膜囊泡的製法的製作方法

2023-04-26 05:23:01 3

專利名稱：膜囊泡的製法的製作方法
技術領域：
本發明涉及膜囊泡的新製法(特別是分離和/或純化)。本發明亦涉及以此方法製成的膜囊泡與例如其生物學及醫學應用。
膜囊泡通常是由包含細胞質部分的脂雙層組成的直徑小於100納米的囊泡。特別的膜囊泡更特定地經由胞內區室與細胞膜的融合獲得，這使這些膜囊泡釋放於生物流體或培養的細胞的上清液中。這類囊泡通常名為胞外體(exosome)。胞外體直徑通常介於約50～90納米之間，更特定地是介於60～80納米之間，並且，有利的是，其帶有與在其起源細胞的細胞膜中取向相同的膜蛋白質(特別是主要組織相容性複合體蛋白)。此外，視起源而定，胞外體包括諸如CD40、CD80與HSP70等膜蛋白而且不含內質網或高爾基體。
已證實胞外體可由各種生理環境的不同細胞類型釋放。在這方面，已證實，B淋巴細胞釋放攜帶具有抗原呈遞作用的第二類主要組織相容性複合體分子的胞外體(Raposo等.，J.Exp.Med.183(1996)1161)。同樣地，已證實樹狀細胞生成胞外體，該胞外體具特定的結構特徵與功能特徵，並在免疫反應的介導，特別是在細胞毒性T淋巴細胞的刺激中起一定作用(亦名為樹狀細胞胞外體)(Zitvogel等.，Nature Medicine4(1998)594)。亦證實腫瘤細胞以受調控的方式分泌特定胞外體(亦名為腫瘤細胞胞外體)，其攜帶腫瘤抗原並可呈遞這些抗原或將之傳遞至抗原呈遞細胞(專利申請WO99/03499)。亦已知，肥大細胞在胞內囊泡區室中累積一些可在信號影響下分泌的分子(Smith與Weis，Immunology Today17(1996)60)。因此，作為一般規律，細胞發射信號並經由在不同生理狀況下產生的膜囊泡彼此溝通，這些膜囊泡可能攜帶具特定結構特徵與功能特性的抗原型、MHC分子或任何其他信號(細胞因子、生長因子等)。因此，這些囊泡，特別是胞外體，是一種特別希望用於診斷、疫苗接種或治療性的應用或目的分子的傳遞的產品。因此，可以工業規模製備與生物性用途，特別是藥理用途相容的膜囊泡的有效方法將具有特別的意義。
傳統的製備膜囊泡(例如胞外體)的方法涉及一系列差速離心步驟，以從培養基中存在的細胞或細胞碎片中分離囊泡。在這方面，上述文獻實質地描述通過在300g、10,000g與70,000g或100,000g下的一系列離心製備囊泡，所得的團粒則溶於鹽溶液以構成濃縮的胞外體溶液。此製備物可利用傳統生化技術進行分析，用於評價胞外體的蛋白質組成。優選的生化技術包括在變性介質中進行電泳，加上全蛋白質的染色；或根據Western印跡技術利用抗體檢測特定蛋白質。最終製備物中的胞外體可在以4％戊二醛溶液固定制備物後利用電子顯微鏡術直接檢測。
根據本方法，可得純度令人滿意的胞外體，因為該製備物可在動物模型中顯示生物活性與抗腫瘤性質。然而，這些現有技術的離心方法，無法將膜囊泡(例如胞外體)與細胞蛋白質或某些大分子成份(DNA、RNA)或大分子複合體進行精細分離。因此，這些方法無法排除對人類的治療用途不相容的未識別的生物汙染物的存在。此外，這些步驟難以外延至工業規模，特別是在處理量很大時；或難以用於自體(即病人對病人)的體外應用，在其後者中該方法通常須應用於限定的系統中。
本發明現在提供對此問題的解決方式。本發明說明在與工業用途和藥理應用相容的條件下製備(即分離和/或純化)膜囊泡的新方法。特別可應用本發明的方法取得個體化的自體胞外體製備物和由確立細胞株獲得胞外體製備物，以用於實驗或生物用途、或者預防或治療性的疫苗接種目的。
本發明更特定地基於層析分離法的使用來製備膜囊泡，特別是把膜囊泡和潛在的生物汙染物分離開。
更具體而言，本發明第一個目的是由生物樣品製備膜囊泡的方法，其特徵在於，其至少包括樣品的陰離子交換層析處理步驟。
事實上，申請人現已證明膜囊泡，特別是胞外體，可通過陰離子交換層析得以純化。在這方面，在此應用中出人意料地證明，在陰離子交換層析後，胞外體呈一個均一峰。此結果是完全出人意料的，因為胞外體是由圍繞在包括可溶蛋白的內體積周圍的膜所組成的超分子複合物質。此外，胞外體包含膜蛋白。
因此，本發明的優選目的涉及由生物樣品製備膜囊泡，特別是純化膜囊泡的方法，其中至少包括一個陰離子交換層析步驟。
為應用本發明，可使用強或弱的陰離子交換，優選進行強的陰離子交換。此外，在一具體實施方案中，該層析是壓力下進行。因而，更具體而言，其可以包括高效液相色譜法(HPLC)。
在陰離子交換層析中可使用不同類型的載體。更優選的是，這些載體可以包括纖維素、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、瓊脂糖、葡聚糖、丙烯醯胺、矽石、乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物、或其混合物如瓊脂糖-葡聚糖混合物。為對此舉例說明，可採用由上述載體組成的不同的層析裝置，特別是使用下列的凝膠例如Source、Poros、Sepharose、Sephadex、Trisacryl、TSK-凝膠SW或PW、Superdex、Toyopearl HW與Sephacryl，上述凝膠皆適用於本發明。
因此，在一具體實施方案中，本發明涉及由生物樣品製備膜囊泡的方法，其至少包括一個步驟，在此步驟中該生物樣品經陰離子交換層析處理，其中載體選自纖維素、聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、矽石、丙烯醯胺、瓊脂糖、葡聚糖、乙二醇-甲基丙烯酸鹽共聚物，它們單獨或以混合物使用，並得任選加以官能化。
