一種融合蛋白的組成及其分離方法

2023-05-16 03:15:51

專利名稱：：一種融合蛋白的組成及其分離方法
技術領域：
：本發明涉及一種融合蛋白的組成及其分離方法。
背景技術：
：使用融合蛋白的表達系統生產重組蛋白是一種廣為接受的4支術。在該系統中，融合伴侶有助於所需蛋白的表達和純化。融合伴侶常用於提供一個可以幫助融合蛋白進行後續純化的"標籤"。然而，為了使所需蛋白恢復其自然形態或藥學上可接受的形態，該融合伴侶必須在融合蛋白分離後立即去除。去除融合伴侶最廣為使用的方法是使用特異性裂解酶，如凝血酶，Xa因子或腸激酶(Wassenberg等，Prate/"5"c,'<5:1718(1997);Schlumpberger等，屍rafe/"9:440(2000);Zaitseva等，5:1100(1996))。它包括在所需蛋白和融合伴侶之間插入一段能被裂解酶特異性裂解的特定胺基酸序列。所需的蛋白可通過採用裂解酶(如凝血酶)裂解融合蛋白進行恢復。凝血酶是一種可以斷裂使用絲氨酸的多肽鍵的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。許多研究者研究了凝血酶的特異性。已知的凝血酶裂解位點如下(Chang，￡wkJ.所0c/2e附.151:211(1985);GSTgenefusionsystemhandbook,AmershamBiosciences,EditionAA,p.88-89)。l)P4-P3-Pro-Arg/Lys丄Pl，-P2，，其中P3和P4是疏水胺基酸，Pl，和P2，是非酸性胺基酸。Arg/LysiPl，鍵被斷裂。範例:tableseeoriginaldocumentpage14(SEQIDNOS:1-3)2)P2-Arg/Lys丄Pl',其中P2或Pl，是Gly。Arg/Lys丄Pl，4建一皮斷裂。tableseeoriginaldocumentpage14最常用的凝血酶裂解序列是由牛因子XIII(Takagi等,傷oc/7em,Wo;13:750(1974))的序歹'H〉'亍生的Leu-Val-Pro-Arg-Gly(SEQIDNO:4)或者Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)。斷裂發生在精氨酸殘基處，從而使目標蛋白在胺基酸末端以Gly或Gly-Ser擴展。凝血酶裂解序列還被用於一些商用表達質粒，包括pGEX系列(AmershamBiosciences)禾口pET系歹寸(Novagen)。最近，Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)序列一皮進一步i^飾，在凝血酶裂解位點Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)前面或後面緊接插入了包含序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQIDNO:5)的富含4青氨酸的4妄頭(Guan等，5/oc/2ew.192:262(1991》Hakesetal，v4船/.202:293(1992》。雖然凝血酶對已知接頭序列區域的裂解具有相當的特異性，但這並非絕對。儘管凝血酶是一種相當特異性的酶，但它可以使用一系列不同的胺基酸序列作為裂解位點。如果目標蛋白包含多個凝血酶裂解位點，則在這些位點均能發生裂解，從而得到內部裂解的蛋白產品，而非所需的全長蛋白。例如，當一個包含內部凝血酶裂解序列的鹽生鹽桿菌(Halobacteriumhalobium)Lll蛋白4乍為一個GST融合蛋白表達，且該融合蛋白在GST標籤和Lll之間具有Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)凝血酶裂解位點時，以凝血酶進行處理將導致目標蛋白Lll內部的裂解，而非在Lll和GST標籤之間的裂解(Porseetal，J.7kfo/.S,》/,276:391(1998))。酉良酒酵母的Cdcl4p蛋白同才羊具有一個內部凝血酶裂解序列。當Cdcl4p蛋白作為含有Ser-GIy-Gly-Gly-Gly-Gly-Leu-Val畫Pro-Arg隱Gly-Ser(SEQIDNO:6)凝血酶斷裂位點的GST融合蛋白進行表達時，融合蛋白同時在Cdcl4p內部位點和,疑血酶裂解4妻頭處斷裂(Tayloretal,J.Biol.Chem.272:24054(1997))。本發明提供了一種比已知序列更具特異性的可用凝血酶裂解的新型4妻頭序列。
發明內容本發明提供了一種包含新型凝血酶裂解位點的肽接頭，該接頭可用於包含目標蛋白的融合蛋白的重組生產以及,人融合蛋白中分離目標蛋白。在一個實施例中，該itU妾頭包含以下序列X1-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5其中XI是兩個或兩個以上4皮此相同或不同的胺基酸殘基；X2是疏水胺基酸；X3是精氨酸或賴氨酸；X4是丙氨酸或甘氨酸；以及X5是一種非酸性胺基酸。本發明提供了一種融合蛋白，其包括目標蛋白、融合伴侶以及插在兩者之間的本發明所述的肽接頭。本發明還提供一種從融合蛋白分離目標蛋白的方法，包括使融合蛋白與足夠量的凝血酶接觸從而引起肽"t妻頭的裂解。當裂解反應發生後，由融合蛋白產生得到目標蛋白。目標蛋白可採用本領域中公知的簡單技術進行恢復。本發明可用於純化在宿主細胞中以重組DNA^支術表達的原核或真核蛋白。這些重組蛋白產品包括通過蛋白工程技術或合成蛋白生產的細胞因子，趨化因子，激素，受體，酶，貯藏蛋白，血液蛋白，突變體蛋白。此外，本發明還涉及編碼肽接頭的多聚核苷酸，編碼融合蛋白的多聚核苷酸，包含相同多聚核苷酸的載體，以及包含該載體的宿主細胞。本發明進一步提供了一種編碼融合蛋白的多聚核苷酸的製備方法，一種融合蛋白的生產方法以及一種目標蛋白的生產方法。本發明還提供了包含本發明的多聚核苷酸和載體的試劑圖1是編碼包含本發明肽4妾頭的融合蛋白的pGEX4T-hILll(A)的圖示(SEQIDNO:8)。圖2A顯示GST-IL11(A)的凝血酶裂解。圖2B顯示GST-IL11(A)的凝血酶裂解。圖3顯示IL-11(A)的MALDI-TOF分析。圖4是編碼包含本發明肽接頭(SEQIDNO:8)的融合蛋白的pGEX-胸腺肽(34的圖示。圖5是GST-胸腺肽(34的凝血酶裂解。圖6顯示了胸腺肽(34的MALDI-TOF分析。圖7是編碼包含本發明肽接頭(SEQIDNO:8)的融合蛋白的pGEX-IL6的圖示。圖8顯示GST-IL6的凝血酶裂解。圖9是編碼包含本發明肽接頭(SEQIDNO:8)的融合蛋白的pGEX-PAR4的圖示。圖IO是編碼包含本發明肽接頭(SEQIDNO:7)的融合蛋白的pGEX-IL11(LV-)的圖示。圖11顯示GST-ILll(LV-)的凝血酶裂解。圖12是編碼包含本發明肽接頭(SEQIDNO:7)的融合蛋白的pMAL-c2-IL11的圖示。圖13顯示MBP-ILll的凝血酶裂解。圖14是編碼包含本發明肽接頭(SEQIDNO:7)的融合蛋白的pET19b-IL11的圖示。圖15顯示His-IL11的凝血酶裂解。發明詳述本發明提供了一種包含可被凝血酶及其類似物裂解的凝血酶裂解位點的肽4妻頭。在一個實施例中，該肽接頭包含以下序列XI-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5其中XI是兩個或兩個以上彼此相同或不同的胺基酸殘基；X2是疏水胺基酸；X3是精氨酸或賴氨酸；X4是丙氨酸或甘氨酸；以及X5是一種非酸性胺基酸。在一個實施例中，XI是4個或4個以上^^此相同或不同的胺基酸殘基。在另一實施例中，XI為不超過IO個胺基酸殘基，例如不超過8個胺基酸殘基，例如不超過6個胺基酸殘基。例如，在不同的實施例中XI可以是2-6，2-8，2-10,4-6，4-8,或4-10個胺基酸殘基。當採用凝血酶處理肽接頭時，X3和X4之間的4定發生斷裂。對於裂解位點，當XI是兩個胺基酸殘基時XI佔據位點5和6(P5-P6),或當XI是4個胺基酸殘基時XI佔才居位點5到9(P5-P8)。X2,Ser,Pro,X3,X4和X5分別佔據位點4，3,2，1，l，和2，，和T(P4,P3,P2，Pl，Pl，，P2，)。在一個實施例中，XI包含Pro和Arg。在一個實施例中，X3可以是Arg或Lys。當Arg或Lys在羧基前時;疑血酶斷裂多肽4建。在另一實施例中，X4可以是Ala或Gly。Ala和Gly的性質非常相似，都是小分子非極性胺基酸。在一個實施例中，X2可以是選自由Gly,Ala，Pro，Val,Leu,lie,Met,Phe,Tyr禾口Trp所組成的群的疏水胺基酸。在一個特殊的實施例中，X2為Gly。在一個更進一步的實施例中，X5可以是選自由Ser，Ala,Asn，Val，Leu,lie,Lys，Phe,Tyr和Trp所組成的群的非酸性胺基酸。在一個特殊的實施例中，X5是Ser。在一個實施例中，Xl可以是2個或更多的任何胺基酸。在另一個實施例中，Xl可以是4個或更多的任何胺基酸。XI的確切胺基酸序列對凝血酶裂解沒有明顯的影響。在一個實施例中，肽4妻頭包含序列Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:7)。