用於體內傳送生物製品的方法及用於該方法的組合物的製作方法

2023-04-22 19:57:26 4

專利名稱：用於體內傳送生物製品的方法及用於該方法的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物製品的體內傳送。一方面，是將生物製品與生物相容材料製成的聚合物外殼相結合。該生物製品可以聚合物外殼本身結合在一起，和/或將生物製品(或者是懸浮於/分散於生物相容分散劑中的生物製品)包含在聚合物外殼之內。另一方面，將與聚合物外殼相結合的生物製品給一個體給藥，或者是分散於一種合適的生物相容液體中給藥。
存在於血液中的微粒體和外來小體一般是由「血液過濾器官」，即脾臟，肺臟和肺臟，從血液循環中清除的。正常全血中所含有顆粒物質包括紅細胞(一般直徑8微米)，白細胞(一般直徑6—8微米)和血小板(一般直徑1—3微米)。大多數器官和組織中的微循環可以使這些血液細胞自由通過。當血液循環中存在直徑大於l0—15微米的小血栓(血塊)時，就會有毛細管梗塞或阻塞的危險，導致局部缺血或氧缺乏以及可能出現組織壞死。因此，必須避免向血液循環中注射直徑大於10—15微米的顆粒。儘管如此，小於7—8微米的顆粒混懸液還是相對安全的，曾經用它傳送過脂質體和乳劑形式的藥物活性成份，營養試劑，和成像用的對比劑。
顆粒的大小及其傳送方式決定了它們的生物功能。Strand等人[in Microsphere—Biomedical Applications，ed.A.Rembaum，PP193—227，CRC Press(1988)]曾報導過顆粒的傳送狀況取決於它們的大小。在組織間質注射之後，大小在幾毫微米至100毫微米之間的顆粒進入毛細淋巴管，在淋巴結中就會出現吞噬作用。靜脈/動脈注射之後，小於大約2微米的顆粒會很快被血液中的網狀內皮系統(RES)，也稱之為單核吞噬細胞系統(MPS)，所清除。大於約7微米的顆粒在靜脈注射之後，會被肺毛細管所捕獲。動脈注射之後，在到達的第一個毛細血管床把顆粒捕獲。小泡狀的巨噬細胞捕獲吸入的顆粒。
對於不溶於水或難溶於水對胃酸環境敏感的藥物來說，不能按常規方式給藥(如靜脈注射或口服給藥)。通過在表面活性劑或乳化穩定劑存在下將油穩定的藥物與水溶液(如生理鹽水)一起乳化製成穩定的微粒乳劑可以實現這些藥物的非腸道給藥。只要乳化劑的成份在藥理學是隋性的，即可以將這些乳化劑靜脈注射。例如，美國專利NO.4,073,943描述了在表面活性劑如卵磷脂，普盧蘭尼克(聚丙二醇與聚乙二醇的共聚物)，油酸聚甘油酯等存在下將溶於油的非水溶性藥理活性成份與水乳化後的給藥。PCT國際專利公開號NO，WO85/00011描述了具有適合於皮內或靜脈注射大小範圍的，用磷脂，如二肉豆蔻醯卵磷脂，包裹的麻醉藥物微小滴劑。
有文獻報導用蛋白微粒作用藥理或診斷試劑的載體。通過熱變性或化學交聯已製備出了白蛋白微球體。熱變性微球體是在100℃至150℃的溫度之間由一種乳化混合物(如，白蛋白，所要加入的試劑，和一種合適的油)製得。然後用一種合適的溶劑洗滌微球體，並貯存。Leucuta等人(Internation-al Journal of Pharmaceutics vol 41213—217(1988))描述熱變性微球體的製備方法。
製備化學交聯微球體的方法包括用戊二醛處理乳化液以使蛋白交聯，然後洗滌和貯存。Lee等人[Science Vol.213233—235(1981)]和美國專利No.4,671,954報導了這種製備方法。
上述用於製備作為藥理活性成份載體的蛋白微球體的方法，雖然適用傳送水溶性試劑，但不能攜帶不溶於水的試劑。這種限制是基於使油包水乳劑的水相中蛋白成份交聯或熱變性的製劑技術所固有的。任何水溶性試劑溶於含有蛋白的水相中可以被這種所產生的交聯或熱變性蛋白基質所包裹攜帶，但是難溶於水或溶於油的試劑不能結合到由這些方法形成的蛋白基質中。
