離肝素期間獲得(例如，Celsus Laboratories he.-有時被稱為「Celsus HS」)。硫酸類肝素的其它適合來源包括來自任何哺乳動物(人或非人)的硫酸類肝素，尤其是來自腎、肺或腸黏膜的硫酸類肝素。在一些實施方式中，硫酸類肝素來自豬(豬科)或母牛(牛科)的腸黏膜、腎或肺。另一種適合來源為成骨細胞細胞外基質材料，或者獲自成骨細胞細胞外基質材料的硫酸類肝素流分。在本發明的另一個方面，提供了包含根據上述任一方面的HS/BMP2和BMP2蛋白的組合物。在本發明的一個方面，提供了包含根據上述方面的HS/BMP2的藥物組合物或藥劑。所述藥物組合物或藥劑還可以包含藥用載體、佐劑或稀釋劑。
在一些實施方式中，所述藥物組合物用於在治療方法中使用，所述方法包括斷骨的修復和/或再生。在一些實施方式中，該藥物組合物或藥劑還可以包含BMP2蛋白。在一些實施方式中，該藥物組合物或藥劑還可以包含間充質幹細胞。在本發明的另一個方面，提供了 HS/BMP2，其用於在醫療方法中使用。該醫療方法可以包括體內傷口癒合的方法、結締組織的修復和/或再生、骨的修復和/或再生和/或哺乳動物或人骨的修復和/或再生。在本發明的相關方面中，提供了 HS/BMP2在製造用於醫療方法的藥劑中的應用。 在一些實施方式中，該醫療方法包括哺乳動物或人的斷骨的修復和/或再生。在本發明的另一個方面，提供了包含生物材料和HS/BMP2的生物相容性植入物或假體。在一些實施方式中，該植入物或假體塗覆有HS/BMP2。在一些實施方式中，該植入物或假體浸漬有HS/BMP2。所述植入物或假體還可以塗覆或浸漬有BMP2蛋白和/或間充質幹細胞。在本發明的另一個方面，提供了形成生物相容性植入物或假體的方法，該方法包括用HS/BMP2塗覆或浸漬生物材料的步驟。在一些實施方式中，該方法還包括用BMP2蛋白和間充質幹細胞中的之一或兩者塗覆或浸漬生物材料。在本發明的另一個方面，提供了治療患者骨折的方法，所述方法包括向所述患者給予治療有效量的HS/BMP2。在一些實施方式中，所述方法包括將HS/BMP2施用至骨折周圍的組織。在一些實施方式中，所述方法包括將HS/BMP2注射至骨折周圍的組織。在這些方法中，可以將HS/BMP2配製成包含HS/BMP2和藥用載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物或藥劑。在一些實施方式中，所述方法還可以包括將BMP2蛋白施用至患者。在這些方法中，可以將HS/BMP2和BMP2蛋白配製成包含HS/BMP2和BMP2蛋白以及可藥用載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物。在一些實施方式中，所述方法還可以包括向患者給予間充質幹細胞。在這些方法中，可以將HS/BMP2、BMP2蛋白和間充質幹細胞中的至少兩種配製成包含HS/BMP2、BMP2蛋白和間充質幹細胞中的至少兩種以及藥用載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物。優選地，分別以治療有效量提供HS/BMP2、BMP2蛋白和間充質幹細胞。在一些實施方式中，治療骨折的方法還包括以下步驟將治療有效量的HS/BMP2和/或BMP2蛋白和/ 或間充質幹細胞配製成包含HS/BMP2和/或BMP2蛋白和/或間充質幹細胞以及藥用載體、 佐劑或稀釋劑的藥物組合物，其中向患者給予該藥物組合物。在本發明的另一個方面，提供了治療患者骨折的方法，所述方法包括將生物相容性植入物或假體手術植入到在骨折部位處或骨折部位周圍的患者組織中，該植入物或假體包含生物材料和HS/BMP2。在一些實施方式中，所述植入物或假體塗覆有HS/BMP2。在一些實施方式中，所述植入物或假體浸漬有HS/BMP2。在一些實施方式中，所述植入物或假體還浸漬有BMP2蛋白和間充質幹細胞中之一或兩者。在本發明的另一個方面，提供了培養基，所述培養基包含HS/BMP2。在本發明的另一個方面，提供了 HS/BMP2在體外細胞培養中的應用。在本發明的相關方面，提供了 HS/BMP2在結締組織體外生長中的應用。在本發明的另一個相關方面，提供了結締組織體外生長的方法，所述方法包括培養與外源添加的HS/BMP2接觸的間充質幹細胞。在本發明的另一個方面，提供了促進骨生成的方法，所述方法包括將HS/BMP2施用至骨前體細胞或骨幹細胞。所述方法可以包括使骨前體細胞或骨幹細胞與HS/BMP2體內或體外接觸。在一些實施方式中，使骨前體細胞或骨幹細胞與BMP2蛋白接觸，並同時與HS/ BMP2接觸。在優選的實施方式中，骨前體細胞或骨幹細胞為間充質幹細胞。在本發明的另一個方面，提供了在需要該治療的人或動物患者中骨組織的修復、 置換或再生的方法，所述方法包括(i)將與HS/BMP2接觸的間充質幹細胞體外培養足以使所述細胞形成骨組織的一段時間；(ii)收集所述骨組織；(iii)將所述骨組織在創傷或疾病部位處植入到患者的身體中以修復、置換或再生患者的骨組織。在一些實施方式中，所述方法還包括使培養物中的間充質幹細胞與外源BMP2蛋白接觸。在本發明的另一個方面，提供了通過在存在HS/BMP2的情況下體外培養間充質幹細胞所獲得的骨組織。在一些實施方式中，該骨組織是通過在存在HS/BMP2和BMP2蛋白的情況下體外培養間充質幹細胞獲得的。在本發明的另一個方面，提供了培養間充質幹細胞的方法，所述方法包括培養與 HS/BMP2接觸的間充質幹細胞。在本發明的另一個方面，提供了包含多個部件的試劑盒，所述試劑盒包含預定量的HS/BMP2和預定量的BMP2。所述試劑盒可以包含含有預定量HS/BMP2的第一容器和含有預定量BMP2的第二容器。所述試劑盒還可以包含預定量的間充質幹細胞。可以提供該試劑盒以在醫療方法中使用。該醫療方法可以包括體內傷口癒合、結締組織的修復和/或再生、骨的修復和/或再生和/或哺乳動物或人骨的修復和/或再生的方法。可以與所述試劑盒一同提供說明單獨、順序或同時施用HS/BMP2、BMP2蛋白和/或間充質幹細胞以提供醫學治療的說明書。在本發明的另一個方面提供了產品，所述產品含有治療有效量的下列物質(i)HS/BMP2 ；和以下中的之一或兩者(ii)BMP2 蛋白；(iii)間充質幹細胞，以用於在醫療方法中同時、單獨或順序使用。該醫療方法可以包括體內傷口癒合、 結締組織修復和/或再生、骨的修復和/或再生和/或哺乳動物或人骨的修復和/或再生的方法。可以可選地將該產品配製為用於同時給藥的複合製劑。以下說明了本發明的其它方面。在本發明的一個方面，提供了對BMP2具有高結合親合力的GAG。更優選地，GAG為硫酸類肝素(HS)。在一種實施方式中，按照本文所述的方法，從成骨細胞的細胞外基質獲得的GAG混合物中分離出HS，其中將包含BMP2的肝素結合結構域(SEQ ID NO :1)的多肽連接到固體載體上並且使得形成GAG-多肽複合物。GAG組分從GAG-多肽複合物的解離導致在本文被稱為「HS/BMP2」(有時稱為「HS-3」或「HS3」)的獨特HS的分離。在另一種實施方式中，使用相同方法從肝素與豬腸黏膜分離期間獲得的並且得自 Celsus Laboratories Inc (Cincinnatti, USA)的可商購硫酸類肝素(Celsus HS)(例如， 1爾-08-045，硫酸類肝素1丄618118 Lab Inc，H0-03102，H0_10595，IOX IOOmg)中分離出 HS/ BMP2。本發明人相信，能夠從獲自多種來源的HS流分中獲得HS/BMP2，所述來源包括哺乳動物(人和非人)組織和/或細胞外基質。因此，在本發明的一個方面，提供了 HS/BMP2。可以提供分離或純化形式的HS/ BMP2。在另一個方面，提供了包含HS/BMP2的培養基。在本發明的另一個方面，提供了包括HS/BMP2的藥物組合物或藥劑，其可選地與藥用載體、佐劑或稀釋劑組合。在一些實施方式中，藥物組合物或藥劑還可以包含BMP2蛋白。提供了用於創傷或疾病的預防或治療的包含HS/BMP2的藥物組合物或藥劑。還提供了 HS/BMP2在製造用於預防或治療創傷或疾病的藥劑中的應用。在本發明的另一個方面，提供了預防或治療需要治療的患者中創傷或疾病的方法，所述方法包括向患者給予有效量的HS/BMP2。可以將所給予的HS/BMP2配製到適合的藥物組合物或藥劑中，並且還可以包含藥用載體、佐劑或稀釋劑。可選地，該藥物組合物或藥劑還可以包含BMP2蛋白。在本發明的另一個方面，提供了促進或抑制骨生成(骨細胞和/或骨組織形成) 的方法，包括向骨前體細胞或骨幹細胞施用HS/BMP2。在本發明的另一個方面，提供了促進或抑制軟骨組織形成(軟骨形成)的方法，包括向軟骨前體細胞或軟骨幹細胞施用HS/BMP2。可選地，提供了在存在外源加入的BMP2蛋白的情況下，通過使骨或軟骨前體細胞或幹細胞與HS/BMP2接觸，可以體外實施刺激或抑制骨生成或軟骨組織形成的方法。所述前體細胞或幹細胞可以是間充質幹細胞。在促進組織形成的情況下，可以收集所形成的組織並用於向人或動物患者移植。因此，在本發明的一個方面，提供了結締組織，其中該結締組織是在存在HS/ BMP2 (即，外源HS/BMP2)，並且可選地在存在BMP2 (即，外源BMP2)的情況下，通過間充質幹細胞的體外培養獲得的。所述結締組織可以是骨、軟骨、肌肉、脂肪、韌帶或腱。使用HS/BMP2的疾病預防或治療可以包括組織的修復、再生或置換，尤其是結締組織，如骨、軟骨、肌肉、脂肪、韌帶或腱。在這些組織之一發生惡化的患者中，可向惡化部位施用HS/BMP2以用於刺激該部位的組織生長、增殖和/或分化。例如，對施用部位處或附近的間充質幹細胞的刺激(優選地，當該部位處也存在BMP2時)會導致間充質幹細胞增殖且分化為適當的結締組織，由此提供了對損傷組織的置換/再生以及創傷的治療。可替代地，可收集從與HS/BMP2接觸的間充質幹細胞的體外培養物中獲得的結締組織並且在創傷或疾病部位處植入以置換損傷或惡化的組織。可選地，可以首先將損傷或惡化的組織從創傷或疾病部位切除。在另一個方面，可以提供含有幹細胞(優選間充質幹細胞)和HS/BMP2的藥物組合物。組合物在創傷、疾病或惡化部位處的施用(例如，注射)提供了該部位處組織的再生。
因此，HS/BMP2可用於體內傷口癒合，包括組織修復、再生和/或置換(例如，瘢痕組織或斷骨的癒合)，其通過將HS/BMP2，可選地與BMP2和/或幹細胞組合而直接應用至需要治療的患者來起作用。HS/BMP2還可用於組織的體外生成，所述組織適合於移植到需要組織修復、再生和/或置換的患者體內。下列編號段落包含了對本文所公開的創造性技術特徵的廣泛組合的說明1、一種分離能夠與具有肝素結合結構域的蛋白質結合的糖胺聚糖的方法，所述方法包括(i)提供固體載體，其具有附著到該載體上的多肽分子，其中該多肽包含肝素結合結構域；(ii)使該多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸從而使得能夠形成多肽-糖胺聚糖複合物；(iii)將多肽-糖胺聚糖複合物與該混合物的其餘部分分開；(iv)使糖胺聚糖從該多肽-糖胺聚糖複合物解離；(ν)收集解離的糖胺聚糖。2、一種鑑別能夠刺激或抑制細胞和/或組織生長和/或分化的糖胺聚糖的方法， 所述方法包括(i)提供固體載體，其具有附著到該載體上的多肽分子，其中所述多肽包含肝素結合結構域；(ii)使該多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸從而使得能夠形成多肽-糖胺聚糖複合物；(iii)將多肽-糖胺聚糖複合物與混合物的其餘部分分開；(iv)使糖胺聚糖從多肽-糖胺聚糖複合物解離；(ν)收集解離的糖胺聚糖；(vi)將收集的糖胺聚糖添加到細胞或組織中，其中存在含有肝素結合結構域的胺基酸序列的蛋白質；(vii)測量以下的一項或多項細胞增殖、細胞分化、一種或多種蛋白質/糖蛋白/ 糖脂標記物的表達。3、第1段或第2段所述的方法，其中包含糖胺聚糖的混合物含有細胞外基質材料。4、第3段所述的方法，其中細胞外基質材料來源於結締組織或結締組織細胞。5、第1段至第4段中任一段所述的方法，其中包含糖胺聚糖的混合物含有硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸類肝素中的一種或多種。6、第1段至第5段中任一段所述的方法，其中包含糖胺聚糖的混合物富含硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸類肝素中的一種。7、第1段至第6段中任一段所述的方法，其中所述方法還包括對所收集的糖胺聚糖進行進一步分析以確定GAG的結構特徵。8、第1段至第7段中任一段所述的方法，其中糖胺聚糖-多肽複合物與裂合酶接觸。9、第1段至第8段中任一段所述的方法，其中所述多肽為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2 之一或包含 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 2 之一。
10、硫酸類肝素 HS/BMP2。11、包含HS/BMP2的培養基。12、包含HS/BMP2的藥物組合物或藥劑。13、第12段所述的藥物組合物或藥劑，還包含藥用載體、佐劑或稀釋劑。14、第12段或第13段所述的藥物組合物或藥劑，還包含BMP2蛋白。15、第12段至第14段中任一段的藥物組合物或藥劑，用於預防或治療創傷或疾病。16、HS/BMP2在製造用於預防或治療創傷或疾病的藥劑中的應用。17、第15段或第16段所述的藥物組合物或應用，其中所述預防或治療選自結締組織的修復、再生或置換以及傷口癒合。18、一種預防或治療需要治療的患者中創傷或疾病的方法，所述方法包括向患者給予有效量的HS/BMP2。19、第18段所述的方法，其中將所給予的HS/BMP2配製為藥物組合物或藥劑。20、第19段所述的方法，其中所述藥物組合物或藥劑還包含BMP2蛋白。21、一種促進或抑制骨生成的方法，包括將HS/BMP2施用於骨前體細胞或骨幹細胞。22、第21段所述的方法，其中所述骨前體細胞或骨幹細胞與HS/BMP2體外接觸。23、第21段所述的方法，其中所述骨前體細胞或骨幹細胞與HS/BMP2體內接觸。24、第21段至第23段中任一段所述的方法，其中骨前體細胞或骨幹細胞與BMP2 接觸，同時與HS/BMP2接觸。25、一種促進或抑制軟骨組織形成的方法，包括向軟骨前體細胞或軟骨幹細胞施用 HS/BMP2。26、第25段所述的方法，其中軟骨前體細胞或軟骨幹細胞與HS/BMP2在體外接觸。27、第25段所述的方法，其中軟骨前體細胞或軟骨幹細胞與HS/BMP2在體內接觸。28、第25段至第27段中任一段所述的方法，其中軟骨前體細胞或軟骨幹細胞與 BMP2接觸，同時與HS/BMP2接觸。29、一種用於修復、置換或再生需要治療的人或動物患者中的結締組織的方法，該方法包括(i)將與HS/BMP2接觸的間充質幹細胞體外培養足以使所述細胞形成結締組織的一段時間；(ii)收集該結締組織；(iii)將所述結締組織在創傷或疾病部位處植入到患者的身體中以修復、置換或再生患者的結締組織。30、第四段所述的方法，還包括使培養物中的間充質細胞與外源BMP2接觸。31、在存在HS/BMP2的情況下，通過間充質幹細胞的體外培養獲得的結締組織。32、第31段中所述的結締組織，其中在存在外源BMP2，並且可選地在存在BMP2的情況下培養該間充質細胞。33、一種藥物組合物，包含幹細胞和HS/BMP2。34、第32段所述的藥物組合物，其中所述幹細胞為間充質幹細胞。
35、第33段或第34段所述的藥物組合物，其中所述組合物還包含BMP2。36、第33段至第35段中任一段的藥物組合物，用於治療創傷或疾病。37、一種治療需要治療的患者中的創傷或疾病的方法，包括向所述患者給予包含幹細胞和HS/BMP2的藥物組合物。38、第37段所述的方法，其中所述幹細胞為間充質幹細胞。39、第37段或第38段所述的方法，其中所述方法還包括向患者給予BMP2。40、HS/BMP2在結締組織體外生長中的應用。41、一種用於體外生長結締組織的方法，包括培養與外源加入的HS/BMP2接觸的間充質幹細胞。42、一種生物植入物，包含浸漬有HS/BMP2的固體或半固體基質材料。43、第42段所述的生物植入物還浸漬有BMP2。44、第42段或第43段所述的生物植入物還浸漬有間充質幹細胞。45、一種試劑盒，包含對具有肝素結合結構域的蛋白質具有高親合力的預定量的糖胺聚糖和預定量的所述蛋白質。46、第45段所述的試劑盒，其中所述糖胺聚糖為HS/BMP2，所述蛋白質為BMP2。優選實施方式的說明HS/BMP2本發明涉及HS/BMP2，其可通過富集含有一種或多種GAG的化合物的混合物的方法獲得，所述GAG與對應於BMP2的肝素結合結構域的多肽結合。該富集方法可用於分離 HS/BMP2。本發明還涉及富含HS/BMP2的化合物的混合物，以及使用這樣的混合物的方法。HS/BMP2被認為能夠加強(例如，促進)BMP_2的活性，並且因此加強了它刺激幹細胞增殖和骨形成的能力。除了可通過本文所述方法獲得之外，還可以在功能和結構上限定HS/BMP2。在功能上，HS/BMP2能夠結合具有胺基酸序列SEQ ID NO :1或SEQID NO 6或由胺基酸序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 6組成的肽。優選地，HS/BMP2結合SEQ ID NO :1或 6 的肽的 Kd 小於 100 μ M，更優選地，小於 50口] 、4(^]\1、3(^]\1、2(^]\1或1(^]\1之一。優選地，HS/BMP2還結合ΒΜΡ2蛋白，其Kd小於100 μ Μ，更優選地，小於50 μ Μ、 40 μ Μ、30 μ Μ、20 μ m或10 μ M之一。可以通過以下測定方法確定HS/BMP2和ΒΜΡ2蛋白之間的結合。將ΒΜΡ2以3 μ g/ml的濃度溶解於封閉液(Blocking Solution) (0. 2%明膠在SAB 中的溶液)，並用封閉液建立0-3 μ g/ml的稀釋系列。將200 μ 1的每種ΒΜΡ2的稀釋液分配到用肝素預塗覆的肝素/GAG結合板的三個孔中；在37°C溫育2小時，用SAB和200 μ 1的加入封閉液中的250ng/ml的生物素化抗BMP2小心清洗三次。在37°C溫育1小時，用SAB、 200 μ 1加入封閉液中的220ng/ml的ExtrAvidin-AP小心清洗三次，在37°C溫育30分鐘， 用SAB和自來水小心清洗三次以除去殘餘液體，加入200 μ 1顯色試劑(SigmaFAST磷酸對硝基苯酯)。在室溫下溫育40分鐘，在1小時內在405nm處讀取吸光度。在該測定中，可以通過測量吸光度來確定結合併且可相對於對照確定結合，所述對照例如是不加入硫酸類肝素的BMP2蛋白，或者加入了不與BMP2蛋白結合的硫酸類肝素的BMP2蛋白。相對於非特異性結合併且在HS/BMP2可通過以下方法選自其它硫酸類肝素和/或 GAG的情況下，HS/BMP2的結合優選地為特異性的，所述方法涉及對表現出與SEQ ID NO=I 或SEQ ID NO :6的肽或與BMP2蛋白具有高親合力結合相互作用的硫酸類肝素的選擇。根據本發明的HS/BMP2優選地使小鼠成肌細胞系C2C12細胞中BMP2誘導的鹼性磷酸酶(ALP)活性增加到比單獨添加相應量的BMP2蛋白或肝素所獲得的增加更高的程度。 優選地，它還使C2C12細胞中BMP2誘導的ALP活性增加到比組合加入相應量的BMP2蛋白和肝素，或者BMP2蛋白和與BMP2蛋白不能高親合力結合的硫酸類肝素所誘導的活性增加更高的程度(例如，參見圖46)。可以通過實施以下ALP測定來測量ALP活性的增加。在37°C /5% CO2的條件下， 將C2C12細胞以20，000個細胞/cm2鋪於24孔板中的DMEM(例如，Sigma-Aldrich Inc.， St. Louis, MO)中，所述 DMEM 含有 10% FCS(例如，Lonza Group Ltd.，Switzerland)和抗生素(1%的青黴素和的鏈黴素)(例如，Sigma-Aldrich Inc.，St. Louis, MO)。24小時後，將培養基換成含有 100ng/mL BMP2(例如，R & D Systems, Minneapolis, MN) ,3mg/mL Celsus HS和不同濃度的BMP2特異性(+ve HS)和非特異性(_veHS) Celsus HS製劑的不同組合的5% FCS低血清培養基。3天後，使用含有Triton X_100、150mM NaClUOmM Tris pH 7. 4、2mM EDTA.0. 5% Ig印al (NP40)、0· 十二烷基硫酸鈉(SDS)和蛋白酶抑制劑混合物III (Calbiochem,德國)的RIPA緩衝液進行細胞溶解。通過使用BCA蛋白質測定試劑盒(Pierce Chemical Co. , rockford, IL)確定細胞裂解物的蛋白質含量。然後，通過將細胞裂解物與磷酸對硝基苯酯底物anvitrogen，Carload，CA) —同溫育來確定細胞裂解物中的ALP活性。將讀數歸一化為總蛋白量並表示為相對於只含有BMP2處理組的相對量。還可以通過如圖47所示出的以下ALP染色實驗方案的免疫組織化學技術來跟蹤 C2C12細胞中ALP活性的提高。ALP染色。如上述測定方法中所述，培養C2C12細胞。處理 3天後，在PBS中清洗細胞層，並根據製造商的說明書使用白細胞鹼性磷酸酶試劑盒(例如， Sigma-Aldrich Inc. ,St. Louis,MO)進行染色。將細胞層固定在用檸檬酸鹽緩衝的60%丙酮中，並且在含有萘酚AS-MX鹼性磷酸酶和重氮鹽的鹼性染料混合物中染色。使用邁爾蘇木紫染液(Mayer，s Hematoxylin solution)進行核染色。這些技術可用於將HS/BMP2鑑別為與非特異性硫酸類肝素(例如，不結合BMP-2 蛋白的硫酸類肝素)相比，能夠將C2C12細胞中BMP2蛋白誘導的ALP活性更大程度增加的硫酸類肝素。根據本發明的HS/BMP2還將BMP2信號作用延長到等於或超過肝素那些作用的水平。這可以通過下列測定進行評價。將C2C12細胞暴露於(i)無、(ii) RBMP2、(iii)BMP2+ 肝素或(iv)BMP2+HS/BMP2 72小時，並且通過免疫印跡法監測BMP2特異性胞內信號分子 Smadl/5/8的磷酸化水平。HS/BMP2的重要功能特性是其增強骨修復過程的能力，尤其是在哺乳動物受試者中。這可以在骨修復模型中進行測試，如實施例8和實施例9中所述的模型，其中比較了對照動物(例如，未給予HS的動物或者給予了不結合BMP2蛋白或SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 6所示的肽的HS的動物)和HS/BMP2治療動物中骨修復的速度和質量。通過分析傷口部位處的骨體積隨時間的生成(例如，通過對傷口進行X射線和微CT成像分析)來評價骨修復的速度和質量。在結構上，已發現HS/BMP2中N-乙醯-D-葡糖胺(GlcNAc)殘基的N-硫酸化對於保持對BMP2蛋白的結合親合力是重要的。N-脫硫酸化顯示會導致BMP2蛋白結合親合力顯著降低(圖49)。還發現N-硫酸葡糖胺(GlcNS)殘基的6_0_硫酸化(C6處的0_硫酸化)對於保持對BMP2蛋白的結合親合力具有中等程度的重要性。6-0-脫硫酸化導致BMP2蛋白結合親合力發生一定程度的降低(圖49)。發現IdoA和/或D-葡萄糖醛酸(GlcA)殘基的2_0_硫酸化(C2處的0_硫酸化) 不影響BMP2蛋白結合。這樣，HS/BMP2可以可選地為2_0_硫酸化的或2_0_脫硫酸化的。圖43示出了 HS/BMP2的二糖組成。根據本發明的HS/BMP2包括二糖組成在圖43 中標題為「BMP2特異性HS」一欄中對每種二糖所示數值的士 10% (更優選士9^^8^^7%、 6%、5%、4%、3%、2% 或之一)以內的並且對 BMP2 蛋白或 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO: 6所示的肽表現出高親合力結合的硫酸類肝素，如本說明書中所述的。還通過進行表面等離子共振分析說明了 HS/BMP2與不結合BMP2蛋白的硫酸類肝素相比的結構差異。例如，圖44所示的角偏移曲線可用於區分HS/BMP2和其它硫酸類肝素。通過進行強陰離子交換高壓液相色譜法(SAX-HPLC)進一步說明了 HS/BMP2與不結合BMP2蛋白的硫酸類肝素相比的結構差異。圖40示出了 HS/BMP2的SAX-HPLC譜圖，其可以與不結合BMP2蛋白的硫酸類肝素的SAX-HPLC譜圖(圖41和圖42)進行比較。為了鑑別HS/BMP2，本發明人發明了涉及富集對具有肝素結合結構域的特定多肽表現出結合的糖胺聚糖分子的方法。從而能夠鑑別分離的GAG混合物和/或分子並測試它們對表達含有肝素結合結構域的蛋白質的細胞和組織的生長和分化的調節能力。這使得能夠受控地分析特定GAG糖序列對細胞和組織的生長和分化的體外和體內影響。本發明人對骨形態發生蛋白2(BMP》應用了該方法以分離和表徵對BMP2具有高結合性的GAG。因此，為了鑑別HS/BMP2，本發明人提供了分離能夠與具有肝素/類肝素結合結構域的蛋白質結合的糖胺聚糖的方法，所述方法包括(i)提供固體載體，其具有附著到該載體上的多肽分子，其中所述多肽包含肝素結合結構域；(ii)使所述多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸從而使得能夠形成多肽-糖胺聚糖複合物；(iii)將多肽-糖胺聚糖複合物與該混合物的其餘部分分開；(iv)使糖胺聚糖從多肽-糖胺聚糖複合物解離；(ν)收集解離的糖胺聚糖。本發明人還提供了通過它們調節細胞或組織的生長或分化的能力所鑑別的分離的糖胺聚糖。為了實現該目標，他們提供了鑑別能夠刺激或抑制細胞和/或組織的生長和 /或分化的糖胺聚糖的方法，所述方法包括(i)提供固體載體，其具有附著到該載體上的多肽分子，其中所述多肽包含肝素結合結構域；(ii)使所述多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸從而使得能夠形成多肽-糖胺聚糖複合物；