在一個更進一步的實施例中，月太才妾頭包含序歹'JLeu-Val-Pro隱Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:8)。當一個包含該裂解位點的融合蛋白以凝血酶處理時，裂解位點中的Arg丄Ala《建斷裂。在一個實施例中，肽4妄頭包含一個與Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:7)不同的序列。在另一個實施例中，肽4妻頭包含一個與Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:8)不同的序列。肽4妾頭序歹'JPro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:7)和Leu國Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:8)不同於以往已知的凝血酶裂解位點，因為P3胺基酸Ser為非疏7jC性。根據以往的研究，最佳凝血酶裂解位點在P3位點含有疏水胺基酸(Chang,五MK乂S/0c/2em.151:211(1985》。已知P3位點的非疏水性胺基酸會延長凝血酶裂解的時間。Raftery等人報導了在鼠MPR14蛋白中發現的胺基酸序列Asn-Asn-Pro-Arg-Gly-His(SEQIDNO:9)可作為;疑血酶的底物，^f旦它是一種比Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)差的底物(Raftery等，戶/15:228(1999))。對;疑血酶的天然底物纖維蛋白原，Gly^立於纖維蛋白月太A(Gly-Gly-Val-Arg丄Gly-Pro)(SEQIDNO:10)的P3位點，而Ser位於纖維蛋白肽B(Phe-Ser-Ala-Arg丄Gly-His)(SEQIDNO:ll)的P3位點。纖維蛋白肽A可以比纖維蛋白肽B更迅速地一皮;疑血酶裂解(Binnie等，57:3186(1993))。本發明提供了一種融合蛋白，其包含目標蛋白，融合伴倡以及插在兩者之間的本發明的肽4妾頭。此處所用的術語"融合蛋白"和"嵌合蛋白"可進行互換，指包含目標蛋白，融合伴侶以及插在兩者之間帶有凝血酶裂解位點的接頭肽的多肽和蛋白質。在一個實施例中，目標蛋白連接至肽接頭的N末端，融合伴侶連接至肽接頭的C末端。在另一實施例中，目標蛋白連接至肽接頭的C末端，融合伴侶連接至肽接頭的N末端。在一個更進一步的實施例中，融合蛋白可能包含分別用肽4妻頭分隔的超過一個的目標蛋白和/或超過一個的融合伴侶。在這些實施例中，多個目標蛋白可以相同或不同，多個融合伴侶可以相同或不同，且多個月太4妻頭可以相同或不同。此處所用的術語"目標蛋白"，"所需多肽"，"所需蛋白"或"粑蛋白，，可進行互換，並指任4可其產物有用的蛋白或肽。在一個實施例中，蛋白或肽具有生物活性。目標蛋白的例子包括但不僅限於白介素(IL)-ll,胸腺肽P4，胸腺肽ocl,IL-2,IL-3,IL-4,IL隱5，IL-6,IL-7，IL-8,IL-IO，IL-13，IL-15,IL誦18,蛋白酶;敫活受體l(PARl),PAR3,PAR4,RANTES，基質細胞衍生因子-loc,單核細胞趨化蛋白，幹細胞因子，FLT-3L,甲狀旁腺激素，血小板生成素，表皮細胞生長因子，石成性成纖維細胞生長因子，胰島素樣生長因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，粒細胞集落刺激因子，巨噬細胞集落刺激因子，血小^^反源生長因子，轉化生長因子(TGF)-Pl,腫瘤壞死因子(TNF)-a,幹護G素(IFN)-a，IFN-P，IFN-y,肝細月包生長因子，血管內皮生長因子以及免疫球蛋白重鏈。在一個實施例中，目標蛋白選自由人IL11,胸^J太P4，IL-6和PAR4所組成的群。在另一實施例中，目才示蛋白為人ILll。此處所用的術語"融合伴侶"指任何期望包含在融合蛋白中的蛋白或肽。在一個實施例中，融合伴侶為融合蛋白賦予了改善的特性，如更易純化，更具穩定性，可溶性等等。在一個實施例中，融合伴侶為一種親和肽。親和肽的例子包括但不僅限於穀胱甘肽s轉移酶(GST),麥芽糖結合蛋白(MBP),六聚組氨酸，T7多肽，泛素，Flag多月太，c-myc多肽，聚精氨酸，聚半胱氨酸，聚苯丙氨酸，BTag，半乳糖結合域，纖維素結合域(CBD),石克氧還蛋白，葡萄球菌蛋白A,鏈球菌蛋白G,鈣調蛋白，P-半乳糖苷酶，氯黴素乙醯轉移酶，S-多肽，鏈黴親和素，His-標籤和Strep-標籤。此處所用的術語"肽接頭"指包含可被凝血酶識別和裂解的凝血酶裂解位點的特定胺基酸序列。此處所用的術語"凝血酶，，指任何形式的可裂解本發明月太才妄頭的;疑血酶。；疑血酶可包"fe天然;疑血酶，重糹且;疑血酶，；疑血酶片段以及凝血酶類似物，只要蛋白中保留了一定水平的裂解活性。在一個實施例中，凝血酶可以是人凝血酶或牛;疑血酶，包括天然凝血酶，重組凝血酶，或是由人或牛序列中衍生得到的凝血酶片段和類似物。本發明提供了一種從包括所述目標蛋白，融合伴侶和插在兩者中間的肽接頭的融合蛋白中分離目標蛋白的方法，所述方法包括將融合蛋白與足夠量的凝血酶接觸從而引起多肽接頭的裂解。在一個實施例中，融合蛋白由肽衝妄頭的X3和X4中間斷裂。本方法可進一步包括將目標蛋白從融合蛋白的其他部分中分離，如通過親和純化或尺寸分離。在一個實施例中，凝血酶為人凝血酶，融合蛋白與約0.1USP單位至約l.OUSP單位的凝血酶4妻觸，如約0.2單位至約0.7單位的;疑血酶，如約0.2單位至約0.5單位的凝血酶，如約0.2單位至約0.3單^立的凌是血酶。在另一實施例中，；疑血酶為人;疑血酶，融合蛋白與凝血酶接觸時間為約5分鐘至約1.5小時，如約8分鐘至約1.2小時，如約10分鐘至約1.0小時。在一個更進一步的實施例中，凝血酶為人凝血酶，並且融合蛋白與約0.25單位的凝血酶接觸約30》^中。在一個實施例中，，疑血酶為牛湊是血酶，融合蛋白與約O.l單位至約1.0單位的凝血酶，如約0.2單位至約0.7單位的凝血酶4妻觸。在另一實施例中，凝血酶為牛凝血酶，融合蛋白與凝血酶4妻觸時間為約5分鐘至約1.5小時，如約8分鐘至約1.2小時，如約10分鐘至約1.0小時。在一個更進一步的實施例中，凝血酶為牛凝血酶，且融合蛋白與約0.5單位的凝血酶4妻觸約1.0小時。本發明4是供了一種編碼本發明中的肽接頭的多聚核苷酸。該多聚核苷酸可通過化學合成或克隆進行製備。本發明才是供了一種編碼本發明中的融合蛋白的多聚核苷酸。按照本方明，一個編碼目標蛋白的多聚核苷酸序列被分離，合成或以其他方式獲得並,皮連4妻至一個編碼肽4妻頭的多聚核苷酸序列上。該種包含了連接至編碼肽接頭的多聚核苷酸序列的所需蛋白的基因的雜交多聚核苷酸:帔稱作嵌合多聚核苷酸。在一個實施例中，嵌合多聚核普酸使用整合了編碼肽接頭的多聚核芬酸序列的5j物通過聚合酶鏈式反應等方法進行擴增製備，因此擴增產品中編碼肽序列的多聚核普酸可操作地連接至編碼目標蛋白的多聚核苷酸。在其他的實施例中，多聚核苷酸通過一種連4妻酶連4妻在一起。嵌合多聚核芬酸隨後一皮可才喿作地與編碼融合伴4呂的多聚核香酸連4妾乂人而得到編碼融合蛋白的多聚核苷酸。在其他實施例中，編碼融合伴侶的多聚核苷酸被可操作地連接至編碼肽接頭的多聚核苷酸以獲得嵌合多聚核苷酸，該嵌合多聚核苷酸隨後一皮連4妾至編碼目標蛋白的多聚核苷酸從而得到編碼融合蛋白的多聚核苷酸。此處所用的術語"可操作地連接"指兩個編碼蛋白或肽的多聚核普酸以一定的方式進4亍連4妾，通過該方式可獲得^爭越兩個多聚核苦酸的連續開放閱讀框架。從調節元件來il,術語"可操作地連4妻，，指一個調節元件以一定方式連接至一個編碼蛋白或肽的多聚核苦酸，通過該方式連4^後的調節元件可以對多聚核苷酸的轉錄和/或翻"^產生影響。本發明才是供了一種包含編碼肽4姿頭的多聚核苷酸的載體(如質粒，病毒，或是噬菌體載體)。在一個實施例中，該載體是表達載體。該載體優選可在宿主細胞中自主複製以及優選帶有耐藥基因(如氨千西林或四環素)或營養缺陷型補充基因等可選4奪標誌。在一個實施例中，該載體進一步包含可操作地連接至(如在同一閱讀框架的上遊或下遊)編碼肽接頭的多聚核苷酸的編碼融合伴倡的多聚核香酸。在另一個實施例中，該載體進一步包含可操作地連接至(如在同一閱讀框架的上遊或下遊)編碼肽接頭的多聚核苷酸的編碼目標蛋白的多聚核苦酸。在另一實施例中，該載體包含編碼融合蛋白的多聚核普酸，該融合蛋白包含目標蛋白，融合伴侶以及插在兩者之間的肽接頭。在一個實施例中，該含有編碼肽接頭的多聚核苷酸的載體在編碼肽接頭的多聚核香酸的上遊和/或下遊進一步包含一個或多個如限制性內切酶識別位點等的克隆位點，以幫助編碼目標蛋白或融合伴侶的多聚核香酸被克隆到載體中並與肽4妻頭同框。該載體提供了必要的調節序列(如轉錄和翻譯元件)以控制融合蛋白在合適的宿主細胞中的表達。該調節序列可包括一個或多個啟動子區，增強子區，轉錄終止位點，核糖體結合位點，起始密碼子，剪切信號，內含子，多聚腺苷酸化信號，Shine/Dalgamo翻i奪序列以及Kozak—致序列。調節序列的選4奪依據生產融合蛋白的宿主細胞而定。合適的細菌啟動子包招「但不^又限於噬菌體人pL或pR，T6，T7，T7/lacO，lac,recA,gal,trp,ara,hut以及trp-lac。