分子的糖基化的製作方法

2023-04-30 21:07:21 2

專利名稱：：分子的糖基化的製作方法
技術領域：
：本發明涉及獲得糖基化的分子，特別是蛋白質和脂質分子的方法。背景高效表達系統是生產大多數目前正在開發中的生物藥物(例如，重組蛋白)所需要的。許多這些生物藥物的生物學活性依賴於它們的修飾(例如，磷酸化或糖基化)。一種基於酵母的表達系統將遺傳操作和微生物發酵的簡易性與分泌和修飾蛋白的能力相結合。然而，酵母細胞中產生的重組糖蛋白主要展現為異質性的高甘露糖和超甘露糖聚糖結構(high-mannoseandhyper-mannoseglycanstructures),其可能7十蛋白質功能、下遊力口工和後續治療用途有害，特別是在糖基化扮演重要的生物學角色的情況下。概述本發明至少部分基於(a)發現解脂西洋蓍黴(]^rovWa/少;o/仏'ca)細胞中的單個基因缺失(外部鏈延長(OuterCHainelongation)(OCHl)缺失)導致基本上均質產生在MansGlcNAc2(結構式IV;圖l)骨架上具有a-l,2-連接的甘露糖殘基的糖基化蛋白質；(b)發現靶向解脂西洋蓍黴細胞(具有和不具有OCH1缺失的兩種細胞)ER的經工程化的a-l，2-甘露糖苷酶的過表達導致基本上均質產生具有MansGlcNAc2N-聚糖結構(結構式IV;圖l)的糖基化蛋白；(c)發現使解脂西洋蓍黴細胞中天冬醯胺連接的糖基化3(ALG3)酶活性失活導致糖基化聚糖水平的高度增加；和(d)發現解脂西洋蓍黴細胞中解脂西洋蓍黴基因(MNN4)的過表達導致a-1,2-連接的甘露糖殘基的超磷酸化(hyperphosphorylation)。如此，遺傳工程化的細胞(例如，解脂西洋蓍黴(Kwrow/a/j[po/"/ca)、^rxw/aat/em'w/vora"s,或其它相關種類的雙態性酵母細胞)可以在產生如下目標分子的方法中使用，所述目標分子如與在未經遺傳工程化的相同種類的細胞中產生的目標分子的N-糖基化形式相比具有改變的N-糖基化形式。向患有代謝紊亂(例如，溶酶體貯積病(lysosomalstoragedisorder))的患者施用N-糖基化的目標分子(例如，N-糖基化蛋白)已被證明可改善所述病症的症狀，所描述的方法和細胞可用於製備N-糖基化的目標分子用於治療，包括但不限於，代謝紊亂，例如溶酶體貯積病。本發明還至少部分基於解脂西洋蓍黴和巴斯德畢赤酵母(屍&/^IIAC1基因的剪接形式的發現。由HAC1基因編碼的蛋白質Haclp是轉錄激活因子，其通過與稱為未摺疊蛋白質應答(UnfoldedProteinResponse)(UPR)元件的DNA序列基序結合而激活數個靶基因的轉錄。在Haclp耙基因之中包括編碼侶伴蛋白、摺疊酶(foldase)和負責脂質和肌醇代謝的蛋白質的那些。由於經剪接形式Haclp是比由未經剪接的HAC1mRNA所編碼的形式更強力的轉錄激活因子，所以Haclp轉錄因子的經剪接形式的過表達能夠導致天然和異源蛋白表達水平的增加，以及在ER膜中的增加。由此，Haclp的經剪接形式能夠用於在多種真核細胞(例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍黴或任何其它本文描述的酵母細胞)、植物細胞或動物細胞(例如，哺乳動物細胞的產生。，5、，"本發明還基於這樣的發現，即在解脂西洋蓍黴中表達時，MNS1甘露糖香酶的突變形式能夠將Man8GlcNAc2(結構式I;圖4)結構轉化成Man5GlcNAc2(結構式IV;圖4)、Man6GlcNAc2(結構式V;圖4)和Man7GlcNAc2(結構式VI;圖4)。由此，表達甘露糖苷酶如MNS1的突變形式的遺傳工程化的真核細胞(例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍黴或任何其它本文描述的酵母細胞)、植物細胞或動物細胞(例如，哺乳動物細胞如人的細胞))能夠在產生如下目標分子的方法中使用，所述目標如與在未經遺傳工程化的相同種類的細胞中產生的目標分子的N-糖基化形式相比具有改變的N-糖基化形式。因此，所描述的方法和細胞可用於製備N-糖基化的目標分子用於治療，包括但不限於，代謝紊亂，例如溶酶體貯積病(見下文)。在一個方面，本公開描述了產生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法。所述方法包括向細胞引入編碼目標蛋白的核酸的步驟，其中所述細胞產生N-糖基化形式改變的目標蛋白，並且其中所述細胞是經遺傳工程化而含有至少一種經修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍黴或^n:w/atwfew'm'wrara細胞(或相關種類的雙態性的酵母細胞)。所述方法也可包括提供經遺傳工程化而含有至少一種經修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍黴或^rxw/a12c^em'"/vora/w細胞(或相關種類的雙態性的酵母細胞)的步驟。所述方法也可包括分離目標蛋白的改變的N-糖基化形式的步驟。在一些實施方案中，目標蛋白可以是內源蛋白或外源蛋白。目標蛋白可以是哺乳動物蛋白如人的蛋白。目標蛋白可以是例如，病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細胞因子、趨化因子、抗體或其抗原結合片段，或融合蛋白。融合蛋白可以是例如，病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細胞因子或趨化因子與抗體或其抗原結合片段的融合物。目標蛋白可以是例如，與溶酶體貯積病(LSD)相關的蛋白質。目標蛋白可以是例如，葡糖腦香酯酶、半乳糖腦苷酯酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、(3-D-半乳糖苷酶、P-葡糖苷酶、P-己糖胺酶、P-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖芬酶、芳基碌^酸酯酶B、芳基^L酸酯酶A、a-N-乙醯半乳糖胺酶(a-N-acteylgalactosaminidase)、天冬氨醯葡糖胺酶(aspartylglucosaminidase)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖苷-N-乙醯轉移酶、(3-D-葡糖醛酸酶(p-D-glucoronidase)、透明質酸酶、a-L-甘露糖苷酶、a-神經氨酸酶、磷酸轉移酶、酸性脂肪酶、酸性神經醯胺酶、鞘磷脂酶(sphinogmyelinase)、石危酯酶、組織蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。在一些實施方案中，改變的N-糖基化形式可以含有一種或多種N-聚糖結構如，例如，Man5GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2、Man3GlcNAc2、GlClMan5GlcNAc2、Glc2Man5GlcNAc2。在一些實施方案中，改變的糖基化可以是，例如，Man5GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2、Man3GlcNAc2、GlCiMan5GlcNAc2、Glc2Man5GlcNAc2。在一些實施方案中，目標蛋白的改變的N-糖基化形式可以是均質的或基本上均質的。例如，含有改變的糖基化的改變的目標分子的分數可以是至少約20%,至少約30%,至少約40%,至少約45%,至少約50%,至少約55%,至少約60%，至少約65%，至少約70%，至少約75%，至少約80%，至少約85%,至少約90%,或至少約95%或更多。在一些實施方案中，細胞可以經遺傳工程化而缺乏至少一種N-糖基化活性。所述N-糖基化活性可以是，例如，ALG3活性、OCH1活性、MNS1活性或MNN9活性。在一些實施方案中，至少一種修飾可以是(a)缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的基因；(b)表達具有N-糖基化活性的蛋白質的突變形式；(c)引入或表達幹擾具有N-糖基化活性的蛋白質的功能性表達的RNA分子；(d)13表達具有N-糖基化活性的蛋白質(例如ALG6或a-甘露糖香酶(例如，耙向內質網的a-甘露糖苷酶)。表達的蛋白質可以是由細胞中的內源核酸編碼的蛋白質。表達的蛋白質可以是最適pH在7.5以下的(例如，最適pH在5.1以下)的a-甘露糖苷酶。具有N-糖基化活性的蛋白質可以是外源蛋白。具有N-糖基化活性的蛋白質可以是哺乳動物蛋白(如人的蛋白)或低等真核生物的(例如，真菌、原生動物或錐蟲)蛋白。低等真核生物可以選自下組布氏錐蟲(7Vpa/70^oma6rwcez')、口合茨木審(7h.c/oc/ermaAarz/awt/m)、#^(/41yperg///w1s)，和任何其它本文描述的低等真核生物。在一些實施方案中，N-糖基化活性可以是葡萄糖基轉移酶活性。在一些實施方案中，具有N-糖基化活性的蛋白質是ALG6或a-甘露糖苷酶。a-甘露糖香酶可以靶向內質網。例如，具有N-糖基化活性的蛋白質可以是融合蛋白，其包含a-甘露糖苷酶多肽和HDEL內質網保留肽(HDELend叩lasmicreticulumretentionpeptide)。在一些實施方案中，具有N-糖基化活性的蛋白質可以是能夠從Maii5GlcNAc2去除葡萄糖殘基的蛋白質。例如，具有N-糖基化活性的蛋白質可以是具有a-l,3-葡糖苷酶活性的蛋白質，例如，但不限於，葡糖苷酶II(例如，葡糖苷酶II的a和卩亞基之一或二者)或變聚糖酶(mutanase)。在一些實施方案中，細胞可以經遺傳工程化而包含至少兩種經修飾的N糖基化活性，例如任何本文描述的經修飾的N-糖基化活性。所述至少兩種經修飾的N-糖基化活性可以包含，例如，ALG3活性的缺乏和升高的ALG6活性水平。在一些實施方案中，細胞可以經遺傳工程化而包含至少三種經修飾的N-糖基化活性，例如任何本文描述的經修飾的N-糖基化活性。所述至少三種經修飾的N-糖基化活性可以包含，例如，ALG3活性的缺乏；升高的ALG6活性水平；和升高的葡糖苷酶II活性水平。在一些實施方案中，細胞未經遺傳工程化而缺乏OCHl活性。在一些實施方案中，修飾可以包含表達能夠影響目標蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質或其生物活性的變體。所述能夠影響目標蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質或其生物活性的變體可以是MNN4、PN01或MNN6。在一些實施方案中，糖蛋白的至少約30%的甘露糖基殘基可以是磷酸化的。在一些實施方案中，所述方法可進一步包括對糖蛋白的額外加工。額外14加工可以發生在體外或體內。額外加工可以包括將異源模塊(moiety)添加到修飾的糖蛋白。異源模塊可以是聚合物或載體。額外加工可以包括對目標蛋白的改變的N-糖基化形式酶處理或化學處理。例如，額外加工可以包括用甘露糖苷酶、甘露聚糖酶、磷酸二酯酶、葡糖苷酶或糖基轉移酶處理目標蛋白的改變的N-糖基化形式。額外加工可以包括用氫氟酸處理目標蛋白的改變的N-糖基化形式。額外加工可以包括目標蛋白的改變的N-糖基化形式的磷酸化。在另一方面，本公開提供產生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法。本方法包括如下步驟提供經遺傳工程化而包含至少一種經修飾的N-糖基化活性的真核細胞(例如，真菌細胞、植物細胞或動物細胞)；和向細胞引入編碼目標蛋白的核酸，其中所述細胞產生N-糖基化形式改變的目標蛋白。在另一方面，本公開描述了產生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法。所述方法包括將目標蛋白與,人角年月旨西洋蓍黴或爿n:w/aacfem'm'vorara細月包製備的細胞裂解物接觸的步驟，所述解脂西洋蓍黴或Axw/g^fe"/m'wraw細胞經遺傳工程化而包含至少一種經修飾的N-糖基化活性，其中將目標蛋白與所述細胞裂解物接觸導致目標蛋白的改變的N-糖基化形式。在又一方面，本公開描述產生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括將目標蛋白與一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質接觸的步驟，其中所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質獲得自經遺傳修飾而包含至少一種經修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍黴或Jr:a^a&m'm'vora似細胞，並且其中將目標分子與一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質接觸導致目標蛋白的改變的N-糖基化形式。在另一方面，本公開提供N-糖基化改變的分離的蛋白質，其中所述蛋白質由任一上述方法產生。在又一方面，本公開提供分離的經遺傳工程化而包含至少一種經修飾的N-糖基化活性的解脂西洋蓍黴或^n:w/aa&w'w'vora附細胞(或其它相關種類的雙態性的酵母細胞)。所述N-糖基化活性可以是，例如，ALG3活性、OCH1活性、MNS1活性或MNN9活性。所述修飾可以是任何本文所述的那些修飾。例如，所述修飾可以包括(a)缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的基因；(b)表達具有N-糖基化活性的蛋白質的突變形式；(c)引入或表達幹擾具有N-糖基化活性的蛋白質的功能性表達的RNA分子；或(d)表達具有N-糖基化活性的蛋白質。具有N-糖基化活性的蛋白質可以是例如，ALG6。具有N-糖基化活性的蛋白質可以是哺乳動物蛋白，例如人的蛋白。所述修飾也可以包括表達能夠促進經修飾糖蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質(例如，MNN4或PNOl)或其生物學活性的變體。在另一方面，本公開提供治療病症的方法，所述病症可以通過施用N-糖基化改變的蛋白質來治療。所述方法包括向受試者施用如下蛋白質的步驟，所述蛋白質可以通過上述任何方法獲得，其中所述受試者是患有或疑似患有可通過施用N-糖基化改變的蛋白質來治療的疾病的患者。所述方法也可以包括如下步驟(a)提供受試者和/或(b)測定該受試者是否患有可以通過施用N-糖基化改變的蛋白質來治療的疾病。所述受試者可以是哺乳動物如人。所述病症可以是例如，癌症，免疫病症(例如，炎性狀態)或代謝紊亂。代謝紊亂可以是任何本文描述的那些代謝紊亂，例如，溶酶體貯積病(LSD)如高歇爾氏病(Gaucherdisease),泰-沙二氏病(Tay-Sachsdisease)、旁姆普氏病(Pompedisease)、尼-皮二氏病(Niemann-Pickdisease)或法布裡氏病(Fabrydisease)。所述蛋白質可以是與LSD相關的蛋白質，例如，所述蛋白質可以是，例如，葡糖腦香酯酶、a-半乳糖苷酶。所述蛋白質可以是，例如，oc-L-艾杜糖苷酸酶、P-D-半乳糖苷酶、p-葡糖苷酶、(3-己糖胺酶(hexosaminidase)、卩-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙醯半乳糖胺酶、天冬氨醯葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖苦-N-乙醯轉移酶、(3-D-葡糖醛酸酶、透明質酸酶、a-L-甘露糖苷酶、a-神經氨酸酶、磷酸轉移酶、酸性脂肪酶、酸性神經醯胺酶、鞘磷脂酶(sphinogmyelinase)、石克酯酶、組織蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。在另一方面，本公開提供解脂西洋蓍黴或y^;w/a"Am'"/vorara細胞(或其它相關種類的雙態性的酵母細胞)的基本上純的培養物，其中大量細胞是經遺傳工程化而包含至少一種經修飾(例如任何本文所述的修飾)的N-糖基化活性的。所述細胞培養物可以包含一種或多種細^9包亞群，各亞群包含不同的經修飾的糖基化活性。在又一方面，本公開提供(a)包含SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的分離的核苷酸序列；(b)包含與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2至少80%相同的序列的分離的核苷酸序列；或(c)由(a)或(b)的分離的核苷酸序列編碼的多肽。在一些實施方案中，分離的核酸序列是SEQIDNO:l或SEQIDNO:2。在另一方面，本公開描述分離的核酸，其含有(a)在高嚴緊條件下與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的補體雜交的核苷酸序列；或(b)核苷酸序列的補體。在又一方面，本公開提供(a)包含本文所示核酸序列中任一(或由其組成)的分離的核苷S吏序列；(b)包含與本為所示的核酸序列中的任一至少80%相同的序列的分離的核苷酸序列；或(c)由(a)或(b)的分離的核苷酸序列編碼的多肽。在一些實施方案中，所迷分離的核酸序列是本文所示的核酸序列中的任一。在另一方面，本公開描述分離的核酸，其含有(a)在高嚴緊條件下與本文所示核酸序列中任一的補體雜交的核苷酸序列；或(b)所述核芬酸序列的補體。在又一方面，本公開提供(a)包含上述核酸序列中任一的載體或(b)含有(a)的載體的經培養的細胞。所述載體可以是表達載體。載體中的核酸序列可以與表達調控序列可操作地連接。在另一方面，本公開提供產生蛋白質的方法。所述方法包括在允許多肽表達的條件下培養上述細胞中的任一種的步驟。所述方法也可包括如下步驟在培養細胞之後，從細胞或培養細胞的培養基中分離多肽。所述細胞可以是例如，含有包含上述核酸序列中任一的載體的經培養細胞。本文所述的目標分子(例如，目標蛋白)、具有N-糖基化活性的蛋白質和N-糖基化改變的分子(統稱為"本發明的分子")可以是，但不需要是分離的。術語"分離的"如應用於任何本文所述的本發明的分子是指這樣的分子或其片段，其已經從天然與其伴隨的成分(例如，蛋白質或其它天然存在的生物分子或有機分子)分開或純化。應理解的是重組分子(例如，重組蛋白)將總是"分離的"。通常，當本發明的分子按重量佔製備物中全部相同類型的分子的至少60%時，例如佔樣品中全部相同類型的分子的60%時，則它是分離的。例如，當糖基化改變的蛋白質按重量佔製備物或樣品中全部蛋白質的至少60%時，它是分離的。在一些實施方案中，製備物中的本發明的分子按重量組成至少75%，至少90%，或至少99%的製備物中全部相同類型的分子。如用於本文，目標分子的"改變的N-糖基化形式"是由經遺傳工程化的宿主細胞(例如，解脂西洋蓍黴細胞、Jnrw/fl"<ie"/m'vonms細胞或另一相關的雙態性酵母細胞種類的細胞)產生的目標分子的N-糖基化形式，其不同於未經遺傳工程化的與經遺傳工程化的細胞相同種類的細胞中產生的目標分子的N-糖基化形式。由此，目標分子的改變的糖基化形式可以是例如，非N-糖基化的目標分子。此外，目標分子的改變的糖基化形式可以是例如，一種或多種N-聯聚糖的磷酸化改變的目標分子的形式。如用於本文，術語"其它相關的雙態性酵母細胞種類"是指與解脂西洋著審和Jncw/aac/em.m'v。raw相關的屬於雙足囊菌科(familyZ^wc^wcacg"g)的酵母，例如爿rjaJa、雙足嚢菌屬(Z)0o^^cws)(例如白色雙足嚢菌(D.a/6^/w"、大雙足嚢菌CD./wgem')、或i"/eci/^)、半乳糖黴(Ga/fl"cwy/ce力(例如裡氏半乳淨唐黴(Gre&s7./)或大；也半乳衝唐黴(Ggeo/n'c/zw/w》、iS^orap"c/^afer附fl、射盾子嚢黴屬CSy甲/w"oascw力(例如，西非射盾子嚢黴(S.cz/en7))、擬威克酵母屬(奶'c/:er/zamz'e〃a)和才妄嚢菌屬(ZygoascM力。具體而言,進4b4支M^c/w汰ovWa(例如，Af./3w/c/zew'/wa或Magaves)和射盾子嚢黴屬(通過分析菌種如(例如Aac/em'mVoram或」.&/7^的》的26S-rDNA序歹'j的Dl/D2結構域將解脂西洋蓍黴被分配於其中)中的酵母以及一些念珠菌屬菌種(Ca"WAspecies)(例如，C.ap/co/a，而非白念珠菌(C,a/6z'cara)、麥芽糖念珠菌(C.ma/tose)或熱帶念珠菌(C.frap/cafc))。"多肽，，和"蛋白質，，可以互換使用並且意指任何肽連接的胺基酸鏈，無論其長度和翻譯後修飾。本公開還提供本文所述的野生型、全長、成熟"目標蛋白"或"具有N-糖基化活性的蛋白質，，的(i)生物學活性變體和(ii)生物學活性片段或其生物學活性變體。全長、成熟、野生型蛋白質或所述蛋白質的片段的生物學活性變體可以含有添加、缺失或取代。具有取代的蛋白質將通常具有不多於50個(例如，不多於l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或50個)保守胺基酸取代。保守取代是用一種胺基酸取代另一種具有相似特徵的胺基酸。保守取代包括在以下組內的取代纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸；天冬氨酸和穀氨酸；天冬醯胺和穀氨醯胺；絲氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非極性疏水胺基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和曱硫氨酸。極性中性胺基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺。帶正電的(鹼性)胺基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電的(酸性)胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸。將上述極性、鹼性或酸性組中的一個成員用相同組中的另一成員取代可認為是保守取代。相反，非保守取代是用一種胺基酸取代另一種具有不相似的特徵的胺基酸的取代。在夾失變體可以擊夾乏l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(兩個或更多個胺基酸的)胺基酸區段或不連續的單獨胺基酸。添力口(添加變體)包括融合蛋白，所述融合蛋白含有(a)全長、野生型、成熟多肽或其含有至少五個胺基酸的片段；和(b)內部或末端(C或N)的無關的或異源的胺基酸序列。在這些融合蛋白的背景下，術語"異源胺基酸序列"是指除(a)之外的胺基酸序列。因此含有本文描述的肽和異源胺基酸序列的融合蛋白在序列上不對應於天然存在的蛋白質的全部或部分。例如，異源序列可以是用於重組蛋白的純化的序歹U(例如，FLAG、多組氨酸(例如，六組氨酸)、血凝素(hemagluttanin)(HA)、穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)或麥芽糖結合蛋白(MBP))。異源序列也可以是用作診斷或檢測標誌物的蛋白質，例如，螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)或氯黴素乙醯轉移酶(CAT)。在一些實施方案中，融合蛋白含有來自另一蛋白質的信號序列。在某些宿主細胞(例如，酵母宿主細胞)中，目標蛋白的表達和/或分泌可以通過使用異源信號序列增加。在一些實施方案中，融合蛋白可以含有可用於例如引發免疫應答(例如，用於抗體生成；見下文)的載體(例如，KLH)或內質網或高爾基體保留信號。異源序列可以具有不同的長度，並且在一些情況下可以是比異源序列所附接的全長目標蛋白更長的序列。"片段，，如用於本文是指比全長、不成熟的蛋白質短的多肽的區段。蛋白質的片段可以具有末端(羧基或氨基末端)缺失和/或內部缺失。通常，蛋白質的片段的長度將是至少4個(例如，至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少12個、至少15個、至少18個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少50個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個或至少IOO個或更多個)胺基酸。目標蛋白或具有N-糖基化活性的蛋白質的生物學活性片段或生物學活性變體具有野生型、全長、成熟蛋白質的活性的至少25%(例如，至少30%;40%;50%;60%;70%;75%;80%;85%;卯％;95%;97%;98%;99%;1999.5%,或100%或甚至更高)。在目標蛋白的情況下，相關活性是目標蛋白在經遺傳工程化的細胞中經歷改變的N-糖基化的能力。在具有N-糖基化活性的蛋白質的情況下，相關活性是N-糖基化活性。依賴於它們的預期用途，蛋白質、其生物學活性片段或生物學活性變體可以是任何物種的，如，例如，真菌(包括酵母)、線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠(gerbil)、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人)。在一些實施方案中，生物學活性片段或生物學活性變體包括所述蛋白質的免疫原性和抗原性片段。免疫原性片段是具有相關全長、未成熟蛋白質在感興趣的動物中刺激免疫應答(例如，抗體應答或細胞免疫應答)的能力的至少25%(例如，至少30%;40%;50%;60%;70%;75%;80%;85%;90%;95%;97%;98%;99%;99.5%或100%或甚至更多)的片段。蛋白質的抗原性片段是具有相關全長、未成熟的蛋白質被對於所述蛋白質特異性的抗體或對於所述蛋白質特異性的T細胞識別的能力的至少25%(例如，至少30%;40%;50%;60%;70%;75%;80%;85%;90%;95%;97%;98%;99%;99.5%或100%或甚至更多)的片段。"N-糖基化活性"如用於本文是指任何如下活性，即(i)能夠向目標分子添加N-聯聚糖(即，寡糖基轉移酶活性)；(ii)從目標分子去除N-聯聚糖，(iii)修飾目標分子上的一個或多個N-聯聚糖，(iv)修飾多萜醇連接的寡糖；或(v)能夠輔助(i-iv)之內的活性的活性。同樣，N-糖基化活性包括，例如，N-糖苷酶活性、糖芬酶活性、糖基轉移酶活性、糖核苷酸合成、修飾或轉運蛋白活性。對目標分子上一種或多種N-聯聚糖的修飾包括甘露糖基磷醯基轉移酶(mannosylphosphoryltransferase)活性、5敫酶活性或石舞酸酶活性，例如，改變目標分子上N-聯聚糖的磷酸化狀態的甘露糖基磷醯基轉移酶、激酶或磷酸酶活性。如用於本文，"遺傳工程化"細胞或"經遺傳工程化的細胞"和類似術語是指任何人工創造的細胞的遺傳改變，其導致與未經遺傳工程化的細胞(例如，真菌細胞例如解脂西洋蓍黴細胞、^nrw/aacfem'm'vora"s細胞或其它相關種類的雙態性的酵母細胞，植物細胞或動物細胞(例如，哺乳動物細胞例如人的細胞))相比細胞中的至少一種經修飾的N-糖基化活性。