此外，在本發明範疇中，為改善該層析分離度，優選所用的載體的小珠形式。理想情形為，這些珠子具有均一且已標準化的直徑，和相當高的孔隙度以使物質能在層析過程中穿透過(即胞外體)。在這方面，若設定胞外體的直徑(通常介於50至100納米)，為應用本發明，優選使用高孔隙度凝膠，特別是介於10納米至5微米，更優選介於約20納米至約2微米，最優選介於約100納米至約1微米。
對陰離子交換層析而言，所用的載體必須用能與陰離子分子作用的基團官能化。通常，此基團是由三級或四級胺組成，其分別限定弱或強的陰離子交換劑。
在本發明範疇中，使用強陰離子交換劑是特別有利的。在這方面，根據本發明，使用經四級胺官能化的上述層析載體。因此，根據本發明一更具體的實施方案，該陰離子交換層析在以四級胺官能化的載體上進行。甚至更優選，此載體選自聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、丙烯醯胺、瓊脂糖、葡聚糖與矽石，其單獨或以混合物形式使用，並經四級胺官能化。
經四級胺官能化的載體的實例包括Source Q、Mono Q、QSepharose、Poros HQ與Poros QE等凝膠、Fractogel TMAE型凝膠和Toyopearl Super Q凝膠等。
有一種特別優選用於進行陰離子交換層析的載體包括聚(苯乙烯-二乙烯基苯)。可於本發明範疇中使用的這類凝膠的實例之一是SourceQ凝膠，特別是Source 15 Q(pharmacia)。該載體的優點是提供很大的內部孔隙，因此對流經凝膠的液體的循環只有低的阻力，同時使胞外體能快速擴散至官能團，這些官能團對指定大小的胞外體是特別重要的參數。
可採用不同方式洗脫保存在柱內的生物學化合物，特別是利用漸增濃度如0～2摩爾濃度的鹽溶液梯度進行。特別可使用濃度例如為0～2摩爾濃度的氯化鈉溶液。以此方式純化的不同級分則通過利用連續式分光光度讀數在柱出口處測量光密度(OD)而進行檢測。就做為指標而言，在上述實例所用條件下，以離心強度大約介於350～700毫摩爾濃度的溶液洗脫包括膜囊泡的級分，所用濃度視囊泡類型而定。
根據需要及須處理的試樣體積，層析步驟可使用不同類型的柱進行。例如，視製備物而定，可使用從約100微升至10毫升或更高的柱。在這方面，可用的載體例如具有可達25毫克蛋白質/毫升的容量。為此，100微升柱具有約2.5毫克蛋白質的容量，對於所述樣品而言，這允許處理約2升的培養上清液(其在濃縮10～20倍之後，代表例如每個製備物體積為100～200毫升)。可以了解，例如通過增大柱體積亦可能處理較大的試樣體積。
此外，為進行本發明，亦可能聯合陰離子交換層析步驟與凝膠滲透層析步驟。在這方面，根據本發明一具體實施方案，將凝膠滲透層析步驟加於陰離子交換步驟，可置於陰離子交換層析步驟之前或後。在此實施方案中，該滲透層析步驟優選是在陰離子交換步驟後進行。此外，在另一具體實施方案中，該陰離子交換層析步驟被凝膠滲透層析步驟代替。本發明應用顯示，也可利用凝膠滲透液相層析來純化膜囊泡，特別是當此步驟與陰離子交換層析或其他生物樣品處理步驟聯合時，這如下面所詳述的那樣。
進行凝膠滲透層析步驟時，優選使用的載體選自矽石、丙烯醯胺、瓊脂糖、葡聚糖、乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物或其混合物如瓊脂糖-葡聚糖混合物。作為舉例說明，對凝膠滲透層析而言，優選使用諸如Superdex 200HR(Pharmacia)、TSK G6000(TosoHaas)或Sephacryl S(Pharmacia)。
根據本發明的方法可能應用於不同生物樣品。特別是，這些樣品可包括來自某些個體的生物流體(骨髓、外周血液等)、培養上清液、細胞溶胞物、預純化的溶液或任何其他包含膜囊泡的組合物。
就此方面言，在本發明一具體實施方案中，生物樣品是膜囊泡生成細胞的培養上清液。
此外，根據本發明一優選實施方案，在層析步驟前處理生物樣品，以富含膜囊泡(富集階段)。在這方面，在一具體實施方案中，本發明涉及由生物樣品製備膜囊泡的方法，其特徵在於，其至少包括b)一個富集步驟，以製備富含膜囊泡的樣品；與c)一個在其過程中利用陰離子交換層析和/或凝膠滲透層析處理該樣品的步驟。
根據一優選實施方案，生物樣品是經處理以富含膜囊泡的培養上清液。特別是，該生物樣品可能是由源於一群膜囊泡生成細胞的培養上清液或源於生物流體的預純化溶液組成，並且預純化溶液是經諸如離心、澄清、超濾、納過濾和/或親和層析等處理而獲得，特別是利用澄清和/或超濾和/或親和層析獲得。
因此，根據本發明，製備膜囊泡的優選方法更特別地包括下列步驟a)在允許囊泡釋放的條件下培養一群膜囊泡(例如胞外體)生成細胞，b)一個使樣品富含膜囊泡的步驟，與c)對樣品進行陰離子層析和/或凝膠滲透層析的處理。
如上述，該樣品(例如上清液)富集步驟可能包括對上清液進行一或多個離心、澄清、超濾、納過濾和/或親和層析步驟。在第一具體實施方案中，富集步驟包括(i)清除細胞和/或細胞碎片(澄清)，可能繼之以(ii)一個濃縮和/或親和層析步驟。在另一具體實施方案中，該富集步驟包括一個親和層析步驟，並任選在其前進行清除細胞和/或細胞碎片(澄清)的步驟。根據本發明的優選富集步驟包括(i)清除細胞和/或細胞碎片(澄清)、(ii)濃縮以及(iii)親和層析。
可利用樣品的低速離心清除樣品中的細胞和/或細胞碎片，例如利用低速離心進行，優選低於1000g，例如介於100至700g。在本步驟中的優選離心條件，例如為約300g或600g，時間為1至15分鐘。
欲清除樣品的細胞和/或細胞碎片亦可利用過濾，並可能結合上述的離心步驟。該過濾步驟特別可採用孔隙度逐漸縮小的濾器進行連續過濾。為此目的，優選使用孔隙大於0.2微米的濾器，例如孔隙度介於0.2至10微米之間的濾器。特別可能的是連續使用孔隙度為10微米、1微米、0.5微米、繼之以0.22微米的濾器。
