同時檢測牛奶中多種黴菌毒素的方法
2023-04-23 08:41:26
同時檢測牛奶中多種黴菌毒素的方法
【專利摘要】本發明公開了一種同時檢測牛奶中多種黴菌毒素的方法，該方法包括以下步驟：（1）提取牛奶中的黴菌毒素，得到黴菌毒素粗提取物；（2）將黴菌毒素粗提取物純化、濃縮；（3）濃縮後的黴菌毒素上色譜柱，用流動相梯度洗脫，收集洗脫物；（4）將收集的洗脫物用質譜儀進行定性定量檢測。本發明建立了一種高效、靈敏、穩定的同時檢測牛奶中黃麴黴毒素M1、赭麴黴毒素A、玉米赤黴烯酮和α-玉米赤黴烯醇的方法。本發明在生鮮乳、液態奶和奶粉中驗證了本發明檢測方法的線性、靈敏度、回收率、精確性和重現性，驗證結果證明本發明檢測方法線性範圍好、靈敏度高、可信性好、穩定性強。
【專利說明】同時檢測牛奶中多種黴菌毒素的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測牛奶中黴菌毒素的方法，尤其涉及一種採用液相色譜串聯質譜法同時檢測牛奶中黃麴黴毒素Ml、赭麴黴毒素A、玉米赤黴烯酮和α -玉米赤黴烯醇的方法，屬於牛奶中黴菌毒素的檢測領域。
【背景技術】
[0002]牛奶已成為人們生活的必需品，尤其嬰幼兒牛奶是母乳的最佳替代品，但黴菌毒素已成為牛奶的主要質量安全風險因子之一，嚴重威脅人類健康。黴菌毒素在牛奶加工過程中，無論是巴氏殺菌還是高溫殺菌均無法降解黴菌毒素，黴菌毒素可以完整殘留至奶產品中，因此，牛奶中黴菌毒素越來越受到人們的廣泛關注，特別是黃麴黴毒素M1、赭麴黴毒素Α、玉米赤黴烯酮和α -玉米赤黴烯醇因其汙染程度和毒性而受到重視。
[0003]目前，奶業發達國家已經積極監測牛奶中黴菌毒素汙染狀況，但在中國相關報導較少，這可能與缺少高通量的檢測技術存在一定關係。傳統的檢測方法各有其優缺點。酶聯免疫吸附法作為當今最具代表性的快速檢測方法，已廣泛應用於黴菌毒素分析檢測，但由於假陽性和不能精確定量等缺點限制了其進一步應用。因此，基於薄層色譜法、氣相色譜、高壓液相色譜等技術的定量檢測方法已經建立，但這些方法只能檢測一種或一類黴菌毒素，已不能滿足現代奶業中黴菌毒素的監測和科研需求。近年來，超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)因其高靈敏、高選擇性和高通量已成為多黴菌毒素分析的最普遍方法，廣泛應用於食品、飼料、血漿、尿液和中草藥中黴菌毒素的檢測。隨著人們日益關注牛奶中黴菌毒素汙染，牛奶中UPLC-MS/MS多黴菌毒素同時檢測方法成為研究的熱點，但是該方法不同程度的存在著靈敏度低、可信性差、穩定性弱等缺陷，有待改進。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種時檢測牛奶中多種黴菌毒素的方法，該方法具有線性範圍好、靈敏度高、可信性好、穩定性強等優點。
[0005]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:
[0006]一種同時檢測牛奶中多種黴菌毒素的方法，該方法包括以下步驟:
[0007](I)提取牛奶中的黴菌毒素，得到黴菌毒素粗提取物；(2)將黴菌毒素粗提取物純化後濃縮；(3)將濃縮後的黴菌毒素上色譜柱，用流動相梯度洗脫，收集洗脫物；(3)將收集的洗脫物用質譜儀進行定性定量檢測。
[0008]牛奶中黴菌毒素的提取效果對檢測是否成功具有決定性影響。有學者在飲料、牛奶和小麥中黴菌毒素檢測時，提取前利用甲酸或乙酸酸化樣品，這主要是為了提高伏馬菌素的回收率，而對黃麴黴毒素M1、赭麴黴毒素Α、玉米赤黴烯酮和α -玉米赤黴烯醇的回收率沒有顯著影響。適合的提取劑可大大提高牛奶中黴菌毒素的提取效率，在樣品中加入甲醇或乙腈既可以沉澱蛋白還可以提取黴菌毒素，但不同的基質和黴菌毒素，甲醇和乙腈的提取效率存在差別，本發明比較了提取溶劑甲醇和乙腈的提取效果，結果表明乙腈對這四種黴菌毒素的提取效率非常顯著的優於甲醇的提取效果，因此，本發明優選採用乙腈作為提取溶劑提取牛奶中的黴菌毒素。
