抗cd40單克隆抗體的製作方法
2023-05-01 00:31:56 2
專利名稱：抗cd40單克隆抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及識別人B細胞、樹突狀細胞(DC)等表面上存在的人CD40抗原的抗體或其功能片段。具體地說，本發明涉及對樹突狀細胞(DC)表面上的人CD40抗原有充分拮抗作用的抗人CD40抗體或其功能片段，和預期具有比常規抗人CD40抗體有更高治療效果的激動性(agonistic)抗人CD40抗體或其功能片段。
背景技術：
1.CD40CD40是存在於細胞膜表面的分子量為50kDa的抗原。CD40是在B細胞、樹突狀細胞(DC)、某些類型的癌症細胞和胸腺上皮細胞上表達的。已知CD40在B細胞和DC的增殖和分化中起了重要作用。CD40已經被鑑定是在人B細胞表面上表達的抗原(E.A.Clark等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834494，1986，I.Stamenkovic等，EMBO J.81403，1989)。根據胺基酸序列的同源性，CD40被認為是TNF受體家族的成員，該家族包括低親和力的NGF受體、TNF受體、CD27、OX40、CD30等。最近已經克隆了人和小鼠CD40的配體(CD40L)的基因，發現它是II型膜蛋白質，是在激活的CD4+T細胞上表達的。也已經表明，CD40L在人和小鼠B細胞中導入了強的激活信號。
已經證明CD40的表達在樹突狀細胞上比在B細胞上更頻繁，所以顯然CD40起了重要作用。CD40和CD40L的結合引起了抗原呈遞細胞(APC)的激活。具體地說，它增強了共刺激分子如CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的表達，或IL-12的產生(Caux，C.等通過CD40交聯的人樹突狀細胞的激活，J.Exp.Med.，1801263，1994)，(Shu，U等激活的T細通過CD40-CD40配體的相互作用誘導單核細胞產生白介素-12，Eur.J.Immunol.251125，1995)。樹突狀細胞顯示了強大的抗原呈遞能力，並具有強大的激活輔助T(Th)細胞的能力。另外，人們認為，樹突狀細胞控制了天然的Th細胞分化成Th1或Th2細胞。當樹突狀細胞(DC1)通過在存在GM-CSF和IL-4的條件下培養骨髓樹突狀細胞的外周血液單核細胞並利用CD40L而成熟時，DC1在體外能夠產生IL-12，刺激並激活異常的天然(allo-naive)Th細胞，所以誘導了產生IFNγ的T細胞(特別是促進分化成Th1)。由於這一作用是通過抗IL-12抗體抑制的，反應可以由IL-12介導。在其他方面，當通過培養存在於有IL-3和CD40配體的外周血液中的淋巴組織T區域或類漿細胞(plasmacytoid)T細胞來製備淋巴細胞-樹突狀細胞(DC2)時，DC2不能生產IL-2，刺激和激活異常的天然Th細胞，誘導生產IL-4的T細胞，從而促進分化成Th2。人們認為Th1細胞參與了細胞免疫的激活，Th2細胞參與了體液免疫能力的增強以及細胞免疫能力的抑制。用Th1細胞輔助激活細胞毒性T細胞(CTL)可以除去在細胞質和腫瘤細胞中擴增的病原因子(許多病毒、單核細胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、結核桿菌(tubercle bacillus)，弓形蟲原生動物(toxoplasma protozoa)等)。
已經顯示，識別膜表面表達的CD40的抗CD40單克隆抗體在B細胞上發揮了各種生物活性。抗CD40單克隆抗體大部分被分類成影響CD40和CD40L之間相互作用的激動性和拮抗性抗體。
2.激動性抗體B細胞的激活已知是激動性抗體的作用。例如，已經報導抗CD40的抗體可以誘導細胞的粘附(Barrett等，J.Immumol.1461722，1991；Gordon等，J.Immunol.1401425，1988)，增大細胞體積(Gordon等，J.Immunol.1401425，1988；Valle等，Eur.J.Immunol.191463，1989)，誘導只用抗IgM抗體、抗CD20抗體或佛波酯激活的B細胞的分裂(Clark和Ledbetter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834494，1986；Gordon等，LEUCOCYTE TYPING III.A.J.McMicheal ed.Oxford UniverstityPress.Oxford，p.426；Paulie等，J.Immunol.142590，1989)，在存在IL4時誘導B細胞的分裂(Valle等，Eur.J.Immunol.191463，1989；Gordon等，Eur.J.Immunol.171535，1987)，誘導IgE的表達(Jabara等，J.Exp.Med.1721861，1990；Gascan等，J Immunol.1478，1991)，用IL-4刺激和無T細胞時培養的細胞的IgG和IgM(Gascan等，J.Immunol.1478，1991)，通過IL-4(Gordon和Guy，Immunol.Today 8339，1987；Cairns等，Eur.J.Immunol.18349，1988)增強來自B細胞的可溶CD23/FcεRII的分泌和細胞上的表達(Challa A，Allergy，54576，1999)，並促進IL-6的產生(Clark和Shu，J.Immunol.1451400，1990)。另外，已經報導，B細胞克隆是通過在存在CDw32+粘附細胞時加入IL-4和抗CD40抗體從人初級培養B細胞建立的(Bancherau等，Science24170，1991)，並且抑制生發中心細胞的程序死亡是CD40介導的，儘管有抗原受體的功能(Liu等，Nature 342929，1989)。如上所述，CD40已經鑑定為人B細胞表面上表達的抗原。已經主要利用誘導人B細胞的增殖和分化的功能和誘導癌症細胞的細胞死亡作為指示物的活性來評估大多數分離的抗體(Katira，A.等，LEUKOCYTE TYPING V.S.F.Schlossossman等，eds.P547.Oxford University Press.Oxford，W.C.Flansow等，LEUKOCYTE TYPING V.S.F.Schlossossman等，eds.P.555.Oxford University Press.Oxford.J.D.Pound等，IntemationalImmunology，1111，1999)。
抗CD40能導致DC的成熟(Z.H.Zhou等，Hybridoma，18471，1999)。另外，已經報導在抗原特異性的CD8T細胞引發(priming)中CD4T細胞的作用是通過CD40-CD40L信號來激活DC。已經顯示，在樹突狀細胞(DC)的激活中CD4輔助T細胞的作用可以通過抗CD40的單克隆抗體(mAb)來替代(Shoenberger，S.P.等T細胞輔助細胞毒性T淋巴細胞是通過CD40-CD40L相互反應來介導的，Nature，480，1998)。另外，在小鼠中，通過施用抗CD40抗體不僅可以保護生物體不受表達CD40的腫瘤細胞的侵害，而且可以不受不表達CD40的腫瘤細胞的侵害(French，R.R.等CD40抗體引起去除淋巴瘤和免於T細胞輔助的細胞毒性T細胞應答，Nature Medicine，5，1999)。
至今報導的大多數抗體還沒有用針對DC的效果作為指示物來分離。然而，在DC功能的修飾方面，用抗體對B細胞的作用來選擇的抗體似乎不足以作為治療藥劑。據報導，根據抗體識別的表位，在抗小鼠CD40的單克隆抗體中，有與DC反應而與血管內皮細胞不反應的克隆，和不與DC反應而與血管內皮細胞反應的克隆(Van Den Berg，TK等，Immunology，88294，1996)。人們也假設人CD40抗體對DC的結合和作用是根據表位而不同的。
已知，抗CD40抗體或CD40配體可以阻遏表達CD40的淋巴瘤細胞系的增殖，所以可以誘導細胞死亡。(Funakoshi S等，Blood，832782，1994；Funakoshi S等，Journal of Immunotherapy，19，93，1996；Z.H.Zhou等，Hybridoma，18471 1999；和Joseph A等，CancerResearch，603225，2000)。關於激動性抗體，有趣的是抗體的功能並不總是與CD40L的一致。激活B細胞的作用也不與阻遏B細胞腫瘤生長的作用一致。人們需要的是開發具有DC激活能力和腫瘤細胞增殖阻遏作用的抗體。另外，在激動性抗體中間，抑制和不抑制CD40L與CD40的結合的抗體是存在的(Challa A等，Allergy，54576，1999)。例如，G28-5(ATCC No.HB-9110)產生的抗體與CD40L競爭，所以沒有與CD40L組合應用產生的影響。表達CD40的細胞的激活程度是根據抗體而不同的。甚至當抗體獨立地顯示弱的激動活性的時候，將抗體與CD40配體結合使用能比單獨使用CD配體產生的活性更明顯地提高存在抗體時的活性。相反，甚至當抗體獨立地顯示激動活性時，CD40配體的抑制在存在抗體時可以將活性降低到比單獨使用CD40配體產生的活性更低的程度(Pound等，Intemational Immunology，1111，1999)。已經顯示，使用不與CD40配體競爭的抗體，雖然抗體本身阻遏腫瘤細胞增殖的作用是弱的，但在存在CD40配體時可以達到更強的增殖抑制(Joseph A等，Cancer Research，603225，2000)。因此，需要的是開發結合CD40以獨立地抑制細胞增殖，但不抑制CD40配體與CD40結合的抗體。通過充分利用這些特性的優點，有可能開發出比可溶CD40L更有效的治療藥劑。例如，可溶的CD40L是通過與CD40的結合而激活的，同時，它抑制了體內存在的CD40L的功能。不與CD40L競爭的抗體不會引起這樣的抑制，並且通過協同作用可以預期有更好的治療效果。
3.拮抗性抗體同時，如上所述，可以預期因為CD40在免疫反應中有重要作用，可以通過抑制CD40和它的配體的結合來開發器官移植的免疫抑制和針對自體免疫疾病的治療藥劑。Sawada-Hase等已經報導，強烈表達CD40的細胞的比例在Crohn疾病的患者的外周血液單核細胞中是增加的。但是，抑制CD40與它的配體的結合的抗體還沒有被很好地了解。例如，抑制結合的抗體可以是對CD40的功能性分析和需要CD40的激活的抗疾病治療是有效的。另外，也已經顯示抑制CD40的配體的抗體具有有效地作為抵抗其中涉及CD40和CD40配體的結合的疾病的治療藥劑的潛力。但是，已經報導，CD40L是在激活的血液血小板中表達的(V.Henn等，Nature 391591，1998)。已經報導，如果抗CD40L抗體用作治療藥劑，存在引起凝血的危險(T.Kawai等，Nat.Medi.6114，2000)。從這樣的一個觀點來看，可以預期抗CD40的抗體作為抑制CD40與它的配體結合的治療藥劑，比抗CD40L的抗體更安全。需要抗CD40抗體抑制CD40L與CD40的結合，而不是通過抗體本身激活CD40。
雖然，在過去對於特異性地結合人CD40並抑制CD40L與CD40的結合而不激活CD40的抗體已經進行了大量的研究，但只報導了一個例子，即稱為5D12的小鼠抗人CD40抗體(J.Kwekkeboom等，Immunology 79439，1993)。另外，還不知道是否顯示B細胞中和活性的抗體也顯示DC中和活性，即是否抗體可以中和CD40配體的作用。另外，已經報導，生物素化抗小鼠CD40抗體的作用可以通過與抗生物素蛋白的交聯來增強(Johnson等，Eur J Immunol，241835，1994)。我們利用針對標記(FLAG)的抗體(M2)增強了針對B細胞系(Ramos細胞)的可溶CD40配體的作用，並且測量了中和活性，所述抗體在此之前已經通過遺傳工程技術提供給可溶配體。因此，我們證明，5D12(ATCC No.HB-11339)只顯示輕微的中和活性。
我們最近發現，作為甚至在沒有CD40L時交聯的結果，5D12(一種拮抗性抗體)對它自身具有激動活性。已經報導，小鼠CD40抗體的作用是通過生物素與抗生物素蛋白的交聯而增強的(Johnson等，EurJ Immunol.，241835，1994)。另外，已知利用固相化(solid-phased)在平板上的抗免疫球蛋白抗體固相化CD40抗體，可以導致抑制腫瘤細胞增殖的活性的增強。這被認為是固相化產生的效果。但是，還不知道，當在培養溶液中加入抗免疫球蛋白抗體用於抗CD40抗體的交聯時，拮抗性抗體可能顯示激動活性。如果用於治療的抗體具有抗原性，可以產生完全相反的效果，製備在人體中結合CD40抗體的抗體，並且CD40抗體與之交聯，由此產生了似乎與CD40配體相同的活性。相應地，從治療藥劑的安全性出發，將抗體的抗原性保持在低水平是非常重要的。考慮這樣一種情況，其中治療藥劑是根據小鼠抗體的可變區的序列通過人源化技術來開發的。由於人源化抗體具有免疫原性，在施用之後可能產生抗人源化抗CD40的抗體。特別是，存在抗體變成激動性抗體的危險。即使抗原性是低的，抗CD40抗體也可以與抗體受體(FcR)交聯。從這些事實出發，優選的拮抗性抗體這樣一種人抗體，它特異性地結合CD40，抑制CD40L的結合，甚至通過交聯也不激活CD40，具有與FcR的弱結合。
發明內容
如上所述，最近對DC的功能的分析已經日益增加，所以CD40已經開始被識別到是在控制DC的功能中的重要基因。從這一背景出發，本發明的目的是利用一種使用DC的評估系統，提供抗人CD40抗體或其功能片段，它對樹突狀細胞(DC)表面的人CD40抗原也基本上是拮抗性的；並提供激動性的抗人CD40抗體或其功能片段，可以預期它具有比常規的抗人CD40抗體更高的治療效果。
作為關於抗人CD40的抗體的製備的深入研究的結果，我們完成了本發明，產生了被認為對疾病具有比常規的已知抗CD40抗體更高的治療效果的新的激動性抗體和拮抗性抗體來。即本發明如下。
(1)抗人CD40的抗體，或其功能片段，具有選自下列特性(a)至(f)中的至少一個特性(a)在存在LPS和IFNγ時作用於樹突狀細胞，產生IL-12；(b)具有作用於樹突狀細胞導致細胞成熟的活性，該活性比G28-5抗體的更高；(c)具有促進已建立的B細胞系表達CD95的活性，該活性比G28-5抗體的更高；(d)具有抑制已建立的B細胞系增殖的活性，該活性比G28-5抗體的更高；(e)誘導已建立的B細胞系的細胞死亡；和(f)不抑制CD40配體與CD40的結合。
(2)本發明的上述抗體或其功能片段，其中樹突狀細胞的成熟是在20μg/ml或更低的濃度下進行的。另外，抗體或其功能片段促進已建立的B細胞系在抗體濃度20μg/ml或更低的濃度下表達CD95。已建立的B細胞系的例子包括Ramos、HS-Sulton等。
(3)另外，本發明的上述抗體或其功能片段當將濃度為0.1μg/ml或更多的抗體加入到濃度為1×106細胞/ml的樹突狀細胞中時產生100pg/ml或更多的IL-12，當加入1μg/ml或更高濃度的抗體時，產生1000pg/ml或更多，優選10000pg/ml或更多的IL-12。
(4)另外，在0.01μg/ml和10μg/ml的抗體濃度範圍內，本發明的上述抗體或其功能片段，促進已建立的B細胞系(Ramos細胞)表達CD95，效力比作為對照的G28-5抗體表達的高約2到3倍。例如，抗體濃度為0.01μg/ml時，其表達效力比作為對照的G28-5抗體的表達高約2到6倍或更高。抗體濃度為0.1μg/ml時，其表達效力比作為對照的G28-5抗體的表達高約2到7倍或更高。抗體濃度為1μg/ml時，其表達效力比作為對照的G28-5抗體的表達高約2到7倍或更高。抗體濃度為10μg/ml時，其表達效力比作為對照的G28-5抗體高約2到6倍或更高。
(5)一種抗體或其功能片段，具有雜交瘤KM302-1(保藏號FERMBP-7578)，KM341-1-19(保藏號FERM BP-7759)，2105(保藏號FERMBP-8024)，或F1-102(保藏號ATCC PTA-3337)產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列。
(6)一種抗體或其功能片段，具有以下區域的成熟部分的胺基酸序列雜交瘤F2-103產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，它們分別由保藏號ATCC PTA-3302和ATCC PTA-3303的質粒DNA編碼；雜交瘤F5-77產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，它們分別由保藏號ATCC PTA-3304和ATCC PTA-3305的質粒DNA編碼；或雜交瘤F5-157產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，它們分別由保藏號ATCC PTA-3306和ATCC PTA-3307的質粒DNA編碼。