合適的真核啟動子包括但不僅限於PRBI，GAPDH，金屬硫蛋白，胸苷激酶，病毒LTR，巨細胞病毒，SV40,或是組織特異性或腫瘤特異性的啟動子如曱胎蛋白，澱粉酶，組織蛋白酶E，Ml毒蕈石鹹受體或Y-穀氨醯轉移酶。從宿主細胞分泌到培養基或宿主細胞周質的融合蛋白也可能帶有信號序列。信號序列可能為融合伴侶或其他序列。編碼4言號序列的多聚核苷S臾可以一皮可才喿作i也連衝妄至編石馬融合蛋白的多聚核苷酸的5，末端。此外，可以在信號序列和融合蛋白剩餘部分之間插入額外的肽接頭，從而使信號序列可以通過凝血酶裂解從融合蛋白去除。合適的信號序列已在本領域公知且包括如來自E.coli的MBP,GST,TRX,DsbA,和LamB以及來自酵母的cx-因子。合適表達載體的額外例子可在美國專利US5,814,503中找到,此處引入作為參考。本發明提供了一種製備編碼融合蛋白的多聚核苷酸的方法，包括在載體的克隆位點插入編碼目標蛋白的多聚核芬酸，從而4吏該多聚核苷酸在編碼肽4妻頭的多聚核苷酸的上遊或下遊並與其同框。在一個更進一步的實施例中，編碼目標蛋白的多聚核普酸萍皮插入載體的克隆位點，所述載體包含可操作地連4妄至編碼融合伴侶的多聚核苷酸的編碼肽接頭的多聚核苷酸，,人而使該編碼目標蛋白的多聚核苦酸在編碼肽接頭的多聚核苦酸的上遊或下遊並與其同框。本發明提供了一種包含本發明載體的宿主細胞。該宿主細月包可以是適合融合蛋白表達的任何細胞，包括原核(如糹田菌)和真核(如真菌，酵母，動物，昆蟲，一直物)細力包。合適的原核宿主細胞包括^f旦不4又限於(如DH5,HBIOI,JM109或W3110菌才朱)，芽月包才幹菌(S"c/〃ws入嗜連黴菌(5^e/om_yc"入沙門氏菌(Sa/附o"e〃aA沙雷氏菌(J牙口々i單月包菌(屍sez^omo""sJ種屬。合適的真核宿主細胞包括但不僅限於COS，CHO,HepG-2，CV-I，LLC-MK2,3T3，HeLa，RPMI8226,293，BHK-21，Sf9，酵母(Sacc/^ramyces義畢赤酵母(P/c//"A'漢遜酵母(7/awsewt//a乂克魯維酵母(A7w_yveraw_yce^人麴黴菌(爿^wg/〃M9或木黴菌(7Wc/70fiter附aJ種屬.製備重組載體和轉化宿主細胞使用相同的方法和材料，對於載體在宿主細胞中複製以及具有生物活性的外源多肽和蛋白表達的4苗述見Old等人,PrinciplesofGeneManipulation,2ndedition,(1981);Sambrook等人，MolecularCloning,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratory,2001以及Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork3rdedition,(2000)以上內容均引入作為參考。載體可以通過任何本領域的已知技術導入宿主細胞，這些方法包括但不僅限於轉化，磷酸鈣沉澱，電轉化，脂質體，顯樣"主射以及病毒感染。本發明提供了一種生產融合蛋白的方法，包括製備一個包含編碼本發明融合蛋白的多聚核苷酸的載體，將載體轉入一個宿主細胞，在融合蛋白表達的條件下培養宿主細胞，然後分離融合蛋白。本方法可進一步包括將融合蛋白與凝血酶4妄觸以裂解該融合蛋白，並且分離目標蛋白。本發明進一步提供了一種生產目標蛋白的方法，包括製備包含編碼本發明融合蛋白的多聚核苷酸的載體，將載體轉入宿主細胞，在融合蛋白表達的條件下培養宿主細胞，分離融合蛋白，將分離得到的融合蛋白與凝血酶接觸以裂解該融合蛋白，並且分離目標蛋白。融合蛋白可通過任知，典型條件如下約pH7至約pH9，約4。C至約37。C,底物酶的比例為約5:1至約125:l(摩爾比)，時間為約1小時至約24小時。上述蛋白純化技術也可以用於凝血酶裂解融合蛋白後目標蛋白的分離。在一個實施例中，目標蛋白採用陽離子交換層析(如CMSEPHAROSE)和/或陰離子交換層析(如QSEPHAROSE)。在一個實施例中，目標蛋白首先採用陽離子交換層析，隨後採用陰離子交換層析。例如，由親和層析分離得到的重組IL-ll蛋白可以首先採用陽離子交換柱，如CMSepharoseFastFlow介質。4吏用該介質填充的層析柱可採用含有25mMTris-HCl的緩衝液B進行平4軒。可將含有IL-ll蛋白的樣品採用緩沖液B稀釋約4倍，然後上柱。洗柱時，先採用緩沖液B，然後採用含有0.15MGly-NaOH，pH9.5的糹爰衝液E。輩巴蛋白可採用含有0.15MGly-NaOH，pH9.5和0.15MNaCl的緩衝液F進行洗脫。本步驟的所有過程均可在約4'C下進行。緩沖液B的pH值範圍為約7.5至約8.5。緩沖液E和緩衝液F的pH範圍為約9.2至約9.7。從陽離子交換柱洗脫的重組IL-ll蛋白可以採用陰離子交^灸一主如QSepharoseFastFlow介質進4亍進一步純化。<吏用該介質填充的層析柱可採用含有1MGly-NaOH,pH9.5的緩沖液G進行平#f。4吏用含有40mMGly-NaOH,pH9.5的糹爰衝液H對柱進4亍再平衡。可將前一步驟獲得的樣品用水稀釋約4倍，然後上柱。收集含有耙蛋白的流出液。4吏用含有40mMGly-NaOH,pH9.5的糹爰沖液H過柱，收集流出液。本步-驟;也pH^直範圍為約9.2至約9.7或約9.5。陰離子交換層析的所有步驟均可在室溫左右進行。通過這些步吝聚可以有#丈去除內毒素。本發明才是供了一種包含編碼一種肽4妻頭的多聚核苷酸的試劑盒。在一個實施例中，該試劑盒包含了一種帶有編碼肽接頭的多聚核苦酸的載體。在另一實施例中，該載體是表達載體。在一個實施例中，該載體進一步包含可操作地連接至(如在同一閱讀框架的上遊或下遊)編碼肽接頭的多聚核苷酸的編碼融合伴侶的多聚核苷酸。在另一個實施例中，該載體進一步包含可操作地連衝妻至(如在同一閱讀框架的上遊或下遊)編碼肽接頭的多聚核苷酸的編碼目標蛋白的多聚核苦酸。在另一實施例中，該載體包含編碼融合蛋白的多聚核苷酸，該融合蛋白包含目標蛋白，融合伴侶以及插在兩者之間的肽接頭。在一個實施例中，該含有編碼肽接頭的多聚核苷酸的載體在編碼肽4妻頭的多聚核苷酸的上遊和/或下遊進一步包含一個或多個如限制性內切酶識別位點等的克隆位點，以幫助編碼目標蛋白或融合伴4呂的多聚核苷酸一皮克隆到載體中並與肽^妻頭同框。在一個附加的實施例中，該栽體包含可操作地連接至編碼融合伴倡的多聚核苷酸的編碼肽衝妻頭的多聚核苷酸，並在編碼肽4妾頭的多聚核苷酸上遊或下遊進一步包含了一個或多個克隆位點。在一個實施例中，多聚核苷酸的順序為融合伴侶，肽接頭，克隆位點。在另一個替代實施例中，多聚核苷酸的順序為克隆位點，肽4妄頭，融合伴侶。在一個實施例中，試劑盒中包含了多個載體，每一個載體包含編碼肽-接頭的多聚核苷酸和相對肽4妄頭處於不同閱讀框架內的多個克隆位點，這樣編碼目標蛋白的多聚核苷酸可以插入到其中一個載體上並與肽接頭同框。該試劑盒可進一步包含與載體使用相關的試劑，如緩衝液，限制性內切酶，連接酶，磷酸化酶類，宿主細胞等等。試劑盒還可以包括載體的使用說明，如插入編碼目標蛋白的多聚核苷酸或生產融合蛋白的i兌明。藥物治療和藥物科學中常見的各種條件和參悽t所作的在本領域中顯而易見的適當修改在本發明的精神和範圍之內。具體實施例方式實施例1.GST-IL11(A)本實施例中製備了GST-IL11(A)融合蛋白。GST-IL11(A)融合蛋白由穀胱甘肽s轉移酶(GST)和人IL-11以及插入在兩者之間的凝血酶裂解位點組成。GST-IL11(A)的凝血酶裂解位點為Leu-Val-Pro-Arg-Gly隱Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:8)。為生產GST-IL11(A),構建了一個E.coli表達質粒pGEX4T畫hILll(A)(圖1)。編碼人IL11(A)的DNA序列可通過PCR和定點突變,人人IL11cDNA獲得。下列引物對坤皮用於PCR。5':GGATCCCCGCGAGCTTCCCCAGACCCT(SEQIDNO:12)BamHI3':GTCGACCCCTTATCACAGCCGAGTCTTCAG(SEQIDNO:13)Sail下列引物對被用於定點突變。5'DN:CCAGCCACCCCCGAACCCGCCGGCGCC(SEQIDNO:14)3'DN:GGCGCCGGCGGGTTCGGGGGTGGCTGG(SEQIDNO:15)PCR的5，引物可編石馬Pro-Arg-AIa-Ser殘基(SEQIDNO:16)。經BamHI/Sall處理的DNA片賴j皮克隆至pGEX4T-l質粒上的BamHI/SalI位點，並得到pGEX4T-hILll(A)。pGEX4T-l質粒自身在GST標籤之後帶有凝血酶裂解位點Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQEDNO:l)。這樣，pGEX4T-ML11(A)在穀胱甘肽s轉移酶和人ILll序列之間具有了新的凝血酶裂解位點Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-ArgiAla-Ser(SEQIDNO:8)。進行定點突變的目的在於將野生型IL-ll(NCBI序列號AAA59132)的Aspl55變為Asn。