用於發現改變靶蛋白穩定性的療法的方法與流程
2023-04-26 15:11:32 2
相關申請案
本申請案主張根據2014年10月10日提交的美國臨時申請案ussn62/062,257的35u.s.c.§119(e)的權益，其全部內容以引用的方式併入本文中。
聯邦政府資助的研究
本發明根據美國國立衛生研究院授予的2r01ca068490-19和2r01ca076120-13在政府支持下進行。政府擁有本發明中的某些權利。
背景技術：
報導基因測定已經在製藥和生物技術工業中常規地使用以識別影響蛋白功能的前導化合物。在近十年中，化學家在短時間內通過如組合化學反應的技術合成大量化學化合物能力已大大提高，並且常常需要篩選數千到數百萬的化合物以識別對所關注蛋白質具有期望效應的那些化合物。
通常，報導基因測定測量在樣品中一種報導基因蛋白的活性，但是可結合多種報導基因。用於共表達多種報導基因的一個策略涉及雙順反子構建體的設計，其中通過內部核糖體進入位點(ires)序列分隔開的兩種基因在常見上遊啟動子的控制下表達為單個轉錄盒(或雙順反子轉錄)(延(yen)等人，《科學(science.)》2008年11月7日；322(5903)：918-23)。插入ires序列充當用於有效的帽獨立性內部翻譯起始的核糖體結合位點。此設計實現具有ires引導的帽獨立性翻譯的兩種基因的轉錄。此系統允許在實驗處理時不期望改變的對照報導基因與在每個測試樣品中歸一化為所述對照的測試報導基因一起共表達。然而，相比於帽獨立性翻譯，在所述細胞中的許多擾動可差異地影響蓋獨立性翻譯。此外，一些ires已經示出顯示下遊基因的可變表達(王(wong)等人《基因療法(genether.)》2002年3月；9(5)：337-44)。這導致高的假陽性和不可靠的報導基因測定。因此，存在用於分析蛋白穩定性的有效的高通量方法的需要，其中報導基因活性的非特異性變異用於控制在細胞類蛋白穩定性測定中的固有變化。這使得降低有效且高效地運行hts測定所需要的數據中的錯誤。
技術實現要素：
在一些方面，本公開涉及可用於在特異性擾動之後有效監測數千蛋白的穩定性的質粒的開發。
根據一些方面，本公開提供一種識別使所關注蛋白穩定或使其不穩定的測試化合物的方法，所述方法包括：
(i)使包括dna質粒的轉化的宿主細胞與測試化合物接觸，其中所述質粒包括以可操作連接的
(a)啟動子，
(b)第一內部核糖體進入位點(ires)；
(c)編碼第一報導基因蛋白的核苷酸序列；
(d)第二ires；以及
(e)編碼第二報導基因蛋白的核苷酸序列，
其中開放閱讀框(orf)融合到編碼第一報導基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到編碼第二報導基因蛋白的所述核苷酸序列，並且其中所述開放閱讀框編碼所關注蛋白；
(ii)在所述測試化合物的存在和不存在所述測試化合物下確定融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的比率；以及
(iii)當所述在測試化合物存在下融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的所述比率與在不存在所述測試化合物的情況下融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的所述比率相比增加時，將所述測試化合物識別為穩定劑，而當在所述測試化合物存在下融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的所述比率與在不存在所述測試化合物的情況下融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的所述比率相比降低時，將所述測試化合物識別為去穩定劑。
在一些實施例中，所述第一和第二報導基因蛋白具有可區分的可檢測報導基因信號。在一些實施例中，所述第一和第二報導基因蛋白為具有由其產物產生的可區分信號的酶蛋白。在一些實施例中，所述第一和第二報導基因蛋白為具有可區分的生物發光信號的生物發光蛋白。在一些實施例中，所述第一和第二報導基因蛋白為具有可區分的螢光信號的螢光蛋白。在一些實施例中，所述第一和第二報導基因蛋白選自由海腎螢光素酶(rluc)和螢火蟲螢光素酶(fluc)組成的群組。在一些實施例中，所述第一和第二報導基因蛋白選自由綠色螢光蛋白和紅色螢光蛋白組成的群組。在一些實施例中，所述啟動子為真核啟動子或合成啟動子。在一些實施例中，所述啟動子包括巨細胞病毒(cmv)啟動子。在一些實施例中，所述開放閱讀框來源於生物體的orfeome。在一些實施例中，所述開放閱讀框編碼癌蛋白。在一些實施例中，所述癌蛋白選自由以下組成的群組：myc、ikaros家族鋅指蛋白1(ikzf1)、ikaros家族鋅指蛋白3(ikzf3)、幹擾素調節因子4(irf4)、突變體p53、n-ras、c-fos和c-jun。在一些實施例中，使包括所述質粒的轉化的宿主細胞與測試化合物接觸包括在所述測試化合物存在下使所述轉化的宿主細胞生長適當的時間。