(7)一種抗體或其功能片段，具有以下區域的成熟部分的胺基酸序列雜交瘤KM341-1-19產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS28和30表示；雜交瘤2105產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS32和34表示；雜交瘤110產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS36和38表示；雜交瘤115產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS40和42表示；雜交瘤KM643-4-11產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS52和54表示；雜交瘤F2-103產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ IDNOS60和62表示；或者雜交瘤F5-77產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS64和66表示。
(8)一種抗體或其功能片段，具有以下區域的成熟部分的胺基酸序列從雜交瘤KM341-1-19分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS27和29表示；從雜交瘤2105分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS31和33表示；從雜交瘤110分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS35和37表示；從雜交瘤115分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS39和41表示；從雜交瘤KM643-4-11分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS51和53表示；從雜交瘤F2-103分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQID NOS59和61表示；或從雜交瘤F5-77分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS63和65表示。
(9)一種抗人CD40的抗體或其功能片段，具有選自下列特性(g)至(j)中的至少一個(g)中和CD40上配體的作用；(h)中和或減弱已建立的B細胞系上的CD40的配體在表達CD40的細胞上具有的一種或多種作用，並具有對已建立的B細胞系上的CD40的激動作用，由於抗免疫球蛋白抗體的交聯，該激動作用比5D12的更弱；(i)減弱或中和CD40配體對已建立的B細胞系的作用，增強CD95表達；和(j)對樹突狀細胞上表達的CD40具有拮抗作用。
(10)上面(9)的抗體或功能片段，當將濃度0.1μg/ml的抗體加入補充了飽和量的表達CD40L的細胞的1×106細胞/ml的Ramos細胞時，可以抑制Ramos細胞中CD95的表達水平比對照低約10％或更低(to a level approximately 10％or less than that of a control)；當加入抗體的濃度1μg/ml時，可以抑制Ramos細胞中CD95的表達到和陰性對照相同的水平；當加入的抗體濃度為10μg/ml時，可以抑制Ramos細胞中CD95的表達到與陰性對照相同的水平。
(11)上面(9)的抗體或其功能片段，其中當在補充了可溶的CD40L(1μg/ml)的1×105扁桃體B細胞中加入濃度為0.001μg/ml到10μg/ml之間的抗體時，扁桃體B細胞的增殖在體外受到約80％到約95％或更多的抑制。例如，當加入的抗體的濃度在0.01μg/ml到10μg/ml之間時，扁桃體B細胞的增殖受到約95％或更多的抑制。特別是，當加入的抗體的濃度為0.001μg/ml時，扁桃體B細胞的增殖受到約80％或更多的抑制。
(12)一種抗體或其功能片段，具有雜交瘤KM281-1-10(保藏號FERM BP-7579)，4D11(保藏號FERM BP-7758)或F4-465(保藏號ATCC PTA-3338)產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列。
(13)一種抗體或其功能片段，具有以下區域的成熟部分的胺基酸序列雜交瘤KM281-1-10產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS44和46表示；雜交瘤4D11產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS48和50表示；或雜交瘤F4-465產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ IDNOS56和58表示。
(14)一種抗體或其功能片段，具有以下區域的成熟部分的胺基酸序列從雜交瘤KM281-1-10分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS43和45表示；雜交瘤4D11產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS47和49表示；或從雜交瘤F4-465分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS55和57表示。
(15)上面(1)到(14)的抗體或其功能片段的例子，包括人抗體。
(16)一種藥物組合物，含有上面(1)到(15)中任一項的抗體或其功能片段作為活性成分。
(17)一種免疫強化劑、抗腫瘤藥劑或抗自體免疫疾病藥劑，含有上面(1)到(8)中任一項的抗體或其功能片段作為活性成分。
(18)一種免疫抑制劑、抗自體免疫疾病藥劑、抗過敏的治療藥劑或抗凝血因子VIII抑制綜合症的治療藥劑，含有上面(9)到(14)中任一項的抗體或其功能片段作為活性成分。
(19)在此，本發明的單克隆抗體識別的人CD40的表位，可以通過已知的方法來測定，例如通過檢測與從人CD40的一級胺基酸序列得到的重疊的(overlapping)合成寡肽的結合(例如，Ed Harlow和David Lane(eds.)，抗體實驗室手冊，1988，冷泉港實驗室出版；美國專利No.4708871)。具有噬菌體展示過程(process)的肽文庫試劑盒(新英格蘭生物實驗室)也可以用於表位的圖譜定位。本發明也包括識別人CD40的新表位的抗體或其功能片段，它被上述各雜交瘤產生的抗體或其功能片段識別。
(20)本發明進一步提供了一種核酸(RNA或cDNA)，它編碼至少從上述各雜交瘤分離的抗體的重鏈和/或輕鏈的可變區，本發明還提供含有該核酸的載體和攜帶該核酸的寄主細胞。
以下詳細描述本發明。本說明書(specification)包括PCT申請PCT/US01/13672(2001年4月27日遞交)、日本專利申請2001-142482(2001年5月11日遞交)、日本專利申請2001-310535(2001年10月5日遞交)和美國專利申請USSN 10/040,244(2001年10月26日遞交)的說明書和/或附圖中公開的內容的一部分或全部，這些申請文本是本申請的優先權文本。
如後面所述，我們已經發現，已知的單克隆抗體5D12(ATCC No.HB-11339)是拮抗B細胞上的CD40的，不是拮抗DC上的CD40的。我們進一步發現，作為抗免疫球蛋白抗體交聯的結果，即使它們是阻遏CD40L的作用的拮抗性抗體，許多單克隆抗體顯示對其自身有激動活性。
1.定義用於本說明書的術語定義如下。
本發明中的術語「人CD40」指具有Clark等(E.A.Clark等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834494 1986)或Stamenkovic等(I.Stamenkovic等，EMBO J.81403，1989)顯示的胺基酸序列的多肽。特別地，人CD40是在B細胞、DC、巨噬細胞、內皮細胞、上皮細胞或這些細胞的腫瘤細胞的表面上表達的抗原多肽。
術語「抗CD40單克隆抗體」指抗細胞表達的CD40、全長的CD40或部分長度的CD40的任何單克隆抗體。更優選的抗CD40單克隆抗體結合了CD40的細胞外部分，提供了表達CD40的細胞上的激動或拮抗作用。
另外，本發明中的術語「抗體」來源於編碼組成免疫球蛋白的重鏈可變區、重鏈恆定區、輕鏈可變區和輕鏈恆定區的基因(通常稱為「抗體基因」)。本發明的抗體包括任何免疫球蛋白類別和具有任何同型(isotype)的抗體。本發明的抗體的術語「功能片段」是如上定義的抗體的一部分(部分片段)，指保留抗體對抗原的一種或多種作用的片段。這樣的功能片段的特定的例子包括F(ab』)2，Fab』，Fab，Fv，具有二硫鍵的FVs，單鏈FV(scFV)，和其多聚物(D.J.King.，單克隆抗體的應用和工程化，1998 T.J.International Ltd)。
本發明中的術語「人抗體」指這樣一種抗體，它是來源於人的抗體基因的表達產物。
術語「激動性」指促進CD40配體與細胞表面上表達的CD40結合的作用，所述細胞例如B細胞、腫瘤細胞或樹突狀細胞；或提供給表達CD40的細胞一種或多種作用，所述作用是通過CD40配體提供給表達CD40的細胞的。術語「激動性抗體」指具有這樣的激動性作用的抗體。
術語「拮抗性」指抑制CD40配體與細胞表面上表達的CD40結合的作用，所述細胞例如B細胞、腫瘤細胞或樹突狀細胞的；或中和CD40配體提供給表達CD40的細胞的一種或多種作用。術語「拮抗性抗體」指具有這樣的作用的抗體。
術語「樹突狀細胞(DC)」在本發明中指也稱為樹突狀白細胞的具有很強抗原呈遞功能的一組細胞。本文利用的樹突狀細胞是通過培養例如骨髓、臍帶血或外周血中含有的CD34陽性前體細胞誘導的。或者，樹突狀細胞可以通過在存在GM-CSF和IL-4的條件下培養外周血液中的CD14陽性單核細胞而得到。
術語「不成熟的DC」指DC是CD14陰性、CD1a強陽性、CD83、CD86陽性和MHC II類陽性。
術語「成熟的DC」指DC是CD14陰性、CD1a陽性和已經變成CD83、CD86和MHC II類強陽性。
術語「激活DC」在本發明中指DC通過對CD40刺激的應答誘導的變化。例如，它也指使不成熟的DC成熟，CD80、CD86和HLA-II類的高水平表達，和IL-12的生產的增強。或者，當T細胞共存在時，它也指刺激T細胞以促進它們的增殖。
術語「激活B細胞和B細胞系」在本發明中指細胞通過對CD40刺激的應答誘導的變化。例如，它指引起DNA合成，促進胸腺嘧啶的摻入，由此增加CD95的表達量。
2.抗體的獲得為了得到本發明的抗體，優選地利用作為抗原的用重組體產生和純化的表達人CD40或可溶的人CD40的基因重組小鼠細胞系的來免疫小鼠。用於免疫的小鼠在生產人抗體時是優選的(Tomizuka等，ProcNatl Acad Sci USA.，2000，97卷722)。通過選擇結合利用重組體已經生產和純化的可溶人CD40的單克隆抗體，也與B細胞以外的細胞上表達的CD40反應的抗體可以比通過選擇特異性地與B細胞反應的克隆的情況更容易地得到。雜交瘤可以通過Kohler和Milstein等的方法生產(Nature，1975，256卷495)，這一方法通常用於利用免疫小鼠的淋巴結或脾細胞來生產單克隆抗體中。
另外，可溶CD40L與CD40的結合是利用表面胞質團(plasmon)共振系統如BIAcore 2000(Biacore)來分析的，然後選擇不競爭CD40L的抗體。另外，選擇獨立地抑制B淋巴瘤的細胞生長的抑制的抗體。另外，利用是否它們作用於DC作為指示物的條件進行抗體的選擇。這能利用生產和選擇具有作用於樹突狀細胞或B細胞而不與CD40L競爭，和抑制表達CD40的癌症細胞的增殖的抗體。
本發明的抗體是通過培養這樣得到的雜交瘤得到的。另外，編碼人單克隆抗體或其可變區的基因是從生產抗體的細胞如B細胞或雜交瘤克隆的，克隆的基因摻入適當的載體，然後將載體導入寄主(例如，哺乳動物細胞系，大腸桿菌，酵母細胞，昆蟲細胞或植物細胞)，由此可以製備基因重組技術產生的重組抗體(P.J.Delves.，ANITBODYPRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.，1997 WILEY，P.Shepherd和C.Dean.，單克隆抗體.，2000，牛津大學出版社；J.W.Goding.，單克隆抗體原理和實踐，1993，學術出版社)。另外，生產了靶抗體基因通過轉基因動物生產技術摻入內源基因的轉基因的小牛，山羊，羊或豬。從這些轉基因動物的奶，可以大量得到從抗體基因衍生的單克隆抗體。當在體外培養雜交瘤時，它們是在適於各種條件如待培養的細胞種類的特性，實驗和研究的目的和培養的方法的各種方法下生長，維持和存儲的。然後，雜交瘤可以利用從已知的用於在培養上清液中生產單克隆抗體的已知的營養培養基或已知的鹼性培養基誘導和製備的任何營養培養基來培養的。
3.篩選利用人B淋巴瘤通過分析進行激動性抗體的篩選，所以可以選擇促進CD95表達的抗體。另外在純化的DC培養溶液中加入抗體，任何選擇導致成熟的抗體。或者，選擇在利用不成熟的DC的混合淋巴細胞的反應中具有增殖的T細胞的活性的抗體。另外，在成熟的DC中加入抗體，然後，選擇具有促進IL-12成熟的作用的抗體。另外，選擇具有抑制表達CD40的腫瘤細胞的生長的活性或誘導腫瘤細胞的細胞死亡的活性的抗體。根據抗體是否利用例如表面胞質團共振系統(BIOCore)抑制可溶CD40與可溶CD40配體的結合可以區別與CD40L的競爭。另外，根據抗體是否增強CD40配體在B細胞系上的作用也可以從其他情況中區別。
利用人B淋巴瘤通過分析進行拮抗性抗體的篩選。在存在抗-FLAG抗體時加入具有FLAG作為標記的可溶CD40L能篩選更強烈地抑制人B淋巴瘤細胞上可溶CD40L與CD40的結合的抗體。通過導入編碼CD40L而不是CD40L的基因，也可以利用在細胞表面表達許多CD40配體的重組細胞。隨後，人抗體與抗人IgG抗體交聯，所以除去了激活交聯的B淋巴瘤的克隆。另外，選擇當在成熟的CD中加入CD配體時在利用純化和成熟的DC的混合的淋巴細胞反應中具有抑制T細胞增殖的活性的抗體或具有抑制IL-12生產的作用的抗體。
如上所述得到的抗體至少具有下面的任何特性，所述特性被認為是治療效果。
(1)對於激動性抗體(a)在存在LPS(脂多糖)和IFNγ時抗體作用於樹突狀細胞引起IL-12產生。LPS濃度在這一情況中範圍為10pg/ml到10ng/ml，IFNγ濃度範圍為10-4M到10-2M。在利用G28-5抗體作為對照的實驗中，IL-12的生產量比已知的激動性抗CD-40抗體更大。當濃度為0.1μg/ml或更大的抗體加入到濃度為1×106g細胞/毫升的樹突狀細胞中時，產生了100pg/ml或更多的IL-12，或者當加入濃度為1μg/ml或更多時，產生了1,000pg/ml或更多，優選地10,000pg/ml或更多的IL-12(參見實施例9和13)。
(b)抗體具有結合樹突狀細胞的作用，能引起樹突狀細胞的成熟。另外，當抗體濃度為20μg/ml或更低，優選地0.1到15μg/ml；更優選地5到15μg/ml時，與樹突狀細胞一起培養，引起成熟的活性比G28-5抗體更高(參見實施例9)。
(c)抗體具有比G28-5抗體更大的促進已建立的B細胞系表達CD95的活性。在這一情況中，抗體濃度為10μg/ml或更大，優選地1μg/ml或更大，更優選地0.1μg/ml或更大，更優選地0.01μg/ml或更大，最優選地0.001μg/ml或更大，促進CD95表達的活性比實驗中用作對照的G28-5抗體的活性更大。在實驗中用作對照的G28-5抗體促進CD95的表達的活性與濃度10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml和0.01μg/ml的抗體的比例如下所示(表1)。
表1