由此，應該理解的是人工創造的遺傳改變不包括，例如，自發突變。人工遺傳改變的實例在下文描述(參見"遺傳工程化的細胞，，)。如用於本文，術語"野生型"如應用於核酸或多肽是指當生物學生物體產生的核酸或多肽。術語"異源，，如在本文中應用於宿主細胞中的核酸或由宿主細胞產生的多肽是指並非源自與宿主細胞相同種類的細胞的核酸或多肽(例如，具有N-糖基化活性的蛋白質)。因此，如用於本文，"同源，，核酸或蛋白質是在與宿些。術語"外源，，如用於本文與核酸和特定宿主細胞有關時是指不存在於(並且不能獲得自)在自然界中存在的所述特定細胞的任何核酸。因此，非天然存在的核酸一旦引入宿主細胞則被認為對於所述宿主細胞是外源的。重要的是應注意非天然存在的核酸可以含有在自然界中存在的核酸序列的核酸亞序列或片段，條件是所述核酸作為整體不存在於自然界中。例如，在表達載體內含有基因組DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，並且因此一旦引入宿主細胞則對所述宿主細胞是外源的，因為該核酸分子作為整體(基因組DNA加上載體DNA)不存在於自然界中。因此，作為一個整體在自然界中不存在的任何載體、自複製質粒或病毒(例如，逆轉錄病毒、腺病毒或皰滲病毒)被認為是非天然存在的核酸。由此推斷通過PCR或限制性內切核酸酶處理的基因組DNA片段以及cDNA被認為是非天然存在的核酸，因為它們作為在自然界中不存在的單獨的分子而存在。還由此推斷以自然界中不存在的排列含有啟動子序列和多肽編碼序列的任何核酸是非天然存在的核酸。天然存在的核酸對於特定細胞可以是外源的。例如，從酵母x的細胞分離的完整染色體一旦引入酵母y的細胞則該染色體對於酵母y的細胞是外源核酸。從上文將顯而易見的是，"外源"核酸可以是"同源"或"異源，，核酸。相反，術語"內源"如用於本文與核酸或基因(或由所述核酸或基因編碼的蛋白質)以及特定細胞有關時是指確實存在於(並且可以獲得自)在自然界中存在的所述特定細胞中。作為對上述概念的示例，轉化入解脂西洋蓍黴細胞中的編碼解脂西洋蓍黴ALG6蛋白的表達質粒相對於該細胞而言是外源核酸。然而，編碼ALG6蛋白的序列和由其產生的ALG6蛋白與所述細胞是同源的。類似地，轉化入21解脂西洋蓍黴細胞中的編碼a血w'mVoraraALG6蛋白的表達質粒相對於該細胞而言是外源核酸。然而與前一例子相反，編碼所述ALG6蛋白的序列和由其產生的ALG6蛋白與所述細胞是異源的。如用於本文，"啟動子"是指使基因能夠被轉錄的DNA序列。啟動子由RNA聚合酶識別，然後起始轉錄。因此，啟動子含有或者直接通過RNA聚合酶的募集結合的或在RNA聚合酶的募集中涉及的DNA序列。啟動子序列也可以包括"增強子區，，，其是能夠與蛋白質結合以增強基因簇中基因的轉錄水平(因此得名)的一個或多個DNA區(即，反式作用因子，更像一組轉錄因子)。所述增強子儘管通常在編碼區的5，端，但是也可以與啟動子序列分開，並且可以例如在基因內含子區內或在基因編碼區的3，。如用於本文，"可操作地連接，，是指併入遺傳構建體從而表達調控序列有效地調控感興趣的編碼序列的表達。本文描述的任何核酸序列的變體(例如，SEQIDNO:l或SEQIDNO:2中所示的HAC1序列)可以具有與野生型核酸序列同源的序列，例如，與野生型核酸序列為至少約70%(例如，至少約75%，至少約80%,至少約85%，至少約卯％，至少約95%或至少約99%)同源(相同)的序列。這4f的野生型序列可以分離自自然界或者可以通過重組或合成方法產生。由此野生型序列核酸可以具有天然存在的人的核酸序列、猴核酸序列、鼠類核酸序列或任何其它含有所述感興趣野生型核酸的同源物的物種的核酸序列。如用於本文，"同源"或"同源核酸序列"或類似術語是指如下序列，其特徵在於在核苷酸水平的至少指定百分比的同源性，並且可與序列同一性互換使用。百分比同源性或同一性可以如下測定，例如通過Gap程序(WisconsinSequenceAnalysisPackage,用於UNIX的第八版，GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,Madison,WI)，使用預設設定，其j吏用Smith和Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2:482-489)的算法。在一些實施方案中，探針和靶(見下文)之間的同源性在約50%至約60%之間。在一些實施方案中，探針和耙核酸之間的同源性是大約55%-65%，65%-75%,約70%-80%，約75%-85%,約80%-90%,約85%-95%或約90%-100%。術語"探針，，如用於本文是指長度可變的核酸序列。在一些實施方案中，探針包含至少io個並且多如6,00o個核苷酸序列。在一些實施方案中，^:針包含至少12個，至少14個，至少16個，至少18個，至少20個，至少25個，至少50個或至少75個或100個連續核苷酸。較長長度的探針通常獲得自天然或重組的來源(與直接的化學合成相反)，對於靶序列是高特異性的，並且與較長的寡聚物相比與靶雜交慢得多。探針可以是單鏈或雙鏈核酸分子。在一些實施方案中，本文描述的變體核酸可以具有如下序列，所述序列包含與感興趣的野生型核酸(例如，如SEQIDN0:1或SEQIDNO:2中所示的HAC1核酸序列)中的區域、部分、結構域或區段具有部分互補性(例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少卯％、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%互補性)的單鏈或雙鏈。在一些實施方案中，感興趣的變體核酸序列可以具有如下序列，所述序列包含與野生型核酸序列中的區域、部分、結構域或區段具有完全互補性(即，100%互補性)的單鏈或雙鏈。序列"互補性"是指特定含氮鹼基之間由於它們的氫鍵鍵合特性(即，具有使反向平行雙鏈體能夠形成的^5威基序列的兩條核酸鏈的性質，其中腺噤呤和尿嘧啶(或胸腺嘧啶，在DNA或經修飾的RNA的情況下)4皮此相反，而鳥嘌呤和胞嘧咬彼此相反)產生的化學親和力。如此，完全互補序列將是在核苷酸序列形成反向平行雙鏈體時具有完全的一對一44基序列對應性(即，腺噪呤對尿嘧啶/胸腺嘧啶且鳥噪呤對胞嘧啶)的兩個序列。雜交也可用作對兩個核酸序列之間同源性的測量。本文描述的核酸序列，或其片段或變體，可以用作依據標準雜交技術的雜交探針。感興趣的特定探針(例如，HAC1核苷酸序列的探針，例如，如SEQIDNOS:l或2中所示的HAC1核苷S臾序列)與來自試驗來源(例如，真核細胞)的DNA或RNA的雜交表明對在試驗來源中對應於所述探針的DNA或RNA的存在(例如，HAC1核香酸序列)。雜交條件是本領域那些技術人員已知的，並且可以在CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.,6.3.1-6.3.6,1991中找到。將中等雜交條件定義為等同於在2X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在30。C雜交，之後在IXSSC、0.1%SDS中在50。C清洗。將高嚴緊性條件定義為等同於在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在45°C雜交，之後在0.2XSSC、0.1%SDS中在65。C清洗。除非另有限定，本文使用的全部技術和科學術語具有與本發明所屬領域的一個普通技術人員所通常理解的相同的含義。儘管在本發明的實踐或測試中可以使用與本文描述的那些相似的或等同的方法和材料，在下文將描述示例性的方法和材料。將本文提及的全部^^開文獻、專利申請、專利、Genbank登錄號和其它參考文獻通過所述整體併入。發生沖突的情況下，以包括定義在內的本申請為準。材料、方法和實例僅作為示例說明，而非意欲進行限制。本發明的其它特徵和優勢，例如，產生N-糖基化改變的分子的方法，將從以下詳述並從權利要求書中清楚可見。附圖簡述圖1是描述在酵母內質網的N-聚糖前體合成的示意圖。其所編碼的蛋白質具有介導指明的酶促轉化的活性的基因在帶陰影的框中(例如，ALG7;左上)。"UDP"和"UMP"分別指二磷酸尿普和一磷酸尿苷。"GDP"和"GMP"分別指二磷酸鳥苷和一磷酸鳥苷。"Gn"是指N-乙醯葡糖胺。"M"是指單體甘露糖，G是指葡萄糖，Pi是指磷酸。圖2是描述酵母內質網中N-聚糖加工的示意圖。圖3是描述釀酒酵母0S.cerevWae)高爾基體中N-聚糖加工的示意圖。其編碼的蛋白質具有介導指明的酶促轉化的活性的基因在帶陰影的框中(例如，0CH1;中上)。圖4是描述多種本文所述的N-聚糖結構的示意圖。圖5是描述用於破壞解脂西洋蓍黴中0CH1基因的克隆策略的示意圖。"PCR"是指聚合酶鏈式反應。圖6是描述用於MNN9基因破壞片段的克隆策略的示意圖。"PCR"是指聚合酶鏈式反應。圖7是一系列描述獲得自野生型解脂西洋蓍黴細胞或糖基化突變體(例如，Aochlc19、Amnn91和AochlAmnn9)細胞和MTLY60菌林細胞的甘露糖蛋白的N-聚糖分析的電泳圖譜(dectroferogram)。在一些情況下，將所述N-聚糖進一步用a-l,2甘露糖苷酶處理。使用DNA測序儀輔助型、螢光團輔助型糖電泳(DSA-FACE)來進行分析。"M5","M6","M7"，"M8"，和"M9"是指與基本N-乙醯葡糖胺結構結合(conjugate)的甘露糖殘基數。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖(oligomaltose)的分析。圖8是描述用於釀酒酵母MNS1表達載體的克隆策略的示意圖。"PCR"是指聚合酶鏈式反應。圖9是一系列描述對獲得自MTLY60細胞的分泌型糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜，所述細胞表達野生型(WT)Mnslp或所指明的Mnslp的多種突變形式(即，R273G、R273L或R269S/S272G/R273L)。分析使用I)SA-FACE進行。"M5","M6","M7"，"M8","M9，，是指與基本N-乙醯葡糖胺結構結合的甘露糖殘基數。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖10是描述用於MNN4表達載體的克隆策略的示意圖。圖11是一系列描述對獲得自指明的野生型MTLY60細胞或糖基化突變細胞的分泌型糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。"M5"，"M6"，"M7","M8"，"M9"是指與殼二糖核心結構結合的甘露糖殘基數。"P，，是指含有一個磷酸殘基的甘露糖蛋白，而"PP"是指含有兩個磷酸殘基的甘露糖蛋白。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖12是描述用於a-半乳糖苷酶表達載體的克隆策略的示意圖。圖13是一系列描述對獲得自指明的野生型MTLY60細胞或糖基化突變細胞的多種克隆的甘露糖蛋白和磷酸甘露糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。"alg3，，表明所述細胞是ALG3敲除型。"ALG6過表達"表明所述ALG6的蛋白質產物在細胞中過表達。分析使用DSA-FACE進行。"M5，，，"M6，，，"M7"，"M8，，和"M9，，是指與基本N-乙醯葡糖胺結構結合的甘露糖殘基數。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過聚丙烯醯胺凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖14是一系列描述對獲得自指明的野生型MTLY60細il包或糖基化突變細胞的多種克隆的甘露糖蛋白和磷酸甘露糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。"alg3，，表明所述細胞是ALG3敲除型。"ALG6過表達"表明所述ALG6的蛋白質產物在細胞中過表達。一個峰與RNA酶B標誌物的Man5GlcNAc2運行在相同位置，並且在a-l，2-甘露糖苷酶處理之後遷移了兩個葡萄糖單位，並在(x-甘露糖苷酶(JB)消化之後遷移4個葡萄糖單位。這與預期的25Man5GlcNAc2結構相符。額外的兩個峰在約一個和兩個糖單位的距離運行，並且不受a-l,2-甘露糖苷酶消化的影響。在a-甘露糖苷酶(JB)消化時兩個峰都遷移一個葡萄糖單位。小遷移是因為加入的酶(例如JB甘露糖苷酶)的較高的鹽濃度。分析使用DSA-FACE進行。"M5"，"M6"，"M7"，"M8"和"M9"是指與殼二糖核心結構結合的甘露糖殘基數。Y軸代表相對焚光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖15是對獲得自未摺疊蛋白質應答(UPR)誘導的菌抹解脂西洋蓍黴的分離的DNA片段(SEQIDNO:l)序列與基因組HAClDNA序列(SEQIDNO:5)的序列比對。帶框的序列對應於非常規剪接的內含子。圖16是一系列對巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母的預測的5'(頂部)和3，(底部)剪接位點的序列比對。粗體加下劃線的核苷酸存在於環結構中。圖17A和17B是對獲得自DTT-誘導型(I)(SEQIDNO:2)和非誘導型(NI)(SEQIDNO:6)巴斯德畢赤酵母培養物的HAC1cDNA的序列比對的兩個部分視圖。圖18是對巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母18個胺基酸的C-末端區域的序列比對。保守的胺基酸為粗體並加下劃線。圖19是描述對KAR2mRNA的相對表達水平進行比較的柱狀圖。將克隆3、4和5(巴斯德畢赤酵母GSM5細胞)在作為碳源的曱醇上培養。"3+"、"4+"和"5+，，是指在作為碳源的曱醇上培養的各個克隆，而"3-"、"4-"和"5_"是指在作為碳源的葡萄糖上培養的各個克隆。Y軸代表使用實時PCR的KAR2基因的相對表達。圖20是描述兩種巴斯德畢赤酵母克隆(克隆6和8)中Kar2和HAC1的相對表達水平的柱狀圖。"6+，，和"8+，，是指在作為碳源的曱醇上培養的各個克隆，而"6-，，和"8-"是指在作為碳源的葡萄糖上培養的各個克隆。Y軸代表使用實時PCR的KAR2基因的相對表達。圖21是描述用於Y1MNN6表達載體的克隆策略的示意圖。圖22是一系列描述對獲得自指明的單獨的Aochl解脂西洋蓍黴細胞，或表達Y1MNN6的Aochl解脂西洋蓍黴的多種克隆(Z3、Z4、Z5、U5、U6和U8)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖23是描述用於MFManHDEL表達載體的克隆策略的示意圖。圖24是一系列描述對獲得自指明的單獨的Aochl解脂西洋蓍黴細胞，或表達MFManHDEL的Aochl解脂西洋蓍黴的多種克隆(9、11、10、3、5和6)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖25是描述用於LIP2preManHDEL表達載體的克隆策略的示意圖。圖26是一系列描述對獲得自指明的單獨的Aochl解脂西洋蓍黴細胞，或表達LIP2ManHDEL的Aochl解脂西洋蓍黴的多種克隆(l、5、10和11)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。"M5"，"M6","M7"，"M8"和"M9"是指與殼二糖核心結構結合的甘露糖殘基數。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。圖27A和27B是解脂西洋蓍黴(圖27A;SEQIDNO:3)和巴斯德畢赤酵母(圖27B;SEQIDNO:4)的HAC1蛋白的胺基酸序列。圖28是考馬斯藍染色的聚丙烯醯胺凝膠的照片，其描述在多種解脂西洋蓍黴細胞(MTLY60、MTLY60Aa/g3和MTLY60Aa/gWZG6)培養物中Lip2p過表達的結果。在凝膠中解析了以下樣品泳道l("梯子"或"梯")，已知分子量的蛋白質的組合；泳道2("WT")，獲得自過表達Lip2p的WT解脂西洋蓍黴細胞(MTLY60)的Lip2p蛋白；泳道3("WT+PGaseF，)，獲得自過表達Lip2p的WT解脂西洋蓍黴細胞並用PNGaseF酶處理的Lip2p蛋白；泳道4("alg3-ALG6"),獲得自缺乏alg3並且過表達Lip2p和ALG6二者的西洋蓍黴細胞(MTLY60Aa/g^4丄G6)的Lip2p蛋白；泳道5("alg3-ALG6+PNGaseF,)，獲得自缺乏alg3並且過表達Lip2p和ALG6二者的西洋蓍黴細胞(MTLY60A"/g3/^G"6)並且用PNGaseF酶處理的Lip2p蛋白；泳道6("alg3，，)，獲得自缺乏alg3並且過表達Lip2p的解脂西洋蓍黴細胞(MTLY60Aa/g3)的Lip2p蛋白；泳道7("alg3+PNGaseF"),獲得自缺乏alg3並且過表達Lip2p的解脂西洋蓍黴細胞(MTLY60Aalg3)並用PNGaseF酶處理的Lip2p蛋白；泳道8("無Lip2p過表達的WT"),獲得自MTLY60細胞的蛋白質；和泳道9("無Lip2p過表達的WT+PNGaseF")，獲得自MTLY60細胞並用PNGaseF酶處理的蛋白質。圖29是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍黴細胞(WT(MTLY60);Aalg3;Aalg3ALG6過表達的；和過表達ALG6連同來自解脂西洋蓍黴(Yl)或布氏錐蟲(Tb)的葡糖苷酶II的a亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。"M5"，"M6","M7"，"M8"和"M9"是指與殼二糖核心結構結合的甘露糖殘基數。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝月交的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。圖30是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍黴細胞(Aalg3;Aalg3ALG6過表達的；和過表達ALG6連同含有HDEL序列的來自解脂西洋蓍黴(Y1)的葡糖苷酶II的a亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖語。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。圖31是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍黴細胞(Aalg3;Aalg3ALG6過表達的；和過表達ALG6連同含有HDEL序列的來自布氏錐蟲(ro;p朋仍oma^mc&)(Tb)的葡糖苷酶II的a亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。圖32是一系列描述對獲得自指明的用不同濃度變聚糖酶體外處理的alg3ALG6解脂西洋蓍黴細胞的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。圖33是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍黴細胞(Aalg3;Aalg3ALG6過表達的；和過表達ALG6連同在Hp4d或TEF啟動子調控下表達的來自解脂西洋蓍黴(Y丄)的葡糖苷酶II的a亞基和來自Y.l的葡糖苷酶II的(3亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。圖34是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍黴細胞(Aalg3ALG6過表達的；和過表達ALG6連同在Hp4d或TEF啟動子調控下表達的含HDEL的來自解脂西洋蓍黴(Y.1.)的葡糖香酶II的a亞基和來自Y.l的葡糖苷酶II的(3亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。分析使用DSA-FACE進行。Y軸代表相對焚光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。圖35是一系列描述對獲得自指明的多種解脂西洋蓍黴細胞(Aalg3和過表達在TEF啟動子調控下表達的來自解脂西洋蓍黴(Y.1.)的葡糖苷酶II的a亞基和來自Y.l的葡糖苷酶II的卩亞基的Aalg3克隆)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。圖36A和36B描述的是編碼黑麴黴C^p^^〃wm'gw)葡糖苷酶IIq成熟形式(缺少信號肽)的cDNA的核苷酸序列，其是為了在解脂西洋蓍黴中表達而經密碼子優化的cDNA(SEQIDN0:7)。圖37是描述編碼黑麴黴(v^;wgz7/^m'gw)葡糖苷酶II卩成熟形式(缺少信號肽)的cDNA的核苷酸序列，其是為了在解脂西洋蓍黴中表達而經密碼子優化的cDNA(SEQIDNO:8)。圖38是一系列對獲得自指明的多種解脂西洋蓍黴細胞(Aalg3和ALG6過表達的，連同在TEF或hp4d啟動子調控下表達的來自黑麴黴(An)的葡糖香酶II的a亞基)的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖鐠是對RNA酶B的分析。圖39A和39B是一對柱狀圖，其描述在WT(MTLY60)解脂西洋蓍黴細胞中或在含有在hp4d啟動子表達調控下的HAClcDNA的經剪接形式的解脂西洋蓍黴細胞的兩個克隆(克隆7和克隆2)中，HAC1(39A)或KAR(39B)基因的相對表達水平(Y軸)。圖40是線型圖，其描述用空載體轉化的野生型巴斯德畢赤酵母GS115細胞與表達Haclp蛋白的巴斯德畢赤酵母GS115細胞的生長相比的生長。圖41是考馬斯藍染色的聚丙烯醯胺凝膠的照片，其比較了來自表達鼠類IL-10(mlL-10)蛋白的巴斯德畢赤酵母GS115細月包細胞培養物的mIL-lO蛋白的表達水平與獲得自在誘導型啟動子AOX1調控下表達mIL-lO和來自巴斯德畢赤酵母的經剪接HAC1蛋白的GS115細胞的培養物的mlL-10蛋白的表達。在凝膠中解析了以下樣品泳道l("梯子")，已知分子量的蛋白質的組合；泳道2("參照，，)，獲得自表達參照mIL-lO的巴斯德畢赤酵母菌抹(GS115)的蛋白質；泳道3("參照")，獲得自表達參照mIL-lO的巴斯德畢赤酵母菌抹的、在用PNGaseF酶處理蛋白質之後的蛋白質；泳道4("克隆l")，獲得自誘導型表達HAC1蛋白的表達mIL-10的巴斯德畢赤酵母細胞的蛋白質；泳道5("克隆1")，荻得自誘導型表達HAC1蛋白的表達mIL-lO的巴斯德畢赤酵母細胞的、在用PNGaseF酶處理蛋白質之後的蛋白質；泳道6("克隆2")，獲得自誘導型表達HAC1蛋白1的表達mIL-10的巴斯德畢赤酵母細胞的蛋白質；泳道7("克隆2")，獲得自誘導型表達HAC1蛋白的表達mIL-10的巴斯德畢赤酵母細胞的、在用PNGaseF酶處理蛋白質之後的蛋白質。圖42描述的是編碼裡氏木黴(7Hc/706few7aa-l，2甘露糖苷酶、為了在解脂西洋蓍黴中表達而經密碼子優化、含有LIP2前信號序列的示例性cDNA序列的核苷酸序列(SEQIDNO:9)。圖43描述的是用於解脂西洋蓍黴的GAP啟動子的示例性核苷酸序列的核苷酸序列(SEQIDNO:10)。圖44A-44C描述的是用於表達載體pYLHUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDNO:ll)，其含有編碼裡氏木黴a-1,2甘露糖苷酶的、為了在解脂西洋蓍黴中表達而經密碼子優化並且含有LIP2前信號序列的cDNA序列。圖45A-45C描述的是用於表達載體pYLGUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDNO:12)，其含有編碼裡氏木黴a-l，2甘露糖苷酶的、為了在解脂西洋蓍黴中表達而經密碼子優化並且含有LIP2前信號序列的30200880018736.4cDNA序列。圖46A-46C描述的是用於表達載體pYLPUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDNO:13)，其含有編碼裡氏木黴a-l,2甘露糖苷酶的、為了在解脂西洋蓍黴中表達而經密碼子優化並且含有LIP2前信號序列的cDNA序列。圖47A-47C描述的是用於表達載體pYLTUXdL2preManHDEL的示例性核苷酸序列(SEQIDNO:14),其含有編碼裡氏木黴a-l,2甘露糖苷酶的、為了在解脂西洋蓍黴中表達而經密碼子優化並且含有LIP2前信號序列的cDNA序列。圖48是一系列對獲得自用指明的不同表達載體轉化的解脂西洋蓍黴細胞的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜"hp4dL2ManHDEL"(pYLHUXdL2preManHDEL，圖44A-44C);"GAPL2ManHDEL，，(pYLGUXdL2preManHDEL，圖45A-45C);"TEFlL2ManHDEL"(pYLTUXdL2preManHDEL，圖47A-47C)。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的葡聚糖(dextran)的分析。系列中第二個電泳圖鐠是對RNA酶B的分析。圖49是一系列對獲得自含有穩定整合的表達載體pYLTUXdL2preManHDEL(圖47A-47C)的解脂西洋蓍黴MTLY60Aoc/z/細胞的糖蛋白進行的N-聚糖分析的電泳圖譜。糖蛋白樣品獲得自24、48、72和96小時的細胞培養物。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的葡聚糖(dextran)的分析。系列中第二個電泳圖譜是對RNA酶B的分析。圖50是用於人葡糖腦苷酯酶的示例性核酸序歹'](GLCM，SwissProt條目號P04062;SEQIDNO:15),其是按照為了在解脂西洋蓍黴中表達而經密碼子優化的cDNA以化學方法合成的。圖51是免疫印跡的照片，其描述了在解脂西洋蓍黴菌林MTLY60(WT;泳道4和6)和MTLY60AocW(Aochl;前三個泳道)中表達的人葡糖腦苷酯酶的遷移圖。蛋白質的分子量(kDa)通過在所述免疫印跡最右側的分子量標誌物來說明。圖52是人促紅細胞生成素的示例性核酸序歹'J(Epo,SwissProt條目號P01588;SEQIDNO:16)，其是按照為了在解脂西洋蓍黴中表達而經密碼子31優化的CDNA以化學方法合成的。圖53是人a-半乳糖香酶A的示例性核酸序列(AGAL,SwissProt條目號P06280;SEQIDNO:17)，其是按照為了在解脂西洋蓍黴中表達而經密碼子優化的cDNA以化學方法合成的。圖54是一系列過表達Haclp蛋白的經剪接形式的巴斯德畢赤酵母細胞或野生型巴斯德畢赤酵母細胞的電子顯微照片。