一種人肺腺癌細胞系及其應用的製作方法

2023-05-16 03:01:21 1

一種人肺腺癌細胞系及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種人肺腺癌細胞系及其應用。該人肺腺癌細胞，於2014年5月23日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址：中國武漢武漢大學，郵編：430072，培養物名稱為人肺腺癌細胞ZRLC-1，保藏編號為CCTCC?NO：C2014103。該人肺腺癌細胞ZRLC-1作為實驗材料在肺腺癌基礎和臨床研究中的應用，可用於建立肺癌發生、發展或轉移的動物模型。本發明的人肺腺癌細胞系性狀穩定，可穩定多次傳代，並且高表達EpCAM，E-cadherin等上皮標誌，細胞流式顯示EpCAM陽性細胞達99.70%，為肺癌研究提供新的更接近於臨床腫瘤生物學特性的實驗材料。
【專利說明】一種人肺腺癌細胞系及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於微生物動物細胞系領域，特別涉及一種人肺腺癌細胞系及其應用。

【背景技術】
[0002] 原發性肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年新發肺癌大約130萬人， 佔全部新發癌症病例總數的12.3 %，居首位，而尤以我國是該疾病的高發國家。近年的 流行病學調查數據顯示，肺癌是我國人群中發病率和死亡率上升最快的癌症之一。衛生部 公布的的全國第三次死因調查結果中，肺癌居我國癌症死因首位，佔全部癌症死因的22. 7 %，與70年代相比，我國的肺癌死亡率上升4. 65倍，特別值得關注。
[0003] 目前手術、化療、放療這些傳統方案仍然是治療肺癌的有效途徑，隨著相關輔助學 科的發展，靶向治療、生物治療為肺癌患者帶來新的希望，但是多數肺癌患者確診時已是晚 期，無手術機會，能手術的患者術後轉移率高，術後生存率不高，總體預後欠佳。因而，尋求 更加有效的肺癌治療手段顯得尤為重要。
[0004] 肺癌細胞株作為肺癌發生機理及抗肺癌藥物開發的接近臨床腫瘤生物學特性的 實驗材料已被廣泛應用，但全世界目前報導的肺癌細胞株仍為數不多。同時，已有的肺癌細 胞株在反覆的傳代過程中，細胞特性與原始腫瘤細胞相比發生了很大變化。因此，肺癌原代 細胞培養並建立細胞系在現階段具有很大的應用價值，而針對我國肺癌的高發現象，建立 我國自己的肺腺癌細胞模型具有更顯著的科學意義和社會意義。
[0005] 運用臨床腫瘤組織直接體外培養建立細胞系往往混雜其它非腫瘤細胞，成功率較 低。本發明通過運用臨床腫瘤標本先初步體外擴增到一定的細胞數，再經動物皮下接種富 集純化腫瘤細胞，進而通過原代培養建立人源性腫瘤細胞系。該方法成功率較高，且細胞系 接近於腫瘤的臨床生物學特性，對藥物的耐藥性及敏感性有很好的預測性，是研究肺癌發 生分子機制和抗腫瘤藥物篩選的理想實驗材料。
[0006]


【發明內容】

[0007] 本發明的目的是針對現有的人肺腺癌細胞系存在的生物多樣性低，與臨床上肺腺 癌的生物學性狀相差較大等不足，提供一種新的人肺腺癌細胞系。
[0008] 本發明的人肺腺癌細胞，於2014年5月23日保藏在中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)(地址：中國.武漢.武漢大學即湖北省武漢市武昌區武漢大學保藏中心，郵編： 430072)，培養物名稱為人肺腺癌細胞ZRLC-1，保藏編號為CCTCC NO :C2014103。