為減低層析階段須處理的樣品體積，亦可進行濃縮步驟。就此方式，濃縮可通過高速離心進行，例如以介於10,000與100,000g間進行離心，以沉降膜囊泡。此可包括一系列差速離心，且最終的離心在約70,000g進行。所得團粒中的膜囊泡可以較小體積溶於適當緩衝劑中，以進行本方法中的後續步驟。
亦可利用超濾進行濃縮步驟。事實上，此超濾既可濃縮上清液又可進行初步的膜囊泡純化。根據一優選實施方案，將生物樣品(例如上清液)超濾，優選切向超濾。切向超濾包括濃縮與分級分離由具有確定截止限的膜所隔離的兩個區室間的溶液(濾液與保留液)。進行該分離時是將一定流量施加在保留液區室中並在此區室與濾液區室間施予跨膜壓力。進行超濾時可使用不同系統，諸如螺旋膜(Millipore，Amicon)、扁平膜或中空纖維(Amicon，Millipore，Sartorius，Pall，GF，Sepracor)。在本發明範圍內，所用的膜的截止限為小於1000kDa，優選介於300kDa至1000kDa，最優選介於300kDa或500kDa間。
親和層析步驟得採用不同的層析載體與材質以不同方式進行。目的在於保留(即結合)溶液內所有的某些汙染物而不保留目的物質(即胞外體)的非特異性親和層析是有利的。故其是負選擇。優選在染料上進行親合層析，以清除(即保留)諸如蛋白質與酶等汙染物，例如白蛋白、激酶、脫氫酶、凝血因子、幹擾素、脂蛋白或輔因子等。更優選本層析步驟所用的載體是如離子交換層析所用的載體並用染料官能化。就具體實例而言，染料可選自藍瓊脂糖凝膠(Blue Sepharose)(Pharmacia)、黃色86、綠色5號和褐色10號(Sigma)。載體更優選瓊脂糖。應明白，本發明可使用任何其他載體和/或染料或允許保留(結合)所處理的生物樣品中的汙染物的反應基團。
在本發明一個具體實施方案中，通過對膜囊泡生成細胞的培養上清液進行至少一個過濾階段，獲得該生物樣品。
在本發明另一個具體實施方案中，通過令膜囊泡生成細胞的培養上清液進行至少一次離心步驟而獲得生物樣品。
在本發明一個優選實施方案中，通過令膜囊泡生成細胞的培養上清液進行至少一次超濾步驟而獲得生物樣品。
在本發明另一優選實施方案中，通過令膜囊泡生成細胞的培養上清液進行至少一次親和層析步驟而獲得生物樣品。
本發明範疇內有一個更具體的優選膜囊泡製備方法，包括下列步驟a)在允許囊泡釋放的條件下培養膜囊泡(例如胞外體)生成細胞的群體，b)以至少一個超濾或親和層析步驟處理培養上清液，以生成富含膜囊泡(例如胞外體)的生物樣品，與c)對生物樣品進行陰離子交換層析和/或凝膠滲透層析處理。
在一優選實施方案中，上述步驟b)是包括過濾培養上清液，接著超濾，優選切向超濾。
在另一優選實施方案中，上述步驟b)包括澄清培養上清液，隨之在染料上進行親合層析，染料優選藍瓊脂糖凝膠。
此外，如果適用，可在步驟c)之後對所收集的物質進行一或多個額外處理和/或過濾步驟d)，特別是用於滅菌時。對於此過濾處理步驟，所用濾器直徑優選小於或等於0.3微米，甚至更優選小於或等於0.25微米，這類濾器的直徑為例如0.22微米。
步驟d)之後，將所得物例如分裝於含適當貯存介質的諸如瓶、管、袋、注射器等適當裝置中。以此方式所得的已純化的囊泡可冷藏、冷凍或立即使用。
因此，本發明範疇中的一個具體製法至少包括下列步驟c)生物樣品的陰離子交換層析和/或凝膠滲透層析處理，與d)階段c)之後，對所收集的物質的一個過濾步驟，特別是滅菌過濾。
在第一種變化中，根據本發明的方法包括c)生物樣品的陰離子交換層析處理，與d)階段c)之後，對所收集的物質的一個過濾步驟，特別是滅菌過濾。
在第二種變化中，根據本發明的方法包括c)生物樣品的凝膠滲透層析處理，與
d)階段c)之後，對所收集的物質的一個過濾步驟，特別是滅菌過濾。
根據第三種變化，本發明的方法包括c)生物樣品的陰離子交換處理，在該步驟之前或之後則進行滲透層析，與d)階段c)之後，對所收集的物質的一個過濾步驟，特別是滅菌過濾。
各實施例的結果顯示，將胞外體製備物注射入層析柱後，可得到完全分離的對稱吸收峰(

圖1)。在變性凝膠中使用傳統蛋白質電泳技術並繼之以考馬斯(Loomassie)藍染色技術或利用抗體使用特異性蛋白檢測技術，可分析以此方法分離的不同級分。因此有可能證明，對腫瘤細胞胞外體而言，利用400毫摩爾濃度鹽溶液在陰離子交換層析中洗脫的峰與利用傳統方法製備的胞外體製備物具有相同的蛋白質分布情形(圖2)。事實上，這使以較低或較高鹽溶液濃度洗脫的峰特性化為與獨特的生物性汙染物相關。在另一實驗中，以介於約500至700毫摩爾濃度的離子濃度洗脫由樹狀細胞生成的膜囊泡(樹狀細胞胞外體)或某些腫瘤細胞胞外體，而肥大細胞衍生的囊泡則以約350毫摩爾濃度進行洗脫。
此外，各實施例的結果亦顯示，根據本發明的方法允許檢測製備物中由培養基中的主要蛋白如牛血清白蛋白造成的可能的汙染。事實上，在上述條件下標準牛血清白蛋白溶液的層析確實顯示，在不同於胞外體峰的鹽溶液濃度下有一峰洗脫出(圖3)。
因此，本發明的方法，(i)在與藥理用法相容的定量和定性條件下純化膜囊泡，與(ii)檢測所處理的生物樣品中特定生物性汙染物的存在。
可應用本發明的方法來製備不同來源的膜囊泡。特別是，這些囊泡例如可包括由抗原呈遞細胞或腫瘤細胞產生的胞外體。此外，他們可包含例如培養的初級細胞，或是確立細胞系，例如無限增殖化的膜囊泡生成細胞系。他們可以包含哺乳類來源的細胞，特別是來源於鼠類或人類的細胞。
在本發明一具體實施方案中，膜囊泡是由抗原呈遞細胞生成的囊泡，特別是由樹狀細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞與肥大細胞所生成的囊泡，並優選先經一或多種選定抗原致敏這些細胞。本發明有一種特別優選的應用是基於由樹狀細胞所生成的膜囊泡的製備物。這些細胞可為人或動物的樹狀細胞，特別是人源或鼠源樹狀細胞。這些細胞可為收集自受測體的生物流體或由前體細胞在活體外產生的初級細胞，或亦可是源於確立細胞系，例如源於經致癌基因無限增殖化的確立細胞系(EP701604)。