含有凝血酶裂解位點的hILll(A)的胺基酸序列如下Leu-Val一Pro-Arg-Gly-Ser一Pro-Arg丄-Ala-Ser一Pro-Asp-Pro-Arg-Ala—Glu陽Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Aa-Leu-Gly-Ala-Leu-Gin-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gin-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gin-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu(SEQIDNO:17)表達質粒pGEX4T-hlL11(A)隨後4皮轉化進入五.co//BL21。將轉化才朱接種至添加了氨千西林(最終濃度50jug/ml)的LB培養基中，在37。C下培養至OD600達到0.5。然後添加異丙基-(3-D硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.4mM以誘導蛋白表達，繼續在37。C下i咅養細月包3小時。GST-IL11的表達通過SDS-PAGE進行確認。離心收集細胞，再懸浮於50mM，pH8.0的Tris-HCl緩衝液中並採用超聲;容解。添加石危酸4妄至終濃度為5.6%,同時採用Tris粉末將pH維持在8.0。硫酸銨的添加在4。C下進行。含有靶蛋白的上清液加至以pH8.0，25mMTris-HC1IC衝液進4亍預平4軒的谷耽甘月太Sepharose4FastFlow(AmershamBiosciences)親和柱。多次洗滌後，以含有150mMNaCl和10mM還原性谷月光甘肽的pH8.0的25mMTris-HC1緩衝液洗脫結合的融合蛋白。以凝血酶消化純化後的融合蛋白。100微克的蛋白樣品可採用0.]單位，0.25單位或0.5單位的牛或人凝血酶在含有150mMNaCl，pH8的25mMTris-HCl緩沖液中於20。C下進行裂解。在不同的時間點(反應開始後10分鐘，30分鐘，1小時，2小時以及5小時)從反應中取出等量的樣品，通過煮沸5分鐘進行熱滅活終止反應。以SDS-PAGE分析結果，並用考馬斯亮藍著色顯示。隨反應進行，融合蛋白GST-hILll(A)逐漸分裂成兩個主要的產物，GST融合伴侶(26kDa)和IL-11(18.2kDa)(圖2A和2B),且未發現IL-11的內部裂解。GST融合^f半侶可^皮牛和人凝血酶在試-驗中的濃度範圍和時間點有效地裂解(圖2Aand2B)。備選地，融合蛋白的GST部分還可以在融合蛋白結合在層析柱時進行去除，其中該層析柱包含了結合容量約為10毫克每毫升的谷月光甘月太Sepharose4FastFlow介質。該4主以谷月光甘肽Sepharose4FastFlow介質進4亍;真充後，用約54咅一主體積(CV)的含有25mMTris-HCl，pH8.0的緩衝液B進行平^f。將細菌溶解得到的上清'液上才羊後，以約20CV的糹爰衝液B洗一主，然後以約5CV的含有pH8.0，25mMTris-HC1和0.15MNaCl的糹爰衝液C進4亍平4軒。然後〗吏用溶解在緩衝液C的凝血酶，其濃度為約IO單位每毫升介質(或約1單位每毫克介質結合容量)。隨後使用約3CV的緩衝液C過柱，收集從融合伴侶上分離的IL11(A)。所有的過程均在約20-25。C的室溫下進4亍。為4企查IL-ll是否存在任^T內部裂解，可將IL-11先後採用陽離子交換層析和陰離子交換層析進行進一步的純化，再使用基體輔助雷射解吸電離質i普4義(MALDI-TOF/MS)(ProteomicsSolutionI(Voyager-DESTR)，AppliedBiosystems)進4亍分析。才艮4居i十算PI/MW工具(可由au.expasy.org/tools/pitool.html獲耳又M尋到的IL-11的預期分子量為18.26kDa，實際觀察到了一個18264Da的峰(圖3)。/人這一結果可確定在凝血酶裂解GST-IL11(A)後得到了完整的IL-11蛋白。更具體的說，通過親和層析分離得到的重組IL-ll蛋白首先採用CMSepharoseFastFlow介質進4亍純化。層析柱以該介質填充後用緩沖液B進行平衡。含有IL-ll蛋白的樣品以緩衝液B稀釋約4倍後加載到層析柱上。洗柱時，先採用緩衝液B,然後採用含有0.15MGly-NaOH,pH9.5的緩沖液E。耙蛋白可採用含有0.15MGly-NaOH,pH9.5和0.15MNaCl的糹爰衝液F進4亍洗脫。本步驟的所有過程均在約4。C下進行。然後4吏用QS印haroseFastFlow介質對/人陽離子交換柱洗脫的重組IL-ll蛋白進一步純化。採用含有1MGly-NaOH,pH9.5的緩衝液G對填充該介質的層析柱進行平衡。4吏用含有40mMGly-NaOH，pH9.5的緩衝液H對柱進行再平衡。將前一步驟獲得的樣品用水稀釋約44咅，然後上柱。收集含有靶蛋白的流出液。使用含有40mMGly-NaOH,pH9.5的緩沖液H過柱，收集流出液。本步驟中的pH值約為9.5。陰離子交換層衝斤的所有步4聚均在室溫左右進行。通過這些步驟有效去除了內毒素。GST-ILU(A)融合蛋白含有新的凝血酶裂解序列Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:8)。儘管Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:8)序列包含了已知的Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)序列，埃是血酶裂解並非發生在Arg丄Gly，而是在Arg丄Ala。這證明了凝血酶優選Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:8)而非Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO:l)。實施例2.GST-胸腺肽(34GST-胸腺肽(34表達質粒pGEX-胸腺肽^4可通過在pGEX4T-l-Kan中插入胸腺肽(34的cDNA進行構建(圖4)。編碼人胸腺肽(34的cDNA可通過反轉錄(RT)-聚合酶鏈式反應(PCR)從由K562細胞獲得的總RNA中克隆得到。用於PCR的寡聚核苷酸序列如下5':GGATCCCCTCGAGCTTCTGACAAACCCGATATG(SEQIDNO:18)BamHI3':GTCGACTTACGATTCGCCTGC丁TGCTTCTC(SEQIDNO:19)SalI所i殳計的5，引物含有Gly隱Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:20)的編碼序列，這樣當PCR產物克隆進入pGEX4T-i表達質粒時可生成Leu-Val國Pro-Arg-Gly-Ser畫Pro-ArgiAIa畫Ser(SEQIDNO:8)序列。通過PCR可4尋到一個135bp的cDNA產物。^1尋擴增產物克隆入pGEM-TEasy質粒(Promega,WI,USA)，獲得pGEM-胸月泉肽(34。經過序列確證後，pGEM-胸月泉肽|34的BamHI/Sall片羊殳淨皮克隆入pGEX4T-1-Kan載體的相應位點，該載體可通過將pGEX4T-I中的氨爺西林耐藥基因替換為卡那黴素耐藥基因製備得到。含有凝血酶裂解位點的胸腺肽|34的胺基酸序列如下Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Argi-Ala-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gn-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-lie-Glu-Gin-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser(SEQIDNO:21)該表達質粒—皮一皮轉化進入E.coliDH5cc。將轉化才朱4妾種至LB培養基，在37。C下培養至OD600達到0.5,然後添加IPTG至糹冬濃度為0.4mM。繼續i多養3小時，然後離心收集細力包。GST-胸腺肽P4的表達通過SDS-PAGE進4亍確i人。將細力包再懸浮於50mM，pH8.0的Tris-HCl緩衝液中並採用超聲溶解。採用穀胱甘肽Sepharose4FastFlow從可溶組分中純化GST-胸腺肽(34。經純4匕的融合蛋白以凝血酶進4亍消化，並以4吏用15%tricine分離凝膠的SDA-PAGE進行分析。100孩i克的蛋白樣品可採用0.5單位的凝血酶在含有150mMNaCl和10mM還原型穀胱甘肽的pH8，25mMTris-HCl的緩衝液中於2(TC下進行裂解。在不同的時間點(反應開始後IO分鐘，30分鐘，1小時以及3小時)從反應中取出等量的樣品，通過煮沸5分鐘進行熱滅活終止反應。隨反應時間的增加，融合蛋白GST-胸腺肽P4(31kDa)逐漸消失，而胸&泉肽(34(5kDa)的悽史量逐沐斤增力o(圖5)。以凝血酶裂解後，重新^吏用穀胱甘肽Sepharose4FastFlow對胸腺肽P4進行層析以去除融合蛋白的GST部分。使用Procise491AHT蛋白測序4義(AppliedBiosystems,USA)分才斤胸&泉肽e4的N末端氨基S交序列。