用於抑制血糖值上升的組合物以及飲食品的製作方法

2023-05-01 10:26:06 1

專利名稱：用於抑制血糖值上升的組合物以及飲食品的製作方法
技術領域：
本發明涉及混合使用茶的葉子和枇杷葉並將其發酵而形成的發酵茶葉、發酵茶葉提取物以及使用這些的飲食品。另外，本發明提供用於抑制血糖值上升的組合物以及含有該組合物的飲食品。

背景技術：
已知茶具有抗氧化作用、抗癌作用、預防癌症、降低血中膽固醇作用、抑制血壓上升作用等效果(例如，下述非專利文獻1)。在下述專利文獻1中，提出了使用番石榴葉的提取液中含有的抑制α-澱粉酶的物質的飲食品。
另外，現在對因不規則的飲食生活或運動不足等原因而引起的生活習慣病的關心很高，其中，糖尿病有大幅度增加的傾向。即使不引發糖尿病，高的血糖值也成為各種生活習慣病的信號，另外，由於肥胖被認為容易引起生活習慣病，因此，抑制血糖值上升的飲食品受到矚目。
除了在下述專利文獻1中記載的番石榴葉提取液以外，作為具有穩定地進行糖的吸收的作用的特定保健用食品，已知有以難消化性糊精、小麥白蛋白、L-阿拉伯糖、豆豉抽提物作為有效成分的飲食品。
[專利文獻1]特開平7-59539號公報 [非專利文獻1]「茶的化學」村松敬一郎編(朝倉書店)p124-191

發明內容
發明要解決的問題 茶的原料或製法多種多樣，對於藥效成分仍有很多未知的部分。
由於茶是安全性高的食品，可以習慣性地攝取，因此，期待開發對維持或改善健康發揮有效的藥效的新型的茶。
另外，近年來，對抑制血糖值上升的飲食品的關注在提高，因此要求更加有效的用於抑制血糖值上升的組合物以及飲食品。
本發明就是鑑於上述情況而作成的，其目的在於，提供一種對維持或改善健康具有有效的藥效的新型的發酵茶葉、發酵茶葉提取物以及使用其的飲食品。
解決問題的方法 本發明提供一種發酵茶葉，其特徵在於，混合、揉捏茶的葉子和枇杷葉，並進行發酵。
本發明提供一種發酵茶葉，其特徵在於，混合茶的葉子和枇杷葉，並破壞組織，再進行發酵。
本發明提供一種發酵茶葉，其特徵在於，混合茶的葉子和枇杷葉，並且磨碎，再進行發酵。
本發明提供一種發酵茶葉，其特徵在於，在茶的葉子和枇杷葉中加入水並粉碎攪拌混合，再進行發酵。
本發明提供一種提取本發明的發酵茶葉而得到的發酵茶葉提取物。
本發明提供一種含有本發明的發酵茶葉的飲食品。
本發明提供一種含有本發明的發酵茶葉提取液的飲食品。
本發明的飲食品適合作為抑制血糖值上升的飲食品。
本發明的飲食品適合作為用於預防或改善糖尿病的飲食品。
本發明的飲食品適合作為用於降低中性脂肪的飲食品。
本發明的飲食品適合作為用於降低膽固醇的飲食品。
本發明的飲食品適合作為用於降低血清過氧化脂質的飲食品。
本發明的飲食品適合作為用於抑制體內脂肪蓄積的飲食品。
本發明的飲食品適合作為用於抑制血壓上升的飲食品。
另外，本發明人等發現，以茶的葉子和枇杷葉作為原料製造的混合發酵茶葉的作為抑制血糖值上升作用指標的AGH抑制性(麥芽糖酶抑制性和蔗糖酶抑制性)高，並且在使用小鼠的實驗中發揮優異的抑制血糖值上升的效果，對這樣的帶來優異的抑制血糖值上升效果的有效成分的特定進行深入研究的結果發現，茶多酚(theasinensin)A、具有棓醯基的茶黃素衍生物、以表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素、以及兒茶素棓酸酯類氧化縮合的多酚P等各成分分別顯示高的AGH抑制性，所述多酚P在13C-NMR譜圖中顯示來自兒茶素A環的間苯三酚的信號和來自棓醯基的信號，其乙醯化物的分子量為1000～15000，並以2000為極大，以至完成本發明。
即，本發明提供一種用於抑制血糖值上升的組合物，其中含有選自下述物質中的1種以上茶多酚A、具有棓醯基的茶黃素衍生物、以表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素、以及兒茶素棓酸酯類氧化縮合的多酚P，該多酚P在13C-NMR譜圖中顯示來自兒茶素A環的間苯三酚的信號和來自棓醯基的信號，其乙醯化物的分子量為1000～15000，並以2000為極大。
優選的用於抑制血糖值上升的組合物中，還含有枇杷原花青素。
另外，本發明提供一種用於抑制血糖值上升的組合物，其中包含發酵茶葉，所述發酵茶葉含有選自下述物質中的1種以上茶多酚A、具有檣醯基的茶黃素衍生物、以表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素、以及兒茶素棓酸酯類氧化縮合的多酚P，該多酚P在13C-NMR譜圖中顯示來自兒茶素A環的間苯三酚的信號和來自棓醯基的信號，其乙醯化物的分子量為1000～15000，並以2000為極大。
優選的用於抑制血糖值上升的組合物中，上述發酵茶葉還含有枇杷原花青素。
另外，本發明提供一種用於抑制血糖值上升的組合物，其中包含發酵茶葉提取物，所述發酵茶葉提取物含有選自下述物質中的1種以上茶多酚A、具有棓醯基的茶黃素衍生物、以表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素、以及兒茶素棓酸酯類氧化縮合的多酚P，該多酚P在13C-NMR譜圖中顯示來自兒茶素A環的間苯三酚的信號和來自棓醯的信號，其乙醯化物的分子量為1000～15000，並以2000為極大。
優選的用於抑制血糖值上升的組合物中，上述發酵茶葉提取物還含有枇杷原花青素。
另外，本發明提供一種含有本發明的用於抑制血糖值上升的組合物的飲食品。
發明的效果 按照本發明，可以得到具有抑制血糖值上升的效果、預防或改善糖尿病的效果、降低中性脂肪的效果、降低膽固醇的效果、降低血清過氧化脂質的效果、抑制體內脂肪蓄積的效果、或抑制血壓上升的效果這樣的對於維持/改善健康有效的效果的新型的發酵茶葉、發酵茶葉提取物以及使用這些的飲食品。
另外，按照本發明，可以得到具有良好的抑制血糖值上升作用的組合物以及含有該組合物的飲食品。



圖1是示出本發明涉及的混合發酵茶葉提取物的高速液相色譜分析結果的圖。
圖2是示出本發明涉及的混合發酵茶葉的成分分離操作的例子的流程圖。
圖3是示出本發明涉及的混合發酵茶葉中含有的多酚的例子的圖。
圖4是示出用本發明涉及的混合發酵茶葉的成分分離操作得到的級分的高速液相色譜分析結果的圖。
圖5是示出用本發明涉及的混合發酵茶葉的成分分離操作得到的級分中含有的原花青素的推測結構和硫醇分解物的例子的圖。
圖6是示出本發明涉及的混合發酵茶葉提取物以及作為比較例的單獨發酵茶葉提取物的水溶性級分的高速液相色譜分析結果的圖。
圖7是示出本發明涉及的混合發酵茶葉提取物以及作為比較例的單獨發酵茶葉提取物的乙酸乙酯可溶級分的高速液相色譜分析結果的圖。
圖8是示出從本發明涉及的混合發酵茶葉中分離的氧化型高分子多酚級分及其硫醇分解物的高速液相色譜分析結果的圖。
圖9是示出從本發明涉及的混合發酵茶葉中分離的氧化型高分子多酚級分和枇杷原花青素的13C-NMR譜圖的圖。
圖10是示出實驗例2的結果的曲線圖。
圖11是示出實驗例3的結果的曲線圖。
圖12是示出實驗例4的結果的曲線圖。
圖13是示出實驗例8的結果的曲線圖。
圖14是示出實驗例13的結果的曲線圖。
圖15是示出實驗例13的結果的曲線圖。
圖16是示出實驗例13的結果的曲線圖。
圖17是示出實驗例13的結果的曲線圖。
圖18是示出臨床試驗例1的結果的曲線圖。
圖19是示出臨床試驗例1的結果的曲線圖。
圖20是示出臨床試驗例1的結果的曲線圖。
圖21是示出臨床試驗例1的結果的曲線圖。
圖22是示出臨床試驗例1的結果的曲線圖。
圖23是示出臨床試驗例1的結果的曲線圖。
圖24是示出臨床試驗例1的結果的曲線圖。
圖25是示出臨床試驗例1的結果的曲線圖。
圖26是示出臨床試驗例1的結果的曲線圖。
圖27是示出臨床試驗例1的結果的曲線圖。
圖28是示出臨床試驗例1的結果的曲線圖。
圖29是示出臨床試驗例1的結果的曲線圖。
圖30是示出臨床試驗例2的結果的曲線圖。

具體實施例方式 [I]首先，對本發明的發酵茶葉、發酵茶葉提取物、以及含有它們的飲食品進行說明。
在本發明中，作為原料使用的茶的葉子，是所說的山茶科的常綠灌木Thea sinensis L.的葉子。作為該葉子，除最初摘的新茶以外，還可以使用第二次摘的茶、第三次摘的茶、秋冬摘的茶、收割的茶等，優選含有比較多的多酚類的第二次摘的茶以後的廉價的茶的葉子。另外，這些遲割的粗茶現在價格低廉，相當一部分被廢棄，可以有效地利用該粗茶。
特別是，在後述的實驗例和分析試驗例中使用的長崎東彼杵產的中國種的茶葉，優選在藪北茶樹(ヤブキタ)種的茶葉中，由於含有在天然中被確認只存在很少的具有表阿夫兒茶精-3-O-檣酸酯為結構單元的原花青素，故優選。另外，作為可能含有具有表阿夫兒茶精-3-O-棓酸酯為結構單元的原花青素的茶葉，可以舉出用於製造印度產的大吉嶺紅茶和中國產的祁門(キ一モン)紅茶的茶葉。
如後面所述，該具有表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素具有高的AGH抑制性(麥芽糖酶抑制性和蔗糖酶抑制性)。
在本發明中，作為原料使用的枇杷葉是薔薇科、植物名「枇杷」的葉子，可以沒有特別限制地使用。
本發明的發酵茶葉(以下，也稱為混合發酵茶葉)如下所述進行製造。
首先，作為前處理，優選根據需要將枇杷葉和茶的葉子乾燥，製成含水率為50～60質量％左右。另外，優選切成適當的尺寸，例如1～10mm見方左右的大小。
然後，將茶的葉子乾燥，使水分量減少，並使之凋萎。在該工序中，可以使用如下方法，例如，使用粗揉機、直接用火或用電進行加熱的鍋或板狀的器具一邊攪拌茶的葉子，一邊將溫度為40～150℃的加熱空氣接觸茶的葉子的方法；將茶葉投入到密閉攪拌的容器內並抽吸容器內的空氣，使內部成為減壓的狀態並進行攪拌來乾燥的方法；使用凋萎槽並從散布在網上的茶葉的下方通氣的方法等。
通過該凋萎，如果使原料茶的葉子的含水率減少到45～65質量％、優選為50～60質量％左右，由於在下面的揉捏工序中難以從茶的葉子中揉出水分，因此可以防止有效成分的流失，同時可以抑制品質的降低。另外，在可以縮短後面的乾燥工序這點上，也是優選的。
接著，將經過了凋萎工序的原料的茶的葉子邊加壓邊揉搓(操捏)，同時，在揉捏時添加枇杷葉，將兩者一起揉捏，枇杷葉可以在開始揉捏茶的葉子的同時添加，或者也可以在進行了一段時間的僅揉捏茶的葉子之後，添加枇杷葉再進行揉捏。優選從揉捏開始經過總揉捏時間的0～40％的時間之後再添加枇杷葉。更加優選從揉捏工序的最初添加枇杷葉。
枇杷葉的添加量優選枇杷葉/茶的葉子的幹透質量比為5/95～35/65的範圍，更加優選8/92～30/70的範圍。如果枇杷葉的添加量為上述範圍內，通過混合茶的葉子和枇杷葉，可以良好地獲得抑制血糖值上升作用的提高效果。
揉捏可以適當採用使用在茶的葉子的揉捏中使用的通常的揉捏機的方法等公知的方法。
揉捏時間為15～25分鐘。通過設定為該範圍，可以使抑制血糖值上升的作用良好。
另外，揉捏時的原料的溫度為20～40℃。低於20℃發酵不足，超過40℃時，品質降低顯著。
通過該揉捏，茶的葉子和枇杷葉的組織被破壞，茶的葉子中含有的多酚氧化酶等氧化酶將茶的葉子和枇杷葉中含有的多酚氧化、聚合，生成氧化聚合物。
接著，將該狀態的混合原料轉移到發酵工序中。即，將揉捏後的混合原料以堆積成幾cm厚的狀態在溫度20～27℃、溼度30～60％RH的發酵室內等環境下靜置。另外，在茶類的製造工序中所說的「發酵」，是指通過葉中的氧化酶進行氧化反應的意思。
發酵時間為0～4小時。這裡，發酵時間為0小時是由於在先前的操捏工序中在開始揉捏的同時開始發酵，不將揉捏工序的時間包含在發酵工序中時，也可以稱發酵時間為0小時，實質上即使是0小時也進行發酵。發酵時間超過4小時時，得到的混合發酵茶葉或其提取物的味道、香氣有降低的傾向。為了得到特別優異的AGH抑制性，發酵時間優選1小時以下，最為優選0小時。
接著，經過規定的發酵時間後，加熱原料，停止發酵並進行乾燥。例如，將原料投入到連續式乾燥機中，並向其中吹入溫度80～120℃的熱風，使排氣溫度為50～60℃地進行操作。加熱時間為10～30分鐘左右就是充分的，由此，可以使原料中的含水率為5質量％左右。
在上述製造工序中，揉捏時間、發酵時間越長，AGH抑制性變得越低。另外，抗氧化作用(1，1-二苦基-2-苯基肼基(DPPH)消去活性)也變低。關注功能性來進行製造時，理想的是揉捏時間設定為15～25分鐘，並且發酵時間儘量短。