(iii)將多肽-糖胺聚糖複合物與混合物的其餘部分分開；(iv)使糖胺聚糖從多肽-糖胺聚糖複合物解離；(ν)收集解離的糖胺聚糖；(vi)將收集的糖胺聚糖添加到細胞或組織中，其中存在含有肝素結構結合結構域的胺基酸序列的蛋白質；(vii)測量以下一項或多項細胞增殖、細胞分化、一種或多種蛋白質標記物的表達。本發明人使用這些方法來鑑別能夠結合於ΒΜΡ2的GAG(他們稱之為HS/BMP2或 HS3或HS-3)，其中在本發明人的方法中使用的多肽包含來自ΒΜΡ2的胺基酸序列的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 6的肝素結合結構域。在本發明人的方法中，包含GAG的混合物可以含有合成糖胺聚糖。然而，得自細胞或組織的GAG是優選的。例如，所述混合物可以含有細胞外基質，其中所述細胞外基質材料是通過原位刮取活組織獲得的(即，直接從獲得所述材料的人或動物身體中的組織獲得)或者通過刮取已從人或動物身體中提取的組織(活或死組織)獲得。可替代地，該細胞外基質材料可以活自在培養物中生長的細胞。該細胞外基質材料可以獲自結締組織或結締組織細胞，例如， 骨、軟骨、肌肉、脂肪、韌帶或腱。對於HS/BMP2的分離，細胞外基質材料的一個適合來源為成骨細胞，如小鼠MC3T3細胞。GAG組分可以從組織或細胞樣品中提取或通過本領域技術人員所熟知的一系列常規分離步驟(例如，陰離子交換色譜法)提取。GAG混合物可以含有不同類型糖胺聚糖的混合物，所述糖胺聚糖可以包括硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素和硫酸類肝素。優選地，與固體載體接觸的GAG混合物富含硫酸類肝素。 可通過對GAG混合物對適當流分具有選擇的實施柱色譜法以獲得富含硫酸類肝素的GAG部分，例如，弱、中或強陰離子交換色譜法以及強高壓液相色譜法(SAX-HPLC)。可對收集的GAG進行進一步分析以鑑別GAG，例如，確定GAG組成或序列，或確定 GAG的結構特徵。GAG的結構通常是高度複雜的，並且考慮到現有可用的分析技術，在大多數情況下對GAG序列結構進行準確確定是不可能的。然而，可對收集的GAG分子進行部分或完全糖消化(例如，通過亞硝酸進行化學消化或通過如肝素酶III的裂合酶進行酶消化)以獲得GAG的具有特徵性和診斷性的糖片段。具體地，消化得到二糖(或四糖)可用於測量所獲得的每種二糖的百分比，其將提供 GAG的特徵二糖「指紋圖譜」。還可以確定GAG的硫酸化類型並且利用該硫酸化類型來確定GAG結構。例如，對於硫酸類肝素，在氨基糖以及在C2、C3和C6位置處的硫酸化類型可以用於表徵硫酸類肝素。二糖分析、四糖分析和硫酸化分析可以與諸如HPLC、質譜和NMR的其它分析技術結合使用，所述其它分析技術可以各自提供GAG的獨特光譜。組合時，這些技術可提供GAG 的明確結構表徵。GAG與肝素結合結構域之間的高親合力結合相互作用表明GAG將含有有助於高親合力結合相互作用的特定糖序列。其它步驟可以包括參與該結合相互作用的GAG完整或部分糖序列或GAG關鍵部分的確定。
可以用裂解糖胺聚糖鏈的試劑(例如，裂合酶)處理GAG-多肽複合物。裂合酶處理可以切割結合的GAG上不參與多肽結合相互作用的部分。參與多肽結合相互作用的GAG 部分可以被保護不受裂合酶的作用。除去裂合酶後，例如，在清洗步驟後，仍保持與多肽結合的GAG分子代表了多肽的特異結合配偶體(「GAG配體」)。由於較短GAG分子的複雜性較低，因此GAG配體解離和收集後，可以期望獲得GAG配體的高度結構表徵。例如，糖序列 (即，包含在GAG配體中的單糖一級(線性)序列)、硫酸化類型、二糖和/或四糖消化分析、 NMR光譜、質譜光譜和HPLC譜的任何組合可以提供GAG配體的高水平結構表徵。如本文所使用的，術語「富集」、「富集的」等說明了這樣一種方法(或狀態)，即混合物的相對組成以由一種或多種實體組成的該混合物流分增加，而由一種或多種不同實體組成的該混合物部分降低的方式改變(或已經發生改變)。通過富集分離的GAG可以是純的，即基本只含有一種類型的GAG，或者可以繼續為不同類型GAG的混合物，但是相比於起始混合物，該混合物具有較高比例的與肝素結合結構域結合的特定GAG。在與表達或包含含有肝素結合結構域的蛋白質的細胞或組織接觸時，所鑑別的 GAG優選地表現出功能性作用。該功能性作用可以是調節或增強作用。該功能性作用可以是促進(刺激)或抑制某種類型細胞的增殖或者一種細胞類型向另一種細胞類型的分化，或者一種或多種蛋白標記物的表達。例如，GAG可促進細胞增殖 (即，細胞數目增加)，或者促進幹細胞向特化細胞類型的分化(例如，結締組織中的間充質幹細胞)，促進或抑制指示細胞多能性或分化狀態的蛋白標記物的表達(例如，標記物，如鹼性磷酸酶活性、RUNX2、奧斯特利斯(osterix)、膠原I、II、IV、VII、X、骨橋蛋白、骨鈣素、 BSPII、S0X9、聚集蛋白聚糖、ALBP、CCAAT/增強子結合蛋白-a (C/EBP α )、脂肪細胞脂質結合蛋白(ALBP)、鹼性磷酸酶(ALP)、骨唾液酸糖蛋白2 (BSPII)、膠原2al (Co 112a)和S0X9的檢測)。如本文所使用的，術語「調節作用」應理解為表示第一實體對第二實體的作用，其中通過第一實體的存在改變了第二實體在另一過程中的正常功能。該調節作用可以是激動 (或促進，agonistic)或拮抗的。該調節作用可以是增強作用。術語「增強作用」應理解為表示提高效力的作用。在本發明優選的實施方式中，術語「增強作用」是指第一實體對第二實體的作用，該作用使第二實體在另一過程中的效力增加。在本發明的其它優選實施方式中，增強作用應理解為表示分離的GAG對肝素結合因子的作用，其中所述作用使所述肝素結合因子的效力增加。該增強作用可以是肝素結合因子生物利用率的提高。在本發明的優選實施方式中，增強作用是BMP2生物利用率的提高。測量肝素結合因子生物利用率提高的一種方法是通過確定肝素結合因子局部濃度的增加。增強作用可以是保護肝素結合因子不被降解。在本發明的一種特別優選的實施方式中，增強作用是保護BMP-2不被降解。確定肝素結合因子降解降低的一種方法是通過測量肝素結合因子半衰期的增加。增強作用可以是將肝素結合因子與細胞受體隔離或者可以是穩定配基-受體相互作用。可以通過使用適當測定來確定增強作用(例如，生長或分化的調節)。例如，可以通過ELISA確定HS對BMP-2穩定性的作用。可以通過測量SMAD 1、5或8中的一種或多種的激活/表達，或者測量一種或多種成骨標記物基因(如Rimx2、鹼性磷酸酶、奧斯特利斯 (Osterix)、骨鈣素和BSP1)的表達，或者使用如茜素紅和馮庫薩(von Kossa)染色的染色方法測量礦化作用的水平來確定HS對BMP-2活力的作用。如本文所使用的，「接觸」的過程包括使兩種或更多種不連續實體在物理上靠近。 「接觸」的過程包括使兩種或更多種不連續實體在物理上靠近一段時間並且在一定的條件下，從而足以使兩種或更多種不連續實體的一部分在分子水平上發生相互作用。優選地，如本文所使用的，「接觸」的過程包括使具有一個或多個GAG的化合物的混合物與對應於肝素結合因子的肝素結合結構域的多肽靠近。「接觸」過程的實例包括混合、溶解、溶脹、清洗。 在優選的實施方式中，GAG混合物與多肽的「接觸」足以在彼此表現出高親合力的GAG和多肽之間形成複合物，其可以是共價的，但優選非共價的。多肽可以包含具有肝素結合結構域的所選蛋白質的全長或接近全長的一級胺基酸序列。由於較長的多肽中會發生摺疊從而會導致肝素結合結構域可能被掩蓋從而不能與 GAG混合物接觸，因此優選該多肽較短。優選地，多肽將具有包含肝素結合結構域的胺基酸序列並且可選地在肽的N和C末端之一或每一個包含一個或多個胺基酸。這些另外的胺基酸可以使得將多肽連接至固體載體所需的接頭或連接分子能夠被加入到多肽中。在本發明人發明的方法的優選實施方式中，除了肝素結合結構域中的胺基酸數之外，所述多肽還含有1-20個，更優選地1-10個，更優選地1-5個其它胺基酸。在一些實施方式中，肝素結合結構域的胺基酸序列佔多肽胺基酸的至少80 %，更優選地佔至少90 %， 更優選地佔至少95%。為了將多肽附著到固體載體的表面上，優選地對多肽進行修飾以包含分子標記， 並且修飾固體載體的表面以摻入對該分子標記具有高親合力的相應分子探針，即，分子標記和探針形成結合對。標記和/或探針可以選自以下任一種抗體、細胞受體、配體、生物素、這些結構的任何片段或衍生物、上述項的任意組合，或者通過其可以設計或配置探針以進行特異性結合或聯合的任何其它結構。適合用作標記和探針的優選結合對為生物素和抗生物素蛋白。多肽來源於所關心的蛋白質，其在本發明中為BMP2。「來源於」表示由於含有所關心蛋白質中存在的肝素結合結構域的胺基酸序列，因此選擇、選定或製備了該多肽。可以修飾所關心蛋白質中出現的肝素結合結構域的胺基酸序列(例如)以研究肝素結合結構域序列的變化對GAG結合的影響。在本說明書中，所述蛋白質為BMP2。來自BMP2的優選肝素結合結構域的胺基酸序列為 QAKHKQRKRLKSSCKRHP (SEQ ID NO :1)，其位於 SEQ ID NO :2(圖 35)的胺基酸 283-300 處，或者為 QAKHKQRKRLKSSCKRH(SEQ ID NO 6)，其位於 SEQ ID NO 2 的胺基酸 283-299 處。本領域技術人員應理解，特定多肽的胺基酸序列的微小改變會保持該部分的固有功能。還應理解用同配的(isosteric)和/或等電子的其它胺基酸殘基取代肽內的某些胺基酸殘基可保持或改善未取代肽的某些性能。這些改變也涵蓋在本發明的範圍內。例如， 有時可以用胺基酸丙氨酸取代胺基酸甘氨酸(反之亦然)並且同時保持該肽的一種或多種性能。術語「同配的」是指兩種實體之間的空間類似性。在中等高溫下同配部分的兩個實例為異丙基和叔丁基基團。術語「等電子的」是指兩種實體之間的電子類似性，實例為兩種實體具有相同或相似PKa功能性的情況。對應於肝素結合結構域的多肽可以是合成的或重組的。固體載體可以是具有可通過共價或非共價鍵直接或間接連接於分子的表面的任何基底。所述固體載體可以包括能夠為連接到該表面上的探針提供物理支持的任何基底材料。它可以是基質載體。該材料通常能夠承受與將探針連接至所述表面有關的條件以及執行測定期間所遇到的任何後續處理、操作和加工。所述材料可以是天然存在的材料、合成材料或經修飾的天然材料。所述固體載體可以是塑料材料(包括聚合物，例如，聚氯乙烯)； 環-烯烴共聚物、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丁烯)、聚苯乙烯、 聚甲基丙烯酸酯、聚(對苯二甲酸亞乙酯)、聚四氟乙烯(PTFE或Teflon )、尼龍，聚(丁酸乙烯酯))等，它們單獨使用或結合其它材料使用。可以考慮諸如玻璃的其它剛性材料，其包括二氧化矽並且還包括，例如，可作為生物玻璃獲得的玻璃。可以使用的其它材料包括多孔材料，例如，可控多孔玻璃珠。還考慮了能夠(例如)在其表面上摻入一種或多種官能團 (如氨基、羧基、巰基或羥基官能團中的任一種或多種)的本領域已知的任何其它材料。優選的固體載體包括將多肽固定在柱表面上的柱。所述表面可以是該柱的壁和/ 或可以由裝填到柱中央空間內的珠提供。可以將多肽固定在固體載體上。固定方法的實例包括吸附、共價結合、包埋和膜包覆。在本發明的一種優選實施方式中，多肽和基質之間的相互作用基本上是永久性的。在本發明的另一種優選實施方式中，肽和基質之間的相互作用對離子交換色譜具有適當的惰性。在優選的安排中，將多肽連接到固體載體的表面。應理解本領域技術人員將具有許多種可選項以供選擇從而將兩個實體彼此化學和/或物理連接。這些選項均涵蓋在本發明的範圍內。在優選的安排中，通過生物素與抗生蛋白鏈菌素之間的相互作用將多肽吸附到固體載體上。在這種安排的代表性實例中，將生物素分子共價鍵合到多肽上，生物素-多肽綴合物與抗生蛋白鏈菌素結合，而抗生蛋白鏈菌素又已經共價鍵合到固體載體上。在另一種安排中，間隔區或接頭部分可以用於將生物素分子與多肽連接，和/或將抗生蛋白鏈菌素與基質連接。通過將GAG混合物與固體載體接觸使得形成了 GAG-多肽複合物。通過(例如) 清洗固體載體以洗脫未結合材料將剩餘的混合物從固體載體中除去從而使這些混合物與剩餘的混合物分離。在使用柱作為固體載體的情況下，可以從柱上洗脫GAG混合物的未結合組分，從而留下與柱結合的GAG-多肽複合物。應理解某些寡糖可通過非特異方式與多肽相互作用。在某些實施方式中，通過非特異方式與多肽相互作用的寡糖可以包括在富含調節肝素結合因子作用的一種或多種GAG 的化合物的混合物中或排除在所述混合物之外。非特異相互作用的實例為在合適尺寸和/ 或形狀分子的袋(pocket)中的暫時包覆。另外，應理解這些寡糖可能要比對肽根本未表現出相互作用的那些寡糖洗脫得更慢。另外，應理解非特異結合的化合物可能不需要輸入相同的外界刺激以使得它們如通過特異方式結合(例如，通過離子相互作用)的那些化合物一樣被洗脫。本發明人的方法能夠將寡糖混合物分成該混合物的以下那些組分以特異方式與多肽結合的那些；以非特異方式與多肽結合的那些；和不與多肽結合的那些。對每一種GAG-肽對運用性地(operationally)定義了這些名稱。通過改變發生GAG和多肽結合的固體載體表面上所存在的條件(例如，鹽濃度)，
18可以選擇對肝素結合結構域具有最大親合力和/或特異性的那些GAG。因此，可以獲得對所關心蛋白和/或所關心蛋白的肝素結合結構域具有高結合親合力的GAG。結合親合力(Kd)可以選自下列之一小於101^、小於11^、小於ΙΟΟηΜ、小於 ΙΟηΜ、小於 InM、小於 IOOpMo通過所述方法獲得的GAG可用於一系列體外和/或體內應用中。可以提供GAG 用於刺激或抑制體外細胞或組織培養物中或者體內細胞或組織中的細胞或組織的生長和/ 或增殖和/或分化。出於該目的，可以提供作為製劑的GAG。例如，可以提供培養基，其包含通過所述方法獲得的GAG，即，包含HS/BMP2。可以收集在存在HS/BMP2的情況下從體外細胞或組織培養物中獲得的細胞或組織並將其植入到需要治療的人或動物患者中。因此，提供了細胞和/或組織植入的方法，所述方法包括以下步驟(a)體外培養與HS/BMP2接觸的細胞和/或組織；(b)收集所述細胞和/或組織；(c)將所述細胞和/或組織植入到需要治療的人或動物受試者中。可對部分(a)中與HS/BMP2接觸的細胞進行培養足以使所述細胞或組織生長、增殖或分化的一段時間。例如，所述的一段時間可以選自至少5天、至少10天、至少20天、 至少30天或至少40天。在另一實施方式中，可以配製HS/BMP2以在醫療方法中使用，包括創傷或疾病的預防或治療。可以提供包含HS/BMP2和藥用稀釋劑、載體或佐劑的藥物組合物或藥劑。可以提供該類藥物組合物或藥劑以用於創傷或疾病的預防或治療。還提供了 HS/BMP2在製造用於預防或治療創傷或疾病的藥劑中的使用。可選地，根據本發明的藥物組合物和藥劑還可以包含具有與GAG結合的肝素結合結構域的所關心的蛋白(即BMP2)。在其它實施方式中，所述藥物組合物和藥劑還可以包含幹細胞，例如，間充質幹細胞。創傷或疾病的治療可以包括細胞或組織的修復、再生或置換，所述組織如結締組織(例如，骨、軟骨、肌肉、脂肪、腱或韌帶)。對於組織修復，可以將包含HS/BMP2的藥物組合物或藥劑直接施用於創傷或疾病部位以刺激新組織的生長、增殖和/或分化從而起到修復創傷的作用或者治癒或減輕疾病狀況(例如，減輕症狀)的作用。可以通過將幹細胞混合在藥物組合物或藥劑中來改善組織的修復或再生。對於組織置換，可以在細胞和/或組織的體外培養期間使HS/BMP2與細胞和/或組織接觸以產生用於在患者創傷或疾病部位植入的細胞和/或組織。細胞或組織的植入可以通過受傷或患病組織的置換來用於對患者的受傷或患病組織產生修復作用。這可以包括受傷/患病組織的切除和通過與HS/BMP2接觸的細胞和/或組織的培養所製備的新組織的植入。因此，根據本發明的藥物組合物和藥劑可以包含以下之一(a) HS/BMP2 ；(b) HS/BMP2與幹細胞結合；(c)HS/BMP2與含有HS/BMP2結合的肝素結合結構域(即，SEQ IDNO :1或SEQ ID NO 6)的蛋白結合；
(d)HS/BMP2與幹細胞和含有HS/BMP2結合的肝素結合結構域(即，SEQ ID NO 1 或SEQ ID NO 6)的蛋白結合；(e)從與HS/BMP2接觸的細胞或組織的培養物中獲得的組織或細胞。HS/BMP2可用於身體組織的修復或再生，特別是骨再生、神經再生、骨胳組織構建、 心血管創傷修復以及胚胎和成體幹細胞的擴增和自更新。因此，HS/BMP2可用於預防或治療多種疾病和創傷，其包括骨關節炎、軟骨置換、任何種類的斷骨(例如，椎間盤融合治療、 長骨斷裂、顱骨缺損)、臨界或不連接骨缺損再生。HS/BMP2在組織修復、再生或置換中的應用可以包括在傷口癒合中的應用，例如， 加速傷口癒合、疤痕或骨組織癒合以及組織移植。在另一個方面，本發明提供了包含HS/BMP2的生物支架。在一些實施方式中，可以在整形外科、血管、假體、皮膚和角膜應用中使用本發明的生物支架。本發明所提供的生物支架包括延長釋放藥物遞送裝置、組織瓣膜、組織瓣膜小葉、藥物洗脫支架、血管移植物、傷口癒合或皮膚移植物以及整形外科假體，如骨、韌帶、腱、軟骨和肌肉。在本發明的一種優選實施方式中，生物支架是導管，其中內(和/或外)表面包含連接到該導管上的一種或多種 GAG化合物(包括HS/BMP2)。在另一個方面，本發明提供了通過所述方法分離的一種或多種GAG(包括HS/ BMP2)，其用作佐劑。所述佐劑可以是免疫佐劑。在另一個方面，本發明提供了藥用製劑，其包含含有一種或多種GAG的化合物的混合物，所述混合物相對於HS/BMP2含量豐富。在另一個方面，本發明提供了藥用製劑，其包含(i)包含一種或多種GAG的化合物的混合物，所述混合物中富含HS/BMP2 ；和(ii)BMP-2,其用於單獨、同時或順序給予。在一種優選的實施方式中，所述製劑包含含有一種或多種GAG的化合物的混合物，所述混合物富含緊密混合物(均勻混合物，intimate admixture)中的HS/BMP2和BMP-2，並且向需要治療的患者同時給予所述製劑。在本發明的另一個方面，提供了在組織修復或再生中使用的試劑盒，所述試劑盒包含⑴預定量的HS/BMP2，和(ii)預定量的BMP2。可將本發明富集的混合物的化合物作為其藥用鹽給予受試者。例如，本發明富集的混合物的化合物的鹼性鹽包括，但不限於，與可藥用陽離子所形成的那些鹽，所述可藥用陽離子如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、銨和烷基銨離子。陽離子鹽包括在本發明的範圍內，例如，鈉鹽或鉀鹽。應理解，可以將具有羧基的本發明富集的混合物的化合物以可給予的前體藥物的形式遞送，其中酸部分被酯化(以具有-C02R』的形式)。術語「前體藥物」具體地涉及-OR』 基團體內轉化為-OH基團，或其來源的羧酸根陰離子。因此，本發明的前體藥物可以起到提高藥物吸收和/或藥物向細胞遞送的作用。可以通過細胞酶(如脂肪酶或酯酶)或通過化學切割(如體內酯水解)促進前體藥物的體內轉化。可將根據本發明各方面的藥劑和藥物組合物配製成用於通過多種途徑施用，包括，但不限於，疾病或創傷部位處的注射。可以將藥劑和組合物配製成液體或固體形式。可以配製液體製劑以用於通過注射對人或動物身體的所選區域施用。