本發明的一個特定目的是一種製備膜囊泡(樹狀細胞胞外體)的方法，其特徵在於，其包括下列步驟a)獲得樹狀細胞群落，b)在允許生成膜囊泡(樹狀細胞胞外體)的條件下培養這些樹狀細胞，與c)使用至少包括一個上述陰離子交換層析處理的方法純化這些膜囊泡(樹狀細胞胞外體)。
有一更優選的實施方案涉及樹狀細胞胞外體的製備方法，包括下列步驟a)獲得樹狀細胞群落，b)在允許生成樹狀細胞胞外體的條件下培養樹狀細胞，c)處理培養上清液以產生富含樹狀細胞胞外體的生物樣品，特別是利用超濾或親和層析步驟進行處理，與d)在上述條件下，利用至少包括一種陰離子交換和/或凝膠滲透層析步驟的方法來純化樹狀細胞胞外體。
更具體而言，為了進行這一實施方案，該樹狀細胞優選獲自由一研究對象例如骨髓或外周血液所得的生物樣品。
就此方面而言，已有現有技術公開了樹狀細胞產生技術，而且熟練的技術人員皆可使用這些技術(特別參見專利申請WO99/03499所述的技術，並列於本申請中以供參考)。因此，該樹狀細胞可由免疫系統幹細胞、單核細胞前體製成，或可直接在分化狀態下分離(參照Hart，血液(Blood)90(1997)3245的綜述)。
有一種本發明範疇中的優選方法是基於由單核細胞前體或骨髓產生樹狀細胞。更具體而言，在本發明範疇中，優選使用通過在GM-CSF+IL-4或GM-CSF+IL-13組合存在下處理的單核細胞前體(含於血或骨髓中)而獲得的樹狀細胞。
此外，為本發明的進行，使用包括不成熟樹狀細胞的樹狀細胞群落是特別有利的。更有利的是，所用的樹狀細胞的群落主要(即至少60％，優選70％)由不成熟樹狀細胞組成。
因而，樹狀細胞製備步驟可有利地包括製備包含不成熟樹狀細胞的樹狀細胞群落，特別是人源樹狀細胞，尤其是來自單核細胞前體的樹狀細胞，更具體而言是經諸如GM-CSF+IL-4或GM-CSF+IL-13的細胞因子組合的處理來進行製備。
此外，在本發明範疇中，亦可能使用無限增殖化的樹狀細胞群落。這些群落可由無限增殖化的樹狀細胞系(例如D1細胞系或例如通過將myc致癌基因導入樹狀細胞而生成的任何其他細胞系)組成。他們亦可由在體外製備並無限增殖化的樹狀細胞組成。無限增殖化的樹狀細胞的目的是構建對指定抗原基團敏感的細胞庫，其可在工業上用於製備對於施用給全體病人相容的樹狀細胞胞外體。
為了產生膜囊泡(樹狀細胞胞外體)，可於本領域技術人員所知的傳統條件下培養樹狀細胞。然而，優選於刺激樹狀細胞胞外體產生的條件下，特別是在可刺激樹狀細胞胞外體產生的因子存在下，特別是在細胞因子諸如γ幹擾素、白細胞介素10或白細胞介素12存在下(例如參照WO99/03499的應用)，培養這些細胞。在本發明方法的一優選實施方案中，在上述步驟b)中，於足以刺激膜囊泡產生的條件下培養樹狀細胞。
而且，在一具體變化中，在產生膜囊泡前，先令樹狀細胞經抗原敏感化。在此實施方案中用特定抗原集中樹狀細胞，以產生具指定免疫原性的樹狀細胞胞外體。此敏感化步驟可以利用不同的已知技術進行，例如包括令細胞與抗原性肽、抗原、蛋白質複合物、表達抗原的細胞或其膜、凋亡體、膜囊泡、脂質體、腫瘤RNA或可編碼一或多個抗原的任何核酸、抗原決定簇或表位(可能由病毒載體或非病毒的載體所攜帶)等等進行接觸(例如參見申請WO99/03499)。在一優選方法中，利用其與肽、抗原、RNA或核酸一起溫育進行敏感化。應了解，此申請不限於樹狀細胞的敏感化或產生技術。
本發明另一特別有利的實施方案是基於由腫瘤細胞(特別是人源腫瘤細胞)產生的膜囊泡的製備。特別是，其可包括任何源於實性或柔軟(liquid)腫瘤的細胞與任何在體外轉化或無限增殖化的細胞。更常提到的可能是實性、造血的或腹水腫瘤。
本發明的一個具體實施方案亦在於製備膜囊泡，該膜囊泡包括一或多種異種分子，特別是重組分子。就此方式，例如有可能在遺傳上修飾膜囊泡生成細胞(例如肥大細胞系)，使之在其所產生的囊泡內或表面上表達目的分子(PCT/FR99/02691)。本發明也可用於純化這類已修飾的囊泡。
更普遍而言，可應用本發明製備由任何細胞類型所產生的膜囊泡，特別是胞外體類型的囊泡，優選其直徑小於約100納米。這些細胞可以包括巨噬細胞、肥大細胞、網狀細胞等等。在實驗部分，使用源於(i)細胞系如鼠類腫瘤細胞系(TS/A)、樹狀細胞系(D1)、肥大細胞系(RBL)與(ii)人類單核細胞衍生的樹狀細胞的胞外體製備物。所得結果可以直接轉換至其他可在工業上可接受的條件下得以培養的原代培養物諸如人類腫瘤細胞、樹狀細胞、B淋巴細胞等。因此，本發明的方法可用來純化在人類治療中使用的胞外體。
視其來源而定，以此方式所得的膜囊泡代表用於癌症或免疫系統調控研究的工具，以及用於分子轉移、抗體產生、標記、診斷、庫構建、疫苗或藥物成份等等的工具。
此外，亦可使用本發明的方法做為對培養基中或膜囊泡製備物中可能存在的汙染物(特別是汙染性蛋白)進行定量和定性控制的方法。
因此，就此方面而言，本發明既可應用於膜囊泡的製備方法，又可應用於用以測試不論製法的膜囊泡製備物定量和定性的分析系統。
因此，本發明亦涉及測試膜囊泡(尤其是胞外體)製備物中汙染物(尤其是蛋白或核酸來源的汙染物)，其包括對該製備物的級分至少進行陰離子交換層析與汙染物存在的檢測。
作為常規，本發明亦涉及陰離子交換層析，特別是高效液相層析，用以製備或純化膜囊泡的應用。其亦涉及使用親和層析製備或純化膜囊泡。
本發明亦涉及使用本發明方法製備的膜囊泡與包括這類囊泡的任何組合物。
通過下列實施例更詳細說明本發明，這些實施例只用於說明而非限制。
圖2一種胞外體製備物的不同洗脫級分通過SDS PAGE電泳繼之以考馬斯藍染色而進行的蛋白質分布分析。