另外，關於味道，發酵時間越長苦澀感越變強，香氣也變差，發酵時間越短，味道、香氣也越優異。
這樣，可以得到混合發酵茶葉。加熱工序後的茶葉是所謂的粗茶(荒茶)，根據需要還可以對其實施精加工，製成精加工茶。精加工可以適當採用再乾燥、加熱、篩分、整形、分選等與以往的茶葉製造中的精加工同樣的工序。上述加熱是進行再次加熱來謀求增加香味的工序。通過進行精加工，可以提高貯存性、香氣等品質，從而可以使商品性提高。另外，還可以將粗茶或精加工茶製成適當的大小的粉末狀。
另外，如上所述，上述揉捏工序可以破壞茶的葉子和枇杷葉的組織，除了使用揉捏機的方法以外，還可以使用例如用手揉搓的方法、磨碎的方法、加入水進行粉碎的方法等來進行。
使用用手揉搓的方法時，通常可以適當使用揉混茶的葉子時使用的方法。例如，可以採用在被稱為「大張草蓆(ねこぶき)」的用粗繩編織的具有凹凸的鋪墊織物上用手揉混的方法等，也可以使用除此之外的方法。具體地，通過用手揉搓經過了凋萎工序的原料的茶的葉子的方法進行揉捏，同時在揉捏時添加枇杷葉，將兩者一起揉捏。此時的揉捏時間優選20～30分鐘，低於20分鐘或超過30分鐘時，得到的發酵茶的抑制血糖值上升的作用變低。其他條件等與上述相同。發酵工序可以與上述同樣地進行。
在本方法中，揉捏時間、發酵時間越長AGH抑制性變得越低。另外，抗氧化作用(DPPH消去活性)也變低。關注功能性來進行製造時，理想的是揉捏時間設定為20～30分鐘，並且發酵時間儘量短。
使用磨碎的方法時，可以採用使用茶的葉子的磨碎中使用的通常的乳缽的方法等，也可以使用除此之外的磨碎方法。具體地，磨碎經過了凋萎工序的原料的茶的葉子，同時在該磨碎混入時添加枇杷葉，磨碎混入兩種原料。此時的磨碎時間優選15～25分鐘，低於15分鐘或超過25分鐘時，得到的發酵茶的抑制血糖值上升的作用變低。磨碎時的原料的溫度為20～40℃。低於20℃發酵不充分，超過40℃時，品質降低。另外，枇杷葉的添加時間可以在茶的葉子開始磨碎的同時添加，或者也可以在進行一定時間的只磨碎茶的葉子之後，添加枇杷葉再進行磨碎。可以在從磨碎開始經過總磨碎時間的0～40％的時間之後再添加枇杷葉。其他條件等與上述相同。
這樣，通過磨碎，茶的葉子和枇杷葉的原料的組織被破壞，茶的葉子中含有的多酚氧化酶等氧化酶將茶的葉子和枇杷葉中含有的多酚氧化、聚合，生成氧化聚合物。發酵工序可以與上述同樣地進行。
在本方法中，磨碎時間、發酵時間越長AGH抑制性變得越低。另外，抗氧化作用(DPPH消去活性)也變低。關注功能性來進行製造時，理想的是磨碎時間設定為15～25分鐘，並且發酵時間儘量短。
另外，關於味道，發酵時間越長苦澀感變得越強，香氣也變差，發酵時間越短，味道、香氣也越優異。
使用加入水進行粉碎的方法時，可以通過向茶的葉子和枇杷葉中加入水並進行粉碎攪拌來將它們混合，同時破壞茶的葉子和枇杷葉的原料的組織。粉碎攪拌可以採用使用在茶的葉子的粉碎攪拌中使用的通常的混合器等的方法，也可以使用除此之外的粉碎攪拌方法。具體地，向經過了凋萎工序的原料的茶的葉子和枇杷葉中加入水並進行粉碎攪拌。茶的葉子和枇杷葉的混合比例與上述同樣。相對於茶的葉子和枇杷葉的總量100質量份，加入的水的量優選20～200質量份，更加優選50～150質量份。
粉碎攪拌時間為5～15分鐘，低於5分鐘或超過15分鐘時，得到的發酵茶的抑制血糖值上升的作用變低。粉碎攪拌時的原料的溫度與上述相同，為20～40℃。
枇杷葉的添加時間可以在開始粉碎攪拌的同時添加，或者也可以在進行一定時間的僅粉碎攪拌茶的葉子之後，添加枇杷葉再進行粉碎攪拌。優選在從粉碎攪拌開始經過總粉碎攪拌時間的0～50％的時間之後再添加枇杷葉。
這樣，通過粉碎攪拌，茶的葉子和枇杷葉被混合，同時，這些的原料組織被破壞，茶的葉子中含有的多酚氧化酶等氧化酶將茶的葉子和枇杷葉中含有的多酚氧化、聚合，生成氧化聚合物。
接著，在將通過粉碎攪拌得到的混合原料發酵的工序中，將粉碎攪拌後的混合原料以堆積成幾cm厚的狀態在溫度20～27℃、溼度30～60％RH的發酵室內等環境下靜置。發酵時間優選4～12小時。發酵時間低於4小時時，由於不進行發酵，因此抑制血糖值上升的作用低，並有青草味兒。發酵時間超過12小時時，得到的發酵茶的味道、香氣有降低的傾向。在重視藥效的情況下，優選4～12小時。即，發酵時間4～12小時的AGH抑制性特別高。另外，抗氧化作用(DPPH消去活性)也變高。關注功能性來進行製造時，理想的是粉碎攪拌時間保持在10～15分鐘，發酵時間保持在4～12小時。另外，關於味道，如果在該時間以外，則苦澀感變強，香氣也變差。
接著，經過規定的發酵時間後，加熱原料，停止發酵並進行乾燥。例如，將灌入了原料的容器放入到乾燥機中，並吹入溫度為80～120℃的熱風，使排氣溫度為50～60℃地進行操作。加熱時間優選60～120分鐘左右，由此，可以使原料中的水分量為5％左右。這樣，可以得到本發明的發酵茶，加熱工序後的發酵茶可以粉碎成粉末狀，也可以不進行粉碎而作為固體物使用。
作為這樣得到的混合發酵茶葉中含有的成分，可以舉出在後述的分析試驗例中分離的成分。
對於通過本發明的混合發酵茶葉而發揮的有助於藥效的有效成分的全部雖然還不明確，但通過後述的實驗例和分析試驗例可知，下述(1)～(4)的各成分顯示高的AGH抑制性(麥芽糖酶抑制性和蔗糖酶抑制性)。
(1)茶多酚A(以下，有時也簡記為TS-A)、 (2)具有檣醯基的茶黃素衍生物、 (3)具有表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素、 (4)兒茶素檣酸酯類氧化縮合的多酚P，該多酚P在13C-NMR譜圖中顯示來自兒茶素A環的間苯三酚的信號和來自檣醯基的信號，其乙醯化物的分子量為1000～15000，並以2000為極大(以下，有時也簡記為多酚P)。
(1)茶多酚A是具有圖3所示結構的化合物。
(2)具體地，具有檣醯基的茶黃素衍生物是選自茶黃素-3-O-棓酸酯(3-TFG)、茶黃素-3』-O-棓酸酯(3』-TFG)、茶黃素-3，3』-二-O-棓酸酯(3，3』-TFGG)中的1種以上。它們的結構示於圖3。這些當中，特別是，茶黃素-3，3』-二-O-棓酸酯的AGH抑制性更強。
(3)具有表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素包含在後述的分析試驗例3中的Fr.7中，通過採用巰基乙醇進行的硫醇分解，生成選自表兒茶酸(EC)、表棓兒茶酚(EGC)、表棓兒茶酚-3-O-棓酸酯(EGCg)、以及表兒茶酸-3-O-棓酸酯(ECg(以下，有時也記為ECG))中的1種以上、選自EGC-ME(以下，「-ME」表示「4-(2』-羥乙基硫代)醚」，例如，EGC-ME表示EGC的4-(2』-羥乙基硫代)醚，以下相同)、EC-ME、EGCg-ME以及ECg-ME中的1種以上、和表阿夫兒茶精-3-O-棓酸酯-ME。這樣的原花青素的硫醇分解前的結構推定為例如圖4所示結構。另外，(3)成分中的表阿夫兒茶精棓酸酯是指表阿夫兒茶精-3-O-棓酸酯。
該成分(3)來自於原料的茶的葉子，作為原料的茶的葉子，包含在使用含有(3)具有表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素的茶的葉子製造的混合發酵茶葉中。
上述(4)多酚P如例如後述的分析試驗例5所示，通過下述方法得到在室溫下用60％乙醇(濃度60體積％的乙醇水溶液，下同)提取含有多酚P的發酵茶葉，將提取液依次用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇進行溶劑分配，將可以溶解在正丁醇中的部分溶解在60％甲醇中，並將得到的物質用SephadexLH-20柱以60％甲醇、80％甲醇、100％甲醇、接著是甲醇-水-丙酮(8∶1∶1)混合溶液、甲醇-水-丙酮(6∶2∶2)混合溶液、水-丙酮(1∶1)混合溶液依次洗脫，再將得到的洗脫液進行薄層層析(甲苯-甲酸乙酯-甲酸、1∶7∶1)分析，只收集含有不從原點移動的物質的級分並進行濃縮。
另外，本發明的混合發酵茶葉的特徵是，含有枇杷原花青素。如後述的分析試驗例3所示，可以認為，在由AGH抑制性高的混合發酵茶葉的提取物得到的多個級分中，枇杷原花青素包含在AGH抑制性最高的級分(Fr.7)中，因此，有助於AGH抑制性。
另外，本發明的混合發酵茶葉的特徵是，通過添加枇杷葉，可以促進茶黃素類(茶黃素(TF)、茶黃素-3-O-棓酸酯(3-TFG)、茶黃素-3』-O-棓酸酯(3』-TFG)、茶黃素-3，3』-二-O-檣酸酯(3，3』-TFGG))的生成。
即，混合發酵茶葉中含有的茶黃素類的總的含量比除了未加入枇杷葉以外在相同條件下製造的茶的葉子的單獨發酵茶葉中含有的茶黃素類的總含量多，例如，為1.5倍以上，優選2倍以上，更加優選2.5倍以上。上限雖然沒有限制，但推測不能多於4倍。
例如，在後述的分析試驗例4以及圖7(發酵茶葉抽提物的乙酸乙酯可溶性級分的高速液相色譜(以下，有時簡記為HPLC)分析結果)中，混合發酵茶葉抽提物與單獨發酵茶葉抽提物相比，茶黃素類的峰面積的總計增加到約2.7倍，可知通過添加枇杷葉大幅促進了茶黃素類的生成。
另外，本發明的混合發酵茶葉的特徵是，通過添加枇杷葉促進了上述(4)成分(多酚P)的生成。
即，混合發酵茶葉中含有的多酚P的含量比除了未加入枇杷葉以外在相同條件下製造的茶的葉子的單獨發酵茶葉中含有的多酚P的含量多。例如，為1.2倍以上，優選2倍以上，更加優選3倍以上。上限雖然沒有限制，但推測不能多於4倍。
例如，在後述的分析試驗例4以及圖6(發酵茶葉抽提物的水溶性級分的HPLC分析結果)中，混合發酵茶葉抽提物與單獨發酵茶葉抽提物相比，作為基線的凸起而被檢測出的物質的峰面積增加到約1.59倍(159％)，可以認為該增加的部分來自通過添加枇杷葉而促進生成的兒茶酸氧化生成物。在分析試驗例5中，該兒茶酸氧化生成物相當於作為上述多酚P的特定的成分。
另外，本發明的混合發酵茶葉具有如下特徵的香氣成分組成含有1-己醇、反-2-己烯醛、乙酸3-己烯-1-醇酯、3-己烯-1-醇、裡哪醇、苯甲醛、水楊酸甲酯、香葉醇、以及橙花叔醇的香氣成分，在固相微提取法中，反-2-己烯醛、乙酸3-己烯-1-醇酯、3-己烯-1-醇、裡哪醇、苯甲醛、水楊酸甲酯、香葉醇、以及橙花叔醇的香氣成分的各峰面積均比1-己醇的峰面積大。
上述舉出的香氣成分中，如後述的分析試驗例10所示，裡哪醇、苯甲醛、水楊酸甲酯、香葉醇、以及橙花叔醇在紅茶等發酵茶中含有較多，在綠茶等非發酵茶以及發酵的枇杷葉中是少的香氣成分。另外，反-2-己烯醛、乙酸3-己烯-1-醇酯以及3-己烯-1-醇是在發酵的枇杷葉中較多含有的香氣成分。本發明的混合發酵茶葉以比較多的含量具有這些香氣成分，由此，可以品味到作為發酵茶的特有的香氣。
本發明的混合發酵茶葉，如後述的實驗例所示，顯示高的AGH抑制性，通過攝取該混合發酵茶葉，可以得到抑制血糖值上升的作用，並可以獲得預防或改善糖尿病的效果、降低中性脂肪的效果、降低膽固醇的效果、降低血清過氧化脂質的效果、抑制體內脂肪蓄積的效果、或抑制血壓上升的效果。優選同時獲得這些效果的2種以上，還可以同時得到全部的效果。
本發明的發酵茶葉提取物(以下，有時也稱為混合發酵茶葉提取物)是用提取溶劑將發酵茶葉的可溶性成分提取而得到的提取物。提取溶劑可以是水(包含溫水或熱水)，也可以是有機溶劑。作為有機溶劑的具體例子，可以舉出甲醇、乙醇、丙酮等。作為本發明的用於抑制血糖值上升的組合物的發酵茶葉提取物的形態，沒有特別限定，可以是溶液狀，也可以是其濃縮物，還可以是通過冷凍乾燥等乾燥的固體。固體的情況下，可以是塊狀，還可以是將其粉碎成適當的大小的粉末狀。將發酵茶葉提取物以含有有機溶劑的形態用於飲食品中時，可以使用乙醇作為有機溶劑。
提取條件沒有特別限制，但在用水進行提取時，優選將發酵茶葉浸在溫度為40～100℃的溫水或熱水中3分鐘～60分鐘左右來進行提取。水和發酵茶葉的比例優選相對於100質量份水，發酵茶葉(含水率5質量％)為0.5～20質量份左右，更加優選0.5～5質量份左右。
用有機溶劑進行提取時，優選相對於100質量份有機溶劑使用0.1～20質量份左右的發酵茶葉(含水率5質量％)，並在常壓或加壓下、在溫度-20～60℃、時間1～60分鐘的條件下進行，但並不限定於該範圍，可以適當變更。
提取處理後，通過過濾、離心分離等除去固體成分，得到提取液。