[0009]採用超高壓液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS)檢測牛奶中的多黴菌毒素普遍存在基質效應。基質效應影響信號強度、定量限和準確度，因此UPLC-MS/MS必須考察和避免基質效應，這已成為黴菌毒素的UPLC-MS/MS檢測方法開發的重點。而減弱或消除基質效應影響的最佳辦法是對樣品進行預處理，預處理可去除幹擾物、富集痕量樣品、使得樣品與採用的分離和檢測技術更匹配。
[0010]在痕量分析中淨化和富集步驟對靈敏度具有巨大的作用。分析結果顯示，未經淨化和富集的粗提取液樣品直接進樣，幹擾峰較多，信號較差，因基質效應發生強烈的信號抑制作用，因此直接注入提取液不能滿足相關限量標準的檢測要求，需要淨化和富集樣品中的黴菌毒素。本發明比較了 mycosep226和HLB柱對黴菌毒素的純化效果，結果顯示，Mycos印226柱淨化富集時，OTA和a -ZOL的信號較差，以致無法準確定量OTA和a -Z0L。而HLB柱的淨化富集效率較高，有效的去除了幹擾物質。因此，本發明優選採用HLB柱淨化η集牛奶中黃麴黴毒素Ml、赫麴黴毒素Α、玉米赤黴稀麗和α -玉米赤黴稀醇這四種黴圃毒素。
[0011]在確定了 HLB柱為最適宜的淨化富集牛奶中黃麴黴毒素Ml、赭麴黴毒素Α、玉米赤黴烯酮和α -玉米赤黴烯醇這四種黴菌毒素方式後，本發明對包括黴菌毒素粗提取物過柱PH值、過柱速度、水洗體積和洗脫溶劑等參數進行了優化以提高黴菌毒素的吸附和洗脫效率。
[0012]本發明根據24+1全因子實驗設計篩選出關鍵影響因子。實驗結果發現，當其它參數不變時，過柱粗提液PH和洗脫液是影響純化和富集結果的兩個最關鍵參數。從響應面圖中可看出，黴菌毒素粗提取液pH值越低，洗脫液中甲醇含量越高，信號越好。隨pH(5.0 -8.5)增高，信號抑制作用增強，回收率迅速降低。因此，本發明確定黴菌毒素粗提取液過柱最佳pH值為5.0，洗脫液優選為100%甲醇。現有文獻報導pH低於6.0時，回收率會快速降低；過柱粗提取液pH為8.5時回收率最大，基質效應最小。本發明所優化的參數與文獻報導的參數差異較大。
[0013]在確定過HLB柱粗提取液pH5.0和100%甲醇洗脫液後，本發明進一步考察了水洗體積和過柱速度對淨化富集效果的影響，本發明通過多水平因子設計最終發現，當過柱速度為1.5mL/min和水洗體積2mL時,具有最佳的富集效果。
[0014]本發明中所用色譜分離採用BEH C18色譜柱(2.1 X 50mm，1.7 μ m)，流動相為甲醇和0.1%氨水,梯度洗脫黴菌毒素分析物；
[0015]採用正、負離子掃描方式進行儀器方法學研究，確定豐度比最高的離子對為監測離子分別為定性和定量離子，採用多離子反應監測模式進行檢測。
[0016]靈敏度檢測結果表明，採用本發明進行檢測，四種黴菌毒素的LOD和LOQ範圍分別為0.001 - 0.005 μ g/kg和0.003 - 0.015 μ g/kg，完全滿足中國、歐盟和美國等各國對牛奶中黴菌毒素檢測的限量要求。
[0017]不同加標水平和牛奶基質中，本發明監測方法回收率為87.0%_109%，相對標準偏差為3.4%-9.9%，這表明本發明檢測方法精密度較高。本發明方法在三個不同水平和基質中，相對標準偏差和重現性均低於10%，這表明本發明檢測方法具備較高穩定性。[0018]本發明建立了一種高效、靈敏、穩定的同時檢測牛奶中黃麴黴毒素M1、赭麴黴毒素A、玉米赤黴烯酮和α -玉米赤黴烯醇的超高效液相色譜串聯質譜法。以0.1%氨水和甲醇為流動相進行梯度洗脫，利用BEH C18色譜柱在2min內就能成功分離這四種黴菌毒素。本發明檢測方法分別在生鮮乳、液態奶和奶粉中得到驗證，線性、靈敏度、回收率、精確性和重現性都證明本發明檢測方法線性範圍好、靈敏度高、可信性好、穩定性強。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1 0.025 μ g/kg混合標準溶液在多反應監測模式下的選擇性離子流圖。