本發明的所述實施例和方面中的每個可獨立或組合實踐。此外，本文所用的措詞和術語是出於描述的目的並且不應被視為是限制性的。本文「包含」、「包括」或「具有」、「含有」、「涉及」以及其變體的使用意指涵蓋在其後所列舉的所述項目和其等效物以及額外項目。
參考具體實施方式，本發明的這些和其它方面以及各種優點和效用將變得顯而易見。本發明的每個方面可涵蓋如將被理解的各種實施例。
在本申請案中識別的所有文獻以其全文引用的方式併入本文中。
附圖說明
附圖並不打算按比例繪製。在附圖中，不同的圖中所說明的每個相同或幾乎相同的組件由類似數字表示。為了清楚的目的，可能不在每一個附圖中標記每一個組件。在附圖中：
圖1確認在293ft和hela細胞中的pirigf構建體表達(圖1a至1c)和在u-2os細胞中的pug-firp構建體表達(圖1d)。測試若干不同形式的哺乳動物和慢病毒質粒構建體的產生表達標記的靶蛋白(例如螢火蟲或nanoluc標籤)和共表達報導基因螢光素酶(例如海腎或螢火蟲)的細胞(例如293ft、hela或u-2os細胞)的能力。
在圖2中，293ft和hela細胞用ikzf1-螢火蟲、ikzf3-螢火蟲和myc-螢火蟲融合蛋白轉染並且分別使用嘌呤黴素和遺傳黴素選擇。這些集合體非常不穩定並且在10到30天中丟失信號並且通常對imid具有極小應答(圖2a至2c)。因此，使用有限的克隆策略在96孔板中分離單個克隆。存活的細胞被分離為菌落，進一步擴增並且測試螢光素酶信號和對imid的應答。克隆2b4被識別為對來那度胺的強應答者。hela細胞表達非常低水平的螢光素酶，這使hela克隆的分離非常困難。通過對螢火蟲、ikzf1和myc的蛋白質印跡的檢測確認所述融合蛋白的表達和與螢火蟲螢光素酶信號相關的相對表達(圖2d)。
在圖3中表達指定螢火蟲融合蛋白的細胞系克隆(ikzf1-2b4、ikzf1-2b11、myc-1c3和myc-5f2)在dual-glo測定中評估再現性。imid的效能和螢火蟲螢光素酶信號的相對降低確認期望的應答並且產生具有足夠用於篩選的z'值的數據(圖3a至3d)。
圖4示出了對於ikzf12b4細胞-活性化合物(prestwick收集；圖4a)和nci收集；圖4b)的試驗性篩選結果。
圖5示出了對於myc5f2細胞-活性化合物nci收集)的試驗性篩選結果。
圖6確認在ikzf12b4和myc5f2細胞系(圖6a至6c)上測試命中物。來自市售化合物和來自dtp化合物的概述重複測試數據在圖6d至6e中示出。
圖7示出了使用蛋白質印跡的確認數據。ikzf12b4細胞系實例(圖7a至7b)、myc5f2實例(圖7c)。
圖8示出了hsp90抑制劑的進一步評估。圖8a表明在用myc-螢火蟲融合蛋白暫時轉染的細胞上的hsp90抑制劑cct018159和格爾德黴素的測試。圖8b示出了在穩定表達myc-螢火蟲融合蛋白的293ft細胞上的hsp90抑制劑cct018159和格爾德黴素的測試。圖8c示出了在穩定表達myc-螢火蟲融合蛋白的5種不同細胞系上的若干hsp-90抑制劑在各種劑量下的測試。圖8d比較在暫時表達ikzf1-螢火蟲融合蛋白的293ft細胞上的所述hsp90抑制劑biib021和泊馬度胺。
圖9示出了iccb篩選結果的概貌圖。具體地說，它示出了用於ikzf1iccb篩選的最佳挑選重複試驗。
圖10示出了比較ikzf1對myc細胞系的活性。測試在ikzf1和myc細胞系中的133種最佳挑選。
圖11示出了在16小時對於hsp90抑制劑：biib021(圖11a)和pf-04929113(圖11b)的較好劑量應答。
圖12示出了在包含環己醯胺未標記的螢光素酶(圖12a)和環己醯胺標記的螢光素酶(圖12b)的7種myc細胞系上的環己醯胺時程。
圖13示出了在包含mg-132標記的螢光素酶(圖13a)和mg-132未標記的螢光素酶(圖13b)的7種myc細胞系上的mg132時程。
圖14示出了在包含mln4924標記的螢光素酶(圖14a)和mln4924未標記的螢光素酶(圖14b)的7種myc細胞系上的mln4924時程。