將細胞中堆疊的脂質膜的離散區加框。圖55是一系列電泳圖譜，其描述對獲得自指明的WT解脂西洋蓍黴細胞(polld)和表達a-l，2-甘露糖芬酶和HDEL序列的融合蛋白的解脂西洋蓍黴細胞的糖蛋白進行的N-聚糖分析。分析使用DSA-FACE進行。"M5"，"M6"，"M7"，"M8"和"M9"是指與殼二糖核心結構結合的甘露糖殘基數。Y軸代表相對螢光單位，表明各個甘露糖結構的量。X軸代表各個複合甘露糖結構通過凝膠的相對遷移率。頂部的電泳圖譜是對用作遷移率標準品的寡麥芽糖的分析。底部的電泳圖譜是對RNA酶B的分析。詳述本文描述的方法和遺傳工程化的細胞可以用於產生如下目標分子(例如，目標蛋白或目標多萜醇)，其與在未經遺傳工程化的細胞中產生的所述目標分子的N-糖基化形式相比具有改變的N-糖基化形式。已經證明糖基化目標分子(例如，糖基化蛋白)向患有代謝紊亂(例如，溶酶體貯積病)患者的施用使所述病症的症狀改善。因此，所述的方法和細胞可用於製備N-糖基化改變的目標分子，其用於包括但不限於治療代謝紊亂如溶酶體貯積病。這樣的N-糖基化改變的分子也可用於廣泛多樣的其它領域，例如，食品和飲料工業；藥物工業(例如，作為疫苗)；農業工業；和化學工業，等等。N-糖基化改變的分子如用於本文，目標分子是指通過來自遺傳工程化的細胞(例如，真菌細胞；植物細胞；或動物細胞)的一種或多種N-糖基化活性而經受改變的N-糖基化的任何分子。在一些實施方案中，目標分子能夠^皮運輸經過解脂西洋蓍或多步，導致它們的N-糖基化因宿主細胞機構(machinery)而改變。所述目標分子可以是內源或外源的。述含有添加、缺失或取代的蛋白質。合適的目標蛋白包括病原體蛋白(例如，破傷風類毒素；白喉(diphtheria)類毒素；病毒表面蛋白(例如，巨細胞病毒(CMV)糖蛋白B、H和gCIII;人免疫缺陷病毒1(HIV-1)包膜糖蛋白；勞斯肉瘤病毒(RSV)包膜糖蛋白；單純皰瘮病毒(HSV)包膜糖蛋白；EB病毒(EBV)包膜糖蛋白；水痘帶狀皰滲病毒(VZV)包膜糖蛋白；人乳頭狀瘤病毒(HPV)包膜糖蛋白；流感病毒糖蛋白；和肝炎家族表面抗原)，溶酶體蛋白(例如，葡糖腦苦酯酶、腦苷酶或半乳糖腦香酯酶)，胰島素，胰高血糖素，生長因子，細胞因子，趨化因子，抗體及其片段，或所述蛋白質中任一與抗體或抗體片段的融合物(例如，蛋白質-Fc)。生長因子包括，例如，血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、骨形態發生蛋白(BMP)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、神經生長因子(NGF);神經營養蛋白、血小板衍生生長因子(PDGF)、促紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、Myostatin(GDF-8)、生長分化因子-9(GDF9)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF或FGF2)、表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)。細胞因子包括，例如，白介素(例如，IL-1至IL-33(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-12、IL-13或IL-15))。趨化因子包括，例如，1-309、TCA-3、MCP-1、MIP-louMIP-1卩、RANTES、CIO、MRP-2、MARC、MCP-3、MCP-2、MRP-2、CCF18、MIP-ly、Eotaxin、MCP-5、MCP-4、NCC-1、CkpiO、HCC-1、白細胞誘素-1(Leukotactin-l)、LEC、NCC-4、TARC、PARC或Eotaxin-2。還包括腫瘤糖蛋白(例如，腫瘤相關抗原)，例如，癌胚抗原(CEA)、人粘蛋白、HER-2/neu和前列腺特異性抗原(PSA)[R.A.Henderson和0.J.Finn,AdvancesinImmunology,62，第217-56頁(1996)]。在一些實施方案中，目標蛋白可以是與溶酶體貯積病相關的目標蛋白，所述目標蛋白包括，例如，a-L-艾杜糖苷酸酶、P-D-半乳糖苷酶、|3-葡糖苷酶、(3-己糖胺酶、(3-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙醯半乳糖胺酶、天冬氨醯葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖苷-N-乙醯轉移酶、(3-D-葡糖醛酸酶、透明質酸酶、a-L-甘露糖苦酶、a-神經氨酸酶、磷酸轉移酶、酸性脂肪酶、酸性神經醯胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。目標蛋白也可以是融合蛋白。融合蛋白包括，例如，(i)本文描述的任何蛋白或其片段與(ii)抗體或其片段的融合物。如用於本文，術語"抗體片段"是指抗原結合片段，例如，Fab、F(ab')2、Fv和單鏈Fv(scFv)片段。scFv片段是單一多肽鏈，其包括所述scFv所源自的抗體的重鏈和輕鏈可變區二者。此外，雙抗體[Poljak(1994)Structure2(12):1121-1123;Hudson等(1999)J.Immunol.Methods23(1-2):177-189，將這兩篇的內容通過所述整體併入本文]和細胞內抗體[Huston等(2001)Hum.Antibodies10(3-4):127-142;Wheeler等(2003)Mol.Ther.8(3):355-366;Stocks(2004)DrugDiscov.Today9(22):960-966,將全部這些的內容通過所述整體併入本文]也可以在本發明的方法中使用。目標蛋白也可以與聚合物、載體、佐劑、免疫毒素或可檢測的(例如，焚光、發光或放射性)模塊中的一種或多種結合。例如，可以將目標蛋白與聚乙二醇結合，所述聚合物模塊可以用於例如增加小蛋白質的分子量和/或增加循環滯留期。在一些實施方案中，目標分子可以是或可以含有多萜醇。遺傳工程化的細胞本文描述的遺傳工程化的細胞具有至少一種經修飾的N-糖基化活性，所述細胞可用於一種或多種具有改變的N-糖基化形式的目標分子的產生。適合於遺傳工程化的細胞包括，例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍黴或本文所述的任何其它相關的雙態性酵母細胞)，植物細胞或動物細胞(例如，(線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人))。所述細胞可以是原代細胞、無限增殖化細胞或經轉化的細胞。所述細胞可以是動物中，例如非人哺乳動物中的那些細胞。這些細胞，在進行本文指定的遺傳工程化之前，可以獲得自多種商業來源和研究資源機構，如，例如，美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(Rockville,MD)。目標分子包括蛋白質，例如任何本文所述的目標蛋白(見上文)。目標分子也包括多碎醇。對細胞進行的遺傳工程化包括遺傳修飾如(i)缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的內源基因；(ii)引入編碼具有N-糖基化活性的蛋白質(例如，內源或外源蛋白)的突變形式的重組核酸(即，表達具有N-糖基化活性的突變蛋白)；(iii)引入或表達RNA分子，所述RNA分子幹擾具有N-糖基化活性的蛋白質的功能性表達；(iv)引入編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的野生型(例如，內源的或外源的)的重組核酸(即，表達具有N-糖基化活性的蛋白質)；或(v)改變編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的一種或多種內源基因的啟動子或增強子元件，由此改變它們編碼的蛋白質的表達。RNA分子包括，例如，小幹擾RNA、短髮夾RNA(shRNA)、反義RNA或微小RNA(miRNA)。應該理解的是，第(ii)項包括，例如，用相對於如下被替代的內源基因編碼具有更大N-糖基化活性的蛋白質的基因替代內源基因(例如，通過同源重組)。遺傳工程化還包括改變編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的內源基因以產生具有添加(例如，異源序列)、缺失或取代(例如，突變如點突變；保守或非保守突變)的蛋白質。突變可以特異性地引入(例如，定點誘變或同源重組；參加隨附實施例)或者可以隨機引入(例如，可以對細胞進行化學誘變，如在例如Newman和Ferro-Novick(1987)J.CellBiol.105(4):1587中所述，將其公開內容通過所述整體併入本文)。本文描述的遺傳修飾可以導致如下的一種或多種(i)在經遺傳修飾的細胞中一種或多種N-糖基化活性的增加，(ii)在經遺傳修飾的細胞中一種或多種N-糖基化活性的減少，(iii)在經遺傳修飾的細胞中一種或多種N-糖基化活性的定位或胞內分布的變化，或(iv)在經遺傳^f務飾的細胞中一種或多種N-糖基化活性的比例的變化。應該理解的是，N-糖基化活性的量的增加可以歸因於一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質的過表達；內源基因的拷貝數的增加(例如，基因重複)；或內源基因的啟動子或增強子的改變，其刺激由所述基因編碼的蛋白質的表達增加。一種或多種N-糖基化活性的減少可以歸因於一種或多種蛋白質的突變形式(例如，顯性陰性形式)的過表達，所述突變形式具有改變N-糖基化的活性；一種或多種幹擾RNA分子的引入或表達，所述幹擾RNA分子降低一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質的表達；或一種或多種編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的內源基因的缺失。缺失或破壞一種或多種內源基因的方法在隨附實施例中描述。例如，為了通過同源重組破壞基因，"基因替代，，載體可以以一種使其包括可選擇的標記基因的方式構建。這些可選擇的標記基因可以在5'和3'端與長度足以介導同源重組的基因部分可操作地連接。所述可選擇的標記可以是多種基因之一，所述基因或者補足宿主細胞的營養缺陷型(auxotrophy)，或者提供抗生素抗性，包括URA3、LEU2和HIS3基因。其它合適的可選擇標記包括CAT基因，其賦予酵母細胞氯黴素抗性，或lacZ基因，其導致因表達p-半乳糖脊酶產生的藍色菌落。然後使用本領域公知的方法(見下文)將基因替代載體的線性化DNA片段引入細胞。線性片段向基因組中的整合和基因的破壞可以基於所述選擇標記來測定，並且可以通過例如Southern印跡分析來聰、證。如在隨附實施例中詳述的，在可選"^的標記在選"^中使用之後，可以將其從宿主細胞的基因組去除，通過例如Cre-loxP系統(見下文)。或者，基因替代載體可以以一種使其包括待破壞基因的部分的方式構因編碼序列的失活片段。"失活片段"是這樣的基因片段，其編碼的蛋白質具有，例如，產自所述基因全長編碼序列的蛋白質的活性的低於約10%(例如，低於約9%,低於約8%,低於約7%，低於約6%，低於約5%,低於約4%,低於約3%,低於約2%,低於約1%,或0%)。將這種基因部分以如下方式插入載體，即沒有已知啟動子序列與該基因序列可操作連接，但是終止密碼子和轉錄終止序列與所述基因序列的所述部分可操作地連接。然後可以同源重組的方式，於是將這種線性化的載體整合入所述基因的內源對應物(counterpart)中。表達載體可以是自主性的或整合型的。可以將重組核酸(例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的野生型或突變形式的重組核酸)以表達載體的形式引入細胞，所述表達載體例如質粒、噬菌體、轉座子、粘粒或病毒顆粒。重組核酸可以保持在染色體外，或者它可以被整合入酵母細胞染色體DNA。表達載體可以含有選擇標記基因，其編碼細胞在選擇條件下生存所需的蛋白質(例如，URA3，其編碼尿嘧啶生物合成所需要的酶；或TRPl,其編碼色氨酸生物合成所需要的酶)，以允許檢測和/或選擇那些用期望的核酸轉化的細胞(參見，例如，美國專利No.4,704,362)。表達載體也可以包括自主複製序列(ARS)。例如，美國專利No.4,837,148描述了自主複製序列，其為在巴斯德畢赤酵母中保持質粒提供了適合的方法。將美國專利No.4，837，148的^Hf內容通過所述整體併入本文。整合型載體在例如美國專利No.4,882,279(將其公開內容通過所述整體36併入本文)中披露。整合型載體通常包括連續排列的至少有第一可插入DNA片段、可選擇的標記基因和第二可插入DNA片段的序列。所述第一和第二可插入DNA片段的長度各為約200個(例如，約250,約300，約350,約400,約450，約500或約1000或更長)核香酸並且具有與待轉化物種基因組DNA中的部分同源的核苷酸序列。將用於表達的含有感興趣的基因(例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的基因)的核苷酸序列插入這種載體的第一和第二可插入DNA片段之間，在標記基因之前或是之後。可以在酵母轉化之前將整合型載體線性化以促進感興趣的核苷酸序列整合入宿主細胞基因組。表達載體可以包含(feature)在酵母(例如，解脂西洋蓍黴、」rxw/"^/ew'm'vorara,或其它相關的雙態性酵母種)啟動子調控下的重組核酸，所述啟動子使得它們能夠在酵母中表達。合適的酵母啟動子包括例如，ADC1、TPIl、ADH2、hp4d、POX和GallO(參見，例如，Guarente等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79(23):7410)啟動子。另外的合適啟動子在例如Zhu和Zhang(1999)Bioinformatics15(7-8):608-611和美國專利No.6,265,185中記載，將它們每一篇的公開內容通過所述整體併入本文。在將表達載體引入動物細胞(例如哺乳動物細胞)的情況下，所述表達載體可以包含在適合用於在感興趣的宿主細胞中表達的動物細胞啟動子調控下的重組核酸。哺乳動物啟動子的實例包括，例如，SV40或巨細胞病毒(CMV)啟動子。啟動子可以是組成型或誘導型(條件性)的。組成型啟動子應理解為這樣的啟動子，其表達在標準培養條件下是恆定的。誘導型啟動子是響應於一種或多種誘導信號(inductioncue)的啟動子。例如，可以對誘導型啟動子進行化學調節(例如，其轉錄活性受到化學誘導劑的存在或缺失調節的啟動子，所述化學誘導劑例如醇、四環素、類固醇、金屬或其它小分子)或物理調節(例如，其轉錄活性受到物理誘導物的存在或缺失調節的啟動子，所述物理誘導物例如光或高溫或低溫)。誘導型啟動子也可以直接通過一種或多種轉錄因子調節，所述轉錄因子本身直接受到化學或物理信號的調節。細胞的遺傳工程化還包括激活存在於宿主細胞中，但是通常在所述細胞中不表達或在所述細胞中不以顯著水平表達的內源基因(例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的基因)。例如，可以修飾內源基因的調節序列(例如，基因啟動子或增強子)從而使可操作連接的編碼序列展現增加的表達。同源遺傳工程化的細胞中所顯現的調節或誘導模式。用於引入基因的調節序列(例如，啟動子或增強子)的改變的合適方法記載著，例如，美國專利申請公開No.20030147868中，將其7>開內容通過所述整體併入本文。應理解的是，其它遺傳工程化的修飾也可以是條件性的。例如，可以將基因條件性地缺失，使用例如位點特異性DNA重組酶如Cre-loxP系統(參見，例如，Gossen等(2002)Ann.Rev.Genetics36:153-173和美國申請No.20060014264,將它們每一篇的公開內容通過所述完整併入本文)。可以使用多種方法將重組核酸引入本文所述的細胞，所述方法例如原生質球技術或全細胞氯化鋰酵母轉化方法。其它對於將質粒或線性核酸載體轉化入細胞有用的方法記載在，例如，美國專利No.4,929,555;Hinnen等(1978)Proc.Nat.Acad.Sci.USA75:1929;Ito等(1983)J.Bacteriol.153:163;美國專利No.4,879,231;和Sreekrishna等(1987)Gene59:115中，將它們每一篇的公開內容通過所述完整併入本文。電穿孔和PEG1000全細胞轉化方法也可以使用，如Cregg和Russel，MethodsinMolecularBiology:PichiaProtocols,Chapter3，HumanaPress,Totowa,N丄，第27-39頁(1998)中所述，將其公開內容通過所述完整併入本文。動物細胞的轉染可以包括，例如，使用磷酸鈣、電穿孔、熱激、脂質體或轉染試劑如FUGENE⑧或LIPOFECTAMINE⑧或通過使棵核酸載體與細胞在溶液中接觸(參見，例如，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManualSecondEditionvol.1,2and3.ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NewYork,USA,Nov.1989;將其公開內容通過所述完整併入本文)將載體引入細胞。可以通過使用合適的技術來選擇經轉化的酵母細胞，所述技術包括但不限於，在轉化之後在缺乏所需生化產物(由於細胞的營養缺陷型)條件下培養營養缺陷型細胞，選擇和檢測新的表型，或在對於缺乏轉化體中所含抗性基因的酵母為毒性的抗生素存在下進行培養。轉化體也可以通過將表達盒整合入基因組來選擇和/或驗證，其可以通過例如Southern印跡或PCR分析來評定。在將載體卩1入感興趣的靶麵胞之前，可以將載體在細菌細胞如大腸桿菌(￡.co/Z)中培養(例如，擴增)。載體DNA可以通過任何本領域已知的方法從細菌細胞分離，所述方法致使載體DNA從細菌環境中純化。經純化的載體DNA可以用酚、氯仿和醚粗提(extractextensively),以確保沒有大腸桿菌蛋白存在於質粒DNA製備物中，因為這些蛋白質對於哺乳動物細胞是毒性的。如本文所述，遺傳工程化可以用於表達(例如，過表達)多種基因、向多種基因中引入修飾或缺失多種基因，例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的基因。這些基因包括，例如，ALG7、ALG13、ALG14、ALG1、ALG2、ALGll、RFT1、ALG3、ALG9、ALG12、ALG6、ALG8、ANL1、ALGIO、ALG5、OST3、OST4、OST6、STT3、OSTl、OST5、職P1、SWP1、OST2、DPM1、SEC59、OCHl、MNN9、VAN1、M麗8、MNNIO、MNNll、HOCl、MNN2、M麗5、MNN6、KTR1、YUR1、MNN4、KRE2、KTR2、KTR3、MNN1、MNS1、MNN4、PNOl、MNN9、葡糖苷酶I、葡糖苷酶II、或內切甘露糖苷酶(endomannosidase)。編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的基因可以來自任何含有這樣的基因的物種(例如，低等真核生物(例如，真菌(包括酵母)或錐蟲)，植物，或動物(例如，昆蟲、鳥、爬行動物或哺乳動物(例如，齧齒動物如小鼠或大鼠、犬、貓、馬、山羊、牛、豬、非人靈長類動物或人))。編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的基因可以從中獲得的示例性真菌菌種包括，但不限於，異常畢赤酵母(屍/c/n'fla"oma/a)、牛腸畢赤酵母CP/c/z/a幻v&)、力口拿大畢赤酵母(屍/c/z/aozwo^e"w."、/Vc/,ac<amomY、並分4犬畢赤酵母(/Vc/n'a/an,wose)、發酵畢赤酵母(/7c/z/a/ermew^z/w)、；必液畢赤酵母(屍/c/z/a_/7w:o^w)、膜醭畢赤酵母(屍/c/2/amew6ra朋e/act'em)、膜醭畢赤酵母CP/c/z/amem6rawaey^c/era)、並且卄士念J朱菌(Caw//<iava/Wa)、白念；朱菌(Ca"(i/(iaa/6/cam1)、Cawd油asca/a//2油r,、Ca/^Waaw//2/:dae、南極念珠菌(Caw/油勘torc"ca)、大西洋念珠菌(Cawd油af/aw"ca)、Ca"d油a加os//zaeWca、Qwcfe/aWfl"ae、Qwiiz'c/acmpop/H7a、Ca"(i油ceramZyc油r騰、Ca"cfeiac/zaw/zWes、Ca"(i油co^/a/z's、GaWdat/aw，'、都柏林念珠菌(Ca"6f油cMMm.em7's)、Caroi油erg她似/s、Cawci油^/h/c加、光滑念珠菌(Ca"A(iag/Wrato)、發酵念珠菌(C""<i/<ia/erwe"to")、季也蒙念珠菌(QmdWagM/〃/ermowc//0、希木隆念多朱菌(C"a"(i/(ia/zaew"/ow/0、C"awt//7&rwe<i/a)、Ca"(iz'da)e#rew7、乳酒念珠菌(Owc/WaA:e^r)、克魯斯念珠菌(Ca"t&b^rw化/)、葡萄牙念玉朱菌(Cawii/(ia/imYam'ae)、Caw/z'^/a(yxoso//^7a、CVm&c/ama/tosa、醭月莫念玉朱菌(Cb"(i/(ia附e附6n3f/7^/^"'e"^、wn'//eW、G(3"d/dao/eo//nYa、奧裡戈念珠菌(Cam^.cfaorego"em7》、近平滑念珠菌(Ca"t/油para戶7os7》、桔念珠菌(C朋(i油，erc浙w—、休哈塔念珠菌(Caw(i油Ae/^ea)、Qwt/油,e/w"oc/z//ae、纖糹田念J朱菌(Ca"(i/(iate"M/力、熱帶念玉朱菌(Ca"d/(ia/廠0/^"//力、Cawd油加c/z—e、Ca"t/油w'wo/a6ora""'畫、普油念珠菌(C"w(i油—"e)、維斯念珠菌(Ca"^iav&wa"aA")、產朊念珠菌(C朋^iaWz7/力、膜醭畢赤酵母、(屍/c/7/aw7ve欲/"、膜醭畢赤酵母、屍/c/z/ac/zo^"、膜醭畢赤酵母、膜醭畢赤酵母、戶/c/^m/"wcw/e、巴斯德畢赤酵母、假多形畢赤酵母(屍/c/z/fl/weM(iopo/_ymo/7/w)、才樂畢赤酵母(屍/c/z/a《wercjww)、屍/c/z/aroZer/s//、齋藤畢赤酵母(屍/c/w,asazYc^.)、屍z'c/n.aw7veWn、/、斯i也畢赤酵母(屍/c/n'asZnxs^z^geww^)、陸生畢赤酵母(屍/c/w.ate/r/co/")、屍/c//ava"n)7、屍jewdoz，aj"to/r,/c<3、紅冬孑包酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、糹工酵母(i^ot/oton^/ag7w"m's)、貝酵母(*S*acc/zflram_yc&s6ayawM力、貝酵母、Sacc/2(arcw^ceywcwz^/n^7.cw、葡萄汁酵母(Sacc/7flrawycesmvotmw)、貝酵母、西良酒酵母、二孑包酵母(iSacc/^rawyces6一or—、薛瓦酵母(5^cc/z(3ram少cesc/zeva/z'en')、德爾布酵母(iSacc/2flra，ces(ie/Z^wech7)、少孑包酵母((Sacc/zar函ycesex/gwo—、發酵性酵母(iSacc/zoromyces1/^環e"/加,)、脆壁酵母(&cc/2anmyces々agz7&)、馬克思酵母(iSacc/zaromycesmanc/a/ii)、蟲奪蜜酵母(5""cc/2flromyc&sme〃&)、羅斯酵母(Sacc/za廠o附^ycesrase/)、魯酵母(6"acc/zar麵;;c&sra腿7)、葡萄汁酵母、威爾酵母(Sacc/wrawjc&sw/〃/a"w力、^各德、酵母3各《急酵母、(Sacc/^ram^yco/wzica/ww/or/s、4口嚢復膜孑包酵母(5^^0/&/6"/&^(3)、扣嚢復月莫孑包酵母、大麥曲內孑包黴(五"(icw少c^/wde/)、EWo，co戸'sybW/gera、5^w潔'5pora扁.toz'、八孑包裂殖酵母(/Sc/7/zosacc/7ara附ycesocto^or—、粟酒裂歹直酵母(iSc/z/zosacc/zaramycas/9om6e)、西方"i午旺酵母(5bMvcw"/ow少cesocc/cfewtofe)、戴爾有孑包圓酵母(7brw/ay/orafife/6rMecA://)、戴爾有孑包圓酵母、大連酵母(5"flcc/2ara/w少cesda/re似/力、戴爾有孑包圓酵母、發酵有孑包圓酵母(7^^/05/0^3_/^77￡;^"")、發酵性酵母、戴爾有孢圓酵母、羅斯有孢圓酵母(ronz/a^orara化/)、羅斯酵母(&cc/7fl/w^cesmye/)、戴爾有孢圓酵母、羅斯酵母、戴爾有孢圓酵母、德爾布酵母、戴爾有孑包圓酵母、德'爾布酵母、々gosacc/zaram^yc&smcwgo/Zcws、(Dora/as;9orag/oZ)osa)、；求形德-巴利酵母CDe^a7^omycesg7oZ)asw力、圓&jM以酵酵母(7Wc/asporowcw她e調)、三角酵母(7HgW7o/w^va〃'aZ//^)、力口利3畐尼亞擬威爾酵母(附'〃/o;w/51ca/zybrm'ca)、擬威爾酵母(附〃/o戸.ss她w—、二孑包接合酵母(Zjgos(3Cc/zara，ces6—w"力、二孢接合酵母、(Detor;w^cesofc;on^)、二孢酵母、二孢接合酵母、二孢酵母、蟲奪蜜接合酵母(^vgc^acc/7aramycesme脂)、^vg。sacc/j"ra附yces、(Zygc^acc/wra，c&srawx"m)、魯接合酵母(々gwacc/z(3ra，c&srawx//)、(Z_vgoMcc/wram_yc&yZ^Aen')、魯酵母、魯接合酵母、大接合酵母(Zygaracc/zaramyc&ym"乂or)、魯酵母、異常畢赤酵母、牛腸畢赤酵母、加拿大畢赤酵母、P/c&'acwwm'"粉狀畢赤酵母、發酵畢赤酵母、泌液畢赤酵母、膜醭畢赤酵母、假多形畢赤酵母、櫟畢赤酵母、P/c/;/ara6er加7、屍"w&2^附a爿"to/T"CG、紅冬孢酵母、紅冬孢酵母、紅酵母、貝酵母、貝酵母、二孢酵母、釀酒酵母、薛瓦酵母、德爾布酵母、發酵性酵母、脆壁酵母、路德酵母、粟酒裂殖酵母、西方許旺酵母、戴爾有孢圓酵母、rww/asporag/o6oM、三角酵母、加利福尼亞擬威爾酵母、擬威爾酵母、二孢接合酵母、蜂蜜接合酵母、魯接合酵母或任何其它本領域已知的或本文描述的真菌(例如，酵母)。