在混合發酵茶葉提取物中含有混合發酵茶葉的可溶性成分，如後述的實驗例和分析試驗例所示，顯示高的AGH抑制性。另外，如後述的實驗例和分析試驗例所示，通過攝取該混合發酵茶葉提取物，可以得到抑制血糖值上升的效果、預防或改善糖尿病的效果、降低中性脂肪的效果、降低膽固醇的效果、降低血清過氧化脂質的效果、抑制體內脂肪蓄積的效果、或抑制血壓上升的效果。優選的是同時獲得這些效果的2種以上，還可以同時得到全部的效果。
本發明的飲食品是含有混合發酵茶葉的飲食品、或者是含有混合發酵茶葉提取物的飲食品，並且只要是可以口服攝取形態的飲食品，則沒有特別限定。還可以含有混合發酵茶葉和混合發酵茶葉提取物兩者。
本發明的飲食品是例如含有混合發酵茶葉提取物的各種飲料。另外，混合發酵茶葉提取物是用水提取混合發酵茶葉而得到的提取物，如果具有可以直接飲用的風味，還可以將該提取物製成茶飲料。
另外，是將混合發酵茶葉和/或混合發酵茶葉提取物添加到各種食品原材料中的食品。作為食品原材料，沒有特別限定，涉及納豆、豆乳、醬、醬油等大豆食品；魚肉山芋丸子、魚糕、圓筒狀魚糕等熬煉的膏狀製品；火腿、香腸等肉制加工品；飴糖、奶糖、豆餡糯米點心、羊羹等點心類等多種食品原材料。
本發明的飲食品中的混合發酵茶葉和/或混合發酵茶葉提取物的含量是任意的，可以根據想要獲得的藥效的程度、以及期望的風味和攝取量適當設定。
例如，用於抑制血糖值上升的食品的情況下，可以以添加的混合發酵茶葉和混合發酵茶葉提取物各自的AGH抑制性(例如IC50)為基準，根據想要獲得的抑制血糖值上升效果、以及期望的風味和攝取量適當設定。
將用水提取發酵茶葉而得到的提取物直接製成茶飲料時，水和發酵茶葉的比例優選相對於100質量份的水，發酵茶葉(含水率5質量％)為0.5～20質量份左右。另外，提取方法優選浸在溫度為40～100℃的溫水或熱水中3分鐘～60分鐘的方法。
將發酵茶葉添加到食品原材料中的情況下，例如，相對於100質量份的食品原材料，發酵茶葉(含水率5質量％)在0.1～200質量份的範圍適當決定。
這樣的本發明的飲食品含有混合發酵茶葉和/或混合發酵茶葉提取物，通過攝取該物質，可以得到抑制血糖值上升的效果、預防或改善糖尿病的效果、降低中性脂肪的效果、降低膽固醇的效果、降低血清過氧化脂質的效果、抑制體內脂肪蓄積的效果、或抑制血壓上升的效果。優選的是同時獲得這些效果的2種以上，還可以同時得到全部的效果。
[II]接著，對本發明的用於抑制血糖值上升的組合物以及含有該組合物的飲食品進行說明。
本發明的用於抑制血糖值上升的組合物含有選自 (1)茶多酚A(以下，有時也簡記為TS-A)、 (2)具有棓醯基的茶黃素衍生物、 (3)具有表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素、 (4)兒茶素棓酸酯類氧化縮合的多酚P，該多酚P在13C-NMR譜圖中顯示來自兒茶素A環的間苯三酚的信號和來自棓醯基的信號，其乙醯化物的分子量為1000～15000，並以2000為極大(以下，有時也簡記為多酚P)中的1種或2種以上的成分。含有2種以上時的組合是任意的，更加優選含有全部4種。
如後述的實驗例和分析試驗例所示，這些(1)～(4)成分任何一種都是顯示高的AGH抑制性(麥芽糖酶抑制性和蔗糖酶抑制性)的成分。
含有這樣的成分的本發明的用於抑制血糖值上升的組合物，通過口服攝取，可以得到抑制血糖值上升的效果。
(1)～(4)成分的說明與上述相同。
本發明的用於抑制血糖值上升的組合物的優選的實施方式是含有上述(1)～(4)成分的1種以上的發酵茶葉或發酵茶葉提取物。
所謂發酵茶葉，是不進行採用加熱的氧化酶失活而是經過將作為原料的葉子進行揉捏的工序而得到的發酵茶葉，在製造過程中產生由於氧化酶產生的成分的氧化。作為本發明的用於抑制血糖值上升的組合物的發酵茶葉的形態，沒有特別限定，可以是將產生發酵的茶葉加熱來停止發酵，並進行乾燥的茶葉(所謂的粗茶)，另外，也可以是根據需要實施了精加工的精加工茶。另外，還可以將粗茶或加工茶製成適當大小的粉末狀。
所謂的發酵茶葉提取物，是用提取溶劑將發酵茶葉的可溶性成分提取而得到的提取物。提取溶劑可以是水(包含溫水或熱水)，也可以是有機溶劑。作為有機溶劑的具體例子，可以舉出甲醇、乙醇、丙酮等。作為本發明的用於抑制血糖值上升的組合物的發酵茶葉提取物的形態，沒有特別限定，可以是溶液狀，也可以是其濃縮物，還可以是通過冷凍乾燥等乾燥的固體。固體的情況下，可以是塊狀，還可以是將其粉碎成適當的大小的粉末狀。將發酵茶葉提取物以含有有機溶劑的形態用於飲食品中時，可以使用乙醇作為有機溶劑。
提取條件沒有特別限制，但在用水進行提取時，優選將發酵茶葉浸在溫度為40～100℃的溫水或熱水中3分鐘～60分鐘來進行提取。水和發酵茶葉的比例優選相對於100質量份水，發酵茶葉(含水率5質量％)為0.5～20質量份左右，更加優選0.5～5質量份左右。
用有機溶劑進行提取時，優選相對於100質量份有機溶劑，使用0.1～20質量份左右的發酵茶葉(含水率5質量％)，並在常壓或加壓下、在溫度-20～60℃、時間1～60分鐘的條件下進行，但並不限定於該範圍，可以適當變更。
提取處理後，通過過濾、離心分離等除去固體成分，得到提取液。
本發明中的發酵茶葉優選混合茶的葉子和枇杷葉並進行揉捏、發酵而形成的混合發酵茶葉。在該混合發酵茶葉中含有上述(1)茶多酚A、(2)具有棓醯基的茶黃素衍生物、以及(4)上述多酚P。
另外，作為原料的茶的葉子，由於在使用含有上述(3)具有表阿夫兒茶精檣酸酯為結構單元的原花青素的茶的葉子製造的混合發酵茶葉中含有全部上述(1)～(4)的成分，故更加優選。
在上述混合發酵茶葉的特徵是，含有枇杷原花青素。
枇杷原花青素的說明與上述相同。
另外，在上述混合發酵茶葉中，與茶的葉子和枇杷葉分別單獨同樣地揉捏、發酵而得到的單獨發酵茶葉相比，茶黃素類(茶黃素(TF)、茶黃素-3-O-檣酸酯(3-TFG)、茶黃素-3』-O-棓酸酯(3』-TFG)、茶黃素-3，3』-二-O-棓酸酯(3，3』-TFGG))的總含量更多。
另外，在上述混合發酵茶葉中，與茶的葉子和枇杷葉分別單獨同樣地揉捏、發酵而得到的發酵茶葉相比，(4)上述多酚P的含量更多。
上述混合發酵茶葉可以用以下的方法製造。
作為原料使用的茶的葉子和枇杷葉的說明與上述相同。
製造混合發酵茶葉的方法與上述相同。
本發明的用於抑制血糖值上升的組合物中的上述(1)茶多酚A、(2)具有棓醯基的茶黃素衍生物、(3)具有表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素、(4)多酚P的各成分的含量沒有特別的限定。可以以各成分具有的AGH抑制性(例如IC50)為基準，根據想要獲得的抑制血糖值上升效果、以及該用於抑制血糖值上升的組合物的攝取量適當設定。
本發明的飲食品含有本發明的用於抑制血糖值上升的組合物，並且，只要是可以口服攝取的形態的飲食品即可，沒有特別限定。
例如，含有作為本發明的用於抑制血糖值上升的組合物的發酵茶葉提取物的各種飲料。另外，該發酵茶葉提取物是用水提取發酵茶葉而得到的提取物，如果具有可以直接飲用的風味，還可以將該提取物製成茶飲料。
另外，是將作為本發明的用於抑制血糖值上升的組合物的發酵茶葉或發酵茶葉提取物添加到各種食品原材料中的食品。作為食品原材料，沒有特別限定，涉及納豆、豆漿、豆醬、醬油等大豆食品；魚肉山芋丸子、魚糕、圓筒狀魚糕等熬煉的膏狀製品；火腿、香腸等肉制加工品；飴糖、奶糖、豆餡糯米點心、羊羹等點心類等多種食品原材料。
本發明的飲食品中的用於抑制血糖值上升的組合物的含量是任意的，可以以用於抑制血糖值上升的組合物本身具有的AGH抑制性(例如IC50)為基準，根據想要獲得的抑制血糖值上升的效果、以及期望的風味和攝取量適當設定。
例如，將用水提取發酵茶葉而得到的提取物直接製成茶飲料時，水和發酵茶葉的比例優選相對於100質量份的水，發酵茶葉(含水率5質量％)為0.5～20質量份左右。另外，提取方法優選浸在溫度40～100℃的溫水或熱水中3分鐘～60分鐘的方法。
另外，將發酵茶葉添加到食品原材料中時，例如，相對於100質量份的食品原材料，發酵茶葉(含水率5質量％)可以在0.1～200質量份的範圍適當決定。
這樣的含有本發明的用於抑制血糖值上升的組合物的飲食品，可以通過攝取該用於抑制血糖值上升的組合物而獲得抑制血糖值上升的效果。
實施例 在以下的實驗例和分析試驗例中，只要沒有特別說明，「％」為「質量％」。
以下的實驗例和分析試驗例中使用的原料的「茶的葉子」，均為長崎縣綜合農林試驗場東彼杵茶葉支場栽培的ヤブキタ種的第三次摘的茶的葉子。另外，只要沒有特別說明，揉捏是使用揉捏機進行。
另外，實施例1、分析試驗例1～5中的AGH抑制性的評價依照由松井等人提出的使用了游離AGH的方法(J.Agric.Food Chem.，47，550-553，(1999))進行，並且用α-葡糖苷酶(AGH)酶活性的抑制率(單位％)來表示測定結果。
[實驗例1] (混合發酵茶葉的製造) 將枇杷葉投入到茶的葉子中，用揉捏機揉混。茶的葉子和枇杷葉的混合比例為茶的葉子∶枇杷葉的質量比為90∶10(枇杷投入比例為10％)和75∶25(枇杷投入比例為25％)2種。揉混時間為20分鐘和40分鐘兩種。
此後，經過0小時、1小時、2小時、4小時、6小時、24小時的6種發酵工序，得到24種混合發酵茶葉。另外，發酵工序0小時的茶葉是揉混剛結束時得到的混合發酵茶葉。
(感觀審查) 由具有綠茶的感觀審查經驗的3名參加者按照綠茶的審查方法對上述得到的24種混合發酵茶葉進行香氣和味道的評判。審查時，是在審查茶碗中加入3g混合發酵茶葉並注入180ml熱水，在注入熱水後對香氣進行評判，在5分鐘後對味道進行審查，結果示於表1。
[表1]
·香氣、味道分別以5分為滿分 ·綠茶的感觀審查中，最初摘的新茶為6～7分、第二次摘的茶為稍低於5分、第三次摘的茶為5分 如表1的結果所示，關於味道、香氣，在揉捏時間20分鐘、發酵時間0～4小時時，香氣濃，並且後味清爽，優異。揉捏時間為40分鐘時，味道降低，發酵時間為6小時以上時，香氣的惡化明顯。
(AGH活性的測定) 在上述得到的24種混合發酵茶葉中，對除了發酵時間為6小時和24小時的混合發酵茶葉以外的16種，測定在100℃的熱水中提取10分鐘而得到的提取液(混合發酵茶葉使用量2.0mg/ml)的AGH抑制性。結果示於表2。
另外，將市售的綠茶、枇杷茶、番石榴茶、紅茶分別同樣地用熱水提取，並對提取液同樣地測定AGH抑制性。結果示於表3。
[表2]
[表3] 如表2所示，AGH抑制性為，枇杷葉相對於茶的葉子的配合比例變多時，抑制率變低，即使揉捏時間長也變低。另外，隨著發酵時間變長，抑制率有變低的傾向。
另外，由表2、3的結果可知，特別是在枇杷葉的配合比例為10質量％、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0～1小時，以及枇杷葉的配合比例為25質量％、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0小時的條件下，可以得到比綠茶優異的AGH抑制性。
[分析試驗例1] 在室溫下用70％丙酮(濃度70體積％的丙酮水溶液，下同)提取在表2中顯示優異的AGH抑制性的混合發酵茶葉(茶的葉子和枇杷葉的配合比例為9∶1、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0小時)，將提取液濃縮製成水溶液後，加入乙醚進行溶劑分配，除去葉綠素等脂溶性成分。得到的水層用高速液相色譜(HPLC)進行分析，結果示於圖1。
如圖1所示，除了作為綠茶成分的咖啡因、表兒茶酸(EC)、表檣兒茶酚(EGC)、表棓兒茶酚-3-O-檣酸酯(EGCg)、以及表兒茶酸-3-O-棓酸酯(ECg)以外，還檢測出了由這些兒茶素的氧化而生成的二聚體茶多酚C、茶多酚E、茶多酚A、茶多酚D(與EGCg重合)、茶黃素類(包含茶黃素(TF)、茶黃素-3-O-棓酸酯(3-TFG)、茶黃素-3』-O-棓酸酯(3』-TFG)、茶黃素-3，3』-二-O-棓酸酯(3，3』-TFGG))的峰。另外，還發現了作為基線的凸起被檢測出的兒茶素氧化生成物的存在。
[分析試驗例2] 使在表2中顯示優異的AGH抑制性的混合發酵茶葉(茶的葉子和枇杷葉的配合比例為9∶1、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0小時)乾燥，並將該乾燥發酵茶葉按照圖2所示的程序分級。