促進CD95的表達是指，抗體激活已建立的B細胞系。這裡，已建立的B細胞系的例子包括Ramos細胞和HS-Sulton細胞。另外，Ramos細胞是Burkitt淋巴瘤，它是人樹突狀B細胞的模型細胞。HS-Sulton細胞是Burkitt淋巴瘤(參見實施例6和12)。
(d)抗體具有抑制DNA合成，胸腺嘧啶摻入，和已建立的B細胞系(Ramos細胞或HS-Sulton細胞)的增殖的活性，這一活性比G28-5抗體的活性更高。在這一情況中，抗體的濃度至少0.05μg/ml，或者更優選地是0.1到15μg/ml(參見實施例8)。
(e)抗體誘導已建立的B細胞系的細胞死亡(參見實施例16)。
(f)抗體不抑制CD40配體與CD40的結合。術語「不抑制」指CD40L可以結合CD40到與當沒有抗體時甚至當抗體已經結合了CD40(即沒有抗體)時相同的程度。CD40配體和CD40中的一個或兩個可以是在膜上或可溶蛋白質上表達的蛋白質類型(參見實施例11)。
例如，通過雜交瘤KM302-1(FERM BP-7578)和雜交瘤KM341-1-19(FERM BP-7759)可以產生具有上面的特性的抗體。
測定了雜交瘤KM341-1-19產生的單克隆抗體的重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)可變區的核苷酸序列和胺基酸序列(實施例17)。本發明提供了至少編碼重鏈可變區或全長重鏈的DNA，和編碼雜交瘤KM341-1-19產生的單克隆抗體的輕鏈可變區的DNA。DNA也包括其他編碼由於密碼子間並的相同的胺基酸序列和實施例17中所述的那些。另外，本發明提供了至少重鏈可變區的胺基酸序列或全長重鏈的胺基酸序列和輕鏈可變區的胺基酸序列特異的單克隆抗體或其功能片段，如實施例17中公開的。
(2)對於拮抗性抗體(g)抗體中和了CD40的配體的作用。這裡，術語「配體的作用」指T細胞上或其他細胞上表達的配體的作用和自由CD40的配體的作用(參見實施例7和14)。
(h)抗體中和已建立的B細胞系上CD40的配體對表達CD40的細胞的一種或多種作用，和在上面的已建立的B細胞系上通過與抗免疫球蛋白抗體的交聯對CD40不具有拮抗作用。這一作用比5D12的更弱。「配體對表達CD40的細胞的作用」指表達CD40的細胞的激活。特別是，在B細胞中，該效果指胸腺嘧啶摻入和B細胞增殖的激活，和在建立的B細胞系中CD95增強的表達的激活。另外，在DC中，該效果指DC成熟的激活，CD86和HLA-DR的增強的表達的激活，共存的T細胞的胸腺嘧啶的激活，增殖的促進，IL-12和IL-10的生產的激活等。通過導致在培養溶液中產生0.1μg/ml或更多的抗免疫球蛋白抗體進行抗免疫球蛋白抗體的交聯(見實施例7)。
(i)抗體緩解或中和交聯的CD40L或細胞表達的CD40L的活性來增強已建立的B細胞系中CD95的表達。抗體也緩解或中和CD40L的活性，其作用是通過與抗體的交聯和抗體標記的抗體來增強的。CD40與表達CD40的細胞的配體(包括游離的配體和特異的細胞表達的配體)的結合，最後導致細胞在細胞表面上表達CD95(Fas)。因此，本發明的拮抗性抗體通過與CD40結合抑制上面的信號傳導，從而中和CD95的表達。在這一情況中的抗體的濃度是1μg/ml或更多，優選地是0.1μg/ml或更多(參見實施例7和14)。
(j)抗體拮抗DC上的CD40。具體地說，抗體緩解或中和CD40L激活DC的活性。當通過T細胞上的配體與DC共存在來刺激DC時，T細胞被激活，所以促進了胸腺嘧啶的摻入等。在混合的淋巴細胞的反應中，允許來源於不同的個體DC和T細胞共存在，DC與T細胞相互反應，從而導致T細胞激活。本發明的拮抗性抗體通過結合CD40抑制上面的相互反應，導致胸腺嘧啶的摻入受到抑制。在這一情況中抗體的濃度至少是0.001μg/ml，或者更優選地是0.1到10μg/ml(參見上面的拮抗性抗體是通過例如雜交瘤KM281-1-10(FERM BP-7579)和KM281-2-10-1-2(FERM BP-7580)(2001年5月9日，國際專利生物保藏(IPOD)，保藏於高級工業科學和技術研究所(Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki)和4D11(FERM BP-7758)產生上面的拮抗性抗體。
(3)本發明的抗體可被改變成不同亞類的抗體(例如，參見EP314161公開)，方法是用本領域已知的遺傳工程技術，特別是通過用確定另一亞類的區域取代抗體重鏈中確定亞類的區域。重鏈可變區和另一亞類的恆定區可以直接連接。例如，改變本發明的抗體的亞類成IgG2或IgG4能使降低抗體與Fc受體的結合程度。具體地說，根據Kabat等(Sequence of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，國家健康研究所，Bethesda，Md.(1991))在人抗體重鏈，EU指標118(Ala)，119(Ser)位點中導入Nhe I位點(GCTAGC)。利用關到另一亞類的限制酶消化，不改變胺基酸可以關到另一亞類IgG。另外，人工改變恆定區的胺基酸序列，或具有這樣的改變的胺基酸序列的恆定區序列與本發明的抗體的可變區的結合可以降低Fc受體的結合程度(Lund J.等，J.Immunol.1991147卷2657-2662)，或者也可以提高或降低CDC的活性(Tao M.等，J.Exp.Med.19911025-1028卷，Idusogie E E.等，J.Immunol.2001 166卷2571-5)。另外，為了避免ADCC，CDC等的作用，可以先選擇IgG2或IgG4亞類抗體。另外，放射性核素，細菌毒素，化學治療劑，前藥等與本發明的抗體的結合可以進一步增強抗疾病如癌症的治療效果。
4.藥物組合物含有本發明的純化抗體的藥物製劑的藥物組合物也包括在本發明的範圍內。這樣的藥物組合物優選地除了抗體還含有生理可接受的稀釋劑或載體，或者可以是與其他抗體或其他藥物如抗生素的混合物。適當的載體的例子包括但不限於生理鹽溶液，磷酸緩衝鹽溶液，磷酸緩衝鹽葡萄糖溶液和緩衝生理鹽。另外，抗體是凍幹的，然後當需要時加入上述的緩衝水溶液來重建。給藥的途徑的例子包括口服途徑和腸胃外途徑，包括靜脈內，肌肉內，皮下和腹膜內注射或藥物遞送。
在這種情況中，與有效劑量的本發明的抗體，適當的稀釋劑結合給藥的有效劑量的範圍是每次給藥，每公斤體重0.1mg到100mg。給藥進行的間隔是2天到8星期。
當利用含有本發明的抗體的藥物組合物時，特別是當利用激動性抗體時，組合物用作免疫強化藥物(抗病毒藥劑和抗感染藥物)，抗腫瘤藥劑或抗自體免疫疾病藥劑。這些疾病的多個例子可以同時發生。另外，抗體也可以用作與疫苗如癌症特異的肽結合的佐劑。當組合物含有拮抗性抗體，在器官移植是用作器官移植基礎上的免疫阻遏藥劑(針對免疫注射的預防性或治療性藥劑或在移植胰島，腎等的基礎上的GVHD)，或抗自體免疫疾病藥劑(例如，針對風溼病，或作為針對動脈硬化，瀰漫性硬化，系統性紅斑狼瘡，自發性凝血病或Crohn疾病的治療藥劑)，針對過敏如氣喘的治療藥劑，或針對血液凝血因子VIII抑制綜合症的治療藥劑。這些疾病的多個例子可以同時發生。
當將抗CD40抗體用於針對CD40參與的疾病的治療方法時，可以期望通過利用DC的功能作為指示物來選擇抗體，提供更好的治療效果。
在激動性抗體的情況中，可以期望具有強免疫強化作用的抗體可以通過選擇可以更有效地激活DC的抗體來得到。另外，利用成熟的DC作為指示物促進IL-12的生產，可以得到具有強CTL誘導作用的抗體。通過CTL誘導，可以得到除去用病毒或腫瘤細胞感染細胞內高度有效的抗體。另外，因為可以期望協同效果，優選的抗體結合CD40而不抑制CD40配體與CD40的結合。當考慮癌症治療時，如果存在直接誘導表達CD40的癌症細胞的細胞死亡或抑制它們的增殖和有效激活DC的抗體，可以從中期望協同效果，這樣的抗體可以是用於抵抗不表達CD40的腫瘤的治療藥劑。這些抗體可以認為是可以用作抵抗病毒疾病的治療藥劑或抗腫瘤藥劑。
同時，特異性地結合CD40和抑制CD40L的結合而不激活CD40的抗體也可以期望不僅能夠抑制B細胞的配體的作用，而且抑制DC上的作用。但是，利用它們在B細胞上的效果作為指示物至今已經得到抗體。所以，得到同樣在樹突狀細胞上有強大的阻遏作用的抗體抱歉開發它們作為藥物產物是非常有意義的。另外，關心的是通過如上所述的交聯，抗CD40抗體可以具有基本上相反的作用。所以，甚至通過交聯也不激活CD40的抗體叔需要的。同樣關心的是，迄今作為抗人CD40抗體報導的從非人哺乳動物如小鼠衍生的單克隆抗體，包括小鼠單克隆抗體的可變區和人免疫球蛋白的恆定區的嵌合抗體，和CDR移植產生的人源化抗體具有抗原性。所以，人抗體可以如願作為抗體移植與CD40配體的結合。
附圖簡述
圖1顯示KM302-1抗體促進CD95的表達。
圖2A顯示拮抗性抗體中和Ramos細胞上CD40配體的作用。
圖2B顯示拮抗性抗體中和Ramos細胞上CD40配體的作用。
圖3顯示KM281-1-10抗體中和Ramos細胞上CD40配體的作用。
圖4顯示交聯的KM281-1-10抗體不促進CD95的表達。
圖5顯示交聯的5D12抗體促進CD95的表達。
圖6顯示腫瘤細胞上的KM302-1抗體的增殖阻遏效果。
圖7顯示KM302-1抗體促進DC的成熟。
圖8顯示KM302-1抗體促進DC的IL-12的產生。
圖9顯示KM281-1-10抗體中和DC上CD40配體的作用。
圖10顯示KM281-1-10抗體中和DC上CD40配體的作用。
圖11顯示KM302-1抗體激活不成熟的DC-MLR。
圖12顯示KM341-1-19抗體等促進Romos細胞的CD95的表達。
圖13顯示KM341-1-19抗體促進成熟的DC的IL-12的產生。
圖14顯示KM341-1-19抗體促進成熟的DC的IL-10的成熟。
圖15顯示4D11抗體等中和Ramos細胞上CD40配體的作用。
圖16顯示KM302-1抗體在人腫瘤細胞移植小鼠模型上抗腫瘤的效果。
圖17顯示KM341-1-19抗體顯示了抵抗腫瘤細胞的增殖阻遏效果。
圖18顯示F4-465，4D11和KM281-1-10阻遏了特異於抗原的IgG的生產。
圖19顯示F4-465，4D11和KM281-1-10阻遏了特異於抗原的IgM的產生。
圖20顯示F4-465阻遏了扁桃體B細胞的增殖。
實施本發明的最佳方式參考實施例，本發明將被進一步詳細敘述。但是，本發明的技術範圍不受這些實施例的限制。
實施例1抗原的製備
(1)細胞EL-4細胞是來源於小鼠的已建立的T細胞系，可以容易地得到(ATCCTIB-39)。從ATCC購買了Ramos B細胞(ATCC No.CRL-1596)和產生小鼠抗CD40抗體的雜交瘤G28-5(HB-9110)和5D12(HB-11339)。
(2)抗原的表達和純化利用人CD40 cDNA(Genbank登記號NM_001250)作為模板，和下面的引物，在條件20個循環的95℃5秒，55℃30秒和72℃30秒，通過PCR擴增細胞外的區域。
引物 15』-CCCAGATCTG TCCATCCAGA ACCACCCACTGCATGCAGAG-3』(SEQ ID NO1)引物 25』-ACAAGATCTG GGCTCTACGT ATCTCAGCCGATCCTGGGGA C-3』(SEQ ID NO2)在蜂毒素信號序列之前和pFastBac載體(Gibco BRL)的來源於人IgG1的FC或來源於小鼠的FC區域之前插入擴增的cDNA。為了產生CD40，根據說明製備了重組的杆狀病毒。用重組病毒感染Th5細胞，然後培養4天。用0.22nm濾紙處理上清液，在其中加入蛋白質G瓊脂糖(Amersham Pharmacia)，然後在4℃溫和搖動混合物。過一夜後，將瓊脂糖轉移到柱上，然後用20個體積的PBS洗滌。用20mM的甘氨酸緩衝液(pH3.0)洗脫人CD40 FC蛋白質。從Randolph J.Noelle(Inui，S等，EJI，20，1747-1753，1990)得到細胞表面上表達CD40的載體。用Xba I酶裂解全長的cDNA，然後插入pCDNA3(INVITROGEN)。將載體導入EL-4細胞，然後在存在0.5mg/mlG418(Gibco BRL)時培養細胞，得到溫度表達的菌株。利用FITC結合的抗體人CD抗體(Pharmingen)進行FACS分析證實CD40的表達。
實施例2用於免疫的小鼠的產生用於免疫的小鼠具有一個遺傳背景，它們對於內源的Ig重鏈和κ輕鏈是純合的，同時小鼠含有染色體14片段(SC20)，含有人Ig重鏈基因座位，和人Igκ鏈轉基因(Kco5)。這些小鼠是具有人Ig重鏈基因的A系小鼠和具有人Igκ鏈轉基因的B系小鼠雜交產生的。A系小鼠對於破壞的內源Ig重鏈和κ輕鏈是純合的，含有染色體14片段(SC20)，可以傳遞到子代，上述如在Tomizuku等的報告中(Tomizuka.等，Proc Natl Acad Sci USA.，2000 97卷722)。免疫A系的小鼠，得到下面的雜交瘤F2-103和F5-77。另外，B系的小鼠(轉基因小鼠)對於裂解的內源Ig重鏈和κ輕鏈是純合的，含有人Igκ鏈轉基因(Kco5)，上述如在Fishwild等的報告中所述(Nat Biotechnol.，1996 14卷845)。
將通過A系的雄性小鼠和B系的雌性小鼠雜交，或A系的雌性小鼠與B系的雄性小鼠雜交得到的具有在血清中同時檢測到的人Ig重鏈和κ輕鏈的個體用於下面的免疫實驗。另外，通過與Kirin BreweryCo.，ltd的合同可以得到上面的產生人抗體的小鼠。通過免疫上面的小鼠，得到下面的雜交瘤KM302-1，KM341-1-19，KM643-4-11，2053，2105，3821，3822，285，110，115，KM281-1-10，KM281-2-10-1-2，KM283-5，KM292-1-24，KM225-2-56，KM341-6-9，4D11，5H10，11E1，5G3，3811，3411和3417。另外，含有Kuroiwa等報導的人抗體的Lambda鏈的嵌合小鼠也用於下面的免疫實驗。從小鼠得到了雜交瘤F4-465。
實施例3製備抗人CD40的人單克隆抗體根據單克隆抗體的實驗方法(Tamie ANDO等，KODANSHA，1991)的引言中所述的一般的方法製備本實施例中的單克隆抗體。本文中用作免疫原的人CD40是實施例1中製備的人CD40人FC和表達CD40的EL-4-細胞。本文中用於免疫的動物是生產實施例2中製備的人免疫球蛋白的產生人抗體的小鼠。
用2到100μg/CD40免疫hFc每個小鼠免疫產生人抗體的小鼠。除了第一次免疫，將抗原溶液與等體積的Freund不完全佐劑(Sigma)混合，然後皮下注射進幾個分開的位點。每10天到3星期進行免疫約3到4次。對於第一次免疫，利用Freund不完全佐劑(Sigma)。從小鼠尾巴收集血液，然後利用ELISA測定抵抗CD40的人抗體γ和κ。在切除脾臟之前3到4天，通過尾靜脈注射20μg CD40溶解於PBS的Fc進行最後的免疫。
用表達人CD40的小鼠EL-4細胞免疫產生人抗體的小鼠。在PBS中懸浮EL-4細胞(108細胞/毫升)，然後與等體積的預先與PBS乳化的RIBI佐劑溫和混合。約10天到3星期用細胞進行免疫3到5次。當不利用佐劑時，用X射線，用8000rad輻射細胞。
從免疫的小鼠通過外科得到脾臟。將收集到的脾細胞與小鼠骨髓瘤SP2/10(ATCC No.CRL1581)以比例5到1混合。用聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim)座位細胞融合的試劑融合細胞，製備大量的雜交瘤。通過在10％的胎牛血清(FCS)，次黃嘌呤(H)，氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)補充的含有HAT的DMEM培養基(Gibco BRL)中培養選擇雜交瘤。在96孔的微滴平板(Beckton Dicknson)上進行培養。利用酶聯免疫吸附測試(ELISA)和螢光激活的細胞分揀器(FACS)，如實施例4所述測定進行產生抗人CD40的人單克隆抗體的雜交瘤克隆的篩選。
通過如下所述的3種類型ELISA和FACS分析進行ELISA篩選產生人單克隆抗體的雜交瘤。所以，得到大量的產生具有人免疫球蛋白γ鏈(hIgγ)和人免疫球蛋白輕鏈κ的人單克隆抗體的雜交瘤。在包括這一實施例的下面的任一實施例中，顯示實施例的實驗結果的表和圖，利用信號給出了本發明的產生人抗人CD40單克隆抗體的雜交瘤克隆。後面注有「抗體」的克隆指各個雜交瘤產生的抗體，或攜帶從雜交瘤分離的抗體基因(全長或可變區)的寄主細胞產生的重組抗體。另外，在文中明確的範圍內，雜交瘤克隆的名稱可以表達抗體的名稱。
下面的雜交瘤克隆代表單個克隆。
激動性抗體KM302-1，KM341-1-19，KM643-4-11，2053，2105，3821，3822，285，110，115，F1-102，F2-103，F5-77和F5-157。