經確i正分離後的胸膽J汰P4在N末端具有序歹'JAla-Ser-Asp-Lys匿Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile(SEQIDNO:22)。為衝企查胸腺肽(34是否存在任何內部裂解，可將胸腺肽P4先後採用陽離子交換層析和陰離子交換層析進行進一步的純4匕，再4吏用MALDI-TOF/MS(ProteomicsSolutionI(Voyager-DESTR),AppliedBiosystems)進4亍分鬥斤。才艮才居計算PI/MW工具(可由au.expasy.org/tools/pitool.html獲取)得到的胸腺肽(34的預期分子量為5.02kDa，實際觀察到了一個4992Da的峰(圖6)。從這一結果可確定在凝血酶裂解GST-胸腺肽(34後得到了完整的胸腺肽P4蛋白。實施例3.GST-IL6GST-IL6表達質粒pGEX-IL6可通過在pGEX4T-1中插入一個鼠IL-6的cDNA進行構建(圖7)。編碼鼠IL-6的cDNA可通過RT-PCR從由鼠樹突細胞獲得的總RNA中克隆得到。用於PCR的寡聚核苷酸序列如下5':GGATCCCCTCGAGCTTCTTTCCCTACTTCA(SEQIDNO:23)BamHI3，GTCGACCTAGGTTTGCCGAGTAGATCT(SEQIDNO:24)Sail所設計的5，引物含有Gly-Ser-Pro-ArgiAla-Ser(SEQIDNO:20)的編碼序列，這才羊當PCR產物克隆進入pGEX4T-i表達質粒時可生成Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:8)序列。通過PCR可得到588bp的cDNA。將擴增產物克隆入pGEM-TEasy質粒，獲得pGEM-IL6。經過序列確證後，pGEM-IL6的BamHI/Sall片賴^皮克隆入pGEX4T-1載體的衝目應《立點。含有凝血酶裂解位點的IL6的胺基酸序列如下Leu-^Val一Pro-Arg-Gly-Ser一Pro-Argi陽AIa-Ser一Phe匿Pro-Thr一Ser一Gln-Va1—Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-Thr-Glu-Asp-Thr-Thr-Pro-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Thr-Thr陽Ser-Gln-Val-Gly-Gly-Leu-Ilu-Thr-His-Val-Leu-Trp-Glu-Ilu-Val-Glu-Met-Arg-Lys-Glu-Leu-Cys-Asn-Gly-Asn-Ser-Asp-Cys-Met-Asn-Asn-Asp-Asp-Ala-Leu-Ala-Glu-Asn-Asn-Leu-Lys-Leu-Pro-Glu-Ilu-Gln-Arg-Asn-Asp-Gly-Cys-Tyr-GIn-Thr-Gly-Tyr-Asn-Gln-Glu-Ilu-Cys-Leu-Leu-Lys-Ilu-Ser-Ser-Gly—Leu-Leu-Glu-Tyr-His-Ser—Tyr-Leu-Glu陽Tyr-Met-Lys-Asn陽Asn-Leu-Lys-Asp-Asn-Lys-Lys-Asp-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Gln-Arg-Asp-Thr-Glu-Thr-Leu-Ilu-His-Ilu-Phe-Asn-Gln-Glu-Val-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ilu-Val-Leu-Pro-Thr-Pro-Ilu-Ser-Asn-Ala-Leu-Leu-Thr-Asp-Lys-Leu-Glu-Ser-Gln-Lys-Glu-Trp-Leu-Arg-Thr-Lys-Thr-nu-Gln-Phe-Ilu-Leu-Lys-Ser-Leu-Glu-Glu-Phe-Leu-Lys-Val-Thr-Leu-Arg-Ser陽Thr-Arg-Gln-Thr(SEQIDNO:25)表達質粒隨後被轉化進入E.coliBL21。將轉化株接種至添加了氨節西林(最終濃度50mg/ml)的lb培養基中，在37°C下培養至OD600達到0.5，然後添力。IPTG至終濃度為0.4mM。繼續培養3小時，然後離心收集細月包。GST-IL6的表達通過SDS-PAGE進4亍確i人。將細月包再懸浮於50mM，pH8.0的Tris-HCl緩沖液中並採用超聲>容解。採用穀胱甘肽Sepharose4FastFlow乂人可溶組分中純4匕GST-IL6。以凝血酶消化純化後的融合蛋白並以SDS-PAGE進行分析。100孩i克的蛋白樣品可採用0.5單位的凝血酶在含有150mMNaCl和10mM還原型穀胱甘肽的pH8，25mMTris-HC1的緩衝液中於20。C下進ff裂解在不同的時間點(反應開始後10分4f,30分鐘，1小時，2小時以及3小時)從反應中取出等量的樣品，通過煮沸5分鐘進行熱滅活終止反應。隨反應時間的增加，融合蛋白GST-IL6(46kDa)逐)新消失，而IL6(22kDa)的悽t量逐)新增加(圖8)。欲檢查凝血酶處理後是否發生裂解，可將含IL-6蛋白的蛋白條帶進行胺基酸測序。首先，將純化後的GST-IL6蛋白以凝血酶處理3小時，並用SDS-PAGE進行分離。然後將聚丙烯醯胺凝月交上的蛋白轉移到PVDF膜上。在鑑別含有IL-6蛋白的條帶後，將其從PVDF膜上切下，然後進4亍胺基酸測序。經確i正IL-6在N末端具有序歹'JAla-Ser-Phe-Pro-Thr-Ser-Gin-Val-Arg陽Arg(SEQIDNO:26)。實施例4.GST-PAR4已知蛋白酶激活受體(PARs)可#皮N末端exodomain的蛋白水解激活(Kahn等，J.C//w./wve"103:879(1999))。構成這一蛋白家力矣共有4個PARs(PARI-4)，其中PAR1，3和4可^皮凝血酶激活(Coughlin,屍rac.淑/.^c"c/.USA96:11023(1999)).PAR4上的凝血酶裂解位點的胺基酸序列為Leu43-Pro-Ala-Pro-Arg4-Gly-Tyr(SEQIDNO:27)。我們生產了以Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄-Ala-Ser(SEQIDNO:8)序列作為另一凝血酶裂解位點的GST-PAR4蛋白，以測試凝血酶優選哪一個位點。GST-PAR4表達質粒pGEX-PAR4可通過在pGEX4T-l-Kan中插入人PAR4的cDNA進4亍構建(圖9)。編碼人PAR4的cDNA可通過RT-PCR從由K562細胞獲得的總RNA中克隆得到用於PCR的寡聚核苷酸，序列如下5':GGATCCCCTCGAGCTTCTATGTGGGGGCGA(SEQIDNO:28)BamHI3，GTCGACTCAGTGCACCAGGGCCAGGTA(SEQIDNO:29)SalI所i殳計的5，引物含有Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:20)的編碼序列，這樣當PCR產物克隆進入pGEX4T-l-Kan質粒時可生成Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:8)。[OIOO]通過PCR可得到540bp的cDNA。將擴增產物克隆入pGEM-TEasy質粒，獲得pGEM-PAR4。經過序列確i正後，pGEM-PAR4的BamHI/Sall片#殳#皮克隆入pGEX4T-l-Kan載體的相應位點。含有凝血酶裂解位點的PAR4的胺基酸序列如下Leu畫V"al-Pro-Arg國Gly-Ser一Pro-Argi-Ala-Ser-Met-Trp-Gly-Arg-Leu-Leu-Leu-Trp-Pro-Leu-Val-Leu-Gly-Phe-Ser-Leu-Ser-Gly-Gly-Thr-Gln-Thr-Pro-Ser-Val-Tyr-Asp-Glu-Ser-Gly-Ser-Thr-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-Ser-Thr-Pro-Ser-IIe-Leu-Pro-Ala-Pro-Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Gln-Val-Cvs-Ala-Asn-Asp-Ser-Asp-Thr-Leu-Glu-Leu-Pro-Asp-Ser-Ser-Arg-Ala-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr陽Val-Pro-Thr-Arg-Leu-Val-Pro-Ala-Leu-Tyr-Gly-Leu-Val-Leu-Val-Val-Gly-Leu-Pro-Ala-Asn-Gly-Leu-Ala-Leu-Trp-Val-Leu-Ala-Thr-Gln-Ala-Pro-Arg-Leu-Pro-Ser-Thr-Met-Leu-Leu-Met-Asn陽Leu-Ala-Thr-Ala-Asp-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile-Ala-Tyr-His-Leu-Arg-Gly-Gln-Arg-Tyr-Pro-Phe-Gly-Glu-Ala-Ala-Cys-Arg-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Leu-Tyr-Gly-His-Met-Tyr-Gly-Ser-Val-Leu-Leu-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Leu-Asp-Arg-Tyr-Leu-Aa-Leu-Val-His(SEQIDNO:30)下劃線部分為內部;疑血酶裂解位點。