示例性低等真核生物還包括麴黴屬(vl^erg/〃^)的多個種，包括但不限於，淺藍灰麴黴(Jsperg/〃Mscaew'e〃w力、亮白麴黴(/^/ez-g/〃^s、肉色麴黴(y^/erg飾scaweiw)、棒麴黴(A/erg/〃z^c/avof加)、彎頭麴黴(y^/er^〃w^c/e^/7ecZw力、黃麴黴(v4s/erg〃/ws_/7avM>s)、》因麴黴(^s;erg/〃t^/w附/gflft^)、灰糹錄麴黴(y^/erg/〃twg/awc—、構巢麴黴(v4，rg/〃船w油/a—、黑麴黴、赭麴黴(yl5perg7'〃woc/7racew力、米麴黴(y^e,g/〃w寄生麴黴(y4iperg7'〃w/arasWc—、青黴狀麴黴(A/erg7'〃j^戸m'c/〃o/(i&y)、局卩艮麴黴(Aperg贏smstn'c^s)、醬油麴黴(J^erg7'〃wssoy'ae)、聚多麴黴(」5pe屍g/〃^s;/(iovW)、溜麴黴(y^/^g/〃z^to應〃')、土麴黴(A;grg7.〃^fe廳et^)、焦麴黴(/^/7Wg7.〃WSM虛5)或雜色麴黴(^^ewz7/wve^cofo。。編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的基因可以從中獲得的示例性原蟲屬包括，但不限於，芽短膜蟲屬(說wtocr欣Wa)、短膜蟲屬(CWAWa)、腸錐蟲屬C&26fo^少/7fl"w附)、旬滴蟲屬(/ferpeto附owos)、利什曼原蟲屬(丄e/A柳(3m'a)、細滴蟲屬(丄e/tomo"os)、才直生滴蟲屬(屍/^tomcwos)、4,蟲屬(7)j/7a"asom(3)(例io，布氏4,蟲(7:^Mceh')、甘比亞4,蟲(7:gam&e似e)、羅德西亞錐蟲(r/zoafew'erae)和克氏4偉蟲(Z"wz)和應該理解的是，如本文所述，遺傳工程化可以用於表達(例如過表達)、引入修飾至、或缺失多種基因(例如，編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的基因)和/或本文所述任何基因中一種或多種(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15或20種或更多種)的任意組合。在一些實施方案中，所述經遺傳工程化的細胞缺乏ALG3(Genbank⑧登錄號XM一503488;GenolevuresRef:YALI0E03190g)基因或其基因產物(例如，mRNA或蛋白質)。在一些實施方案中，所述經遺傳工程化的細胞表達(例如過表達)ALG6(Genbank登錄號XM—502922，GenolevuresRef:YALI0D17028g)蛋白。在一些實施方案中，所迷經遺傳工程化的細胞表達MNN4基因(Genbank登錄號XM—503217,GenolevuresRef:YALI0D24101g)。在一些實施方案中，所述經遺傳工程化的細胞缺乏0CH1和/或MNN9基因或其基因產物(例如，mRNA或蛋白質)。在一些實施方案或蛋白質)。在一些實施方案中，所述經遺傳工程化的細胞表達葡糖苷酶II的a或(3亞基(或a和p亞基二者)，所述葡糖苷酶II例如解脂西洋蓍黴或布氏錐蟲的葡糖苦酶II。在一些實施方案中，所述經遺傳工程化的細胞表達變聚糖酶(mutantase),例如哈茨木黴的變聚糖酶。在一些實施方案中，所述經遺傳工程化的細胞可以具有這些修飾的任意組合。例如，在一些實施方案中，所述經遺傳工程化的細胞可以缺乏ALG3(例如，由Genbank⑧登錄號XM—503488,GenolevuresRef:YALI0E03190g示例的ALG3基因)基因或其基因產物(例如，mRNA或蛋白質)；可以過表達ALG6(例如，如由Genbank⑧登錄號XM—502922，GenolevuresRef:YALI0D17028g示例的ALG6)蛋白；可以過表達葡糖苷酶II(例如解脂西洋蓍黴、布氏錐蟲或任何其它本文所述的物種的葡糖苷酶II)的a和/或p亞基；可以過表達a-l，2-甘露糖苷酶；並且過表達如下中的一種或多種(和任意組合)糖苷酶、糖基轉移酶、糖-核苷酸轉運蛋白、糖-核苷酸修飾酶。在一些實施方案中，所述經遺傳工程化的細胞不缺乏0CH1基因或其基因產物(例如，mRNA或蛋白質)。在一些實施方案中，所述經遺傳工程化的細胞可以含有甘露糖苷酶活性(例如，a-甘露糖苷酶活性)。所述甘露糖苷酶活性可以靶向內質網。所述甘露糖苦酶可以具有至少7.5以下的最適pH(例如，至少7.4以下，至少7.342以下，至少7.2以下，至少7.1以下以下，至少6.7以下，至少6.6以下以下，至少6.2以下，至少6.1以下以下，至少5.7以下，至少5.6以下以下，至少5.2以下，至少5.1以下以下或至少4.7以下)。所述甘露糖苦酶可以是MNS1。例如，所述經遺傳工程化的細胞可以過表達甘露糖香酶(例如，a-l，2-甘露糖香酶或任何其它本文所述的甘露糖苷酶)，但是不缺乏OCH1基因或其基因產物(例如，mRNA或蛋白質)。所述甘露糖香酶可以是所述蛋白質的野生型形式，或者可以是突變形式，例如含有甘露糖苷酶和HDELER-保留胺基酸序列的融合蛋白(參見實施例)。(應該理解可以將任何具有N-糖基化活性的蛋白質工程化改造成包含HDEL序列的融合蛋白)。在一些實施方案中，所述經遺傳工程化的細胞可以含有能夠促進目標分子的改變的N-糖基化形式進行甘露糖基磷酸化的活性。例如，可以將編碼促進N-聚糖進行磷酸化的活性的核酸(例如MNN4，MNN6，PN01)引入遺傳工程化的細胞，所述細胞能夠增加目標分子的N-糖基化的磷酸化。在一些實施方案中，所述經遺傳工程化的細胞可以含有能夠去除甘露糖殘基的活性(例如，甘露糖苷酶，如來自JackBean的甘露糖苷酶)，所述甘露糖殘基遮蔽N-糖基化改變的分子的磷酸化。在一些實施方案中，所述經遺傳工程化的細胞能夠從Man5GlcNAc2去除葡萄糖殘基。例如，所述經遺傳修飾的細胞可以過表達具有a-l，3-葡糖苷酶活性的蛋白質，例如，但不限於，變聚糖酶或葡糖香酶II(例如解脂西洋蓍黴、布氏錐蟲或本文所述的任何其它真菌菌種的葡糖苷酶II)的a和/或f3亞基。在具有N-糖基化活性的蛋白質源自與表達該蛋白質的細胞不同類型(例如，不同種)的細胞的實施方案中，可以為了在特定的感興趣的細胞中表達而對編碼所述蛋白質的核酸進行密碼子優化。例如，可以對來自布氏錐蟲的編碼具有N-糖基化的蛋白質的核酸進行密碼子優化用於在酵母細胞(例如解脂西洋蓍黴)中表達。這種密碼子優化可以用於增加蛋白質在感興趣的細胞中的表達。用於對編碼蛋白質的核酸進行密碼子優化的方法是本領域已知,至少7.0以下，至少6.9以下，至少6.8，至少6.5以下，至少6.4以下，至少6.3,至少6.0以下，至少5.9以下，至少5.8,至少5.5以下，至少5.4以下，至少5.3，至少5.0以下，至少4.9以下，至少4.8的，並且記載在例如Gao等(Biotechnol.Prog.(2004)20(2):443-448)，Kotula等(Nat.Biotechn,(1991)9，1386—1389)和Bennetzen等(J.Biol.Chem.(1982)257(6):2036-3031)中。也可以對細胞進行遺傳工程化以主要產生作為哺乳動物(例如，人)糖基化途徑的中間體的N-聚糖。例如，可以將編碼具有N-糖基化活性的人的蛋白的一種或多種核酸引入細胞。在一些實施方案中，可以將人的蛋白引入細胞，並且可以抑制(例如，缺失或突變)一種或多種具有N-糖基化活性的內源酵母蛋白。用於"人源化，，真菌糖基化途徑的技術記載在，例如，Choi等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(9):5022-5027;Verveken等(2004)Appl.Environ.Microb.70(5):2639-2646;和Gerngross(2004)NatureBiotech.22(11):1410-1414中，將它們每一篇的公開內容通過所述整體併入本文。在遺傳工程化涉及例如改變蛋白質的表達或外源蛋白(包括內源蛋白的突變形式)的表達的情況下，可以使用多種技術來測定經遺傳工程化的細胞是否表達該蛋白質。例如，編碼所述蛋白質的mRNA或蛋白質本身的存在可以如下檢測，分別使用例如Northern印跡或RT-PCR分析或Western印跡分析。具有N-糖基化活性的蛋白質的胞內定位可以通過使用多種技術來分析，所述技術包括亞細胞分級和免疫螢光。另外的遺傳修飾和將它們引入本文描述的任何細胞的方法可以根據例如，美國專利Nos.7,029,872;5,272,070;和6,803,225;和美國專利申請公開Nos.20050265988、20050064539、20050170452和20040018588的/>開內容修改適用，將它們每一篇的公開內容通過所述整體併入本文。儘管在雙態性酵母菌種中為了實現體內產生Man5GlcNAc2和Man3GlcNAc2而進行的工程化步驟可能與在其它酵母菌種中進行的工程化步驟不同，但是本領域技術人員將清楚在雙態性酵母中體內產生經修飾的糖蛋白(具有MansGlcNAc2和Man3GlcNAc2核心N-聚糖結構)的工程化技術可以根據常規實驗法從包括但不限於美國專利No.7,326,681和美國公開Nos.200400185卯、20060040353和20060286637(將它們每一篇的公開內容通過所述整體併入本文)中公開方法修改獲得。由此可以將經修改的方法用於實現糖蛋白的產生，所述糖蛋白經修飾而具有人類型雜合和複合的N-聚糖。這些複合N-聚糖可以在上文指定的核心聚糖上具有2-5個以GlcNAc殘基起始的分支，其可以進一步延伸，例如，用半乳糖、果糖、唾液酸殘基延伸。在一些實施方案中，具有N-糖基化活性的突變蛋白或野生型蛋白可以從經遺傳工程化的細胞中使用標準技術分離。例如，在所述經遺傳工程化的細胞中表達突變蛋白或野生型蛋白之後，可以從該細胞本身或從培養該細胞的培養基分離所述蛋白質。分離蛋白質的方法是本領域已知的並且包括，例如，液相層析(例如，HPLC)、親和層析(例如，金屬螯合或免疫親和層析)、離子交換層析、疏水相互作用層析、沉澱或差示溶解(differentialsolubilization)。在一些實施方案中，可以將具有N-糖基化活性的分離的蛋白質冷凍、凍幹或固定，並且儲存在合適條件下，所述條件允許該蛋白質保持活性。本公開還提供本文描述的任何經遺傳工程化的細胞的基本上純的培養物。如用於本文，經遺傳工程化的細胞的"基本上純的培養物"是這樣的細胞培養物，其中所述培養物中活細胞總數的低於約40%(即，低於約35%;30%;25%;20%;15%;10%;5%;2%;1%;0.5%;0.25%;0.1%;0,01%;0.001%;0.0001%;或甚至更低)是除所述經遺傳工程化的細胞之外的活細胞，例如，細菌、真菌(包括酵母)、支原體或原生動物細胞。術語"約"在本文上下文中指相關的百分比可以比指定百分比高或低所述指定百分比的15%。因此，例如，約20%可以是170/。-23%。這樣的經遺傳工程化的細胞的培養物包括細胞和培養、儲存或轉運培養基。培養基可以是液體、半固體(例如，膠狀培養基)或是冷凍的。培養物包括培養在液體培養基中或培養在半固體培養基中/上的細胞、或儲存或轉運培養基(包括冷凍儲存或轉運培養基)中儲存或轉運的細胞。培養物可以在培養容器或儲存容器或基底(例如，培養皿、燒瓶或管或儲存小瓶或管)中。本文描述的經遺傳工程化的細胞可以如下儲存，例如，作為冷凍細胞懸液，例如，在含有冷凍保護劑如甘油或蔗糖的緩衝劑中，作為凍幹的細胞。或者，它們可以例如作為乾燥的細胞製備物儲存，通過例如流化床乾燥或噴霧乾燥，或任何其它合適的乾燥方法。產生N-糖基化改變的分子的方法本文描述產生目標分子的改變的N-糖基化形式的方法。所述方法通常涉及使目標分子與來自經遺傳工程化的細胞(例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍黴、/1rx"/aa&m'mVwwM或本文所述的任何其它關的雙態性酵母細胞)、植物細胞或動物細胞(例如，線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人))的一種或多種N-糖基化活性接觸。所述方法可以是基於細胞的或不基於細胞的。基於細胞的方法可以包括向經遺傳工程化而具有至少一種經修飾N-糖基化活性的細胞(例如，真菌細胞(例如，解脂西洋蓍黴、爿no/A3aAw'w'voraraN-糖基化的目標分子的核酸，其中所述細胞以改變的N-糖基化形式產生所述目標分子。所述目標分子可以是，例如，蛋白質如任何本文所述的目標蛋白。在目標蛋白是脂質的實施方案中，核酸可以是編碼一種或多種促進脂質合成的酶的核酸。通過對細胞進行遺傳工程化來產生的修飾的類型在本文描述(參見隨附實施例和上文的"遺傳工程化的細胞")。用於引入核酸的方法是本領域已知的並且記載在隨附實施例和上文中。在遺傳工程化的細胞中引入或表達目標分子(例如，目標蛋白)可以導致運輸目標分子通過細胞的內質網和/或高爾基體，由此產生目標分子的改變的N-糖基化形式。在對目標分子進行加工之後(例如，在經遺傳修飾的細胞中)，目標分子(例如，目標蛋白)的改變的N-糖基化形式可以含有一種或多種N-聚糖結構。例如，目標分子的改變形式可以含有一種或多種特定的N-具體結構如Man5GlcNAc2(結構式I或VII;圖4),Man8GlcNAc2(結構式I;圖4)，Man9GlcNAc2(結構式II;圖4)，Man3GlcNAc2(結構式XIV;圖4)，Glc!Mari5GlcNAc2(結構式VIII;圖4),或Glc2Man5GlcNAc2(結構式IX;圖4)("Man，，是甘露糖；"Glc，，是葡萄糖；而"GlcNAc，，是N-乙醯葡糖胺)。產生自經遺傳工程化的細胞的N-糖基化改變的目標分子可以是均質的(即，全部N-糖基化改變的分子含有相同的特定N-聚糖結構)或者可以是基本上均質的。"基本上均質"是指改變的目標分子是由經遺傳工程化的細胞產生的改變N-糖基化的目標分子的至少約25%(例如，至少約27%,至少約30%，至少約35%，至少約40%，至少約45%，至少約50%，至少約55%，至少約60%，至少約65%,至少約70%，至少約75%,至少約80%,至少約85%，至少約90%或至少約95%或至少約99%)。在經遺傳工程化的細胞包括一種或多種影響N-聚糖磷酸化的N-糖基化活性的情況下，目標分子的改變的N-糖基化形式可以具有至少約25%(例如，至少約27%，至少約30%,至少約35%，至少約40%，至少約45%,至少約50%，至少約55%，至少約60。/0，至少約65%，至少約70%，至少約75%或至少約80%)的它的甘露糖基殘基是磷酸化的。在遺傳工程化的細胞的任何遺傳修飾在誘導信號(例如，化學或物理信號)存在下為誘導型或條件性的情況下，可以任選地將所述遺傳工程化的細胞在引入核酸之前、過程中或之後在誘導劑存在下培養。例如，在引入編碼目標蛋白的核酸之後，可以將所述細胞曝露於化學誘導劑，所述化學誘導劑能夠促進一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質的表達。在多種誘導信號誘導一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質條件性表達的情況下，可以使細胞與多種誘導信號接觸。在通過一種或多種N-糖基化活性加工之後，將改變的目標分子分離。改變的目標分子可以經由編碼序列(外源核酸所固有的或工程化至表達載體中的)提供的機制分泌至培養基中，所述編碼序列指導所述分子從細胞分泌。細胞裂解物或培養基中改變的目標分子的存在可以通過多種用於檢測分子存在的標準規程來驗證。例如，在改變的目標分子是蛋白質的情況下，這樣的規程可以包括，但不限於，使用對於所述改變的目標蛋白(或目標蛋白本身)特異性的抗體進行的免疫印跡或放射免疫沉澱，對於所述改變的目標蛋白(或目標蛋白本身)特異性的配體進行的結合，或測試改變的目標蛋白(或目標蛋白本身)的特異性酶活性。在一些實施方案中，可以將分離的改變的目標分子冷凍、凍幹或固定，並且儲存在合適條件下，例如，所述條件允許改變的目標分子保持生物學活性。可以對目標分子的改變的N-糖基化形式進一步進行體內加工(例如，在經遺傳工程化的細胞中)，或者可以在從經遺傳工程化的細胞或細胞培養基分離之後進行體外加工。進一步加工可以包括對改變的目標分子的一種或多種N-聚糖殘基的修飾或對改變的目標分子的N-聚糖殘基之外的修飾。改變的目標分子的額外的加工可以包括添力o(共價或非共價結合)異源模塊如聚合物或載體。進一步的加工也可以包括對改變的目標分子進行的酶或化學處理。酶處理可以包括使改變的目標分子與一種或多種糖苦酶(例如，甘露糖香酶或甘露聚糖酶)、磷酸二酯酶、磷脂酶、糖基轉移酶或蛋白酶接觸足以誘導對所述改變的目標分子的修飾的時間。酶處理也可以包括使所述改變的目標分子與能夠從Mari5GlcNAc2去除一種或多種葡萄糖殘基的酶接觸，所述酶例如，但不限於，甘露糖苷酶或葡糖苷酶II的a和/或(3亞基。化學處理可以例如包括使改變的目標分子與酸(例如氫氟酸)接觸足以誘導對所述改變的目標分子的修飾的時間。特定條件下的氫氟酸處理特異性地去除與聚^f唐以磷酸二酯鍵連接的甘露糖殘基，同時在聚糖上保留磷酸。改變的目標分子可以通過從一個或多個N-聚糖添加或去除磷酸基團來進一步加工。例如，可以使改變的目標分子與甘露糖基激酶或甘露糖基磷酸酶接觸。在一些實施方案中，任何文描述的改變的目標分子可以在分離之後與異源模塊附接，例如，使用酶或化學方法。"異源模塊"是指與改變的目標分子結合(例如，共價或非共價)的任何成分，所述成分不同於原始存在於所述改變的目標分子之上的成分。異源模塊包括，例如，聚合物、載體、佐劑、免疫毒素或可檢測(例如，螢光、發光或放射性)的模塊在一些實施方案中，可以向改變的目標分子添加額外的N-聚糖。應該理解的是，可以，但不需要在遺傳工程化的細胞中加工目標分子。例如，本公開還包括無細胞的產生具有改變的N-糖基化形式的目標分子的方法，所述方法包括使目標分子在N-糖基化條件下與製備自細胞(例如，真菌細胞(例如，解月旨西洋蓍黴、^n;w/aafifem'm'vorara或本文描述的任何其它相關的雙態性酵母細胞)、植物細胞或動物細胞(例如，線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人))的細胞裂解物接觸的步驟，所述細胞經遺傳工程化而具有至少一種經修飾的N-糖基化活性，其中使目標分子與所述細胞裂解物接觸產生目標分子的改變的N-糖基化形式。"N-糖基化條件"是指將混合物(例如，目標分子和細胞裂解物的混合物)在允許改變的N-糖基化的條件下溫育(如上所述)。用於獲得細胞裂解物(在所述裂解物中保留一種或多種N-糖基化活性的活性或完整性)的合適方法可以包括使用合適的緩沖液和/或抑制劑，包括核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制劑，其保護或最小化細胞裂解物中N-糖基化活性的改變。這些抑制劑包括，例如，螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇雙(P-氨基乙醚)N，N,N1，Nl-四乙酸(EGTA),蛋白酶抑制劑如苯曱基磺醯氟化物(PMSF)、抑肽酶、亮抑肽酶、抗痛素等，和磷酸酶抑制劑如磷酸鹽、氟化鈉、釩酸鹽等。抑制劑可以這樣選擇，即它們不幹擾或僅最小程度負面影響N-糖基化活性或感興趣的活性。用於獲得含有酶活性的裂解物的合適的緩衝齊寸禾口條4牛i己載在，例^口,Ausubel等CurrentProtocolsinMolecularBiology(Supplement47)，JohnWiley&Sons,NewYork(1999);Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress(1988》HarlowandLane,UsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(1999);TietzTextbookofClinicalChemistry,3rded.BurtisandAshwood，eds.W.B.Saunders，Philadelphia,(1999)中。可以將細胞裂解物進一步加工以使當地消除或最d、化幹擾物質的存在。如有需要，可以通過多種本領域技術人員熟知的方法將細胞裂解物分級，所述方法包括亞細胞分級和層析技術，如離子交換、疏水和反向、大小排阻、親牙口、發u7JC電荷i秀導層衝斤等(參見，例i口，Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,thirdedition,Springer-Verlag,NewYork(1993);Burton和Harding,J.Chromatogr.A814:71-81(1998))。在一些實施方案中，可以製備細胞裂解物，其中全部細胞器保持完整和/或有功能。例如，裂解物可以含有完整的糙面內質網、完整的光面內質網或完整的高爾基體中的一種或多種。用於製備含有完整的細胞器的裂解物和測試細胞器的功能性的合適方法記載在，例如，Moreau等(1991)J.Biol.Chem.266(7):4329-4333;Moreau等(1991)J.Biol.Chem.266(7):4322-4328;Rexach等(1991)J.CellBiol.U4(2):219-229;和Paulik等(1999)Arch.Biochem.Biophys.367(2):265_273中；將它們每一篇的公開內容通過所述整體併入本文。本公開還提供產生具有改變的N-糖基化形式的目標分子的方法，其包括使目標分子在N-糖基化條件下與一種或多種具有N-糖基化活性的分離的蛋白質接觸的步驟，其中使所述目標分子與一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質接觸產生目標分子的改變的N-糖基化形式，並且其中所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質製備自經遺傳工程化而具有至少一種經修飾的N-糖基化活性的細胞(例如真菌細胞(例如，解脂西洋蓍黴、^"xw/aatfew/m'wrara或本文描述的任何其它相關的雙態性酵母細胞)、植物細力包或49動物細胞(例如，線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物、或哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、倉鼠、沙鼠、犬、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人))。可以使用如上所述的標準技術將一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質純化。可以使目標分子與一種或多種蛋白質在合適的緩衝液中接觸足以誘導對目標分子的修飾的時間，如例如，Lee和Park(2002)30(6):716-720以及Fujita和Takegawa(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.282(3):678-682中所述，將所述公開內容通過所述完整併入本文。在一些實施方案中，可以使目標分子僅與一種具有N-糖基化活性的蛋白質接觸。在一些實施方案中，可以使目標分子與超過一種具有N-糖基化活性的蛋白質接觸。可以使目標分子與超過一種蛋白質同時或相繼接觸。在將目標分子與超過一種具有N-糖基化活性的蛋白質相繼接觸的情況下，可以，但不需要，將目標分子在一個或多個步驟之後純化。即，可以使目標分子與蛋白活性A接觸，然後在將所述分子與蛋白活性B接觸之前進行純化，等等。在無細胞方法的一些實施方案中，在使目標分子與一種或多種N-糖基化活性接觸之前將目標分子與固相支撐物連接可能是有利的。這樣的連接能夠使N-糖基化修飾之後的純化更簡單。合適的固相支撐物包括，但不限於，多孔測定平板、顆粒(例如，^磁性或編碼顆粒)、柱或膜。用於檢測目標分子的N-糖基化(例如，改變的N-糖基化)的方法包括DNA測序儀輔助型(DSA)、螢光團輔助型糖電泳(FACE)(如隨附實施例中所述)或表面增強型雷射解吸/電離飛行時間質譜(SELDI-TOFMS)。例如，分析可以利用DSA-FACE，其中，例如，將糖蛋白變性，其後固定在例如膜上。然後可以將糖蛋白用合適的還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)或p-巰基乙醇還原。蛋白質的巰氬基可以使用酸如碘乙酸來羧化。然後，可以使用酶如N-糖苷酶F將N-聚糖從蛋白質釋放。任選地，N-聚糖可以通過還原性氨基化重建和衍生化。然後可以將衍生化的N-聚糖濃縮。適合用於N-聚糖分析的儀器包括，例如，ABIPRISM377DNA測序儀(AppliedBiosystems)。數據分析可以使用例如GENESCAN3.1軟體(AppliedBiosystems)進4亍。任選地，可以將分離的甘露糖蛋白進一步用一種或多種酶處理以確認它們的N-聚糖狀態。示例性的酶包括，例如，a-甘露糖普酶或a-l，2甘露糖苷酶，如隨附實施例中所述。另外的N-聚糖分析方法包括，例如，質譜(例如，MALDI-TOF-MS)，正相、反相高壓液相層析(HPLC)和離子交換層析(例如，當未標記聚糖時使用脈沖電流計檢測，而如果對聚糖進行了合適的標記則使用UV吸光度或萸光)。還參見Callewaert等(2001)Glycobiology11(4):275-281和Freire等(2006)Bioconjug.Chem.17(2):559-564,將它們每一篇的公開內容通過所述整體併入本文。可由N-糖基化改變的分子處理的病症本文描述的分離的、N-糖基化改變的分子(例如，N-糖基化改變的蛋白質或多萜醇)可以用於治療多種疾病，所述疾病可以通過施用一種或多種N-糖基化改變的分子來治療(例如，N-糖基化改變的蛋白質)。能夠通過施用N-糖基化改變的分子(例如，改變的N-糖蛋白或改變的N-糖基化的多萜醇)治療或預防的一些特定醫學狀況的實例在下節中評述。(i)代謝紊亂代謝紊亂是影響個體人(或動物)細胞內能力產生的病症。大多數代^f紊亂是遺傳性的，儘管一些可以因飲食、毒素、感染等而"獲得"。遺傳性代謝紊亂也稱作代謝的先天性缺陷。概括而言，遺傳性代謝紊亂是由遺傳缺陷引起的，所述缺陷導致缺失或不正確地構建細胞代謝過程中的一些步驟所必須的酶。最大幾類的代謝紊亂是糖代謝的紊亂、胺基酸代謝的紊亂、有機酸代謝的紊亂(有機酸尿症(organicacidurias)),脂肪酸氧化和線粒體代謝的紊亂，卟啉代謝的紊亂，嘌呤或嘧啶代謝的紊亂，類固醇代謝的紊亂，線粒體功能的紊亂，過氧化物酶體功能的紊亂和溶酶體貯積病(LSD)。