[0009] 本發明採用取自一位55歲女性肺腺癌手術切除標本，經體外初步培養擴增成一 定數量級的細胞懸液後，接種於裸鼠皮下，成瘤後取出腫瘤組織，經體外培養獲得穩定傳代 的一種新的肺腺癌細胞，命名為：ZRLC-1。
[0010] 本發明人肺腺癌細胞ZRLC-1具有以下生物學特性： 1.細胞系貼壁生長，無接觸抑制； 2. 細胞系生長快速和代謝旺盛，具有良好的體外培養擴增性； 3. 細胞系染色體核型分析提示該細胞為近二倍體細胞系，有較多的染色體缺失、異位 及衍生現象； 4. 細胞系高表達EpCAM (上皮細胞粘附分子)，E-cadherin (E-鈣粘蛋白）等上皮表面 標誌，細胞流式顯示EpCAM陽性細胞達99. 7 % ; 5. 細胞系在無血清培養基條件下，具有一定的克隆球形成能力； 6. 細胞傳至第五代按2*10~6、2*10~5、2*10~4、2*10~3數量級接種裸鼠，均可成瘤，致 瘤性強，組織切片提示移植瘤組織學特性與原發瘤相似。
[0011] 本發明的進一步目的是提供該人肺腺癌細胞ZRLC-1作為實驗材料在肺腺癌基礎 和臨床研究中的應用，可用於建立肺癌發生、發展或轉移的動物模型，可用於製備人肺腺癌 相關藥物療效的分子檢測方法中的應用。
[0012] 本發明的人肺腺癌細胞系性狀穩定，可穩定多次傳代，並且高表達EpCAM， E-cadherin等上皮標誌，細胞流式顯示EpCAM陽性細胞達99. 70 %，為肺癌研究提供新的更 接近於臨床腫瘤生物學特性的實驗材料。具有強致瘤性，可以成功製備肺癌發生、發展或轉 移的動物模型，所製得的動物模型可以用於研究肺癌發生發展分子機制、篩選抗肺癌小分 子化合物、探究肺癌的耐藥機理以及發現肺癌轉移新標誌等，是人肺癌基礎研究和臨床前 期應用的理想細胞系。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1.本發明人肺腺癌細胞ZRLC-1的光鏡下（X 100)形態學觀察； 圖2.本發明人肺腺癌細胞ZRLC-1的生長時間曲線； 圖3.本發明人肺腺癌細胞ZRLC-1的染色體分析結果； 圖4.本發明人肺腺癌細胞ZRLC-1的表面標誌蛋白質印跡檢測結果； 圖5.本發明人肺腺癌細胞ZRLC-1的表面標誌EpCAM的流式檢測結果； 圖6.本發明人肺腺癌細胞ZRLC-1無血清培養基條件下細胞克隆球形成結果，其中A 為第3天的克隆球圖，B為第7天的克隆球圖； 圖7.本發明人肺腺癌細胞ZRLC-1的成瘤性； 圖8.腫瘤的病理組織切片；其中A.臨床上取得的腫瘤標本；B.第1代裸鼠移植瘤； C.第2代裸鼠移植瘤。

【具體實施方式】
[0014] 下面結合附圖及具體實施例對本發明做進一步的分析(下述實施例中所述實驗方 法，如無特殊說明，均為常規方法)。
[0015] 本發明的人肺腺癌細胞，於2014年5月23日保藏在中國典型培養物保藏中 心（CCTCC)(地址：中國.武漢.武漢大學，郵編：430072)，培養物名稱為人肺腺癌細胞 ZRLC-1，保藏編號為 CCTCC N0:C2014103。
[0016] 實施例1.細胞的製備 裸鼠：5隻裸小鼠，雄性，體重16. 0±1. 0g，鼠齡4周，飼養於SPF動物房。裸鼠由浙江 省實驗動物中心統一飼養。