圖3標準牛血清白蛋白陰離子交換層析後的洗脫分布。
圖4包括膜囊泡的生物樣品的切向超濾處理圖。
圖5樹狀細胞胞外體上清液經600與10,000g離心後的藍瓊脂糖凝膠6快速流動步驟的一般分布。
圖6未吸附級分與藍瓊脂糖凝膠6快速流動步驟的洗脫物中的胞外體MHC II分子的Western印跡。
圖7藍瓊脂糖凝膠6快速流動步驟後的Source Q15步驟的一般分布。
圖8藍瓊脂糖凝膠6快速流動步驟後的Source Q15上的洗脫梯度的詳細情形(圖7右下部的放大圖)。
圖9由RBL DR+細胞系產生(53微克蛋白質當量)並在DNA酶與RNA酶處理後經Source Q15柱純化的胞外體的純化分布情形。
圖10利用不連續的NaCl梯度於Source Q15載體上進行的胞外體分離。
圖11經HPLC分離與超速離心的每一峰的人類MHC II分子的Western印跡。陽性對照組表達MHC II分子的人類樹狀細胞。陰性對照組超速離心過的培養基(背景信號)。MW分子量；NA未吸附的級分。
一般細胞培養與分子生物學技術1)細胞培養TS/A細胞系是由自發的乳腺癌確立的鼠類細胞系。此細胞繫於37℃、5％CO2下在含10％胎牛血清(Dominigue Dutcher)的RPMI培養基中培養。
樹狀細胞系保存於含10％滅活的胎牛血清、2毫摩爾濃度L-穀氨醯胺、50微摩爾濃度2-βME、100單位/毫升青黴素與100微克/毫升鏈黴素的IMDM培養基中。
2)SDS PAGE蛋白質分析20微升樣品以連力(Laemmli)緩衝液(Nature 227(1970)680-685頁)稀釋，然後在95℃熱變性10分鐘，然後負載於10％丙烯醯胺凝膠上(Novex1毫升×10孔)。在遷移後，將該凝膠以考馬斯藍染色。
此實施例說明陰離子交換層析處理怎樣用來分離來自胞外體製備物的雜質。
1.1方案在此實驗中，起始材料是利用差速離心由TS/A細胞培養上清液製備式的胞外體濃縮物組成，用於將胞外體由培養基中的細胞或細胞碎片中分離出。為使來自培養上清液的懸浮液中的細胞得以沉降，初次離心是以低速(300g，5分鐘)進行。另外進行兩次離心(1200g、20分鐘，隨之為10,000g、30分鐘)使細胞碎片形成團粒。然後，令以此方式澄清化的上清液以70,000g高速超速離心1小時以使胞外體得以沉降，然後將此製備物以大量鹽溶液洗過並經上述條件再次離心。然後將該凝塊溶於近100微升的鹽溶液以形成濃縮的胞外體溶液。蛋白量以Bradford技術(Biorad，Ivry，法國)測量。此濃縮物的蛋白質總量介於500至1000微克/毫升。
令稀釋於500微升pH8的50毫摩爾濃度HCl/Tris緩衝液的40微克的此胞外體製備物注射入包含經pH8、50毫摩爾濃度HCl/Tris緩衝液穩定的Source Q15凝膠(Pharmacia)的柱。衝洗後，在30倍體積的柱上用0～500毫摩爾濃度線性梯度的NaCl隨之為2摩爾濃度NaCl溶液洗脫吸附物。洗脫級分則以260與280納米(nm)用分光光度法分析，將洗脫級分分成5個主要級分(F1至F5)以分別進行其蛋白質分布分析。以1/10體積的100％三氯乙酸溶液沉澱每一級分的蛋白質，然後再以丙酮溶液漂洗。以20微升連力溶液溶該蛋白質團粒並負載於SDS PAGE丙烯醯胺凝膠，然後進行考馬斯藍染色。
1.2結果圖1所示為260與280nm時的洗脫分布。該分布顯示3個明顯的分別洗脫於鹽溶液濃度為105毫摩爾濃度、400毫摩爾濃度與2摩爾濃度NaCl的對稱峰。
相對於不同峰的級分的蛋白質分布情形分析顯示，於400毫摩爾濃度NaCl洗脫出的峰與經離心製成的傳統胞外體製備物具有相同的蛋白質分布情形(圖2)。測定值為0.8的260與280nm吸收間的比例與蛋白質的情況相容。
然而，以105毫摩爾濃度NaCl洗脫的峰(F2級分)顯示不同的蛋白質分布，僅顯示兩個不同帶。260與280nm的吸收測定值的比例為1.6，意指存在核酸與蛋白質的組合。
以2摩爾濃度NaCl洗脫的F5級分對應於與柱有力連結的生物化合物。
因此，有可能以陰離子交換步驟將不純物與胞外體分離。
2)標準牛血清白蛋白溶液的陰離子交換層析亦可使用此陰離子交換層析技術評估胞外體製備物受培養基中的蛋白質汙染的程度。在這方面，利用相當於培養基中主要蛋白質的10微克牛血清白蛋白溶液進行的層析，證明它以205毫摩爾濃度NaCl洗脫出，為窄峰，可以與上述胞外體的峰有所分別。
3)包含胞外體的培養上清液的超濾處理。
此實施例證明，可利用超濾濃縮胞外體。此外，該胞外體製備物僅含少量諸如BSA的蛋白質汙染。
方法(圖4)以0.22微米孔隙率的濾器(Millipore)過濾由TSA細胞於300g離心後所得的150毫升細胞培養上清液。以PBS等倍稀釋濾液。生成的300毫升液體以300,000D(Sartorius)截止限的過濾匣(10平方釐米的膜)進行切向過濾。
結果經1小時過濾後可得7毫升保留液。令保留液進行超速離心(79,000)以取得團粒並分析胞外體。經SDS-PAGE分析加上考馬斯藍染色後顯示，樣品所含BSA明顯比超濾的溶液所含的少。此外，亦可見由TSA生成的胞外體的特殊蛋白質帶。
因此，為分離胞外體與汙染的蛋白，可在胞外體純化方法中使用超濾法。
4.由人類單核細胞衍生的樹狀細胞產生的人類胞外體的HPLC純化。
4.1)材料與方法·緩衝液與貯存溶液除了水與鹼液外，皆使用經0.22微米過濾的貯存液。第一種緩衝液為緩衝至pH＝6的100毫摩爾濃度(Sigma，純度99％)Bis-Tris-丙烷(BTP)溶液，此緩衝液連接至層析用的通道A(BioCad Sprint，Perkin-Elmer)。第二種緩衝液是緩衝至pH＝9的100毫摩爾濃度Bis-Tris-丙烷溶液，此緩衝液連接至層析用的通道B。水是在電阻18MΩcm下用Milli-Q系統於樹脂上產生的。水連接於通道C。令3摩爾濃度氯化納貯存液(NaCl，Prolabo，純度99.5％)連接於通道D。令0.1摩爾濃度的鹼液(NaOH，Prolabo，最小純度98％)連接於通道F。通道E是用以將培養上清液負載於柱上。