因此，許多難溶於水的生物製品給人體給藥帶來了問題。的確，如果口服給藥傳送藥物是無效的，這種本來不溶於或難溶於水介質的藥理活性成份的傳送會受到嚴重削弱。因此，目前用於傳送本來不溶於或難溶於水介質的藥理活性成份的製劑中需要加入試劑以穩定藥理活性成份。儘管如此，用於穩定藥理活性成分的試劑(如乳化劑)還是會經常引起嚴重的過敏反應。因此，一般的給藥方法是在注射藥理活性成份之前先用抗組織胺藥和類固醇治療病人以減少藥物傳送所加入試劑的過敏作用。
在努力改進本來不溶於或難溶於水介質的藥物水溶性過程中，一些研究者曾用能帶來強水溶性的官能團對藥物的結構進行公學改性。現有技術中所述的化學改性是製備磺化的衍生物[Kingston et al.，美國專利5,059,699(1991)]，和胺基酸酯[Mathew et al.，J.Med.Chem.Vol.35145—151(1992)]，它表現出明顯的生物活性。這種改性產生的水溶性衍生物有助於本來不溶於或難溶於水的藥物在水介質(溶於無害的載體如生理鹽水)中的靜脈內傳送。儘管如此，但這種改性給藥物製備增加了成本，還會引起不希望發生的副作用和/或過敏反應，和/或降低藥物的效果。
常常難以傳送的生物製品是氧。的確，不能過分強調用作紅細胞代用品(「血液代用品」或「人造血」)的臨床安全性和有效的氧攜帶介質的要求。這些介質的一些可能的用途包括(A)一般的輸液應用，包括常規和緊急情況下替代急性失血，(B)在器官移植前體外支持器官或體內手術中支持器官，(C)向體內局部缺血的組織和器官加強氧傳送，(D)向血管供應不足的腫瘤加強氧傳送以增加放療或化療的效果，(E)在實驗研究中支持器官或動物，和(F)向培養基中的活細胞增加氧輸送。
輸血可以用來補充患有各種疾病的病人的血液動力系統，這些疾病包括血溶量的減少，(如由於失血引起)，紅細胞數目的減少(如，由於骨髓破壞引起的)或血細胞受損或破壞(如由於溶血性貧血引起)。輸血不僅可以增加血管內的容量，而且還可以提供攜帶有溶解氧的紅細胞有助於向組織供氧。
在向已經過大量失血的病人的輸血過程中，對於供血者和接受輸血者的血型要小心匹配以使之相容。這樣常使病人經歷一段有害的缺氧時間。而且，即使是有通過預先採血和貯存的病人自己提供的自體紅細胞，由於存放時間的原因這些自體細胞氧攜帶能力和安全性都會降低。因此，在輸液後24小時的時間內，病人會處於非最佳氧傳送狀態。最後，在所有的全血或從中得到的紅細胞輸血過程中，一直存在著病人受病毒和/或細菌感染的危險。
因此，大家公認需要有一種在正常環境狀況下用於氧運輸和傳送的替代物質，它應具有如下特性。理想的是，用於氧運輸和傳送的物質應當能夠攜帶和傳送氧到達裝置、器官和組織以致於使這些環境保持正常的氧壓。理想的這種物質應當是安全和無毒，無細菌和/或病毒汙染，和無抗原性和無熱原性(也即小於0.25EU/ml)。另外，用於氧運輸和傳送的物質應當具有與血液相匹配的粘度、膠態和滲透特性。還希望這種物質能夠長時間地保持在病人的血液系統內，從而使得病人自己的紅細胞再生和成熟。而且，還希望使用的這種物質不影響或阻礙紅細胞的生成。
目前，已有一些靜脈液體可用於治療急性血容量減少，包括類晶體的，如乳酸鹽林格溶液或生理鹽水，和膠體溶液，如正常人血清白蛋白。類晶體和膠體的溶液可以暫時地糾正血容量的不足，但是不能直接補充給組織的氧傳送。儘管輸血是優選的治療方式，但是是否能夠有足夠量的安全的血液來源是一個永久性的問題。
其他一些經常是不溶於或難溶於水介質，並且希望是溶於一種無毒載體如生理鹽水中給藥的，且有利於儘可能減少不希望發生的副作用和/或過敏反應的生物製品是一些診斷試劑，如對比試劑。