圖15示出了在用針對mycmrna的sirna處理48小時的myc阻斷基因表現之後的a549-myc-螢火蟲和h1299-myc-螢火蟲蛋白質印跡確認。如通過具有myc和螢火蟲導入抗體的蛋白質印跡觀察，融合蛋白的降低(圖15a)與螢光素酶信號的降低(圖15b)比較。myc抗體還檢測內源性myc的降低。
圖16示出了來自針對包含表達myc-螢火蟲的a549(圖16a)、h1299(圖16b)和hek293t(圖16c)細胞和表達myc-nanoluc的u2os(圖16d)細胞的dub酶家族的sirna的商業文庫的篩選結果。
具體實施方式
在一些方面，本公開基於可用於在特異性擾動之後有效監測數千蛋白的穩定性的所述質粒的開發。所述質粒允許兩種報導基因蛋白的所述共表達，其中的每種處於ires的控制下。以此方式，兩種報導基因一起被轉錄(即由相同mrna編碼)並且兩者均使用ires翻譯。這將由差異地影響ires依賴性與ires獨立性翻譯的擾動(例如化合物)引起的所述兩種報導基因的比率的偽改變的問題最小化，並且因此將假陽性最小化。
根據一些方面，本公開提供一種識別使所關注蛋白穩定或使其不穩定的測試化合物的方法。所述方法包括
(i)使包括dna質粒的轉化的宿主細胞與測試化合物接觸，其中所述質粒包括以可操作連接的
(a)啟動子，
(b)第一內部核糖體進入位點(ires)；
(c)編碼第一報導基因蛋白的核苷酸序列；
(d)第二ires；以及
(e)編碼第二報導基因蛋白的核苷酸序列，
其中開放閱讀框(orf)融合到編碼第一報導基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到編碼第二報導基因蛋白的所述核苷酸序列，並且其中所述開放閱讀框編碼所關注蛋白；
(ii)在所述測試化合物的存在和不存在所述測試化合物下確定融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的比率；以及
(iii)當在所述測試化合物存在下融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的所述比率與在不存在所述測試化合物的情況下融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的所述比率相比增加時，將所述測試化合物識別作為穩定劑，而當在所述測試化合物存在下融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的所述比率與在不存在所述測試化合物的情況下融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的比率相比降低時，將所述測試化合物識別為去穩定劑。
如本文所用，「可操作連接」是指在兩種核酸序列，如轉錄控制元件(例如啟動子)和連接的經轉錄序列之間的功能連接。因此，啟動子如果可調節基因的轉錄，那麼它與基因處於可操作連接中。
如本文所使用，「啟動子」通常含有提供用於rna聚合酶的結合位點和用於發生轉錄的轉錄因子的特異性dna序列(響應性元件)。在一些實施例中，啟動子為真核啟動子或合成啟動子。啟動子的實例包含但不限於tata盒、來自猿猴病毒40的sv40晚期啟動子、巨細胞病毒(cmv)啟動子、泛素c啟動子(ubc啟動子)和t7啟動子。這些和其它啟動子序列是在本領域中是眾所周知的。在本發明的一個實例中，啟動子為cmv啟動子。在本發明的一個實例中，啟動子為ubc啟動子。
如本文所用，「內部核糖體進入位點」或「ires」為調節在rna分子上的核糖體的內部進入並且由此調節在真核系統中的翻譯的順式作用核酸元件。在本發明的所述方法和組合物中，第一與第二ires元件包含於所述質粒中。所述第一和第二ires元件允許獨立翻譯編碼報導基因蛋白的核苷酸序列並且開放閱讀框融合到編碼來自單個信使rna的另一報導基因蛋白的核苷酸序列。在一些實施例中，所述第一和第二ires相同(即，它們具有相同序列)。在一些實施例中，所述第一和第二ires是不相同的(即，它們不具有相同序列)。