將125g乾燥發酵茶葉(含水率5質量％)與2L 70％的丙酮一起在破碎機(製品名；旋轉混合機7011S型，FMI(エフ·エム·アイ)公司製造)中破碎，過濾。用3L 70％的丙酮提取殘渣，得到丙酮提取液，然後，用3L甲醇提取殘渣，得到甲醇提取液。將上述過濾得到的濾液、上述丙酮提取液、上述甲醇提取液合併，用旋轉式蒸發器濃縮後，乾燥，得到59.9g提取物(乾燥物)。
將得到的提取物懸浮在水中，加入乙醚進行溶劑分配，除去葉綠素等脂溶性成分。
將操作(2)得到的水層灌入到用水製備的Sephadex LH-20柱(フアルマシア フアイン ケミカル公司製造，4cm×28cm)中，依次用水(500mL)、40％甲醇(200mL)、60％甲醇(300mL)、80％甲醇(300mL)、甲醇(300mL)、60％丙酮(500mL)洗脫。
將洗脫液濃縮，分級成級分Fr.1(18.66g)、Fr.2(5.79g)、Fr.3(3.12g)、Fr.4(4.87g)、Fr.5(6.01g)、Fr.6(3.55g)、Fr.7(2.07g)。
對各級分測定AGH抑制活性時，如下述表4所示，Fr.6和Fr.7顯示非常高的抑制率。
[表4] 因此，再用圖2所示的操作對Fr.6和Fr.7進行分離純化。
對Fr.6和Fr.7，分別加載在MCIgelCHP20P(三菱化學公司製造，3cm×28cm)，依次用20％甲醇(100mL)、30％甲醇(100mL)、40％甲醇(100mL)、50％甲醇(100mL)、60％甲醇(100mL)、70％甲醇(100mL)、80％甲醇(100mL)、90％甲醇(100mL)、甲醇(200mL)洗脫。
濃縮得到的洗脫液，由Fr.6得到Fr.6-1(899mg)、Fr.6-2(2.16g)、Fr.6-3(282mg)的級分。另外由Fr.7得到Fr.7-1(67mg)、Fr.7-2(1.17g)、Fr.7-3(600mg)的級分。
其中，Fr.6-1和Fr.7-1測定氫核磁共振(1H-NMR)譜圖，通過與標準品的譜圖進行比較，分別鑑定為茶多酚A和茶多酚D。由HPLC和薄層層析的結果，Fr.6-3和Fr.7-3均鑑定為茶黃素類。
將Fr.6-2和Fr.7-2合併的物質加載在ChromatorexODS(富士シリシア公司製造，3cm×30cm)，依次用10％甲醇(100mL)、20％甲醇(100mL)、30％甲醇(100mL)、40％甲醇(100mL)、50％甲醇(100mL)、60％甲醇(100mL)、甲醇(200mL)洗脫。
將得到的洗脫液濃縮，分級成Fr.721(179mg)、Fr.722(1.10g)、Fr.723(530mg)、Fr.724(1.27g)。
其中，Fr.721測定1H-NMR譜圖，鑑定為EGCg和茶多酚A的混合物。
將Fr.722和723合併的物質灌入到Sephadex LH-20柱(3cm×20cm)中，依次用乙醇(500mL)、90％乙醇(200mL)、20％甲醇(300mL)、60％丙酮(400mL)洗脫。
將得到的洗脫液濃縮，分級成Fr.7221(3.7mg)、Fr.7222(41.3mg)、Fr.7223(47.0mg)、Fr.7224(166.2mg)、Fr.7225(458mg)、Fr.7226(657.5mg)。
其中，Fr.7221、Fr.7222、Fr.7223、Fr.7224測定1H-NMR譜圖，通過與標準品的譜圖進行比較，分別鑑定為沒食子酸、ECg、EGCg、表棓兒茶酚-3，3』(4』)-O-棓酸酯。
將Fr.7225加載在DiaionHP20SS(三菱化學公司製造，2cm×20cm)，依次用20％甲醇(100mL)、25％甲醇(100mL)、30％甲醇(100mL)、35％甲醇(100mL)、40％甲醇(100mL)、45％甲醇(100mL)、50％甲醇(100mL)、60％甲醇(100mL)、甲醇(200mL)洗脫。
將得到的洗脫液濃縮，分級成Fr.72251(39.6mg)、Fr.72252(320mg)、Fr.72253(47.7mg)。
其中，Fr.72251測定1H-NMR譜圖，通過與標準品的譜圖進行比較，鑑定為烏龍茶氨酸(ウ一ロンテアニン)。
將Fr.72252加載在ChromatorexODS(富士シリシア公司製造，2cm×20cm)，依次用10％甲醇(100mL)、20％甲醇(100mL)、30％甲醇(100mL)、40％甲醇(100mL)、50％甲醇(100mL)、60％甲醇(100mL)、甲醇(200mL)洗脫。
將得到的洗脫液濃縮，分級成Fr.722521(10.5mg)、Fr.722522(38.3mg)、Fr.722523(60mg)。
其中，Fr.722521測定1H-NMR譜圖，鑑定為表棓兒茶酚-3，3』(4』)-O-棓酸酯。
將Fr.722523灌入到Sephadex LH-20柱(1.5cm×20cm)中，依次用80％甲醇(200mL)、90％甲醇(200mL)、甲醇(200mL)、60％丙酮(200mL)洗脫。
將得到的洗脫液濃縮，分級成Fr.7225231(14.4mg)、Fr.7225232(16.1mg)、Fr.7225233(15.5mg)。
其中，Fr.7225232測定1H-NMR譜圖，通過與標準品的譜圖進行比較，鑑定為棓醯基烏龍茶氨酸。
由這些結果可知，AGH抑制活性高的Fr.6和7的下述級分中分別含有下述化合物。下述化合物的結構示於圖3。
Fr.6-1茶多酚A(TS-A)、 Fr.6-3、7-3茶黃素(TF)混合物(包含茶黃素、茶黃素-3-O-棓酸酯、茶黃素-3』-O-棓酸酯、茶黃素-3，3』-二-O-檣酸酯)、 Fr.7-1茶多酚D(TS-D)、 Fr.7221沒食子酸、 Fr.7222表兒茶酸-3-O-棓酸酯(ECg)、 Fr.7223表棓兒茶酚-3-O-檣酸酯(EGCg)、 Fr.7224和Fr.722521表棓兒茶酚(EGC)-3，3』(4』)-二-O-棓酸酯、 Fr.72251烏龍茶氨酸、 Fr.7225232棓醯基烏龍茶氨酸。
另外，將上述各化合物的含量定量的結果示於圖2中。由該結果可知，AGH抑制活性高的Fr.6的主要成分為茶多酚A。另外可知，AGH抑制活性高的Fr.7的主要成分為茶黃素(TF)混合物。分別測定該茶黃素混合物中含有的上述茶黃素類的AGH抑制活性時，特別是，茶黃素-3，3』-O-棓酸酯顯示強的酶抑制活性。這可由後述的分析試驗例5、6的結果知道。
[分析試驗例3] 對在上述分析試驗例2中顯示非常高的AGH抑制活性的Fr.7進行HPLC分析，結果示於圖4A。分析條件為 柱Cosmosil 5C18 ARII(ナカライテスク公司製造，4.6×250mm) 柱溫度35℃ 移動相A；50mM磷酸、B；CH3CN、B 4％到30％(39分鐘)、30％到75％(15分鐘) 流速0.8ml/min 檢測採用光電二極體陣列檢測(Max absorbance)。
(另外，在以下的分析試驗例中的HPLC分析條件，只要沒有特別說明，與本試驗例相同)。
由該圖的結果可以明確在Fr.7中，除了在上述分析試驗例2中確定存在的茶黃素混合物以及上述化合物以外，還含有相當多的在薄層層析(TLC)分析中作為原點檢測出的、以及在HPLC分析中作為基線的凸起檢測出的物質。這些物質主要被分級在圖2中的Fr.724中。
由於這些物質在各種柱色譜中的行為以及紫外可見吸收光譜與EGCg類似，並且對氯化鐵試劑和香草醛鹽酸試劑為陽性，因此，推測為分子量比上述分析試驗例2中確定存在的兒茶素類大的兒茶素氧化生成物。
通常已知，在茶所含有的高分子多酚的典型的物質中存在原花青素，在枇杷葉中含有以表兒茶精為結構單元的原花青素(枇杷原花青素)，因此，推測在上述Fr.7中的「分子量大的兒茶素氧化生成物」中含有原花青素。
原花青素是以兒茶素或兒茶素衍生物為結構單元的二聚體或聚合物，構成其的兒茶素或兒茶素衍生物的4位的碳(C-4)和8位的碳(C-8)、或4位的碳(C-4)和6位的碳(C-6)進行碳-碳結合。
因此，為了明確上述Fr.7中含有的構成原花青素的單元，按照下述方法對Fr.7進行了採用巰基乙醇的硫醇分解。
即，在0.2mL的Fr.7的60％乙醇溶液(Fr.7的濃度10mg/mL)中加入1.8mL巰基乙醇試液(混合了2.5mL巰基乙醇、4mL的0.1％鹽酸、27.5mL乙醇、16mL水的溶液)，在60℃下加熱6小時，用HPLC分析20μL的反應液。分析條件與獲得圖4A時相同。這樣得到的硫醇分解後的譜圖示於圖4B。
如該圖4B所示，將Fr.7進行硫醇分解時，出現了很多在分解前(圖4A)中沒有發現的峰。對於在分解前未發現的峰以及比分解前增大的峰，進行與標準品(Tanaka，T.et.al.，J.Chem.Soc.Perkin Trans 1，1994，3013)的保持時間和紫外線吸收光譜的比較的結果，鑑定了EGC、EC、EGCg、ECg、EGC-ME、EC-ME、EGCg-ME、ECg-ME。
另外，在圖4B中，將Fr.7(500mg)溶解在10mL巰基乙醇試液中，加熱6小時後，用Chromatorex ODS(富士シリシア公司製造)(水-甲醇洗脫液)柱色譜、接著用Sephadex LH-20(EtOH洗脫液)柱色譜分離純化，通過1H-NMR譜圖的分析結果可以明確，在39分鐘檢測出的峰是表阿夫兒茶精-3-O-檣酸酯-ME。表阿夫兒茶精-3-O-棓酸酯-ME的結構式示於圖5。
即，在1H-NMR譜圖中，雖然A環、C環、棓醯基以及羥乙基硫基的信號與EGCg-ME的信號幾乎相同，但觀察到B環的信號為在d7.40和6.81處均為積分面積相當於2H的雙重峰(J＝8Hz)，這表示B環為對羥基苯酚。另外，在TOF(飛行時間型)質譜分析中，在m/z 503處顯示[M+H]+峰也支持該結論。
這些鑑定的結構單元中，EGC、EGCg、ECg來自於高分子化合物的末端單元，硫醚化合物來自於延長單元。因此，硫醇分解前的高分子化合物的結構，即推測上述Fr.7中含有的原花青素的結構為具有例如圖5所示的結構。
迄今為止，以表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素只知道1種從烏龍茶得到的二聚體(Hashimoto，F.et.al.，Chem.Pharm.Bull.，1989，37，3255-3263)。通常，二聚體雖然在HPLC中作為明確的峰被檢測出，但在Fr.7的HPLC中，由於未發現相當於可以說明表阿夫兒茶精-3-O-棓酸酯-ME的生成量的程度的二聚體的峰，因此，Fr.7通過硫醇分解而生成的表阿夫兒茶精-3-O-棓酸酯-ME可以說是來自於三聚體以上的原花青素低聚物或聚合物。該「以表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素(三聚體以上的低聚物或聚合物)」是迄今為止未知的新型的化合物。
另外，對於除了不加入枇杷葉而只使用茶的葉子以外同樣地製造的發酵茶葉進行同樣的分析試驗，比較硫醇分解後得到的硫醚化合物時，混合枇杷葉的情況、不混合枇杷葉的情況，以幾乎同樣的大小檢測出表阿夫兒茶精-3-O-棓酸酯-ME的峰。另外，即使將從枇杷葉中提取的原花青素進行硫醇分解，也未檢測出表阿夫兒茶精-3-O-棓酸酯-ME。由此可知，Fr.7中含有的「以表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素」來自於茶的葉子。
另外，與不混合枇杷葉的情況相比，混合枇杷葉時的EC-ME的峰明顯大。由此可知，枇杷葉中含有的「以表兒茶精為結構單元的原花青素(枇杷原花青素)」包含在AGH抑制性高的Fr.7中。
[分析試驗例4] 如圖4B所示，將AGH抑制性高的Fr.7進行硫醇分解後，仍殘留基線的凸起。
這顯示出，在Fr.7中，除了上述分析試驗例3所述的「以表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素」和「枇杷原花青素」以外，還存在HPLC分析中作為基線的凸起被檢測出的物質。
因此，比較了在混合了茶的葉子和枇杷葉的情況下的混合發酵茶葉和除了不混合枇杷葉以外在同樣情況下的發酵茶葉(以下，有時稱為單獨發酵茶葉)中，在HPLC分析中作為基線的凸起被檢測出的物質的生成量是否相同。另外，混合發酵茶葉的製造條件與分析試驗例1、2相同，茶的葉子和枇杷葉的混合比例為9∶1、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0小時。