[0017] 從浙江大學醫學院附屬第二醫院獲得新鮮的臨床肺腺癌切除標本（女，55歲，原 發性肺腺癌，病理診斷結果為：腺癌），立即浸入預冷的無菌Hanks緩衝液（含500U/ml青 黴素 G、500U/ml慶大黴素）中。在生物安全櫃中，用無菌Hanks緩衝液衝洗標本4?5次， 用眼科剪剪碎成1_3小塊，置於lmg/mll型膠原酶/透明質酸酶中37°C消化1小時，中間每 隔15分鐘劇烈震蕩1次，300目篩網過濾，接種到DMEM培養基(含10ng/ml重組人表皮生長 因子，10 μ g/ml重組人胰島素，10 %胎牛血清蛋白，100U/ml青黴素 G，100U/ml慶大黴素） 中，培養48h後，將細胞轉至普通RPMI1640培養基（含10 %胎牛血清蛋白，100U/ml青黴 素 G、100U/ml慶大黴素）中，擴增細胞至約10~7數量級進行裸鼠皮下接種。動物接種後， 健康狀態良好，行為正常。接種一周後，通過觸摸發現在接種部位皮下有腫瘤小結節，小結 節於接種二周後開始生長明顯，至接種後30天時，腫瘤體積超過200mm 3。
[0018] 原代培養：體外接種擴增的人肺腺癌單細胞懸液30?40天後，將荷瘤裸鼠用過量 二氧化碳氣體麻醉處死，無菌解剖，取出腫瘤組織，進行原代培養，方法如下：用Hanks緩 衝液（含500U/ml青黴素 G、500U/ml慶大黴素）漂洗腫瘤組織塊4?5次，去除結締組織 和壞死組織；用無菌手術刀片將腫瘤組織剪切成約1_3小塊；置於lmg/mll型膠原酶/透 明質酸酶中37°C消化1小時，中間每隔15分鐘劇烈震蕩1次，300目篩網過濾，接種到DMEM 培養基中（含l〇ng/ml重組人表皮生長因子，10 μ g/ml重組人胰島素，10 %胎牛血清蛋白， 100U/ml青黴素 G、100U/ml慶大黴素）中。
[0019] 傳代培養：當細胞布滿培養瓶底部後，進行細胞傳代，具體步驟如下：吸棄舊培養 液，加入5ml PBS緩衝液潤洗兩遍，吸棄廢液，加入lml新鮮的0. 25 %胰蛋白酶溶液，於 37°C孵箱中孵育，觀察到細胞質回縮、細胞間隙增大，待細胞脫落後，加入3ml新鮮的含10 %胎牛血清的RPMI1640培養液，仔細吹打，使之脫離瓶壁形成細胞懸液，收集全部細胞，離 心，計數，分別接種於新的培養瓶。當細胞傳代到第3代以後，將培養液逐步更換為含10 % 胎牛血清的RPMI 1640培養液，細胞生長良好，形態均一。傳代至50代以上。
[0020] 在本發明中，傳代細胞形態較為均一，無接觸抑制，初期生長速度較為緩慢；隨著 傳代次數的增加，生長速度逐步加快；將該細胞系命名為ZRLC-1，提交保藏，保藏編號為 CCTCC NO ：C2014103〇
[0021] 實施例2 ZRLC-1細胞的生物學特性及應用 本發明如實施例1採用含有胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培養液培養ZRLC-1細胞， 使其能體外長期生長和穩定傳代。當細胞傳至10代以上，細胞性狀逐漸穩定，進行相關的 生物學、遺傳學和組織來源鑑定。經實驗觀察與驗證，體外生長的細胞具有典型的上皮樣形 態，失去接觸生長抑制，呈惡性生長。遺傳學研究證實該細胞為異倍體，染色體數目和結構 畸變嚴重，符合惡性腫瘤的遺傳學特徵。該ZRLC-1細胞以2*10~3數量級即可在裸鼠皮下成 瘤，具有高度致瘤性。該ZRLC-1細胞可以為研究體內外臨床抗肺癌藥物敏感性及耐藥性， 以及肺癌的發生、發展和轉移提供新的試驗材料。具體如下： 1.形態學觀察 將培養ZRLC-1細胞的培養瓶置於倒置顯微鏡下，在明視野下進行拍照。如圖1所示， ZRLC-1細胞失去了接觸抑制，呈惡性生長，具有重疊生長的特點，貼壁生長部分呈扁平狀， 符合上皮樣細胞的特點。