[0020]圖2不同黴菌毒素提取劑的回收率:甲醇和乙腈牛奶樣品加標濃度0.025 μ g/kg。
[0021]圖3加標0.025 μ g/kg的牛奶樣品直接進樣的結果。
[0022]圖4加標0.025 μ g/kg的牛奶樣品過HLB柱對黴菌毒素的純化效果。
[0023]圖5加標0.025 μ g/kg的牛奶樣品過mycosep226柱對黴菌毒素的純化效果。
[0024]圖6 AFM1的過柱因子效應按減序排列的帕累託圖。
[0025]圖7 AFM1的響應面圖；水洗體積2mL，固相萃取流速0.5mL/min。【具體實施方式】
[0026]通過下列實施例將更具體說明本發明的實施方式，但是應理解所述實施例僅是範例性的，不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護範圍。1.實驗儀器及試劑
[0027]1.1主要實驗儀器
[0028]表1主要實驗儀器
[0029]
【權利要求】
1.一種同時檢測牛奶中多種黴菌毒素的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟:(1)提取牛奶中的黴菌毒素，得到黴菌毒素粗提取物；(2)將黴菌毒素粗提取物純化、濃縮；(3)將濃縮後的黴菌毒素上色譜柱，用流動相梯度洗脫，收集洗脫物；(3)將收集的洗脫物用質譜儀進行定性定量檢測。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於:用乙腈作為提取溶劑提取牛奶中的黴菌毒素。
3.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於:將黴菌毒素粗提取物過固相萃取柱HLB柱進行純化、濃縮。
4.按照權利要求3所述的方法，其特徵在於:將黴菌毒素粗提取液pH值調為5.0 - 8.5後上固相萃取柱HLB柱，水洗後再用洗脫液洗脫，收集洗脫液。
5.按照權利要求4所述的方法，其特徵在於:將黴菌毒素粗提取液pH值調為5.0後再上固相萃取柱HLB柱。
6.按照權利要求5所述的方法，其特徵在於:所述的洗脫液是100%甲醇。
7.按照權利要求3或4所述的方法，其特徵在於:將黴菌毒素粗提取液按照0.5-1.5mL/min的過柱速度過固相萃取柱HLB柱；優選的，將黴菌毒素粗提取液按照1.5mL/min的過柱速度過固相萃取柱HLB柱。
8.按照權利要求4所述的方法，其特徵在於:水洗體積為2-6mL，優選為2mL。
9.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於:色譜分離採用BEHC18色譜柱，流動相為甲醇和0.1%氨水,梯度洗脫黴菌毒素分析物。
10.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述的黴菌毒素是黃麴黴毒素M1、赭麴黴毒素A、玉米赤黴烯酮和α -玉米赤黴烯醇。
【文檔編號】G01N30/02GK103543221SQ201310461017
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月30日 優先權日:2013年9月30日
【發明者】王加啟, 鄭楠, 黃良策, 程建波, 李松勵, 張養東 申請人:王加啟, 鄭楠, 黃良策