對比劑在放射學成像過程中是需要的，因為它能夠有利於觀察器官(也即，它們的位置，大小和形態)和其它的細胞結構與周圍組織的區分。例如，即使軟組織具有顯著不同的生物學功能(如，肝和脾)，但它們具有類似的細胞組成(即，它們基本由水組成)。
磁共振成像(MRI)或核磁共振成像技術是應用射頻輻射檢查應用磁場強度下的特定原子核。在某些方面它類似於X—線計算機體層成像(CT)，它能提供(在某些情況下)器官的斷層成像，並且有可能具有明顯的軟組織解析度。目前應用當中，它的影像是器官和組織中質子的分散圖。但是，與X—線計算機體層成像不同的是，MRI不使用離子化輻射。因此，MRI是一種安全無害的醫學成像技術。
儘管NMR現象早在1954年就被發現了，但是將其作為描述內部結構的工具用於醫學診斷只是近些年的事情。該技術是由Lauterbur[Nature242190—191(1973)]首次建立的。
大家熟知具有合適的核旋轉的原子核在應用磁場的方向上排列成直線。核旋轉可以是兩種方式排列成直線與外部磁場方向相同或相反。沿磁場方向排列更為穩定；而在不穩定狀態中排列(即，逆磁聲方向)必須吸收能量。對於質子來說，在1特斯拉(1特斯拉＝104高斯)磁場存在下這些核以42.6MHZ的頻率旋進或共振，在此頻率下，輻射的射率脈衝(RF)會激發原子核，並改變它們的旋轉方向以逆磁場方向排列成直線。RF脈衝之後，被激發的原子核「松馳」或反回到平衡狀態或沿磁場方向排列成行。可以用兩種松馳術語描述松馳信號減弱。T1，旋轉—點陣松馳時間或縱向松馳時間，是原子核返回到沿外部應用磁場方向的平衡狀態所需要的時間。第二，T2，或旋轉———旋轉松馳時間，是與單個質子旋轉的起始連貫旋進時間間隔有關。不同種類的哺乳動物中各種體液、器官和組織的松馳時間都有完整的記錄。
MRI的優點之一是可以選擇不同的掃描平面和切面厚度而不會失去解析度。這使得能夠直接獲得高質量的橫向、冠狀和矢狀的影像。MRI設備中沒有任何移動部件保證了高度的可靠性。一般認為在選擇性地檢查組織方面MRI比X—線計算機體層成像(CT)具有更大的潛能。在CT中，X—線衰減係數單獨確定影像對比，而至少有三種分離的變量(T1，T2和原子核旋轉密度)決定了磁共振影像。
由於器官和組織中的細微生理—化學差異，MRI能夠區別組織的類型並檢查出X—線或CT所不可能檢查出的疾病。比較而言，CT和X—線只能對組織和器官中電子密度的差異敏感。由MRI技術能夠得到的影像，由於具有更好的立體解析度，還能使醫生檢查出比CT能夠檢查出的更小的結構。另外，使用MRI技術可以容易地獲得任何影像掃描平面，包括橫向，冠狀和矢狀的。
目前，MRI被廣泛用於許多醫學疾病的輔助診斷。例如，關節損傷，骨髓疾病，軟組織腫瘤，縱隔浸潤，淋巴結病，海綿狀血管瘤，血友病，肝硬變，腎細胞癌，子宮平滑肌瘤，子宮內膜異位，乳腺癌，狹窄性病性，冠狀動脈疾病，分割性動脈瘤，脂肪瘤肥大，房間隔病，縮窄性心包炎，等等。[見，例如，Edelman Warach，Medical Progress 328708—716(1993)；Edelman Warach，New England J. of Medicine328785—791(1993)]。
常規使用的磁共振成像目前是基於來自細胞內水分子的質子信號。因此，經常難以解釋影像和區分單獨器官及細胞結構。有兩種可能的方法來更好地區分質子信號。第一種是使用對比劑來改變一個區域內水分子的T1或T2以與其他區域比較。例如，亞乙基三胺五乙酸釓(Gd—DTPA)可以縮短它附近水分子的質子T1松馳時間，從增強了所獲得的影像。
如上所述，順磁陽離子，例如，Gd，Mn，和Fe是良好的MRI對比劑。它們能夠縮短周圍水的質子T1松馳時間，以增強所獲得的MRI影像，否則這種影像是無法閱讀的。