拮抗性抗體KM281-1-10，KM281-2-10-1-2，KM283-5，KM292-1-24，KM225-2-56，KM341-6-9，4D11，5H10，11E1，5G3，3811，3411，3417和F4-465在2001年5月9日保藏了它們中間的3個雜交瘤克隆KM302-1，KM281-1-10和KM281-2-10-1-2，在2001年9月27日保藏了克隆KM341-1-19和4D11，在2001年4月17日保藏了克隆2105，是根據布達佩斯條約保藏在國家高級工業科學和技術研究所國際專利生物保藏處(Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)的。根據布達佩斯條約，具有F2-103，F5-77和F5-157的重鏈和輕鏈可變區的質粒在2001年4月19日，雜交瘤克隆F1-102和F4-465在2001年4月24日保藏在ATCC(美國類型培養物保藏中心，University Blvd.10801，Manassas，Virginia，USA)(表2)。
表2
實施例4雜交瘤的篩選檢測具有人免疫球蛋白γ鏈的單克隆抗體以50μl/孔在96孔的ELISA的微滴平板(Maxisorp，Nunc)的每個孔中加入實施例1中製備的人CD40小鼠FC(1μg/ml)，在4℃，將吸收到微滴平板上的人CD40小鼠FC溫育。然後，丟棄上清液，然後在每個孔中加入封閉試劑(Block Ace，DAINIPPPONPHARMACEUTICAL)，接著在室溫下溫育封閉。在每個孔中加入每個雜交瘤的上清液(50μl)，反應，然後用0.1％的含有吐溫20的磷酸緩衝液(PBS-T)洗滌每個孔。然後，用含有FBS的1％的PBS-T稀釋用過氧化物酶標記的山羊抗人IgG(γ)抗體(Sigma，A0170)5000倍。在每個孔中加入溶液(50μl/ml)，然後進行溫育。用PBS-T洗滌微滴平板3次，然後在每個孔中加入色原底物溶液(TMB，50μl/孔，SUMITOMO BAKELITE)，接著在室溫下溫育30分鐘。在每個孔中加入終止溶液(50μl/孔)終止反應。用微滴讀數器測定450nm波長處的吸光值。通過FACS分析陽性孔中的培養上清液，然後選擇Ramos細胞染色的孔。通過限制稀釋方法克隆孔中的細胞，然後在每個孔中得到I個克隆的細胞。利用人CD40小鼠FC，通過ELISA證實hk-陽性狀態。作為結果，從20個小鼠得到173個克隆的抗人CD40抗體。表3(激動性抗體)和表4(拮抗性抗體)顯示了這些抗體中的一些。在這些激動性抗體中，利用表達CD40L的細胞，表達CD40的細胞和抗體，在競爭實驗中至少KM341-1-19和2105不明顯地與配體競爭。
表3激動性抗體
表4拮抗性抗體
除了利用過氧化物酶標記的山羊抗人Igk抗體(稀釋1000倍，50μl/孔，Southern Biotechnology)，對於人免疫球蛋白γ鏈，以和上面所述的ELISA方法相似的方法檢測了含有人免疫球蛋白輕鏈k(Igk)的單克隆抗體。
除了利用用過氧化物酶標記的羊抗人IgG1抗體，羊抗人IgG2抗體，羊抗人IgG3抗體或羊抗人IgG4抗體(每個稀釋2,000倍，50μl/孔，The Binding Site)，對於人免疫球蛋白γ鏈，以和上面的ELISA方法相同的方法鑑定了各個單克隆抗體亞類。
抵抗表達人CD40的細胞的各個單克隆抗體的反應實驗通過FACS分析研究了有報導表達CD40的抵抗Ramos細胞系的各個單克隆抗體的反應性。
將Ramos細胞系在0.1％NaN3和2％含有FCS的PBS的染色緩衝液(SB)中懸浮，濃度為2×106/ml。細胞懸浮液(100μl/孔)分布到96孔的園底平板(Beckton Dickinson)。加入各個雜交瘤的培養上清液(50μl)，在冰溫度進行溫育30分鐘。將抵抗人血清白蛋白的人IgG1抗體用作陰性對照，用雜交瘤培養基製備成濃度2μg/ml。加入50μl的溶液，然後在冰溫度下溫育15分鐘。在用SB洗滌後，加入稀釋250倍的R-PE螢光標記的抗人抗體(Southern Biotechnology)，然後在冰的溫度下溫育15分鐘。在用SB洗滌2次後，將產物懸浮於300到500μl的FACS懸浮液中，然後通過FACS(FACSort and FACScan，BecktonDickinson)測量每個細胞的螢光強度。作為結果，選擇具有Ramos細胞繫結合活性的抗體。
實施例5製備各個抗體通過下面的方法製備含有單克隆抗體的培養上清液。
從ATCC(ATCC No.HB-9110)得到生產G28-5抗體的雜交瘤。在含有小牛胰島素(5μg/ml，Gibco BRL)，人轉移素(5μg/ml，Gibco BRL)，乙醇胺(0.01mM，Sigma)和亞硒酸鈉(2.5×10-5nM，Sigma)的eRDF培養基(Kyokutoseiyaku)中馴化生產抗CD40抗體的雜交瘤。在旋轉燒瓶中培養雜交瘤。當雜交瘤的變化的細胞速度達到90％，收集培養上清液。將收集的上清液應用到10μm和0.2μm的濾紙(German Science)上，使消除碎片如雜交瘤。
通過下面的方法從上面的培養上清液純化抗CD40抗體。利用Hyper D蛋白質A柱(NGK INSULATORS，LTD)或蛋白質G柱(為了純化小鼠IgG1，Amersham Pharmacia Biotech)，根據附帶的說明利用PBS(-)作為吸收緩衝液和0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3)作為洗脫緩衝液將含有抗CD40抗體的培養上清液進行親和純化。加入1MTris-HCl(pH8.0)或Na2HPO4溶液調整洗脫部分使具有約7.2的pH。利用洗脫膜(10000cut，Spectrum Laboratories)或SP柱(Amersham PharmaciaBiotech)，用PBS(-)取代製備的抗體溶液，然後利用膜濾紙MILLEX-GV(MILLIPORE)，孔大小0.22μm進行過濾滅菌。測量280nm處的吸光值發現純化的抗體的濃度，然後以1.45OD處1mg/ml計算。
實施例6通過抗CD40激動性抗體促進Ramos細胞中的CD95的表達在96孔平板中以100μl/孔(每孔5×104細胞)接種5.0×105細胞/孔的Ramos細胞懸浮液。用培養基將雜交瘤培養上清液或純化的抗體稀釋到20μg/ml，然後以100μl/孔的濃度在96孔的平板中加入溶液。在過夜培養後，收集細胞，然後通過FACSCan或FACSort(Beckton Dickinson)，利用R-PE標記的抗體CD95抗體(Pharmingen NJ)分析。圖1顯示了結果。在圖1中的水平軸表明了CD95的表達強度。用厚線表示抗體的加入，用薄線表示沒有抗體加入。顯示KM302-1抗體促進CD95的表達比是已知抗體的G28-5抗體更好。即，KM302-1抗體顯示有更有效的激動性。
實施例7通過抗CD40拮抗性抗體在Ramos細胞中阻遏CD95的表達以50μl/孔，將1.0×106細胞/ml的Ramos細胞懸浮液接種到96孔平板中。用培養基將雜交瘤培養上清液或純化的抗體調整到2μg/ml，然後以100μl/孔加入到96孔的平板中。在培養基中加入可溶的CD40配體(4μg/ml，ALEXIS CORPORATION)和抗FLAG抗體(4μg/ml，M2，Sigma)。在過夜培養後，收集細胞，然後利用R-PE標記的抗CD95的抗體(Pharmingen NJ)通過FACS分析。圖2A和2B和3顯示了結果。在圖中的水平軸表示了CD95的表達強度。通過下面的雜交瘤的每一個KM281-1-10，KM281-2-10-1-2，KM283-5，KM292-1-24和KM225-2-56產生的抗體將CD95的表達阻遏到與陰性對照相同的程度。
在圖3中，KM281-1-10抗體(下面的組)阻遏CD95的表達比5D12抗體(中間的組)更有效，該已知的抗體僅僅輕微地阻遏CD95的表達。特別是，KM281-1-10抗體顯示更有效的拮抗性。所以，人單克隆抗體顯示是拮抗性抗體。
抗免疫球蛋白抗體交聯的效果以50μl/孔在96孔的平板中接種1.0×106細胞/ml的Ramos細胞懸浮液。用培養基將雜交瘤培養上清液或純化的抗體調整到2μg/ml，然後以100μl/孔加入到96/孔的平板中。以4μg/ml將抗人IgG抗體(Sigma，I3382)或抗小鼠IgG抗體(Biosource，AMI3401)加入到培養基中，然後以50μl/孔將培養基加入到96孔的平板中。在過夜培養後，收集細胞，然後利用R-PE標記的抗CD95抗體(Pharmingen NJ)通過FACS分析。圖4和5顯示了結果。在圖中的水平軸表示了CD95的表達強度。通過各個雜交瘤KM281-1-10和KM281-2-10-1-2產生的抗體阻遏了CD95的表達。相反，下面各個雜交瘤，5D12，KM283-5，KM292-1-24和KM225-2-56產生的抗體增強了CD95的表達。
實施例8抗CD40的激動性抗體阻遏Ramos細胞中的增殖以100μl/孔在96孔的平板中接種1.0×105細胞/ml的Ramos細胞和HS-Sulton細胞懸浮液。等量的純化抗體或可溶的CD40配體的混合物，和抗FLAG抗體(M2)加入到培養基中。在培養2天後，加入10μl的100uCi/ml3H-胸腺嘧啶(Amersham Pharmacia)。在18小時後，利用Macro 96收集器(SKATRON)在Printer Filtermat A(Wallac)中收集培養產物，乾燥，然後在Betap；Scint(Wallac)中浸沒孔。在包裝後，利用1205BETAPLATE液體閃爍計數器測量活性。圖6顯示了結果。在圖中，縱軸表示了細胞摻入的3H胸腺嘧啶的量，水平軸表示了培養溶液中抗體或CD40L的濃度。當在Ramos細胞和HS-Sulton細胞中加入KM302-1抗體時，摻入的胸腺嘧啶的量比常規的G28-5抗體和CD40L的更低。所以，顯示KM302-1抗體是可以有效阻遏腫瘤細胞的增殖的激動性抗體。
實施例9 CD40激動性抗體活化樹突狀細胞(1)材料和方法從Genzyme techne購買重組人IL-4。從Miltenyi Biotech GmbH購買抗人CD24MACS小珠。從Nycomed Pharma AS購買Lymphoprep。用於培養的培養基是用10％熱失活的FCS(Cell CultureTechnologies)，10mM HEPES(Sigma)，55μM 2-巰基乙醇(Gibco BRL)和硫酸鏈黴素(MEIJI SEIKA KAISHA，LTD.)，可以誘導DC。用2％FCS(Cell Culture Technologies)和0.02％Azaid補充的PBS(Sigma)洗滌染色過程中的細胞。當將細胞冷凍時，利用了Cell banker(NipponZenyaku Kogyo)。
(2)誘導單核細胞衍生的DC通過Lymphoprep密度梯度離心從外周血液製備單核細胞(PBMC)。利用抗人CD14 MACS小珠將細胞進行陽性選擇，分離細胞成CD14陽性部分和陰性部分。在陽性部分加入重組的人GM-CSF(50ng/ml)和重組人IL-4(100ng/ml)，接著在用10％FCS補充的RPMI1640培養基中在6孔的平板中培養。在開始培養時，細胞培養的濃度是1×106細胞/ml(3ml每孔)。在培養過程中，每2天交換培養基一次。在離心管中取10％的培養溶液進行培養基交換，離心溶液，除去上清液，用比取樣培養溶液體積大2倍的新的培養溶液(含有上面濃度的細胞激動素等)懸浮，然後將懸浮液回到每個孔中。在培養6天後，收集細胞，計算細胞數，然後在上面的培養基中以1×106/ml的濃度懸浮細胞。然後在24孔的平板中再培養4天。在這一時期中，沒有進行培養交換(每孔的細胞數1×106細胞，細胞濃度為1×106細胞)。
(3)細胞染色和流動細胞計分析為了染色，利用了抗HLA-DR抗體(同型對照大鼠IgG2a)，抗-CD86抗體(同型對照大鼠IgG1)和抗-CD83抗體(同型對照大鼠IgG2b)。首先加入抗體，然後在4℃進行溫育30分鐘。在洗滌3次後，利用FACS Calibur(Beckton Dickinson)進行分析。
(4)增強成熟DC的IL-12分泌能力在如上所述得到不成熟的DC後，加入LPS(400pg/ml)和IFNγ(10-3M)，然後進行培養2天，得到成熟的DC。在成熟的DC中，加入10μg/ml的抗CD40抗體或同型對照。在24小時後的上清液中，利用ELISA測量IL-12的產生(Pharmingen)。
(5)結果和討論圖7顯示了M302-1抗體，激動性抗體對DC成熟的效果，圖8顯示KM302-1抗體對成熟的DC的IL-12生產的抗體的效果。成熟的程度是可以與作為對照的G28-5抗體相比較。當檢測了CD86的表達和HLA-DR的表達時，進一步提高了表達，即在KM302-1抗體的情況與G28-5抗體比較時成熟的程度提高了。同時顯示，用KM302-1抗體處理成熟的DC提高了IL-12的分泌。因此，顯示KM302-1抗體可以作為DC上的激動性抗體。
實施例10 DC-MLR在2000rpm離心正常人收集的血液(外周血)10分鐘，然後吸收血清。用PBS再懸浮血液細胞部分，然後在Ficoll(AmershamPharmacia)上溫和放置。在2000rpm進行離心30分鐘，所以收集在中間層中的PBMC部分，用PBS洗滌2次，然後利用MACS用於一些細胞分離過程。
利用MACS(Miltenyi Biotec GmbH)附帶的說明進行培養DC的單核分離。這可以簡單地解釋如下。在PBMC(1×108)加入800μl MACS緩衝液和200μl的MACS CD14(Miltenyi Biotec GmbH，502-01)，然後在4℃處理15分鐘。將細胞吸收到MACS LS柱，然後洗滌。將吸收到柱上的細胞作為單核細胞收集。在不吸收到柱上的細胞中加入MACS HLA-DR(Miltenyi Biotec GmbH，461-01)。用BS柱除去HLR-DR陽性細胞，從而製備T細胞部分。通過FACS測量CD3陽性細胞的比例，然後從T細胞部分的總細胞數計算T細胞的基本數。在6孔培養平板中，在含有100ng/ml的IL-4(RD系統)，50ng/mlG-CSF(KIRIN)和10％的FCS(SIGMA)的R0培養基(補充了β-巰基乙醇(Gibco)和含有HEPES(SIGMA))中培養得到的單核細胞，濃度是1×106細胞/ml。在培養後的第5天，在細胞中加入10ng/ml的LPS(DIFCO)分化成熟的DC。
通過混合已經從不同的人中分離的T細胞和成熟的DC進行MLR。測定T細胞與DC的細胞比例為1∶80，確定T細胞的數目是2×105細胞/孔。首先，在DC中加入抗體反應，進行了30分鐘。隨後，加入T細胞，進行培養4天，然後加入10μl的100uCi ml3H-胸腺嘧啶(Amersham Pharmacia)。14小時後，在Printed Filtermat A(Wallac)中利用Macro 96收集器(SKATRON)收集細胞，乾燥，然後在Betap；Scint(Wallac)中浸沒孔。在包裝後，利用1205BETAPLATE液體閃爍計數器測定活性。通過混合已經從不同的人分離的T細胞和成熟的DC進行利用不成熟的DC的MLR。在細胞的比例為T細胞比DC140的情況中，相同地進行MLR。圖9和10顯示了結果。顯示加入KM281-1-10抗體降低了胸腺嘧啶的摻入，所以MLR被阻遏。另外，在圖10中顯示，KM283-5和5D12抗體沒有阻遏DC-MLR。即，只有KM281-1-10抗體是中和DC上的CD40配體的作用的拮抗性抗體。另外，圖11顯示了利用不成熟的DC，在MLR上檢測拮抗性抗體KM302-1抗體的效果的結果。DC的激活促進了與T細胞的相互反應，引起了胸腺嘧啶的摻入的增強。這些結果表明，KM302-1是作用於不成熟的DC的激動性抗體。
實施例11 CD40抗體對CD40L與CD40結合的作用利用BIAcore 2000(Biacore)引起抗CD40抗體結合固定的CD40人FC，然後檢測可溶的CD40L與CD40的結合數中的變化。根據系統附帶的說明，在CM晶片(CM5，Biacore)上固定可溶的CD40人FC。然後，加入25μg/ml抗CD40的抗體，結合CD40。另外，加入10μg/ml的可溶CD40L用於結合。測定在加入CD40L之前和之後的結合數之間的差異。當加入對照IgG時，CD40L的結合數是100RU。在加入KM302-1抗體後，CD40L的結合數是110RU，在加入KM283-5抗體後，CD40L的結合數是18RU。所以，顯示KM302-1抗體不抑制CD40L與CD40的結合。