優選地，以「治療有效量」給予，這足以顯示出對個體的益處。所給予的實際量以及給藥速率和時間過程將取決於所治療的創傷或疾病的性質和嚴重程度。治療的確定， 例如，劑量的決定等，是全科醫生及其他醫生的職責，並且通常會考慮待治療的病症、個體患者的病況、遞送位點、給藥方法以及醫師已知的其它因素。可以在「雷明頓藥物科學 (Remington 『 sPharmaceutical Sciences)，，，第 20 版，2000, pub. Lippincott, Williams &ffiIkins中查找到上述技術和方案的實例。在本說明書中，待治療的患者可以是任何動物或人。所述患者可以是非人哺乳動物，但是更優選地為人類患者。所述患者可以是男性或女性。如所說明的，可以體外或體內實施根據本發明的方法。術語「體外」旨在涵蓋使用培養物中細胞的程序，而術語「體內」旨在涵蓋使用完整多細胞有機體的程序。幹細胞與HS/BMP2接觸的細胞包括幹細胞。本文中所培養並描述的幹細胞可以是任何種類的幹細胞。它們可以是全能性或多能性的。它們可以是來自任何組織的胚胎幹細胞或成體幹細胞，並且可以是造血幹細胞、神經幹細胞或者間充質幹細胞。優選地，它們是成體幹細胞。更優選地，它們是成體間充質幹細胞，例如，能夠分化成結締組織和/或骨細胞，如軟骨細胞、成骨細胞、肌細胞和脂肪細胞。幹細胞可以獲自任何動物或人，例如，非人動物，例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它齧齒動物(包括來自齧齒目中任何動物的細胞)、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛、馬、非人靈長類或其它非人脊椎動物；和/或非人哺乳動物；和/或人。可選地，它們是非人的。在本說明書中，幹細胞是指能夠分裂(即自更新)並且保持全能性或多能性並且如果需要能夠產生特化細胞的任何細胞類型。在本發明中所培養的幹細胞可以獲自或來源於現有的培養物或者直接獲自或來源於任何成體、胚胎或胎兒組織，包括血液、骨髓、皮膚、上皮或者臍帶(通常被丟棄的組織)。可以通過利用適合的測定來確定幹細胞的多能性。這些測定可以包括檢測多能性的一種或多種標記物，例如，鹼性磷酸酶活性、檢測RUNX2、osterix、膠原I、II、IV、VII、 X、骨橋蛋白、骨鈣素、BSPII, S0X9、聚集蛋白聚糖、ALBP、CCAAT/增強子結合蛋白-α (C/ ΕΒΡα)、脂肪細胞脂質結合蛋白(ALBP)、鹼性磷酸酶(ALP)、骨唾蛋白2、(BSPII)、膠原 2a1(Co112a)和 S0X9。將間充質幹細胞或人骨髓基質幹細胞定義為具有產生軟骨、骨、肌肉、腱、韌帶和脂肪能力的多能性祖細胞。這些原始祖代細胞在出生後存在並顯示出幹細胞的特徵，即低發生率和廣泛的更新潛力。這些性質結合它們的發育可塑性使得對間充質幹細胞置換受損組織的潛在使用產生了很大的興趣。本質上，可以培養間充質幹細胞以使它們的數量增加， 然後移植到創傷部位或者在接種到支架中/上後產生適當的組織構建。因此，骨骼、肌肉、腱和韌帶修復的替代方法是在骨結合傳導或誘導支架以支持和引導性再生以及正確選擇特異性組織生長因子的情況下，選擇、擴增和調節適當的祖細胞 (如，骨祖細胞)。可以使用選擇性標記物分離和檢測人骨髓間充質幹細胞，所述標記物例如來自 CD34+流分的STRO-I，其指示它們的骨髓再增殖潛力。這些細胞表面標記物僅存在於間充質幹細胞的細胞表面並且是細胞多能性的指徵。通過微創技術能夠容易地從骨髓獲得間充質細胞並且可以將其在培養物中擴增並使其分化成所需的細胞系。可以通過應用特異性生長因子來誘導分化。如骨形態發生蛋白(BMP)的轉化生長因子β (TGF-β)超家族成員蛋白是間充質幹細胞軟骨形成和成骨分化的重要因子。適合的MSC可以獲自或來源於從骨髓抽出物中採集的骨髓單核細胞(BMMNC)(例如，Wexler等人，成人骨髓是人類間充質「幹」細胞的豐富來源，而臍帶和被動員起來的成人血液貝Ij不是。(Adult bone marrow is a rich source of human mesenchyma 1"stem"ce 11 s but umbilical cord and mobilized adult blood are not.)HAEMOPOIESIS AND LEUCOCYTES British Journal of Haematology 121(2) :368-374, 2003 年 4 月)或者獲自或來源於臍帶的臍帶膠樣組織(華頓氏膠，Wharton' s Jelly)(例如，Ta等人，Long-term Expansion and Pluripotent Marker Array Analysis of Wharton ' sJelly-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 2009 年 7 月 20 日(Epub))。如本領域所熟知的，可以通過應用適合的分化因子從多能性幹細胞的分化中獲得間充質幹細胞，所述多能性幹細胞如人胚胎幹細胞或誘導的多能幹細胞。在本發明的另一個方面，提供了包含通過本發明的任何方法所產生的幹細胞或者它的片段或產物的藥物組合物。所述藥物組合物在醫療方法中有用。適合的藥物組合物還可以包含藥用載體、佐劑或稀釋劑。在本發明的另一個方面，通過本發明的任何方法所產生的幹細胞可以在醫療方法中使用，優選地，提供醫療方法，包括向需要治療的個體給予治療有效量的所述藥劑或藥物組合物。通過根據本發明的培養方法和技術獲得的幹細胞可以用於分化為在醫療方法中使用的另一種細胞類型。因此，分化的細胞類型可以來源於並且可以視為通過所述培養方法和技術獲得的並且隨後能夠發生分化的幹細胞的產物。可以提供藥物組合物，其包含該類分化細胞(可選地)和藥用載體、佐劑或稀釋劑。該藥物組合物可以在醫療方法中使用。糖胺聚糖如本文所使用的，術語「糖胺聚糖」和「GAG」可以替換使用並且應理解為是指多種包含寡糖的分子，其中那些結合的糖中的一種或多種具有氨基取代基或其衍生物。GAG的實例為硫酸軟骨素、硫酸角質素、肝素、硫酸皮膚素、透明質酸酯和硫酸類肝素。硫酸類肝素是本發明的優選實施方式。如本文所使用的，術語「GAG」還延伸至涵蓋作為GAG綴合物的那些分子。GAG綴合物的實例為蛋白糖胺聚糖(PGAG，蛋白聚糖)，其中肽組分共價鍵合到寡糖組分上。 在本發明中，應理解存在多個GAG化合物來源，包括天然的、合成的或半合成的來源。GAG的優選來源為生物組織。GAG的優選來源為幹細胞。GAG的特別優選來源為幹細胞，其能夠分化為對應於將要接受治療的受試者的組織的細胞。例如，GAG可以來源於前成骨細胞以用於骨再生或骨骼組織構建。在本發明特別優選的實施方式中，GAG可以來源於永生化細胞系。在本發明的其它優選實施方式中，GAG可以來源於在生物反應器中生長的永生化細胞系。GAG的另一個優選來源為合成來源。在這一方面，可以通過本領域技術人員已知的或能夠獲知的技術從將可商購起始材料轉化為更複雜的化學形式的合成加工中獲得GAG。這種可商購起始材料的實例為葡糖胺。GAG的另一個優選來源為半合成來源。在這一方面，使用本領域技術人員已知的或能夠獲知的技術通過合成加工了具有所需材料天然起始材料的大部分複雜性的合成加工。該天然起始材料的實例為幾丁質和葡聚糖，並且將起始材料加工成適合在本發明中使用的GAG混合物的合成步驟類型的實例為醯胺鍵水解、氧化和硫酸化。具有所需結構的GAG的半合成途徑的另一個實例包括相關GAG的合成互變以獲得適合在本發明中使用的GAG。硫酸類肝素(HS)在本發明的優選方面，糖胺聚糖或蛋白聚糖優選為硫酸類肝素。類肝素硫酸蛋白聚糖(HSPG)代表蛋白聚糖的高度多樣化亞組，並且它們是由共價連接到蛋白質主鏈的硫酸類肝素糖胺聚糖側鏈組成的。核心蛋白以三種主要形式存在 稱為基底膜蛋白聚糖的分泌形式、稱為磷脂醯基醇蛋白聚糖的錨定在質膜上的形式以及稱為多配體蛋白聚糖的跨膜形式。它們是哺乳動物細胞表面和大多數細胞外基質的普遍組成。還存在其它蛋白質，如集聚蛋白或澱粉樣前蛋白，其中HS鏈可以連接到不太常見的核心。「硫酸類肝素」(「硫酸類肝素」或「HS」)最初是在高爾基體中作為由D-葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙醯-D-葡糖胺(GlcNAc)的串聯重複所組成的多糖進行合成。隨後， 可以對剛合成的多糖進行一系列的修飾步驟=GIcNAc的N-脫乙醯化/N-硫酸化，GlcA向艾杜糖醛酸(IdoA)的C5差向異構化，IdoA和GlcA在C2處的0-硫酸化，N-硫酸葡糖胺 (GlcNS)在C6處的0-硫酸化和GlcNS偶爾在C3處的0-硫酸化。HS的N-脫乙醯化/N-硫酸化、2-0-、6-0_和3-0-硫酸化分別是通過HS N-脫乙醯基酶/N-磺基轉移酶(HSNDST)、 HS 2-0-磺基轉移酶(HS2ST)、HS 6_0_磺基轉移酶(HS6ST)和HS 3_0_磺基轉移酶所介導的。在每個修飾步驟中，僅有一部分可能的底物被修飾，從而導致產生了相當大的序列多樣性。HS的這種結構複雜性使得難以確定它的序列並了解HS結構與功能之間的關係。硫酸類肝素側鏈是由通過(1 — 4)糖苷鍵連接的交替排列的D-葡萄糖醛酸或者 L-艾杜糖醛酸和D-葡糖胺所組成的。葡糖胺通常是N-乙醯化的或N-硫酸化的，並且糖醛酸和葡糖胺均可另外被0-硫酸化。特定HSPG對特定結合配偶體的特異性是由連接到葡糖胺和糖醛酸上的羧基、乙醯基和硫酸酯基團的特定類型所產生的。與肝素相比，硫酸類肝素含有較少的N-和0-硫酸酯基團，而含有較多的N-乙醯基團。硫酸類肝素側鏈通過四糖鍵(-葡萄糖醛酸基-(1 — 3)-半乳糖基-β-(1 — 3)-半乳糖基-β-(1 — 4)-木糖基-β -1-0-(絲氨酸))區域連接到核心蛋白的絲氨酸殘基。硫酸類肝素鏈和核心蛋白均可經受最終可影響它們生物活性的一系列修飾。已經認識到HS的複雜性超過了核酸的複雜性(Lindahl等人，1998，J. Biol. Chem. 273,24979 ； Sugahara 和 Kitagawa，2000，Curr. Opin. Struct. Biol. 10，518)。HS 類物質的變型是由被含有N-乙醯化葡糖胺的二糖的未硫酸化區域分開的糖殘基的非隨機的、高度硫酸化序列的合成所產生的。N-乙醯葡糖胺向N-硫酸葡糖胺的最初轉化產生了對其它修飾的關注， 包括葡萄糖醛酸向艾杜糖醛酸的差向異構化和葡糖胺或艾杜糖醛酸上0-硫酸化的複雜類型。另外，在未修飾、低硫酸化的N-乙醯化序列中，己糖醛酸酯殘基仍保持為葡萄糖醛酸酯，而在高度硫酸化的N-硫酸化區域中，以C-5差向異構體艾杜糖醛酸酯為主。這限制了任意給定鏈中可能的潛在二糖變體的數目，但是未限制每種變體的豐度。大部分修飾發生在N-硫酸化區域，或直接與它們相鄰，從而在成熟鏈中存在被低硫酸化結構域分開的高硫酸化區域(Brickman 等人，(1998)，J. Biol. Chem. 273 (8)，4350-4359，該文獻以其整體作為參考併入本文)。假設高度可變的硫酸類肝素鏈通過自分泌、鄰分泌和旁分泌反饋環的複雜組合在多種胞外配基的調節作用中起關鍵作用，包括對細胞生長和粘附因子的調控和表現，從而控制胞內信號並由此控制幹細胞的分化。例如，儘管可能在遺傳學上說明了硫酸類肝素糖胺聚糖(Alberts 等人，(1989)Garland Publishing, Inc，New York&London，第 804 和 805 頁)，但是從單一來源分離的硫酸類肝素糖胺聚糖類在生物活性上可能是不同的。如在 Brickman等人，1998，Glycobiology 8，463中所示的，根據促有絲分裂的狀態，獲自神經上皮細胞的硫酸類肝素糖胺聚糖的兩種單獨混合物(pool)可特異性地激活FGF-I或FGF-2。 類似地，在WO 96/23003中說明了硫酸類肝素(HS)與FGF-I或FGF-2之間相互作用的能力。 根據本專利申請，在胚胎的約11至約13天從鼠細胞中獲得了能夠與FGF-I相互作用的各個HS，而在胚胎的約8至約10天獲得了能夠與FGF-2相互作用的HS。如上所述，HS的結構是高度複雜的並且在HS之間是可變的。的確，HS結構的變化被認為是對有助於每種HS在促進細胞生長和指導細胞分化中具有不同活力起到了重要作用。這種結構複雜性被認為是超過了核酸的結構複雜性，並且儘管可以將HS結構表徵為具有特異和獨特硫酸化類型的重複二糖單元的序列，但是目前尚沒有與可用於核酸測序的那些技術相當的標準測序技術以用於確定HS序列結構。在不存在確定明確HS序列結構的簡單方法的情況下，本領域技術人員通過使用多種分析技術明確地鑑別了並在結構上表徵了 HS分子。這些包括二糖分析、四糖分析、HPLC和分子量確定中的一種或組合。這些分析技術是本領域技術人員所熟知和使用的。從HS產生二糖和四糖的兩種技術包括亞硝酸消化和裂合酶消化。僅僅是出於舉例說明的目的，以下提供了執行這些消化技術中一種方法的描述，這樣的描述未限制本發明的範圍。亞硝酸消化硫酸類肝素基於亞硝酸的解聚在完成時導致碳水化合物鏈最終降解為其各個二糖組分。例如，可以通過分別在冰上將250 μ 1 0. 5Μ的H2SO4和0. 5Μ的Ba (NO2) 2冷卻15分鐘來製備亞硝酸。冷卻後，將Ba(NO2)2與H2SO4混合併在離心除去硫酸鋇沉澱前渦流混合。 將125 μ 1 HNO2加入到懸浮於20 μ IH2O中的GAG樣品中並且渦流混合，然後在不時混合的情況下在25°C溫育15分鐘。溫育後，將IM Na2CO3加入到樣品中使其pH為6。接著，將 100 μ 1 0. 25Μ的NaBH4在0. IM NaOH中的溶液加入到樣品中並將混合物加熱至50°C，保持 20分鐘。然後，將混合物冷卻至25°C並加入酸化的冰醋酸使樣品的pH為3。然後，用10M NaOH中和混合物並通過冷凍乾燥縮小體積。將最終樣品上Bio-Gel P_2柱以分離二糖和四糖從而驗證降解程度。裂合酶消化肝素酶III在葡萄糖醛酸鍵處切割糖鏈。一系列肝素酶(I、II和III)分別通過在特定硫酸化識別位點使某些硫酸類肝素序列解聚而顯示出相對特異的活性。肝素酶I沿 HS鏈切割具有NS區域的HS鏈。這導致硫酸化結構域的斷裂(disruption)。肝素酶III使具有NA域的HS解聚，從而導致碳水化合物鏈分解成各個硫酸化結構域。肝素酶II主要切割HS鏈的NA/NS 「肩(shoulder)」結構域，其中存在不同的硫酸化類型。注類肝素聚合物的重複二糖主鏈為連接到氨基糖葡糖胺上的糖醛酸。「NS」表示氨基糖，其在氨基上帶有硫酸酯，從而能夠使C2、C6和C3處的其它基團硫酸化。「NA」表示未被硫酸化且其仍保持乙醯化的氨基。例如，對於使用肝素酶III在NA區域中的解聚，在含有20mMTris-HCl、0. lmg/ml BSA和4mM CaCl2的緩衝液(pH 7.5)中製備了酶和凍幹的HS樣品。僅僅是通過舉例說明的方式，可以以5mU/l μ gHS加入肝素酶III並在37°C溫育16h，然後通過加熱至70°C，保持 5分鐘使反應停止。二糖和四糖可以通過柱色譜洗脫。肝素結合結構域Cardin 禾口 Weintraub(Molecular Modeling of Protein-Glycosaminoglycan Interactions, Arteriosclerosis，第 9 卷，第 1 期，1989 年 1 月 /2 月，第 21-32 頁)說明了多肽肝素結合結構域的共有序列，該文獻以其整體作為參考併入本文。該共有序列具有終止於一個或多個鹼性殘基的兩個或三個親水殘基分開的一段二-或三鹼性殘基序列。鑑別出兩種特定的共有序列XBBXBX[SEQ ID NO 3]和XBBBXXBX[SEQ ID NO :4]，其中B為鹼性殘基(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，而X為親水殘基(例如，丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、 絲氨酸)。據報導，肝素結合結構域富含胺基酸Asn、Ser.Ala, Gly、lie、Leu和Tyr而胺基酸Cys、Glu、Asp、Met、Phe和Trp的出現率較低。這些共有序列可以用於搜索蛋白質或多肽胺基酸序列以鑑別候選肝素結合結構域胺基酸序列，其可以合成並根據本發明測試GAG結合。WO 2005/014619A2還公開了多種肝素結合肽。WO 2005/014619A2的內容以其整體作為參考併入本文。在一些方面，本發明涉及HS/BMP2的治療性使用(人和獸醫)以治療骨折。本文報導了 HS/BMP2以增強骨傷口癒合。HS/BMP2刺激創傷後的骨再生並且有助於改善骨的傷口癒合。HS/BMP2加快了骨折修復的速度，從而能夠縮短創傷後的恢復時間。骨折是一種醫學病況。在本發明申請中，「骨折」包括骨的損傷或創傷，其中骨發生開裂、斷裂或碎裂。斷裂是指骨的不連續。骨折可以是由物理衝擊或機械應力或者由如骨質疏鬆症或骨關節炎的醫學病況造成的。骨折的整形外科分類包括閉合性或開放性以及單碎片或多碎片骨折 (multi-fragmentary fracture)。在閉合性骨折中，皮膚保持完整，而在開放性骨折中，骨可以暴露穿過傷口部位，這使得感染的風險更高。單純性骨折是沿一條線發生的，趨於將骨分為兩段。多碎片折斷將骨分成多片。其它骨折類型包括壓縮骨折、嵌插骨折、螺旋骨折、完全和不完全骨折、橫骨折、線性骨折和斜骨折以及粉碎性骨折。在大部分受試者中，骨癒合(骨折連接)是自然發生的並且在創傷後開始。出血通常導致凝塊並吸引白血球和成纖維細胞，從而產生膠原纖維。接著，骨基質(鈣羥磷灰石) 沉積(礦化作用)從而將膠原基質轉化為骨。不成熟的再生骨通常比成熟的骨脆弱，並且
25不成熟的骨隨時間經歷了重建過程以產生成熟的「板狀(lamellar)」骨。完全骨癒合過程通過需要相當長的時間，通常為數月。發生骨折並且可以從使用HS/BMP2的治療中受益的骨包括所有的骨類型，尤其是所有哺乳動物的骨，包括但不限於，長骨(例如，股骨、肱骨、指骨)、短骨(例如，腕骨、跗骨)、扁平骨(例如，顱骨、肋骨、肩胛骨、胸骨、骨盆帶)、不規則骨(例如，椎骨)、籽骨(例如，膝蓋骨)。發生骨折並且可從使用HS/BMP2的治療中受益的骨包括骨骼骨(即，骨架的任何骨)、顱-面區域的骨、中軸骨骼的骨(例如，椎骨、肋骨)，附屬骨(例如，肢的骨骼)、骨盆骨骼的骨(例如，骨盆)。發生骨折並且可從使用HS/BMP2的治療中受益的骨還包括頭部(顱骨)和頸部的那些骨，包括面部的那些骨，如頌骨、鼻骨和頰骨。在這個方面，在一些優選的實施方式中， HS/BMP2可以用於輔助牙科或面部或顱骨手術中的骨修復和再生，其可以包括面部和/或口腔骨(不同於牙齒)的重建，例如，包括顎骨。骨折還包括病理性多孔性，如骨質疏鬆症受試者所表現出的。儘管未限制本發明，但是HS/BMP2的主要作用可以是針對傷口部位內、傷口部位附近或造成遷移到傷口部位中的細胞，並且可以是針對骨幹細胞、前成骨細胞或成骨細胞， 或者針對存在於傷口床內或造成遷移到傷口床中或在傷口床內遷移的任何輔助細胞或血管源性細胞。提供了 HS/BMP2和包含HS/BMP2的藥物組合物和藥劑以用於哺乳動物受試者的骨折治療方法中。治療可以包括骨中的傷口癒合。治療可以包括骨的修復、再生和生長。HS/BMP2通過促進新骨生長來促進骨折修復。HS/BMP2起到改善骨折修復的速度的作用，從而使骨癒合的發生更快，導致創傷後恢復時間的縮短。治療可以導致骨強度得到改善。治療還可以包括骨質疏鬆症或骨關節炎的治療。優選地，將HS/BMP2施用於骨折周圍的組織。這可以包括直接施用於其中發生骨折的骨組織。可以施用於骨或骨折周圍的結締組織或者施用於靠近並供給骨的脈管系統 (例如，血管)。可以直接施用於創傷部位，並且可以施用於由傷口初始癒合所形成的骨痂。可以配製根據本發明的藥劑和藥物組合物以通過多種途徑施用。最優選地，將HS/ BMP2配製為用於注射的液體或液態形式。在一些實施方式中，將HS/BMP2配製為控釋製劑，例如，在用於植入到傷口部位的藥物膠囊中。HS/BMP2可以附著於、浸漬於或吸收到載體材料中(例如，生物材料)，如納米纖維或生物可降解的紙或織物。包含HS/BMP2的藥物組合物、藥劑、植入物和假體還可以包含BMP2。由於HS/BMP2 與BMP2結合的能力，HS/BMP2可以起到BMP2載體的作用以輔助將BMP2遞送到傷口部位並維持BMP2的穩定性。優選地，以「治療有效量」給予，與相應的未治療骨折相比，這足以改善骨折的癒合。所給予的實際量以及給藥速率和時間過程將取決於骨折的性質和嚴重程度。治療的確定，例如，劑量的決定等，是全科醫生以及其他醫生的職責，並且通常將會考慮骨折的性質、 個體患者的病況、遞送部位、給藥方法以及醫師已知的其它因素。根據主治醫生的指導，可以單次或多次給予HS/BMP2劑量。僅僅是通過舉例說明的方式，可將HS/BMP2以至少Ing/ ml的劑量遞送，更優選地，以至少5ng/ml的劑量遞送並且可選地以lOng/ml或以上的劑量遞送。各個HS/BMP劑量可以為約小於Img並且大於lyg，例如，約5yg、約IOygJA 25μ g、約30μ g、約50μ g、約ΙΟΟμ g、約0. 5mg或約Img之一。可以在「雷明頓藥物科學 (Remington 『 sPharmaceutical Sciences)，，，第 20 版，2000, pub. Lippincott, Williams &ffiIkins中查找到上述技術和方案的實例。HS/BMP2可以與其它治療一起用於治療骨折，所述其它治療是例如給予止痛劑或抗炎藥劑、骨固定和正骨(例如，在石膏模中固定受創傷的肢體)、手術幹預(例如，重新放置骨或移動骨以修正位移、彎曲或脫位)。如果需要手術的話，可以在手術過程中將HS/ BMP2直接施用於(例如，應用於)骨折。牛物材料本發明的藥物組合物和藥劑可以採用塗覆有和/或浸漬有HS/BMP2的生物材料的形式。可以由生物材料形成植入物或假體。可以將這些植入物或假體通過手術植入以輔助骨生長、再生、重建和/或再成型。可以將HS/BMP2應用於植入物或假體以加快所需位置的新骨形成。應理解，不同於蛋白質，硫酸類肝素是特別強健的並且對製造合成生物支架以及對植入物和假體的應用所需的溶劑具有更好的耐受能力。生物材料可以塗覆或浸漬有HS/BMP2。浸漬可以包括(例如)在聚合期間通過將 HS/BMP2與生物材料的組成成分混合以形成該生物材料，或者將HS/BMP2吸收到該生物材料中。塗覆可以包括將HS/BMP2吸附到該生物材料表面上。當施用於或植入到受試者中時，生物材料應能夠使得塗覆或浸漬的HS/BMP2從該生物材料上釋放。可以通過改變生物材料的結構(例如，多孔性)來改變生物材料的釋放動力學。除了用HS/BMP2塗覆或浸漬生物材料外，可以將一種或多種生物活性分子浸漬或塗覆到生物材料上。例如，選自由以下組成的組中的至少一種BMP-2、BMP-4、OP-1、FGF-1、 FGF-2、TGF-i3 1、TGF-β 2、TGF-β 3 ；VEGF ；膠原；層粘連蛋白；纖連蛋白；玻璃粘連蛋白。除了上述生物活性分子以外或者作為上述生物活性分子的替代物，可以將一種或多種二膦酸鹽與HS/BMP2 —起浸漬或塗覆到生物材料上。有用的二膦酸鹽的實例可以包括選自由以下組成的組中的至少一種依替膦酸鹽；氯屈膦酸鹽；阿侖膦酸鹽；帕米膦酸鹽；利塞膦酸鹽； 唑來膦酸鹽。塗覆或浸漬了 HS/BMP2的生物材料可以在醫學和獸醫中使用。應該理解本發明可以改善患者的生活質量或者潛在地延長動物的壽命，例如，用於繁殖的珍貴的賽馬。生物材料提供了支架或基質載體。生物材料可以適合於組織中的植入或者可以適合於給藥(例如，作為溶液中的微膠囊)。植入物或假體應是生物相容性的，例如，無毒並且低免疫原性(最優選無免疫原性)。生物材料可以是可生物降解的，從而隨著傷口癒合的發生，生物材料降解，並且在受試者中最終僅原位留下再生骨。作為另外一種選擇，可以使用非生物降解的生物材料(例如)以在較大的斷裂處引導骨再生和/或用作骨癒合過程中的結構支撐，並且傷口成功癒合後，手術除去該生物材料是可選的要求。