表達質粒隨後被轉化進入E.coliBL21。將轉化林接種至添加了卡那黴素(最終濃度50ug/ml)的LB培養基中，在37°C下培養至OD600達到0.5,然後添力oIPTG至終濃度為0.4mM。繼續培養3小時，然後離心收集細胞。GST-PAR4的表達通過SDS-PAGE進行確認。將細胞再懸浮於50mM,pH8.0的Tris-HCl緩衝液中並採用超聲溶解。採用穀胱甘肽Sepharose4FastFlow從可溶組分中純化GST-PAR4。經純化的融合蛋白以凝血酶進4亍消化，並以SDA-PAGE進4亍分析。100孩i克的蛋白才羊品可採用0.5單位的凝血酶在含有150mMNaC和10mM還原型穀胱甘肽的pH8，25mMTris-HCI的緩衝液中於2(rc下進4亍裂解。在不同的時間點(反應開始後io分鐘，30分鐘，1小時，2小時以及3小時)從反應中取出等量的樣品，通過煮沸5分鐘進行熱滅活終止反應。實施例5.GST-ILI1(LV-)為測試進行有效的凝血酶裂解是否需要完整的Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:8)序列，構建了編碼Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)作為凝血酶裂解位點的表達質粒。首先參照實施例1的方法從pGEX4T-ILll(A)中獲取含有IL-ll(A)的BamHI/Sall片段。然後將其插入pGEX6P-2的BamHI/Sall位點，獲得pGEX6P-ILl1。質粒pGEX6P-2在BamHI位點的上遊含有"Pro-Leu"序列。因此，由於含有IL-ll(A)的BamHI/Sall片段以Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:20)序列起始，所以pGEX6P-ILll可以具有Pro-Leu-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:31)。通過定點突變將第二個胺基酸Leu該為Arg，以得到Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)序列。下述寡聚核普酸序列,皮用於定點突變5':CAGGGGCCCCGGGGATCCCCTCGAGCT(SEQIDNO:32)所得的質粒被命名為pGEX-ILll(LV-)(圖10)，用於GST-ILll(LV-)的生產。含有凝血酶裂解位點的IL-1l(LV-)的胺基酸序列如下Pro扁Arg-Gly-Ser-Pro畫Argi-Ala-Ser—Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gin-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-VaI-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg—Ala-Gly-Gly—Ser-Ser-Leu—Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gin-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gin-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala畫Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu(SEQIDNO:34)[107]表達質粒隨後被轉化進入E.coliBL21。將轉化株接種至添加了氨千西林(最終濃度50jug/ml)的LB培養基中，在37°C下培養至OD600達到0.5,然後添加IPTG至終濃度為0.4mM。繼續i備養3小時，然後離心收集細胞。GST-ILll(LV-)的表達通過SDS-PAGE進行確認。將細胞再懸浮於50mM，pH8.0的Tris-HCl糹爰衝液中並採用超聲〉容解。採用谷月光甘肽Sepharose4FastFlow,人可溶組分中純化GST-ILU(LV-)。經純化的融合蛋白以凝血酶進^亍消化，並以SDA-PAGE進行分析.100孩i克的蛋白樣品可釆用0.5單位的凝血酶在含有150mMNaCl的pH8，25mMTris-HCl的糹爰沖'液中於20。C下進4亍裂解在不同的時間點(反應開始後10分4中，30分鐘，1小時，2小時以及3小時)從反應中取出等量的樣品，通過煮沸5分鐘進行熱滅活鄉冬止反應。隨反應時間的增力口，融合蛋白GST-ILll(LV-)(44kDa)逐漸消失，而IL-11(LV-)(18kDa)的數量逐漸增力口(圖11)。欲檢查凝血酶處理後是否發生裂解，可將含IL-ll(LV-)蛋白的蛋白條帶進行胺基酸測序。首先，將純化後的GST-IL11(LV-)蛋白以凝血酶處理3小時，並用SDS-PAGE進行分離。然後將聚丙烯醯胺凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上。在鑑別含有IL-ll(LV-)蛋白的條帶後，將其,人PVDF膜上切下，然後進行胺基酸測序。經確證IL-11(LV-)在其N末端具有序列Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp(SEQIDNO:35),i兌明Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)已足夠進4亍有效的凝血酶裂解。實施例6.MBP-IL11MBP-IL11表達質粒pMAL畫c2-IL11可通過在pMAL-c2中插入人IL-11的cDNA進行構建(圖12)。編碼人IL-11的cDNA可從pGEX4T-ILll(A)通過PCR獲取。用於PCR的寡聚核苷S臾序列如下5，GAATTCCCTCGAGGTTCACCTCGAGCTTCC(SEQIDNO:36)EcoRI3':GTCGACTCACAGCCGAGTCTTCAGCAG(SEQIDNO:37)SalI[Olll]所設計的5，引物含有Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg丄Ala-Ser(SEQIDNO:7)的編碼序列。含有IL-ll序列的EcoRI/Sall片段被克隆入pMAL-c2載體的EcoRI/Sall位點，得到pMAL-c2-ILl1。因此，pMAL-c2-IL11與pGEX-ILll(LV-)在麥芽糖結合域和人IL-ll序列之間具有相同的凝血酶裂解位點。在麥芽糖結合域下遊含有凝血酶裂解位點的IL-ll的胺基酸序列如下Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Argi-Ala-Ser-Pro-Asp-Pro陽Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-GIn-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gin-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gin-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu(SEQIDNO:34)表達質粒隨後被轉化進入E.coliBL21。將轉化4朱接種至添加了氨千西林(最終濃度50jag/ml)的LB培養基中，在37。C下培養至OD600達到0.5,然後添力口IPTG至終濃度為0.4mM。繼續培養3小時，然後離心收集細胞。MBP-IL11的表達通過SDS-PAGE進4亍確^人。將細月包再懸浮於含有200mMNaCl，1mMEDTA和1mM疊氮化鈉的20mM，pH8.0的Tris-HCl緩沖液中並採用超聲溶解。含有草巴蛋白的上清液力口至以含有200mMNaCl和lmMEDTA的20mM，pH7.4的Tris-HClH衝液進4亍預平^f的直鏈澱升分(NewEnglandBiolabs)親和柱。多次洗滌後，用含有200mMNaCl，lmMEDTA和10mM麥芽一唐的20mM,pH7.4的Tris-HCli差沖液洗脫結合的融合蛋白。經純化的融合蛋白以凝血酶進4亍消化，並以SDA-PAGE進4亍分衝斤。100孩i克的蛋白衝羊品可採用0.5單^f立的;疑血酶在含有200mMNaCl，lmMEDTA和lOmM麥芽#唐的20mM,pH7.4的Tris-HC1的緩衝液中於20。C下進行裂解在不同的時間點(反應開始後10分4中，30分4t,l小日於，2小時以及3小時)乂人反應中耳又出等量的衝羊品，通過煮沸5分4f進^於熱滅活終止反應。