許多ires元件已經在病毒和真核基因組兩者中識別。此外，也已開發合成ires元件。例如，ires元件已經發現於多種病毒中，包含以下病毒屬的成員：腸病毒屬(例如人類脊髓灰質炎病毒1(石井(ishii)等人(1998)《病毒學雜誌(jvirol.)》72：2398-405和白(shiroki)等人(1997)《病毒學雜誌》77：1-8)、人類b型柯薩奇病毒)；鼻病毒(例如人類鼻病毒)；肝病毒(a型肝炎病毒)；心病毒屬(腦心肌炎病毒ecmv(基因庫寄存編號ab041927的核苷酸2137-2752和金(kim)等人(1992)《分子細胞生物學(molcellbiology)》72：3636-43)和泰勒腦脊髓炎病毒(etheirler'sencephalomyelitisvirus))；口蹄疫病毒屬(口蹄疫病毒(基因庫寄存編號af308157的核苷酸600-1058；貝爾斯罕(belsham)等人(1990)《歐洲分子生物學學會(embo)》77：1105-10；貝利(poyry)等人(2001)rna7：647-60；以及斯通利(stoneley)等人(2000)《核酸研究(nucleicacidresearch)》25：687-94)，a型馬鼻炎病毒、馬b型鼻炎)；瘟病毒屬(例如牛病毒腹瀉病毒(普爾(poole)等人(1995)《病毒學(virology)》206：150-154)和典型豬瘟病毒(萊茵布蘭(rijnbrand)等人(1997)《病毒學雜誌》77：451-7)；C型肝炎病毒屬(例如c型肝炎病毒(冢山-小原(tsukiyama-kohara)等人(1992)《病毒學雜誌》66：1476-1483，萊蒙(lemon)等人(1997)《病毒學研討會(semin.virol.)》5：274-288，和基因庫登錄號aj242654的核苷酸1201-1812)和gb病毒b)。這些參考文獻中的每個均以引用方式併入本文中。
ires元件也已在來自逆轉錄病毒科的病毒中發現，其包含慢病毒科的成員(例如猿猴免疫缺乏病毒(奧爾曼(ohlmann)等人(2000)《生物化學雜誌(journalofbiologicalchemistry)》275:11899-906)和人類免疫缺陷病毒1(巴克(buck)等人(2001)《病毒學雜誌》75:181-91)；blv-htlv逆轉錄病毒(例如人類t親淋巴病毒1型(阿塔爾(attal)等人(1996)《eees快報(eeesletters)》392：220-4)；以及哺乳動物c型逆轉錄病毒家族(例如莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus)(華格納(vagner)等人(1995)《生物化學雜誌(j.biol.chem)》270：20316-83)，弗雲德鼠白血病病毒(friendmurineleukemiavirus)、哈維鼠肉瘤病毒(harveymurinesarcomavirus)，禽類網狀內皮組織增殖病毒(洛佩茲-拉斯特拉(lopez-lastra)等人(1997)《人類基因療法》5:1855-65)，鼠白血病病毒(環境rna)(迪福德(deffaud)等人(2000)《病毒學雜誌》74:846-50)，勞斯氏肉瘤病毒(roussarcomavirus)(迪福德等人(2000)《病毒學雜誌》74:11581-8)。這些參考文獻中的每個均以引用方式併入本文中。
真核mrna還含有ires元件，其包含例如bip(馬切亞克(macejak)等人(1991)《自然(nature)》355：91)；果蠅的觸角控制基因(外顯子d和e)(奧(oh)等人(1992)《基因和發展(genesanddevelopment)》6：1643-1653；c-myc；以及細胞凋亡的x鏈抑制劑(xiap)基因(美國專利第6,171,821號)。
已經產生各種合成ires元件。參見例如格雷戈裡(degregorio)等人(1999)《歐洲分子生物學雜誌(emboj.)》75：4865-74；歐文斯(owens)等人(2001)《美國國家科學院院刊(pnas)》4：1471-6；以及文卡特桑(venkatesan)等人(2001)《分子和細胞生物學(molecularandcellularbiology)》21：2826-37。對於本領域中已知的另外的ires元件參見例如rangueil.inserm.fr/iresdatabase。
在具體實施例中，ires序列來源於腦心肌炎病毒(ecmv)。
如本文所用，報導基因蛋白為當表達時可例如經由其螢光或酶活性特異性地檢測(即，當表達時具有可檢測信號)的任何蛋白。所述質粒包括編碼第一報導基因蛋白的核苷酸序列和編碼第二報導基因蛋白的核苷酸序列。開放閱讀框融合到編碼第一報導基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到編碼第二報導基因蛋白的所述核苷酸序列任一者。在一些實施例中，所述開放閱讀框融合到編碼第一報導基因蛋白的所述核苷酸序列。在一些實施例中，所述開放閱讀框融合到編碼第二報導基因蛋白的所述核苷酸序列。這允許人們研究響應於不同刺激的所述連接開放閱讀框的所述表達。如本文所用，「融合」旨在意指由所述orf編碼的所述胺基酸和所述報導基因蛋白通過肽鍵接合以產生連續的蛋白序列。因此，融合到所述開放閱讀框的所述報導基因蛋白充當所述融合的開放閱讀框的穩定性的標記。未融合到所述開放閱讀框的其它報導基因蛋白(並且因此不產生具有由所述orf編碼的所述胺基酸的連續蛋白序列)充當歸一化細胞數量和表達變化的內部對照。