[0022] 2.細胞生長曲線檢測 用細胞計數法繪製細胞生長曲線：a.取對數生長期的ZRLC-1細胞，將細胞密度調整 為2X10~3/ml，將其接種於六孔板中，每孔加入2ml細胞懸液，共接種21孔；b.分別於接種 後第1、2、3、4、5、6、7天的同一時間隨機抽取3孔胰酶消化後進行細胞計數，連續計數7天； c.根據每日細胞數繪製細胞生長曲線，連續細胞計數繪製細胞的生長曲線。如圖2所示，本 株細胞貼壁後第1.2天生長緩慢，第四天開始呈指數生長，在隔天更換培養基營養充足的 條件下細胞可出現疊加生長，無接觸抑制現象，具有良好的體外培養擴增性。
[0023] 3.染色體的鑑定 將培養的ZRLC-1細胞置於4 °C下12小時後，加入秋水仙素，使秋水仙素終濃度為 0.4118/1111，再於371：孵箱中繼續培養10小時。採集分裂中期的細胞，用0&111〇7固定液 (甲醇：冰醋酸=3:1)進行固定，然後將細胞懸液滴於預冷的載物片上，用Giemas染色液染 色，於顯微鏡下計數染色體數。如圖3所示，細胞連續傳代後，染色體仍保持人源性腫瘤細 胞染色體的特徵，表現為近二倍體核型，細胞染色體數目大多在42?53之間，染色體數目 和結構存在一定變異，符合惡性腫瘤的遺傳學特徵。
[0024] 4.蛋白質印跡法檢測表面標誌物 取1 X ΚΓ6貼壁生長的ZRLC-1細胞及對照另一株皮膚成纖維細胞，PBS緩衝液各清洗 細胞2次，加入RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，待測樣品按50ug/孔上樣，進 行10 % SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺）電泳，然後將蛋白轉移到PVDF (聚偏二 氟乙烯）膜上，予5 %的脫脂奶粉常溫封閉1小時，分別加入小鼠抗人EpCAM (用含5 %牛 血清白蛋白的TBST緩衝液稀釋成 1:1000)、小鼠抗人E-Cadherin(用含5%牛血清白蛋白 的TBST緩衝液稀釋成1 :1000)、小鼠抗人Vimentin單克隆抗體(用含5 %牛血清白蛋白的 TBST緩衝液稀釋成1 :1000)4°C孵育過夜，HRP (辣根過氧化物酶）標記的山羊抗鼠 IgG(用 含5 %脫脂奶粉的TBST緩衝液稀釋成1:5000) 37°C孵育1小時，洗膜後ECL化學發光顯色液 顯像成像。如圖4所示，ZRLC-1細胞高表達上皮表面標誌EpCAM、E-cadherin，幾乎不表達 波形蛋白Vimentin,而對照成纖維細胞高表達Vimentin,幾乎不表達EpCAM、E-cadherin。
[0025] 5.流式檢測上皮EpCAM標誌 ZRLC-1細胞經胰酶消化後製成單細胞懸液，PBS緩衝液衝洗離心後，調整細胞數為 10~6/管,其中一管加入PE標記的小鼠抗人EpCAM單克隆抗體作為實驗組，另一管加入PE 標記的小鼠 IgG作為同型對照，避光4°C孵育30min，PBS緩衝液衝洗後上機檢測。流式細胞 儀為FACScan，200mW氬雷射（488nm)檢測PE綠色螢光信號，採集10000個細胞，所測數據用 Flow jo 7. 0軟體處理。EpCAM陽性數（％)=(實驗管EpCAM陽性細胞數-陰性對照EpCAM 陽性細胞數)/10000X 100 %。如圖5所示，ZRLC-1細胞高表達上皮表面標誌EpCAM，EpCAM 陽性細胞達99. 7 %，與蛋白質印跡法檢測結果相一致。