對於混合發酵茶葉和單獨發酵茶葉，分別在室溫下用100mL 70％的丙酮提取3g茶葉(含水率5質量％)(提取時間為18小時)，然後進行過濾。將濾液濃縮製成水溶液(20mL)，然後，用乙醚、乙酸乙酯各進行2次溶劑分配。
將殘留的水層濃縮後，用70％乙醇製成30mL，用HPLC對其10μL進行分析。該水層的HPLC分析結果示於圖6。
如該圖所示，與單獨發酵茶葉相比，混合發酵茶葉的作為基線凸起被檢測出的物質的量明顯多。比較峰面積時，在混合發酵茶葉中作為基線凸起被檢測出的物質的量估計為單獨發酵茶葉的159％。該增加部分雖然也包含來自枇杷葉的原花青素，但由於在混合發酵茶葉中的枇杷葉的添加量只為茶的葉子的十分之一的量，因此不能說明只是因原本包含在枇杷葉中的成分就增加59％。因此，該增加部分顯示出由於添加枇杷葉而促進生成，不添加枇杷葉時就不會生成的兒茶素氧化生成物的存在。
另一方面，將上述得到的乙酸乙酯層濃縮後，用80％甲醇製成30mL後，將其中1mL在ODS短柱(TOYOPAK ODS M、TOSO、東ソ一公司製造)中用80％甲醇導通，將洗脫液製成5.0mL，將其中5μL用HPLC進行分析。該乙酸乙酯層的HPLC分析結果示於圖7。
如該圖所示，與單獨發酵茶葉相比，混合發酵茶葉的茶黃素類的峰面積合計增加到2.7倍。另一方面，兒茶素類的峰面積減少，具體地，EGC減少到0.24倍、EC減少到0.44倍、EGCg減少到0.57倍、ECg減少到0.64倍。
這顯示出，在混合發酵茶葉中，通過在茶葉中添加揉混枇杷葉，生成大量高分子的兒茶素氧化生成物。
[分析試驗例5] 由分析試驗例4的結果可知，在混合發酵茶葉中，通過在茶葉中添加揉混枇杷葉，大量生成高分子的兒茶素氧化生成物，其在HPLC分析中作為基線凸起被檢測出，即，在薄層層析(TLC)分析中作為原點被檢測出。
因此，為了鑑定在這樣的混合發酵茶葉中特異地增加的成分，按照以下的方法，在混合發酵茶葉(茶的葉子和枇杷葉的混合比例為9∶1、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0小時)中含有的成分中，分離在薄層層析(TLC)分析中作為原點被檢測出氧化型高分子多酚。
即，在室溫下用3L 60％乙醇提取228g混合發酵茶葉(含水率為5質量％)3次，將3次的提取液合併減壓濃縮。將得到的水溶液(1.5L)依次用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇進行溶劑分配，得到乙醚可溶部分(4.03g)、乙酸乙酯可溶部分(9.8g)、正丁醇可溶部分(22.1g)。
將15g正丁醇可溶部分溶解在60％甲醇中，並加載在用60％乙醇調溼的Sephadex LH-20柱上，依次用60％甲醇、80％甲醇、100％甲醇、接著是甲醇-水-丙酮(8∶1∶1)混合溶液、甲醇-水-丙酮(6∶2∶2)混合溶液、水-丙酮(1∶1)混合溶液進行洗脫。將洗脫液進行TLC(甲苯-甲酸乙酯-甲酸、1∶7∶1)分析，只收集含有未離開原點的物質的級分並進行濃縮，得到1.4g聚合物狀的物質(氧化型高分子多酚級分)。其HPLC分析結果示於圖8A中。
在圖8A中，從其UV吸收看，在45分鐘附近的小峰表示混合存在茶黃素類，但峰面積為基線凸起全部的2％以下。
對這樣得到的聚合物狀物質(氧化型高分子多酚級分)測定AGH抑制性。其結果示於表5。
另外，對於茶黃素-3，3』-二-O-棓酸酯的AGH抑制性的測定結果也合併示於表5中。
[表5] 如表5所示，用上述方法從混合發酵茶葉中分離的氧化型高分子多酚級分，即，在混合發酵茶葉中特異地增加的高分子多酚顯示與茶黃素-3，3』-二-O-棓酸酯同等強度的麥芽糖酶和蔗糖酶抑制活性。從含量考慮，該活性不是來自於混入的茶黃素類(45分鐘附近的峰)，而是來自於高分子多酚。
另外，對於上述得到的氧化型高分子多酚級分，按照下述方法進行採用巰基乙醇的硫醇分解。
即，將0.2mL使上述得到的氧化型高分子多酚溶解在60％乙醇中的溶液(氧化型高分子多酚的濃度10mg/mL)和0.8mL巰基乙醇試液混合，在60℃下反應5小時，用HPLC分析其中5μL。其結果示於圖8B。
在上述分析試驗例3中，與將Fr.7硫醇分解得到的物質進行HPLC分析時同樣地，檢測出以表阿夫兒茶精-3-O-棓酸酯-ME為首的硫醚化合物和兒茶素類的峰。另外，在圖8B中，在硫醇分解後還觀察到基線的凸起。
從該情況暗示了，在上述得到的氧化型高分子多酚級分中含有上述的具有表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素，但其含有比例少，含有相當量的未被硫醇分解的物質。
因此，測定該氧化型高分子多酚級分的13C-NMR譜圖，並將其與在枇杷葉中含有的「以表兒茶精為結構單元的原花青素(枇杷原花青素)」的13C-NMR譜圖進行比較。其結果示於圖9。圖9A為枇杷原花青素的譜圖，圖9B是上述氧化型高分子多酚級分的譜圖。
由圖9的結果可知，在枇杷原花青素中觀察到來自兒茶酚環型B環(Bc)的信號，與此相反，在從混合發酵茶葉中分離的氧化型高分子多酚中幾乎未觀察到來自B環的信號，但觀察到來自對應於兒茶素的A環的間苯三酚(1，3，5-三羥基苯)的信號、以及來自於棓醯基的焦棓酚1，2，3-三羥基苯)的信號，雖然小但也確認到部分來自C環的信號。
由此可知，用上述方法從混合發酵茶葉中分離的氧化型高分子多酚的主要成分不是枇杷原花青素，而是在B環部分具有各種結構的兒茶素衍生物氧化縮合而高分子化的物質。
這樣的高分子多酚的結構雖然還不明確，但由圖3所示的化合物類推，可以認為主要是兒茶素棓酸酯類的B環彼此氧化縮合而高分子化的結構。作為B環的結合方式，可以推測有圖3所示的茶多酚、茶黃素、烏龍茶氨酸等各種類型，但現在其具體情況還不明確。
另外，將該氧化型高分子多酚進行元素分析的結果，碳為57.06％、氫為4.51％、氮為0.35％。
與EGCg的計算值(C22H18O11碳為57.65％、氫為3.96％；C22H18O11·2H2O碳為53.44％、氫為4.49％)相比，含氫率高，由於在通常的氧化中含氫率應該減少，因此，暗示在兒茶素氧化的過程中，有混入其他的代謝產物的可能性。
另外，將得到的氧化型高分子多酚進行乙醯化之後，通過凝膠滲透色譜測定分子量時，峰頂分子量為2000(數均分子量為1400，質量平均分子量為3200)，分子量分布寬，為1000～15000左右。
凝膠滲透色譜的測定條件如下。
柱TSK-gel G 4000H6，直徑4.6mm×長度250mm，東ソ一公司製造 泵TOSO DP8020，東ソ一公司製造 檢測器JASCO UV970日本分光公司製造，254nm 移動層四氫呋喃 溫度室溫 流速1.0mL/min 通過與標準聚苯乙烯的比較的分子量計算JASCO 807IT積分儀，日本分光公司製造。
另外，從兒茶素類推，由於乙醯化引起的分子量增加部分為1.5倍時，分子量為以1330為極大值的670～10000。如果假定只由兒茶素棓酸酯生成，則含有相當於二聚體的物質(茶黃素)到相當於20聚體的物質。
[分析試驗例6] 將EC、ECG、EGC、EGCg、茶黃素(TF)、3-TFG、3』-TFG、3，3』-TFGG以及茶多酚A(TS-A)的純品(市售品)溶解在由DMSO(二甲亞碸)∶水＝1∶9製成的混合溶劑中，製備試樣溶液，對各試樣溶液進行AGH抑制活性測定。
本試驗例和分析試驗例7中的AGH抑制性的評價按照使用了將大鼠小腸AGH固定化的載體的pseudo-in vivo法(T.Oki.et.al.，Biol.Pharm.Bull.，23，1084-1087(2000))進行，酶活性以50％抑制的終濃度(IC50值，單位mM)表示。其結果示於表6。
[表6]
由表6的結果可以明確，麥芽糖酶抑制性強的是ECG、EGCG、3-TFG、3，3』-TFGG，蔗糖酶抑制性強的是ECG、EGCG、3，3』TFGG。即，兒茶素中的酯型、茶黃素中具有包含棓醯基的多取代OH基的分子結構的物質的AGH抑制性更強。
[分析試驗例7] 用1000mL 100℃的熱水將20g混合發酵茶葉(茶的葉子和枇杷葉的混合比例為9∶1、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0小時，含水率為5質量％)提取10分鐘，將離心分離而得到的上清液冷凍乾燥，並將冷凍乾燥得到的物質作為試料，調查AGH抑制性。
將試料溶解在DMSO∶水＝1∶9的混合溶劑中，製備試樣溶液，關於該試樣溶液，採用上述的pseudo-in vivo法測定AGH抑制性。另外，測定該試樣溶液中含有的兒茶素類(EC、ECG、EGC、EGCg)以及茶黃素類(TF、3-TFG、3』-TFG、3，3』-TFGG)的含量。然後，基於在上述分析試驗例6中測定的IC50值，求出將由混合發酵茶葉發揮的AGH抑制性作為100％時的由各成分發揮的AGH抑制性的比例(活性貢獻率，單位％)。麥芽糖酶抑制性的結果示於表7，蔗糖酶抑制性的結果示於表8。
[表7] (1)麥芽糖酶抑制性
[表8] (2)蔗糖酶抑制性
[分析試驗例8] 用1L 100℃的熱水將20g與分析試驗例7同樣的混合發酵茶葉提取10分鐘。將提取液過濾，用蒸發器將得到的濾液濃縮後，冷凍乾燥。在乾燥後的粉末10mg中添加1ml水，攪拌後，進行離心處理(3000rpm，10分鐘)，得到上清、即水溶性級分。測定該水溶性級分的AGH抑制性。其結果示於表9。
另外，本分析試驗例中的AGH抑制性的測定採用使用了上述游離AGH的in vitro法(Oki.T.et.al.，J.Agric.Food Chem，47，550-553(1999))進行。
[表9] 由表9的結果可知，混合發酵茶葉的熱水提取物的水溶性級分顯示高的AGH抑制性。
因此，再用下述方法對該顯示高的AGH抑制性的熱水提取物的水溶性級分進行成分分離操作。
即，將該熱水提取物的水溶性級分供給到使用了SephadexLH-20(Amersham Biosciences製造)的吸附色譜法中。洗脫以水、50％甲醇、100％甲醇、70％丙酮的順序進行，對於將得到的各種級分進行冷凍乾燥得到的物質，與上述同樣地進行AGH抑制性測定。各級分的收率和AGH抑制性示於下述表10。另外，在表10中還合併示出表9的測定結果。
[表10] 如表10所示，混合發酵茶葉熱水提取物的水溶性級分中，特別是70％丙酮洗脫級分和100％甲醇洗脫級分的AGH抑制性高。
因此，通過凝膠滲透色譜法對該70％丙酮洗脫級分和100％甲醇洗脫級分測定分子量時，明確了這些AGH抑制性特別高的兩級分中含有的成分處於分子量100～1500的範圍。
這裡的凝膠滲透色譜法的測定條件如下。
柱TSK-gel G2500PWXL，直徑7.8mm×長度250mm 泵島津製作所製造，LC-10Avp 檢測器SPD-10AV，254nm 移動層0.1M，磷酸緩衝液(pH7.2，含有0.1M氯化鈉) 溫度室溫 流速0.3mL/min 通過與標準聚乙二醇的比較進行分子量計算 [分析試驗例9] 與上述分析試驗例8同樣地，用1L 100℃的熱水將20g與分析試驗例7同樣的混合發酵茶葉提取10分鐘，過濾得到的提取液，得到濾液。將該濾液供給到填充了Porapack Q(製品名，Waters公司製造)的柱中。然後，用100ml水、接著用100ml 50％甲醇洗脫柱中的水溶性成分。將這樣得到的水洗脫級分、以及50％甲醇洗脫級分分別濃縮並乾燥後，測定AGH抑制活性。其結果示於下述表11。
本分析試驗例中的AGH抑制性的測定按照由松井等人提出的使用了游離AGH的方法進行，用抑制率(單位％)的值表示。
[表11] 如表11所示，混合發酵茶葉熱水提取物的水洗脫級分和50％甲醇洗脫級分的任何一種都顯示高的AGH抑制性。
另外，對該水洗脫級分和50％甲醇洗脫級分在與上述分析試驗例8同樣的條件下通過凝膠滲透色譜法測定分子量時，明確了這些AGH抑制性特別高的兩級分中含有的成分處於分子量100～1900的範圍。
由分析試驗例8、9的結果可知，混合發酵茶葉的熱水提取物的水溶性級分顯示高的AGH抑制性，並且對該AGH抑制性的貢獻大的成分的分子量為100～1900左右的比較低的分子量。