生物材料可以是軟的和/或柔性的，例如，水凝膠、纖維蛋白網或網狀物，或者膠原海綿。「水凝膠」是有機聚合物(可以是天然的或合成的)凝固或固化以產生捕獲水或其它溶液分子的立體開放柵格結構從而形成凝膠時所形成的物質。可以通過聚集、凝結、疏水性相互作用或交聯發生固化。可替代地，生物材料可以是相對剛性的結構，例如，由例如塑料或生物惰性金屬 (如鈦)的固體材料形成。生物材料可以具有多孔基質結構，其可以通過交聯聚合物提供。優選地，該基質是骨生長所需的營養物和生長因子可透過的。基質結構可以通過交聯纖維形成，例如，纖維蛋白或膠原，或者海藻酸鈉、殼聚糖或其它多糖通過適合的交聯劑(例如，鈣鹽、聚丙烯酸、肝素)的液膜。可替代地，可以形成作為凝膠的支架，其通過膠原或海藻酸鹽製成，使用本領域技術人員所知的已建立的方法交聯。用於基質形成的適合的聚合材料包括，但不限於，可生物降解/可生物吸收的聚合物，其可以選自由以下物質組成的組瓊脂糖、膠原、纖維蛋白、殼聚糖、聚己酸內酯、聚 (DL-丙交酯-共-己內酯)、聚(L-丙交酯-共-己內酯-共-乙交酯)、聚乙交酯、聚交酯、 聚羥基烷基酸酯、它們的共聚物，或者非生物可降解的聚合物，其可以選自由以下物質組成的組醋酸纖維素；丁酸纖維素、海藻酸鹽、聚碸、聚氨脂、聚丙烯腈、磺化聚碸、聚醯胺、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、它們的共聚物。由於膠原的生物相容性和支持細胞附著和功能的有利性質，其是基質構建的優良材料(美國專禾丨J No. 5019087 ；Tanaka, S. ；Takigawa, T. ；Ichihara, S. & Nakamura, T. Mechanical properties of the bioabsorbable polyglycolicacid-collagen nerve guide tube Polymer Engineering & Science 2006，46，1461-1467)。臨床上可用的膠原海綿是基質的一個實例並且在本領域中是熟知的(例如，來自^itegra Life kiences的膠原海綿)。纖維蛋白支架(例如，纖維蛋白膠)提供了替代性基質材料。作為傷口密封劑、遞送生長因子的貯器以及作為放置和固定生物植入物的輔助物，纖維蛋白膠在臨床上得至Ij 了廣泛應用(Rajesh Vasita, Dhirendra S Katti. Growth factor delivery systems for tissue engineering :a materials perspective. Expert Reviews in Medical Devices. 2006 ；3(1) :29-47 ；Wong C, Inman. Ε, Spaethe R. Helgerson S.Thromb. Haemost. 2003. 89(3) :573-582 ；Pandit AS, Wilson DJ, Feldman DS. Fibrin scaffold as an effective vehicle for the delivery of acidic growth factor (FGF-I). J. Biomaterials Applications. 2000 ；14(3) :229-242 ；DeBlois Cote MF. Doillon CJ.Heparin-fibroblast growth factor fibrincomplex :in vitro and in vivo applications to collagen based materials. Biomaterials. 1994 ；15 (9) :665-672)。Luong-Van 等人(In vitro biocompatibi 1 ity and bioactivity of microencapsulated heparan sulphate Biomaterials 28 (2007) 2127-2136)說明了 HS 從聚己酸內酯微膠囊中延長的局部遞送，該文獻作為參考併入本文。生物材料的另一個實例是摻入羥基磷灰石或透明質酸的聚合物。適合於與HS/BMP2結合使用的生物材料的一個實例為JAX 骨填料(Smith&Nephew)。Jax顆粒是由高純度硫酸鈣構成的並且保留了它們的形狀以提供具有可控顆粒間孔隙度和顆粒遷移穩定性的支架。Jax顆粒在體內能夠安全並且完全溶解。其它適合的生物材料包括陶瓷或金屬(例如，鈦)、羥基磷灰石、磷酸三鈣、去礦物質骨基質(DBM)、自體移植物(即，來源於患者組織的移植物)或同種移植物(來源於患者以外動物組織的移植物)。生物材料可以是合成的(例如，金屬、纖維蛋白、陶瓷)或生物的 (例如，由動物組織製成的載體材料，例如，非人哺乳動物(例如，母牛、豬)或人)。生物材料可以補充有其它細胞。例如，可以用未分化的骨前體細胞「接種」生物材料(或與之共合成)，所述未分化的骨前體細胞例如，幹細胞，如間充質幹細胞，更優選人間充質幹細胞。待治療的受試者可以是任何動物或人。所述受試者優選地為哺乳動物，更優選地為人。所述受試者可以是非人哺乳動物(例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它齧齒動物(包括來自齧齒目中任何動物的細胞)、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛(包括母牛，例如，奶牛或牛屬中的任何動物)、馬(包括馬科中的任何動物)、驢和非人靈長類)。非人哺乳動物可以是家養寵物或者出於商業目的飼養的動物，例如，賽馬，或者家畜，如豬、羊或牛。受試者可以是雄性或雌性。受試者可以是患者。培養基包含HS/BMP2的培養基可以是任何種類的，但是優選地為液體或凝膠，並且可以含有其它營養物和生長因子(例如，FGF-2)。HS/BMP2優選地以非痕量存在。例如，培養基中HS/BMP2的濃度可以在約1. Ong/ml培養基至約lOOOng/ml培養基的範圍內。優選地，培養基中HS/BMP2的濃度在約5ng/ml培養基至200ng/ml培養基之間，更優選地，在約20ng/ ml培養基至170ng/ml培養基之間。BMP2 蛋白在本說明書中，BMP2是指骨形態發生蛋白2(也稱為骨形態發生蛋白2、BMP2或 BMP-2)，它是TGF- β超家族的成員並且與骨和軟骨發育有關。圖35中示出了來自人(Homo sapiens)的BMP2前蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO 2)。胺基酸1至23代表信號肽，而胺基酸M至396代表前蛋白的胺基酸序列。本文中，成熟蛋白質的胺基酸序列表示為SEQ IDNO :5。在本說明書中，「BMP2蛋白」包括與圖35中所示的BMP2前體蛋白(pr印rotein) 或BMP2前蛋白(proprotein)的胺基酸序列或者與SEQ IDNO :5所示的成熟BMP2蛋白的胺基酸序列具有至少70%序列同一性的蛋白質，更優選具有75 %、80%、85 %、90%、95 %、 96%、97%、98%、99%或100%之一的序列同一性的蛋白質。BMP2蛋白優選地還包括肝素結合結構域，其具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 6所示的胺基酸序列(存在於SEQ ID NO :2的胺基酸觀3-300處)，或者具有與SEQ ID NO 1 或 SEQ ID NO :6 具有 75%、80%，85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之一的序列同一
性的胺基酸序列。對於BMP2蛋白，優選地包括Ruppert等人(Eur J. Biochem 1996)中所述的BMP-2蛋白。BMP2蛋白優選地為成骨的，即，具有誘導或輔助誘導成骨細胞分化的活性。BMP2蛋白可以來自或來源於任何動物或人，例如，非人動物，例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它齧齒動物(包括來自齧齒目中任何動物)、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛(包括母牛， 例如，奶牛，或牛屬中的任何動物)、馬(包括馬科中的任何動物)、驢和非人靈長類或者其它非人脊椎動物；和/或非人哺乳動物；和/或人。除明顯不允許或者明確應避免的組合之外，本發明包括所述方面和優選特徵的組合。本文所使用的章節標題僅是出於組織結構的目的，而不應視作對所述主題內容的限制。現在，將通過舉例說明並參考附圖對本發明的方面和實施方式進行說明。其它方面和實施方式對於本領域技術人員來說將是顯而易見的。本文中所提到的所有文件均將併入本文作為參考。


現在，將參考附圖對說明本發明原理的實施方式和實驗進行討論，其中圖1.使用8M尿素/CHAPS緩衝液破壞的MX樣品的陰離子交換色譜。在IM NaCl 洗脫後觀察到了較大的GAG峰。圖2.在來源於MX的GAG純化期間，脫鹽系統的代表性色譜圖。初始峰(12-18min) 代表全長GAG鏈。電導率峰和碎片峰(19-30min)代表鹽和GAG碎片的洗脫。圖3.加載到未衍生化的Hi-Trap抗生蛋白鏈菌素柱上的tGAG(2. 5mg)。所有GAG 在流過液中從柱洗脫，表明GAG與柱無「背景」附著。圖4. BMP2-HBP (Img)與tGAGQ5mg)預溫育30分鐘。洗脫分布圖示出了肽Q80nm) 與tGAG樣品一起在流過液中離開柱。圖5.加載到Hi-Trap柱上的BMP2-HBP (Img)。280nm的吸光度水平表明即使在高鹽條件下，肽仍保持附著於柱；因此，生物素化的肽與抗生蛋白鏈菌素接頭成功偶聯。圖6.加載了 25mg tGAG的BMP2-HBP(Img)偶聯的柱。色譜圖(232nm)清楚地示出了流過液中的柱過載以及一些GAG與BMP2-HBP床的結合。圖7.上次實驗(圖6)中的GAG (流過)流分的再次應用。顯著的GAG+洗脫峰的存在表明所有可用的BMP2-HBP結合位點已飽和，從而導致大部分易結合的GAG在流過液中離開柱。圖8.加載了 tGAG(6mg)的BMP2-HBP(^ig)偶聯的柱。色譜圖032nm)清楚地示出了柱未過載，並且存在對BMP2-HBP具有相對親合力的GAG亞組。圖9.上次運行(圖8)中GAG(流過)的再次運行。GAG+洗脫峰的消失表明在上次運行中可用的BMP2-HBP結合位點未飽和，從而使得能夠在單次運行中有效提取GAG+糖。圖10.分離的全長GAG+流分Qmg)的再次施加顯示在肝素酶III消化前對 BMP2-HBP (2mg)柱的親合力未發生變化。對BMP2-HBP柱再次施加GAG-流分還顯示親合力未發生變化，基本如圖9所示，所有GAG均在流過液中離開柱。圖11.在加載到BMP2-HBP(2mg)柱之前，用肝素酶III消化的GAG-流分(Img)。 色譜圖032nm)清楚地顯示GAG樣品未與柱保持結合，而是在流過液中離開。這表明全長 GAG-鏈中不存在任何GAG+結構域。圖12.在加載到BMP2-HBP (2mg)柱之前，用肝素酶3消化的GAG+流分(^iig)。色譜圖032nm)證明GAG+樣品保留在柱上，表明全長GAG+鏈上的所有結構域均對BMP2-HBP 具有相對親合力。與相同乾重的GAG+相比(圖10)，吸光度峰的增加表明肝素酶3處理的效力。圖13.使用排阻限在1. 5kDa至20kDa之間的Biogel PlO柱分離全長GAG+鏈。色譜圖顯示大部分樣品鏈具有大於20kDa的整體分子量。圖14.將全長GAG+糖鏈用亞硝酸處理20分鐘以診斷性地降解硫酸類肝素類物質。由Biogel PlO排阻色譜柱產生的色譜圖顯示與圖13相比，所有GAG+鏈幾乎完全降解， 表明GAG+分離鏈主要由硫酸類肝素組成。圖15.加載到BMP2-HBP(ang)柱上的4_硫酸軟骨素(6mg)。色譜圖清楚地顯示由於在與GAG+樣品相似的鹽濃度洗脫，因此大部分GAG鏈對肽具有親合力。圖16.加載到BMP2-HBP (2mg)柱上的6_硫酸軟骨素(6mg)。色譜圖表明幾乎沒有 C6S GAG鏈對肽柱具有任何親合力。圖17.加載到BMP2_HBP(aiig)親合柱上的硫酸皮膚素(6mg)。色譜圖表明幾乎沒有DS GAG鏈對肽具有任何親合力，只有少量GAG在與GAG+樣品相似的鹽濃度洗脫。圖18.加載到BMP2-HBP(ang)柱上的牛硫酸類肝素(2. 5mg)。色譜圖032nm)顯示僅有一小部分GAG與柱結合。圖19.加載到BMP2-HBP (ang)柱上的肝素-LMW(50mg)。色譜圖Q32nm)顯示幾乎沒有GAG與肽結合。圖20.加載到BMP2-HBP (ang)柱上的肝素_HMK28mg)。色譜圖Q32nm)顯示幾乎沒有GAG與肽結合。圖21.將用肝素酶I預消化的肝素_HMK25mg)加載到BMP2-HBP(^iig)柱上。色譜圖032nm)顯示極少GAG片段與肽結合。圖22.示出了親合色譜分離BMP-2肽特異性HS的步驟的色譜圖。圖23.示出了親合色譜洗脫BMP-2肽特異性HS (GAG+)的色譜圖。圖24.示出了親合色譜洗脫BMP-2肽非特異性HS(GAG_)的色譜圖。圖25.示出了通過排阻色譜法在Superdex 75柱上洗脫Sigma HS (H9902)標準品的色譜圖。圖26.示出了通過排阻色譜法在Superdex 75柱上洗脫BMP-2肽特異性HS (GAG+) 的色譜圖。圖27.示出了對對照培養基、100ng/ml BMP2和300ng/ml BMP2響應的C2C12細胞中Osterix表達的圖。圖28.示出了對對照培養基、100ng/ml BMP2禾Π 300ng/ml BMP2響應的C2C12細胞中骨鈣素表達的圖。圖29.示出了對對照培養基、100ng/ml BMP2禾Π 300ng/ml BMP2響應的C2C12細胞中Runx2表達的圖。圖30.示出了對對照培養基、BMP-2,陰性GAG (GAG-)、陽性GAG (GAG+)、總HS和肝素Ofep)響應的C2C12細胞中通過定量PCR測量的鹼性磷酸酶表達的圖。圖31.示出了對對照培養基、BMP-2，陰性GAG (GAG_)+BMP-2、陽性 GAG(GAG+)+BMP-2、總HS和肝素Ofep)響應的C2C12細胞中通過定量PCR測量的Osterix表達的圖。圖32.示出了對對照培養基、BMP-2，陰性GAG (GAG_)+BMP-2、陽性 GAG(GAG+)+BMP-2、總HS和肝素Ofep)響應的C2C12細胞中通過定量PCR測量的Bspll表達的圖。圖33.示出了對對照培養基、BMP-2，陰性GAG (GAG-)+BMP-2、陽性 GAG(GAG+)+BMP-2、總HS和肝素Ofep)響應的C2C12細胞中通過定量PCR測量的Runx2表達的圖。圖34.示出了對BMP和從MC3T3-E1細胞分離的GAG+(+BMP_2)響應的C2C12細胞中骨鈣素表達的圖。圖35.來自人的骨形態發生蛋白2前蛋白的胺基酸序列，NCBI登錄號 No. NP_001191(NP_001191. IGI :4557369)(SEQ ID NO 2)。圖36.示出了親合色譜洗脫BMP-2肽特異性HS的色譜圖。將6mg生物素化的 BMP2-肽(SEQ ID NO :1)偶聯到Iml抗生蛋白鏈菌素柱。色譜圖顯示所有生物素化的 BMP2-肽與柱結合。圖37.示出了 BMP2-肽(SEQ ID NO 1)特異性硫酸類肝素純化的色譜圖。圖38.示出了 BMP2肽(SEQ ID NO 1)柱結合的硫酸類肝素脫鹽的色譜圖。圖39.示出了 BMP2肽(SEQ ID NO 1)柱未結合的硫酸類肝素脫鹽的色譜圖。圖40. 二糖消化後BMP2陽性硫酸類肝素的SAX-HPLC分布圖。圖41. 二糖消化後BMP2陰性硫酸類肝素的SAX-HPLC分布圖。圖42. 二糖消化後Celsus HS的SAX-HPLC分布圖。圖43.示出了 BMP2特異性HS、BMP2非特異性HS和Celsus HS的裂合酶來源的二糖百分比組成的表。對每個峰下方的面積積分以計算每種二糖的百分比。一=未檢出。圖44.示出了 BMP2陽性和BMP2陰性HS表面等離子共振(SPR)分析的圖。圖45.示出了塗覆在Iduron肝素/GAG結合板上的BMP2陽性和BMP2陰性Celsus HS製劑的BMP2結合量的圖。圖46.示出了 C2C12細胞上BMP2陽性和BMP2陰性HS的鹼性磷酸酶(ALP)活性的圖。圖47. ALP活性的HS增強的免疫組織化學分析的照片。當通過組織化學評價時， 與非特異性HS相比，BMP2特異性HS提高BMP2誘導的ALP活力的程度更高。結合0、0. 3、 3 禾口 30 μ g/ml 的 BMP2 陽性或 BMP2 陰性 HS，引入了 100ng/ml 的 BMP2。圖48.無圖。圖49.示出了選擇性O-0、6-0和N-)去硫酸化的BMP2陽性HS的BMP2結合量並且表明結合BMP2所需的HS鏈的電荷取代類型的圖。圖50.示出了肝素對BMP-2穩定性作用的圖。圖51. JAX -磷酸三鈣骨填料的SEM照片，兔尺骨缺損模型的X光照片。與位於 200 μ 1水凝膠(88%水、甘油、羧甲基纖維素鈉)中的30μ gHS/BMP2組合的說明。圖52.在處理第4周時，用JAX 骨填料(對照)或JAX 骨填料加HS/BMP2處理的兔尺骨缺損模型的X光和微CT掃描分析。圖53.在處理第8周時，用JAX 骨填料(對照)或JAX 骨填料加HS/BMP2處理的兔尺骨缺損模型的X光和微CT掃描分析。 圖54.示出了在JAX 骨填料(對照)、JAX 骨填料加HS/BMP2 (HS3)或JAX 骨填料加BMP2陰性HS處理的兔尺骨缺損模型中通過微CT掃描評價的處理第4周(A)和處理第8周(B)時的％骨體積的圖。圖55.示出了暴露於陰性對照、僅BMP2、BMP2+肝素或BMP2+HS3後，Smad 1/5/8 磷酸化水平的免疫印跡圖。圖56.不連接的嚴重兔尺骨缺損修復實驗設計的圖示說明。圖57.示出了肝素隨時間從JAX 顆粒上釋放的百分比的圖。圖58.示出了在第0、4和8周時，對用JAX 骨填料加對照(無HS)、30 μ g HS3 (HS30)或IOOyg HS3 (HS100)處理的兔尺骨缺損模型治癒時的X光顯微照片。圖59.示出了與圖像處理過的X光重建(新骨用黃色表示)相比，術後4和8周後骨缺損內Jax星的3D圖像再現的微CT(計算機斷層)顯微照片。與右側的X光圖像相比，微CT的圖像為灰色。圖60.示出了第4和8周時，處理組(對照組相對於HS30組和HS100組)中總體積的％骨體積(BV/TV)定量的圖。圖61.示出了 3個處理組(對照組(無HS)、30 μ g HS3組(HS30)或100 μ g HS3 組(HS100))在4和8周中的H&E染色(見下文)的顯微照片。圖62.示出了 3個處理組(對照組(無HS)、30 μ g HS3組(HS30)或100 μ g HS3 組(HS100))在4和8周中的H&E染色的高倍放大顯微照片(與圖61相比)。圖63.示出了 3個處理組(對照組(無HS)、30 μ g HS3組(HS30)或100 μ g HS3 組(HS100))在4和8周中的Rails四色染色(見下文)的顯微照片。圖64.示出了 3個處理組(對照組(無HS)、30 μ g HS3組(HS30)或100 μ g HS3 組(HS100))在4和8周中的Rails四色染色的高倍放大顯微照片(與圖63相比)。圖65.示出了 3個處理組(對照組(無HS)、30 μ g HS3組(HS30)或100 μ g HS3 組(HS100))在4和8周中的骨鈣素免疫染色(見下文)的顯微照片。圖66.示出了 3個處理組(對照組(無HS)、30 μ g HS3組(HS30)或100 μ g HS3 組(HS100))在4和8周中的骨鈣素免疫染色的高倍放大顯微照片(與圖65相比)。圖67.扭轉測試設備的照片。圖68.示出了 8周時，HS30的典型扭轉相對於未受損尺骨角度，加剛度和最大轉矩的圖。圖 69.示出了用吸收了 30 μ g HS3U0y g ΒΜΡ-2,30μ g HS3+10 μ gBMP-2 或等體積PBS中的一種治療劑(總計300 μ L，溶於PBS)的膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型在第0 周時的X光顯微照片。圖 70.示出了用吸收了 30 μ g HS3、10yg ΒΜΡ-2,30μ g HS3+10 μ gBMP-2 或等體積PBS中的一種治療劑(總計300 μ L，溶於PBS)的膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型中的癒合在第4周時的X光顯微照片。圖 71.示出了用吸收了 30 μ g HS3、10yg ΒΜΡ-2,30μ g HS3+10 μ gBMP-2 或等體積PBS中的一種治療劑(總計300 μ L，溶於PBS)的膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型中的癒合在第8周時的X光顯微照片。
圖 72.示出了用吸收了 30 μ g HS3U0y g ΒΜΡ-2,30μ g HS3+10 μ gBMP-2 或等體積PBS中的一種治療劑(總計300 μ L，溶於PBS)的膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型在第4 和8周時的微CT分析的圖。圖 73.示出了用吸收了 30 μ g HS3、10yg BMP_2、30yg HS3+10 μ gBMP-2 或等體積PBS中的一種治療劑(總計300 μ L，溶於PBS)的膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型在第8 周時的最大轉矩和剛度的圖。圖 74.示出了用吸收了 30 μ g HS3、10yg BMP_2、30yg HS3+10 μ gBMP-2 或等體積PBS中的一種治療劑(總計300 μ L，溶於PBS)的膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型在第4 周時的百分比骨體積的圖和微CT圖像。圖 75.示出了當與 10 μ g BMP-2 (BMPlO)、30 μ g HS3 (HS30)、10 μ gBMP-2+30 μ g HS3U00yg HS3 (HSlOO)或對照結合時，比較採用JAXtmTCP星和膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型在第4周時的百分比骨體積的圖。
具體實施例方式通過舉例，在以下說明中說明了本發明的一個或多個實施方式的細節，包括本發明人對實施本發明所考慮的最佳方式的具體細節。對本領域技術人員來說顯而易見的是， 可對這些具體細節不加限制地實踐本發明。我們研究了 GAG增強骨形態形成蛋白2 (BMP2)活力的潛力。已很好地說明了 BMP2 對鼠肌性細胞系C2C12的高成骨誘導活性。該細胞系中的研究和體內研究均顯示出糖胺聚糖在調節該活性中的作用。類似地，很好地說明了 BMP2對肝素的親合力。已經進行了大量研究來設法檢驗 BMP2和GAG之間的動態相互作用。一些研究提出這種相互作用是抑制性的，並因此負責將細胞因子與受體隔離或誘導其與其多種抑制劑結合，如已類似地對肝素顯示出親合力的頭蛋白(noggin)。替代性發現表明BMP2與GAG之間的相互作用是維持需要其信號以分化為成骨細胞系的細胞周圍的細胞因子局部濃度的方法之一。這些發現還表明結合用於顯著延長同型二聚體的半衰期，從而允許它在ECM中保持較長時間的活性。通常對於大多數系統來說，這種相互作用的真實作用可能是上述一些或全部作用的混合。儘管許多研究已提供了 BMP2對模型糖具有相互作用的證據，但是BMP2肝素結合肽(BMP2-HBP)，即位於每個BMP2單體N末端的一串胺基酸(QAKHKQRKRLKSSCKRHP [SEQ ID NO :1])，與適合的糖胺聚糖之間的特異性相互作用卻很少受到關注。這產生的主要問題在於HS鏈中是否嵌入了控制絕對、或至少相對特異性結合的互補糖序列。我們設法分離可以通過與細胞因子的直接相互作用調節BMP2活性的序列特異性糖胺聚糖。實施例1材料和方法緩衝液製備在嚴格關注質量的情況下，配製了用於GAG提取和分析的所有緩衝液。關鍵的是將緩衝液的PH維持在正確的水平並且對所有緩衝液實施過濾和脫氣以避免沉澱物或氣泡