能夠通過使用一種或多種本文描述的N-糖基化改變的分子(或其藥物組合物)來治療的代謝紊亂的實例包括，例如，遺傳性血色病(hereditaryhemochromatosis)、目艮皮月夫白4匕病(oculocutaneousalbinism)、蛋白C(proteinCdeficiency)、I型遺傳性血管性水胂(typeIhereditaryangioedema)、先天性蔗糖酶-異麥芽糖酶在失乏(congenitalsucrase-isomaltasedeficiency)、克-糹內二氏II型(Crigler-Najjartype11)、Laron症候群(Laronsyndrome)、遺傳性髓過氧化物酶(hereditaryMyeloperoxidase)、原發性甲狀A泉才幾能減退(primaryhypothyroidism)、先天性長QT症候群(congenitallongQTsyndrome)、酪氨酸結合3求蛋白缺乏(tyroxinebindingglobulindeficiency)、家族性高膽固醇血症(familialhypercholesterolemia)、家族性乳糜微粒血症(familialchylomicronemia)、a卩-月旨蛋白血症(a(3-lipoproteinema)、葉氐原生質月旨蛋白A平(lowplasmalipoproteinAlevels)、伴有肝損傷的遺傳性氣月中(hereditaryemphysemawithliverinjury)、先天性曱狀^>才幾能減退(congenitalhypothyroidism)、成骨不全(osteogenesisimperfecta)、遺傳性血纖維蛋白原過少(hereditaryhypofibrinogenemia)、a-1#元月夷)疑乳蛋白酶擊失乏(a-1antichymotrypsindeficiency)、腎原性尿崩症(nephrogenicdiabetesinsipidus)、垂體^申糹至^卩尿崩症(neurohypophysealdiabetesinsipidus)、il^香脫氨酶缺乏(adenosinedeaminasedeficiency)、佩-邁二氏病(PelizaeusMerzbacherdisease)、IIA型馮維勒布蘭德病(vonWillebranddiseasetypeIIA)、結合性因子V和VIII缺乏(combinedfactorsVandVIIIdeficiency)、遲發性脊推骨媒發育不全(spondylo-epiphysealdysplasiatarda)、無月7:M各月莫(ch0r0ideremia)、I糹田月包病(Icelldisease),白頓氏病(Battendisease)、共濟失調性毛細血管擴張症(ataxiatelangiectasias)、常染色體顯性多嚢性腎病(ADPKD-autosomaldominantpolycystickidneydisease)、微絨毛包含病(microvillusinclusiondisease)、糹*核性石更化(tuberoussclerosis)、Lowe目艮腦腎綜合4正(oculocerebro-renalsyndromeofLowe)、月幾蓁糹宿'l"生柳J索石更4b(amyotrophiclateralsclerosis)、骨髓增生異常症候群(myelodysplasticsyndrome)、棵淋巴細胞症候群(Barelymphocytesyndrome)、丹吉爾病(Tangierdisease)、家力矣性肝內月旦汁鬱積(familialintrahepaticcholestasis),X連鎖的腦白質腎上腺萎縮症(X-linkedadreno-leukodystrophy)、Scott症候群(Scottsyndrome)、1型和2型海-普二氏症候群(Hermansky-Pudlaksyndrometypes1and2)、左爾威格氏症候群(Zellwegersyndrome)、月支才艮點^大庫欠骨發育異常(rhizomelicchondrodysplasiapuncta)、常染色體隱性原發性高草酸尿(autosomalrecessiveprimaryhyperoxaluria)、MohrTranebjaer症候群(MohrTranebjaergsyndrome)、脊骨逸延髓月幾萎縮(spinalandbullarmuscularatrophy)、原發性睫運動障礙(primaryciliarydiskenesia)(卡》荅才各內氏綜合4正(Kartagener，ssyndrome))、巨人症詳口月支端月巴大症(giantismandacromegaly)、享L溢(galactorrhea)、艾迪遜氏病(Addison'sdisease)、腎上腺性男性化(adrenalvirilism)、庫興氏症候群(Cushing，ssyndrome)、酮酸中毒(ketoacidosis)、原發性或繼發性醛固酮增多症(primaryorsecondaryaldosteronism)、米-迪症候群(MillerDiekersyndrome)、無腦回(lissencephaly)、運動3申經元病(motorneurondisease)、阿史爾氏綜合4正(Usher，ssyndrome)、威-阿二氏症候群(Wiskott-Aldrichsyndrome)、奧4風齊氏綜合4正(Optizsyndrome)、亨廷頓氏病(Huntington'sdisease)、遺傳性月夷腺炎(hereditarypancreatitis)、抗石舞脂綜合4正(anti-phospholipidsyndrome)、重疊結締組織病(overlapconnectivetissuedisease),斯耶格倫氏症候群(Sj6gren，ssyndrome)、僵體症候群(stiff-mansyndrome)、Brugada症候群(Brugadasyndrome)、芬蘭型先天性腎病症候群(congenitalnephriticsyndromeoftheFinnishtype)、；fi-約二氏症候群(Dubin-Johnsonsyndrome)、X連鎖4氐石奔酸鹽血症(X-linkedhypophosphosphatemia)、佩德裡得症候群(Pendredsyndrome)、嬰兒期持續性高血胰島素低血糖(persistenthyperinsulinemichypoglycemiaofinfancy)、遺傳性J求形紅細胞增多症(hereditaryspherocytosis)、無血漿酮藍蛋白血症(acemloplasminemia)、嬰JL^申糹至元蠟才羊月旨4曷質;^禾口、症(infantileneuronalceroidlipofuscinosis)、假性軟骨發育不全和多發性骨骺發育不良(不全)(pseudoachondroplasiaandmultipleepiphyseal)、Stargardt樣黃斑發育不良(Stargardt-likemaculardystrophy)、X連鎖夏-馬-圖三氏病(X-linkedCharcot-Marie-Toothdisease)、常染色體顯性視網膜色素變性(autosomaldominantretinitispigmentosa)、Wolcott-Rallison症候群(Wolcott-Rallisonsyndrome)、庫興氏病(Cushing，sdisease)、月支帶月幾營養不良(limb-girdlemusculardystrophy)、IV型粘多糖貝i積病(mucoploy-saccharidosistypeIV)、芬蘭遺傳性家力矣性澱並分才羊變性(hereditaryfamilialamyloidosisofFinish)、安德才l氏病(Andersondisease)、肉瘤(sarcoma)、十曼性髓單核細胞性白血病(chronicmyelomonocyticleukemia)、心肌病(cardiomyopathy)、面生殖發育異常(faciogenitaldysplasia)、Torsion病(Torsiondisease)、亨廷牽頁禾口脊骨逸小月滷姿糹宿(Huntingtonandspinocerebellarataxias)、hereditaryhyperhomosyteinemia、多神經病(polyneuropathy),下運動神經元病(lowermotorneurondisease)、色素性視網膜炎(pigmentedretinitis)、血清陰性多關節炎(seronegativepolyarthritis),間質月申纖維化(interstitialpulmonaryfibrosis)、雷諾氏現象(Raynaud'sphenomenon)、韋才各糹內氏肉芽月中病(Wegner，sgranulomatosis),蛋白尿(preoteinuria)、CDG-Ia、CDG-Ib、CDG-Ic、CDG-Id、CDG-Ie、CDG畫If、CDG-IIa、CDG陽IIb、CDG-IIc、CDG-IId、埃-當二氏症候群(Ehlers-Danlossyndrome)、多發性外生骨疣(multipleexostoses)、格裡斯塞利氏症候群53(Griscellisyndrome)(1型或2型)或X連鎖性非特異性腦力發育遲緩(X-linkednon-specificmentalretardation)。此夕卜，4戈i射紊亂還可包4舌溶酶體貯積病例^口，但不限於，法布裡氏病、法勃氏病(Farberdisease)、高歇爾氏病、GMi神經節糖苷沉積症(GM廣gangliosidosis)、泰-沙二氏病、桑德霍夫氏病(Sandhoffdisease)、GM2激活病(GM2activatordisease)、克臘伯氏病(Krabbedisease)、異染性腦白質營養不良(metachromaticleukodystrophy)、尼-皮二氏病(Niemann-Pickdisease)(A、B和C型)、赫勒氏病(Hurlerdisease)、沙4尹氏病(Scheiedisease)、Hunter病(Hunterdisease)、桑菲歹寸普氏病(Sanfilippodisease)、莫爾基奧氏病(Morquiodisease)、馬-垃病(Maroteaux-Lamydisease)、透明質酸酶缺乏(hyaluronidasedeficiency)、天門冬醯氨酸葡萄糖胺尿症(aspartylglucosaminuria)、巖藻糖香貝i積病(fbcosidosis)、甘露糖香過多症(mannosidosis)、"i射爾德氏病(Schindlerdisease)、1型p垂液酸擊夾乏病(sialidosistypel)、旁姆普氏病、緻密性成骨不全(Pycnodysostosis)、蠟樣脂褐質沉積症(ceroidlipofuscinosis)、膽固醇酯沉積病(cholesterolesterstoragedisease)、烏爾曼氏病(Wolmandisease)、多發性硫酸酯酶缺乏(Multiplesulfatasedeficiency)、乳液唾液異常增多(galactosialidosis)、粘月旨貯積病(mucolipidosis)(11、III和IV型)、月光氨酸病(cystinosis)、唾液酸貯積病(sialicacidstoragedisorder)、伴有馬-斯二氏症候群的乳糜微粒留滯病(chylomicronretentiondiseasewithMarinesco-Sj6grensyndrome)、海-普二氏症候群(I-Iermansky-Pudlaksyndrome)、切-希二氏症候群(Chediak-Higashisyndrome)、Danon病(Danondisease)或Geleophysic發育不良(Geleophysicdysplasia),代謝紊亂的症狀多種多樣，並且可以包括如下的一種或多種，例如，貧血、疲勞、容易挫傷(bruisingeasily)、血小板低、肝增大、脾增大、骨骼脆弱(skeletalweakening)、肺損傷、感染(例如，胸部感染或肺炎)、腎損傷、進行性腦損傷、發作、胎糞過厚、咳嗽、哮鳴、唾液或粘液過量產生、氣短(shortnessofbreath)、腹痛、腸或消化道閉塞(occludedbowelorgut)、生育力問題、鼻內息肉、杵狀指/趾曱和皮膚(clubbingofthefinger/toenailsandskin)、手或扭卩疼痛(paininthehandsorfeet)、血管角質瘤(angiokeratoma)、4非汗減少、角月莫和晶狀體混法(cornealandlenticularopacities)、白內障(cataracts)、二尖瓣垂牙口/或回；危(mitralvalveprolapseand/orregurgitation)、心、髒月巴大(cardiomegaly)、溫度不耐受、行走困難、吞咽困難、進行性視力喪失、進行性聽力喪失、張力減退、巨舌、反射消失、下腰痛、睡眠呼吸暫停、端坐呼吸、嗜睡、脊柱前凸或脊柱側凸。應理解的是，由於^:陷或缺乏蛋白質和所導致疾病表型(例如，代謝紊亂的症狀顯現)的不同性質，給定病症將通常^f又出現對於特定病症為特徵性的症狀。例如，患有法博氏病的患者可以出現上述症狀中的特定亞組，例如，但不限於，溫度不耐受、角膜眩暈(comealwhirling)、疼痛、皮滲、噁心或腹瀉。患有高歇爾氏症候群(Gauchersyndrome)的患者可以出現脾大、肝硬變、驚厥、張力過高、呼吸暫停、骨質疏;^或皮膚變色。除了施用本文描述的一種或多種N-糖基化改變的分子，代謝紊亂也可以通過適當的營養和維生素(例如，輔因子療法)、物理療法和疼痛藥物療法來治療。依賴於給定代謝紊亂的特定性質，患者可以在任何年齡出現這些症狀。在許多情況下，症狀可以在兒童期或成人期早期出現。例如，法博氏病的症狀可以在年輕時(earlyage)出現，在10或11周歲的年齡。如用於本文，"有風險發展出代謝紊亂"(例如本文所述的代謝紊亂)的受試者是具有發展出紊亂的傾向(predisposition)的受試者，即，由於酶中的突變而產生的發展出代謝紊亂的遺傳傾向，所述酶例如a-L-艾杜糖苷酸酶、(3-D-半乳糖苷酶、|3-葡糖苷酶、J3-己糖胺酶、P-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙醯半乳糖胺酶、天冬氨醯葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖苷-N-乙醯轉移酶、P-D-葡糖醛酸酶、透明質酸酶、a-L-甘露糖苷酶、a-神經氨酸酶、磷酸轉移酶、酸性脂肪酶、酸性神經醯胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K或脂蛋白脂肪酶。顯然，"有風險發展出代謝紊亂"的受試者不是感興趣的物種中的全部受試者。"疑似患有病症"的受試者是具有病症(例如，代謝紊亂或任何其它本文所述的病症)的一種或多種症狀(例如，任何本文所述的那些症狀)的受試者。(ii)癌症癌症是一類這樣的疾病或病症，其特徵在於細胞不受控制的分裂和這些細胞擴散的能力，所述擴散或者通過侵入直接生長進入相鄰組織或者通過轉移植入遠距離位點(其中癌細胞經過血流或淋巴系統轉運)。癌症可以侵襲各個年齡的人，但是風險有隨年齡增加的趨勢。癌症的類型可以包括，例如，肺癌、乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、腎癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌(hematologicalcancer)、神經組織癌(neuraltissuecancer)、黑素瘤、曱狀腺癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌、宮頸癌、陰道癌或膀胱癌。如用於本文，"有風險發展出癌症，，的受試者是具有發展出癌症的傾向的受試者，即，發展出癌症的遺傳傾向，例如，腫瘤抑制基因中的突變(例如，BRCA1、p53、RB或APC中的突變)或已經曝露於能夠導致癌症的條件。因此，當受試者已經曝露於誘變或致癌水平的特定化合物(例如，香菸煙霧中的致癌化合物例如丙烯醛、砷、苯、苯並蒽(Benz{a}anthracene)、苯並芘(Benzo{a}pyrene)、釙-210(氡)、氨基甲酸酉旨(Urethane)或氯乙烯)時，所述受試者也可以是"有風險發展出癌症，，的受試者。此外，當受試者已經曝露於例如大劑量的紫外線或X線輻射或曝露於(例如感染)引起腫瘤/與腫瘤相關的病毒如乳頭狀瘤病毒、EB病毒(Epstein-Barrvims)、B型肝炎病毒或人T-細胞白血病-淋巴瘤病毒時，所述受試者可以是"有風險發展出癌症，，的受試者。從上文可以清楚的是"有風險發展出癌症，，的受試者不是感興趣的物種中的全部受試者。"疑似患有癌症"的受試者是具有癌症的一種或多種症狀的受試者。癌症的症狀是本領域技術人員熟知的並且包括，但不限於，乳腺肺塊、乳頭變化、乳腺嚢中、乳腺疼痛、體重減輕、虛弱、過度疲勞、進食困難、食慾喪失、久咳、惡化的呼吸急促(worseningbreathlessness)、咳血、血尿、血{更、噁心、嘔吐、肝轉移、肺轉移、骨轉移、腹脹、氣脹、腹膜腔積液(fluidinperitonealcavity)、陰道出血、便秘、腹脹、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、發熱、疼痛)、疼痛、吐血、大量出汗(heavysweating)、發熱、高血壓、貧血、腹瀉、黃疸、眩暈、寒戰、肌肉痙攣、結腸轉移、肺轉移、膀胱轉移、肝轉移、骨轉移、腎轉移和胰腺轉移、吞咽困難等。除了施用一種或多種本文所述的N-糖基化改變的分子，也可以通過化療劑、電離輻射、免疫治療劑或超高溫治療劑來治療癌症。化療劑包括，例,"頃4白(cisplatin)、卡4白(carboplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、環石壽醯胺(cyclophosphamide)、喜樹威(camptothecin)、阿黴素(adriamycin)、異環磷醯胺(ifosfamide)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安、亞硝基脲、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博來黴素(bleomycin)、普卡黴素、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊普(etoposide)、verampil、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、4也莫昔芬(tamoxifen)、^"斥》醇(taxo1)、(transplatinum)、5-氟尿嘧咬(5-flurouracil)、長春新石威(vincristin)、長春石成(vinblastin)和甲氨蟲萊。令(methotrexate)。(iii)炎性病症如用於本文，"炎性病症"是指其中一種或多種物質(例如，非天然存在於受試者中的物質)，藉由白細胞(例如，B細胞、T細胞、巨噬細胞、單核細胞或樹突細胞)的作用，不適當地引發病理學應答(例如，病理學免疫應答)的過程。因此，所述炎性應答中涉及的這些細胞稱作"炎性細胞"。不適當菌)存在於受試者中或受試者上的應答。不適當地引發的應答可以是其中自身成分(例如，自體抗原)被炎性細胞靶向的應答(例如，自身免疫病如多發性例如，過敏反應。因此，不適當地引發的應答的原因可以是存在微生物感染(例如，病毒、細菌或真菌的)。炎性病症的類型(例如，自身免疫病)可以包括，但不限於，骨關節炎、類風溼性關節炎(rheumatoidarthritis(RA))、脊推關節病(spondyloarthropathies)、POEMS症候群(POEMSsyndrome)、克朗氏病(Crohn'sdisease)、多中心性卡斯爾氏病(multicentricCastleman，sdisease)、系統性紅斑狼齊(systemiclupuserythematosus(SLE))、多發性硬化(MS)、肌營養不良(musculardystrophy(MD))、胰島素依賴性糖尿病(insulin-dependentdiabetesmellitus(IDDM))、皮月幾炎(dermatomyositis)、多月幾炎(polymyositis)、炎性4申經病(inflammatoryneuropathies)例3口歸伯二氏綜合^正(GuillainBarresyndrome)、脈管炎(vasculitis)例如韋格納肉芽月中病(Wegener'sgranulomatosus)、結節性多動脈炎(polyarteritisnodosa)、風溼性多月幾痛(polymyalgiarheumatica)、顳動脈炎(temporalarteritis)、舍格倫症候群(Sjogren'ssyndrome)、貝賽特氏病(Bechet，sdisease)、丘-施二氏綜合j正(Churg-Strausssyndrome)或高安氏動脈炎(Takayasu，sarteritis),炎性病症還包括特定類型的變態反應例如鼻炎(rhinitis)、鼻竇炎(sinusitis)、蕁麻疹抗原、病毒、細菌、真硬化)。(urticaria)、尋麻滲(hives)、血管性7jc月中(angioedema)、特應性皮炎(atopicdermatitis)、食物變態反應(foodallergies)(例如，(堅果變態反應(nutallergy))、藥物變態反應(drugallergies)(例如，青黴素)、昆蟲變態反應(insectallergies)(例如，針對蜂螫的變態反應)或肥大細胞病(mastocytosis)。炎性病症也可包括潰瘍性結腸炎(ulcerativecolitis)和哮喘(asthma)。"有風險患上炎性病症"的受試者是指具有一種或多種炎性病症的家族史(例如，一種或多種炎性病症的遺傳傾向)的患者或曝露於一種或多種炎症誘導條件的受試者。例如，受試者可能已經曝露於病毒或細菌超抗原，例如，但不限於，葡萄球菌腸毒素(staphylococcalenterotoxins)(SEs)、酉良膿鏈球菌夕卜毒素(streptococcuspyogenesexotoxin)(SPE)、金黃色葡萄球菌中毒性休克-症候群毒素(staphylococcusaureustoxicshock-syndrometoxin)(TSST-1)、鏈球菌促有絲分裂外毒素(streptococcalmitogenicexotoxin)(SME)和鏈球菌超抗原(streptococcalsuperantigen)(SSA)。從上文可以清楚的是"有風險發展出炎性病症"的受試者不是感興趣的物種中的全部受試者。"疑似患有炎性病症"的受試者是出現炎性病症的一種或多種症狀的受試者。炎性病症的症狀是本領域熟知的並且包括，但不限於，發紅、腫脹(例如，關節肺脹)、觸石並發熱的關節(jointsthatarewarmtothetouch)、關節痛、僵硬、關節功能喪失、發熱、寒戰、疲勞、精力喪失(lossofenergy)、頭痛、食慾喪失、肌肉僵硬、失眠、瘙癢、鼻塞、噴嚏、咳嗽、一種或多種神經學症狀如眩暈、發作或疼痛。除了施用一種或多種本文所述的N-糖基化改變的分子之外，炎性病症也可以通過非類固醇抗炎藥(NSAID)、緩解病情的抗風溼藥(DMARD)、生物反應調節劑或皮質類固醇來治療。生物反應調節劑包括，例如，抗TNF劑(例如，可溶性TNF受體或對TNF特異性的抗體如adulimumab、英夫利昔單抗(infliximab)或依刃卩西普(etanercept)使用N-糖基化改變的分子(或其藥物組合物)、適用於治療(例如，預防藥物組合物和治療方法N-糖基化改變的分子(例如，目標分子如目標蛋白的改變的N-糖基化形式)可以併入藥物組合物，所述藥物組合物含有治療有效量的所述分子和一58種或多種佐劑、賦形劑、載體和/或稀釋劑。可接受的稀釋劑、載體和賦形劑通常不負面影響受體的體內穩態(例如電解質平衡)。可接受的載體包括生物相容性、惰性或生物可吸收的鹽、緩衝劑、寡糖或多糖、聚合物、粘度改善齊'J(viscosity-improvingagent)、防腐劑等。一種示例性載體是生理鹽水(0.15MNaCl,pH7.0-7.4)。另一種示例性載體是50mM磷酸鈉、100mM氯化鈉。關於配製和施用藥物組合物的技術的進一步細節可以在例如Remington'sPharmaceuticalSciences(MaackPublishingCo.,Easton,Pa.)中找到。也可以將輔助性活性化合物(supplementaryactivecompound)併入組合物中。含有N-糖基化改變的分子的藥物組合物的施用可以是系統的或局部的。可以將藥物組合物這樣配製，即令它們適用於胃腸外和/或非胃腸外施用。具體使用方式(administrationmodality)包括皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內、經皮、鞘內、口服、直腸、口腔、局部、鼻、眼、關節內、動脈內、蛛網膜下、支氣管、淋巴、陰道和子宮內施用。施用可以通過定期注射所述藥物組合物的推注(bolus)，或者可以是不間斷或連續地通過從外部儲器(reservoir)(例如，IV包)或內部儲器(例如，生物可腐蝕性植入物(bioerodableimplant)、生物人工器官(bioartificialorgan)或植入的產生N-糖基化改變的分子的細胞集落)進行靜脈內或腹膜內施用。參見，例如，美國專利Nos.4，407，957、5,798,113和5,800,828,將它們通過所述整體併入本文。藥物組合物的施用可以使用合適的遞送手,爻(deliverymeans)來實現，所述遞送手,殳例如泵(參見，例如，AnnalsofPharmacotherapy,27:912(1993);Cancer,41:1270(1993);CancerResearch,44:1698(1984)，通過所述整體併入本文)；微嚢化(參見，例如，美國專利Nos.4,352,883;4,353,888;和5,084,350,通過所述整體併入本文)；連續釋放聚合物植入物(continuousreleasepolymerimplant)(參見，例如，Sabel，美國專利No.4,883,666,通過所述整體併入本文)；大囊化(macroencapsulation)(參見，例如，美國專利Nos.5,284,761、5,158,881、4,976,859和4,968,733，和/>開的PCT專利申請W092/19195、WO95/05452,將它們每一篇的公開內容通過所述整體併入本文)；皮下、靜脈內、動脈內、肌肉內注射或注射至其它合適部位；或在膠嚢、液體、片劑、丸劑(pill)或延長釋放製劑(prolongedreleaseformulation)中口月l施用。胃腸外遞送系統的實例包括乙埽-乙酸乙烯共聚物顆粒、滲透泵(osmoticpump)、可才直入輸注系統(implantableinfbsionsystem)、泵遞送(pumpdelivery)、嚢j匕糹田月包遞送(encapsulatedcelldelivery)、月旨質體遞送(liposomaldelivery)、4十遞送注射(needle-deliveredinjection)、無針注射(needle-lessinjection)、噴霧器(nebulizer)、霧化器(aerosolizer)、電穿孑L和經皮貝佔片(transdermalpatch)。適合於胃腸外施用的製劑通常含有N-糖基化改變的分子的無菌含水製備物，其優選與受體的血液等滲(例如，生理鹽水溶液)。製劑可以以單位劑量或多劑量形式存在。適合於口服施用的製劑可以作為離散單位如膠嚢、扁嚢劑(cachet)、片劑或錠劑(lozenges)存在，其各自含有預定量的N-糖基化改變的分子；或含水液體中或非水液體中的懸液，如糖漿、酏劑、乳劑或飲劑(draught)。可以將適合於局部施用的N糖基化改變的分子(例如，目標分子例如目標蛋白的改變的N-糖基化形式)向哺乳動物(例如，人患者)作為例如乳膏(cream)、噴霧、泡沫、凝膠、軟膏(ointment)、油膏(salve)或乾燥摩擦劑(drymb)施用。乾燥摩擦劑可以在施用部位再水合。N-糖基化改變的分子也可以直接注入(例如，浸入並乾燥)其後可以進行局部應用的繃帶、紗布或貼片。