第二種區分單獨器官和細胞結構的方法是導入另一種能夠成像的原子核(即，成像劑)。使用第二種方法，只能在對比劑到達的地方成像。這種方法的優點是排除周圍水的幹擾而獲得影像。合適的對比劑必須是生物相容的(即，無毒，化學穩定性，不與組織發生反應)並能在有限的時間內從體內消除。
雖然氫一直被選為MRI掃描的典型基礎(因為體內有大量的氫)，但是由於缺乏對比，產生的是非常差的影像區域。因此，使用其他的活性MRI原子核(如氟)具有優越性。Mattery曾在文章中[見SPIE，626，XIV/PACS IV，18—23(1986)]描述了在不同診斷成像技術如超聲波，磁共振，放射照相和計算機體層照相中使用特定的全氟化碳。使用氟是有益的，因為在體內天然不存在氟。
現有技術提到的可用於醫學診斷目的的磁共振的含氟化合物限於從一組水溶性或能夠形成乳劑的含氟分子中選擇。因此，現有技術中使用水溶性氟化碳的氟化碳乳劑具有行多缺點，例如，1)使用了不穩定的乳劑，2)缺乏器官特異性和目標性，3)由於使用了乳化劑和表面活性劑(如卵磷脂和卵黃卵磷脂)有可能誘發過敏反應，4)傳送能力有限，和5)靜泳注射後這種水溶性氟化碳很快被血液稀釋。
根據本發明，提供了用於體內傳送生物製品的，適合於以水懸浮液非腸道給藥的微顆粒形式的組合物。本發明組合物含有與聚合物外殼相結合的生物製品(固體、液體或氣體的)。該聚合物外殼是一種有二硫鍵存在下交聯的生物相容材料。與生物製品相結合的聚合物外殼可以懸浮於一種生物相容基質中給藥。用本發明組合物傳送生物製品排除了以含有，例如，乙醇和多乙氧基蓖麻油，並用生理鹽水稀釋的乳劑形式給藥生物製品的必要性(見，例如，Norton et al.，inAbstracts of the 2nd National Cancer Institute Workshopon Taxol Taxus，September 23—24，1992)。這些已知組合物的缺點是它們有可能產生過敏副作用。
根據本發明的另一方面，驚奇和未預料地發現根據本發明製備的不溶結構的血紅蛋白(Hb)可以可逆性地結合氧。本發明的不溶性血紅蛋白結構(IHC)結合氧的氧親合性與用紅細胞中可溶性血紅蛋白分子或現有技術中曾描述過的用作可能的血液代用品的可溶性改性的血紅蛋白分子獲得的氧親合性相似。
根據本發明的另一方面，還提供了將生物製品包裹在聚合物外殼中的方法。本發明的另一方面，還提供了獲得局部氧和溫度數據的方以及獲得體內器官和組織的氟磁共振影像的方法。
以微顆粒混懸液的形式傳送生物製品，通過使不同大小的顆粒和通過不同途徑給藥，可以在某種程度上到達靶器官如肝臟，肺臟，脾臟，淋巴循環系統，等。本發明的傳送方法還使得生物製品給藥，例如基本上水不溶性藥理活性成份的給藥，以比現有技術的傳送系統所需的給藥體積和時間(即傳送一典型人體劑量的200—400mg的紫杉醇需要在24小時的時間內靜脈輸液大約1至2升的液體)更小的液體量和大大減少的給藥時間來完成。
例如，本發明聚合物外殼的混合液可以靜脈內給藥，使得產生血管化器官(如肝臟，脾臟，淋巴和肺)和骨髓的影像成為可能。由於網狀內皮系統(RES)(也稱之為單核吞噬細胞(MNP)系統)能夠攝取微米大小的含有機氟的聚合物外殼，因此可以獲得器官靶特異性。象肝臟和脾臟這樣的器官在從血液中清除外來品種物質(如，顆粒物質)過程中起著重要作用，因此經常被稱之為「血液過濾器官」。
這些器官組成了大部分的網狀內皮系統。此外，淋巴循環中的淋巴結合有網狀內皮系統的細胞。所以，使用本發明的微米大小的含有機氟聚合物外殼使淋巴系統的成像成為可能。口服給藥或作成一種栓劑，也能進行胃和胃腸道的成像。這種懸浮液也能被注入非血管部位，如腦脊髓腔使這些部位成像。