[實驗例2] 讓正常大鼠攝取混合發酵茶葉的熱水提取物(冷凍乾燥品)，研究對耐糖能力帶來的影響。
準備混合發酵茶葉(茶的葉子和枇杷葉的混合比例為9∶1、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0小時)、粗茶、使枇杷葉乾燥並粉碎的枇杷葉、以及不混合枇杷葉而只將茶的葉子揉捏20分鐘而得到的單獨發酵茶葉作為試料茶葉。另外，上述粗茶使用與作為混合發酵茶葉的原料而使用的相同的茶的葉子，是按照通常的綠茶的製造法製造的粗茶(不使茶的葉子發酵而製造的粗茶)。
讓各種試料茶葉(含水率為5質量％)20g用1000ml的100℃熱水提取10分鐘後，過濾。將濾液乾燥，得到粉末狀的提取物。
使4周齡的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠分別自由攝食如下獲得的飼料(4種)將不含膽固醇的AIN-76組成為基本組成的食餌中添加上述製備的熱水提取物並使含有率為1質量％。
另外，作為對照，讓同樣的大鼠自由攝取在食餌中未添加熱水提取物的對照食物。
大鼠在室溫22±1℃、溼度55±5％、8:00～20:00點燈的光循環的動物飼養室內飼養。4周後，在禁食6小時後，口服給藥1g/kg體重的麥芽糖。給藥後，在0、10、20、30以及60分鐘後，分別從尾靜脈採血，使用血糖試驗測定醫用安全管(メデイセ一フチップ)(テルモ公司製造)測定血糖值。
其結果示於圖10。
在圖10中，橫軸表示麥芽糖給藥後的經過時間，縱軸表示血糖值的值。另外，血糖值的值是將麥芽糖給藥時的血糖值做為0mg/dl來表示的。
如該圖所示，攝取了混合發酵茶葉的熱水提取物的大鼠的血糖值在比任意一種試料茶葉都低的水平上推移。
由此可知，通過攝取混合發酵茶葉的熱水提取物，可以得到優異的抑制血糖值上升的效果。另外可知，該效果比只乾燥枇杷葉得到的枇杷葉、只使茶的葉子乾燥而得到的茶葉所得到的效果優異，通過使茶的葉子和枇杷葉混合、揉捏、發酵，可以得到協同效果。
[實驗例3] 讓患有2型糖尿病的大鼠攝取混合發酵茶葉的粉末，研究對血糖值帶來的影響。
使用食品加工機將混合發酵茶葉(茶的葉子和枇杷葉的混合比例為9∶1、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0小時，含水率5質量％)進行粉碎加工，直到成為60～100目大小的粉末狀態，得到粉末狀混合發酵茶葉。
大鼠使用1個月齡的自然發病2型糖尿病的雄性Otuka Long-EvansTokushima Fatty大鼠(以下，稱為OLETF大鼠)、和作為其對象模型動物的未患糖尿病的雄性Long-Evans Tokushima Otsuka大鼠(以下，稱為LETO大鼠)。大鼠在室溫22±1℃、溼度55±5％、8:00～20:00開燈的光循環的動物飼養室內飼養。
最初的3個月期間對LETO和OLETF大鼠給藥MF固態飼料(オリエンタル酵母工業(株)製造)進行預備飼養。由於OLETF大鼠通常在5個月齡到8個月齡發病2型糖尿病，從具有發病可能性的1個月前的4個月齡起，與LETO大鼠一起開始攝食試驗食物。
即，在4個月齡時禁食6小時(9:00～15:00)後，從尾靜脈採血，測定血糖值，按照體重和血糖值相等地以每組6隻來進行分組，使其自由攝食以下試驗食物5個月。
試驗食物是以基於AIN-76的純化食物作為對照食物，讓LETO大鼠-對照組和OLETF大鼠-對照組攝食。對照食物的組成(g/kg)為酪蛋白200、色拉油100、礦物混合(AIN-76-MX)35、維生素混合(AIN-76-VX)10、纖維素50、重酒石酸膽鹼2、DL-蛋氨酸3、玉米澱粉150以及蔗糖450。
在OLETF大鼠-混合發酵茶葉添加組中，在上述對照食物中添加飼料總質量5％的粉末狀混合發酵茶葉，並減去其添加量部分的蔗糖量。
任何一組在餵養期間中，攝食量每天測定，體重和攝水量每隔1天進行測定。
從給藥試驗食物開始，在1、2、3、4以及5個月後，禁食6小時後從尾靜脈採血並使用血糖試驗測定醫用安全管(テモル公司製造)測定血糖值。攝取試驗食物5個月間的大鼠血糖值的變化示於圖11。
在圖11中，橫軸表示從給藥試驗食物開始後的經過時間(單位月)，縱軸表示血糖值的值。
如該圖所示，攝取了對照食物的未患糖尿病的LETO大鼠的血糖值在整個餵養期間均為低值。另一方面，攝取了對照食物的患有糖尿病的OLETF大鼠的血糖值隨時間而上升，被看作糖尿病發病。
與此相反，使患有2型糖尿病的OLETF大鼠攝取了添加了混合發酵茶葉的粉末的飼料的組中，即使經過長時間血糖值也不上升，是與未發病糖尿病的LETO大鼠同等程度的低水平。由此可知，混合發酵茶葉的粉末具有優異的抑制血糖上升的效果。
[實驗例4] 讓患有2型糖尿病的大鼠攝取混合發酵茶葉的熱水提取物(冷凍乾燥品)，研究對血糖值帶來的影響。
將20g混合發酵茶葉(茶的葉子和枇杷葉的混合比例為9∶1、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0小時，含水率5質量％)用1000mL 100℃的熱水提取10分鐘，並將過濾得到的濾液進行冷凍乾燥，得到粉末狀的混合發酵茶葉提取物。
作為比較例，在同樣的條件下提取按照通常的綠茶的製造方法製造的粗茶(不使茶的葉子發酵而製造的粗茶)，過濾、乾燥，得到粉末狀的粗茶提取物。另外，在同樣的條件下提取乾燥成同樣的含水率的枇杷葉，過濾、乾燥，得到粉末狀的枇杷葉提取物。
大鼠使用與上述實驗例3同樣的大鼠，直到4個月齡的餵養條件也相同。
在4個月齡時禁食6小時(9:00～15:00)後，從尾靜脈採血，測定血糖值，按照體重和血糖值相等地以每組6隻來進行分組，使其自由攝食以下的試驗食物5個月。
對於LETO大鼠和OLETF大鼠的對照食物組，攝食與實驗例3同樣的對照食物。
在OLETF大鼠-混合發酵茶葉添加組中，在上述對照食物中添加飼料總質量5％的粉末狀混合發酵茶葉提取物，並減去其添加量部分的蔗糖量。
在OLETF大鼠-粗茶添加組中，在上述對照食物中添加飼料總質量5％的粉末狀的粗茶提取物，並減去其添加量部分的蔗糖量。
在OLETF大鼠-枇杷葉添加組中，在上述對照食物中添加飼料總質量5％的粉末狀枇杷葉提取物，並減去其添加量部分的蔗糖量。
在餵養期間中，攝食量每天測定，體重和攝水量每隔1天進行測定。
從給藥試驗食物開始，在1、2、3、4以及5個月後，與實驗例3同樣地測定血糖值。攝取試驗食物5個月的大鼠血糖值的變化示於圖12。
圖12中的橫軸和縱軸與圖11同樣。如該圖所示，攝取了對照食物的未患糖尿病的LETO大鼠的血糖值在整個餵養期間均為低值。另一方面，攝取了對照食物的患有糖尿病的OLETF大鼠的血糖值隨時間而上升，被看作糖尿病發病。
與此相反，讓患有2型糖尿病的OLETF大鼠攝取了添加有混合發酵茶葉的熱水提取物(冷凍乾燥品)的飼料的組中，即使經過長時間血糖值也不上升，是與未發病糖尿病的LETO大鼠同等程度的低水平。由此可知，混合發酵茶葉的熱水提取物具有優異的抑制血糖上升的效果。
[實驗例5] 研究讓患有2型糖尿病的大鼠攝取混合發酵茶葉的粉末時的其它效果。
與上述實驗例3同樣地製造粉末狀混合發酵茶葉。
作為比較例，製造使用與作為混合發酵茶葉的原料使用的茶的葉子同樣的茶的葉子製造的粗茶(不使茶的葉子發酵而製造的粗茶)，同樣地進行粉碎加工，得到粉末狀的粗茶。另外，將乾燥成同樣含水率的枇杷葉進行粉碎加工處理，得到粉末狀的枇杷葉。
大鼠使用與上述實驗例3同樣條件的大鼠，直到4個月齡的餵養條件也相同。
在4個月齡時禁食6小時(9:00～15:00)後，從尾靜脈採血，測定血糖值，按照體重和血糖值相等地以每組6隻來進行分組，使其自由攝食以下的試驗食物5個月。
對於LETO大鼠和OLETF大鼠的對照食物組，攝食與實驗例3同樣的對照食物。
在OLETF大鼠-混合發酵茶葉添加組中，在上述對照食物中添加飼料總質量5％的粉末狀混合發酵茶葉，並減去其添加量部分的蔗糖量。
在OLETF大鼠-粗茶添加組中，在上述對照食物中添加飼料總質量5％的粉末狀的粗茶，並減去其添加量部分的蔗糖量。
在OLETF大鼠-枇杷葉添加組中，在上述對照食物中添加飼料總質量5％的粉末狀枇杷葉，並減去其添加量部分的蔗糖量。
在餵養期間中，攝食量每天測定，體重和攝水量每隔1天進行測定。
給藥試驗食物開始5個月後，禁食6小時後，宰殺並採取血清、肝臟、以及腎臟和睪丸周邊的脂肪組織。
在下表中分別示出了血清胰島素濃度、血清過氧化脂質濃度、脂肪組織質量、血清膽固醇、血清甘油三酸酯、肝臟膽固醇、肝臟甘油三酸酯的測定結果。
[表12] 由表12的結果，使OLETF大鼠攝取對照食物或枇杷葉的組發現胰島素的降低。另外，通過血糖值測定可知，這些組處於糖尿病發病的狀態。與此相反，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，讓其攝取粉末狀混合發酵茶葉的組的胰島素濃度上升到未發病糖尿病的LETO大鼠的水平。由此可以確認，混合發酵茶葉具有改善由於糖尿病發病引起的胰島素分泌降低的效果。
[表13] 由表13的結果，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，讓其攝取粉末狀混合發酵茶葉的組的血清過氧化脂質濃度與其它的OLETF大鼠組相比也低。由此可以確認，混合發酵茶葉具有降低血清過氧化脂質濃度的效果。
[表14] 由表14的結果，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，讓其攝取粉末狀混合發酵茶葉的組的腎臟和睪丸周邊的脂肪組織質量，也比攝取對照食物的OLETF大鼠組有意義地低。由此可以明確，混合發酵茶葉具有抑制體內脂肪蓄積的效果。
[表15] 由表15的結果，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，攝取粉末狀混合發酵茶葉的組的血清和肝臟的膽固醇濃度和中性脂肪濃度，也比攝取對照食物的OLETF大鼠組降低。由此可以明確，混合發酵茶葉具有降低膽固醇的效果和降低中性脂肪的效果。
[實驗例6] 研究使發病2型糖尿病的大鼠攝取混合發酵茶葉的熱水提取物(冷凍乾燥物)時的其它效果。
與上述實驗例4同樣地，使LETO大鼠和OLETF大鼠自由攝食試驗食物5個月。
投餵試驗食物開始5個月後，禁食6小時後，宰殺並採取血清、肝臟、以及腎臟和睪丸周邊的脂肪組織。
在下表中分別示出了血清胰島素濃度、脂肪組織質量、血清甘油三酸酯、肝臟甘油三酸酯的測定結果。
[表16] 由表16的結果，讓OLETF大鼠攝取對照食物、粗茶提取物或枇杷葉提取物的組發現胰島素的降低。另外，通過血糖值測定可知，這些組處於糖尿病發病的狀態。與此相反，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，攝取混合發酵茶葉提取物的組的胰島素濃度上升到未發病糖尿病的LETO大鼠的水平。由此可以確認，混合發酵茶葉的熱水提取物具有改善由於糖尿病發病引起的胰島素分泌降低的效果。
[表17] 由表17的結果，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，攝取混合發酵茶葉提取物的組的腎臟和睪丸周邊的脂肪組織質量，也比攝取對照食物的OLETF大鼠組低。由此可以明確，混合發酵茶葉的熱水提取物具有抑制體內脂肪蓄積的效果。
[表18] 由表18的結果，即使是患有糖尿病的OLETF大鼠，攝取混合發酵茶葉提取物的組的血清和肝臟的中性脂肪濃度，也比攝取對照食物的OLETF大鼠組降低。由此可以明確，混合發酵茶葉的熱水提取物具有降低中性脂肪的效果。
[實驗例7] 研究讓正常大鼠攝取混合發酵茶葉的熱水提取物(冷凍乾燥品)時的其它效果。
即，在與實驗例2同樣的條件下，讓4周齡的Sprague-Dawley(SD)大鼠自由攝食與上述實驗例2同樣地分別添加了將試料茶葉(粗茶、單獨發酵茶葉、枇杷茶、混合發酵茶葉)的熱水提取物冷凍乾燥而得到的物質的4種飼料、以及對照食物來進行餵養。
4周後，禁食6小時後，宰殺並採取血清、肝臟、以及脂肪組織。
在下表中分別示出了血清過氧化脂質濃度、脂肪組織質量、血清中性脂肪(甘油三酸酯)、肝臟中性脂肪(甘油三酸酯)的測定結果。
[表19] 由表19的結果，在正常大鼠中，通過攝取混合發酵茶葉的熱水提取物，與攝取對照食物的情況相比，血清過氧化脂質濃度降低。由此可以確認，混合發酵茶葉的熱水提取物即使在正常的健康狀態，也發揮降低血清過氧化脂質的效果。