[0026] 6.無血清培養克隆球形成實驗 接種分散均勻的第6代ZRLC-1細胞於低粘附六孔板中，每孔1000個細胞，設置三個副 孔，靜置培養1-2周，加入無血清的DMEM培養基(含10ng/ml重組人表皮生長因子，10 μ g/ ml重組人胰島素，100U/ml青黴素 G，100U/ml慶大黴素)。如圖6所示，在無血清條件培養 基條件下，細胞呈球形立體生長，細胞球呈圓形，球內細胞結合緊密，球體飽滿，折光性強， 隨著時間延長，細胞球可逐漸增大，形狀趨於規則。
[0027] 7.第1代裸鼠移植瘤 將新鮮的臨床肺腺癌切除標本進行體外初步擴增培養，細胞擴增至約1(Γ7數量級進 行裸鼠皮下接種，形成第1代裸鼠移植瘤。將此第1代裸鼠移植瘤細胞進行原代培養形成 ZRLC-1 細胞。
[0028] 8.細胞的成瘤性 體外大規模培養和收集ZRLC-1細胞，以2*10~6、2*10~5、2*10~4、2*10~3數量級接種裸 鼠皮下，每數量級接種2隻裸鼠，裸鼠皮下接種該腫瘤細胞後一周，即可見移植瘤長出，8隻 裸鼠全部成瘤，移植瘤呈結節狀，與皮膚有粘連，結果見圖7,可見該細胞達2*10~3數量級 即可在裸鼠體內形成腫瘤，具有高度致瘤性。
[0029] 9.腫瘤的病理學鑑定 將實施例1的臨床肺癌手術標本、手術標本體外初步擴增後接種於裸鼠皮下形成的第 1代移植瘤、上述8步驟中第1代移植瘤細胞體外擴增後接種於裸鼠皮下形成第2代移植 瘤，進行福馬林固定、石蠟包埋切片及Η&Ε染色，結果見圖8,臨床手術標本鏡下觀察，腫 瘤細胞核大、深染，核漿比例增大，周圍被纖維組織包裹，形成大量腺管樣結構；裸鼠體內成 瘤標本鏡下觀察，細胞生長旺盛，細胞核增大、深染，異型性明顯。它們的病理診斷結果見表 1。可見臨床標本、第1代裸鼠移植瘤和第2代裸鼠移植瘤的組織學形態結構類似，形成對 應關係。
[0030] 表1.各腫瘤標本的病理診斷結果

【權利要求】
1. 一種人肺腺癌細胞系，其特徵在於其於2014年5月23日保藏在中國典型培養物 保藏中心CCTCC，地址：中國.武漢.武漢大學，郵編：430072,培養物名稱為人肺腺癌細胞 ZRLC-1，保藏編號為 CCTCC N0:C2014103。
2. 如權利要求1所述的一種人肺腺癌細胞系，其特徵在於人肺腺癌細胞ZRLC-1作為建 立肺癌發生、發展或轉移的動物模型中的應用。
3. 如權利要求1或2所述的一種人肺腺癌細胞系，其特徵在於具有以下生物學特性： 細胞系貼壁生長，無接觸抑制；細胞系生長快速和代謝旺盛，具有良好的體外培養擴增性； 細胞系染色體核型分析提示該細胞為近二倍體細胞系，有較多的染色體缺失、異位及衍生 現象；細胞系高表達EpCAM，E-cadherin等上皮表面標誌，細胞流式顯示EpCAM陽性細胞達 99.7 % ;細胞系在無血清培養基條件下，具有克隆球形成能力；細胞傳至第五代按2*10~6、 2*10~5、2*10~4、2*10~3數量級接種裸鼠，均可成瘤，致瘤性強，組織切片提示移植瘤組織學 特性與原發瘤相似。
【文檔編號】A01K67/027GK104195109SQ201410332239
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月11日 優先權日:2014年7月11日
【發明者】王凱, 徐霞, 柴守傑, 朱永良, 王曉健 申請人:浙江大學