實施例12通過抗CD40激動性抗體促進Ramos細胞中的CD95的表達根據實施例6的方法分析實施例4中得到的雜交瘤的純化的抗體，然後選擇產生激動性抗體的克隆(每個孔的細胞數目5×104；細胞濃度2.5×105/ml)。圖12顯示了結果。在圖中，水平軸表示了，在培養溶液中的抗體濃度，縱軸表示了平均螢光強度，即CD95的表達強度。在濃度0.01μg/ml或更大，KM341-1-19和2105抗體顯示比已知的小鼠抗體G28-5抗體更有效地促進Ramos細胞的CD95的表達。特別是，KM341-1-19和2105抗體顯示是更有效的激動性抗體。另外，KM341-1-19和2105抗體(0.01μg/ml)的激動活性(增強Ramos細胞的CD95的表達)是比G28-5抗體的更高(10μg/ml)(圖12)。表5概括了在各個抗體的濃度下，CD95的表達水平比加入G28-5抗體表達的水平高或低多少倍。
表5
實施例13 CD40激動性抗體激活樹突狀細胞根據實施例9的方法，測定了CD40激動性抗體對成熟的DC產生IL-12和IL-10的影響。通過ELISA(Pharmingen)方法測定了IL-10。圖13和14顯示了結果。顯示用KM341-1-19抗體處理增強IL-12的分泌。相反，甚至當允許已經用X射線(5000rad)輻射的表達CD40配體的重組L細胞(2×105細胞/ml)共存時，IL-12和IL-10在培養溶液中的濃度是254和51pg/ml。它們比加入1μg/ml KM341-1-19抗體時更低。
如上所述，顯示KM341-1-19抗體作為有效的激動性抗體作用於DC。引起成熟的DC分泌IL-12的KM341-1-19抗體(0.1μg/ml)的激動活性比G28-5抗體(100μg/ml)更高。引起成熟的DC分泌IL-12的KM341-1-19抗體(1μg/ml)的激動性活性是比G28-5抗體高100倍或更大(圖13)。另外，引起成熟的DC分泌IL-10的KM341-1-9抗體(1μg/ml)的激動活性是比G28-5抗體(100μg/ml)高10倍或更高(圖4)。另外，因為KM341-1-19抗體的亞類是IgG2，抗體對Fc受體比IgG1或IgG3具有更低的結合活性。它使NK細胞的殺死活性的能力和激活補充系統的能力也是弱的。因此，由於抗體的關係，表達CD40的細胞的功能或細胞本身的數目降低的危險可能是低的。另外，抗體不容易通過Fc受體交聯，所以可以期望藥物效果是容易控制的，不會造成由於交聯引起的體內激動活性的任何大的波動。
實施例14抗CD40拮抗性抗體阻遏Ramos細胞中的CD95表達在平底的96孔平板(每個孔細胞數5×104)中以50μl/孔接種1.0×106細胞/ml的Ramos細胞懸浮液。在96孔平板中以100μl/孔加入用培養基稀釋的純化的抗體。以1.0×105細胞/ml製備表達CD40配體的重組小鼠L細胞(參見Sproggs，M.K.等，J.Exp.Med.，1761543，1992；Garrone，P.等，J.Exp.Med.，1821265，1995等)。以50μl/ml加入製備的細胞(每孔的Ramos細胞的數目5×104；Ramos細胞濃度2.5×104細胞/ml；每孔的小鼠L細胞的數目5×103；小鼠細胞濃度2.5×104細胞/ml)。在過夜培養後，收集細胞，然後利用R-PE標記的抗CD95抗體，通過FACS分析。圖15顯示了結果。在圖中，縱軸表示了平均螢光強度，即CD95的表達強度。當已知的5D12抗體輕微阻遏表達時，甚至在0.1μg/ml濃度時4D11抗體阻遏CD95的表達到和其中沒有加入表達CD40L的細胞的陰性相同的程度。另外，在1μg/ml的濃度下，4D11，F4-465和KM281-1-10阻遏CD95的表達到和其中沒有加入表達CD40L的細胞的陰性對照的情況相同的程度。這些結果顯示，4D11，F4-465和KM281-1-10抗體是更有效的拮抗性抗體。表6顯示了當沒有加入拮抗性抗體的對照的值定為100時，相對於各個抗體濃度的平均螢光強度的相對值。
表6
實施例15抗CD40激動性抗體在Ramos細胞移植中的抗腫瘤效果在5星期大的C.B.17/Icr-scidJc1小鼠(CLEA JAPAN)中靜脈內注射抗-asialo GM1抗體。1天後，作為腫瘤細胞在每個小鼠中靜脈內注射5×106個Ramos細胞。1天後，靜脈內注射作為陰性對照的KM302-1抗體或抗人白蛋白人IgG抗體。每個小鼠的KM302-1抗體的劑量是1、10、100μg，陰性對照抗體是100μg。對5個小鼠一次給藥這些抗體。圖16顯示了結果。在移植後34天，所有的陰性對照給藥小鼠組死亡，而所有5個給藥10μg和100μg KM302-1抗體的小鼠組都生存。所以，證實了KM302-1抗體的抗腫瘤效果。KM302-1抗體是IgG4亞類，所以依賴Fc受體介導的抗體的細胞毒性(ADCC)和整個系統的激活是弱的。儘管有這些特徵，也觀察到單個給藥10μgKM302-1抗體延長了有腫瘤的小鼠的生存時間。
實施例16通過抗CD40激動性抗體阻遏Ramos細胞的增殖在補充了10％FBS的RPMI1640的培養基中以1×104細胞/ml的Ramos細胞懸浮液，然後在96孔的平板中各分配100μl的懸浮液。將與配體相同濃度的抗體FLAG抗體(M2)與可溶配體(反應溶液濃度10μg/ml)共存，從而增強活性。在培養5天後，在每個孔中加入20μl的MTS試劑，然後允許反應2到3小時。在無細胞和無抗體的孔和含有細胞和抗體的孔之間的差異在490nm波長處測定，從而測定可變的細胞數。另外，利用96孔的U底平板相似地將阻遏增殖的作用與G28-5抗體比較。加入利用培養基製備成2μg/ml的KM341-1-19抗體或G28-5抗體。圖17顯示了結果。在已經加入KM341-1-19抗體的孔中，觀察死亡細胞，細胞數明顯比已經加入G28-5抗體或配體的孔的更低，吸光值也低。這些結果表明，腫瘤細胞的增殖被阻遏了，誘導了細胞的死亡。
實施例17抗體基因的cDNA克隆培養生產KM341-1-19，2105，110，115，KM281-1-10，4D11，KM643-4-11，F4-465，F2-103和F5-77抗體的雜交瘤，然後通過離心收集細胞。在細胞中加入TRIZOL(Gibco BRL)，然後根據附帶的說明萃取總RNA。利用SMART RACE cDNA擴增試劑盒(CLONTECH)根據附帶的說明進行抗體cDNA的可變區的克隆。利用5μg總RNA作為模板，構建第一鏈cDNA。為了擴增KM341-1-19，2105，110，115，KM281-1-10，4D11，KM643-4-11，F2-103和F5-77的重鏈(H鏈)，利用了Z-Taq(Takara)和UMP和hh6引物，重複98℃1秒和68℃30秒的循環30次。另外，利用1μl的反應溶液作為模板和MUMP和hh3引物，重複98℃1秒和68℃30秒的循環20次。為了擴增F4-465重鏈，利用了UMP和hh2引物和Advantage 2PCR試劑盒(Clonthech，cat#1910)，進行5個循環的94℃5秒，72℃3分鐘，5個循環的94℃5秒，70℃0秒和72℃3分鐘，和25個循環的94℃5秒，68℃10秒和72℃3分鐘。
Hh6引物5』-GGT CCG GGA GAT CAT GAG GGT GTC CTT-3』(SEQ ID NO3)Hh3引物5』-GTG CAC GCC GCT GGT CAG GGC GCC TG-3』(SEQ ID NO4)Hh2引物5』-GCT GGA GGG CAC GGT CAC CAC GCT G-3』(SEQID NO5)隨後，利用PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化擴增的PCR產物，然後利用hh4作為引物確定核苷酸序列。或者，將產物亞克隆進PCR-Script(Stratagene，Lajolla，CA)或 PCR-Blunt(Invitrogene，Carlsbad，CA)，然後進行測序。根據序列的信息，合成特異於抗體重鏈的引物。在KM341-1-19的情況中合成341H引物，在2105的情況中合成2105Hsal引物，在110的情況中合成110Hsal引物，在KM281-1-10的情況中合成281Hsal引物，在4D11的情況中合成4D11Sal引物，在KM643-4-11的情況中合成643Hsal引物，在F4-465的情況中合成H11-9 5』引物，在F2-103的情況中合成F2-103H引物，在F5-77的情況中合成F5-77H引物。利用抗體重鏈特異引物和hh4，從第一鏈cDNA擴增cDNA，然後利用擴增的產物作為模板和特異於抗體的引物確定相反方向的序列。
Hh4引物5』-GGTGCCAGGGGGAAGACCGATGG-3』(SEQ IDNO6)341H引物5』-atatgtcgacGCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAG-3』(SEQ ID NO7)2105HsalatatgtcgacTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAG(SEQ ID NO8)110HsalatatgtcgacTTCCATTCGGTGATCAGCACTGAACAC(SEQ ID NO9)281HsalatatgtcgacTTTGAGAGTCCTGGACCTCCTGTG(SEQ IDNO10)4D11SalatatgtcgacGAGTCATGGATCTCATGTGCAAG(SEQ IDNO11)643HsalatatgtcgacCCAGGGCAGTCACCAGAGCTCCAGAC(SEQID NO12)H11-95』-ACC GTG TCG ACT ACG CGG GAG TGA CT(SEQ IDNO13)F2-103Haccgtgtcga cgctgatcag gactgcaca(SEQ ID NO14)F5-77H accgtgtcga cggtgatcag gactgaacag(SEQ ID NO15)利用UMP和hk2引物和通過重複循環98℃1秒和68℃30秒30次擴增KM341-1-19，2105，110，115，KM281-1-10，4D11，KM643-4-11，F2-103和F5-77的輕鏈(L鏈)。利用UMP和hL2引物通過重複循環98℃1秒和68℃30秒30次擴增輕鏈F4-465。利用PCR純化試劑盒純化擴增的PCR產物，然後利用hk6或hL2引物確定核苷酸序列。根據序列，合成輕鏈特異的引物。在KM341-1-19的情況中合成341K引物，在2105的情況中合成2053KBg1引物，在110和115的情況中合成110KBg1引物，在KM281-1-10的情況中合成281KBg1引物，在4D11的情況中合成4D11KBg1，在KM643-4-11的情況中合成643KBg1引物，在F4-465的情況中合成Lamda 5』引物，在F-103和F5-77的情況中合成F2-103K引物。
在341-1-19，110，115，KM643-4-11，KM281-1-10，4D11和2105的情況中，利用輕鏈特異引物和hk6引物從第一鏈cDN擴增cDNA。然後，從兩個方向利用擴增的產物作為模板確定序列。對於F4-465，F2-103和F5-77，亞克隆進PCR-Script(Stratagene，Lajolla，CA)或PCR-Blunt(Invitrogene，Carlsbad，CA)確定序列。
hk2引物5』-GTT GAA GCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3』(SEQ ID NO16)hL2引物5』-TCT TCT CCA CGG TGC TCC CTT CAT-3』(SEQ IDNO17)341K引物atatagatctGAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGG-3』(SEQ ID NO18)2053KBg1atatagatctCGCGGGGAAGGAGACTGCTCAGTT(SEQID NO19)110KBg1atatagatctAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGC(SEQID NO20)281KBg1atatagatctGAGCTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGG(SEQ ID NO21)4D11KBg1atatagatctTAAGCAAGTGTAACAACTCAGAGTAC(SEQ ID NO22)643KBg1atatagatctGAGGAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGG(SEQ ID NO23)Lamda 5』-AACTCCAGATCTGCCTCAGGAAGCAGCATC(SEQID NO24)F2-103Kaactccagat ctagggcaag cagtggtaac(SEQ ID NO25)hk6引物5』-TGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTG-3』(SEQID NO26)
編碼全長H鏈和L鏈可變區的341-1-19的DNA和H鏈和L鏈的胺基酸序列分別顯示如下。
H鏈DNA的翻譯起始點是從SEQ ID NO27的第50位腺嘌呤(A)開始的ATG密碼子，終止密碼子是第1472位胸腺嘧啶(T)開始的TGA。抗體可變區和恆定區的邊界定位於5』末端的第493位腺嘌呤(A)和第494位鳥嘌呤(G)之間。在胺基酸序列中，H鏈可變區的範圍是N末端到SEQ ID NO28的第148位絲氨酸(S)殘基，恆定區是第149位丙氨酸(A)和後面的殘基。據基因序列推測軟體(Signa1 P第2版)推測，H鏈信號序列範圍是N末端到SEQ ID NO28的第20位絲氨酸(S)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ ID NO28的第21位穀氨酸(Q)。
L鏈DNA的翻譯起始點是從SEQ ID NO29的5』末端的第29位A開始的，可變區範圍是5』末端到第400位腺嘌呤(A)。在胺基酸序列中，可變區範圍是SEQ ID NO30的N末端到第124位賴氨酸(K)。純化的L鏈蛋白質的N末端的分析發現，L鏈信號序列範圍是SEQ ID NO30的N末端到第20位甘氨酸(G)，成熟的蛋白質的N末端是SEQ ID NO30的第21位穀氨酸(E)。
341-1-19 H鏈(SEQ ID NO27)GTCGACGCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAGCCACCAGAGCTCCAGACAATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATCGTGATTATGTAGGATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGACACATCCAACAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACAAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGATTACCCCTACTACTACAGTATGGACGT
CTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCAGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGGATCC
341-1-19 H鏈胺基酸序列(SEQ ID NO28)MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRDLEWLGRTYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK341-1-19 L鏈(SEQ ID NO29)ACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG341-1-19 L鏈胺基酸序列(SEQ ID NO30)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSL8PGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEpEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRT編碼H鏈可變區和L鏈可變區的2105的DNA和H鏈和L鏈的胺基酸序列如下。