通常，所述第一和第二報導基因蛋白具有可區分的可檢測報導基因信號。例如，所述第一和第二報導基因蛋白為具有由其產物產生的可區分的信號的酶蛋白。在一些實施例中，所述第一和第二報導基因蛋白為發射不同波長的光和/或利用不同底物的生物發光蛋白。另選地，所述第一和第二報導基因蛋白為在不同波長下發螢光的螢光蛋白。
可使用本領域中已知的許多報導基因蛋白，其包含但不限於生物發光蛋白、螢光報導基因蛋白和酶蛋白，如產生特異性可檢測產物的β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶和鹼性磷酸酶。所述螢光報導基因蛋白包含例如綠色螢光蛋白(gfp)、青色螢光蛋白(cfp)、紅色螢光蛋白(rfp)和黃色螢光蛋白(yfp)以及其改性的形式，例如增強的gfp(egfp)、增強的cfp(ecfp)、增強的rfp(erfp)、mcherry和增強的yep(eyep)。
生物發光蛋白如螢光素酶的實例，包含但不限於海腎螢光素酶(rluc)、螢火蟲螢光素酶(fluc)和nanoluc，在本領域中是已知的(參見例如範(fan),f.和伍德(wood),k.《測定和藥物發展技術(assayanddrugdevelopmenttechnologies)》v5#1(2007)；古普塔(gupta),r.等人《自然方法(naturemethods)》v8#10(2011)；nano-螢光素酶分析系統(普洛麥格(promega))和en.wikipedia.org/wiki/bioluminescence。
報導報導基因蛋白的其它非限制性實例在下文示出：
物質特異性螢光素酶特異性、所需輔因子和物理特性。
在一些實施例中，所述第一和第二報導基因蛋白選自由海腎螢光素酶(rluc)、螢火蟲螢光素酶(fluc)和nanoluc組成的所述群組。在一些實施例中，所述第一和第二報導基因蛋白選自由綠色螢光蛋白和紅色螢光蛋白組成的所述群組。
開放閱讀框融合到編碼第一報導基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到編碼第二報導基因蛋白的所述核苷酸序列任一者。所述開放閱讀框融合到所述核苷酸序列的5'或3'末端。如本文所用，開放閱讀框或orf是指編碼胺基酸的連續序列的核苷酸序列。翻譯的開放閱讀框可為編碼蛋白或所關注的多肽的基因的全部或一部分。
所述質粒的所述orf編碼所關注蛋白。如本文所用，「所關注蛋白」可為可被關注的任何可想像的多肽或蛋白，以便研究或以其它方式表徵。在一些實施例中，所述orf可來源於生物體的orfeome。完全orfeome含有編碼給定生物體的所有蛋白的核酸。完整的orfeome的代表性分數為至少60％的由所述生物體表達的所有蛋白。在一些實施例中，所述生物體為哺乳動物。在一些實施例中，所述哺乳動物為人類。
在一些實施例中，所關注的所述蛋白為人類多肽或蛋白。在一些實施例中，所關注的所述蛋白為癌蛋白，如但不限於ras、myc、src、fos、jun、myb、abl、bcl2、hox11、hox11l2、tal1/scl、lmol、lm02、egfr、mycn、mdm2、cdk4、gli1、igf2、egfr、flt3-itd、tp53、pax3、pax7、bcr/abl、her2neu、flt3r、flt3-itd、tan1、b-raf、e2a-pbx1，和npm-alk，以及pax和fkhr基因家族的成員的融合、wnt、myc、erkegfr、fgfr3、cdh5、kit、ret、幹擾素調節因子4(irf4)和trk。其它示範性致癌基因為本領域中眾所周知的並且若干此些實例描述於例如《人類癌症的基因基礎(thegeneticbasisofhumancancer)》(沃格斯坦(vogelstein),b.和凱澤(kinzler),k.w.編，麥格勞希爾集團(mcgraw-hill)，紐約(newyork,n.y.)，1998)。