也可以將N-糖基化改變的分子以半液態、凝膠(gelled)態或完全液態保持在用於局部施用的繃帶、紗布或貼片中(參見，例如，美國專利No.4,307,717，將其內容通過所述整體併入本文)。可以向需要的受試者以本領域技術人員可以確定的給藥方案施用治療有效量的藥物組合物。例如，可以向受試者施用組合物，例如，以每劑0.01|ig/kg-10，000嗎/kg受試者體重的劑量系統性施用。在另一實例中，劑量是每劑1嗎/kg-100pg/kg受試者體重。在另一實例中，劑量是每劑1pg/kg-30叫/kg受試者體重，例如，每劑3pg/kg-10嗎/kg受試者體重。為了優化治療效力，可以首先以不同的給藥方案施用N-糖基化改變的分子。單位劑量和方案依賴於多種因素，包括，例如，哺乳動物的種類、其免疫狀態、哺乳動物的體重。通常，組織中N-糖基化改變的分子的水平可以使用適合的、作為臨床測試流程一部分的篩查測定法監測，例如，來測定給定治療方案的效力。N-糖基化改變的分子的給藥頻率在醫療工作者(medicalpractitioner)(例如，醫生或護士)的技術和臨床判斷範圍之內。通常，施用方案通過臨床試驗建立，所述試驗可以建立最適施用參數。然而，從業者可以根據受試者的60年齡、健康、重量、性別和醫療狀態改變這些治療方案。給藥頻率可以依賴於治療是預防性還是治療性的而變化。這些N-糖基化改變的分子(例如，目標分子例如目標蛋白的改變的N-糖基化形式)或其藥物組合物的毒性和治療效力可以通過已知的藥學方法在例如細胞培養物或實—瞼動物中測定。這些方法可以用於例如測定LD50(對群體的50。/。致死的劑量)和ED50(在群體的50%中治療有效的劑量)。毒性和治療效果的劑量比是治療指數並且可以表示為LD50/ED50的比例。展現高治療指數的藥物組合物是優選的。儘管可以使用展現毒性副作用的藥物組合物，應該注意設計使這些化合物靶向患病組織的部位以儘量減小對正常細胞的損害(例如，非靶細胞)，並且由此降低副作用。從細胞培養測定法和動物研究獲得的數據可以用於配製用於適當受試者(例如，人患者)中的劑量範圍。這些藥物組合物的劑量通常在如下循環濃度的範圍內，所述濃度包括ED50且幾乎無毒或無毒。劑量可以在這個範圍內依賴於採用的劑量形式和使用的施用途徑而變化。對於如本文所述使用的藥物組合物(例如，用於治療受試者中的代謝紊亂)，最初可以從細胞培養測定法估計治療有效劑量。可以在動物模型中配製劑量以實現包括在細胞培養物中測定的IC50(即，實現對症狀的最大抑制的一半的藥物組合物濃度)的循環血漿濃度範圍。這種信息可以用於更精確地測定在人中有用的劑量。血漿中的水平可以例如通過高效液相層析測量。如本文所定義的，"治療有效量，，的N-糖基化改變的分子是能夠在受治療的受試者中產生期望的醫學結果的分子的量(例如，改善代謝紊亂的一種或多種症狀或減少癌細胞增殖)。N-糖基化改變的分子的治療有效量(即，有效劑量)包括毫克或」微克量的所述化合物每千克受試者或樣品重量(例如，約1微克每千克至約500毫克每千克，約IOO微克每千克至約5毫克每千克，或約1微克每千克至約50微克每千克)。受試者可以是任何哺乳動物，例如，人(例如，人患者)或非人靈長類(例如，黑猩猩(chimpanzee)、狒狒(baboon)或猴(monkey))、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、倉鼠、馬、牲畜類型(例如，牛、豬、綿羊或山羊)、犬、貓或鯨。可以將本文描述的N-糖基化改變的分子或其藥物組合物與另一治療作為聯合療法向受試者施用，所述另一治療例如用於代謝紊亂(例如，溶酶體貯積病)的治療。例如，聯合療法可以包括向受試者(例如，人患者)施用一種或多種額外的為受試者提供治療益處的劑(agent)，所述受試者患有或有風險發展出(或疑似患有)代謝紊亂(例如，溶酶體貝i積病)。由此，化合物或藥物組合物和所述一種或多種額外的劑同時施用。或者，可以首先及時(intime)施用N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質或多碎醇)，並其次及時施用所述一種或兩種額外的劑。可以首先及時施用所述一種或兩種額外的劑，並其次及時施用N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質或多闢醇)。N-糖基化改變的分子可以替代或加強先前施用或當前施用的療法。例如，當用本發明的N-糖基化改變的分子治療時，一種或多種額外的劑的施用可以停止或減少，例如，以較低水平施用。也可以保持先前療法的施用。在一些情況下，可以將先前療法保持到N-糖基化改變的分子的水平(例如，劑量或進度(schedule))達到足以提供治療效果的水平。可以聯合施用兩種療法。應該理解的是在先前治療有特定毒性的情況(例如，具有顯著副作用譜的用於代謝紊亂的治療)下，N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質或多萜醇)的施用可以用於將先前治療的量抵消和/或減少到足以給出相同或改進的治療益處、但是沒有毒性的水平。在一些情況下，當向受試者施用本發明的N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質、多薛醇或與多碎醇連接的脂質)或藥物組合物時，將第一種療法中斷。可以監測受試者的第一種預先選擇的結果，例如，代謝紊亂的一種或多種症狀的改善，例如任何本文所述的那些(見上文)。在一些情況下，在觀察到第一種預先選擇的結果的情況下，減少或中斷使用N-糖基化改變的分子(例如，N-糖基化改變的蛋白質或N-糖基化改變的多碎醇)的治療。然後在使用N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質或多碎醇)的治療之後，可以監測受試者第二種預先選擇的結果，例如，代謝紊亂的症狀的惡化。當觀察到所述第二種預先選定的結果時，可以恢復或增加向受試者施用N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質或多萜醇)，或恢復所述第一種治療的施用，或對受試者施用N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質、多萜醇或與多萜醇連接的脂質)和第一種治療二者或量增加的N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質或多碎醇)和所述第一種治療方案。N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質或多萜醇)也可以與用於疾病(例如，代謝紊亂)的一種或多種症狀的治療一起施用。例如，N-糖基化改變的分子(例如，蛋白質、多萜醇或與多萜醇連接的脂質)可以與例如疼痛用藥(painmedication)共同施用(例如，同時或通過上述聯合方案)。應該理解的是在一些實施方案中，N-糖基化改變的分子是其中改變的糖基化使所述分子產生醫學相關產物的能力增加的分子。例如，N-糖基化改變的分子可以是能夠產生治療性產物(例如，小分子或治療性肽)的酶，所述酶的活性通過糖基化增加或優化。這些產物和使用所述產物的方法在本公開的範圍之內。本文所述的任何藥物組合物可以與施用說明書一起包括在容器、包裝或散發器(dispenser)中。以下是本發明的實踐的實施例。不應將它們理解為以任何方式對本發明範圍的限制。實施例實施例1.質粒、引物和菌抹表l含有在本文所述實驗中所用載體(例如，表達載體)和缺失盒的構建中使用的全部質粒的列表。在所述實驗中使用了解脂西洋蓍黴的MTLY60菌林。表2含有在以下實施例中使用的引物(引物的名稱)和引物應用的列表。表l_tableseeoriginaldocumentpage63tableseeoriginaldocumentpage64tableseeoriginaldocumentpage65tableseeoriginaldocumentpage66性克隆中缺失2328bp片段(包括C/W"而存在1075bp的1075bp(不含C/^43)片段。對2個陽性克隆進行了Southern印跡分析以檢查是否發生了異常DNA整合。將基因組DNA(gDNA)用EcoRV/HindlII雙重消化，進行瓊脂糖凝膠電泳，再轉移至硝酸纖維素膜。將所述膜用來自質粒H(9C7W戶rT(9戶0的500bpSpel/I-Scel片段探查(probe)。AocWPUT中存在1456bp的片段，而AocWPT中存在2066bp的片段且野生型菌抹中存在2893bp的片段。制定使MAW9失活的構建策略並示於圖6。通過Notl/PacI雙重消化將破壞片段從質粒F/MAW9屍LTrO戶0切下並轉化至MTLY60和AocWPT克隆9。對於兩種菌抹獲得了數個WM3陽性克隆，在分離了單克隆之後通過對gDNA進行PCR來篩選它們中構建體的正確整合。使用引物y/MVA^戶>和17MVW9rrv.(表2)在破壞體(disruptant)菌林中擴增了2349bp的片段，而在非轉化體中擴增了2056bp的片段。為了分析通過突變菌抹合成的N-聚糖結構，對從甘露糖蛋白衍生的聚糖進行了DSA-FACE(圖7)。野生型(MTLY60)菌林作為主要核心類型聚糖結構主要具有Man8GlcNAc2(結構式I;圖4)和大量的Man9GlcNAc2(結構式II;圖4),後者最可能含有因Ochlp活性產生的額外的甘露糖。另外，可以觀察到一些較大的結構。AocW菌林主要具有Man8GlcNAc2(結構式I)和小部分的Man9GlcNAc2(結構式II;圖4),其二者均對a-l;甘露糖苷酶處理敏感(表明AocWa-l,2-man),導致剪切(trimming)成Man5GlcNAc2(結構式IV;圖4)。Am""9菌株積累比AocW菌抹更多的Man9GlcNAc2(結構式II;圖4)，這表明Mnn9p涉及接著Ochlp活性發生的聚糖結構的延伸。雙突變AocWAw""9展現了一種類似AocW菌抹的糖基化表型。實施例的誘變(ERa-l,2-甘露糖苷酶)涉及將Man9GlcNAc2剪切Man8GlcNAc2並且具有嚴格的底物特異性，因為它僅能剪切與中央臂的a-l，3-甘露糖連接的a-l，2-甘露糖(圖2)。為了測定能夠在何處誘變層57基因從而使其底物特異性轉換成高爾基型a-l,2-甘露糖苷酶，將幾種ER型甘露糖苷酶的初級序列與高爾基型甘露糖苷酶進行了比較。鑑定了一個在所述兩類之間不同的區域。此外，還分析了在高爾基型甘露糖普酶的催化位點中結晶的寡糖進入酵母MV57(anoligosaccharidethatwascrystallisedinthecatalyticsiteoftheGolgitypemannosidaseintotheyeastMV57)以鑑定可能的4唐和蛋白質之間的相互作用。令人驚訝的是，使用兩種方法鑑定了相同的位點。將來自釀酒酵母(GenBank⑧登錄號Z49631,sgd:YJR131W)的MNS1基因突變從而改變其底物特異性。在相同區域內製造了三種突變版本兩種具有一個突變(R2"L和R2"G)，和一種具有3個突變(R269S/S272G/R273L):A)R273L(精氨酸273成為亮氨酸)B)R2"G(精氨酸273成為甘氨酸)C)R269S/S272G/R273L(精氨酸269成為絲氨酸/絲氨酸272成為甘氨酸/精氨酸273成為亮氨酸)。全部突變使用QuickChange(Stratagene)誘變試劑盒製造。使構建體在強組成型TPI1啟動子調控下表達3種不同的突變基因。使用寡核苷酸CGACTATCCGGTTCGGATCATTGGGTGATTCTTTTTATGAG(SEQIDNO:40)和CTCATAAAAAGAATCACCCAATGATCCGAACCGGATAGTCG(SEQIDNO:41)來生成突變R273L，並使用寡核苦酸CGACTATCCGGTTCGGATCAGGTGGTGATTCTTTTTATGAG(SEQIDNO:42)和CTCATAAAAAGAATCACCACCTGATCCGAACCGGATAGTCG(SEQIDNO:43)使用野生型基因作為模板來生成突變R273G。使用寡核苦酸GGTGCTTCGACTATCAGTTTCGGAGGATTGGGTGATTCTTTTTATG(SEQIDNO:44)和CATAAAAAGAATCACCCAATCCTCCGAAACTGATAGTCGAAGCACC(SEQIDNO:45)施用突變R273L作為模板DNA來獲得突變R269S/S272G/R273L。通過使用寡核苦酸CCCGATATCGGATCCATGAAGAACTCTGTCGGTATTTC(SEQIDNO:46)和GGGAAGCTTAACGCGGTTCCAGCGGGTCCGGATACGGCACCGGCGCACCCAACGACCAACCTGTGGTCAG(SEQIDNO:47)的PCR反應，在突變體和野生型MNS1開^L閱讀框的3'端添加E-標記物的編碼序列從而允許在表達之後的蛋白檢測。對構建策略的概括示於圖8。將三種構建體以及未突變的基因(作為陰性對照)轉化至釀酒酵母菌株XW27(MATaleu2腦3trplhis3ade2lys2ochl::LEU2mnnl::URA3mnn6::ADE2)，使用TRP1作為選褲，標記，在用Xbal消化質粒之後將構建體引導至釀酒酵母基因組中的TRP1基因座。在後菌抹能夠合成統一的Man8GlcNAc2(在其糖蛋白上)。如果經突變的酶是活性的，那麼這種Man8GlcNAc2(結構式I;圖4)應該被剪切成Man5GlcNAc2(結構式IV;圖4)、Man6GlcNAc2(結構式V;圖4)和/或Man7GlcNAc2(結構式VI;圖4)。分離了色氨酸原養型菌株，培養在液體SDC-trp培養基中，並製備了甘露糖蛋白。通過DSA-FACE分析源自甘露糖蛋白的N-聚糖。能夠從圖9看出，來自含有R273G和R269S/S272G/R273L突變的菌抹的小量Man8GlcNAc2(結構式I;圖4)被轉化成MansGlcNAc2(結構式IV;圖4)、Man6GlcNAc2(結構式V;圖4)和Mari7GlcNAc2(結構式VI;圖4)。其它突變體或野生型基因的表達引起改變的N-糖基化表型。為了評估全部突變體是否同樣表達良好，使用對E-標記物(添加至MNSl蛋白的13個胺基酸的表位)特異性的抗體進行了Western印跡分析。全部突變蛋白以及野生型MNSl蛋白等均同樣表達良好。實施例4.增加磷酸化解脂西洋蓍黴MNN4的表達為了增加Man8GlcNAc2的磷酸化，將解脂西洋蓍黴MWW(巴斯德畢赤酵母/WO的同源物)在解脂西洋蓍黴中過表達以促進N-聚糖的核心型磷酸化。使用引物GGCGGATCCATGGTGCTGCACCCGTTTCSaw///>;SEQIDNO:34)和GGCCCTAGGCTACTCAAACTCCTCGCGAATC^vr//rv;SEQIDNO:35)擴增了解脂西洋蓍黴MNN4(XM—503217,YALI0D24101g)基因的編碼序列。將此開放閱讀框(ORF)使用BamHI和Avrll位點克隆至質粒中，其將所述ORF置於質粒pYlHURA3的hp4d啟動子調控下，所述質粒pYlHURA3含有作為選擇標記的t//L43dl基因和用於改善隨機整合的zeta序列(圖10)。在轉化入MTLY60AocW菌抹之前，用Eco47IH(用於整合入基因座)、Pvul(用於整合入MAW4基因座)或Rsrll/BstBI(用於隨機整合)消化含有MNN4表達盒的質粒。通過PCR使用hp4d啟動子中的引物和一個丄/屍2終止子中的引物分析了靶向和MWW基因座的轉化體。通過Southern印跡分析評估了隨機整合了構建體的轉化體。為了評估甘露糖磷酸化是否增加，我們在YPD培養基中的48小時培養之後通過DSA-FACE毛細管電泳分析了自分泌的糖蛋白衍生的N-聚糖(圖11)。MansGlcNAc2(結構式I)的量劇烈降低有利於(infavourof)兩種結構，所述兩種結構遷移更快(與MansGlcNAc2(結構式I;圖4)相比)並且4艮有可能分別含有單(P)(結構式X或XI;圖4)和雙(PP)(結構式XII;圖4)(圖11)。因此，可以總結隨機整合的表達盒按順序比整合入基因座或MV7W基因座的表達盒表現更好。MZ2展現了最高的磷酸化水平。假設兩個峰均衍生自Man8GlcNAc2(結構式I;圖4)峰，測定了轉化成磷酸化聚糖的Man8GlcNAc2的量(表3)。表3tableseeoriginaldocumentpage70表3圖例高度和面積是指從電泳圖譜測定的峰的高度和峰的面積。"％信號，，是指每種聚糖在N-聚糖混合物中的比例。由星號表示的數顯示磷酸化說明書第61/80頁的Man8Gn2的比例(頂部)和非磷酸化的Man8Gn2的比例(底部)。這些結果表明在過表達基因的菌抹中多於80%的存在於親本△ocW中的Man8GlcNAc2(結構式I;圖4)是磷酸化的。實施例5.通過在內質網中與脂質連接的寡糖修飾修飾糖基化材料和方法霧錄、培#奈伴和試^/。將大腸桿菌菌株MCI061或TOP10或DH5a用於重組質粒DNA的擴增並且在37°C在補充有100pg/ml羧苄青黴素或50jag/ml卡那黴素(根據使用的質粒)的Luria-Broth(LB)培養基中在熱振蕩器(thermalshaker)中培養使用解脂西洋蓍黴MTLY60("ra3/ew2)菌林作為親本菌抹。將全部酵母培養在28。C保溫箱中。將它們在YPD培養基(2。/。葡萄糖，2%細菌蛋白腖和1。/o酵母提取物)或合成葡萄糖完全(SDC)培養基(0.17。/。w/o胺基酸且不含硫酸銨的YNB，1%葡萄糖，0.5%NH4C1，50mMK/Na磷酸鹽緩沖液pH6.8和0.0770/。完全補充混合物(QbiogeneInc，MorganIrvine,CA))上。為了選衝奪Ura+和Leu+轉化體，分別加入0.077%CSM—ura或CSM—leu。標雀遽傳拔術。解脂西洋蓍黴的轉化用感受態細胞如Boisrame等(1996)J.Biol.Chem.271(20):11668-75所述製備，將其公開內容通過所述整體併入本文。使用7>開的規程(Epicenter試劑盒目錄號MPY80200;EpicenterBiotechnologies,Madison,WI)分離全部酵母菌抹的基因組DNA。所述規程涉及在65。C的非酶促細胞溶解，其後通過沉澱去除蛋白質，並進行核酸沉澱和重懸。PCR擴增在50pl終體積中進行，其中含有5pl10x緩衝液(200mMTris-HClpH8.4和500mMKCl),可變量的MgCl2，2.5pMdNTP,50ng模板，50pmol的正確引物和2.5單位的Taq或PfiiDNA聚合酶。使用的循環條件如下94。C變性10分鐘，其後是熱啟動和30個循環的94°C45秒、在合適的退火溫度進行45秒和在72°C每kb延伸1分鐘，其後是在72°C延伸10分鐘。使用NucleoSpinextractII(Macherey-Nagel)純化乂人凝月交回收的DNA片段(PCR產物或片段)。通過VIBGeneticServiceFacility(Antwerp,Belgium)進行DNA測序。我體溝建(i)ALG3基因的敲除(基因替代)。將ALG3基因(GenBank⑧登錄號XM—503488，Genolevures:YALI0E031卯g)的啟動子片段(P)從解脂西洋蓍黴MTLY60菌抹的基因組DNA通過PCR擴增，所述PCR使用5'CAGTGCGGCCGCACTCCCTCTTTTCACTCACTATTG3'(SEQIDNO:48)和5'CATTACCCTGTTATCCCTACGCTCAGATCCAATTGTTTTGGTGGTC3'(SEQIDNO:49)分別作為正向和反向引物，使用Taq聚合酶(Invitrogen)。用T4DNA聚合酶(Fermentas,Ontario,Canada)去除突出的(overhanging)A核苷酸。通過PCR從解脂西洋蓍黴MTLY60菌林擴增ALG3基因的終止子片段(T),所述PCR使用5，GTAGGGATAACAGGGTAATGCTCTCAAGGACGGACCAGATGAGACTGTTATCG3，(SEQIDNO:50)和C3，(SEQIDNO:51)分別作為正向和反向引物，使用校正讀碼PfuDNA聚合酶(Fermentas)。由於含有ISceI限制位點的重疊的引物序列，可以通過PCR將兩個片段連接，所述PCR使用P-正向引物和T-反向引物。然後將這種共擴增子(co-amplicon)亞克隆至pCR-2.1TOPOTA(Invitrogen)載體中，並且通過測序確認所述共擴增子的序列正確性。然後將共擴增子^f吏用Notl-Pacl位點克隆入中間載體(intermediatevector)。(ii)ALG6基因的過表達。將ALG6ORF(1725bp)連同ALG6基因(GenBank⑧登錄號XM—502922，Genolevures:YALI0D17028g)的終止子(415bp下遊)從解脂西洋蓍黴MTLY60菌抹的基因組DNA通過PCR克隆，所述PCR使用5'CAGTGGATCCATGAACTCTCCTATTTTCACTACCG3，(SEQIDNO:52)和5'GACTCCTAGGAAGCTTCCAGGTTACAAGTTGTTAC3，(SEQIDNO:53)分別作為正向和反向引物，使用校正讀碼PfUDNA聚合酶(Fermentas)。將所述序列克隆至pCR-BluntII-TOPO(Invitrogen)中並且通過測序確認ALG6ORF序列的正確性(如上)。然後，將ALG6ORF通過BamHI和AvrII克隆至含有hp4d啟動子的載體(pYLHmA)中，然後再通過ALG3的終止子片段中存在的獨特的限制位點Clal和HindIII克隆至中間載體中。(iii)選擇標記盒。為了從宿主基因組DNA去除可選擇的標記URA3，使用了Cre-toc重組系統，例如，如Fickers等所述((2003)J.Microbiol.Methods55(3):727-737所述，將其公開內容通過所述整體併入本文)。在從質粒pRRQ2(hp4d-cre,丄五t/2)(來自InstitutNationaldeRechercheAgronomique(INRA)6勺饋贈)表達Cre重組酶時，通過兩個/ox位點之間的重組將標記切除。在兩種具有和不具有ALG6過表達盒的構建體中，將由fox位點側接的URA3選擇標記插入在載體的P和T片段之間引入的I-Scel位點,產生"PUT"構建體。的劍務。將酵母菌抹在28°C保溫箱中以250rpm旋轉在50mlFalcon管中的10ml標準YPD培養基中過夜培養。然後通過在4°C以4000rpm離心使細胞沉澱。去除上清液，並且將細胞首先用2ml0.9。/。NaCl溶液清洗，其後用2ml水清洗兩次，再重懸在微量離心管中1.5ml0.02M檸檬酸鈉pH7中。在將管在121。C高壓滅菌90分鐘之後，渦旋振蕩所述管並且通過離心使細胞碎片沉澱。收集上清液並且用4倍體積的曱醇在4。C以旋轉運動過夜沉澱。然後通過離心所述用醇沉澱的材料荻得沉澱物。使粒狀沉澱(pellet)乾燥並溶解在50|il水中。潛#浙。使用ABI3130DNA測序儀如Callewaert等(2001;見上文)所述進行了DNA測序儀輔助型(DSA)、螢光團輔助型糖電泳(FACE)。簡言之，將糖蛋白在RCM緩沖液(8M尿素，360mMTrispH8.6和3.2mMEDTA)中上。膜的預潤溼用300|^1MeOH進行，用300)il水和50^1RCM清洗3次，然後真空去除。用50plO.IM二硫蘇糖醇將糖蛋白還原1小時，再用300(al水清洗3次。在黑暗中與50jil0.1M碘乙酸一起溫育30分鐘，用於將SH基團羧曱基化，其後用300pl水清洗3次。然後將平板與100pl1%聚乙烯吡咯烷酮360溫育1小時以飽和膜上未被佔據的結合位點，再用300)il水清洗3次。接下來，通過用50fil10mMTris-乙酸pH8.3中的肽N-糖苷酶F(PNGaseF)xU處理3小時來釋放N-聚糖。回收N-聚糖並且用螢光團8-氨基芘-1，3，6-三磺酸酯(8-aminopyrene-l,3,6-trisulfonate)(APTS)通過還原性氨基化來衍生化。這通過在37°C與1.2M檸檬酸中20mMAPTS和DMSO中1MNaCNBH3的1^11:1混合物過夜(ON)溫育並通過加入4^1水猝滅來實現。通過在SephadexG-10樹脂上進行大小分級來去除過量的標記。然後將餘下的標記的N-聚糖通過蒸發進行濃縮。包括RNA酶B的N-聚糖和寡麥芽糖梯子作為大小標誌物。<吏用Genemapper⑧軟^f牛(AppliedBiosystems)進4亍悽t據分才斤。對標記的糖的糖芬酶消化在37°C在100mMNH4ACpH5中過夜進4亍。在過夜消化之後加入額外的Jackbean(JB)甘露糖苷酶並且再在37°C放置24小時。解脂西洋蓍黴中ALG3基因的破壞為了破壞ALG3基因，生成包括ALG3的終止子和啟動子的部分並且具有URA3選擇標記盒的載體，並命名為pYLalg3PUT。整合Notl和Pacl位點以線性化所述載體並由此去除與大腸桿菌相關的DNA元件。使用在啟動子和終止子位點的雙同源重組來用URA3可選擇的標記替代ALG3,這產生了a/g3::URA3突變菌林。應用的敲除策略由Fickers等(2003;見上文)描述並且利用Cre-lox重組系統，其促進有效的標記拯救(markerrescue)。當整合入基因組^LG^重疊群(contig)時，Alg3pa-l,6-甘露糖基轉移酶活性應該喪失。這通過分析幾個轉化體的甘露糖蛋白的糖基化型來監測。將源自甘露糖蛋白的N-聚糖通過DSA-FACE(毛細管電泳)分析並且用選擇的外切糖苷酶進行處理以揭示結構。24個轉化體中的7個在糖基化譜中給出了變化(將其中三個示於圖13)。在全部7個轉化體中，能夠通過PCR確認敲除盒在基因組中的正確整合。通過分析所述譜發現了三種主要的聚糖結構(i)一種(結構式VII;圖4)與RNA酶B的Man5GlcNAc2結構(後者為結構式IV;圖4)運行在同樣大小；(ii)一種距離一個額外的葡萄糖單位；和(iii)一種距離兩個額外的葡萄糖單位。(圖13)這些結果表明將這些細胞中的ALG3破壞。a-l,6-甘露糖基轉移酶Alg6。的過表達開發了一種策略，其中將用於第一葡萄糖基轉移酶(即Alg6p)的組成性活性過表達盒併入alg3基因替代載體。將這種載體命名為pYLalg3PUT-ALG6。將這種載體的Notl/PacI片段轉化入解脂西洋蓍黴MTLY60菌抹。以這種方法，實現對ALG3的破壞和ALG6在hp4d啟動子調控下的過表達。再次通過PCR確認了基因組中的正確整合。對源自甘露糖蛋白的N-聚糖進行的DSA-FACE分析顯示半數的轉化體，即，24個中的12個，與WT菌抹相比展現出糖基化型的變化。^LG6的過表達導致了輕度克隆變異(圖13)。N-聚糖結構的鑑定為了進一步揭示來自上述實驗的聚糖結構的性質，用選擇的外切糖苷酶對源自甘露糖蛋白的聚糖(如上)進行了體外消化。用以下酶分析甘露糖蛋白聚糖a-l，2-甘露糖苦酶；a-甘露糖苷酶(JB)和葡糖苷酶II。三種觀察到的聚糖結構為Man5GlcNAc2(結構式VII;圖4)、GlcMan5GlcNAc2(結構式VIII;圖4)和Glc2Man5GlcNAc2(結構式IX;圖4)(圖14)。這些結果表明由a-1,6-甘露糖基轉移酶(例如，Ochlp)進行的甘露糖延伸非常少甚至沒有。為了測定ALG6過表達對於促進N-糖基化位點佔據是否是必須的，在三種不同的菌抹(西洋蓍黴MTLY60,MTLY60Aa/g3和MTLY60Aa/g3^丄G6)中表達了來自解脂西洋蓍黴的脂肪酶2(LIP2)。