H鏈DNA的翻譯起始點是從SEQ ID NO31的5』末端的第70位腺嘌呤(A)開始的ATG密碼子。抗體可變區和恆定區的邊界定位於5』末端的第495位腺嘌呤(A)和第496位鳥嘌呤(G)之間。在胺基酸序列中，H鏈可變區範圍是SEQ ID NO32的N末端到第142位絲氨酸(S)殘基，恆定區是第149位丙氨酸(A)和後面的殘基。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，H鏈信號序列範圍是SEQ ID NO32的N末端到第19位半胱氨酸(C)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ ID NO32的第20位穀氨酸(E)。
L鏈DNA的翻譯起始點是從SEQ ID NO33的5』末端到第28位A，可變區是從5』末端到第405位腺嘌呤(A)。在胺基酸序列中，可變區範圍是SEQ ID NO34的N末端到第126位賴氨酸(K)。據基因推測軟體(Signal P第二版)推測，L鏈信號序列範圍是SEQ ID NO34的N末端到第20位甘氨酸(G)。據認為成熟蛋白質的N末端是SEQ IDNO34的第21位穀氨酸(E)。
2105 H鏈(SEQ ID NO31)CTGAACACAGACCCGTCGACTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAGCACTGAACACAGAGGACTCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCTTGGTGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTTCGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG2105 H鏈胺基酸序列(SEQ ID No32)MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTK
2105 L鏈(SEQ ID NO33)CTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTG2105 L鏈胺基酸序列(SEQ IDNO34)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTV編碼H鏈可變區和L鏈可變區的110的DNA和H鏈和L鏈的胺基酸序列分別如下。
H鏈DNA的翻譯起始點是從SEQ ID NO35的5』末端的第60位腺嘌呤(A)開始的ATG。抗體可變區和恆定區的邊界定位於5』末端的第479位腺嘌呤(A)和第480位鳥嘌呤(G)之間。在胺基酸序列中，H鏈可變區範圍是SEQ ID NO36的N末端到第140位絲氨酸(S)殘基，恆定區是第141位丙氨酸(A)和後面的殘基。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，H鏈信號序列範圍是SEQ ID NO36的N末端到第19位半胱氨酸(C)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ ID NO36的第20位穀氨酸(Q)。
L鏈DNA的翻譯起始點是從SEQ ID NO37的第35位A開始的ATG密碼子，可變區範圍是SEQ ID NO37的5』末端的第35位A開始，可變區範圍是5』末端到第421位腺嘌呤(A)。在胺基酸序列，可變區範圍是SEQ ID NO38的N末端到第129位賴氨酸(K)。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，L鏈信號序列範圍是SEQ IDNO38的N末端到第22位半胱氨酸(C)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ ID NO38第23位纈氨酸(V)。
110 H鏈(SEQ ID NO35)CTGAACACAGACCCGTCGACTTCCATTCGGTGATCAGCACTGAACACAGAGGACTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTATTAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGCTACAATATTTTGACTGGTTATTTTGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGG110 H鏈胺基酸序列(SEQ ID NO36)MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGYNILTGYFGYWGQGTLVTVSSASTK110 L鏈(SEQ ID NO37)TCACAGATCTAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGTCATCTGGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGATGAGTCAGGGCATTAGCAGTGATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTGAGCTCCTGATCTCTGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTTTTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACG
110 L鏈胺基酸序列(SEQ ID NO38)MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCVIWMTQSPSLLSASTGDRVTISCRMSQGISSDLAWYQQKPGKAPELLISAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYYSFPWTFGQGTKVEIKRT編碼H鏈可變區和L鏈可變區的115的DNA和H鏈和L鏈的胺基酸序列分別如下。
H鏈DNA的翻譯起始點是SEQ ID NO39的5』末端的第60位腺嘌呤(A)開始的ATG密碼子。抗體的可變區和恆定區的邊界定位於5』末端的第479位腺嘌呤(A)和第480位鳥嘌呤(G)之間。在胺基酸序列中，H鏈的可變區範圍是SEQ ID NO40的N末端到第140位絲氨酸(S)殘基，恆定區是第141位丙氨酸(A)和後面的殘基。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，H鏈信號序列範圍是SEQ ID NO40的N末端到第19位半胱氨酸(C)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ ID NO40的第20位穀氨酸(Q)。
L鏈DNA的翻譯起始點是SEQ ID NO41的5』末端的第35位A開始的ATG，可變區範圍是5』末端到第421位腺嘌呤(A)。在胺基酸序列中，可變區範圍是SEQ ID NO42的N末端到第129位賴氨酸(K)。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，L鏈信號序列範圍是SEQ ID NO42的N末端到第22位半胱氨酸(C)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ ID NO42的第23位纈氨酸(V)。
115 H鏈(SEQ ID NO39)CTGAACACAGACCCGTCGACTTCCATTCGGTGATCAGCACTGAACACAGAGGACTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGAATGATGGAAGTATTAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGCTACAATATTTTGACTGGTTATTTTGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG115H鏈胺基酸序列(SEQ ID NO40)MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWNDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGYNILTGYFGYWGQGTLVTVSSASTK115 L鏈(SEQ ID NO41)TCACAGATCTAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGTCATCTGGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGATGAGTCAGGGCATTAGCAGTGATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTGAGCTCCTGATCTCTGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCTGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTATTATAGTTTTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGFACG
115L鏈胺基酸序列(SEQ ID NO42)MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCVIWMTQSPSLLSASTGDRVTISCRMSQGISSDLAWYQQKPGKAPELLISAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYCQQYYSFPWTFGQGTKVEIKRT編碼H鏈可變區和L鏈可變區的281-1-10的DNA和H鏈和L鏈的胺基酸序列分別如下。
H鏈DNA的翻譯起始點是從SEQ ID NO43的5』末端的第52位腺嘌呤(A)開始的ATG密碼子。抗體可變區和恆定區的邊界定位於5』末端的第468位腺嘌呤(A)和第469位鳥嘌呤(G)之間。在胺基酸序列中，H鏈的可變區範圍是SEQ ID NO44的N末端和第139位絲氨酸(S)殘基，恆定區是第140位丙氨酸(A)和後面的殘基。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，H鏈信號序列的範圍是SEQ IDNO44的N末端到第19位絲氨酸(S)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ ID NO44的第20位穀氨酸(Q)。
L鏈DNA的翻譯起始點是從SEQ ID NO45的5』末端的第41開始的ATG密碼子，可變區的範圍是從5』末端到第424位腺嘌呤(A)。在胺基酸序列中，可變區的範圍是從SEQ ID NO46的N末端到第128位賴氨酸(K)。據基因序列推測的軟體(Signal P第二版)推測，L鏈的信號序列範圍是從SEQ ID NO46的N末端到第20位甘氨酸(G)。成熟蛋白的N末端被認為是SEQ ID NO46的第21位穀氨酸(E)。
281-1-10 H鏈(SEQ ID NO43)CTGAACACAGACCCGTCGACTTTGAGAGTCCTGGACCTCCTGTGCAAGAACATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATC了ATTACAGTGGGAGCACCAACTACAATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAATTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCCCCCTTGCACGGTGACTACAAATGGTTCCACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG281-1-10 H鏈胺基酸序列(SEQ ID NO44)MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARAPLHGDYKWFHPWGQGTIVTVSSASTK281-1-10 L鏈(SEQ ID NO45)TCACAGATCTGAGCTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATCAAACGTACG
281-1-10 L鏈胺基酸序列(SEQ ID NO46)METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSpGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPITFGQGTRLEIKRT編碼H鏈可變區和L鏈可變區的4D11的DNA和H鏈和L鏈的胺基酸序列分別如下。
H鏈DNA的翻譯起始點是從SEQ ID NO47的5』末端的第16位腺嘌呤(A)開始的ATG密碼子。抗體可變區和恆定區的邊界定位於5』末端的第456位腺嘌呤(A)和第457位鳥嘌呤(G)之間。在胺基酸序列中，H鏈可變區範圍是SEQ ID NO48的N末端到第147位絲氨酸(S)殘基。恆定區是第148位丙氨酸(A)和後面的殘基。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，H鏈信號序列範圍是SEQ ID NO48的N末端到第26位絲氨酸(S)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQID NO48的第27位穀氨醯胺(Q)。
L鏈DNA的翻譯起始點是SEQ ID NO49的5』末端的第59位A開始的ATG密碼子，可變區的範圍是5』末端到第442位腺嘌呤(A)。在胺基酸序列中，可變區的範圍是SEQ ID NO50的N末端到第128位賴氨酸(K)。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，L鏈信號序列範圍是SEQ ID NO50的N末端到第22位半胱氨酸(C)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ ID NO50的第21位丙氨酸(A)。
4D11 H鏈(SEQ ID NO47)ATATGTCGACGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGCGGCTCCATCAGCAGTCCTGGTTACTACGGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATAAAAGTGGGAGCACCTACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGACCTGTAGTACGATATTTTGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC4D11 H鏈胺基酸序列(SEQ ID NO48)MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGGWIRQPPGKGLEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVTV8SAS4D11 L鏈(SEQ ID NO49)AGATCTTAAGCAAGTGTAACAACTCAGAGTACGCGGGGAGACCCACTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAATTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACG
4D11 L鏈胺基酸序列(SEQ ID NO50)MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRT編碼H鏈可變區和L鏈可變區的KM643-4-11的DNA和H鏈和L鏈的胺基酸序列分別如下。