在一些實施例中，所關注的所述蛋白為轉錄因子。此些轉錄因子的一些實例包含但不限於所述stat家族(stat1、2、3、4、5a、5b和6)、fos/jun、nfκb、hiv-tat和所述e2f家族。在一些實施例中，所關注的所述蛋白為ikaros家族鋅指蛋白。在一些實施例中，所關注的所述蛋白為ikzf1、ikzf2、ikzf3、ikzf4或ikzf5。在一些實施例中，所關注的所述蛋白為ikzf1或ikzf3。
編碼報導基因蛋白的所述核苷酸序列和所述融合的orf「在框內」，即，包括編碼所述報導基因蛋白的所述核苷酸序列的單個多核苷酸的連續三聯體密碼子，並且所述融合的開放閱讀框編碼單個連續的胺基酸序列。
本文所描述的方法允許人們篩選化合物的文庫和識別使所關注蛋白穩定或使其不穩定的測試化合物。化合物文庫為通常用於高通量篩選的存儲化合物的收集。所述文庫化合物可包含(例如)合成的有機分子、天然存在的有機分子、肽、多肽、核酸分子和其組分。化合物文庫的實例包含但不限於screen-化合物文庫(enzo生命科學(enzolifesciences))，express-pick收集和core文庫(化學橋(chembridge))，《國家癌症研究所文庫(nationalcancerinstitutelibrary)》，prestwickchemical和tocriscreen化合物文庫匯集(tocriscreencompoundlibrarycollections)。
本文所述的質粒可使用本領域中已知的任何可用的技術引入到所述宿主細胞。例如，所述質粒可通過脂質體轉染、磷酸鈣轉染、deae聚葡萄糖介導的轉染、電穿孔、轉導、聲致穿孔、感染和光學轉染引入到所述宿主細胞。合適的宿主細胞包含但不限於細菌細胞(例如大腸桿菌、枯草桿菌和鼠傷寒沙門氏菌)、酵母細胞(例如釀酒酵母和粟酒裂殖酵母)、植物細胞(例如菸草和陸地棉)，和哺乳動物細胞(例如cho細胞，和3t3成纖維細胞、hek293細胞、u-2os細胞)。
在一些實施例中，使用本文所述的質粒的轉化的宿主細胞與測試化合物接觸包括在存在所述測試化合物的情況下使所述轉化的宿主細胞在合適的培養條件下生長適當的時間。合適的培養條件(包含所述培養的持續時間)將根據所培養的所述細胞變化。然而，本領域技術人員可容易地通過以下標準協議確定所述培養條件，如《微生物學(microbiology)》學術出版社公司(academicpressinc.)中的系列方法所描述。通常，所述細胞培養基可含有以適當量和組合的以下營養物中的任一種：(一或多種)鹽、(一或多種)緩衝液、胺基酸、葡萄糖或其它(一或多種)糖、抗生素、血清或血清替代物，和其它組分如但不限於肽生長因子、輔因子和微量元素。在一些實施例中，所述經轉染的宿主細胞在所述化合物存在下生長15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、24小時、30小時、48小時或72小時。
在一些實施例中，單個轉化宿主細胞基於對對照測試化合物的優化的應答首先分離、克隆並且擴增並且經確認以提供hts活動所需要的足夠低的誤差。通過確定所關注的所述融合的報導基因蛋白相對於具有用於高通量篩選所需要的必需應答穩定性和再現性的所述未融合報導基因的所述應答來幫助選擇適當的克隆。通過另外將所述融合的報導基因信號標準化為所述對照未融合的報導基因來幫助識別有用的克隆，這可顯著地降低相對於測量單獨來自所述融合的報導基因的所述應答的所述固有誤差。這種誤差降低對於對測試化合物(所述測試化合物具有相對於從治療和未經治療樣品觀察的相應的信號獲得的所述應答誤差的足夠大的應答)對應的有用克隆細胞系的識別很重要，以便提供足夠用於高通量篩選的z因子。(en.wikipedia.org/wiki/z-factor)。
「融合的報導基因蛋白信號」是指由融合到所述orf的所述核苷酸序列編碼的所述報導基因蛋白的所述可檢測信號。如本文所用，「未融合的報導基因蛋白信號」是指由未融合到所述orf的所述核苷酸序列編碼的所述報導基因蛋白的所述可檢測信號。在所述測試化合物的存在和不存在所述測試化合物下使用本領域中已知的方法確定所述融合的和未融合的報導基因蛋白信號。可使用的檢測器如(但不限於)光度計、分光光度計和螢光計，或可檢測報導基因蛋白活性的改變的任何其它裝置。可使用本領域中已知的使得來自單個樣品中的兩種報導基因的穩定報導基因信號的定量的測定系統。實例包含但不限於依次測量來自單個樣品的螢火蟲和海腎螢光素酶的活性的dual-螢光素酶分析系統(普洛麥格)。