從INRA獲得了在TEF組成型啟動子調控下的用於解脂西洋蓍黴LIP2的構建體。將所述表達盒轉化至上述菌抹並且通過對製備自經轉化細胞的上清液進行SDS-PAGE分析(圖28)來驗證蛋白質的表達。Lip2p蛋白具有2個糖基化位點。將源自"/g3-缺陷型("敲除")酵母菌林的Lip^蛋白通過SDS-PAGE解析成三條不同的條帶，使用考馬斯藍染色凝膠使所述條帶可見(圖28)。為了確認凝膠中蛋白質的三種形式是Lip2p蛋白的不同糖基化形式，對獲得自"/g3缺陷型("敲除")酵母菌林的Lip2p蛋白進行用PNGaseF(從糖蛋白去除寡糖殘基的酶)的處理，然後再進行SDS-PAGE分析，如上所述。用PNGaseF處理Lip2p蛋白在考馬斯藍染色後的凝膠上產生了單一條帶，表明先前觀察到的全部三種形式的蛋白質是相同的Lip2p分子的不同糖基化形式。對於源自alg3ALG6菌林的Lip2p也是如此。然而，還原性糖基化形式的蛋白質量降低。因此，可以總結出ALG6的過表達能夠(至少部分)恢復在a/g3敲除的突變酵母菌抹中減少的N-糖基化位點的佔據。去除加帽的葡萄糖結構接下來，為了體內去除單葡萄糖基化的(結構式VIII;圖4)和雙葡萄糖基化的(結構式IX;圖4)MansGlcNAc2(結構式VII;圖4)結構，將細胞遺傳工程化以過表達葡糖苷酶II的a-亞基。西洋蓍黴的葡糖苷酶II(GenBank登錄號XM—500574)的a亞基和布氏錐蟲的葡糖苷酶n(GenBank⑧登錄號AJ865333)的a亞基作為兩種策略獨立地克隆以過表達所述蛋白質。選擇布氏錐蟲葡糖苷酶II的a亞基的原因是它的天然底物是GlcMan5GlcNAc2(結構式VIII;圖4)。將兩種基因克隆在組成型hp4d啟動子的調控下，並且它們的質粒含有W^j標記。將這些構建體轉化入帶有和不帶有^LG6過表達的a/g3突變酵母菌林。從源自含有所述構建體的經培養細胞的分泌蛋白製備寡糖並且通過DSA-FACE分析測定寡糖譜。全部轉化體給出相同的DSA-FACE譜，將每種葡糖苷酶IIct的兩個不同的克隆示於圖29。從這些結果總結出西洋蓍黴或錐蟲葡糖苷酶IIa亞基的過表達對單葡萄糖基化的(結構式VIII;圖4)和雙葡萄糖基化的(結構式IX;圖4)Man5GlcNAc2(結構式VII;圖4)結構僅具有較小的作用。用HDEL序列標記的解脂西洋蓍黴和布氏錐蟲葡糖苷酶IIa-亞基的表逸為了改進西洋蓍黴或錐蟲葡糖苷酶IIa亞基的表達對從Man5GlcNAc2體內去除葡萄糖殘基的作用，使用分子生物學技術將編碼HDEL標記的核酸符合讀框地添加至編碼所述兩種GlsIIa酶中每一種的核酸的3，端。HDEL標記意欲充當從高爾基到ER的恢復機制(retrievalmechanism)。將編碼在hp4d啟動子調控下的、HDEL標記的來自解脂西洋蓍黴(K/.)和布氏錐蟲(7:6.)的葡糖苷酶II序列的質粒轉化至過表達或不過表達ALG6基因的a/g3KO菌抹。如圖30中可見，解脂西洋蓍黴葡糖苷酶IIa亞基的過表達對葡萄糖基化結構的量僅具有較小的作用。相反，過表達帶有額外的HDEL標記的布氏錐蟲a-葡糖苷酶II的a亞基導致單葡萄糖峰的降低(參見圖31)。用變聚糖酶處理葡萄糖基化聚糖上述結果示範了一種減少Man5GlcNAc2的單葡萄糖基化形式的示例性方法。為了從糖蛋白降低Man5GlcNAc2的雙葡萄糖基化形式，作為一種潛在解決方法研究了哈茨木黴的變聚糖酶。從Novozymes(Novozyme234;Bagsvaerd,Denmark)獲得酶製備物並用於體外消化寡糖。即，將不同濃度的變聚糖酶添加至源自a/g3/^G6菌林的寡糖(聚糖Man5GlcNAc2、GlcMan5GlcNAc2和Glc2Man5GlcNAc2)。如圖32的DSA-FACE譜中所示，將在寡糖中觀察到的雙葡萄糖峰有效降低。接下來，體內過表達哈茨木黴的變聚糖酶。按照為了在解脂西洋蓍黴中表達經密碼子優化的cDNA合成了含有HDEL序列的變聚糖酶。將成熟蛋白符合讀框地與LIP2前信號序列一起克隆在TEF1啟動子的調控下(圖33)。將76這種構建體轉化入過表達和不過表達J丄G6的"/g3突變酵母菌4朱。從含有所述構建體的經培養細胞製備了寡糖並且通過DSA-FACE分析測定寡糖譜。預期DSA-FACE譜將顯示在所述寡糖中觀察到的雙葡萄糖峰的降低。從這些結果將總結出變聚糖酶的體內過表達在與不過表達變聚糖酶的細胞相比降低寡糖中觀察到的雙葡萄糖峰方面有效。YlGlsIIa亞基和[3亞基的共表達已知葡糖苷酶II的a亞基和p亞基形成異源二聚體複合物，其中(3-亞基負責將所述複合體恢復到ER並且也涉及底物識別，而a-亞基含有催化活性。由於僅過表達葡糖苷酶II的a-亞基對雙葡萄糖寡糖結構具有的效果小，所以共表達a-和卩-亞基。從基因組DNA擴增了P-亞基(YALI0B03652g)的開放閱讀框，所述基因組DNA使用PCR分離自MTLY60菌抹，並且將所述開放閱讀框克隆在TEF1和hp4d啟動子的調控下。將構建體製成具有LEU2作為選擇標記並具有在TEF1和hp4d啟動子調控下的葡糖苷酶III3-亞基。將這些轉化至過表達和不過表達ALG6、且過表達帶有和不帶有HDEL序列標記的解脂西洋蓍黴葡糖苷酶IIa亞基的a/g3敲除菌林。從分泌自細胞的蛋白質製備N-聚糖，並且將所述N-聚糖的DSA-FACE譜示於圖33和圖34(a/g3敲除且過表達ALG6)。從這些譜可以總結，過表達來自解脂西洋蓍黴的葡糖苷酶IIp亞基對剪切葡萄糖基化的糖確實具有正面效果。概括而言，當在TEF1啟動子下表達時葡糖苷酶II的卩亞基的效力得到改善。當解脂西洋蓍黴葡糖苷酶IIa亞基含有IIDEL標記時，葡萄糖基化結構的降低甚至更大(圖33和34)。對於不過表達ALG6的a/gj缺陷型細胞，對於不同的細胞群體觀察到了有關葡萄糖基化結構降低的相似結果(圖35)。麴黴GlsIIa和b亞基的表達為了從a/g3-缺陷型背景中存在的含有葡萄糖的結構去除葡萄糖殘基，按照為了在解脂西洋蓍黴中表達經密碼子優化的cDNA合成了黑麴黴成熟(缺乏信號肽)葡糖苷酶IIa和|3(a-亞基(SEQIDN0:7;圖36A-36B)卩-亞基(SEQIDN0:8;圖37)。將黑麴黴(An)葡糖苷酶a亞基克隆在組成型TEF1和hp4d啟動子的調控下，並且具有URA3基因作為選擇標記。將所述表達盒(在TEF1和hp4d調控下的ORF)轉化至解脂西洋蓍黴alg3ALG6菌抹。將轉化體候選培養在YPD中，並且通過DSA-FACE分析了來自分泌蛋白的聚糖。從圖38能夠推導出與非轉化體(o/g3ALG6)相比在轉化體菌林中兩種葡萄糖基化結構較不豐富。為了進一步降低葡萄糖基化聚糖結構，製備了具有在TEF1啟動子或hp4d啟動子調控下的黑麴黴葡糖香酶II(3-亞基和作為選#^標記的LEU2的構建體。將這種構建體轉化至表達An葡糖苷酶IIa-亞基的解脂西洋蓍黴fl/^ALG6菌抹。預期黑麴黴葡糖苷酶II13-亞基的表達將導致解脂西洋蓍黴細胞中葡萄糖基化結構的減少。實施例6.鑑定HAC內含子以及克隆和分離HAC1基因^^西^孝,/^C7，V4在^。基於解脂西洋蓍黴和真菌裡氏木黴以及構巢麴黴中HAC1內含子區之間的序列同源性，鑑定了解脂西洋蓍黴HAC1(Genbank:XM—500811，Genolevures:YaliOB12716g)的潛在剪接位點。預期5，和3'剪接位點定位在特徵性環結構中並且計算內含子為29bp長。在所述剪接位點周圍開發了引物從而鑑定所述內含子。使用基因特異性引物，從來自UPR(未摺疊蛋白質應答)誘導型(通過在二硫蘇糖醇(DTT)中培養)和非誘導型培養物(陰性對照)的分離的mRNA合成了第一鏈cDNA。然後對第一鏈使用引物HAC1FW06-003和HAClRv06-001進行了PCR。在1.5%瓊脂糖凝膠上分析了擴增產物。預期對於非誘導型細胞將擴增+/-400bp的片段，預期對於誘導型細胞將擴增29bp的較小的片段。從非誘導型和UPR誘導型細胞獲得了正確大小的片段。對於UPR誘導型培養物獲得了額外兩種擴增產物。中部的片段與獲得自非誘導型培養物的條帶大小相同，並且被理解為未剪接的HAC1。將底部的最突出的條帶從凝膠純化並且克隆入測序載體。在測序所述構建體之後，進行了序列比對以鑑定剪接位點(圖15)。從所述序列比對能夠看出，剪接位點位於從解脂西洋蓍黴和(裡氏木黴和構巢麴黴)HAC1序列的比較中預測的位置。所述剪"l妻位點為29bp長。為了分離活性全長HAC1序列，將引物工程化為具有適合於克隆至表達載體中的限制為點。引物序列如下HaclylRv07-018:CCTAGGTCACTCCAATCCCCCAAACAGGTTGCTGACGCTCGACTCATAGTGAGCTAGATCAGCAATAAAGTCG(SEQIDNO:54)和HAClFw06陽002:GGATCCATGTCTATCAAGCGAGAAGAGTCC(SEQIDNO:55)。將10ml酵母細胞培養物在5mMDTT存在下溫育1.5小時以誘導UPR應答。溫育之後，從經DTT處理的細胞分離了RNA並且從所述分離的RNA使用逆轉錄酶製備了第一鏈cDNA，並且PCR使用所述cDNA作為模板和上述引物。所述PCR擴增的序列含有經剪接的HACl，將所述序列使用標準分子生物學技術插入pCR-blunt-TOPO克隆載體並測序。S身/^舉^發母/￡4C7#"凝/丈《。基於巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母IIAC1基因的內含子區的序列同源性，在巴斯德畢赤酵母HACl基因中鑑定了潛在的剪接位點(圖16)。預期所述5，和3，剪接位點定位在特徵性環結構中並且計算所述內含子長度為322bp。在預期的剪接位點周圍開發了引物(HAC1Fw06-004和HAC1Rv06-005)以鑑定所述內含子(參見表4)。當內含子被去除時預期將擴增257個核苷酸的片段，若內含子仍然存在則預期擴增579bp片段。從來自UPR誘導型和非誘導型培養物的分離的mRNA合成了第一鏈cDNA。UPR通過向10ml指數生長的細胞培養物加入5mMDTT來誘導。將所述細胞在DTT存在下培養1.5小時。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析所述擴增產物。從來自非誘導型和誘導型細胞二者的cDNA獲得了約257bp的片段。表4.引物tableseeoriginaldocumentpage79引物代碼序列5'-->3'信息ACTppRv07-003CCACCGATCCATACGGAGTACT(SEQIDN0:61)用於QPCR的Actl反向引物HAClppFw07-008CGACCTGGAATCTGCACTTCAA(SEQIDNO:62)Hacl正向引物QPCRHACIppRV07-004CGGTACCACCTAAGGCTTCCAA(SEQIDNO:63)Hacl反向引物QPCRKar2ppFw07-009CCAGCCAACTGTGTTGATTCAA(SEQIDNO:64)Kar2正向引物QPCRKar2ppRv07-005GGAGCTGGTGGAATACCAGTCA(SEQIDNO:65)Kar2反向引物QPCR為了驗證未剪接的巴斯德畢赤酵母HAC1基因的長度，使用引物IIAC1-Karl和HAC1Rv06-005對基因組DNA進行了PCR。將獲得的片段的長度與從來自誘導型細胞培養物的cDNA獲得的PCR產物的長度比較。從基因組DNA擴增的片段比使用相同引物源自cDNA的擴增子長約300bp，這表明內含子存在於基因組DNA序列而從經剪接的mRNA中缺失。從凝膠分離了257bp的cDNA片段並且克隆至測序載體中。對所述片段進行測序並且進行了比對以鑑定剪接位點(圖17)。為了分離並克隆經剪接的巴斯德畢赤酵母HAC1基因，開發了具有用於克隆入表達載體的限制酶位點的PCR引物(HAC1-Karl和HAClRv06-009)。將10ml培養物用5mMDTT進行1.5小時的UPR誘導。使用逆轉錄酶從分離的RNA製備了第一鏈cDNA,然後再使用上述引物對所述cDNA模板DNA進行了PCR。分離了經剪接的HAC1並克隆至pCR-bkmt-TOPO克隆載體中用於測序。將經剪接的基因也克隆至表達載體i^丄/Z/S/X中在曱醇誘導型A0X1啟動子的調控下，以獲得載體j^丄///51/^//JCh;^'ce丄HAC1基因向表達載體中的正確插入使用PCR和限制酶分析來確認。在釀酒酵母中，在剪接時，將未剪接mRNA中C-末端IO個胺基酸的編碼序列用18個胺基酸的編碼序列替代。同樣(inaccordance),在巴斯德畢赤酵母中揭示了未剪接HAC1中C-末端45個胺基酸在剪接時也由18個胺基酸的編碼序列替代，所述18個胺基酸與來自釀酒酵母序列的同源(圖18)。實施例7.經剪接HAC1基因向解脂西洋蓍黴中的轉化和誘導將解脂西洋蓍黴細胞(MTLY60菌林)用載體"PYHMAXHAClylspliced"轉化，所述載體含有在hp4d啟動子的表達調控下的經剪接的HAC1cDNA(上文)和作為選擇標記的URA3基因。所述載體向酵母基因組中的整合4吏用PCR驗證。將用PYHMAXHAClylspliced轉化的MTLY60菌林在2ml在YPG中的培養物中在28。C培養24小時。將培養的細胞用YNB清洗兩次，然後稀釋至0D6Q0.6，再在用50mM磷酸鹽緩沖液pH:6.8緩沖的YTG中培養24小時。然後將所述細胞稀釋至OD6{)0.2並且再培養3代從而收穫中指數期(mid-exponentialphase)的細胞。向細胞的粒狀沉澱加入1mlRNApureTM溶液連同1g玻璃珠。通過劇烈振蕩破壞細胞。通過加入150pl氯仿並用異丙醇使RNA沉澱來從破碎的細胞提取RNA。將提取的RNA也用DNA酶處理以去除任何共沉澱的DNA雜質。使用iScriptTMcDNASynthesisKit(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)在20fil總體積的反應中從800ng的RNA製備第一鏈cDNA。將20ngRNA當量用於實時PCR分析以測定細胞中HAC1mRNA的量。使用SYBR⑧綠(SYBRgreen)作為檢測試劑(螢光的)(Eurogentec)運行實時PCR。除了設計用於檢測細胞中HAC1mRNA的量的引物，還設計了對作為對照用於所述實時PCR的ACT1(持家基因)和KAR2(UPR應答基因)基因進行定量的引物。使用肌動蛋白(持家基因)作為表達對照從比較性閾循環值計算細胞中各種基因的相對量。通過測量UPR的表達確認了所述細胞對UPR應答的誘導。在組成型啟動子調控下表達HAC1的菌林中的KAR2以及HAC1的表達水平比野生型菌林MTLY60高(圖39)。實施例8.經剪接的HAC1基因向巴斯德畢赤酵母中的轉化和誘導乂##差對於以下實驗，使用了三種類型的培養基BMY(用於酵母的緩沖型培養基100mM磷酸鉀pH:6.0/1.34。/。無胺基酸的YNB/l。/。酵母提取物/2%蛋白腖)；BGMY(用於酵母的緩衝型甘油-複合培養基100mM磷酸鉀pH:6.0/1.34。/。無胺基酸的YNB/P/。酵母提取物/2。/。蛋白腖/l。/。甘油)；和BMMY(用於酵母的緩沖型曱醇-複合培養基100mM磷酸鉀pII:6.0/1.34。/。無胺基酸的YNB/P/。酵母提取物/2。/。蛋白腖/0，5。/。甘油)。按照來自畢赤酵母表達試劑盒(Invitrogen目錄號K1710-01)的電穿孔規程轉化了巴斯德畢赤酵母細胞。將載體/^￡///5/;^;//^671^/^^/在HIS4基因線性化以使所述構建體耙向HIS4基因組進行整合。將10微克的DNA轉化入酵母細胞。在分離單菌落之後，使用對基因組DNA進行的PCR(引物HAC1-Karl和HAClRv06-005)驗證了構建體的正確整合。從獲得自所述經轉化細胞的DNA擴增了915kb和1237kb的片段，而在非轉化體中(未整合所述構建體的細胞)擴增了1237kb的片段。將由此鑑定為質粒整合陽性的克隆在誘導之前在10mlBMGY培養基中培養24小時。用BMY將細胞清洗一次。向非誘導型培養物加入BMGY，而向誘導型培養物加入BMY。每12小時，為誘導型培養物補料0.5%曱醇(終濃度)。將誘導進行24小時，之後通過離心收穫細胞。為了製備RNA，將細胞與1mlRNApure(GenhunterCorporation,Nashville,NY)和1g玻璃珠組合，並且通過劇烈振蕩裂解。通過加入150pl氯仿並用異丙醇沉澱來提取RNA。對提取並沉澱的RNA進行DNA酶處理，使用獲得自Qiagen的不含RNA酶的DNA酶(目錄號79254)。使用寡dT引物和SuperscriptII逆轉錄酶(Invitrogen，目錄號18064-014)對400ng的總RNA進行逆轉錄反應。在實時PCR反應中使用20ngRNA當量。通過PrimerExpress軟體(AppliedBiosystems)設計了引物序歹'J(序列參見引物表)。利用SYBR綠色螢光試劑(Eurogentec)的實時PCR在來自BioRad的iCycler儀器中運行。使用持家基因肌動蛋白作為對照從比較性閾循環值計算mRNA的相對量。對UPR的定量通過對UPR-靶基因KAR2的表達分析來進行。當將未經誘導的克隆與用甲醇誘導的相同克隆比較時，獲得了高3-7倍的KAR2表達(圖19)。通過定量PCR測定了來自另外兩個克隆6和克隆8的HAC1mRNA的相對量，並且與Kar2的mRNA的相對量進行了比較。在兩個克隆中均)現察到了對HAC1的強誘導。KAR2mRNA的相對量似乎與HAC1mRNA的相對量相關，較高的HAC1表達水平導致較高的KAR2表達水平(圖20)。使用螢光流式細胞儀(FFC)進行經曱醇誘導的培養物的細胞凋亡研究，並且與未經誘導的培養物的細胞凋亡比較。每次分析測量了數萬細胞。在12、36和48小時的誘導之後，在FACScalibur(BectonDickinson)上分析細胞。GlycoSwitchM5(GSM5)菌抹具有主要為Man5GlcNAc2(結構式IV;圖4)的主要核心型聚糖結構。為了檢查對Haclp的誘導是否對N-聚糖結構有影響，對1ml培養基進行了DSA-FACE分析。在對經剪接Haclp進行48小時誘導之後獲得的聚糖譜與親本GSM5菌株的鐠相似。製作了生長曲線以檢查Haclp誘導是否損害了巴斯德畢赤酵母的生長。與用空載體轉化的菌抹相比在Haclp誘導菌抹中未見生長缺陷(圖22)。實施例9.Y1MNN6的表達在釀酒酵母中，MNN6將磷酸甘露糖殘基轉移至N-聚糖。因此，解脂西洋蓍黴中Y1MNN6的過表達能夠導致磷酸化的增加。此外，對解脂西洋蓍黴磷酸化的額外作用通過過表達Y1MNN4和Y1MNN6獲得。將Y1MNN6編碼區(Genbank⑧登錄號XM—499811,GenolevuresRef:YALI0A06589g)使用PCR引物Y1MNN6BamHIfw(GCGGGATCCATGCACAACGTGCACGAAGC(SEQIDNO:34))和Y1MNN6AvrIIrv(GCGCCTAGGCTACCAGTCACTATAGTTCTCC(SEQIDNO:35))從基因組以PCR擴增，並克隆入pYHmAX表達載體中用於在hp4d啟動子調控下的表達。將質粒使用zeta序列轉化至解脂西洋蓍黴菌林MTLY60以改善隨機整合。從培養在無尿嘧啶的培養基上的細胞克隆收集分泌的糖蛋白，並且使用DSA-FACE分析合成所述糖蛋白的聚糖組成。然而，未觀察到磷酸化的增力口(圖22)。實施例10.Haclp表達的效果對異源蛋白分泌評估Haclp過表達。將含有在誘導型A0X1啟動子(pPIChygppHAClspliced)調控下或在組成型GAP啟動子調控下(pGAPhygHAClppspliced)的潮黴素抗性標記和經剪接的/L4C7cDNA的載體轉化至表達在誘導型A0X1啟動子調控下的mlL-10蛋白的GS115菌抹。將巴斯德畢赤酵母細胞按照來自畢赤酵母表達試劑盒(Invitrogen目錄號K1710-01，Invitrogen,Carlsbad,CA)的電穿孔規程轉化。將所述載體在A0X1或GAP啟動子中線性化以使Haclp基因的整合分別靶向AOX1或GAP基因座。使用PCR確認了所述質粒向宿主基因組中的整合。將來自鑑定為陽性的克隆的預培養物(5ml)在YPD中培養24小時。測量了培養物中細胞在600nm(OD6oo)波長的濃度(OD)並且將培養物在24孔平板的各個孔中的2mlBMGY培養基中稀釋至OD6o0為1。將培養物在BMGY中培養48小時，用BMY清洗兩次，然後在BMMY中誘導24小時。83每8-12小時，為培養物再次補料含1°/。甲醇(終濃度)的培養基。誘導之後，收穫細胞的上清液並且使用三氯乙酸(TCA)從1ml上清液沉澱蛋白質。對沉澱的蛋白質進行15%SDS-PAGE。從SDS-PAGE，在不同的克隆之間觀察到在至少一種蛋白質(mIL-10)的表達方面的克隆變異。例如，對於組成型(在GAP啟動子調控下)表達Haclp蛋白的克隆，未觀察到表達水平的改進，而對於誘導型(AOXl啟動子)表達Haclp的克隆，可以鑑定出兩個克隆展現了更高的mIL-10蛋白的表達水平(圖40和圖41)。將各個克隆的mlL-10表達與由表達mlL-10的參照GS115菌抹產生的mIL-10表達比較。對於這些克隆進行了新的誘導。將培養24小時的預培養物在帶擋板的搖瓶中的20mlBMGY中稀釋至OD1。將細胞在BMGY中培養48小時，清洗兩次，然後在BMMY中誘導。每8-12小時為培養物再次補料含1%曱醇的培養基。誘導之後，收穫細胞的上清液並且使用TCA從1ml的所述上清液沉澱蛋白質。在對沉澱的蛋白質進行15%SDS-PAGE之前，用PNGaseF處理所述蛋白質(或不處理)以去除全部糖基化(圖41)。SDS-PAGE解析出來自表達Haclp的菌抹的上清液的蛋白質含有75kDa的顯著條帶，該條帶在參照菌抹中不存在。通過質i普的方法鑑定了這個條帶為Kar2p,其是最主要的UPR靶基因。使用細胞因子珠測定法(cytokinebeadarray)(CBA)能夠證明IIaclp和mIL-10蛋白的同時誘導型表達能夠導致2倍高的mIL-10蛋白表達(克隆l,圖41)。CBA是對經endoH處理的mIL-lO蛋白進行的。對異源蛋白的表面表達評估Haclp過表達。將含有在誘導型AOX1啟動子調控下(pPIChygppHAClspliced)或在組成型GAP啟動子調控下(pGAPhygHAClppspliced)的潮黴素抗性標記和經剪接的//JC7cDNA的載體轉化至分別在誘導型AOX1啟動子調控下表達成熟人幹擾素-p/a-凝集素融合蛋白、成熟小鼠幹擾素Y/a-凝集素融合蛋白、成熟人促紅細胞生成素/a-凝集素融合蛋白或a-凝集素和小鼠凝血調節蛋白的凝集素樣結構域(lectin-likedomainofmousethrombomodulin)的融合蛋白的GlycoswitchMan5菌抹中。按照來自畢赤酵母表達試劑盒(Invitrogen目錄號K1710-Ol)的電穿孔規程轉化了巴斯德畢赤酵母細胞。將所述載體在AOX1或GAP啟動子中線性化以使Haclp基因分別靶向AOX1或GAP基因座進行整合。使用PCR確認了所述質粒向宿主基因組中的整合。將來自鑑定為陽性的克隆的預培養物(5ml)在YPD中培養24小時。測量了OD麵並且將培養物在24孔平板的各個孔中的2mlBMGY培養基中稀釋至OD6。。為1。將培養物在BMGY中培養24小時，用去離子水清洗兩次，然後在BMMY中誘導(使用含1%甲醇的培養基)24小時。通過直接使用對V5表位特異性的抗體進行免疫染色證明表面表達，所述抗體與VhH編碼序列在C-末端融合。誘導之後，將在補充有0.1%牛血清清蛋白的1mlPBS(pH7.2)(PBS/BSA)中的107細胞與1pl/ml所述抗V5抗體(lHgl;Invitrogen)—起溫育，用PBS/BSA清洗，並且與lpl/mlAlexafluor488標記的羊抗小鼠IgG分子探針)一起溫育。在用PBS/BSA清洗兩次之後，通過流式細胞儀分析細胞(表5)。表5.通過流式細胞儀測定的MFI值tableseeoriginaldocumentpage85MFP從流式細胞儀分析獲得的平均螢光強度。對於組成型表達Haclp蛋白的菌株，與僅表達表面蛋白的參照菌林相比，對於全部四種蛋白在表面表達水平方面沒有觀察到改進或觀察到非常小的差異。在表達人幹擾素-|3的細胞中，觀察到了表面表達水平的顯著降低。對於過表達誘導型Haclp(表5)的菌抹，可以觀察到如下l)在人幹擾素-y表面表達菌抹中，與僅表達人幹擾素-pa-凝集素融合物的參照菌抹相比能夠觀察到表面表達水平1.8倍的降低；2)對於表面表達人促紅細胞生成素a-凝集素融合蛋白的菌抹，與參照菌林相比能夠觀察到表面表達水平1.3倍的降低；3)在表面表達人幹擾素-P的菌林中，與參照菌抹相比沒有觀察到表面表達水平的差異；和4)在表面表達小鼠凝血調節蛋白凝集素樣結構域的菌林中，與參照菌株相比能夠觀察到表面表達水平1.9倍的增加。Haclp的it^達對磷脂合成的影響。為了測定Haclp產物的過表達(自經剪接的HAC1cDNA產生)是否對巴斯德畢赤酵母中的脂質代謝有影響，用上述經剪接的HAC1cDNA轉化細胞並且通過電子顯孩史鏡分析測定Haclp對細胞中脂質代謝的影響。將細胞在BMGY上培養48小時，用PBS清洗一次，然後在BMMY上再培養48小時。每8-12小時將細胞再次培養(nextculture)在含有1%曱醇的培養基中。然後按照Baharaeen的方法(Baharaeen等(20(M)Mycopathologia)製備用於電子顯微鏡的細胞。簡言之，使含有戊二醛(3。/o)和低聚曱醛(para-formaldehyde)(1.5%，在pH7.2的0.05M二曱胂酸鈉中緩沖)的初期固定劑與所述細胞在水上接觸2小時。然後將細胞用0.05M二甲胂酸鈉清洗三次20分鐘。清洗之後，將細胞與6%高錳酸鉀溶液在室溫接觸l小時，然後用0.05M二曱胂酸鈉清洗三次20分鐘。將實驗結果示於圖54。巴斯德畢赤酵母中Haclp產物(自經剪接的HAC1cDNA產生)的過表達導致離散的膜堆疊的區域，如示於圖54的電子顯微照片(EM)中所示。這些結果證明Haclp的過表達通過其對脂質代謝中涉及的基因的轉錄激活而確實對巴斯德畢赤酵母中的脂質代謝有強烈效果。實施例11.ManHDEL的表達對於與由Aochl菌林表達的糖蛋白結合的Man5GlcNAc2,可以表達a-l,2-甘露糖苷酶以將Man8GlcNAc2切割成Man5GlcNAc2(即，高爾基型a-l,2-甘露糖苷酶活性)。這種甘露糖苷酶應該靶向分泌系統。與釀酒酵母前原交配因子(prepromatingfactor)融合併且用HDEL序列標記的裡氏木黴a-l，2-甘露糖苷酶(Genbank⑧登錄號.AF212153)能夠在巴斯德畢赤酵母中以及在裡氏木黴和黑麴黴中將Man8GlcNAc2體內剪切成Man5GlcNAc2。製備了在解脂西洋蓍黴中在組成型hp4d啟動子調控下過表達MFManHDEL(與裡氏木黴a-l,2-甘露糖苷酶融合的用HDEL序列標記的釀酒酵母前原a-交配因子)的表達構建體(圖23)。在用限制酶Notl消化質粒pYHmAXManHDEL之後，將所述表達盒轉化入細胞，其後使用瓊脂糖凝膠電泳分離期望的片段。使用DSA-FACE分析從來自經轉化細胞的甘露糖蛋白衍生的聚糖。僅一'J、部分Man8GlcNAc2被轉化成Man5GlcNAc2(圖24)。Man8GlcNAc2向Mari5GlcNAc2的不完全轉化可能是因為非最適的分泌信號。因此，將所述釀酒酵母分泌信號用源自良好表達的解脂西洋蓍黴LIP2(LIP2pre)的分泌信號替代。