34堵塞色譜柱。具體地，氣泡的形成會造成柱的嚴重損壞，並且對於密封的預裝柱來說，會導致它們不能使用。用不含Ca2+或Mg2+的1 XPBS (150mM NaCl)或雙蒸水(ddH20)過濾所有使用的緩衝液以製備最終溶液。破碎緩衝液8M尿素/CHAPS破碎緩衝液是由加入CHAPS、8M尿素和0. 02% NaN3(防止在儲存期間被微生物生長汙染)的PBS(150mM NaCl)組成的。該溶液用於破碎基質(MX)樣品， 因此未經脫氣或過濾。PGAG陰離子交換低鹽U50mM)緩衝液低鹽PGAG陰離子交換緩衝液包含具有另外IOOmM NaCl的PBS(150mM NaCl)。用 NaOH和0. 02% Ne^3將緩衝液平衡至pH 7. 3。然後，在負壓下對溶液脫氣並且在通過0. 4 μ m 過濾器過濾之前持續攪拌直至不再釋放氣泡。PGAG陰離子交換較高鹽(IM)緩衝液高鹽PGAG陰離子交換緩衝液包含具有另外850mM NaCl的PBS(150mM NaCl)。用加入的NaOH和0. 02% NaN3將緩衝液平衡至pH 7. 3。然後，在負壓下對溶液脫氣並且在通過0. 4 μ m過濾器過濾之前持續攪拌。/mmmm PGAG 籠■碰該緩衝液用於在陰離子交換後使脫鹽的PGAG樣品復原以製備它們用於進行相關核心蛋白的酶消化。它是由25mM的醋酸鈉(CH3COOHNa)組成的。用冰醋酸(CH3COOH)將緩衝液平衡至PH 5.0。根據生產商的說明，復原鏈黴蛋白酶和神經氨酸酶。GAG親合餼譜低鹽(150mM)緩衝液使用未加入任何其它鹽的PBS (150mM NaCl)製備低鹽GAG陰離子交換緩衝液。用 NaOH和0.02% Ne^3將緩衝液平衡至pH 7.3。在負壓下對溶液脫氣並且在通過0. 4 μ m過濾器過濾之前持續攪拌直至不再釋放氣泡。GAG親合餼譜高鹽(IM)終緩衝液使用加入另外850mM NaCl的PBS (150mM NaCl)製備高鹽GAG陰離子交換緩衝液。 用NaOH將緩衝液平衡至pH 7. 3，並且加入0. 02% NaN3,然後將溶液脫氣並通過0. 4 μ m過濾器過濾。脫鹽溶液使用通過0. 02% NaN3平衡至pH 7. 0的ddH20製備脫鹽溶液。然後，將溶液脫氣
並過濾ο樣品製備使用破碎緩衝液(8M尿素/CHAPS)利用破碎基質樣品，然後在該緩衝液中刮去培養表面，並在37°C攪拌過夜以確保最大的細胞溶解。然後，將樣品在5000g離心30min，並且將上清液通過0. 4 μ m過濾器淨化以準備用於通過陰離子交換色譜的PGAG提取。柱準備和使用用於GAG分離和表徵中每個順序步驟的柱類型的選擇和準備對於該方案的成功是至關重要的。在每個步驟中，小心平衡和清洗該柱是重要的。陰離子交換柱
由於用於GAG提取的MX底物的量相對較大，且加載到柱系統上的加載量大，因此必須手動裝填和準備專門用於該研究的大陰離子交換柱。將Capto Q陰離子交換珠 (Pharmacia)裝填到Wiarmacia XK 26柱(Pharmacia)中以產生每次運行的最大加載量為 500ml MX裂解物的柱。使用前，將柱和所有緩衝液平衡至室溫30分鐘，然後將該柱在PGAG陰離子交換低鹽Q50mM)緩衝液中清洗和平衡30分鐘直至所有吸光度通道保持穩定。然後，將澄清的細胞裂解物通過該柱，並且再用500ml低鹽緩衝液清洗該柱以除去任何非特異性結合的碎片。然後，使用250mlPGAG陰離子交換高鹽(IM)緩衝液洗脫PGAG，並且在脫鹽前凍幹。然後，將該柱在低鹽緩衝液中清洗並返回4°C保存。脫鹽方案PGAG/GAG分離後，必須除去從柱中洗脫時在樣品中積累的大量的鹽。對於該步驟，合併相同實驗組的所有洗脫樣品，並且將其加載到4XWmrmacia HiPrepTM 26/10脫鹽柱上。使用前，將柱和所有溶液平衡至室溫30分鐘，然後將該柱在脫鹽溶液中清洗和平衡 30min直至所有吸光度通道達到穩定。將凍幹樣品在能夠獲得透明溶液的最小可能體積的脫鹽溶液中復原。柱的這種組合允許加載多達60ml樣品。將先從柱上洗脫的那些流分凍幹並且保留用於進一步分離或細胞培養應用。然後，將柱在脫鹽溶液中清洗並返回4°C保存。BMP2-HBP 柱的製備使用BMP2-HBP柱分離了對BMP2具有相對親合力的GAG。在ImlGAG親合色譜低鹽(150mM)緩衝液中製備了約2mg生物素化的BMP2-HBP。將該量加載到HiTrap抗生蛋白鏈菌素HP柱(Pharmacia)上並且允許對該柱連接5分鐘。然後，在不存在GAG的情況下對該柱進行完整的運行循環。以0. 5ml/min的流速用13ml低鹽緩衝液清洗該柱，然後以Iml/ min運行IOml GAG高鹽緩衝液。最後，用IOml低鹽緩衝液清洗該柱。在該過程中，小心監測數據以確保未觀察到肽的洗脫或柱降解。GAG+樣品分離一旦製備好BMP2-HBP柱並在正常運行條件下測試了穩定性，就已準備好用於 GAG+鏈從tGAG(總GAG)樣品中分離。在:3ml GAG親合低鹽(150mM)緩衝液中製備了 tGAG 樣品(6mg)並將其注射到用於對柱進行加載的靜態進樣環(static loop)中。使用前，將 BMP2-HBP柱和所有緩衝液平衡至室溫30分鐘，然後將該柱在低鹽緩衝液中清洗和平衡30 分鐘直至所有吸光度通道穩定。然後，以0. 5ml/min將樣品加載到該柱上並且以0. 5ml/min 用IOml低鹽緩衝液清洗柱和樣品。隨後，通過用IOml高鹽(IM)緩衝液洗脫回收保留的 GAG+樣品並將其凍幹用於脫鹽。然後，將該柱在IOml低鹽緩衝液中清洗並在4°C保存。鏈黴蛋白酶/神經氨酸酶處理為了將GAG鏈與它們的核心蛋白分離，用鏈黴蛋白酶和神經氨酸酶對它們進行消化。將凍幹的PGAG樣品再懸浮於最小體積的25mM醋酸鈉(pH 5.0)中並通過用0.4μπι注射器式過濾器過濾澄清。將總樣品體積以500μ 1的等份分配到IOml玻璃管中。加入500μ 1 lmg/ml的神經氨酸酶並在37°C溫育4h。溫育後，向每個樣品中加入5ml IOOmM的Tris-乙酸(pH 8. 0)。向每個樣品中加入用500mM Tris-乙酸、50mM乙酸鈣(pH 8. 0)復原的另外的l.aiil 10mg/ml的鏈黴蛋白酶並在36°C溫育Mh。處理後，合併所有體積並將其通過離心和過濾準備用於陰離子交換處理。GAG消化方案通過使用包括亞硝酸或裂合酶降解的已建立的方案對GAG進行分析，包括其硫酸化結構域的大小和相對硫酸化水平。亞硝酸消化硫酸類肝素的基於亞硝酸的解聚在完成時導致碳水化合物鏈最終降解為其各個二糖組分。通過在冰上分別將250 μ 1 0. 5Μ的H2SO4和0. 5Μ的Ba(NO2)2冷卻15分鐘來製備亞硝酸。冷卻後，將Ba(NO2)2與H2SO4混合併在離心以除去硫酸鋇沉澱前渦流混合。將 125 μ 1 HNO2加入到懸浮於20 μ 1 H2O中的GAG樣品中並且渦流混合，然後在不時混合的情況下在25°C溫育15分鐘。溫育後，將IM Na2CO3加入到樣品中使pH為6。接著，將100 μ 1 0. 25Μ的妝8扎在0. IM NaOH中的溶液加入到樣品中並將混合物加熱至50°C，保持20分鐘。 然後，將混合物冷卻至25°C並在通風櫥中用冰醋酸酸化使pH為3。然後，用IOM NaOH中和混合物並通過冷凍乾燥使體積減小。將最終樣品在Bio-Gel P-2柱上運行以分離二糖和四糖從而驗證降解。肝素酶III消化肝素酶III是在葡萄糖醛酸鍵處切割糖鏈的酶。一系列肝素酶(I、II和III)分別通過在特定硫酸化識別位點使某些硫酸類肝素序列解聚來顯示相對特異性活性。肝素酶 I沿鏈切割具有NS區域的HS鏈。這導致認為具有HS大部分生物活性的硫酸化結構域的破碎。肝素酶III使NA結構域內的HS解聚，從而導致碳水化合物鏈分解成各個硫酸化結構域。最後，肝素酶II主要切割HS鏈的NA/NS 「肩」結構域，其中存在不同的硫酸化類型。為了分離潛在的活性結構域，我們關注GAG+的NA區域的解聚。在含有20mM Tris-HCl,0. lmg/ml BSA和4mM CaCl2的緩衝液(pH 7. 5)中製備了酶和凍幹的HS。加入至每個樣品中的肝素酶III的濃度取決於樣品中HS組分的相對量。我們通過亞硝酸解聚的分析表明GAG+樣品主要由HS組成；因此，以5mU/l μ g HS使用該酶。將樣品在37°C溫育 16h，然後通過加熱至70°C，保持5min來終止反應。然後，將樣品應用於適當的柱系統進行進一步分析。細胞培養GAG 生產為了分離代表正在發育的成骨細胞的GAG類物質，使MC3T3細胞在成骨條件下生長8天。通過在25°C，在0.02M氫氧化銨(NH4OH)稀釋溶液中溫育5分鐘以除去細胞組分。 5分鐘後，通過翻轉培養表面除去NH4OTL使處理過的培養物在超淨工作檯中乾燥過夜。第二天，用無菌PBS將處理過的培養物清洗三次，並使其在超淨工作檯中乾燥。然後，將所製備的基質培養物在4°C的無菌條件下存放直至通過破碎緩衝液和陰離子交換色譜處理釋放出主要的蛋白聚糖為止。BMP2-特異性GAG的生物活性通過在添加了 10% FCS的達爾伯克改良的伊格爾培養基(DMEM)上以1. 3X IO4個細胞/cm2鋪板，將C2C12成肌細胞每4 繼代培養至最多15代。以2 X IO4個細胞/cm2，在添加了 5% FCS的DMEM中誘導成骨分化，重組人骨形態發生蛋白-2 (rhBMP2)和對rhBMP2 具有陽性或陰性親合力的糖胺聚糖部分(分別為GAG+和GAG-)的標稱濃度。在加入至其相應的C2C12培養物中之前，將rhBMP2和GAG部分在25°C預溫育30min。使該培養物在這些條件下生長5天，每48小時更換用於每種條件的培養基，然後提取mRNA樣品並將其準備用於 RQ-PCR 分析。使用 ABIPrism7000 序列檢測系統(PerkinElmer Life Sciences)進行骨鈣素表達的實時PCR。使用引物表達軟體(v2. 1，PE Applied Biosystems)設計引物和探針。重新設計靶標探針以摻入LNA鹼基並用BHQ-I (Sigma-Proligo)標記。將核糖體亞基基因18S(VIC/TAMRA)用作內源對照，每個條件包括三個重複，每一測試重複三次。使用ABI序列檢測器軟體分析原始PCR數據。在計算相對表達單位(REU)前，將靶標基因表達值歸一化為18S的表達。結果陰離子交換餼譜為了從MX樣品中成功提取GAG，必須除去可能汙染該樣品的其它基質蛋白。由於 GAG構成了 ECM中帶負電荷最強的分子，因此採用陰離子交換色譜能夠最有效地完成。使用8M尿素/CHAPS緩衝液破碎樣品並將其加載到陰離子交換色譜柱上。從柱上清洗掉不想要的蛋白和ECM碎片並用IM NaCl洗脫帶負電的GAG。典型的色譜圖(圖1)清楚地顯示大量未附著的碎片從中流過，並且從MX製備的大量GAG清潔並且緊密地洗脫。因此，該結果不但證明了通過該方法對GAG的純化，而且它還確認用NH4OH處理後ECM中保留了大量GAG。皿在各個處理階段，幾乎所有用於純化和分析GAG的色譜方法均需要使用高鹽緩衝液洗脫。由於高鹽條件幹擾了基於親合力的色譜方法，因此在每個處理階段後必須對樣品脫鹽。該過程通常是使用排阻色譜完成的。在這些條件下，諸如GAG的較大分子在包括鹽和小GAG碎片的小分子之前離開柱。可以通過所得的色譜圖(圖2)觀察GAG與汙染鹽的分離，該色譜圖還用於確認GAG鏈在處理過程中保持完整。BMP2-HBP 柱系統柱製備由於使用可商購試劑製備BMP2生長因子柱的成本限制，我們取而代之地使用了已知的BMP2肝素結合結構域(BMP2-HBP)的生物素化製備物。將該肽固定在Hi-Trap抗生蛋白鏈菌素HP柱(Iml)上以特異性地保留對特定肝素結合結構域肽具有親合力的GAG鏈。首先，通過對不含BMP2-HBP的柱床運行總GAG (tGAG)流分來檢查GAG對空白抗生蛋白鏈菌素柱可能具有的任何背景親合力(圖3)。我們的結果確認從MX獲得的tGAG樣品對抗生蛋白鏈菌素柱不具有固有的親合力。我們還研究了兩種不同的方法，其將tGAG暴露於BMP2-HBP以便分離具有特異親合力的鏈。在加載到抗生蛋白鏈菌素柱上之前，將該肽與 25mg tGAG預溫育30min，或者先加載該肽，隨後將tGAG流過柱床。tGAG與BMP2-HBP的預溫育表明該肽完全不能與柱結合(圖4)，更不必說介導特異性GAG的任何分離了。然而，當將該肽單獨加載到該柱上時，它與柱的結合是絕對的，即使在IM鹽的條件下也不能有效地洗脫該肽(圖幻。這種高親合力結合表明生物素-抗生蛋白鏈菌素的結合正確地起作用，並且表明當與tGAG —同加載時，由於位阻而對與柱之間的結合產生可能的抑制。柱加載量
由於對BMP2-HBP可能具有相對親合力的tGAG的比例未知，因此我們首先將每次分離運行中加載到肽柱上的tGAG的量進行標準化。通過固定Img BMP2-HBP製備了 Hi-Trap 柱以用於提取對BMP2肝素結合位點具有特異親合力的tGAG。選擇該量以使得用於今後實驗的可用肽的量最大化，這會使柱穩定性隨時間而被破壞。不穩定性是肽柱的顯著問題，會相應地影響一致性。開始嘗試將25mg tGAG加載到Img BMP2-HBP偶聯柱上，其導致明顯過載，如通過232nm的流過液吸光度所觀察的(圖6)。儘管觀察到了明顯的洗脫峰，但是由於過載，在流過液中損失了對HBP具有親合力的tGAG。通過使流過液再次通過肽柱來檢查這種情況(圖7)。這導致產生了明顯的GAG+(洗脫)峰，表明上次運行使該柱飽和。進一步的優化使我們通常將不超過6mg的tGAG加載至aiigBMP2-HBP柱。如流過液峰(圖8)和陽性結合部分的缺少(圖9)所證明的，這防止了柱過載。反過來，在單次通過中從每個樣品組提取對BMP-HBP具有親合力的那些tGAG使我們能夠更有效地分離GAG+ 和GAG-流分。GAG結構域分析GAG+鏈特異件通過建立標準化方案，我們能夠可復現地分離GAG+部分以用於進一步分析。考慮到介導蛋白結合特異性的硫酸類肝素的域結構，很有可能是與柱結合的多域 GAG鏈實際上是由對BMP2具有較低特異性親合力或不具有特異性親合力的大部分鏈組成的。類似地，有可能表現為GAG-的鏈實際上可能含有對BMP2-HBP具有一定親合力的結構域。為了檢查這些可能性，必須將GAG鏈破壞成它們的組分域以進行更廣泛的檢查。肝素酶111(類肝素酶I)主要在側接高硫酸化區域的那些區域切割HS鏈，由此釋放與敏感生長因子結合的高荷電蛋白結合結構域，在本文中為BMP2-HBP。將GAG+和GAG-部分暴露於肝素酶消化，儘管任一個流分都未在對BMP2-HBP的親合力方面顯示出任何變化 (圖 10)。隨後，對全長GAG+和GAG-流分進行肝素酶III消化，然後將兩個消化的樣品組加載到BMP2-HBP柱上以評價保留親合力。酶消化後，通過相同乾重樣品相對吸光度的增加驗證了肝素酶消化的效力，如圖 10和圖12所示。由於232nm下GAG鏈的監測是通過糖鏈本身進行的並且，具體地，是通過不飽和鍵進行的，因此導致產生了 HS片段不飽和鍵的肝素酶III沿鏈長的任何切割都會造成吸光度的增加。有趣的是，全長GAG-鏈的肝素酶消化未得到對BMP2-HBP具有任何明顯親合力的流分(圖11)。然而，類似地，全長GAG+樣品的消化未產生對BMP2-HBP缺乏親合力的部分 (圖12)。該結果表明所產生的全部BMP結合的GAG鏈含有對HBP具有特異親合力的域重複。作為另外一種選擇，在這些最低的條件下，HBP可能不能在具有不同親合力的GAG+域之間得到充分的區分。GAG+ 組合物全長GAG+的尺寸估計(sizing)為了檢查來自BMP2-HBP柱的GAG+組合物流分，我們首先檢查了它們的平均尺寸。 這是為了確保我們確實分離了具有適當長度的GAG鏈，而不是不帶有任何特異性親合力的小片段。儘管由於它們具有相對剛性的杆狀構象，GAG鏈的任何尺寸估計都是有問題的，但
39是可以做出涉及斯託克半徑(Stoke' s radiu)和表觀球形度的一組假設。將全長GAG+樣品加載到排阻限為20kDa至1. 5kDa之間的BiogelPlO凝膠過濾柱 (IcmX 120cm)上。232nm下測量的吸光度表明大部分GAG+分子具有大於20kDa的總表觀尺寸(圖13)。已假設糖鏈必須長於約10-14個環以增強對有絲分裂原FGF家族的顯著生物活性。就表觀分子量而言，14個完全硫酸化的二糖鏈對應於約8. 7kDa。由於GAG+樣品中存在的大多數鍊表現出> 20kDa的表觀分子量，因此假設它們對BMP2-HBP所具有的相互作用具有一定特異親合性並且不是由常規非特異相互作用所造成的是合理的。GAG+糖類物質存在五種主要的糖胺聚糖家族透明質酸糖胺多糖(hyaluronan)、硫酸角質素、 硫酸皮膚素、硫酸軟骨素和硫酸類肝素。在這五種糖胺聚糖中，只有硫酸類肝素、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素具有產生不同硫酸化的結構域的能力，這些不同硫酸化的結構域可以編碼與特定細胞因子(如BMP2)的特異性相互作用。鑑定使用BMP2-HBP柱分離的糖類物質的類型對本研究是至關重要的，並且使用診斷化學和酶降解的組合確定了對它們的鑑定。具體地，作為與BMP2相互作用的主要GAG候選物，硫酸類肝素在存在亞硝酸的情況下可以完全降解為其二糖組分。因此，將我們的HBP保留的GAG樣品與亞硝酸溫育20分鐘，然後在Biogel PlO篩分柱上分離。對所得色譜圖的檢查表明如對232nm和226nm處的吸光度所測量的，所有GAG+ 糖樣品幾乎完全降解(圖14)。該結果明確表明由於其它糖鏈不受亞硝酸解聚的影響，因此對BMP2-HBP特異性分離的全長糖鏈主要是由硫酸類肝素組成的。儘管幾乎所有GAG+鏈都可以按照這種方式降解，但是在較高分子量(> 20kDa) 處還是觀察到了小峰。可以假定它是由硫酸軟骨素組成的，其中CS-B(硫酸皮膚素)和 CS-E (4，6-硫酸軟骨素)證明了與硫酸類肝素類似的硫酸化複雜性。GAG類物質分析BMP2-HBP特異性GAG (替代物質)全長GAG+鏈通過暴露於亞硝酸的降解清楚地表明大多數GAG+糖鏈是由硫酸類肝素糖類物質組成的(圖14)。然而，由於在高分子量區域中觀察到了殘餘的峰，因此GAG+樣品的降解是不完全的。該峰的存在明顯指出了其它種類糖鏈的可能性，如硫酸軟骨素或硫酸皮膚素。接著，我們首先通過檢查多種可商購的軟骨素和皮膚素糖對BMP2-HBP柱的親合力來設法檢查另外兩種糖類對該細胞因子可能具有的可能親合力。通過在每種情況下，在與用於將GAG+鏈從MC3T3基質樣品中分離的相同條件下將 6mg糖加載到BMP2-HBP柱上，我們測試了 4-硫酸軟骨素(C4S)、6_硫酸軟骨素(C6S)和硫酸皮膚素(DS)。顯示3種糖鏈類型中每一種的親合力的色譜圖顯示只有C4S(圖1 對該肽具有任何明顯的親合力。這種親合力連同對C6S(圖16)和DS(圖17)樣品所觀察到的對 BMP2-HBP柱缺乏親合力一起似乎表明C4S對BMP2肝素結合位點具有特定的、潛在顯著的相
互作用。由於尚未良好表徵硫酸軟骨素和BMP2之間的任何可能相互作用，因此這些結果使我們懷疑柱色譜作為BMP2/類肝素相互作用的精確監控的有效性。為了進一步研究動態相互作用的特異性，我們測試了幾種可商購糖類對柱的親合力。這些糖類包括硫酸類肝素、 低分子量肝素(肝素-LMW)、高分子量肝素(肝素-HMW)和用肝素酶I處理過的肝素-HMW。有趣的是，這些可商購的GAG類物質無一看上去能夠證明與該肽柱的任何特異相互作用。來自牛腎的硫酸類肝素具有極低的親合力(圖18)，通過其不能正向增強FGF2介導的細胞增殖(數據未示出)進一步確認了該行為，如在存在HS2的情況下所觀察到的。該 GAG樣品與柱結合能力的這種降低可能是由於它是以相對未硫酸化的形式出售所造成的。所測試的肝素樣品無一對柱顯示出即使是較低的親合力。由於在歷史上BMP2本身首先是使用肝素柱分離的，因此這是特別有趣的。為了確認該結果，測試了 LMW(圖19) 和HMW(圖20)肝素；兩者均未對該柱顯示出任何明顯的親合力。由於我們推測相對小的BMP2-HBP肽可能難以維持其與明顯更大的肝素分子的結合，因此我們接著使用肝素酶I預消化了肝素-HMW樣品。然後，將這些較小的肝素-HMW 片段在BMP2-HBP柱上運行；然而，這種處理似乎不能改善任一種肝素樣品結合肽柱的能力 (圖 21)。由於BMP2通常是通過肝素親合力分離的，因此，肽柱不能對各種肝素製劑中的任一種表現出任何特異相互作用是有些出乎意料的。然而，可能的原因是，這可能是由於「受體-配體」相互作用順序的顛倒所造成的；在這種情況下，BMP2-HBP代表固定的「受體」，與代表「配體」的肝素相對，或者BMP2-HBP或可溶性肝素的濃度有利於能夠快速消除流速/鹽壓力下的任何親合力的解離狀態。結論前成骨細胞來源的ECM底物的使用為我們提供了用於模擬與這種成骨誘導有關的天然分泌的、ECM相關GAG的活力的有用模型。儘管先前的許多研究已經檢查了這種天然相互作用在調節BMP2活性中的作用，但是這通常是在細胞因子水平上進行的，而不是著眼於研究生物調節GAG的序列特異性。因此，在本文中我們設法開發了 MX底物中天然分泌的GAG的可用性和它們對於直接、序列特異的相互作用以及調節BMP2誘導的C2C12成肌細胞成為成骨系的潛力。陰離子交換使用這種特別的標準並且良好說明的方案為我們提供了從NH4OH處理的MX底物可接近GAG的結論性證據。我們開始的關注點集中在用於使ECM細胞組分溶解的苛刻化學處理，並且這還可能導致大部分GAG從ECM中剝離。然而，陰離子交換色譜圖中所觀察到的顯著高親合力的峰清楚地顯示出大量GAG在MX底物中的保留。儘管這種特定方法不能夠鑑別各種GAG類物質，但是由於它們作為細胞分泌的帶負電荷最多的分子之一，因此確實提供了它們在樣品中存在的結論性證據。BMP2-HBP 柱系統對BMP2肝素結合肽的功能性作用的先前研究為我們研究BMP2對GAG所具有的潛在特異相互作用提供了有用工具。位於每個BMP2單體N-末端的胺基酸單鏈似乎僅負責調節BMP2對GAG的親合力。因此，我們研究了 BMP2分子的這個區域作為配基「誘餌」的使用以嘗試保留對細胞因子具有相對親合力的那些GAG鏈。以這種方式使用BMP2-HBP導致HS在肽柱(GAG+)上的顯著保留。柱製備使用N-末端生物素化的HBP，我們製備了 BMP2-HBP親合色譜柱，並且能夠成功保留作為控制天然BMP2同型二聚體候選物的GAG樣品。柱的初始製備顯現出了一些有趣的問題。與tGAG預混合的生物素化的BMP2-HBP的製備顯示不能與柱結合。由於隨後的測試顯示當加載到其自身時，BMP2-HBP易於連接到抗生蛋白鏈菌素柱上，因此該結果表明GAG 幹擾肽生物素化位點與抗生蛋白鏈菌素柱結合的能力。tGAG本身對抗生蛋白鏈菌素不具有親合力，這表明與BMP2-HBP可能通過位阻的直接相互作用是造成這種情況的原因。柱優化在沒有使我們能夠估計我們的樣品中GAG+糖的結合量的任何直接信息的情況下，需要優化我們的肽柱以確保過量的樣品加載不會導致柱飽和以及隨後的樣品損失。這起初包括故意使柱飽和以檢查已知量BMP2-HBP的結合量。即使使用大量tGAG，肽仍能夠保留大部分GAG+糖鏈。在這些條件下，少至Img的BMP2-HBP能夠在兩次循環中完全保留所有GAG+鏈。因此，該柱似乎「模擬」 了真實的BMP2生長因子柱並且提供了提取GAG+樣品的非常有效的方法。針對特異GAG的分離，對基於肽的柱的優化是複雜的程序，其根據所使用的蛋白質的尺寸和個體化學特性而有較大不同。利用FGF-I和2生長因子柱(Turnbull和 Nurcombe,personal communication(個人通信))的上述研究還顯示出顯著需要對柱進行持續的維護以及柱的可用壽命周期較短。這些研究證明了使用肽柱的繁複的性質以及必須小心地正確優化該類系統。遺憾的是，儘管存在用於分析特異性蛋白-GAG相互作用的其它系統，但是這些系統通常缺乏分離足夠量的GAG以用於進一步分析的能力，從而使它們不適合我們所設計的研究過程。