所有緩衝液皆由用Milli-Q系統產生的水製成，且未經脫氣。
·柱藍瓊脂糖凝膠6快速流動(Blue Sepharose 6 fast flow，Pharmacia)第一個步驟是用藍瓊脂糖凝膠6快速流動(Pharmacia)柱進行。基質是為與藍瓊脂糖凝膠6快速流動藍3G(7％)連結的瓊脂糖，顆粒大小介於45至165微米間。最大線性流速為750釐米/小時。該凝膠在pH4～12時穩定，在4與12的pH極限時，凝膠可能損壞，其引起固定容量的下降(藍瓊脂糖凝膠6快速流動的分離)與壓力的增加(精細形成)。
藍瓊脂糖凝膠6快速流動是特異於諸如白蛋白、激酶、脫氫酶與其他諸如包含NAD+輔酶的酶、凝血因子、幹擾素與脂蛋白等的化合物。
藍瓊脂糖凝膠6快速流動的理論固定容量，約為15～20毫克血清白蛋白/毫升凝膠。
所用的柱體積約5.5毫升的凝膠(C10/10，Pharmacia)，或是為80～110毫克血清白蛋白的理論容量。所使用若為BioCad Sprint系統，則流速為2毫升/分鐘(150釐米/小時)，若為Pharmacia檢測系統則流速為3.5毫升/分鐘(260釐米/小時)。所用壓力不超過2.5巴，而且實質上視OD測定池而定。
Source 15Q第二個步驟是在一種強的陰離子交換劑即Source 15Q(Pharmacia)柱上進行。基質為與二乙烯基苯交聯的聚苯乙烯。珠子是均質性的且大小為15微米。令珠子通過大小從20變化至1000納米的孔隙系統。這些凝膠具有高抗壓性並抗高線性流動性(1800釐米/小時以上)，同時亦可維持令人滿意的分離度及容量，之所以能夠如此，是由於珠子的均質性以及其上可以促成分子與官能團接近的孔隙。
凝膠於pH2～12間呈穩定狀態，逾此範圍則凝膠易明顯損壞，從而減低其容量。
此交換劑的理論固定容量約為25毫克蛋白質/毫升凝膠。當使用0.8毫升柱(PEEK柱，內徑4.6毫米ID/長50毫米，Perkin-Elmer)時，其最大容量為20毫克蛋白質。確保有良好的分離度時的實際容量為約此最大容量的10％或2毫克蛋白質。所用流速為5毫升/分鐘(1880釐米/小時)並允許快速分離。柱則在15毫升/分鐘、150巴下用Poros selfPack系統充填。
·層析(BioCad Sprint)該BioCad是一種可以在高壓下(最大的巴)與在流速0.2～60毫升/分鐘下操作的HPLC(高效液相層析)系統。其可連接多達6種緩衝液(目前使用6個通道)並可以使用0.1摩爾濃度鹼液(pH12)處理該系統以防止管道與柱過熱。
分離過程可以在室溫或4℃進行。利用可達的通道之一或經可供小體積(100微升至5毫升)用的注射圈負載樣品。該檢測系統是使用雙通道UV測定池；對UV使用190至450納米，對可見光使用366至700納米。傳統上，檢測核酸是使用254納米，檢測蛋白質是使用280納米(此是有吸收的諸如酪氨酸、色氨酸與苯丙氨酸等具有苯環的胺基酸)。該系統是完全電腦化的(由Perspective生物系統公司發展的軟體)。其可監測每次分離時的所有參數(壓力、流速、導電性、光密度、pH等)。
最後，為將非特異性的作用減至最低，將分離的樣品回收於50毫升Falcon管中或收集於矽化的Eppendorf管中(Advantec SF-2120收集器)。
·由樹狀細胞產生胞外體首先，由外周血液單核細胞前體獲得樹狀細胞。將分離的單核細胞於GM-CSF與IL-13或IL-4的組合下培養(參照WO99/03499申請中所述技術)。為產生胞外體，優選使用未成熟樹狀細胞群落。
4.2)藍瓊脂糖凝膠6快速流動階段將培養上清液在負載於藍瓊脂糖凝膠6快速流動柱前先經600g離心兩次與10,000g離心一次。
所用柱為5.5毫升，流速2毫升/分鐘(線性流速150釐米/小時，接觸時間2.7分鐘)、壓力約2.5巴(圖5)。柱經12毫摩爾濃度BTP緩衝液(150毫摩爾濃度NaCl、pH7)平衡。平衡過後，將上清液負載入柱中，然後以相同緩衝液洗柱直至O.D.下降為止。以12毫摩爾濃度BTP緩衝液(1.5毫摩爾濃度NaCl、pH7)(3至4倍柱體積)洗脫已固定的蛋白質。通過通入水(2～3倍柱體積)隨之2倍體積0.1摩爾濃度鹼液(pH12)使柱再生。最後則以12毫摩爾濃度BTP(150毫摩爾濃度NaCl、pH7)使柱再次穩定。
藍瓊脂糖凝膠6快速流動柱階段的定量與定性如上述，藍瓊脂糖凝膠6快速流動階段特異地針對蛋白質，例如白蛋白這一培養上清液的主要汙染物。使用Biorad技術(在600納米測量OD)測量藍瓊脂糖凝膠6快速流動階段每一級分的蛋白濃度。結果列於表1。
表1藍瓊脂糖凝膠6快速流動階段每個級分的蛋白質濃度
蛋白質多數可在洗脫物(72％)或再生液(32％)中測得。未吸附的級分僅代表負載於藍瓊脂糖凝膠6快速流動柱上的總蛋白的7～10％。該階段特異性針對上清液的主要汙染物。為檢查藍瓊脂糖凝膠6快速流動柱的特異性，將每一級分於還原條件下沉積在SDS-PAGE凝膠中並以硝酸銀染色。對柱的過度負載(50毫升上清液負載於5.5毫升藍瓊脂糖凝膠6快速流動柱)是欲計算柱中每毫升的凝膠可能負載上清液中蛋白質的最大容量(表2)。在本情形中，未吸附的級分的百分比由負載的蛋白量的7％增加至超過30％。此質相當於每毫升藍瓊脂糖凝膠6快速流動凝膠可容納16至18毫克蛋白質。總之，1毫升的藍瓊脂糖凝膠6快速流動凝膠可以純化約5～6毫升培養上清液(2.5％HSAAIMV)。這個質對大規模的研究非常重要，這是因為其決定所用的柱的大小，並因此決定此階段的成本。