隨反應時間的增加，融合蛋白MBP-IL11(60kDa)逐洋斤消失，而ILll(18kDa)的數量逐漸增加(圖13)。欲檢查凝血酶處理後是否發生裂解，可將含IL-ll蛋白的蛋白條帶進行胺基酸測序。首先，將純化後的MBP-IL11蛋白以凝血酶處理3小時，並用SDS-PAGE進4亍分離。然後^)奪聚丙蹄醯胺凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上。在鑑別含有IL-ll蛋白的條帶後，將其從PVDF膜上切下，然後進行胺基酸測序。經確證IL-11在其N末端具有序列Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp(SEQIDNO:38),i兌明Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)已足夠進一於有效的凝血酶裂解。實施例7.HIS-IL11所i殳計的5，引物含有Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-ArgiAla-Ser(SEQIDNO:7)的編碼序列。含有IL-l1序列的Ndel/BamHI片^殳4皮克隆至pET19b載體上的Ndel/BamHI位點，並得到pET19b-ILll。因此，pET19b-IL11與pGEX-ILll(LV-)在His標籤和人IL-ll序列之間具有相同的凝血酶裂解位點。在His標籤下遊含有凝血酶裂解位點的IL-l1的胺基酸序列如下Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Argi-AIa-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gin-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-GIy-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gin-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu隱His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr匿Arg-Leu(SEQIDNO:34)將表達質粒轉化進入E.coliBL21(DE3)。將轉化抹接種至添加了氨千西林(最終濃度50jug/ml)的LB培養基中，在37°C下培養至OD600達到0.5，然後添力口IPTG至鄉冬濃度為0.4mM。繼續培養3小時，然後離心收集細胞。His-ILll的表達通過SDS-PAGE進4亍確i人。將細月包再懸浮於含有0.5MNaCl的20mM，pH7.4的Tris-HCl緩衝液中並採用超聲溶解。含有把蛋白的上清液加至以含有0.5mMNaCl和20mM。米唑的20mM,pH7.4的石粦酸鈉糹爰沖液進4亍予貞平4軒的Ni畫Sepharose高凌文(AmershamBiosciences)親禾口片主。多>欠洗滌後，用含有0.5mMNaCl和500mM。米峻的20mM，pH7.4的石庳酸鈉緩衝液洗脫結合的融合蛋白。經純化的融合蛋白以凝血酶進行消化，並以SDA-PAGE進行分析。100孩i克的蛋白樣品可採用0.5單位的凝血酶在含有0.5mMNaCl和500mM。米峻的20mM，pH7.4的石舞酸鈉糹爰衝'液中於20。C下進行裂解。在不同的時間點(反應開始後IO分鐘，30分鐘，1小時，2小時以及3小時)從反應中取出等量的樣品，通過煮沸5分鐘進行熱滅活終止反應。隨反應時間的增加，融合蛋白His-IL11(22kDa)逐;新消失，而ILll(18kDa)的^t量逐漸增加(圖15)。欲檢查凝血酶處理後是否發生裂解，可將含IL-ll蛋白的蛋白條帶進行胺基酸測序。首先，將純化後的His-IL11蛋白以凝血酶處理3小時，並用SDS-PAGE進4亍分離。然後將聚丙烯醯胺凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上。在鑑別含有IL-11蛋白的條帶後，將其從PVDF膜上切下，然後進行胺基酸測序。經確證IL-11在其N末端具有序列Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu陽Asp(SEQIDNO:41),"i兌明Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)已足夠進行有效的凝血酶裂解。現在經過對發明的完整描述，本領域的普通4支術人員均能理解在一個寬泛且等效的條件，配方和其他參悽t範圍內可實現同等效果而不影響本發明和其中任意實施例的範圍。此處所引用的專利，專利申請以及出版物均在此完整引入作為參考。權利要求1.一種包含以下序列的肽接頭X1-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5其中X1是兩個或兩個以上彼此相同或不同的胺基酸殘基；X2是疏水胺基酸殘基；X3是精氨酸或賴氨酸；X4是丙氨酸或甘氨酸；以及X5是一種非酸性胺基酸。2.如權利要求1所述的肽接頭，其中XI是4個或4個以上的氨3.如4又利要求1所述的肽4妻頭，其中XI是不超過10個的氨基酉復歹芙H。4.如權利要求1所述的肽接頭，其中XI包舍脯氨酸和精氨酸。5.如權利要求1所述的肽接頭，其中X2選自由甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸以及色氨酸所組成的群。6.如權利要求5所述的肽4妄頭，其中X2是甘氨酸。7.如權利要求1所述的肽接頭，其中X5選自由絲氨酸，丙氨酸，天門冬醯胺，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，賴氨酸，笨丙氨酸，酪氨酸以及色氨酸所組成的群。8.如權利要求7所述的肽接頭，其中X5是絲氨酸。9.如4又利要求1所述的肽一妻頭，其特4正在於，包含序列Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)。10.如權利要求1所述的肽4妻頭，其特4正在於，包含序列Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:8)。11.一種融合蛋白，其包含個目標蛋白，融合伴倡以及插在兩者之間的肽4妄頭；所述爿大4喜頭包含以下序列Xl-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5其中XI是兩個或兩個以上彼此相同或不同的胺基酸殘基；X2是疏L水胺基酸殘基；X3是精氨酸或賴氨酸；X4是丙氨酸或甘氨酸；以及X5是一種非酸性胺基酸。12.如權利要求11所述的融合蛋白，其中，所述的目標蛋白選自由白介素(IL)-11，胸腺肽(34，胸腺肽a1，1L-2,1L-3，IL-4，1L-5,IL-6,IL-7,IL-8，1L-10,IL-13,fL-15，IL-18,蛋白酶激活受體l(PARl),PAR3,PAR4，RANTES,基質細月包書f生因子-1a，單核細胞趨化蛋白，千細胞因子，FLT-3L，甲狀旁腺激素，血小板生成素，表皮細胞生長因子，鹼性成纖維細胞生長因子，胰島素樣生長因子，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，粒細胞集落刺激因子，巨噬細胞集落刺激因子，血小板源生長因子，轉化生長因子(TGF)-(3l，腫瘤壞死因子(T'NF)-a，幹擾素(IFN)-oc，IFN-(3，IFN-Y,肝細胞生長因子，血管內皮生長因子以及免疫J求蛋白重《連所ia成的群。13.如權利要求12所述的融合蛋白，其中所述的目標蛋白選自由人IL1],胸月泉肽(34,IL-6和PAR4所糹且成的群。14.如權利要求12所迷的融合蛋白，其中所述的目標蛋白為人ILU。15.如權利要求11所述的融合蛋白，其中所述的融合伴倡是一種親和肽。16.如權利要求15所述的融合蛋白，其中所述的融合伴估選自由穀胱甘肽s轉移酶(GST)，麥芽糖結合蛋白(MBP),六聚組氨酸，T7多月大，泛素，Flag多肽，c-myc多月太，聚4青氨酸，聚半胱氨酸，聚笨丙氨酸，BTag，半乳糖結合域，纖維素結合域(CBD)，硫氧還蛋白，葡萄球菌蛋白A,鏈球菌蛋白G,鈣調蛋白，[3-半乳糖苷酶，氯黴素乙醯轉移酶，S-多肽，鏈黴親和素，His-標籤和Strep-標籤所組成的群。17.如4又利要求16所述的融合蛋白，其中所述的融合伴侶是GST。18.—種從權利從要求11所述的融合蛋白分離目標蛋白的方法'，包括使融合蛋白與足夠量的凝血酶接觸從而引起肽接頭的裂角,。19.如權利要求18所述的方法，其中所述的融合蛋白在肽接頭的X3一口X4間斷裂。20.如權利要求18所述的方法，其中所述的凝血酶為人凝血酶「21.如權利要求20所述的方法，其中所述的融合蛋白與約O.]單位至約1.0單位的凝血酶4妻觸。22.如衝又利要求21所述的方法，其中所述的融合蛋白與約0.2單4立至約0.7單^立的;疑血酶4妻觸。23.如權利要求22所述的方法，其中所述的融合蛋白與約0.2單位至約0.5單位的凝血酶4妻觸。