GAG結構域分析特別地，對於硫酸類肝素0B)來說，GAG硫酸化類型經常集中在與較少硫酸化的區域相間隔的高硫酸化結構域中。這種將硫酸化位點分為結構域的分組是提供配體與GAG 鏈區域特異結合的集合，從而使得單個糖分子有可能結合多個不同靶標，並且穩定這些靶標之間的相互作用，如在FGF系統中所顯示的。對於所提出的HS-配體相互作用的這種模型的例外情況包括幹擾素Y (IFNy)和硫酸類肝素之間的相互作用。在這種情況下，GAG 和IFNy之間的相互作用導致細胞因子效力的提高。仍保持與局部GAG解離的IFNY被快速加工成失活形式，由此防止其在擴散後在不適合的區域中發出信號。IFNy還顯示出四個不同的肝素結合結構域，其中每一個都具有不同的序列，這是對於肝素結合蛋白不常見的發現。然而，已表明只有緊鄰蛋白質C末端存在的兩個結構域介導INFy的肝素結合特性。重要的是，對這兩個IFNy肝素結合位點具有特異型親合力的HS序列的序列分析表明了與HS-配體相互作用的通常所觀察的模型相比的有趣差異。在這種情況下，發現負責 IFNy結合的HS序列主要是由具有較少硫酸化的N-乙醯化區域組成的。該區域側接了兩個小N-硫酸化區域。這與FGF中所觀察到的系統顯著不同，在對TOF所觀察的系統中，NS 結構域中的硫酸化類型是造成介導FGF和HS之間的相互作用的原因。近年來，已在多個其它系統中觀察到了這類相互作用，如PDGF、IL-8和內皮抑素(內皮他丁，endostatin)。如在這些細胞因子中所觀察的，與HS的這種相互作用的發現可能能夠解釋在透明質酸糖胺多糖中所觀察到的生物活性，其中透明質酸糖胺多糖在沿其鏈的任一點上不具有硫酸化類型，但是卻具有調節該類因子(如NF-κ B)活力的能力。配體和GAG之間的這些所觀察到的相互作用，具體地，IFN γ的相互作用，與所提出的以及我們所觀察到的HS與ΒΜΡ2之間的相互作用模式明顯不同。ΒΜΡ2的單個N末端肝素結合結構域未表現出二級結構並且似乎僅基於電荷與HS相互作用。儘管未對結合該肽序列的HS進行深入序列分析，但是其需要在約300mM NaCl的條件下洗脫使我們懷疑存在適當程度的硫酸化，由此將該相互作用歸於介導特異相互作用的硫酸化類型的傳統模型中。GAG+鏈特異件將硫酸化類型分配成使HS能夠穩定蛋白質組相互作用的結構域還會導致存在這種可能性，即具有足夠長度和複雜性的GAG+糖鏈可帶有其本身對BMP2-HBP不具有直接親合力的幾個結構域，這是由於這些結構域帶有不同的硫酸化序列所造成的。相反地，也有可能鑑別為對BMP2-HBP(GAG_)具有較低親合力的一些全長糖鏈可能含有一些確實帶有這種親合力的隱蔽結構域。近年來，已發表了為這些複雜碳水化合物鏈內存在「硫酸化編碼」提供強有力證據的多個報告。儘管該「硫酸化編碼」的詳細情況仍難以闡明，並且硫酸化碳水化合物長鏈的測序是複雜並且費時的過程，但還是由此已提出了 GAG和配基之間特異相互作用的多種可能模式。具體地，一種觀察已導致產生了對多種GAG-配基模型的表徵；沿多種類型GAG (如硫酸類肝素)的長度，將硫酸化分組為不連續的區域或「結構域」。有趣的是，尚未觀察到這種現象的模板，並且它似乎主要是由負責GAG合成這一階段的磺基轉移酶的暫時活性所造成的。特別地，研究特異GAG序列的有用工具為可以用於檢查複雜碳水化合物鏈的靶向解聚的多種肝素裂合酶，藉此提供了對它們結構的認識。一種特別的類肝素裂合酶，即肝素酶III (類肝素酶)，在側接可以在硫酸類肝素鏈中存在的高度硫酸化結構域的位點切割硫酸肝素鏈。因此，使用該酶，有可能從全長糖鏈中釋放這些潛在活性區域並且如果它們作為單一結構域起作用，則有可能通過親合色譜將它們與對BMP2-HBP不具有特異親合力的區域分離。重要的是要注意對於GAG-配體相互作用來說，序列的親合力不一定能保證生物活性。在與它們的各種配體結合期間，GAG介導的活性模式根據系統而明顯不同。在其中糖鏈通過穩定蛋白三級結構來起到延長蛋白-蛋白相互作用的作用的一些情況下，如在FGF 與其受體之間所存在的以及HGF/SF和Met之間的相互作用，多個不連續的硫酸化區域可以參與調節糖鏈的預定生物活性。在這樣的情況下，各個硫酸化結構域與全長碳水化合物鏈的分離實際上會造成糖生物活性的抑制，這是因為儘管每個「結構域片段」仍與其預定靶標結合，但是它不能介導混合的全長碳水化合物鏈的預定生物效應。有趣的是，GAG-配體相互作用的這種特定特徵正是使這種方法對調節BMP2活性有用的原因。對BMP2生物活性的GAG調節所提出的模型包括細胞因子在ECM中的GAG或在細胞表面上的固定化。在這樣的系統中，應用對BMP2的肝素結合結構域特異的外源GAG 將會阻止這種相互作用，從而提高短期BMP2介導的信號，這與在加入可溶肝素期間所觀察到的效果類似。儘管存在這種方式的相互作用將會繼續保護細胞因子不被蛋白水解降解的一些指示，但是從長遠來看，BMP2從其生物活性預計區域的離域(delocalization)將有可能對細胞因子的有效性造成負面影響。我們的全長GAG+和GAG-鏈的對照測試產生了與在它們一次分離期間所觀察的類似的分布圖。然而，對用肝素酶III處理後的GAG+和GAG-鏈的分析獲得了出人意料的結果。GAG+鏈的消化似乎不能產生僅根據對BMP2-HBP的親合力而可分離的片段。此外，全長 GAG-鏈的消化未獲得從陰性糖鏈中釋放的陽性結構域。有一定可能性的是酶消化未達到完全。然而，所得的色譜圖清楚地顯示與全長GAG鏈相比，在232nm處的吸光度極大提高。由於232nm下糖胺聚糖的大部分吸光度是通過不飽和鍵(如，酶解聚期間所形成的那些)的吸光度所介導的，因此它明確地表明事實上酶消化是成功的。該結果的含意有些不同尋常。該數據表明GAG鏈不僅是通過細胞合成以特異地與 BMP2相互作用，而且對於MC3T3細胞來說，這些糖鏈帶有對BMP2代謝方面特異的多個序列重複。BMP2作為極其強效因子的事實可能為該觀察現象提供解釋。已經充分地記載了 BMP2 對間充質祖細胞的成骨誘導作用，例如它在甚至從成骨系中除去的細胞中誘導異位骨形成的能力。考慮到該效力，已知BMP2的異位信號對治癒和發育均具有有害的後果。有可能的是在前成骨細胞GAG上設計了 BMP2-HBP相互作用序列的多個重複以確保最大結合，並由此調節該細胞因子誘導改變的細胞結局的能力。相反地，體內產生的極低濃度的BMP2也可能需要這類糖鏈的產生以確保保留足夠的局部濃度，即由體外誘導C2C12成肌細胞的成骨分化所需的極高濃度的BMP2所支持的觀察現象。BMP2-結合結構域的這種重複是通過模板或時間機制尚未被闡明的合成途徑所產生的這一事實是特別有趣的。單一糖鏈內的序列特異性結構域的準確性和可復現性(與對應於其它配基的該類域的隨機成簇相反)明確地表明這些細胞實際上確實具有指導特異性糖序列產生的能力。當前對HS結構的了解表明，在序列特異性區域的產生中對碳水化合物鏈的進行性合成後「編輯」，其中一些觀察現象是針對酶「模板」的一些方式的，藉此使用特定磺基轉移酶以及其它相互作用分子的局部濃度以直接控制特異性糖序列的產生。我們當前對特異合成的這種模式的理解在很大程度上是根據多項研究所獲得的，包括Lindahl 等人對抗凝血酶III和肝素之間高親合力相互作用的研究以及hko等人有關具有不同GAG 合成途徑的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞突變體的研究。儘管這些研究在GAG分析方法方面差異顯著，但是它們均針對用於受指導地調節細胞因子和受體活性的特異GAG合成的高度保守系統。重要地，這些研究還用於說明這些BMP2重複的可能產生，如在我們的研究中所觀察到的。GAG+ 組成全長GAG+尺寸各個GAG鏈對於FGF的生物活性與碳水化合物鏈的長度密切相關。評價GAG生物活性的常用方法是測定不斷縮短的硫酸化結構域片段，並且從而確定介導所觀察的活性所需的最短可能序列。使用該方法，我們首先檢查了全長GAG+糖鏈，並且確定它們的尺寸為> 20kDa，其足夠長以帶有對BMP2具有親合力的多個結構域。有趣的是，該觀察現象為用肝素酶3處理的GAG+樣品表現出對BMP2具有特異親合力的碳水化合物鏈部分的多個重複的早期觀察現象提供了支持，這是因為這種尺寸的不同硫酸化的糖鏈具有帶有多個硫酸化結構域的能力。GAG+糖類物質由於組成「糖組」的五種糖胺聚糖類型中的大部分能夠編碼所觀察到的與BMP2之間的特異相互作用，因此必須闡明這些GAG類型中有哪些可以參與這種特異性結合。儘管這種相互作用的主要候選物為硫酸類肝素，但是還對硫酸軟骨素和硫酸皮膚素鑑別了類似生長因子相互作用。使用亞硝酸可以將硫酸類肝素完全解聚成其二糖組分。這種與硫酸肝素和硫酸角質素共有的特定特徵是分析特異GAG群體所必不可少的。對於我們的GAG+樣品的碳水化合物組成的分析來說，由於亞硝酸所造成的降解是硫酸類肝素的判斷特徵(diagnostic)。 這種可能性主要是由於與硫酸肝素或硫酸角質素相比，通過硫酸化其硫酸類肝素的更高度的帶電類型所造成的。最終，這種帶電類型是造成BMP2與HS的特異性相互作用的原因。我們使用亞硝酸方案的分析顯示了 GAG+樣品組的完全降解，這表明GAG+樣品組中大部分的糖實際上是1，3-連接的，並因此是硫酸類肝素。該結果支持有關硫酸類肝素細胞因子相互作用特異性所觀察到的多種現象，特別是BMP2對肝素和HS表現出的相互作用。GAG類分析BMP2-HBP特異件GAG (替代件物質)在亞硝酸降解GAG+樣品後所觀察到的小殘餘峰是對GAG+樣品組中可能存在帶有對BMP2具有一定特異親合力的其它硫酸化GAG的支持。考慮到我們當前所了解的硫酸化在介導GAG和BMP2之間相互作用中的影響，軟骨素和皮膚素是最有可能顯示出與BMP2具有特異相互作用的替代糖，這是因為它們在硫酸化類型中顯示出最大的可能多樣性。經常用於GAG分析的方法包括檢查各個硫酸化位置對GAG-配體相互作用的影響。 這種分析方法是各個硫酸化位置在維持GAG鏈與其特異的靶標之間相互作用中的重要性的指徵。此外，由於不同類的GAG僅可能帶有對它們的種類特異的硫酸化類型，因此這能夠輔助縮小可能對特異性配體表現出親合力的可能糖胺聚糖候選物的範圍。為此，我們檢查了不同硫酸化的CS鏈、C4S和C6S以及標準DS對BMP2-HBP所帶有的親合力。有趣的是，僅C4S對BMP2-HBP帶有任何顯著的親合力。該數據表明4_0_硫酸化有可能是CS與BMP2-HBP相互作用所必須的。有趣的是，硫酸皮膚素對BMP2-HBP未顯示出親合力。由於DS是表現出與HS類似的硫酸化多樣性的唯一 CS類，因此所觀察到的該現象是很有意思的。此外，我們的觀察表明DS中GlcA向IdoA的差向異構化有可能損害了這種糖類型結合BMP2-HBP的能力。C4S和DS均能夠帶有4_0_硫酸化，但是與C4S相比僅有少量DS保留在柱上。可替代地，這種親合力的缺乏可能只是因為這一特定批次的DS未帶有足夠的4-0-硫酸化以有效介導與BMP2-HBP的結合。有趣的是，所觀察到的這些特別現象似乎表明了 BMP2與帶有4-0-硫酸化的CS之間的相互作用。儘管上述研究已對藥物遞送系統中CS-BMP2相互作用的使用進行了研究，但是對各個CS類和BMP2之間的任何序列特異相互作用仍知之甚少。然而，由於HS鏈是由1，4_連接的二糖單元組成的，因此在 HS-BMP2相互作用中未發現造成CS-BMP2相互作用的所觀察到的4_0_硫酸化，表明在CS中未發現序列特異相互作用。因此，有可能的是亞硝酸處理後所觀察到的殘餘峰可能含有少量帶有C4S或DS的4-0-硫酸鹽。進一步研究顯示，可商購的HS和肝素均未對肽柱保持任何明顯的親合力。用於該
45測定的HS商購自Sigma-Aldrich並且來源於牛腎。考慮到對HS組織特異性的了解，從牛腎來源中分離的這種可商購的HS有可能帶有特異性地介導與BMP2的相互作用所需要的可忽略的碳水化合物序列。類似地，LMW和HMW肝素均未對肽柱表現出任何親合力。用於該分析的肝素也購自Sigma-Aldrich，並且來源於豬腸黏膜。儘管已經很好地描述了肝素與抗凝血酶III的相互作用，以及它在敏感分子分離中的多種作用，但是由於其均一的硫酸化，一般不認為肝素與生長因子的相互作用是特異性的。然而，考慮到肝素通常用於分離BMP2，有些出人意料的是兩種肝素樣品中無一與肽柱的相互作用達到任何顯著程度。肽柱與肝素之間缺乏相互作用的另一種可能是由於兩種分子之間分子量的差異。連接到柱上的小BMP2-HBP可能難以維持它與較大的高度硫酸化的肝素鏈的結合。然而，肝素酶切割的肝素不能與柱結合似乎表明對柱使用全長肝素的空間效應不是破壞糖與 BMP2-HBP之間可能相互作用的唯一原因。對於商購肝素不能與BMP2-HBP柱結合來說，還沒有發現非常明確的原因，儘管可以假定通過間隔區鏈將BMP2-HBP與其結合的珠在空間上進一步分開可以有助於改善該問題。總結在本研究中，我們證明了使用親合色譜分離帶有對BMP2-HBP的特異親合力的糖胺聚糖亞組，並且顯示了該程序獲得可復現結果的可能性。在我們對基於基質的GAG與 BMP2之間相互作用的這部分研究中，我們對參與介導這種結合的GAG類型以及它們的結構進行了幾項觀察。我們的結果表明，硫酸類肝素用於調節BMP2對前成骨細胞ECM所具有的大部分親合力，這是逐漸被認為負責調節BMP2活性的相互作用。此外，我們研究了根據對BMP2肝素結合位點的親合力分離ECM保留的GAG的可能結構，並得到了出人意料的結果。 我們的數據表明全長BMP2GAG+鏈不是由對BMP2具有特異親合力的各個結構域並且在這些結構域之間間隔了對該因子具有較低或不具有親合力的區域所組成的。相反，我們的結果表明這些GAG+鏈是由多個BMP2-結合結構域重複組成的。該結果在幾種水平上都是出人意料的。首先，完成在全長> 20kDa的碳水化合物鏈上的這種觀察所需的重複表明存在一定方式的合成模板。的確，儘管上述研究已不能獲得組裝組織特異性GAG鏈的模板，但是存在這種特異性的確切事實支持存在基於模板的系統。儘管尚未對該過程闡明基因組模板，但是存在一定可能性的蛋白質組學模板，或者可能是酶模板。第二，該觀察現象提供了一些有關BMP2與GAG之間相互作用的重要性的證據。可能需要沿碳水化合物鏈長度上的BMP2親合力位點的多個重複以確保BMP2與ECM的最大結合。已表明這種特定的結合顯著地延長了該因子的半衰期，並且可能負責維持顯著的局部濃度以維持信號發送。可替代地，一些研究提出了模型，藉此由於與基於ECM的GAG之間的相互作用，在空間上抑制了 BMP2與其受體的相互作用。在這種特定的方案中，BMP2親合序列的重複將確保該因子的最大結合，因此降低了它與其受體相互作用的機會。我們的累積性結果表明用於將GAG與ECM分離的這種系統是可行的並且有可能獲得對BMP2具有特異親合力的GAG鏈。本研究支持了有關GAG與BMP2之間相互作用的上述發現。儘管通過加入外源GAG+ 來防止BMP2與ECM體外結合似乎提高了 BMP2的信號並且上調了成骨基因的表達，但是還報導了相反的觀察現象。在這些研究中，通過HBP對BMP2調節的體內檢查顯示當與ECM GAG 的結合得到提高時，長期骨生成得到顯著改善。這種相互作用有可能是通過防止該因子擴散遠離基本活性位點以在維持局部濃度中起到重要作用。按照這些研究和我們自己觀察到的現象，我們提出了通過其與GAG的結合正調和負調了 BMP2的活力。通過Katagiri及同事所提出的模型可以精確地發生負調，由此BMP2遠離其受體在ECM中的保留導致BMP2信號的下調。然而，需要通過該因子發送信號的細胞可以潛在地分泌各種酶(如硫酸酯酶和肝素酶)以使細胞外糖鏈再成型，從而「剪開」保留ECM中BMP2的GAG，藉此釋放該因子並允許其發送信號，從而導致BMP2-ECM的相互作用最終成為細胞因子活力正維持中的一種。 可替代地，通過細胞表面GAG的BMP2負調控可以是通過GAG鏈與它們相關BMP2分子的內化作用進行的，如Jiao及同事所觀察到的。這些上述研究結合我們自己的觀察使我們得到以下結論BMP2與硫酸肝素 (heparin sulfate)之間的序列特異性相互作用代表了能夠正調控和負調控BMP2信號的複雜控制機理。在生理學上，該相互作用負責在胚胎發育、前體提交和傷口癒合等多個方面迫使對該強效細胞因子產生背景依賴性應答。實施例2-BMP2肽特異性HS的純化我們使用來自成熟BMP-2序列的具有肝素結合性質的肽來鑑別與該肽結合的新型HS。成熟BMP-2胺基酸序列QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNS VNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR[SEQ ID NO 5]肝素結合肽的胺基酸序列QAKH KQRKRLKSSCKRHP [SEQ ID NO 1]為了複製肝素結合位點的天然存在形式，我們在其C-末端對該肽進行生物素化並且保留了脯氨酸(P)以改善該肽一旦結合到抗生蛋白鏈菌素柱上的柔性/可接近性。BMP2肽特異性HS的分離所使用的材料包括BMP2-肽偶聯的抗生蛋白鏈菌素柱、HiPrep脫鹽柱(GE Healthcare)、20mM PBS+150mM NaCl (低鹽緩衝液)、20mMPBS+l. 5M NaCl (高鹽緩衝液)、 HPLC 級水(Sigma)、Biologic-Duoflow 色譜系統(Bio-fcid)和冷凍乾燥機。用低鹽緩衝液平衡該柱，並且將Img的Sigma HS(H9902)溶於低鹽緩衝液並通過BMP2-抗生蛋白鏈菌素柱。通過清洗低鹽緩衝液OOmMPBS，pH 7. 2,150mM NaCl)直至 232nm下的流出液吸光度幾乎返回為零為止，將未結合的媒介組分從柱上除去。用高鹽緩衝液(20mM PBS, pH 7. 2，1. 5MNaCl)洗脫結合到基質上的HS。混合峰組分並凍幹48小時。將Img HS應用於該柱，並且用含有低(150mM)NaCl濃度的20mMPBS緩衝液清洗。 在用低鹽緩衝液清洗後，用含有高(1. 5M)NaCl濃度的20mM PBS緩衝液洗脫結合的HS。收集表示保留流分的峰(在232nm處監測)並進行進一步脫鹽。冷凍乾燥後，獲得了 6mg陽性HS (GAG+)和1. ^g陰性HS (GAG-)。實施例3-BMP-2特異性硫酸類肝素的評價C2C12為小鼠間充質幹細胞，其通常表現出生肌分化但是能夠通過在第3代時添加BMP-2誘導為成骨系。將第3代C2C12細胞保持在具有1000g/L葡萄糖(低葡萄糖)10% FCS、1 % P/S並且不含L-穀氨醯胺的DMEM中(維持培養基)。將加入1000g/L葡萄糖(低葡萄糖)、5% FCS、1% P/S並且不含L-穀氨醯胺的 DMEM用作分化培養基。BMP-2對骨牛成的影響我們通過測量成骨標記物(骨鈣素、奧斯特利斯(osterix) ,Runx2)的表達水平評價了外源BMP-2對骨生成的影響。通過測定將不同量(lOOng/ml和300ng/ml)的BMP-2加入至細胞中的影響，我們觀察到了與加入300ng/ml BMP-2相比，在第5天時加入100ng/ml BMP-2的細胞中奧斯特利斯(osterix)、骨鈣素和Rimx2的表達顯著降低(圖27-圖29)。因此，由於任何變化應易於觀察，所以我們選擇該時間點用於今後的測試。材料和方法使用了第3代的C2C12細胞。以1 X IO6個細胞/瓶，將第3代細胞保持在液氮中。一旦從液氮中取出細胞，我們加入500μ 1培養基，來回吸取以使細胞再凍結並立即加入15ml培養基。培養基為加入1000g/L葡萄糖(低葡萄糖)、10 % FCS、1 % P/S並且不含L-穀氨醯胺的DMEM。處理培養基為加入1000g/L葡萄糖(低葡萄糖)、5% FCSU% P/S並且不含 L-穀氨醯胺的DMEM。在從培養基中收穫前，允許C2C12細胞生長至75%匯合(通常2至3天)。如下進行細胞計數。首先吸取/棄去培養基；加入15ml PBS,棄去PBS並加入3ml 胰蛋白酶，在37°C溫育5分鐘以將細胞從燒瓶中提高。加入9ml培養基以中和胰蛋白酶。使用GUAVA確定用於隨後在實驗板上進行細胞接種的細胞量。例如，對於3組12孔板，30000 細胞X36孔X3. 7cm2 = 4，000，000個細胞。從母液中稀釋細胞，並且加入用於細胞接種的所需量的培養基(每個孔需要500 μ 1包含30，000個細胞的培養基)。要製備ΒΜΡ2母液，將10 μ g rhBMP2 (骨形態發生蛋白2)再懸浮於100 μ 1的4mM HC1/0. BSA 中。使用了以下的RNA提取方案。將350 μ 1 RAl緩衝液用於細胞溶解。將細胞與RAl 一起在-80°C冷凍1天，然後將細胞融化並且將裂解物在11，OOOg過濾1分鐘。將過濾液與 350 μ 1 70%的乙醇在1. 5ml管中混合併在11，000g離心30s。加入350 μ 1 MDB緩衝液並將混合物在11，OOOg離心1分鐘。加入95 μ 1 DNA酶反應混合物並將混合物在室溫下保持至少15分鐘。然後，用200 μ 1的RA2緩衝液清洗(以使DNA酶失活)，並且在11，OOOg離心30s。用600 μ 1 RA3緩衝液清洗，並且在IlOOOg離心30秒。用250 μ 1RA3緩衝液清洗， 並且在11，OOOg離心2分鐘。用60 μ 1不含RNA酶的H2O洗脫RNA，並且在11，OOOg離心1 分鐘。使用Nanodrop測量濃度(以ng/ μ 1為單位)。如下進行RT(反轉錄)實驗。在PCR管中混合下列物質隨機引物(0. Ιμ )、 DNTP(1 μ 1)、RNAQ50/500ng)、不含RNA酶的H20(裝滿至最終體積為13μ 1)。在65°C溫育5分鐘。在冰上溫育至少1分鐘。收集內含物並且在加入以下物質前簡單離心第一鏈緩衝液1)、DTT (1 μ 1)、RnaseOUT(l μ 1)、SSIII反轉錄酶(1 μ 1)。加滿至最終體積為 20μ1。通過來回吸取進行混合。在室溫下溫育5分鐘。在50°C溫育60分鐘。在70°C使反應失活15分鐘。