在檢測由所述報導基因蛋白產生的信號之後，在所述測試化合物存在下所述融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的所述比率與在不存在所述測試化合物的情況下所述融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的所述比率相比。與在不存在所述測試化合物的情況下融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的所述比率相比，當在所述測試化合物存在下融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的所述比率增加時，將所述測試化合物識別為所關注的所述蛋白的穩定劑。相比之下，與在不存在所述測試化合物的情況下融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的所述比率相比，當在所述測試化合物存在下融合的報導基因蛋白信號與未融合的報導基因蛋白信號的所述比率降低時，將測試化合物識別為所關注的所述蛋白的去穩定劑。
在一些實施例中，所述開放閱讀框融合到編碼第一報導基因蛋白的所述核苷酸序列。在此類實施例中，在存在和不存在所述化合物下確定第一報導基因蛋白信號與第二報導基因蛋白信號的比率。與在不存在所述測試化合物的情況下第一報導基因蛋白信號與第二報導基因蛋白信號的所述比率相比，當在所述測試化合物存在下所述第一報導基因蛋白信號與第二報導基因蛋白信號的所述比率增加時，將所述測試化合物識別為穩定劑。與在不存在所述測試化合物的情況下第一報導基因蛋白信號與第二報導基因蛋白信號的所述比率相比，當在所述測試化合物存在下第一報導基因蛋白信號與第二報導基因蛋白信號的所述比率降低時，將所述測試化合物識別為去穩定劑。
在一些實施例中，所述開放閱讀框融合到編碼第二報導基因蛋白的所述核苷酸序列。在此些實施例中，在存在和不存在所述化合物下確定第二報導基因蛋白信號與第一報導基因蛋白信號的比率。與在不存在所述測試化合物的情況下第二報導基因蛋白信號與第一報導基因蛋白信號的所述比率相比，當在存在所述測試化合物下所述第二報導基因蛋白信號與第一報導基因蛋白信號的所述比率增加時，將所述測試化合物識別為穩定劑。與在不存在所述測試化合物的情況下第二報導基因蛋白信號與第一報導基因蛋白信號的所述比率相比，當在所述測試化合物存在下第二報導基因蛋白信號與第一報導基因蛋白信號的所述比率降低時，將所述測試化合物識別為去穩定劑。
通過以下實例進一步說明本發明，所述實例決不應理解為進一步限制。在整個本申請中引用的所有參考文獻(包含文獻參考、授予的專利、公開的專利申請以及共同待決專利申請)的全部內容特此以引用的方式明確地併入。
實例
實例1
pirigf構建體在293ft和hela細胞中表達(圖1a至1c)並且pug-firp構建體在u-2os細胞中表達(圖1d)。測試若干不同形式的哺乳動物和慢病毒質粒構建體的產生表達標記的靶蛋白(例如螢火蟲或nanoluc標籤)和共表達報導基因螢光素酶(例如海腎或螢火蟲)的細胞(例如293ft、hela或u-2os細胞)的能力。
293ft和hela細胞用ikzf1-螢火蟲、ikzf3-螢火蟲和myc-螢火蟲融合蛋白轉染並且分別使用嘌呤黴素和遺傳黴素選擇。這些集合體非常不穩定並且在10到30天中丟失信號並且通常對imid具有極小應答(圖2a至2c)。因此，使用有限的克隆策略在96孔板中分離單個克隆。存活的細胞被分離為菌落，進一步擴增並且測試螢光素酶信號和對imid的應答。克隆2b4被識別為對來那度胺的強應答者。hela細胞表達非常低水平的螢光素酶，這使hela克隆的分離非常困難。通過對螢火蟲、ikzf1和myc的蛋白質印跡的檢測確認所述融合蛋白的表達和與螢火蟲螢光素酶信號相關的相對表達(圖2d)。
表達所述指定螢火蟲融合蛋白的細胞系克隆(ikzf1-2b4、ikzf1-2b11、myc-1c3和myc-5f2)在用於再現性的所述dual-glo測定中評估。imid的效能和螢火蟲螢光素酶信號的相對降低確認期望的應答並且產生具有足夠用於篩選的z'值的數據(圖3a至3d)。
在圖4a和4b中示出了對於ikzf12b4細胞-活性化合物(prestwick收集和nci收集)的試驗性篩選結果。
在圖5中示出了對於myc5f2細胞-活性化合物nci收集的試驗性篩選結果。
證實在ikzf12b4和myc5f2細胞系上測試的命中物(圖6a至6c)。來自市售化合物和來自dtp化合物的概述復驗數據在圖6d至6e中示出。
圖7示出了使用蛋白質印跡的確認數據。ikzf12b4細胞系實例(圖7a至7b)、myc5f2實例(圖7c)。