[表20] 由表20的結果，在正常大鼠中，通過攝取混合發酵茶葉的熱水提取物，與攝取對照食物的情況相比，脂肪組織質量低。由此可以確認，混合發酵茶葉的熱水提取物即使在正常的健康狀態，也發揮抑制體內脂肪蓄積的效果。
[表21] 由表21的結果，在正常大鼠中，通過攝取混合發酵茶葉的熱水提取物，與攝取對照食物的情況相比，血清和肝臟的中性脂肪濃度也低。由此可以確認，混合發酵茶葉的熱水提取物即使在正常的健康狀態，也發揮降低中性脂肪的效果。
[實驗例8] 研究通過攝取混合發酵茶葉的熱水提取物對1型糖尿病帶來的影響。
即，在以不含膽固醇的AIN-76組成為基本組成的食餌中添加1質量％的與實驗例2同樣的混合發酵茶葉的熱水提取物(冷凍乾燥品)，並讓4周齡的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠自由攝食。作為比較例，對SD大鼠投餵在同樣的食餌中不添加混合發酵茶葉提取物的對照食物。餵養條件為與實驗例2同樣的條件。
在攝食開始日和攝食開始14天後，禁食6小時後，由尾靜脈採血，使用血糖試驗測定醫用安全管(テモル公司製造)測定血糖值。
另外，攝食開始14天後的上述採血後，再繼續禁食，9小時後(禁食總時間15小時)，給藥30mg/kg體重的鏈脲黴素(STZ)。該STZ是具有下述作用的藥劑破壞胰臟胰島β細胞，引起胰島素分泌損害，從而引發1型糖尿病。給藥STZ後，再自由攝食食物。
從再攝食開始7天後和14天後(從最初的攝食開始3周後和4周後)，禁食6小時後，由尾靜脈採血，使用血糖試驗測定醫用安全管(テモル公司製造)測定血糖值。
另外，從再攝食開始2周後(從最初的攝食開始4周後)，禁食6小時後(上述採血後)宰殺，採取血清和胰臟胰島。對取出的胰臟胰島給予葡萄糖刺激，測定胰島素的分泌。
攝食開始後的血糖值的變化示於圖13。另外，在下述表中示出胰島素分泌的測定結果、以及血清膽固醇濃度和血清中性脂肪濃度的測定結果。
在圖13中，橫軸表示經過時間，縱軸表示血糖值的值。另外，血糖值的值是將攝食開始目的血糖值表示為100mg/dL。
如該圖所示，攝取對照食物的大鼠的血糖值在給藥STZ14天以後，隨時間而上升，被看作1型糖尿病發病。與此相反，攝取了混合發酵茶葉的熱水提取物的大鼠，14天以後的血糖值的上升被抑制得很小。
[表22] 由表22的結果，從攝食開始4周後(從給藥STZ2周後)的由於葡萄糖的刺激引起的來自胰臟胰島的胰島素分泌，攝取了混合發酵茶葉的熱水提取物的大鼠比攝取了對照食物的大鼠高。由此明確了混合發酵茶葉的熱水提取物由於保護胰臟胰島而可以維持胰島素分泌功能，並暗示了混合發酵茶葉的熱水提取物對預防1型糖尿病是有效的。
[表23] 由表23的結果，從攝食開始4周後(從給藥STZ2周後)的血清膽固醇濃度和血清中性脂肪濃度，攝取了混合發酵茶葉的熱水提取物的大鼠顯示比攝取了對照食物的大鼠低的值。由此明確了混合發酵茶葉的熱水提取物在1型糖尿病中具有降低血清脂質濃度的作用。
[實驗例9] 為了確認發酵茶葉的安全性，進行動物實驗。
即，使用食品加工機將混合發酵茶葉(茶的葉子和枇杷葉的混合比例為9∶1、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0小時)進行粉碎加工，直到成為60～100目大小的粉末狀態，得到粉末狀混合發酵茶葉，將該混合發酵茶葉以每天5000mg/kg體重的用量對4周齡的雄性Sprague-Dawley系雄性大鼠口服投喂。在溫度22±1℃、溼度55±5％、自由攝取飼料和水的條件下餵養4周時，未發現死亡，也未發現異常的體重變化，在餵養結束後的解剖檢查中也未觀察到臟器的異常。
因此，推定發酵茶對於大鼠的致死量(LD50)比5000mg/kg體重多，判斷為安全性相當高。
[實驗例10] (混合發酵茶葉的製造-用手揉捏的方法) 將枇杷葉投入到茶的葉子中，採用用手揉捏的方法進行揉捏。茶的葉子和枇杷葉的混合比例為茶的葉子∶枇杷葉的質量比為90∶10(枇杷投入比例為10％)和75∶25(枇杷投入比例為25％)2種。揉入時間(用手揉捏的時間)為25分鐘和50分鐘兩種。
此後，經過0小時、1小時、2小時、4小時4種發酵工序，得到16種混合發酵茶葉。另外，發酵工序0小時的茶葉是揉入剛結束時得到的混合發酵茶葉。
對於得到的混合發酵茶葉，與實驗例1同樣地，用100℃的熱水提取10分鐘，得到提取液(混合發酵茶葉的使用量2.0mg/ml)，對於該提取液，與實施例1同樣地測定AGH抑制性(麥芽糖酶抑制性和蔗糖酶抑制性)，另外，用下述的方法測定DPPH(1，1-二苦基-2-苯基肼基)消去活性。各自的結果示於表24、25。另外，DPPH消去活性的測定值越大，表示抗氧化作用越高。另外，與實驗例1同樣地進行感觀審查。結果示於表26。
(DPPH消去活性的測定方法) DPPH消去活性(單位μmol-Trolox/mg)的測定按照以下的方法進行(下同)。
將混合發酵茶葉粉碎，並將粉碎後的茶葉溶解在80％乙醇溶液中，使用同樣的80％乙醇溶液稀釋成0.5mg/ml。製作12ml的400μM DPPH、12ml的200mM MES緩衝液(pH6.0)和12ml的20％乙醇的混合溶液，使用エッペンドルフマルチピペット將該混合溶液分別注入到試管(a)～(f)各0.9ml，向試管(a)～(f)的每一個中加入(300-x)μl的80％乙醇(x為分析試料的添加量，具體地，在試管(a)～(f)中的x依次為0、30、60、120、180、240)。另外，向試管(a)～(f)中分別加入(x)μl分析試料並進行攪拌，添加20分鐘後，測定在520nm下的吸光度。
具體地，從開始時間的測定30秒鐘後，向試管(b)中加入30μl分析試料，60秒鐘後向試管(c)中加入60μl分析試料，120秒鐘後向試管(d)中加入120μl分析試料，180秒鐘後向試管(e)中加入180μl分析試料，240秒鐘後向試管(f)中加入240μl分析試料。然後，從開始時間的測定20分鐘後測定試管(a)的吸光度，20分鐘30秒後測定試管(b)的吸光度，21分鐘後測定試管(c)的吸光度，這樣每隔30秒進行吸光度的測定。
另一方面，使用Trolox作為標準試料製作標準曲線。標準曲線的橫軸為試料添加量(單位μmol)，縱軸為520nm下的吸光度。
以橫軸作為試料添加量(單位μl)、以縱軸作為520nm下的吸光度，描繪出分析試料的測定值，在吸光度持續直線減少的範圍內求出相對於添加量(x』μl)的吸光度(ΔA520)的值。接著，求出在標準曲線中得到相同的(ΔA520)時的Trolox添加量(單位μmol)。從這樣得到的Trolox相當量(單位μmol)求出每1mg混合發酵茶葉的消去活性的值(單位μmol-Trolox/mg)。
[表24]
[表25]

[表26]
[實驗例11] (混合發酵茶葉的製造-磨碎方法) 在乳缽中加入茶的葉子和枇杷葉並磨碎。茶的葉子和枇杷葉的混合比例為茶的葉子∶枇杷葉的質量比為90∶10(枇杷投入比例為10％)和75∶25(枇杷投入比例為25％)2種。磨碎時間為20分鐘和40分鐘兩種。
此後，經過0小時、1小時、2小時、4小時4種發酵工序，得到16種混合發酵茶葉。另外，發酵工序0小時的茶葉是磨碎剛結束時得到的混合發酵茶葉。
對於得到的混合發酵茶葉，與實驗例1同樣地測定AGH抑制性，另外，測定DPPH消去活性。各自的結果示於表27、28。另外，與實驗例1同樣地進行感觀審查。結果示於表29。
[表27]
[表28]
[表29]
[實驗例12] (混合發酵茶葉的製造-粉碎攪拌的方法) 在混合器(製品名ミルアンドミキサ一，テスコム公司製造)中加入茶的葉子和枇杷葉並進行粉碎攪拌。茶的葉子和枇杷葉的混合比例為茶的葉子∶枇杷葉的質量比為90∶10(枇杷投入比例為10％)和75∶25(枇杷投入比例為25％)2種。相對於茶的葉子和枇杷葉總計100質量份，水的添加量為100質量份。粉碎攪拌時間為10分鐘和20分鐘兩種。
此後，經過1小時、4小時、8小時、12小時、16小時5種發酵工序，得到20種混合發酵茶葉。
對於得到的混合發酵茶葉，與實驗例1同樣地測定AGH抑制性，另外，測定DPPH消去活性。各自的結果示於表30、31。另外，與實驗例1同樣地進行感觀審查。結果示於表32。
[表30]
[表31]
[表32]
[分析試驗例10] (香氣成分的分析) 將僅乾燥枇杷葉得到的材料、僅發酵枇杷葉得到的材料、市售的紅茶(大吉嶺紅茶和阿薩姆紅茶)、使用在長崎縣綜合農林試驗場東彼杵茶葉支場栽培的茶的葉子進行發酵的紅茶、使用相同的茶的葉子但不進行發酵而製造的綠茶(粗茶)、以及混合發酵茶葉(茶的葉子和枇杷葉的混合比例為9∶1、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0小時)等各種作為試樣，進行香氣成分的定量分析。
茶類的香氣成分的前處理通常採用柱濃縮法等來進行。這裡，作為簡易/迅速的試料的提取、濃縮、色譜導入法，採用固相微提取法進行。定量通過如下方法求出在作為測定對象的試料中添加作為內標物的環己醇，求出個香氣成分的峰面積相對於內標物的相對峰面積比。
具體地，按照以下的方法進行。試料的調整如下進行在200mL的三角燒瓶中加入20g試樣、1mL的30％氯化鈉水溶液、50μL作為內標物的1％環己醇，密封后在80℃下加熱5分鐘，使三角燒瓶內穩定後，插入收集管20分鐘，收集產生的香氣成分。將收集了香氣成分的收集管插入到加熱到250℃的氣相色譜儀的注入口，將香氣成分導入到氣相色譜儀的柱中3分鐘，進行分析。收集管使用SUPELCO公司製造的聚二甲基環己烷/carboxen/二乙烯基苯。對於氣相色譜的分析條件，柱為Reapect公司製造的stabil-WAX(聚乙二醇類)60m×0.25mm，膜厚使用0.25μm，柱溫在70℃保持3分鐘後，以10℃/分升溫到250℃。注入口溫度為250℃，氦壓力設定為120kPa。用於成分鑑定的氣相色譜質譜分析在I/F溫度250℃、離子化電壓70eV、離子化電流60μA下進行。對於1-己醇、反-2-己烯醛、乙酸3-己烯-1-醇酯、3-己烯-1-醇、裡哪醇、苯甲醛、水楊酸甲酯、香葉醇、橙花叔醇9種成分，測定相對於內標物的相對峰面積比。其結果示於表33。
[表33] 注)相對於內標物的相對面積 tr雖然可以檢測，但為最小面積以下 由表的結果，在混合發酵茶葉中含有表中列舉的所有9種成分。這些當中，裡哪醇、苯甲醛、水楊酸甲酯、香葉醇、以及橙花叔醇在使試驗場的茶的葉子發酵的紅茶中含有比較多，在市售的2種紅茶中也含有，但在綠茶和發酵的枇杷葉中的含量比較少。另外，反-2-己烯醛、乙酸3-己烯-1-醇酯、3-己烯-1-醇在發酵的枇杷葉中含有特別多。將1-己醇以外的8種成分的峰面積(相對於內標物的相對面積的值)與1-己醇的峰面積(相對於內標物的相對面積的值)相比較時，只有混合發酵茶葉中8種成分所有的各峰面積都比1-己醇的峰面積大。
另外，在混合發酵茶葉中，即使改變茶的葉子和枇杷葉的混合比例、揉捏時間、發酵時間等製造條件，也一定能夠檢測出1-己醇，並且是檢測出的量比表1記載的其他8種成分少的香氣成分。
[實驗例13] 讓自然發病2型糖尿病的KK-Ay小鼠分別攝取混合發酵茶葉的熱水提取物(冷凍乾燥品)、含有大量茶多酚的級分(以下，稱為TS級分)、以及含有大量茶黃素的級分(以下，稱為TF級分)，並研究對血糖值帶來的影響。
混合發酵茶葉的熱水提取物使用如下得到的提取物用1000ml 100℃的熱水提取混合發酵茶葉(茶的葉子和枇杷葉的混合比例為9∶1、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0小時，含水率5質量％)10分鐘後，過濾，將濾液冷凍乾燥病製成粉末狀的物質。
作為TS級分，使用將上述分析試驗例2中得到的Fr.6冷凍乾燥製成粉末狀的物質。
作為TF級分，使用將上述分析試驗例2中得到的Fr.7冷凍乾燥製成粉末狀的物質。
小鼠在室溫22±1℃、溼度55±5％、8:00～20:00開燈的光循環的動物飼養室內飼養。
使用5周齡的KK-Ay小鼠，最初的2周投餵MF固態飼料(オリエンタル酵母工業(株)製造)進行預備飼養。由於KK-Ay小鼠在7～8周齡左右自然發病糖尿病，因此，從具有發病可能性的7周齡起，開始攝食試驗食物。即，在7周齡時禁食6小時(9:00～15:00)後，從尾靜脈採血，測定血糖值，按照體重和血糖值相等地以每組7隻來進行分組，讓其自由攝食下述試驗食物6周。