24.如權利要求23所述的方法，其中所述的融合蛋白與約0.2單位至約0.3單位的凝血酶接觸。25.如權利要求20所述的方法，其中所述的融合蛋白與凝血酶接觸約5分鐘至約1.5小時。26.如權利要求25所述的方法，其角蟲約8分鐘至約1.2小時。27.如權利要求26所3'息的方法，角蟲約10分4中至約1.0小時.,其中所述的融合蛋白與凝血酶接28.如權利要求20所述的方法，其中所述的融合蛋白與約0.25單位凝血酶-接觸約30分鐘。29.如權利要求18所述的方法，其中所述的凝血酶為牛凝血酶。30.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述的融合蛋白與約0.1單位至約1.0單位的凝血酶4妻觸。31.如權利要求30所述的方法，其中所述的融合蛋白與約0.2與4立至約0.7單4立的;疑血S爭4妻觸。32.如權利要求29所述的方法，其中所述的融合蛋白與凝血酶接觸約5分鐘至約1.5小時。33.如權利要求32所述的方法，其中所述的融合蛋白與凝血酶接觸約8分4f至約1.2小時。34.如權利要求33所述的方法，其中所述的融合蛋白與湊是血酶4妄觸約10分4中至約1.0小時。35.如4又利要求29所述的方法，其中所i底的融合爿蛋白與約0.5單4立;疑血f錄^妻觸約i.o小時。36.—種編碼4又利要求1所述的肽4妻頭的多聚核苦酸。37.如權利要求36所迷的多聚核苷酸，其中所述肽接頭中的X2選自由甘氨酸，丙-氮酸，脯氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，蛋氨酸，笨丙氨酸，酪-氮酸以及色-氮酸所組成的群。38.如權利要求37所述的多聚核苷酸，其中所述肽接頭中的X2是甘氨酸。39.如權利要求36所述的多聚核苷酸，其中所述肽接頭中的X5選自由絲-氮酸，丙氨f狻，天門冬醯胺，纈—氮酸，亮氨酸，異亮#7複，賴氨酸，笨丙氨酸，酪氨酸以及色氨酸所組成的群。40.如權利要求39所述的多聚核苷酸，其中所述肽接頭中的X5《酸。41.如權利要求36所述的多聚核苷酸，其中所述肽接頭包含序列Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:7)。42.如權利要求36所述的多聚核苷酸，其中所述肽接頭包含序列Leu-VaI-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro隱Arg-Ala-Ser(SEQIDNO:8)。43.—種編碼權利要求11所述融合蛋白的多聚核普酸。44.如4又利要求43所述的多聚核苷酸，其中所述的目標蛋白選自由白介素(IL)-ll,胸月泉肽(34,胸月泉肽al，IL-2,IL-3，IL-4,IL-5,IL-6，IL-7,IL-8，IL-10,IL-13，IL-15,IL-18,蛋白酶激活受體l(PAR]),PAR3,PAR4,RANTES，基質細胞衍生因子-la,單核細胞趨化蛋白，幹細胞因子，FLT-3L,甲狀旁腺激素，血小板生成素，表皮細胞生長因子，鹼性成纖維細胞生長因子，月臭島素樣生長因子，粒細月包-巨噬細胞集落刺激因子，粒細胞集落刺激因子，巨噬細胞集落刺激因子，血小板源生長因子，轉化生長因子(TGF)-(31,腫瘤壞死因子(TNF)-a,幹擾素(IFN)-cc,IFN-(3，IFN-Y,肝細胞生長因子，血管內皮生長因子以及免疫J求蛋白重《連所組成的群。45.如權利要求44所述的多聚核苷酸，其中所述的目標蛋白為人.IL11。46.如斥又利-要求43所述的多聚核苷酸，其中所述的融合伴侶是一種親和肽。47.如權利要求46所述的多聚核苷酸，其中所述的融合伴侶選自由穀胱甘肽s轉移酶(GST)，麥芽糖結合蛋白(MBP),六聚組—氨酸，T7多肽，泛素，Flag多肽，c-myc多肽，聚精氨酸，聚半胱氨酸，聚苯丙氨酸，BTag,半乳糖結合域，纖維素結合域(CBD)，石克氣還蛋白，葡萄J求菌蛋白A,鏈3求菌蛋白G,鈣調蛋白，(3-半乳糖苷酶，氯黴素乙醯轉移酶，S-多肽，鏈黴親和素，His-標籤和Strep-標籤所組成的群。48.如權利要求47所述的多聚核香酸，其中所述的融合伴估是GST。49.一種包含權利要求43所述多聚核苷酸的載體。50.如4又利要求49所述的載體，其進一步包含一個或多個可才喿作地連4妻至所述多聚核苦酸的調節序列。51.—種包含權利要求50所述載體的宿主細胞。52.如權利要求51所述的宿主細胞，其中所述的宿主細胞為原核糹田月包。53.如權牙要求51所述的宿主細胞，其中所述的宿主細胞為真核糹田月包。54.—種包含權利要求36所述多聚核苷酸的載體'，55.如權利要求54所述的載體，進一步包含一個或多個位於所述多聚核香酸的上遊和/或下遊的克隆位點。56.如權利要求54所述栽體，進一步包含一種位於所述多聚核苷酸的上遊和/或下遊並與該多聚核苷酸同框的編碼融合伴4呂的多聚核苷酸。57.如權利要求54所述的載體，其進一步包含一個或多個可操作地連接至所述多聚核苷酸的調節元件。58.—種包含權利要求54所述載體的宿主細胞。59.如權利要求58所述的宿主細胞，其中所述的宿主細月包為原核全田月包。60.如—又利要求58所述的宿主細胞，其中所迷的宿主細胞為真核細胞。61.—種製備編碼融合蛋白的多聚核苷酸的方法，其包括在4又利要求55所述的載體的克隆位點4翁入編碼目標蛋白的多聚核普酸。62.—種製備融合蛋白的方法，包括a)製備包含一種編碼融合蛋白的多聚核苷酸的載體，所述融合蛋白包含目標蛋白，融合伴侶以及插在兩者之間的如權利-要求1所述的肽接頭；d)分離所述融合蛋白。63.—種製備目標蛋白的方法，包4舌a)製備包含一種編碼融合蛋白的多聚核苷酸的載體，所述融合蛋白包含目標蛋白，融合伴侶以及插在兩者之間的如權利要求]所述的肽4妄頭；b)將所述載體轉入宿主細月包；c)在融合蛋白表達的條件下培養所述的宿主細胞；d)分離所述融合蛋白；e)將所述融合蛋白與凝血酶進行接觸以裂解所述融合蛋白；以.及f)分離所述目標蛋白。64.如權利要求63所述的方法，其中所述的宿主細胞是真核細胞。勺宿主細力包；以及65.如權利要求63所述的方法，其中所述的宿主細胞是原核細胞。66.如權利要求65所述的方法，其中所述的宿主細胞是細菌細月包。67.如權利要求66所述的方法，其中所述的細菌細胞在步驟(d)中採用高壓進行溶解。68.如權利要求67所述的方法，其中所述的細菌細胞以高壓勻裝才幾進行溶解。69.如^U']要求63所述的方法，其中對所述融合細月包的所述分離採用親和柱進4亍。70.如權利要求69所述的方法，其中所述融合蛋白與凝血酶的接71.如權利要求69所迷的方法，其中所述融合蛋白的所述分離進一步包括對所述目標蛋白進《亍陽離子交換層析。72.如4又利要求69所述的方法，其中所il融合z蛋白的所述分離進一步包括對所述目標蛋白進行陰離子交換層析。73.如權利要求63所述的方法，其中所述的凝血酶為人凝血酶。74.如4又利要求73所述的方法，其中所述的融合蛋白與約0.1單位至約l.0單位的凝血酶接觸。75.如權利要求74所述的方法，其中所述的融合蛋白與約0.2單位至約0.7單位的凝血酶接觸。76.如權利要求75所述的方法，其中所述的融合蛋白與約0.2單位至約.5單位的;疑血酶-接觸。77.如權利要求76所述的方法，其中所述的融合蛋白與約0.2單位至約0.3單位的凝血酶4秦觸。78.如權利要求73所述的方法，其中所述的融合蛋白與凝血酶接觸約5分鐘至約1.5小時。79.如4又利要求78所述的方法，其中所述的融合蛋白與;疑血酶4妾觸約8分^t至約1.2小時。80.如權利要求79所述的方法，其中所述的融合蛋白與凝血酶接觸約10分4中至約1.0小時。81.如權利要求73所述的方法，其中所述的融合蛋白與約0.25單位凝血酶^妾觸約30分鐘。82.如4又利要求81所述的方法，其中所述的;疑血酶為牛省是血惑爭，83.如權利要求82所述的方法，其中所述的融合蛋白與約.l單4立至約1.0單〗立的;疑血S條4妻觸。84.如權利要求83所述的方法，其中所述的融合蛋白與約0.2單位至約0.7單位的凝血酶4妻觸。85.如權利要求82所述的方法，其中所述的融合蛋白與凝血酶4妾觸約5分鐘至約1.5小時。86.如權利要求85所述的方法，其中所述的融合蛋白與凝血酶接觸約8分鐘至約1.2小時。87.如權利要求86所述的方法，其中所述的融合蛋白與凝血酶接觸約10至約1.0小時。88.如權利要求82所述的方法，其中所述的融合蛋白與約0.5單位凝血酶^妻觸約1.0小時。89.—種包含權利要求54所述載體的試劑盒。90.如權利要求89所述的試劑盒，其中所述載體進一步包含一個或多個位於所述多聚核苦酸的上遊和/或下遊的克隆位點。91.如權利要求89所述試劑盒，其中所述載體進一步包含一種位於所述多聚核苷酸的上遊和/或下遊並與該多聚核苷酸同框的編碼融合伴侶的多聚衝玄苷酸。92.如權利要求89所述的試劑盒，其中所述載體進一步包含一個或多個可^t喿作地連4妻至所述多聚核苷酸的調節元件。93.如權利要求89所述的試劑盒，進一步包含對所述載體的使用說明。全文摘要本發明涉及一種融合蛋白的組成及利用一種含有新型凝血酶裂解位點的肽接頭進行融合蛋白分離的方法。文檔編號C07K7/04GK101287748SQ200680022054公開日2008年10月15日申請日期2006年4月20日優先權日2005年4月20日發明者許松山,金水晶,金鐘默申請人:百療醫株式會社