圖8示出了hsp90抑制劑的進一步評估。圖8a表明在用所述myc-螢火蟲融合蛋白暫時轉染的細胞上的hsp90抑制劑cct018159和格爾德黴素的測試。圖8b示出了在穩定表達myc-螢火蟲融合蛋白的293ft細胞上的hsp90抑制劑cct018159和格爾德黴素的測試。圖8c示出了在穩定表達所述myc-螢火蟲融合蛋白的5種不同細胞系上的若干hsp-90抑制劑在各種劑量下的測試。圖8d比較在暫時表達ikzf1-螢火蟲融合蛋白的293ft細胞上的所述hsp90抑制劑biib021和泊馬度胺。
實例2：比較ikzf1對myc細胞系的活性
在hms篩選設施iccb處的篩選活動
在iccb處篩選ikzf1的最佳挑選重複試驗(圖9)。44,460種化合物中，篩選的0.6％的化合物具有基於相比於板平均值的大於35％的fluc/rluc降低的命中率。最佳挑選0.3％的化合物重複81％(108/133)的命中物，相比於dmso對照具有大於25％的fluc/rluc降低。在兩種細胞系中大約90％(97/108)被命中。對於ikzf1對myc，存在11>25％的活性差異。所有上述結果為中等或弱命中。
所述iccb最佳挑選ikzf1對myc選擇性比較的所述結果示出，在所述ikzf1細胞系篩選中的大部分命中物在表明非特異性機制的反向篩選測定中也有效(圖10)。五種化合物在所述反向篩選中是惰性的，但是仍使ikzf1螢光素酶信號降低大於35％，這顯示出一些選擇性。
對於hsp90抑制劑的劑量反應
相比於所述反向篩選表達myc-螢火蟲的293ft細胞系：表達myc-螢火蟲的海腎和u2os細胞系：表明用於ikzf1機制非選擇性的海腎，兩種hsp90抑制劑，biib021(圖11a)和pf-04929113(圖11b)，在所述293ftikzf1細胞系中示出類似活性。蛋白水平的阻斷基因表現通過蛋白質印跡確認，這表明所述螢光素酶報導基因系統精確地反映融合蛋白降低。
用於7myc-螢光素酶融合細胞系的穩定性時程
在用環己醯胺阻擋所有蛋白合成之後，七種細胞系用於測量所述螢光素酶的半衰期。觀察的融合的螢光素酶(myc-螢火蟲和myc-nanoluc；圖12b)兩者的衰減與觀察的所述未融合的螢光素酶(海腎和螢火蟲；圖12a)的所述衰減相比，其使用所述myc-螢火蟲：海腎和myc-nanoluc：螢火蟲細胞系293t，u2os和所述myc-螢火蟲：海腎細胞系a549，h1299和ls174t兩者。正如期望，因為未標記的海腎含有pest域，所述未標記的螢火蟲的所述半衰期(大約4小時)短於所述未標記的海腎(大約12小時)的所述半衰期。大約2小時的mycnanoluc半衰期長於少於1小時的myc-螢火蟲半衰期並且更接近未標記的螢火蟲的所述半衰期。myc-nanoluc和未標記螢火蟲的平衡的半衰期應降低加工品命中的數量。
在阻擋用mg132的蛋白酶體後，七種myc-螢光素酶報導基因細胞系用於測量myc螢光素酶表達的改變。所述未融合的海腎和螢火蟲的所述表達不變維持約6小時，但是在18小時之後降低到在細胞系中的可變程度(圖13b)。所有細胞系示出myc螢光素酶融合蛋白增加至少50％，但是具有不同的時程。所述myc-nanoluc展示螢光素酶信號增加約4倍，這表明所述這些融合蛋白的較大部分通過蛋白酶體降解(圖13a)。
在用類泛素化修飾抑制劑mln-4924抑制泛素依賴性蛋白分解之後，七種myc螢光素酶報導基因細胞系用於量測myc螢光素酶表達的改變(圖14a至14b)。除293tmyc-螢火蟲：海腎細胞系以外，最低限度地影響所述未融合的海腎和螢火蟲的所述表達。所有細胞系示出myc螢光素酶融合蛋白增加至少50％，通常在治療6小時之後達到峰值。這些結果確認，在所有7種細胞系中泛素依賴性蛋白分解至少部分造成所述myc融合蛋白的所述穩定性。
在simyc阻斷基因表現之後表達myc螢火蟲的a549和h1299細胞系
使用針對於mrcmrna的sirna治療48小時，sirna用於阻斷基因表現在所述a549和h1299細胞系中的所述myc螢火蟲螢光素酶融合蛋白。如通過具有myc和螢火蟲導入抗體的蛋白質印跡所觀察，融合蛋白質的所述降低(圖15a)與螢光素酶信號的所述降低(圖15b)比較。myc抗體還檢測內源性myc的所述降低。在所述a549細胞中觀察到顯著的myc-nick帶。
sigenomesirna文庫
圖16a至16d示出了來自針對具有表達myc螢火蟲的a549、h1299和hek293t細胞和表達myc-nanoluc的u2os細胞的dub酶家族的市售sirna的文庫的篩選結果。
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