H鏈DNA的翻譯起始點是SEQ ID NO51的5』末端的第1位腺嘌呤(A)開始的ATG密碼子。抗體可變區和恆定區的邊界是定位於5』末端的第447位腺嘌呤(A)和第448位鳥嘌呤(G)之間。在胺基酸序列中，H鏈可變區範圍是SEQ ID NO52的N末端到第149位絲氨酸(S)殘基，恆定區是第150位丙氨酸(A)和後面的殘基。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，H鏈信號序列範圍是SEQ ID NO52的N末端到第20位絲氨酸(S)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ IDNO52的第21位穀氨醯胺(Q)。
L鏈DNA的翻譯起始點是SEQ ID NO53的5』末端的第38位A開始的ATG密碼子，可變區範圍是5』末端到第409位腺嘌呤(A)。在胺基酸序列中，可變區範圍是SEQ ID NO54的N末端到第124位賴氨酸(K)。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，L鏈信號序列範圍是SEQ ID NO34的N末端到第20位甘氨酸(G)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ ID NO54的第21位穀氨酸(E)。
KM643-4-11 H鏈(SEQ ID NO51)ATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCATTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAAAGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACCCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGTATTACTATGGTTCGGGGAGCTATCCCTACTACTACCAAATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCKM643-4-11 H鏈胺基酸序列(SEQ ID NO52)MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSFTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYKDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGYYYGSGSYPYYYQMDVWGQGTTVTVSSASKM643-4-11 L鏈(SEQ ID NO53)AATTGAGGAACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGTGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAAC
KM643-4-11 L鏈胺基酸序列(SEQ ID NO54)MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGESATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGGGTKVEIKR編碼H鏈可變區和L鏈可變區的F4-465的DNA和H鏈和L鏈的胺基酸序列分別如下。
H鏈DNA的翻譯起始點是SEQ ID NO55的5』末端的第47位腺嘌呤(A)開始的ATG密碼子。抗體可變區和恆定區的邊界定位於5』末端的第484位腺嘌呤(A)和第445位鳥嘌呤(G)之間。在胺基酸序列中，H鏈可變區的範圍是SEQ ID NO56的N末端到第146位絲氨酸(S)殘基，恆定區是第147位丙氨酸(A)和後面的殘基。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，H鏈信號序列範圍是SEQ ID NO56的N末端到第19位絲氨酸(S)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQID NO56的第20位穀氨醯胺(Q)。
L鏈DNA的翻譯起始點是SEQ ID NO57的5』末端的第81位A開始的ATG密碼子，可變區範圍是5』末端到第440位(C)。在胺基酸序列中，可變區範圍是SEQ ID NO58的N末端到第120位蘇氨酸(T)。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，L鏈信號序列範圍是SEQ ID NO58的N末端到第19位丙氨酸(G)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ ID NO58的第20位絲氨酸(S)。
F4-465 H鏈(SEQ ID NO55)CTGAACACAGACCCGTCGACTACGCGGGAGACCACAGCTCCACACCATGGACTGGACCTGGAGGATCCTATTCTTGGTGGCAGCAGCAACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCCCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAGCTATGCTATGAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCAACACTGGGAACCCAACGTATGCCCAGGGCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGTAGTACCAGTTGCTATGAGGGTAACTCACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAF4-465 H鏈胺基酸序列(SEQ ID NO56)MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGSELKKPGASVKVPCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREVVPVAMRVTHYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTF4-465 L鏈(SEQ ID NO57)CTGGGTACGGTAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCACAGATCTGCCTCAGGAAGCAGCATCGGAGGTGCCTCAGCCATGGCATGGATCCCTCTCTTCCTCGGCGTCCTTGTTTACTGCACAGGATCCGTGGCCTCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGGCCCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGTTCTGGAGATAAATTGGGGGATAATTTTACTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTTTCAGGATTGGAAGCGGCGCCCAGGGATCCCTGCGCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACATCAGCACTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAG
CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATGAATTCAGATCCGTTAACGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACCAACATAF4-465 L鏈胺基酸序列(SEQ ID NO58)MAWIPLFLGVLVYCTGSVASYELTQPPSVSVAPGQTASITCSGDKLGDNFTCWYQQKPGQSPVLVIFQDWKRRPGIPARFSGSKSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDISTVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS編碼H鏈可變區和L鏈可變區的F2-103的DNA和H鏈和L鏈的胺基酸序列分別如下。
H鏈DNA的翻譯起始點是SEQ ID NO59的第32位腺嘌呤(A)開始的ATG密碼子。抗體可變區和恆定區的邊界定位於5』末端的第463位腺嘌呤(A)到第464位鳥嘌呤之間。在胺基酸序列中，H鏈可變區的範圍是SEQ ID NO60的N末端到第144位絲氨酸(S)殘基，恆定區是第145位丙氨酸(A)和後面的殘基。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，H鏈信號序列範圍是SEQ ID NO60的N末端到第19位半胱氨酸(C)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ IDNO60的第20位穀氨酸(E)。
L鏈DNA的翻譯起始點是SEQ ID NO61的5』末端的第29位A開始的，可變區範圍是5』末端到第415位腺嘌呤(A)。在胺基酸序列中，可變區範圍是SEQ ID NO62的N末端到第129位賴氨酸(K)。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，L鏈信號序列範圍是SEQID NO62的N末端到第22位半胱氨酸。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ ID NO62的第23位Asp(D)。
F2-103 H鏈(SEQ ID NO59)GCTGATCAGGACTGCACACAGAGAACTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTCAGTACCTACTGGATGCACTGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGTGTG GGTCTCACGTATTAATAGTGATGGGAGTAGCACAACCTACGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTG TATTACTGTGCAAGAGATAGAGTACTATGGATCGGGGAGTTATCCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTF2-103 H鏈胺基酸序列(SEQ ID NO60)MEFGLSWVFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSTYWMHWVRQAPGKGLVWVSRINSDGSSTTYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRVLWIGELSYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSF2-103 L鏈(SEQ ID NO61)GGGGAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAAATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAACTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGCTCTATAAGGCATCTGGTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAA
TTCACTCTCACCATCAACAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTCTAATAGTTATTCGTGGACGTTCGGCCACGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAF2-103 L鏈胺基酸序列(SEQ ID NO62)MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKCDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNWLAWYQQKPGKAPKLLLYKASGLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTINSLQPDDFATYYCQQSNSYSWTFGHGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL編碼H鏈可變區和L鏈可變區的F5-77的DNA和H鏈和L鏈的胺基酸序列分別如下。
H鏈DNA的翻譯起始點是SEQ ID NO63的5』末端的第100位腺嘌呤(A)開始的ATG密碼子。抗體可變區和恆定區的邊界定位於5』末端的第528位腺嘌呤(A)和第529位鳥嘌呤(G)之間。在胺基酸序列中，H鏈可變區範圍是SEQ ID NO64的N末端到第143位絲氨酸(S)殘基，恆定區是第144位丙氨酸(A)和後面的殘基。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，H鏈信號序列範圍是SEQ ID NO64的N末端到第19位半胱氨酸(C)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQID NO64的第20位穀氨酸(E)。
L鏈DNA的翻譯起始點是SEQ ID NO65的5』末端的第59位A開始的，可變區範圍是5』末端到第445位腺嘌呤(A)。在胺基酸序列中，可變區範圍是SEQ ID NO66的N末端到第129位賴氨酸(K)。據基因序列推測軟體(Signal P第二版)推測，L鏈信號序列範圍是SEQID NO66的N末端到第22位半胱氨酸(C)。據認為，成熟蛋白質的N末端是SEQ ID NO66的第23位Asp(D)。
F5-77 H鏈(SEQ ID NO63)GGTCTATATAAGCAGAGCTGGGTACGTCCTCACATTCAGTGATCAGCACTGAACACAGACCCGTCGACGGTGATCAGGACTGAACAGAGAGAACTCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGATGGGGGGTACTATGGTTCGGGGAGTTATGGGTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCF5-77 H鏈胺基酸序列(SEQ ID NO64)MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGGYYGSGSYGYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP
F5-77 L鏈(SEQ ID NO65)CAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGGGGGAGTCAGACCCAGTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGTTCCCAGGTTCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGGATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGGATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATTTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAGCAGTTTCCCTCGGACATTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAF5-77 L鏈胺基酸序列(SEQ ID NO66)MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSVSGSVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAGSSLQSGVPSRFSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQASSFPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL實施例18抗體蛋白質在動物細胞中的表達在適當的載體中如N5KG1(IDEC Pharmaceuticals，美國專利6001358)摻入上面得到的含有抗體可變區的DNA片段，由此製得抗體表達載體。利用表達寄主細胞例如CHO-Ras(Katakura Y.等，Cytotechnology，31103-109，1999)是適當的。可以在寄主細胞中通過電穿孔導入載體。利用限制酶將約2μg的抗體表達載體線性化。在350V和500μF條件下，利用Bio-Rad電穿孔儀，在4×107CHO-Ras細胞中導入基因，然後在96孔培養平板上接種。加入對應於表達載體的選擇標記的藥物，繼續培養。當觀察菌落時，通過實施例4所述的方法選擇表達抗體的系。根據實施例5，從選擇的細胞純化抗體。