在不同天中進行兩次反轉錄實驗，並且將PCR產物混合在一起並稀釋至2. 5ng/ μ 1的最終濃度以用於隨後的實時PCR。使用TaqMan 快速通用PCR master Mix(2X) (Applied Biosystem)進行實時 PCR0 將 PCR master Mix (10 μ 1) ,ABI 探針(1 μ 1) ,cDNA(l μ 1) ^ddH2O (8 μ 1)、GAPDH 禾口 β 肌動蛋白用作相對於實驗標靶OSX(Osterix)、OCN(骨鈣素)和Runx2對照基因。BMP-2特異件HS GAG+對骨牛成的影響通過使用定量聚合酶鏈反應(qPCR)測量成骨標記物(osterix、Runx2、鹼性磷酸酶和Bspll)的表達水平，我們評價了實施例2中分離的BMP-2特異性HS(GAG+)對骨生成的影響。準備了時間過程以比較標誌物在10天過程中的表達從而將對照與低和高劑量BMP-2 進行比較，其中高劑量是誘導細胞分化的最優條件。材料和方法將細胞以30，000個細胞/cm2接種到維持培養基中並保持進行連接過夜。第二天， 我們將其轉換為含有以下物質的分化培養基 無添加物· 100ng/ml BMP_2(陽性對照)· 100ng/ml ΒΜΡ-2+30 μ g/ml_GAG(陰性 GAG)· 100ng/ml BMP-2+30 μ g/ml+GAG(陽性 GAG)· lOOng/ml BMP-2+30 μ g/ml 肝素(Sigma#H3149)· lOOng/ml BMP-2+30 μ g/ml 總硫酸類肝素(Sigma#H9902_ 分離前的 HS)將碳水化合物和BMP-2以最小可能體積混合在一起，並且在將它們加入到培養基和細胞上之前在室溫下溫育30分鐘。5天後，使用Macherey-Nagel試劑盒提取RNA並進行反轉錄。如我們在圖30-圖33中所示出的，來自豬黏膜的硫酸類肝素(總HS)可以提高 BMP-2的活力(通過GAG+誘導的鹼性磷酸酶、osterix、Bspll和RunX2表達的提高所顯示的)並且這種活力包含在結合BMP2的流分中(陽性GAG)。這意味著我們可以通過將它們通過BMP-HBD肽柱來分離商購HS的BMP提高的流分。實施例4在添加了 10% FCS、2mM L-穀氨醯胺、ImM丙酮酸鈉和青黴素/鏈黴素的α MEM培養基中每72小時擴增MC3T3-El(sl4)前成骨細胞(從胚胎顱頂建立起的小鼠胚胎顱頂成纖維細胞系)直至產生了用於鋪板的足夠細胞為止。通過在添加了 10%FCS、2mM L-穀氨醯胺、25 μ g/ml抗壞血酸、IOmM β -磷酸甘油和青黴素/鏈黴素的α MEM培養基中以5 X IO4 個細胞/cm2鋪板使細胞分化。每72小時更換培養基，進行8天，此時收穫細胞和培養基。 通過高速離心並且通過0. 4 μ m過濾器過濾使培養基保留和澄清。使用細胞刮刀和含有 PBS(150mM NaCl w/o Ca2+ 和 Mg2+), 1 % CHAPS,8M 尿素和 0. 02% NaN3 的提取緩衝液使細胞層破碎。在所有階段(除非另外說明)，在將樣品加載到柱系統上之前使樣品澄清。該過程包括在5，OOOg高速離心30分鐘，並通過0. 4 μ m注射器式過濾器過濾。在加載通過柱系統前，始終使樣品澄清以防止在不流動的溶液中形成沉澱物。使用陰離子交換色譜從培養基和細胞層樣品中分離蛋白糖胺聚糖(PGAG)流分。在每種情況下，將培養基或細胞層樣品以5ml/min的流速在使用QuadTec UV-Vis檢測器的Biologic DuoFlow系統(Biorad)上通過裝填了 Capto Q陰離子交換珠(Biorad)的 Pharmacia XK 26 (56-1053-34)柱。在含有PBS (150mM NaCl w/o Ca2+和Mg2+)、IOOmM NaCl、 0.02% NaR的低鹽緩衝液(pH 7.3)中加載樣品。在含有PBS (150mM NaCl w/oCa2+和Mg2+)、 850mM NaCl和0.02% NaR的高鹽緩衝液(pH 7.3)中洗脫樣品。收集相關流分並混合成單一的PGAG樣品，並且凍幹以備用於脫鹽。將PGAG樣品以10ml/min的流速在使用QuadTec UV-Vis檢測器的Biologic DuoFlow 系統(Biorad)中通過四個順序連接的 Pharmacia HiPrep 26/10 (17-5087-01)柱進行脫鹽。收集相關部分並混合成單一樣品組，並且凍幹以準備用於進一步處理。在第四步中，對從脫鹽程序中獲得的PGAG樣品組進行鏈黴蛋白酶和神經氨酸酶處理以消化掉核心蛋白質並隨後釋放GAG鏈。在這個方面，將凍幹的PGAG樣品再懸浮於最小體積的25mM醋酸鈉(pH 5.0)中並通過0. 4 μ m注射器式過濾器過濾澄清。將總樣品體積以500 μ 1等份分配到IOml玻璃管中。向該等份中加入500 μ 1 lmg/ml的神經氨酸酶，然後將混合物在37°C溫育4小時。溫育後，將5ml IOOmM的Tris-乙酸鹽(pH 8. 0)加入至每個樣品。將在500mM的Tris-乙酸鹽和50mM乙酸鈣(pH 8. 0)中復原的另外1. 2ml IOmg/ ml的鏈黴蛋白酶加入到每個樣品中，然後將混合物在36°C溫育M小時。在該處理後，合併所有體積並通過離心和過濾準備用於陰離子交換色譜。在第五步中，在蛋白切割後將分離的GAG樣品以5ml/min的流速在使用QuadTec UV-Vis檢測器的Biologic DuoFlow系統(Biorad)上通過裝填了 Capto Q陰離子交換珠 (Biorad)的 Pharmacia XK 26(56-1053-34)柱洗脫。在這個方面，在含有 PBS (150mM NaCl w/o Ca2+和Mg2+)和0.02% Ne^3的低鹽緩衝液(pH 7.3)中加載樣品。在含有PBS(150mM NaCl w/oCa2+ 和 Mg2+)、850mM NaCl 和 0. 02% NaN3 的高鹽緩衝液(pH 7. 3)中洗脫樣品。將相關部分混合、凍幹並根據用於PGAG樣品脫鹽的上述方案進行脫鹽。將對應於BMP-2的肝素結合結構域並且包含QAKHKQRKRLKSSCKRH[SEQ ID NO 6] 所表示的胺基酸序列的N-末端生物素化的肽(Img)與含有PBS(150mM NaCl w/o Ca2+和 Mg2+)的低鹽緩衝液混合。通過裝填了抗生蛋白鏈菌素塗覆的樹脂基質的柱洗脫混合物。然後，將該柱暴露於含有 PBS(150mM NaCl w/o Ca2+和 Mg2+)、850mM NaCl 和 0· 02% NaN3 的高鹽緩衝液(PH 7. 3)以確定在那些條件下所述的肽是否與基質牢固地結合。未觀察到肽從該柱上的明顯損失。隨後，用製備樣品加載的低鹽緩衝液清洗該柱。將使用實施例1中所提到的程序分離的GAG混合物(^iig)懸浮於低鹽磷酸鈉緩衝液(ImL)，並加載到實施例2所述的肽柱上。用含有PBS(150mM NaCl w/o Ca2+和Mg2+)的低鹽緩衝液洗脫該樣品。在UV-Vis檢測器示蹤中觀察到了對應於具有可忽略的BMP-2親合力的GAG的峰。合併導致產生該峰的柱流分。這些流分被稱為「GAG-」-減號表示對該柱缺乏親合力。當在UV-Vis檢測器中明顯可以看出示蹤拉平至基線並且不再有寡糖洗脫時，將洗脫溶劑更換為含有 PBS (150mM NaCl w/o Ca2+和 Mg2+)、850mM NaCl 和 0. 02% NaN3 的高鹽緩衝液(PH 7. 3)。更換衝洗溶劑後，在UV-Vis檢測器示蹤中觀察到了對應於BMP-2 特異性GAG的峰。合併導致產生該峰的柱流分。這些流分被稱為「GAG+」-加號表示對該柱存在親合力。對於來源於前成骨細胞的GAG化合物來說，GAG+流分代表整個GAG混合物的 10%。
實施例5BMP2的加入對誘導C2C12成肌細胞的成骨分化具有明顯有限的能力。類似地， BMP2與肝素的預溫育已顯示出能夠延長細胞因子的半衰期及其體外直接活力。本文中，我們檢查了 GAG+和GAG-流分通過BMP2增強C2C12細胞體外成骨誘導的能力。將實施例4 中的 GAG+樣品(0、10、100、1000ng/ml)在存在 BMP-2 (0、50、100ng/ml) 的情況下體外加入到C2C12成肌細胞中。骨鈣素基因相對表達的測量表明GAG+樣品能夠增強BMP-2從而在遠低於目前在治療中所使用的BMP-2 (300ng/ml)的水平下使骨鈣素基因表達。在圖34中示出了該測定的結果(包括計算的ρ-值和誤差)，其中每種「培養條件」 的實驗條件如下所示1、對照細胞，未加入BMP-2，未加入GAG2、50ng/mL 的 BMP-23、50ng/mL 的 BMP-2、10ng/mL 的 GAG+4、50ng/mL 的 BMP-2、100ng/mL 的 GAG+5、50ng/mL 的 BMP-2、1000ng/mL 的 GAG+6、100ng/mL 的 BMP—27、100ng/mL 的 BMP-2、10ng/mL 的 GAG+8、100ng/mL 的 BMP-2、100ng/mL 的 GAG+9、100ng/mL 的 BMP-2、1000ng/mL 的 GAG+有趣的是，儘管lOOOng/ml的GAG+能夠顯著增強BMP2介導的骨鈣素表達，但是加入濃度低於lOOOng/ml的GAG+似乎逐漸抑制了該表達。此外，加入足夠的GAG+還能夠使通過50ng/ml BMP2的骨鈣素誘導超過僅加入lOOng/ml BMP2的骨鈣素誘導，從而表明了該相互作用的效力。這種基於細胞培養的分析證明將GAG+連同BMP2加入到C2C12成骨培養物中導致骨鈣素表達的顯著上調，從而表明了 BMP2信號效力的提高。該結果支持GAG+鏈與BMP2的特異性結合，藉此阻斷了 BMP2-HBP並防止它與基於基質的PGAG的結合。成骨基因表達的所得的上調與利用肝素的上述研究中所觀察到的結果可比較，從而達到了類似的作用。有趣地，加入濃度低於lOOOng/ml的GAG+似乎對BMP2信號具有初始的拮抗作用。解釋該觀察現象的一個可能假設是圍繞著一定數量GAG+分子結合一定數量BMP2 分子的能力進行的。在培養系統中未加入外源GAG+的情況下，大部分BMP2分子將能夠與 ECM結合，藉此定位到遠離它們的同源受體的位置並且不能立即引發信號。自發地和通過它們結合的GAG鏈的靶標酶改變，BMP2隨後從ECM上的解離具有誘導長期BMP2信號的能力。如添加了 lOOOng/ml GAG+的樣品中的情況，將大量GAG+分子加入到該系統中使得大部分BMP2分子保留在溶液中，在此它們能夠自由地介導受體二聚作用並誘導下遊信號。細胞因子/受體相互作用的這些過程可能需要特定的濃度閾值以維持有效的信號水平。在含有50ng/ml BMP2的培養條件下，低濃度GAG+的加入使得一部分可用的細胞因子仍保持溶解而其餘部分與ECM結合。在這些條件下，僅有少量BMP2保持溶解，但是由於其濃度較低， 因此將在培養基中高度擴散，從而導致產生了可忽略的信號。類似地，由於一部分BMP2保持溶解，因此ECM中可以存在較少量的BMP2，從而導致通過直接細胞活性從ECM中釋放的 BMP2的信號降低。然而，在含有lOOng/ml BMP2的培養條件下，在加入lOOng/mlGAG+的情
51況下，溶解的和基於ECM的BMP2的綜合作用足以誘導與對照水平類似的BMP2信號。然而， 在沒有進一步研究的情況下，對涉及BMP2/GAG+信號的動態過程仍不清楚。利用表面等離子共振的今後的研究可以幫助闡明BMP2/GAG+相互作用的效力並且可以輔助解釋這些觀察現象。實施例6根據以下的方法，使用類肝素酶3切割實施例4中的GAG+和GAG-糖鏈。分別用類肝素酶3 (250mU酶/100 μ g寡糖)對濃度為％ig/mL的GAG+和GAG-在37°C處理16小時。隨後，將混合物在70°C加熱5分鐘使類肝素酶3失活。對消化的GAG+和GAG-混合物分別單獨通過肽柱進行處理。每個色譜運行的UV-Vis檢測器示蹤表明消化的材料對該柱表現出與未消化材料相同的親合力。實施例7牛物素化flt與杭牛蛋白鏈菌素梓的偶聯方法以lmg/ml的濃度，將BMP2HB-肽溶解於含有150mM NaCl的20mM磷酸鹽緩衝液(低鹽緩衝液)中。使用低壓液相色譜(Biologic-Duoflow色譜系統，Bio-Rad)，將肽溶液在用低鹽緩衝液平衡的抗生蛋白鏈菌素柱(Iml)上進行親合色譜。以0. aiil/min的流速加載培養基，並且用相同的緩衝液清洗該柱直至基線為零。要檢查肽確實連接到該柱上， 用1.5M NaCl (高鹽緩衝液)的分級梯度對柱進行洗脫並用低鹽緩衝液重新平衡。合成了BMP2 肝素結合位點(5mg)序列(QAKHKQRKRLKSSCKRHP-NHET 生物素(SEQ ID NO 1))並偶聯到Iml抗生蛋白鏈菌素柱(GE Healthcare)上。色譜圖(圖36)顯示所有肽均緊密結合在抗生蛋白鏈菌素柱上。BMP2-特異性硫酸類肝素的純化方法以lmg/ml的濃度，將Celsus HS溶解於含有150mM NaCl的20mM磷酸鹽緩衝液(低鹽緩衝液)中。使用低壓液相色譜(Biologic-Duoflow色譜系統，Bio-Rad)，將肽溶液在用低鹽緩衝液平衡的抗生蛋白鏈菌素柱(Iml)上進行親合色譜。以0. aiil/min的流速加載培養基，並且用相同的緩衝液清洗該柱直至基線為零。用1. 5M NaCl (高鹽緩衝液) 的分級梯度洗脫結合的BMP2特異性HS，收集峰流分並用低鹽緩衝液重新平衡該柱。分別收集洗脫峰(BMP2+ve)和流過峰(BMP2-ve)，將它們凍幹並在-20°C保存。色譜圖(圖37)顯示了特異地結合在柱上的一小部分HS( 15-20% )並且它在高鹽緩衝液中洗脫。BMP2肽柱結合的HS的脫鹽方法將BMP2特異性HS溶解於IOml蒸餾水中。使用低壓液相色譜 (Biologic-Duoflow色譜系統，Bio-Rad)，將樣品在用蒸餾水平衡的Hi-pr印脫鹽柱(IOml) 上進行脫鹽色譜。將HS以lOml/min的流速加載並用蒸餾水清洗該柱。收集純HS流分，將其凍幹並在-20°C保存。色譜圖(圖38)顯示了純BMP2特異性HS(吸光度峰)與鹽緩衝液(電導率峰) 的完全分離。BMP2肽柱未結合的HS的脫鹽方法將非特異性HS溶解於IOml蒸餾水中。使用低壓液相色譜 (Biologic-Duoflow色譜系統，Bio-Rad)，將樣品在用蒸餾水平衡的Hi-pr印脫鹽柱(IOml)上進行脫鹽色譜。將HS以lOml/min的流速加載並用蒸餾水清洗該柱。收集純HS流分，將其凍幹並在-20°C保存。色譜圖(圖39)顯示了未結合的HS(吸光度峰)與鹽緩衝液(電導率峰)的完全分離。SAX-HPLC 二糖分析-BMP2 陽件 HS方法將樣品(100 μ g)溶解於IOOmM醋酸鈉/0. 2M醋酸鈣中(pH 7. 0)。肝素酶、 類肝素酶I和II均以10mu/ml的濃度在相同緩衝液中使用。將每個樣品順序消化以回收二糖用於SAX-HPLC分析；對於此，將樣品如下所示在37°C進行消化肝素酶消化池，類肝素酶I消化lh，類肝素酶II消化18h，並且最後用每種裂合酶的等份消化他。在用0. 25M NH4HCO3平衡的BioGel P-2柱(lX120cm)上運行樣品。將二糖峰凍幹，然後溶於酸化水 (用HCl酸化，pH 3. 5)中。將其通過連接到高壓液相色譜系統上的ftOPac PA-1SAX-HPLC 柱(Dionex，USA)，並且以lml/min的流速在60分鐘內用O至1. OM NaCl (pH 3. 5)的線性梯度洗脫 HS 二糖。在 A232nm 監測使用 HS 二糖標準品(Seikagaku，Tokyo，Japan and Iduron) 鑑別的峰。通過暴露於肝素裂合酶(肝素酶、類肝素酶I和II)的組合至完成，然後將所得的二糖片段進行強陰離子交換HPLC (SAX-HPLC)，對BMP2肽親合柱保留的HS進行酶二糖分析。 色譜圖(圖40)上的峰使我們能夠估計結合HS的群組中每種組成二糖的相對比例。該分析顯示BMP2結合肽HS群組中較大比例的二糖具有N-硫酸化葡糖胺。SAX-HPLC 二糖分析-BMP2 陰件 HS通過暴露於肝素裂合酶(肝素酶、類肝素酶I和II)的組合至完成，然後將所得的二糖片段進行強陰離子交換HPLC(SAX-HPLC)，對BMP2肽親合柱不保留的HS進行酶二糖分析。色譜圖(圖41)上的峰使我們能夠估計HS群組中每種組成的二糖的相對比例。該分析顯示流過的HS群組中較大比例的二糖具有N-硫酸化葡糖胺。Celsus 總 HS 的 SAX-HPLC 二糖分布圖通過暴露於肝素裂合酶(肝素酶、類肝素酶I和II)的組合至完成，然後將所得的二糖片段進行強陰離子交換HPLC (SAX-HPLC)，還對作為起始材料購自Celsus的總HS進行了酶二糖分析。色譜圖(圖4 上的峰使我們能夠估計HS群組中每種組成二糖的相對比例。ESPR-BMP2陽性和BMP2陰性HS的分析方法將BMP2+ve 和 _ve HS(10mg/ml)溶解於 Iml 0. IM 的 MES(pH5. 5)中，並且將含有 2mg/ml 生物素-LC-醯胼(Pierce)、EDC (7mg)的 300 μ 1 的 0. IMES (pH 5. 5)加入到混合物中，並且在室溫下溫育2h，然後加入另外7mg的EDC。另外溫育池後，用脫鹽柱 (Amersham Pharmacia)除去未摻入的生物素。對BMP2+ve和_ve HS測試它們結合溶解的 BMP2的能力。使用sra進行實時結合分析，其中將生物素硫醇塗覆的金傳感器晶片用作固定化抗生蛋白鏈菌素的平臺。使用生物素-抗生蛋白鏈菌素-生物素橋，可以將生物素化的HS固定在傳感器晶片上。然後，將生長因子QOOnM)加入到浸泡固定化HS的溶液中，並溫育20min。通過測量最小反射角(Θ)隨時間的變化來監測實時結合。圖44顯示了蛋白質-糖相互作用的表面等離子共振(SPR)分析。如曲線所示，其反映「結合率(on-rate) 」的強度(Ka)，如較小的角遷移所證明的，BMP2與「流過」的HS的結合不如與BMP2-結合HS的結合強。塗覆在Iduron肝素/GAG結合板上的BMP2+ve和BMP2_ve Celsus HS製劑的BMP2 結合能力方法將BMP2以3 μ g/ml的濃度溶解於阻斷溶液(0. 2 %的明膠在SAB中的溶液)， 並且用阻斷溶液建立0-3 μ g/ml的稀釋系列。將200 μ 1的ΒΜΡ2的每種稀釋液分配到用肝素預塗覆的肝素/GAG結合板的三個孔中；在37°C溫育2小時，用SAB和加入到阻斷溶液中的200 μ 1 250ng/ml的生物素化抗-BMP2小心清洗三次。在37°C溫育1小時，用SAB、加入到阻斷溶液中的200 μ 1 220ng/ml的ExtrAvidin-AP小心清洗三次。在37°C溫育30分鐘， 用SAB和自來水小心清洗三次以除去殘餘液體，加入200 μ 1顯色試劑(SigmaFAST磷酸對硝基苯酯)。在室溫下溫育40分鐘，並且在1小時內在405nm讀數。特別製備的板表面(lduron)吸附未修飾的GAG，並且同時保留了它們的蛋白結合特徵。在室溫下，在生理緩衝液中發生結合。結果(圖4 證明BMP2選擇性HS製劑對BMP2 的親合力比對流過或天然製劑的親合力更大。BMP2用作對照。C2C12細胞上BMP2陽件和陰件HS的ALP活力方法:ALP測定。在37°C /5% CO2的條件下，將C2C12細胞以20，000個細胞/cm2 鋪板在M孔板中含有10% FCS(Lonza Group Ltd.，Switzerland)和抗生素(1%青黴素和
鏈黴素)(Sigma-Aldrich Inc. ,St. Louis,MO)的 DMEM(Sigma_Aldrich Inc. St. Louis, MO)中。M小時後，將培養基轉換為5% FCS低血清培養基，其中含有lOOng/mL BMP2 (R & D Systems，Minneapolis，MN)、3mg/mL Celsus HS 和不同濃度的 BMP2 特異性(+veHS)和非特異性(_ve HS)Celsus HS製劑的不同組合。3天後，使用含有1 % Triton X_100、150mM NaClUOmM Tris (pH 7.4)、2mM EDTA、0. 5% 的意格倍(Ig印al，NP40)、0. 1 % 的十二烷基硫酸鈉(SDS)和的蛋白酶抑制劑混合組III(Calbiochem，Germany)的RIPA緩衝液進行細胞溶解。通過使用BCA蛋白質測定試劑盒(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)確定細胞裂解物的蛋白質含量。然後，通過將細胞裂解物與磷酸對硝基苯酯底物(Irwitrogen， Carlsbad, CA)溫育來確定細胞裂解物中的ALP活力。將讀數歸一化為總蛋白量並且表示為對於僅包含BMP2處理的組的相對量。圖46顯示與非特異性HS (-ve HS)相比，BMP-2特異性HS (+ve HS)對BMP-2誘導的鹼性磷酸酶(ALP)活力提高的程度更高。將lOOng/mL的BMP-2單獨引入或結合30 μ g/ mL的Celsus HS或不同濃度的特異性和非特異性HS引入。單獨引入30 μ g/mL的特異性和非特異性HS。ALP 染餼方法ALP染色。如上所述，溫育C2C12細胞。處理3天後，用PBS清洗細胞層並且根據生產商的說明，使用白細胞鹼性磷酸酶試劑盒(Sigma-Aldrich Inc. ,St. Louis,MO) 染色。簡要地，將細胞層固定在檸檬酸鹽緩衝的60%的丙酮中，並在含有萘酚AS-MX鹼性磷酸酶和重氮鹽的鹼性染料混合物中染色。使用邁爾蘇木紫溶液進行核染色。當通過組織化學評價時(圖47)，與非特異性HS (-ve)相比，BMP-2特異性HS (+ve HS)對BMP-2誘導的鹼性磷酸酶(ALP)活力提高的程度更高。將lOOng/mL的BMP-2結合 0,0. 3、3 和 30 μ g/mL 的 GAG 引入。BMP2 穩定性