表2第一階段藍瓊脂糖凝膠6快速流動固定相的過度負載研究
正如預期的，經600與10,000g離心後，培養上清液的主要汙染物為白蛋白。經藍瓊脂糖凝膠6快速流動固定後，可在洗脫液與再生液級分中檢測到此汙染物。除此汙染物外，亦可檢測到其他很多低分子量與高分子量的汙染物。
該藍瓊脂糖凝膠6快速流動階段可以消除約90～95％的培養上清液汙染物。胞外體則可在藍瓊脂糖凝膠6快速流動的未吸附級分中發現(圖6)。
4.3)陰離子交換步驟Source 15Q(Pharmacia)。
使用0.8毫升的Source 15Q柱，流速為5毫升/分鐘(線性流速1880釐米/小時，接觸時間0.1分鐘)，壓力約50巴。直接將藍瓊脂糖凝膠6快速流動的未吸附的級分負載到Source 15Q上(圖7)而其鹽溶液(NaCl)濃度或pH不變。
結合步驟後，以12毫摩爾濃度pH7的BTP緩衝液(280毫摩爾濃度NaCl)(35倍柱體積)清洗柱直至OD值降至接近0。第二個清洗步驟以150毫摩爾濃度NaCl鹽濃度(10倍柱體積)進行，以增強胞外體與載體(固定相)的作用。
所採用的第一個梯度為由150至420毫摩爾濃度的NaCl，7倍柱體積(圖8)，然後以9倍柱體積結束該梯度。第二個梯度則以25倍柱體積由420毫摩爾濃度NaCl至1摩爾濃度NaCl。胞外體則在第二個梯度中分別於550與700毫摩爾濃度NaCl洗脫出成兩個峰(圖8)。通過通入10倍柱體積的水，隨之為10倍柱體積0.1摩爾濃度鹼液(pH12)以及最後通入10倍柱體積的3摩爾濃度NaCl，使柱再生。然後以12毫摩爾濃度BTP緩衝液(150毫摩爾濃度NaCl、pH7)平衡柱。
Source 15Q階段的定量與定性。
如圖6所示，未吸附的藍瓊脂糖凝膠6快速流動級分的大部分蛋白質皆未保留在柱中。蛋白質濃度是以Biorad實驗(在600納米測量OD吸收)測量的並概括於表3中。
表3藍瓊脂糖凝膠6快速流動階段後Source 15Q階段的定性問題
負載於Source 15Q柱中的蛋白質95％皆未保留。收集的第4～6級分與收集的第19～23級分代表約1.5％。再生級分則未分析。產率接近100％.所有負載的蛋白質與囊泡皆洗脫出柱外。就柱的蛋白質濃度而言，Source 15Q可以結合約25毫克蛋白質(製造商的資料)，對應於0.8毫升柱可以容納20毫克蛋白質。很清楚地，這些值與柱的最大容量距離很遠，並且只佔良好靈敏度所對應的容量的5～10％，因為其結合了1～2毫克的蛋白質。在這些條件下，使用0.8毫升Source 15Q柱有可能純化200～400毫升的培養上清液。
每一洗脫峰皆經超濾(10,000g，1小時)並合併用於進行電子顯微鏡觀測。第一個峰(於150～420毫摩爾濃度NaCl洗脫出)實質上包含蛋白質、細胞碎片與一些經抗MHC II的抗體標記的囊泡。
經相同方式處理的第二個峰(以550毫摩爾濃度NaCl洗脫出)顯示較低的背景噪音與較多的以抗MHC II的抗體標記的囊泡，囊泡的大小不均勻。
第三個峰(於700毫摩爾濃度NaCl洗脫出)未顯示任何背景噪音，該囊泡實質上均經抗MHC II的抗體標記且其大小非常均一。
以這兩個級分(第2與3峰)與那些使用傳統超速離心純化方法所取得的級分做比較。在此情況中，與兩個層析峰比較可見明顯的背景噪音而且囊泡的非均一性相當高。此外，似乎在碎片與經HPLC純化的胞外體間有所分離，此在超速離心的情況中並不存在。
4.4)結論在兩個層析階段中，第一個涉及胞外體的負選擇(藍瓊脂糖凝膠6快速流動階段)，而第二個涉及正選擇以及胞外體的選擇性洗脫(Source 15Q階段)，約可消除培養上清液中約99～99.5％的蛋白質，同時仍可保留胞外體。在電子顯微鏡觀察時，該法保持胞外體的完整性。因此，本方法是專門針對胞外體的純化。
做為實例，亦可使用其他可保留血清蛋白的柱。此外，亦可使用陽離子型大孔柱代替Source 15Q。
5)由RBL(大鼠嗜鹼性細胞白血病)細胞系產生的胞外體的HPLC純化胞外體由RBL(大鼠嗜鹼性細胞白血病)細胞系產生，該細胞系是經穩定方式轉染以在胞外體膜上表達人類MHC II分子(PCT/FR99/02691)。經以離子載體(iomicyne)誘導後，細胞脫粒並將胞外體釋放至不含蛋白質的培養基(RPMI)中。利用在600g離心10分鐘消除細胞後，回收上清液並以脫氧核糖核酸酶(Sigma)與核糖核酸酶(Sigma)處理。
然後，令經過處理的上清液在37℃於10,000g離心30分鐘，然後則是於100,000g離心1小時。
將超速離心沉降物負載入離子交換柱Source 15Q(Pharmacia)(圖9)。所用為0.8毫升柱，流速為5毫升/分鐘(線性流速1880釐米/小時，接觸時間0.1分鐘)。
柱以12毫摩爾濃度BTP緩衝液(150毫摩爾濃度NaCl，pH7)平衡。負載樣品後，以15～20倍柱體積的相同平衡緩衝液衝洗柱。洗脫是以25倍柱體積通過鹽溶液濃度由150毫摩爾濃度改變至1摩爾濃度NaCl而進行，pH則固定(圖9)。培養基中蛋白質汙染很低，這是由於細胞以PBS洗滌，而胞外體的誘導與釋放則僅在RPMI中進行。此可由在Source 15Q的未吸附級分中所觀測到的吸收(280與254納米)得到證實。胞外體的存在則利用針對MHC II分子的Western印跡分析證實(圖11)，不過其前需先經NaCl分離各峰(圖10)並對每一峰進行超速離心。
可觀察到3個峰加上一個未吸附級分第一個峰於350毫摩爾濃度NaCl洗脫出，第二個峰於700毫摩爾濃度NaCl洗脫出，至於最後的第三個峰則於1.5摩爾濃度NaCl洗脫出。700毫摩爾濃度時的峰則為主要峰。在以人類MHC II分子為目標的Western印跡試驗中，在峰1(350毫摩爾濃度NaCl)與峰2(700毫摩爾濃度NaCl)測到一個信號。