實施例19 CD40拮抗性抗體對抗原特異性抗體生產的阻遏作用通過腹膜內注射100μg(NP-CGG的量)的4-羥基-3-硝基苯乙醯基-雞γ球蛋白結合物(NP-CGGOsaka大學微生物疾病研究所HitoshiKIKUTANI教授提供)和ARAM(ARAM抗原識別激活基序)的複合物，使小鼠敏化，所述小鼠具有遺傳背景，使得它們是小鼠內源破壞的CD40純合的並錨定人CD40基因的轉基因。在抗原敏化之前立即通過尾靜脈給藥30或100μg的各單克隆抗體。將100μg的抗人白蛋白人IgG4抗體作為陰性對照給藥。在敏化後7天，從眶靜脈結叢收集血液，然後通過ELISA方法測定血清中的NP特異IgG1和IgM抗體的量。在ELISA(Maxisorp，Nunc)的96孔微平板的每個孔中通過加入NP結合的小牛血清白蛋白(NP-BSA2.5μg/ml)(50μl/孔)進行ELISA方法，在4℃溫育，然後吸收NP-BSA。然後，丟棄上清液，在每個孔中加入封閉試劑(Super Block，Pierce)，在室溫下進行溫育封閉。然後用0.1％的含有吐溫20的磷酸緩衝液(PBS-T)將每個孔洗滌3次。隨後，在每個孔中加入用10％含有BlockAce的PBS-T吸收的各個血清(50μl/孔)，接著在37℃溫育2小時反應。用PBS-T洗滌微滴平板3次。在每個孔(50/孔)中加入用10％的BlockAce的PBS-T稀釋鹼性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG或IgM抗體(COSMO BIO，1070-04或1020-04)1000倍製備的溶液，接著在37℃溫育2小時。然後，用PBS-T洗滌微滴平板3次，在每個孔中加入色原底物溶液(50μl/孔，Sigma104，磷酸底物)，然後用微滴平板讀數器測量405nm波長處的吸光值。圖18和19顯示了結果。在圖中，縱軸表示了在IgG1抗體的情況中，一個單位的稀釋10000倍的血清和在IgM抗體的情況中用稀釋100倍的血清的一個單位轉化得到的值。這裡，血清是將NP-CGG 2次注射進C57BL/6小鼠中，從小鼠收集血液，合併血清製備的。施用各100μg的F4-465、4D11和KM281-1-10抗體強力地阻遏了NP特異性IgG1和IgM抗體的生產。
實施例20通過CD40拮抗性抗體阻遏扁桃體B細胞的增殖從兒童醫院(San Diego，Califomia，U.S.A)得到人扁桃體。將扁桃體切成小片，研碎，然後通過60微米的尼龍網細胞濾網，製備細胞懸浮液。用PBS洗滌細胞懸浮液幾次，計算細胞數，然後用90％人血清(ICN)和10％的DMSO深低溫保存懸浮液。凍融後，在用10％的人血清和2.5μg/ml的兩性黴素(fangizon，Gibco/BRL)補充的標準RPMI中再懸浮細胞，然後使用。
在96孔的平板中加入1×105細胞，然後加入抗人CD40抗體，濃度為0.01、0.1、1.0和10μg/ml。在每個濃度以三份進行實驗。在每個孔中加入1μg/ml flag標記的CD40L(Alexis)和1μg/ml的CD40L增強抗體(Alexis)，接著培養3天。然後，在每個孔中加入1μCi[3H]胸腺嘧啶。12到15小時後，收集細胞，然後利用液體閃爍計數器測定扁桃體B細胞的增殖。將由於CD40L的刺激B細胞已經增殖而且沒有加入抗體時得到的計數確定為100，將沒有加入CD40L，B細胞也沒有刺激時得到的計數確定為0。例如，當相對計數測定為30，則可以表達為這一實驗中有70％的增殖抑制。
甚至當抗體濃度為100μg/ml時，5D12(已知的拮抗性抗體)也沒有顯示超過50％的增殖抑制。F4-465顯示甚至當抗體濃度低至0.01μg/ml時也有約80％的增殖抑制，當抗體濃度為0-1到10μg/ml時，顯示有約95％的增殖抑制(圖20)。
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工業應用性本發明提供了抗CD40的抗體。本發明的這一抗體包括對CD40有激動性的抗體和對CD40有拮抗性的抗體。所以，這些抗體可以分別用作例如免疫增強藥劑和免疫抑制藥劑。
序列表獨立文本SEQ ID NO1合成的DNASEQ ID NO2合成的DNASEQ ID NO3合成的DNASEQ ID NO4合成的DNASEQ ID NO5合成的DNASEQ ID NO6合成的DNASEQ ID NO7合成的DNASEQ ID NO8合成的DNASEQ ID NO9合成的DNASEQ ID NO10合成的DNASEQ ID NO11合成的DNASEQ ID NO12合成的DNASEQ ID NO13合成的DNASEQ ID NO14合成的DNASEQ ID NO15合成的DNASEQ ID NO16合成的DNASEQ ID NO17合成的DNASEQ ID NO18合成的DNASEQ ID NO19合成的DNASEQ ID NO20合成的DNASEQ ID NO21合成的DNASEQ ID NO22合成的DNASEQ ID NO23合成的DNASEQ ID NO24合成的DNASEQ ID NO25合成的DNASEQ ID NO26合成的DNA
權利要求
1.一種抗人CD40的抗體或其功能片段，具有選自下列特性(a)至(f)中的至少一個特性(a)在存在LPS和IFNγ時作用於樹突狀細胞，產生IL-12；(b)具有作用於樹突狀細胞導致細胞成熟的活性，該活性比G28-5抗體的更高；(c)具有促進已建立的B細胞系表達CD95的活性，該活性比G28-5抗體的更高；(d)具有抑制已建立的B細胞系增殖的活性，該活性比G28-5抗體的更高；(e)誘導已建立的B細胞系的細胞死亡；和(f)不抑制CD40配體與CD40的結合。
2.權利要求1所述的抗體或其功能片段，其中樹突狀細胞的成熟是在抗體濃度為20μg/ml或更低時進行的。
3.權利要求1所述的抗體或其功能片段，在抗體濃度為20μg/ml或更低時能促進已建立的B細胞系表達CD95。
4.權利要求1所述的抗體或其功能片段，其中已建立的B細胞系是Ramos或HS-Sulton。
5.權利要求1所述的抗體或其功能片段，其中當在濃度為1×106細胞/ml的樹突狀細胞中加入濃度為0.1μg/ml或更高的抗體時，產生了100pg/ml或更多的IL-12。
6.權利要求1所述的抗體或其功能片段，其中當在濃度為1×106細胞/ml的樹突狀細胞中加入濃度為1μg/ml或更高的抗體時，產生了1000pg/ml或更多的IL-12。
7.權利要求1所述的抗體或其功能片段，其中當在濃度為1×106細胞/ml的樹突狀細胞中加入濃度為1μg/ml或更高的抗體時，產生了10000pg/ml或更多的IL-2。
8.權利要求1所述的抗體或其功能片段，在抗體濃度範圍為0.01μg/ml到10μg/ml內，促進已建立的B細胞系(Ramos細胞)表達CD95，效力比作為對照的G28-5抗體表達的約高2到3倍或更高。
9.權利要求1所述的抗體或其功能片段，在抗體濃度為0.01μg/ml時，促進已建立的B細胞系(Ramos細胞)表達CD95，效力比作為對照的G28-5抗體表達的約高2到6倍或更高。
10.權利要求1所述的抗體或其功能片段，在抗體濃度為0.1μg/ml時，促進已建立的B細胞系(Ramos細胞)表達CD95，效力比作為對照的G28-5抗體表達的約高2到7倍或更高。
11.權利要求1所述的抗體或其功能片段，在抗體濃度為1μg/ml時，促進已建立的B細胞系(Ramos細胞)表達CD95，效力比作為對照的G28-5抗體表達的約高2到7倍或更高。
12.權利要求1所述的抗體或其功能片段，在抗體濃度為10μg/ml時，促進已建立的B細胞系(Ramos細胞)表達CD95，效力比作為對照的G28-5抗體表達的約高2到6倍或更高。
13.一種抗體或其功能片段，具有雜交瘤KM302-1(保藏號FERM BP-7578)、KM341-1-19(保藏號FERM BP-7759)、2105(保藏號FERM BP-8024)或F1-102(保藏號ATCC PTA-3337)產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列。
14.一種抗體或其功能片段，具有以下區域的成熟部分的胺基酸序列雜交瘤F2-103產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由保藏號ATCC PTA-3302和ATCC PTA-3303的質粒DNA編碼；雜交瘤F5-77產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由保藏號ATCC PTA-3304和ATCC PTA-3305的質粒DNA編碼；或雜交瘤F5-157產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由保藏號ATCCPTA-3306和ATCC PTA-3307的質粒DNA編碼。
15.一種抗體或其功能片段，具有以下區域的成熟部分的胺基酸序列雜交瘤KM341-1-19產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS28和30表示；雜交瘤2105產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS32和34表示；雜交瘤110產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS36和38表示；雜交瘤115產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS40和42表示；雜交瘤KM643-4-11產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS52和54表示；雜交瘤F2-103產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ IDNOS60和62表示；或者雜交瘤F5-77產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS64和66表示。
16.一種抗體或其功能片段，具有以下區域的成熟部分的胺基酸序列從雜交瘤KM341-1-19分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS27和29表示；從雜交瘤2105分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS31和33表示；從雜交瘤110分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS35和37表示；從雜交瘤115分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS39和41表示；從雜交瘤KM643-4-11分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS51和53表示；從雜交瘤F2-103分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQID NOS59和61表示；或從雜交瘤F5-77分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS63和65表示。
17.一種抗人CD40的抗體，或其功能片段，具有選自下列特性(g)到(j)中的至少一個(g)中和CD40配體的作用；(h)中和或減弱已建立的B細胞系上的CD40的配體在表達CD40的細胞上具有的一種或多種作用，並具有對已建立的B細胞系上的CD40的激動作用，由於抗免疫球蛋白抗體的交聯，該激動作用比5D12的更弱；(i)減弱或中和CD40配體對已建立的B細胞系的作用，增強CD95表達；和(j)對樹突狀細胞上表達的CD40具有拮抗作用。
18.權利要求17的抗體或其功能片段，當在用飽和量的表達CD40L的細胞補充濃度1×106細胞/m1的Ramos細胞中加入0.1μg/ml的抗體時，可以抑制Ramos細胞的表達水平比對照低約10％或更低。
19.權利要求17所述的抗體或其功能片段，當將濃度為1μg/ml的抗體加入補充了飽和量的表達CD40L的細胞的濃度為1×106細胞/ml的Ramos細胞中時，可以將Ramos細胞中CD95的表達抑制到與陰性對照相同的水平。
20.權利要求17所述的抗體或其功能片段，當將濃度為10μg/ml的抗體加入補充了飽和量的表達CD40L的細胞的濃度為1×106細胞/ml的Ramos細胞中時，可以將Ramos細胞中CD95的表達抑制到與陰性對照相同的水平。
21.權利要求17所述的抗體或其功能片段，當在補充了可溶的CD40L(1μg/ml)的1×105扁桃體B細胞中加入濃度為0.001μg/ml和10μg/ml之間的抗體時，扁桃體B細胞的增殖在體外被抑制了約80％到95％或更多。
22.權利要求17所述的抗體或其功能片段，當在補充了可溶的CD40L(1μg/ml)的1×105扁桃體B細胞中加入濃度為0.01μg/ml和10μg/ml之間的抗體時，扁桃體B細胞的增殖在體外被抑制了約95％或更多。
23.僅利要求17所述的抗體或其功能片段，當在補充了可溶的CD40L(1μg/ml)的1×105扁桃體B細胞中加入濃度為0.00μg/ml的抗體時，扁桃體B細胞的增殖在體外被抑制了約80％或更多。
24.一種抗體或其功能片段，具有雜交瘤KM281-1-10(保藏號FERM BP-7579)、4D11(保藏號FERM BP-7758)或F4-465(保藏號ATCC PTA-3338)產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列。
25.一種抗體或其功能片段，具有以下區域的成熟部分的胺基酸序列雜交瘤KM281-1-10產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS44和46表示；雜交瘤4D11產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS48和50表示；或雜交瘤F4-465產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ IDNOS56和58表示。
26.一種抗體或其功能片段，具有以下區域的成熟部分的胺基酸序列從雜交瘤KM281-1-10分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS43和45表示；雜交瘤4D11產生的抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS47和49表示；或從雜交瘤F4-465分離的核酸序列編碼的重鏈可變區和輕鏈可變區，分別由SEQ ID NOS55和57表示。
27.權利要求1到26中任一項所述的抗體或其功能片段，它是人抗體。
28.一種藥物組合物，含有權利要求1到26中任一項的抗體或其功能片段作為活性成分。
29.一種免疫強化劑、抗腫瘤藥劑或抗自體免疫疾病藥劑，含有權利要求1到16中任一項的抗體或其功能片段作為活性成分。
30.一種免疫抑制劑、抗自體免疫疾病藥劑、抗過敏的治療藥劑或抗凝血因子VIII抑制綜合症的治療藥劑，含有權利要求17到26中任一項的抗體或其功能片段作為活性成分。
全文摘要
對CD40有激動或拮抗的作用的抗體或它的功能片段。
文檔編號C07K16/28GK1522264SQ0281306
公開日2004年8月18日 申請日期2002年4月26日 優先權日2001年4月27日
發明者三箇山俊文, 吉田均, W·R·福斯, 陳興捷, 高橋信明, 三 山俊文, 明, 福斯 申請人:麒麟麥酒株式會社