LIP2pre序列通過將合成寡核苷酸LIP2prefWGATCCATGAAGCTTTCCACCATCCTCTTCACAGCCTGCGCTACCCTGGCCGCGGTAC(SEQIDNO:66)和Lip2preprorvGTACCGGCCGGCCGCTTCTGGAGAACTGCGGCCTCAGAAGGAGTGATGGGGGAAGGGAGGGCGGC(SEQIDNO:67)雜交來製備並將所述DNA克隆入pYLHmA載體(在BamHI/Avrl1位點)，產生以下構建體pYLHUdL2pre。使用寡核苷酸ManHDELEco47IHfw(GGCAGCGCTACAAAACGTGGATCTCCCAAC(SEQIDNO:68》和ManHDELAvrIIrv(GGCCCTAGGTTACAACTCGTCGTGAGCAAG(SEQIDNO:69))從pGAPZMFManHDELPCR擴增了ManHDEL編碼序列，並將該序列克隆入pYLHUdL2pre。所述構建策略示於圖25。在用Notl消化質粒並分離正確片段(見上)之後將所述表達盒(具有在組成型啟動子hp4d調控下的L2preManHDEL)轉化至解脂西洋蓍黴Aochl菌株。經由DSAFACE分析從分泌蛋白衍生的聚糖。發生了一些Man8GlcNAc2向Man5GlcNAc2的轉化，但是所述反應是不完全的(存在Mari8GlcNAc2以及中間產物Man7GlcNAcjpMan6GlcNAc2;圖26)。為了進一步改進將Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2和Man6GlcNAc2剪切成Man5GlcNAc2,將所述裡氏木黴a-1,2甘露糖苷酶針對在解脂西洋蓍黴中的表達進行密碼子優化(SEQIDNO:9;圖42)並與LIP2前信號序列融合。將這種融合構建體在4中不同的啟動子調控下表達(i)hp4d,(ii)GAP(SEQIDNO:10;圖43),(iii)POX2,和(iv)TEF1。將最終的表達質粒命名為pYLHUXdL2preManHDEL(SEQIDNO:11;圖44A-C)pYLGUXdL2preManHDEL(SEQIDNO:12;圖45A-)pYLPUXdL2preManHDEL(SEQIDNO:13;圖46A-C)pYLTUXdL2preManHDEL(SEQIDNO:14;圖47A-C)。在用Notl切割質粒並分離含有ManHDEL表達盒的片段之後，將全部4種質粒轉化至解脂西洋蓍黴MTLY60AocW菌抹(在實施例2中描述)。將具有在hp4d、GAP和TEF啟動子調控下的ManHDEL(質粒pYLHUXdL2preManHDEL、pYLGUXdL2preManHDEL和pYLTUXdL2preManHDEL)的轉化菌林培養在YPD中。通過DSAFACE分析從轉化菌抹的分泌蛋白原生的聚糖。結果示於圖48。或者，將轉化體(包括整合了pYLPUXdL2preManHDEL質粒的轉化體)培養在含有油酸的培養基中(蛋白質產生條件)，並通過DSA-FACE分析聚糖。有關所述載體之一pYLTUXdL2preManHDEL的數據示於圖49。從所述數據中能夠總結出，通過48小時的培養，幾乎全部聚糖轉化成Man5GlcNAc2。實施例12.用於受P0X2啟動子調控的基因表達的培養條件培養始於新鮮平;^反的單菌落，並且在50mL管中的10mLYPD中於28。C在定軌搖床上以250rpm過夜培養。然後，用所述預培養物以0.2的最終OD600接種含有22mL生產培養基(productionmedium)(包括2.5mL油酸乳劑)的250mL搖瓶。將這種培養物在28°C在定軌搖床上以250rpm溫育。在96小時過程中在不同時間點取培養物的樣品。油酸乳劑(20%)按照如下方法製備向無菌50ml容器加入20ml無菌水j5ml油酸；和125|alTween40。導致乳劑形成的超聲處理在75Hz進行1分鐘。生產培養基由如下組成1%酵母提取物；2%胰蛋白腖；1%葡萄糖；和50mM磷酸鹽pH6.8。實施例13:人葡糖腦芬酯酶的表達按照為了在解脂西洋蓍黴中的表達而經密碼子優化的cDNA(SEQIDNO:15;圖50)以化學方法合成了人葡糖腦苷酯酶(GLCM,SwissProt條目號P0楊2)。將成熟蛋白的編碼序列融合至LIP2前信號序列的編碼序列。將這種融合構建體克隆在油酸誘導型POX2啟動子的調控下。將所得質粒命名為pYLPUXL2preGLCM(=pRAN21))。在轉化之前，將質粒用Notl消化並且將含有所述表達盒的片段分離並轉化至解脂西洋蓍黴菌林MTLY60、MTLY60AocW(上文實施例2中描述)，和MTLY60AocWManHDEL(實施例11中描述)。將在這三種菌抹中獲得的轉化體如實施例12中所述培養。如上所述將蛋白質從上清液沉澱，進行SDS-PAGE並使用大鼠單克隆抗葡糖腦香西旨酶抗體進行免疫印跡(Alessandrini等(2004)J.Invest.Dermatol23(6):1030-6)。示例性免疫一進分析示於圖51。從圖51可以認識到在破壞了ochl的菌抹中沒有出現拖尾(泳道1、2和3),而在WT細胞中作為拖尾觀察到了蛋白質的異質性(泳道4和6)。在獲得自表達ManHDEL的酵母菌抹的蛋白質中沒有觀察到蛋白質拖尾。這些結果證明使用遺傳工程化的解脂西洋蓍黴細胞MTLY60Aochl和MTLY60AochlManHDEL能夠獲得更均質的目標蛋白群體。實施例14:人促紅細胞生成素的表達以化學方法合成針對在解脂西洋蓍黴中表達而經密碼子優化的編碼人促紅細胞生成素(Epo，SwissProt條目號P01588)的cDNA(SEQIDNO:16;圖52)。將所述成熟蛋白的cDNA編碼序列與LIP2前信號序列的編碼序列融合。將這種融合構建體克隆在油酸誘導型POX2啟動子的調控下。將所得質粒命名為pYLPUXL2prehuEPO。在轉化之前將質粒用Notl切割並將含有表達盒的片段分離並轉化至解脂西洋蓍黴菌抹MTLY60AocW(在實施例2中描述)。將轉化體候選如實施例12中所述培養，並通在使用來自R&D系統的單克隆小鼠抗人Epo抗體(克隆AE7A5)進行SDSPAGE之後通過Western印跡分析分泌的蛋白質。獲得自所述細胞的EPO產物展現了非常均質的糖基化。實施例15:人的a-半乳糖香酶A的表達按照為了在解脂西洋蓍黴中表達而經密碼子優化的cDNA(SEQIDNO:17;圖53)以化學方法合成了人a-半乳糖苷酶A(AGAL,SwissProt條目號P06280)編碼cDNA。將成熟蛋白的cDNA編碼序列與LIP2前信號序列的編碼序列融合。將這種融合構建體克隆在油酸誘導型POX2啟動子的調控下。將所得質粒命名為pYLPUXL2preaGalase。在轉化之前將所述質粒用Notl切割並且將含有所述表達盒的片段分離並轉化至解脂西洋蓍黴菌抹MTLY60和MTLY60Aoc/z/MMW(在實施例4中描述)。將在這兩種菌抹中獲得的轉化體如實施例12中所述培養。在SDS-PAGE分析之後通過免疫印跡分析獲得自轉化體的胞外蛋白。使用對a-半乳糖普酶A特異性的抗體(獲得自Abeam的雞多克隆抗體(ab28962)和獲得自SantaCmzBiotechnology的兔多克隆抗體(sc-25823))檢測表達的人a-半乳糖苦酶A蛋白。實施例16.甘露糖苷酶在WT解脂西洋蓍黴中的表達為了測定單獨的甘露糖苷酶HDEL的表達是否能夠導致對真菌細胞表達的蛋白質更均質的糖基化，將含有編碼甘露糖苷酶HDEL的核酸的表達盒(參見實施例ll)轉化入野生型解脂西洋蓍黴pold細胞。通過DSA-FACE分析從獲得自所述細胞的分泌蛋白衍生的聚糖(圖55)。經分析的聚糖主要由MansGlcNAc2和小部分的Mari6GlcNAc2組成。這些結果證明，在缺乏對OCH1基因的任何破壞的條件下，單獨的甘露糖苷酶HDEL的表達導致對解脂西洋蓍黴表達的蛋白質更均質的糖基化。其它實施方案儘管以結合本發明的詳述描述了本發明，但前文所述意在進行示例說明而非對本發明的範圍進行限制，本發明的範圍由隨附權利要求的範圍限定。其它方面、優勢和修飾形式在隨附權利要求的範圍之內。權利要求1.產生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括提供解脂西洋蓍黴或Arxulaadeninivorans細胞，所述細胞經遺傳工程化而包含至少一種經修飾的N-糖基化活性；和向細胞中引入編碼目標蛋白的核酸，其中所述細胞以改變的糖基化形式產生所述目標蛋白。2.權利要求1的方法，還包括分離所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式。3.權利要求1或2的方法，其中所述目標蛋白是外源蛋白。4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述目標蛋白是內源蛋白。5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述目標蛋白是哺乳動物蛋白。6.權利要求5的方法，其中所述目標蛋白是人蛋白。7.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述目標蛋白是病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細胞因子、趨化因子、抗體或其抗原結合片段，或融合蛋白。8.權利要求7的方法，其中所述融合蛋白是病原體蛋白、溶酶體蛋白、生長因子、細胞因子或趨化因子與抗體或其抗原結合片段的融合物。9.權利要求1-8中任一項的方法，其中所述目標蛋白是與溶酶體貯積病(LSD)相關的蛋白質。10.權利要求1-9中任一項的方法，其中所述目標蛋白是葡糖腦苷酯酶或半乳糖腦苷酯酶。11.權利要求1-9中任一項的方法，其中所述目標蛋白選自下組a-L-艾杜糖苷酸酶、P-D-半乳糖苷酶、(3-葡糖苷酶、j3-己糖胺酶、p-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙醯半乳糖胺酶、天冬氨醯葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖苷-N-乙醯轉移酶、p-D-葡糖醛酸酶、透明質酸酶、a-L-甘露糖苷酶、a-神經氨酸酶、磷酸轉移酶、酸性脂肪酶、酸性神經醯胺酶、鞘磷脂酶、^L酯酶、組織蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。12.權利要求1-11中任一項的方法，其中所述改變的N-糖基化形式包括一種或多種N-聚糖結構。13.權利要求12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是MansGlcNAc2。14.權利要求12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Mari8GlcNAc2。15.權利要求12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Mari9GlcNAc2。16.權利要求12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Mari3GlcNAc2。17.權利要求12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Glc,Mari5GlcNAc2。18.權利要求12的方法，其中所述一種或多種N-聚糖是Glc2Man5GlcNAc2。19.權利要求12-18中任一項的方法，其中所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式是均質的。20.權利要求12-18中任一項的方法，其中所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式基本上是均質的。21.權利要求20的方法，其中含有改變的糖基化的改變的目標分子之部分是至少約20%。22.權利要求20的方法，其中含有改變的糖基化的改變的目標分子之部分是至少約30%。23.權利要求20的方法，其中含有改變的糖基化的改變的目標分子之部分是至少約40%。24.權利要求19-23中任一項的方法,其中所述改變的糖基化是Man5GlcNAc2。25.權利要求19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是Man8GlcNAc2。26.權利要求19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是Man9GlcNAc2。27.權利要求19-23中任一項的方法，,其中所述改變的糖基化是Man3GlcNAc2。28.權利要求19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是Glc'Man5GlcNAc2。29.權利要求19-23中任一項的方法，其中所述改變的糖基化是Glc2Man5GlcNAc2。30.權利要求1-29中任一項的方法，其中所述細胞經遺傳工程化而缺乏至少一種N-糖基化活性。31.權利要求30的方法，其中N-糖基化活性是ALG3活性。32.權利要求30的方法，其中N-糖基化活性是OCHl活性。33.權利要求30的方法，其中N-糖基化活性是MNS1活性。34.權利要求30的方法，其中N-糖基化活性是MNN9活性。35.權利要求1-34中任一項的方法，其中所述至少一種修飾包含缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的基因。36.權利要求1-35中任一項的方法，其中所述至少一種修飾包含表達具有N-糖基化活性的蛋白質的突變形式。37.權利要求1-36中任一項的方法，其中所述至少一種修"沛包含引入或表達RNA分子，所述RNA分子幹擾具有N-糖基化活性的蛋白質的功能性表達。38.權利要求1-37中任一項的方法，其中所述至少一種修飾包含表達具有N-糖基化活性的蛋白質。39.權利要求38的方法，其中所述表達的蛋白質是由細胞中的外源核酸編碼的蛋白質。40.權利要求38的方法，其中所述N-糖基化活性是葡萄糖基轉移酶活性。41.權利要求38-40中任一項的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是ALG6。42.權利要求38的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是a-甘露糖苷酶。43.權利要求38的方法，其中所述a-甘露糖苷酶靶向內質網。44.權利要求42或43的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是融合蛋白，所述融合蛋白包含a-甘露糖苷酶多肽和HDEL內質網保留肽。45.權利要求42的方法，其中所述a-甘露糖苷酶具有5.1以下的最適pll。46.權利要求38的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是能夠從Man5GlcNAc2去除葡萄糖殘基的蛋白質。47.權利要求38或46的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是具有a-l,3-葡糖苷酶活性的蛋白質。48.權利要求46或47的方法，其中所述蛋白質是葡糖苷酶II。49.權利要求46-48中任一項的方法，其中所述蛋白質包含葡糖香酶II的ct和/或卩亞基。50.權利要求46的方法，其中所述蛋白質是變聚糖酶。51.權利要求1的方法，其中所迷細胞經遺傳工程化而包含至少兩種經修飾的N-糖基化活性。52.權利要求51的方法，其中所述至少兩種經修飾的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏和升高的ALG6活性水平。53.權利要求1的方法，其中所述細胞經遺傳工程化而包含至少三種經修飾的N-糖基化活性。54.權利要求51的方法，其中所述至少三種經修飾的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏；升高的ALG6活性水平；和升高的葡糖苷酶II活性水平。55.權利要求38-54中任一項的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是外源蛋白。56.權利要求38-54中任一項的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是哺乳動物蛋白。57.權利要求56的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是人蛋白。58.權利要求38-54中任一項的方法，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是低等真核生物蛋白。59.權利要求45的方法，其中所述低等真核生物是真菌、錐蟲或原生動物。60.權利要求58的方法，其中所述低等真核生物選自下組布氏錐蟲、哈茨木黴和麴黴屬。61.權利要求1-60中任一項的方法，其中修飾包含表達能夠影響目標蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質或其生物學活性變體。62.權利要求61的方法，其中所述能夠影響甘露糖基磷酸化的蛋白質或其生物學活性變體是MNN4。63.權利要求61的方法，其中所述能夠影響甘露糖基磷酸化的蛋白質或其生物學活性變體是PNOl。64.權利要求61的方法，其中所述能夠影響甘露糖基磷酸化的蛋白質或其生物學活性變體是MNN6。65.權利要求61-64中任一項的方法，其中糖蛋白中至少約30%的甘露糖殘基是磷酸化的。66.權利要求1-65中任一項的方法，其中所述細胞未經遺傳工程化而成為0CH1活性缺陷的。67.權利要求1-66中任一項的方法，還包括對糖蛋白的額外加工。68.權利要求67的方法，其中所述額外加工發生在體外。69.權利要求67的方法，其中所述額外加工發生在體內。70.4又利要求67-69中任一項的方法，其中所述額外加工包括向^務飾的糖蛋白添加異源模塊。71.權利要求55的方法，其中所述異源模塊是聚合物或載體。72.權利要求67-71中任一項的方法，其中所述額外加工包括對所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式進行酶處理或化學處理。73.權利要求67的方法，其中所述額外加工包括用甘露糖苷酶、甘露聚糖酶、磷酸二酯酶、葡糖苷酶或糖基轉移酶處理所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式。74.權利要求72的方法，其中所述額外加工包括用氫氟酸處理所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式。75.權利要求67-74中任一項的方法，其中所述額外加工包括將所述目標蛋白的改變的N-糖基化形式磷S吏化。76.具有改變的N-糖基化的分離的蛋白質，其中所述蛋白質是通過權利要求1-75中任一項的方法產生的。77.分離的解脂西洋蓍黴或v4ra"/a"A"/"/wnmy細胞，所述細胞經遺傳工程化而包含至少一種經修飾的N-糖基化活性。78.權利要求77的分離的細胞，其中N-糖基化活性是ALG3活性。79.權利要求77或78的分離的細胞，其中N-糖基化活性是0CH1活性。80.權利要求77-79中任一項的分離的細胞，其中N-糖基化活性是MNS1活性。81.權利要求77-79中任一項的分離的細胞，其中N-糖基化活性是MNN9活性。82.權利要求77-79中任一項的分離的細胞，其中所述修飾包含缺失編碼具有N-糖基化活性的蛋白質的基因。83.權利要求77-79中任一項的分離的細胞，其中所述修飾包含表達具有N-糖基化活性的蛋白質的突變形式。84.權利要求77-83中任一項的分離的細胞，其中所述修飾包含引入或表達RNA分子，所述RNA分子幹擾具有N-糖基化活性的蛋白質的功能性表達。85.權利要求77-83中任一項的分離的細胞，其中所迷修飾包含表達具有N-糖基化活性的蛋白質。86.權利要求85的分離的細胞，其中所述N-糖基化活性是葡萄糖基轉移酶活性。87.權利要求85或86的分離的細胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是ALG6。88.權利要求85的分離的細胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是a-甘露糖苷酶。89.權利要求88的分離的細胞，其中所述oc-甘露糖苷酶靶向內質網。90.權利要求88或89的分離的細胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是融合蛋白，所述融合蛋白包含a-甘露糖苷酶多肽和HDEL內質網保留肽。91.權利要求85的分離的細胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是能夠從Man5GlcNAc2去除葡萄糖殘基的蛋白質。92.權利要求85或91的分離的細胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是具有a-l,3-葡糖苷酶活性的蛋白質。93.權利要求91或92的分離的細胞，其中所述蛋白質是葡糖苷酶II。94.權利要求91-93中任一項的分離的細胞，其中所述蛋白質包含葡糖苦酶II的a和/或(3亞基。95.權利要求91的分離的細胞，其中所述蛋白質是變聚糖酶。96.權利要求77-95中任一項的分離的細胞，其中所述細胞經遺傳工程化而包含至少兩種經修飾的N-糖基化活性。97.權利要求96的分離的細胞，其中所述至少兩種經修飾的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏和升高的ALG6活性水平。98.權利要求77-97中任一項的分離的細胞，其中所述細胞經遺傳工程化而包含至少三種經修飾的N-糖基化活性。99.權利要求98的分離的細胞，其中至少三種經修飾的N-糖基化活性包含ALG3活性的缺乏；升高的ALG6活性水平；和升高的葡糖普酶II活性水平。100.利要求77-99中任一項的分離的細胞，其中所述細胞未經遺傳工程化而成為0CH1活性缺陷的。101.權利要求85-100中任一項的分離的細胞，其中所述具有N-糖基化活性的蛋白質是人蛋白。102.利要求77-101中任一項的分離的細胞，其中所述修飾包含表達能夠促進經修飾的糖蛋白的甘露糖基磷酸化的蛋白質或其生物學活性變體。103.權利要求102的分離的細胞，其中所述能夠影響甘露糖基磷酸化的蛋白質或其生物學活性變體是MNN4。104.權利要求103的分離的細胞，其中所述影響甘露糖基磷酸化的蛋白質或其生物學活性變體是PNOl。105.—種治療病症的方法，所述病症可以通過施用具有改變的N-糖基化的蛋白質來治療，所述方法包括向受試者施用權利要求76的蛋白質，其中所述受試者是患有或疑似患有可以通過施用具有改變的N-糖基化的蛋白質來治療的受試者。106.權利要求105的方法，其中所述病症是代謝紊亂。107.權利要求106的方法，其中所述代謝紊亂是溶酶體貯積病(LSD)。108.權利要求107的方法，其中溶酶體貯積病是高歇爾氏病、泰-沙二氏病、旁姆普氏病、尼-皮二氏病或法布裡氏病。109.權利要求105-108中任一項的方法，其中所述蛋白質是與LSD相關的蛋白質。110.權利要求109的方法，其中所述蛋白質是葡糖腦苷酯酶或a-半乳糖苷酶。111.權利要求I09的方法，其中所述蛋白質選自下組a-L-艾杜糖苷酸酶、p-D-半乳糖苷酶、P-葡糖苷酶、P-己糖胺酶、P-D-甘露糖苷酶、a-L-巖藻糖普酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、a-N-乙醯半乳糖胺酶、天冬氨醯葡糖胺酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、a-氨基葡糖脊-N-乙醯轉移酶、(3-D-葡糖醛酸酶、透明質酸酶、a-L-甘露糖苷酶、a-神經氨酸酶、磷酸轉移酶、酸性脂肪酶、酸性神經醯胺酶、鞘磷脂酶、硫酯酶、組織蛋白酶K和脂蛋白脂肪酶。112.權利要求105-111中任一項的方法，其還包括確定所述受試者是否患有可以通過施用具有改變的N-糖基化的蛋白質來治療的疾病。113.權利要求105-112中任一項的方法，其中所述受試者是人。114.產生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括使目標蛋白與製備自解脂西洋蓍黴或Jrx"/a^fem'm'vorara細胞的細胞裂解物接觸，所述細胞經遺傳工程化而包含至少一種經修飾的N-糖基化活性，其中使所述.目標蛋白與所述細胞裂解物接觸導致該目標蛋白的改變的N-糖基化形式。115.產生目標蛋白的改變的N-糖基化形式的方法，所述方法包括使目標蛋白與一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質接觸，其中所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質獲得自解脂西洋蓍黴或Aw/aacfem'm'vorara細胞，所述細胞經遺傳工程化而包含至少一種經修飾的N-糖基化活性，並且其中使所述目標分子與所述一種或多種具有N-糖基化活性的蛋白質接觸導致該目標蛋白的改變的N-糖基化形式。116.解脂西洋蓍黴或Jnro/Gacfem'm'vorara細胞的基本上純的培養物，所述培養物中的大量經遺傳工程化而包含至少一種經修飾的N-糖基化活性。117.權利要求87的基本上純的細胞培養物，其中所述細胞培養物含有一種或多種細胞亞群，每個亞群包含不同的經修飾的糖基化活性。118.分離的核苷酸序列，其包含SEQIDNO:l或SEQIDNO:2。119.分離的核苷酸序列，其包含與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2至少80%相同的序列。120.由權利要求118或119的分離的核苷酸序列編碼的多肽。121.分離的核酸，其包含(a)核苷S交序列，其在高嚴緊條件下與SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的補體雜交；或(b)所述核苦酸序列的補體。122.包含權利要求118-121中任一項的核酸序列的載體。123.包含權利要求118-121中任一項的核酸序列的表達載體。124.包含權利要求123的表達載體的培養的細胞或所述細胞的子代，其中所述細胞表達所述多肽。125.產生蛋白質的方法，所述方法包括在允許表達所述多肽的條件下培養權利要求124的細胞。126.權利要求125的方法，其還包括在培養細胞之後，從細胞或培養細胞的培養基分離多肽。全文摘要本文描述的是可用於產生目標分子的改變的N-糖基化形式的方法和遺傳工程化細胞。還描述用於治療多種病症例如代謝紊亂的方法和N-糖基化改變的分子。文檔編號C12N9/10GK101680014SQ200880018736公開日2010年3月24日申請日期2008年4月3日優先權日2007年4月3日發明者卡倫·J·馬塞爾德波爾克,史蒂文·C·J·蓋森斯,尼科·L·M·卡爾沃爾特,沃特·弗維肯,芒娜·古爾法爾申請人:奧克西雷恩(英國)有限公司