方法=Smad 1/5/8磷酸化。在37°C /5% CO2的條件下，將C2C12細胞以20，000個細胞/cm2鋪板在M孔板中含有10% FCS (Lonza Group Ltd.，Switzerland)和抗生素(1% 青黴素和鏈黴素)(Sigma-Aldrich Inc.，St. Louis, MO)的 DMEM(Sigma-Aldrich Inc. St. Louis,MO)中。M小時後，將培養基轉換為5% FCS低血清培養基。在細胞已經在低血清培養基中平衡24小時後，加入含有100ng/mL BMP2 (R & D Systems, Minneapolis, MN) 並且存在 / 不存在:3mg/mL 肝素(Sigma-Aldrich Inc. ,St. Louis,MO)或 BMP2 特異性(+ve HS)Celsus HS的處理條件。在0、24、48和72小時的時間點處，在IXLaemmli緩衝液中收穫細胞裂解物。在 NuPAGE Novex4-12% Bis-Tris 凝膠(Invitrogen, Carlsbad, CA)中分離該裂解物，並使用抗磷酸-Smad 1/5/8 (Cell Signaling，Danvers，MA)和 Smad 1/5/8 (Santa Cruz Biotechnology Inc. , Santa Cruz，CA)的抗體通過蛋白質印跡進行分析。將BMP2結合的HS (即HS3)延長BMP2對細胞作用的能力(可能部分是通過保護蛋白不被蛋白水解降解)與商購肝素的作用進行比較。將C2C12細胞對無、僅BMP2、BMP2+ 肝素或BMP2+HS3暴露72小時，並通過免疫印跡監測BMP2特異性胞內信號分子Smad 1/5/8 的磷酸化水平(圖55)。結果表明HS3可以將BMP2信號延長至等於或超過肝素的水平。實施例8設計本實驗以研究當與Smith&N印hew的骨填料JAX 凝膠+磷酸三鈣(TCP)星混合時，HS3是否可以加速長骨修復。在成年兔的尺骨中造成不連接的嚴重缺損，在缺損處放置星，閉合傷口並且在4 和8周後，使用組織學和成像的組合監測修復。生物材料JAX 是由 Smith and Nephew Orthopaedics Ltd，USA 生產的 β-磷酸三鈣(TCP) 合成骨代用品。JAX 是由具有六個臂的顆粒組成的，其連結以在缺損位點提供55%的粒間孔隙度，從而允許細胞和血管滲入。臨床適應徵為4-5cm的非承重骨缺損。JAX 還包括水凝膠組分。體外研究通過首先用Alexa Flour 488染料標記，然後監測其向培養板中PBS的釋放評價了肝素以高或低濃度(作為HS的替代物)從JAX凝膠/TCP混合物的體外釋放。兩種情況下的釋放均是快速和爆發式的。肝素的螢光標記。對於非生物體外測定，使用我們的研究小組先前發表的方法(Ε.V.Luong, L.Grondahl, V. Nurcombe, S.Cool.In vitrobiocompatibi1ity and bioactivity of microencapsulated heparan sulfate Biomaterials 2007 ；28 21272136)，將作為HS糖胺聚糖家族的超硫酸化成員的肝素與Alexa Fluor 488(A488， Molecular Probes,UK)連接。簡言之，將 3mg 肝素(H-3149)溶解於 300 μ L 0. IM 的 4-嗎啉乙烷磺酸(MES，M3671)緩衝溶液(pH 4.5)並與50 μ L 10%的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)二亞胺碳鹽酸鹽(EDC，Fluka 03449)在0. IM MES緩衝液中的溶液混合。隨後， 將1%A488在0. IM MES緩衝液中的溶液(501)加入到肝素/EDC溶液中。將混合物避光並在室溫下溫育過夜。將結合了螢光的肝素在Amersham PDlO脫鹽柱上洗脫。標記效率為約 1. 3mol A488/mol 肝素。釋放分布圖。將三種JAX 顆粒與17或170 μ g的A488-肝素(50 μ 1，在100 μ 1水凝膠中)一同加載，避光，並且置於ImL PBS中，在37°C放置48h。在1、2、3、4、5、6、M和 48h，採集100 μ L調節過的磷酸鹽緩衝溶液(PBQ用於採樣並用新鮮的PBS替換。通過螢光測定法定量釋放的Α488-肝素的濃度，並且將Α488-肝素的積累釋放報告為加載濃度的百分比(圖57)。體內研究實驗設計。(參見圖56)對二十隻雄性紐西蘭白兔0-2.5公斤重)造成雙側尺骨缺損。將每種缺損隨機分配到三個實驗組之一。每個缺損接受18個JAX 顆粒以及含有下列治療劑之一的150 μ 1水凝膠30 μ g HS、100 μ g HS或等體積的PBS (50 μ L)。移植4和 8周後，將兔處死並收穫尺骨。使用2D X射線和微計算機斷層(微CT)，非破壞性地評價了每種治療的四塊尺骨在兩個時間點的礦物形成。隨後，處理這些尺骨進行組織學和免疫組織化學研究。第8周，每種治療加入另外三個樣品用於扭力測試評價。將一些缺損保持為空以用作內部對照從而確保該模型確實是不連接的。缺損位點中新骨形成的X射線監測以兩種不同的濃度(30和100μ g，稱為HS30和HS100)將HS3應用到Jax凝膠中， 並且與無治療劑相比，評價0、4和8周中的新骨形成。HS治療的動物與對照相比表現出新骨形成的明顯跡象。射線照相分析。JAX 顆粒是射線不透明的，並且因此難以通過2D X射線與缺損位點中的新骨進行區分。然而，在早期的時間點處，顆粒之間以及緊鄰橈骨的空隙是清晰可見的並且可以監測這些空間中骨形成的進展(S.A. Clarke, N. L. Hoskins，G. R. Jordan, D. R. Marsh. Healing of an ulnardefect using a proprietary TCP bone graft substitute, JAX , in association with autologous osteogenic cells and growth factors. Bone 2007 ；40 :939-947)。使用成像射線照相系統(MUX-100, shimadzu)來獲得手術後即刻以及4周和8周時的尺骨缺損2D圖像。然後，拍攝X射線的數字顯微照片。在全身麻醉的情況下拍攝X射線照片。圖52、圖53和圖58中示出了 X射線顯微照片。缺損位點中新骨形成的微CT監測使用微CT (計算機斷層)成像(圖52、圖53和圖59)，將手術時以30和 100 μ g(HS30和HS100)劑量施用的HS3與僅有PBS星的對照進行比較。微CT分析。在第4周和第8周，用微CT掃描儀(Skyscan 1076 ；Skyscan,比利時)掃描收穫的尺骨。以35 μ m的解析度和68mm的掃描寬度進行掃描。掃描儀設置為電壓104kV，電流98 μ Α。使用錐束CT-重建A Sasov軟體(Skyscan)，將所獲得的各向同性片層數據轉換為2D圖像。對於該重建來說，骨的上下閾值假定為-315和543豪恩斯菲爾德單位(Hounsfieldunit)。然後，使用用於定量的相關CTAn軟體(Skyscan)和Mimics 11. 1 軟體(Materialise，比利時)分析並重建數據以產生3D圖像。對於所有的樣品，將所關心的圓柱形區域(R0I，相對於缺損位點同心定位)和總片層數(對應於缺損的長度)保持恆定。通過對總含骨量、皮層骨(JAX 和橈骨)以及小梁骨(或新形成的骨)分配預定閾值來測量ROI內新形成骨的總體積。將數據報告為骨體積/總體積(％ )。與對照相比，HS3(30yg和IOOyg劑量)顯著提高了 BV/TV(% )。HS30 和 HS100 治療的尺骨之間沒有顯著差異(圖60)。組織學
在指定的實驗時間段後，收穫骨，並將其固定、脫鈣、切片並固定用於各種染料的染色。圖61和圖62示出了 3個治療組在4和8周內的H&E染色(參見下文)。HS3的治療清楚地顯示與對照相比，有更多組織滲入缺損。高倍放大的H&E染色顯微照片(圖6 顯示新骨在緊鄰Jax星處沉積(更清晰的島)，其中HS治療動物中出現了更大量的骨、骨髓和軟骨組織。到第8周，HS治療的尺骨中，新骨已再成型並成熟。組織學分析。將提取的尺骨在真空下固定到10%中性緩衝福馬林中，並且在室溫下在15%的EDTA(pH 7.2)中脫鈣4周。然後，以14h的程序，使用真空組織脫水機 (Sakura Finetek,日本)處理尺骨。脫水並清洗後，將骨包埋在Paraplast石蠟(Thermo Scientific)中，並使用輪轉切片機(Leica Microsystems，德國)將石蠟塊以5 μ M縱向切片。將石蠟切片置於正電荷顯微鏡載玻片上，乾燥，用蘇木紫/伊紅以及改性的四色染劑染色並且最後在Olympus Stereo (SZX12)和直立螢光顯微鏡(B)(51)下檢查。圖63和圖64示出了 4和8周內3個治療組的Ralis四色染劑(Z.A.Ralis， G. ffatkins. Modified tetrachrome method for osteoid and defectively mineralized bone in paraffin sections. Biotech and Histochem 1992 ；67 :339-345)染色(參見下文)。HS治療的缺損清楚地顯示與對照相比，有更多組織滲入缺損。高倍放大的Ralis四色染劑染色的顯微照片(圖64)顯示新骨在緊鄰Jax星處沉積(更清晰的島)，其中HS3治療動物中出現了更大量的編織骨、骨髓和毛細血管。到第8 周，HS治療的尺骨中，新骨已再成型並成熟。免疫染代在指定的實驗時間段後，收穫骨，並將其固定、脫鈣、切片並固定用於各種染料的染色。圖65示出了 4和8周內3個治療組的晚成骨標誌物骨鈣素的免疫染色(參見下文)。 HS3治療的樣本清楚地顯示與對照相比，有更多陽性(棕色)染色填充缺損。骨鈣素染色的高倍放大圖(圖66)顯示新骨在緊鄰Jax星處沉積(更清晰的島)， 其中存在由骨髓、毛細血管和成骨細胞劃線的邊界組成的更大量的再成型腔。免疫組織化學分析。用PBS清洗脫石蠟的切片，並與蛋白酶XXIV(BioGeneX，San Ramon, USA)溫育10分鐘以用於抗原修復，隨後在室溫下與0. 3%的過氧化氫水溶液溫育20 分鐘。清洗後，將切片用5%的正常山羊血清在PBS中的溶液封閉30min。將組織切片與適當濃度的第一抗體骨鈣素(abl3420，l 150, Abeam, UK)或相同濃度的小鼠IgG(MG100， Caltage Lab,USA ；作為陰性對照)在封閉緩衝液中在4°C溫育過夜。用PBS清洗切片三次， 然後與大鼠吸收的生物素標記的抗小鼠IgG(Vector Lab Inc,USA) 一起溫育lh。將切片用 PBS清洗，並與抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶複合物(ABC)溶液(Immunopure ABC過氧化物酶染色試劑盒，Vector Lab. Inc)溫育lh。使用3，3_ 二氨基聯苯胺-四氫氯(DAB ； DAK0，USA)檢測過氧化物酶活力。清洗切片，固定並使用01ympusSZX12立體顯微鏡在明視野顯微鏡下檢查。扭力測試在指定的實驗時間段後，測試骨的機械強度。圖67示出了扭力測試裝置。扭力測試。在術後8周將兔處死，取出兔的尺骨，包裹在PBS滲透的紗布中以保持水分，並且在-20°C冷凍直至進行扭轉測試。融化後，將尺骨末端放入盛放在定製塑料塊中的聚甲基丙烯酸甲酯(Meliodent Rapid Repair, Heraeus Kulzer)中，並使其固化從而能夠穩定固定。隨後，將尺骨固定到MTS 858Mini Bionix II測試系統(MTS，Eden Prairie, MN)中。在測試之前，輕輕地除去聚合物塊和紗布。然後，對每個樣本測試扭轉破損並記錄所得的扭轉角位移曲線。所使用的轉速為每秒1度直至達到35度，並且以IOOHz採集數據。對每個樣本記錄剛度、最大轉矩和破損角度，其中將剛度測量為扭轉角位移曲線的直線胃^>的餘鬥· (M. Bostrom, J. M. Lane, Ε. Tomin, Μ. Browne, W. Berberian, Τ. Turek, J. Smith, J. ffozney, T. Schildhauer. Use of bone morphogenetic protein_2in the rabbit ulnarnon-union model. Clin Orthop Relat Res 1996 ；327 :272-282)。統計分析。以三次重複獲得定量數據，並報告為平均值士標準偏差。使用學生氏 t檢驗(GraphPad software)進行統計分析，認為ρ-值小於0. 05為顯著。對照和HS治療的尺骨中評價的剛度和最大轉矩的定量。HS治療骨的剛度得到顯著改善。由於星佔據了大部分的缺損，其成為新骨滲入的物理屏障，因此它導致了有限的 (與顯著相反)改善-參見圖68。實施例9-評價HS3加載的膠原海綿誘導的極限缺損中的骨再生在第二項研究中使用了與實施例8相同的整個方法，除了用FDA批准的膠原海綿代替Jax TCP星。生物材料。膠原海綿購自htegra Life Sciences (HELISTAT, Integra Life Sciences Corp,USA)並測量為7X21 X5mm。從牛深屈肌腱加工得到了這些海綿，它們是生物可吸收的並且是無熱原性的。使用掃描電子顯微術(SEM)評價了海綿的形態。簡要地，用金濺塗膠原海綿，然後使用SEM(Jeol JSM 5310LV)以IOkV的加速電壓進行檢查。生物分子。本研究中測試的硫酸類肝素OB)為骨形態發生蛋白(BMP)特異性HS， 也稱為HS3。體內研究本研究使用每片海綿加載30 μ g的HS3 (HS30)和每片海綿加載10 μ g的 BMP-2 (BMP2-10)。產生雙側尺骨缺損並用HS30、BMP2_10或HS30+BMP2-10或PBS對照進行處理。將HS3(30y g)單獨或結合BMP2 (10 μ g)應用到膠原海綿中，並且與無治療相比評價了 0、4和8周內的新骨形成。這些是相對於陰性膠原海綿對照和陽性BMP2對照評價的。實驗設計。對二十隻雄性紐西蘭白兔(2-2. 5公斤重)造成雙側尺骨缺損。將每種缺損隨機分配到三個實驗組之一。每個缺損接受浸有下列治療劑(總計300μ 1，在PBS中) 之一的 1 塊膠原海綿30μ g HSUOy g BMP-2 (有時稱為 BMP10)、30 μ g HS+10 μ g BMP-2 或等體積的PBS。移植4和8周後，將兔處死並收穫尺骨。使用2D X射線和微計算機斷層 (微CT)，非破壞性地評價了每種治療的四塊尺骨在兩個時間點的礦物形成。隨後，處理這些尺骨進行組織學和免疫組織化學研究。第8周，每種治療加入另外三個樣品用於扭轉測試評價。將一些缺損保持為空以用作內部對照從而確保該模型確實是不連接的。手術程序。在兔中進行雙側尺骨截骨術的研究方案通過了動物護理和使用學會的批准，並且按照所有適當的指導進行。所有手術程序均在全身麻醉和無菌條件下進行。麻醉包括氯胺酮(75mg/kg)和賽拉嗪(10mg/kg)注射劑的組合以及通過吸氣室和面具用於維持的異氟烷。切開6釐米的皮膚切口並且將疊加肌肉層分開直至暴露出尺骨的長度。使用 Acculan在中央骨幹產生1. 5釐米的縱向缺損。射線照相分析。使用成像射線照相系統(MUX-100，shimadzu,日本)來捕獲手術後即刻以及4周和8周時的尺骨缺損2D圖像。然後，拍攝X射線的數字顯微照片(圖69-圖
70)。在全身麻醉的情況下拍攝X射線照片。膠原海綿不是射線不透明的；因此它易於在2D X射線上鑑別缺損位點中的新骨。4周後監測的X射線顯示與陰性對照相比，在所有治療情況下有大量新骨填充缺損位點(圖70)。8周後監測的X射線顯示所有治療均實現骨連接，但是在陰性對照中未實現(圖
71)。有趣地，單獨遞送HS3所產生的骨連接與BMP2的情況一樣好，由於已達到最大，因此 HS3結合BMP2不會加速該作用。微CT分析。在第4和8周，用μ CT掃描儀(Skyscan 1076 ；Skyscan,比利時)掃描收穫的尺骨。以35 μ m的解析度和68mm的掃描寬度進行掃描。掃描儀設置為電壓104kV， 電流98μΑ。使用錐束CT-重建A Sasov軟體(Skyscan)，將所獲得的各向同性片層數據轉換為2D圖像。對於該重建來說，骨的上下閾值假定為315和543豪恩斯菲爾德單位。然後， 使用用於定量的相關CTAn軟體(Skyscan)和Mimics 11. 1軟體(Materialise,比利時) 分析並重建數據以產生3D圖像。對於所有的樣品，將所關心的圓柱形區域(R0I，相對於缺損位點同心定位)和總片層數(對應於缺損的長度)保持恆定。通過對總含骨量、皮層骨 (橈骨)以及小梁骨(或新形成的骨)分配預定閾值來測量ROI內新形成骨的總體積。將數據報告為骨體積/總體積(％ )_參見圖72。4和8周後，處理組中總體積的百分比骨體積(BV/TV)的微CT定量確認單獨使用 HS3的效果與FDA批准的BMP2的效果顯著可比較(圖72)。扭力測試。在術後8周將兔處死，取出兔的尺骨，包裹在PBS滲透的紗布中以保持水分，並且在-20°C冷凍直至進行扭力測試。融化後，將尺骨末端放入盛放在定製塑料塊中的聚甲基丙烯酸甲酯(Meliodent Rapid Repair, Heraeus Kulzer)中，並使其固化從而能夠穩定固定。隨後，將尺骨固定到MTS 858Mini Bionix II測試系統(MTS，Eden Prairie, MN)中。在測試之前，輕輕地除去聚合物塊和紗布。然後，對每個樣本測試扭轉破損並記錄所得的扭轉角位移曲線。所使用的轉速為每秒1度直至達到35度，並且以IOOHz採集數據。對每個樣本記錄剛度、最大轉矩和破損角度，其中將剛度測量為扭轉角位移曲線的直線胃^>的餘鬥· (M. Bostrom, J. M. Lane, Ε. Tomin, Μ. Browne, W. Berberian, Τ. Turek, J. Smith, J. ffozney, T. Schildhauer. Use of bone morphogenetic protein_2in the rabbit ulnarnon-union model. Clin Orthop Relat Res 1996 ；327 :272-282)。統計分析。以三次重複獲得定量數據，並報告為平均值士標準偏差。使用學生氏 t檢驗(GraphPad software)進行統計分析，認為ρ-值小於0. 05為顯著。對照、BMP2和HS治療的尺骨中評價的剛度和最大轉矩的定量。對於治療組，剛度和最大轉矩均得到顯著改善。顯著地，單獨使用HS3的治療在第8周時導致產生了類似於 BMP2治療的機械性質和完整的骨(圖73)。
權利要求
1.硫酸類肝素HS/BMP2。
2.分離的或基本純化形式的HS/BMP2。
3.根據權利要求1或2所述的HS/BMP2，其中，所述HS/BMP2能夠結合SEQID NO 1或 SEQ ID NO:6。
4.根據權利要求3所述的HS/BMP2，其結合至SEQID NO 1的KD小於100 μ Μ。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的HS/BMP2，其中，所述HS/BMP2為N-硫酸化的。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的HS/BMP2，其中，所述HS/BMP2為6_0_硫酸化的。
7.一種獲得權利要求1至6中任一項所述的HS/BMP2或者分離的或基本純化形式的 HS/BMP2的方法，包括(i)提供固體載體，其具有附著於所述載體上的多肽分子，其中所述多肽包含具有胺基酸序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 6的肝素結合結構域；( )使所述多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸從而使得能夠形成多肽-糖胺聚糖複合物；(iii)將多肽-糖胺聚糖複合物與所述混合物的其餘部分分開；(iv)使糖胺聚糖從所述多肽-糖胺聚糖複合物解離；(ν)收集解離的所述糖胺聚糖。
8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述包含糖胺聚糖的混合物獲自成骨細胞細胞外基質材料。
9.一種組合物，其包含根據權利要求1至8中任一項所述的HS/BMP2和ΒΜΡ2蛋白。
10.一種藥物組合物或藥劑，包含根據權利要求1至8中任一項所述的HS/BMP2。
11.根據權利要求10所述的藥物組合物或藥劑，其用於治療方法中，所述方法包括斷骨的修復和/或再生。
12.根據權利要求10或11所述的藥物組合物或藥劑，還包含ΒΜΡ2蛋白。
13.根據權利要求10至12中任一項所述的藥物組合物或藥劑，其中，所述藥物組合物或藥劑還包含間充質幹細胞。
14.根據權利要求1至8中任一項所述的HS/BMP2，用於醫療方法中。
15.在根據權利要求14或15所述的醫療方法中使用的HS/BMP2，其中，所述醫療方法包括體內傷口癒合的方法。
16.在根據權利要求14或15所述的醫療方法中使用的HS/BMP2，其中，所述醫療方法包括結締組織的修復和/或再生。
17.在根據權利要求14或15所述的醫療方法中使用的HS/BMP2，其中，所述醫療方法包括骨的修復和/或再生。
18.在根據權利要求14所述的醫療方法中使用的HS/BMP2，其中，所述治療方法包括哺乳動物或人的骨的修復和/或再生。
19.根據權利要求1至8中任一項所述的HS/BMP2在製備用於哺乳動物或人的斷骨修復和/或再生的藥劑中的應用。
20.一種生物相容性植入物或假體，包含生物材料和HS/BMP2。
21.根據權利要求20所述的植入物或假體，其中，所述植入物或假體塗覆有HS/BMP2。
22.根據權利要求20所述的植入物或假體，其中，所述植入物或假體浸漬有HS/BMP2。
23.根據權利要求20至22中任一項所述的植入物或假體，其中，所述植入物或假體還塗覆或浸漬有BMP2蛋白和/或間充質幹細胞。
24.一種形成生物相容性植入物或假體的方法，所述方法包括用HS/BMP2塗覆或浸漬生物材料的步驟。
25.根據權利要求M所述的方法，其中，所述方法還包括用BMP2蛋白和間充質幹細胞中的一種或兩種塗覆或浸漬所述生物材料。
26.一種治療患者骨折的方法，所述方法包括向所述患者給予治療有效量的HS/BMP2。
27.根據權利要求沈所述的方法，其中，所述方法包括向骨折周圍的組織給予HS/ BMP2。
28.根據權利要求沈或27所述的方法，其中，HS/BMP2的給予包括將HS/BMP2注射至骨折周圍的組織。
29.根據權利要求沈至觀中任一項所述的方法，其中，將所述HS/BMP2配製成包含HS/ BMP2和藥用載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物或藥劑。
30.根據權利要求沈至四中任一項所述的方法，其中，所述方法還包括向所述患者給予BMP2蛋白。
31.根據權利要求30所述的方法，其中，將所述HS/BMP2和BMP2蛋白配製為包含HS/ BMP2和BMP2蛋白以及藥用載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物。
32.根據權利要求沈至31中任一項所述的方法，其中，所述方法還包括向所述患者給予間充質幹細胞。
33.根據權利要求32所述的方法，其中，將HS/BMP2、BMP2蛋白和間充質幹細胞中的至少兩種配製為包含HS/BMP2、BMP2蛋白和間充質幹細胞中的至少兩種以及藥用載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物。
34.一種治療患者骨折的方法，所述方法包括將生物相容性植入物或假體手術植入到在所述骨折部位處或骨折部位周圍的所述患者組織中，所述植入物或假體包含生物材料和 HS/BMP2。
35.根據權利要求34所述的方法，其中，所述植入物或假體塗覆有HS/BMP2。
36.根據權利要求34所述的方法，其中，所述植入物或假體浸漬有HS/BMP2。
37.根據權利要求34至36中任一項所述的方法，其中，所述植入物或假體還浸漬有 BMP2蛋白和間充質幹細胞中的一種或兩種。
38.一種培養基，包含HS/BMP2。
39.HS/BMP2在體外細胞培養中的應用。
40.HS/BMP2在結締組織體外生長中的應用。
41.一種用於結締組織體外生長的方法，包括培養與外源添加的HS/BMP2接觸的間充質幹細胞。
42.一種促進骨生成的方法，所述方法包括將HS/BMP2施用至骨前體細胞或骨幹細胞。
43.根據權利要求42所述的方法，其中，所述骨前體細胞或骨幹細胞與HS/BMP2體外接觸。
44.根據權利要求42所述的方法，其中，所述骨前體細胞或骨幹細胞與HS/BMP2在體內接觸。
45.根據權利要求42至44中任一項所述的方法，其中，所述骨前體細胞或骨幹細胞與 BMP2蛋白接觸，同時與HS/BMP2接觸。
46.根據權利要求42至45中任一項所述的方法，其中，所述骨前體細胞或骨幹細胞為間充質幹細胞。
47.一種在需要這種治療的人或動物患者中骨組織修復、置換或再生的方法，所述方法包括(i)將與HS/BMP2接觸的間充質幹細胞體外培養足以使所述細胞形成骨組織的一段時間；( )收集所述骨組織；(iii)將所述骨組織在創傷或疾病部位植入到所述患者的身體中以修復、置換或再生所述患者的骨組織。
48.根據權利要求47所述的方法，還包括使所培養的間充質幹細胞與外源BMP2蛋白接觸。
49.一種骨組織，其是在存在HS/BMP2的情況下通過間充質幹細胞的體外培養獲得的。
50.根據權利要求49所述的骨組織，其中，所述間充質幹細胞是在存在BMP2蛋白的情況下培養的。
51.一種培養間充質幹細胞的方法，包括培養與HS/BMP2接觸的間充質幹細胞。
52.一種試劑盒，包含預定量的HS/BMP2和預定量的BMP2。
53.一種產品，用於在醫療方法中同時、單獨或順序使用，所述產品含有治療有效量的以下物質(i)HS/BMP2 ；和以下中的之一或兩者 ( )ΒΜΡ2 蛋白； (iii)間充質幹細胞。
全文摘要
本發明涉及通過使用BMP2的肝素結合結構域的親合色譜所獲得的硫酸類肝素GAG。所述GAG獲自成骨細胞細胞外基質和可商購的硫酸類肝素(Celsus HS)。
文檔編號C07K14/51GK102209731SQ200980144774
公開日2011年10月5日 申請日期2009年9月11日 優先權日2008年9月11日
發明者克裡斯蒂安·多姆布勞斯基, 維克託·努爾科姆比, 西蒙·麥肯齊·庫爾 申請人:新加坡科技研究局