應注意峰1所顯示的Western印跡信號與峰2的信號相當，而蛋白質信號強度比峰2低7～8倍。此可能意味峰1純度較高。為證實此結果，將各峰進行超速離心並以電子顯微鏡觀察。
峰1富含用抗人類MHC II的抗體標記的胞外體，而且只有很少或沒有背景噪音。胞外體的大小不均一，似乎無法利用胞外體的大小進行胞外體的分離，但可利用洗脫液(NaCl)與胞外體間的特異性競爭機制進行分離。
兩個峰間的級分則利用電子顯微鏡分析。所檢測到的胞外體只有很少具有比峰1更高的背景噪音。
峰2與兩個峰間的級分非常相似，所檢測到的胞外體很少，背景噪音較高。
結論Source 15Q可以保留胞外體並將其與潛在汙染物分離(圖9)。絕大部分胞外體於350毫摩爾濃度NaCl以同一峰洗脫出。於電子顯微鏡觀察時，胞外體似乎「正常」，且具有針對人類MHC II分子的特異性標記。胞外體大小的不均一性(峰1)顯示該分離是基於離子交換而非篩選。因此，可使用Source 15Q作為RBL胞外體的純化步驟。
權利要求
1.一種由生物樣品製備膜囊泡的方法，其特徵在於，至少包括一個對樣品的陰離子交換層析處理。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，至少包括一個強陰離子交換層析處理步驟。
3.如權利要求1及2中任何一項所述的方法，其特徵在於，至少包括一個陰離子交換與凝膠滲透層析步驟。
4.如上述權利要求中任何一項的方法，其特徵在於，所述生物樣品是生物流體、培養上清液、溶胞液或經預純化的溶液。
5.一種由生物樣品製備膜囊泡的方法，其特徵在於，至少包括b)樣品處理，以製備富含膜囊泡的樣品，與c)樣品的陰離子交換層析和/或凝膠滲透層析處理。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，其包括a)將膜囊泡(例如胞外體)生成細胞群落於可使囊泡釋放的條件下培養，b)膜囊泡富集步驟，與c)樣品的陰離子交換層析和/或凝膠滲透層析處理。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特徵在於，所述富集步驟包括澄清階段，任選繼之以濃縮階段。
8.如權利要求5～7中任何一項所述的方法，其特徵在於，所述富集步驟包括親和層析步驟，優選在染料上進行。
9.如權利要求7或8所述的方法，其特徵在於，所述富集步驟包括低速離心步驟和/或過濾。
10.如權利要求7～9中任何一項所述的方法，其特徵在於，所述富集步驟至少包括一個超濾步驟，特別是切向超濾。
11.一種製備膜囊泡的方法，其特徵在於，其包括下列步驟a)將膜囊泡(例如胞外體)生成細胞群落於可使囊泡釋放的條件下培養，b)以至少一次超濾或親和層析步驟處理培養上清液，以產生富含膜囊泡(例如胞外體)的生物樣品，與c)該生物樣品的陰離子交換層析和/或凝膠滲透層析處理步驟。
12.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，進一步包括對經處理的製備物的過濾步驟d)。
13.如上述權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，所述膜囊泡的直徑介於約60～90納米。
14.如上述權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，所述膜囊泡是由抗原呈遞細胞所產生的囊泡，特別是由樹狀細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞或肥大細胞所產生的囊泡。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述膜囊泡是由樹狀細胞所產生，特別是由人樹狀細胞所產生。
16.如權利要求1-13中任何一項所述的方法，其特徵在於，所述膜囊泡是由腫瘤細胞所產生，特別是人腫瘤細胞所產生。
17.一種製備膜囊泡的方法，其特徵在於，其包括下步驟a)獲得一樹狀細胞群落，b)在可促使膜囊泡產生的條件下培養所述的樹狀細胞，與c)利用一種至少包括陰離子交換層析處理在內的方法純化所述的膜囊泡。
18.一種製備膜囊泡的方法，其特徵在於，其包括下列步驟a)獲得一樹狀細胞群落，b)於可促使膜囊泡產生的條件下培養所述的樹狀細胞，c)處理該培養上清液以產生富含膜囊泡的生物樣品，特別是利用超濾或親和層析步驟進行，與d)利用一種至少包括陰離子交換和/或凝膠滲透層析步驟在內的方法純化所述膜囊泡。
19.如權利要求17或18所述的方法，其特徵在於，所述樹狀細胞取自從測試對象獲得的生物樣品例如骨髓或外周血液。
20.如權利要求17至19項所述的方法，其特徵在於，所述樹狀細胞未成熟。
21.如權利要求17至20中任何一項所述的方法，其特徵在於，所述樹狀細胞在產生膜囊泡之前先經抗原致敏。
22.如權利要求17至21項中任何一項所述的方法，其特徵在於，在步驟b)中是將所述樹狀細胞於刺激膜囊泡產生的條件下培養。
23.陰離子交換層析用於製備或純化膜囊泡的應用。
24.親和層析用於製備或純化膜囊泡的應用。
25.一種組合物，其是包括利用根據權利要求1至22中任何一項的方法製備的膜囊泡。
全文摘要
本發明涉及由生物樣品製備膜囊泡的方法,其特徵在於,其至少包括一個陰離子交換和/或凝膠滲透層析的樣品處理步驟。本發明用以製備不同來源與類型的囊泡,特別是源於抗原呈遞細胞或腫瘤細胞的囊泡。本發明亦涉及以此方式獲得的囊泡及其應用。
文檔編號B01D15/08GK1355704SQ0080290
公開日2002年6月26日 申請日期2000年1月19日 優先權日1999年1月27日
發明者奧利維耶·德林, 塞巴斯萊昂·阿米戈雷納, 菲利普·拉莫, 若埃爾·克魯澤 申請人:Ap細胞股份有限公司, 法國國家衛生及研究醫學協會, 法國居裡學院