試驗食物為以下的7種。
·對照食物將基於AIN-76組成的純化食物作為對照食物。對照食物的質量組成(g/kg)為酪蛋白200g/kg、玉米油100g/kg、礦物混合物(AIN-76-MX)35g/kg、維生素混合物(AIN-76-VX)10g/kg、纖維素50g/kg、重酒石酸膽鹼2g/kg、DL-蛋氨酸3g/kg、玉米澱粉150g/kg以及蔗糖450g/kg。
·提取物添加食物在100質量份上述對照食物中添加1質量份上述粉末狀的熱水提取物(冷凍乾燥品)，並從對照食物中減去其添加量部分的蔗糖。
·TS添加食物由於上述熱水提取物(冷凍乾燥品)中含有5.4質量％的茶多酚，因此，在對照食物中添加上述TS級分，並使之與上述提取物添加試驗食物中的茶多酚的含量相等，再從對照食物中減去其添加量部分的蔗糖。
·2倍TS添加食物在對照食物中添加上述TS級分，並使茶多酚的含量為上述提取物添加試驗食物的2倍，再從對照食物中減去其添加量部分的蔗糖。
·TF添加食物由於上述熱水提取物(冷凍乾燥品)中含有4.8質量％的茶黃素，因此，在對照食物中添加上述TF級分，並使之與上述提取物添加試驗食物中的茶黃素的含量相等，再從對照食物中減去其添加量部分的蔗糖。
·2倍TF添加食物在對照食物中添加上述TF級分，並使茶黃素的含量為上述提取物添加試驗食物的2倍，再從對照食物中減去其添加量部分的蔗糖。
·TS+TF添加食物在對照食物中添加上述TS級分和上述TF級分，並使之分別與上述提取物添加試驗食物中的茶多酚含量和茶黃素含量相等，再從對照食物中減去它們的添加量的總計部分的蔗糖。
在飼養期間，攝食量每天測定，體重和攝水量隔天測定。
在開始攝食試驗食物2、4、6周後，在禁食6小時後，從尾靜脈採血，並使用血糖試驗測定醫用安全管(テルモ公司製造)測定血糖值。攝取試驗食物的6周的小鼠的血糖值的變化示於圖14至圖17。
如圖14所示，攝取了對照食物的小鼠的血糖值隨時間而上升，在6周後超過300mg/dl。另外，由於攝水量也同樣增加，攝取了對照食物的小鼠被看作糖尿病發病。另一方面，攝取了提取物添加食物的小鼠的血糖值存在隨時間而減小的傾向，6周後的值降低到攝取了對照食物的小鼠的大約一半。
如圖15所示，攝取了TS添加食物的小鼠的血糖值在6周後降低，攝取了2倍TS添加食物的情況下，更加有效地降低。
如圖16所示，攝取了TF添加食物的小鼠的血糖值在6周後降低，攝取了2倍TF添加食物的情況下，從4周後降低。
如圖17所示，攝取了TS+TF添加食物的小鼠的血糖值在4周以後與攝取了提取物添加食物的小鼠幾乎為同一水平。
由以上的結果可以明確，混合發酵茶葉的熱水提取物的抑制血糖值上升的作用主要由茶多酚和茶黃素髮揮。
[臨床實驗例1] 研究攝取含有混合發酵茶葉的提取物的飲料對成人的血糖值、血清中性脂肪、血清膽固醇、體內脂肪率和血壓帶來的影響。另外，本試驗得到縣立長崎西博爾特大學研究倫理委員會的承認，並遵守赫爾辛基宣言的精神來實施。
被試驗者是在長崎縣廳內招募的長崎縣廳職員，與健康的人進行同樣的日常生活，未接受醫生的服藥指導，是未懷孕者並且是醫生判斷為適合的人，對於本試驗的內容，接受充分的說明，並按照本人的自由意願由本人提出同意書，共28人。
試驗飲料使用如下製作的飲料相對於100質量份90℃的熱水，添加0.83質量份將混合發酵茶葉焙煎而得到的物質(茶的葉子和枇杷葉的混合比例為9∶1、揉捏時間為20分鐘、發酵時間為0小時，含水率1質量％)，提取4分鐘後過濾，在每個紙包裝中各填充200ml濾液，密封。
使被實驗者在早餐或中餐和晚餐時分別飲用1瓶，1天飲用2瓶，共飲用3個月。在攝取試驗飲料前、攝取開始1個月後、2個月後以及3個月後的早晨空腹時採血，進行體重測定、體內脂肪率測定以及血壓(收縮壓和舒張壓)測定。另外，採血前一天晚上9點以後禁食。對於試驗期間的3個月的飲食沒有特別限制，指導其按照與日常相同的生活進行。
作為對於血液成分的測定項目，測定了總蛋白質、A/G比、總膽固醇、HDL-膽固醇、中性脂肪、游離脂肪酸、尿酸、尿素氮、肌酸內醯胺、Na、Cl、K、GOT、GPT、γ-GTP、磷脂、Ca、無機磷、膽鹼酯酶、LDH、ALP、白蛋白、直接膽紅素、間接膽紅素、胰島素、血糖、血紅蛋白Alc、白血球數、紅血球數、血色素量、血細胞比容、MCV、MCH、MCHC、血小板數。
攝取試驗飲料的3個月期間，28名試驗者的平均值在所有的測定項目中均為正常範圍內。
圖18、19是示出血糖值的測定結果的曲線圖，圖18表示所有28人的平均值，圖19表示攝取試驗飲料開始前的血糖值(初期值)為110mg/dL以上的人(10名)的平均值相對於初期值的變化率。該變化率是由(測定值的平均值-初期值)/初期值×100(單位％)算出的值，圖中的「*」表示相對於初期值有有意義的差(以下相同)。
圖20、21是示出血清中性脂肪濃度的測定結果的曲線圖，圖20表示所有28人的平均值，圖21表示攝取試驗飲料開始前的血清中性脂肪濃度(初期值)為150mg/dL以上的人(9名)的平均值相對於初期值的變化率。
圖22、23是示出血清膽固醇濃度的測定結果的曲線圖，圖22表示所有28人的平均值，圖23表示攝取試驗飲料開始前的血清膽固醇濃度(初期值)為220mg/dL以上的人(11名)的平均值相對於初期值的變化率。
圖24、25是示出體內脂肪率的測定結果的曲線圖，圖24表示所有28人的平均值，圖25表示攝取試驗飲料開始前的體內脂肪率(初期值)為25％以上的人(15名)的平均值相對於初期值的變化率。
圖26、27是示出最高血壓的測定結果的曲線圖，圖26表示所有28人的平均值，圖27表示攝取試驗飲料開始前的最高血壓(初期值)為140mmHg以上的人(14名)的平均值相對於初期值的變化率。
圖28、29是示出最低血壓的測定結果的曲線圖，圖28表示所有28人的平均值，圖29表示攝取試驗飲料開始前的最低血壓(初期值)為90mmHg以上的人(10名)的平均值相對於初期值的變化率。
由這些結果可知，對於血糖值，雖然所有人的平均值在試驗期間中未變動，但初期值高的人在攝取開始2個月後和3個月後，與攝取前相比，有意義地降低。
對於血清中性脂肪濃度，雖然所有人的平均值在試驗期間中未變動，但初期值高的人在攝取開始2個月後和3個月後，與攝取前相比，降低40％左右。
對於血清膽固醇濃度，雖然所有人的平均值在試驗期間中未變動，但初期值高的人在攝取開始2個月後和3個月後，與攝取前相比，有意義地降低。
對於體內脂肪率，雖然所有人的平均值在試驗期間中未變動，但初期值高且稍有肥胖傾向的人在攝取開始3個月後，與攝取前相比，有意義地降低。
對於最高血壓，雖然所有人的平均值在試驗期間中未變動，但初期值高的人在攝取開始1個月後、2個月後和3個月後，與攝取前相比，有意義地降低。
對於最低血壓，雖然所有人的平均值在試驗期間中未變動，但初期值高的人在攝取開始2個月後和3個月後，與攝取前相比，有意義地降低。
由這些結果可以明確，通過攝取含有混合發酵茶葉的提取物的飲料，在血糖值、血清中性脂肪、血清膽固醇、最高血壓、最低血壓分別有高傾向的人中，可以得到改善這些值的效果。另外，還可以明確，可以得到使稍微有肥胖傾向的人的體內脂肪率降低的效果。另外，由於不使正常的人的上述各測定值降低，因此評價為安全性高的飲料。
[臨床試驗例2] 研究攝取含有混合發酵茶葉的提取物的飲料對年輕女子的體內脂肪率帶來的影響。另外，本試驗得到縣立長崎西博爾特大學研究倫理委員會的承認，並遵守赫爾辛基宣言的精神來實施。
被試驗者是在縣立長崎西博爾特大學內招募的本校女學生，與健康的人進行同樣的日常生活，未接受醫生的服藥指導，是未懷孕者並且是醫生判斷為適合的人，對於本試驗的內容，接受充分的說明，並按照本人的自由意願由本人提出同意書，共54名成人女學生。
試驗飲料使用與上述臨床試驗例1同樣的飲料。另外，作為對照飲料，使用市售的200ml紙包裝的綠茶飲料。
使27名被實驗者飲用試驗飲料、27名被實驗者飲用對照飲料，在早餐或中餐和晚餐時分別飲用1瓶，1天飲用2瓶，共飲用3個月。
在開始攝取前測定所有人的血糖值和體內脂肪率，在試驗飲料飲用組和對照飲料飲用組分別按照平均值幾乎相等地進行分組。試驗飲料和對照飲料的外觀相同，從外觀上不能識別。在攝取試驗飲料前、攝取開始1個月後、2個月後以及3個月後的早晨空腹時採血，進行體重測定、體內脂肪測定以及血壓測定。另外，採血前一天晚上9點以後禁食。對於試驗期間的3個月的飲食沒有特別限制，指導其按照與日常相同的生活進行。
血液成分的測定項目與上述臨床試驗例1相同。
攝取試驗飲料的3個月期間，54名試驗者的平均值在所有的測定項目中均為正常範圍內。另外，在該3個月期間，在攝取試驗飲料的27名被試驗者和攝取對照飲料的27名被試驗者之間，對於所有的測定項目均未觀察到差別。
圖30表示試驗開始前的體內脂肪率(初期值)為25％以上的人(攝取試驗飲料者11名，攝取對照飲料者13名)的體內脂肪率相對於初期值的變化率。
如該圖所示，在體內脂肪率的初期值為25％以上的稍微有肥胖傾向的人中，攝取了試驗飲料的組與攝取對照飲料的組相比，3個月後的體內脂肪率有意義地降低。
由這些結果可以明確，通過攝取含有混合發酵茶葉的提取物的飲料，可以得到使稍微有肥胖傾向的年輕女子的體內脂肪率降低的效果。另外可以確認，即使正常的年輕女子攝取也是安全的。
工業實用性 按照本發明，可以得到對於預防或改善上述的糖尿病或高血脂症具有有效的藥效的發酵茶葉、發酵茶葉提取物以及飲食品。
而且，本發明的發酵茶葉具有下述優點可以有效利用至今為止未被有效利用的枇杷葉，作為原料的茶的葉子，還可以使用到現在仍被割掉丟棄的茶葉。
權利要求
1.一種用於抑制血糖值上升的組合物，其中含有選自下述物質中的1種以上茶多酚A、具有棓醯基的茶黃素衍生物、具有以表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素、以及兒茶素棓酸酯類氧化縮合的多酚P，該多酚P在13C-NMR譜圖中顯示來自兒茶素A環的間苯三酚的信號和來自棓醯基的信號，其乙醯化物的分子量為1000～15000，並以2000為極大。
2.權利要求1所述的用於抑制血糖值上升的組合物，其中還含有枇杷原花青素。
3.一種用於抑制血糖值上升的組合物，其中包含發酵茶葉，所述發酵茶葉含有選自下述物質中的1種以上茶多酚A、具有棓醯基的茶黃素衍生物、具有以表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素、以及兒茶素棓酸酯類氧化縮合的多酚P，該多酚P在13C-NMR譜圖中顯示來自兒茶素A環的間苯三酚的信號和來自棓醯基的信號，其乙醯化物的分子量為1000～15000，並以2000為極大。
4.權利要求3所述的用於抑制血糖值上升的組合物，其中，上述發酵茶葉還含有枇杷原花青素。
5.一種用於抑制血糖值上升的組合物，其中包含發酵茶葉提取物，所述發酵茶葉提取物含有選自下述物質中的1種以上茶多酚A、具有棓醯基的茶黃素衍生物、具有以表阿夫兒茶精棓酸酯為結構單元的原花青素、以及兒茶素棓酸酯類氧化縮合的多酚P，該多酚P在13C-NMR譜圖中顯示來自兒茶素A環的間苯三酚的信號和來自棓醯基的信號，其乙醯化物的分子量為1000～15000，並以2000為極大。
6.權利要求5所述的用於抑制血糖值上升的組合物，其中，上述發酵茶葉提取物還含有枇杷原花青素。
7.一種飲食品，其中含有權利要求1～6中任何一項所述的用於抑制血糖值上升的組合物。
全文摘要
本發明提供對於維持或改善健康具有有效的藥效的新型發酵茶葉、發酵茶葉提取物、用於抑制血糖值上升的組合物以及使用這些的飲食品。即，提供含有混合、揉捏茶的葉子和枇杷葉並進行發酵的發酵茶葉、提取該發酵茶葉而得到的發酵茶葉提取物、用於抑制血糖值上升的組合物、含有該發酵茶葉和/或該發酵茶葉提取物的飲食品、以及含有用於抑制血糖值上升的組合物的飲食品。
文檔編號A23L1/30GK101683165SQ20091020421
公開日2010年3月31日 申請日期2007年2月1日 優先權日2006年2月2日
發明者宮田裕次, 寺井清宗, 玉屋圭, 前田正道, 林田誠剛, 德嶋知則, 田中隆, 田中一成, 西園祥子, 松井利郎 申請人:日本國長崎縣政府, 長崎縣公立大學法人, 國立大學法人長崎大學, 國立大學法人九州大學