作為本發明的又一實施例，順磁陽離子如Gd，Mn，Fe等能與多聚陰離子如藻酸鹽連結，並用作一種有效的MRI對比試劑。
本發明通過下述方法克服了現有技術中的缺陷，即提供了1)含生物製品的聚合物外殼的可注射用懸浮液，2)與簡單的乳化液相比具有增強了的穩定性形式的生物製品，3)由於RES或MNP系統攝取本發明的聚合物外殼，而具有靶器官的特異性(例如，肝，脾，肺等)，4)無乳化劑體系，由此避免了可能潛在引發過敏反應的試劑，以及5)由於本發明含有生物製品的聚合物外殼能夠把一個特定器官作為靶目標，從而具有注射相對少劑量的生物製品並仍能獲得較好反應的性能。


圖1是按照本發明所製備的一種聚合物外殼的示意圖。圖中，A指不溶性二硫化物交聯的聚合物外殼，B指該聚合物外殼的內部，它含有氧或其它氣體，含有溶有氧的氟代烴，溶有生物製品的一種生物相容油，含水基質中溶有生物製品的油包水型乳化液，液體中擴散有固體顆粒的一種混懸液等等，C表示該聚合物外殼的厚度，一般大約為5—50毫微米，而D是表示該聚合物外殼的直徑，一般大約在0.1至20微米的範圍內。
圖2表示無基質的血紅蛋白溶液的氧結合曲線(虛線曲線)和含有本發明不溶性血紅蛋白結構的溶液的氧結合曲線(實線曲線)(即，以希耳氏係數與氧分壓的函數表示的曲線)。本發明不溶性血紅蛋白結構的實際數值點用實心框表示。
圖3表示無基質的血紅蛋白溶液的氧結合曲線(虛線曲線)和含有用1.7mM變構效應物2，3—雙磷酸甘油酯(2，3—BPG)處理後的本發明不溶性血紅蛋白結構的溶液的氧結合曲線(實線曲線)。本發明不溶性血紅蛋白結構的實際數值點用實心框表示。
按照本發明，提供一種體內傳送生物製品的組合物，其中所述的生物製品選自於基本上完全包含在一種聚合物外殼中的一種固體，它可以是分散在一種生物可適應的擴散劑中，基本上完全包含在一種聚合物外殼中的一種液體，它可以是分散在一種生物可適應的擴散劑中，基本上完全包含在一種聚合物外殼中的一種氣體，它可以是分散在一種生物可適應的擴散劑中，與聚合物外殼相結合的一種氣體，或者是上述任意兩種或多種的混合物，其中該殼最大橫切面直徑不大於10微米左右，其中該聚合物外殼含有一種基本上以二硫鍵交聯的生物可接受的物質，以及其中該聚合物外殼的外部可以用一種適當試劑任意改性，其中該試劑是通過共介鍵與該聚合物外殼連接的。
這裡所用的術語「體內傳送」是指通過口服、靜脈、皮下、腹膜內、鞘內、肌肉內、顱內、吸入、局部、經皮、栓劑(直腸)、陰道栓(阻道)等等給藥途徑來輸送一種生物製品。
這裡所用的術語「生物製品」是指藥物活性劑(如止痛劑，麻醉劑，止喘藥，抗菌素，抗抑制藥，抗糖尿病藥，抗真菌劑，抗高血壓藥，抗炎劑，抗腫瘤劑，抗焦慮劑(anxiolytic a-gents)，酶活化劑，核酸結構，免疫促進劑，免疫抑制劑，生理活性氣體，疫苗等)，診斷試劑(如超聲對比劑，放射對比劑，或磁對比劑)，有營養價值的試劑等等。
這裡所用的術語「微米」是指毫米的千分之一的測量單位。
許多生物相容物質可以被用於實施本發明形成一種聚合物外殼。這裡所用的術語「生物相容」是指不會以任何有害方式明顯改變或影響它所被導入的生物系統的物質。基本上任何天然或合成的結構中含有巰基或二硫鍵的物質可用來製備二硫鍵交聯的外殼。巰基或二硫鍵可預先存在於生物相容物質結構中，或者通過一種適宜的化學改性將它們導入。例如，對這種改性來說天然產生的生物相容物質如蛋白質，多肽，寡肽，多核苷酸，多糖(如，澱粉，纖維素，葡聚糖，藻酸鹽，脫乙醯殼多糖，果膠，透明質酸等等)，脂類，等等都是都選擇的物質。其它連接鍵如酯鍵，醯胺鍵，醚鍵等也能在超聲照射步驟中形成(只要在起始物中含有必要官能團)。
作為生物相容物質的適當例子，天然產生的或合成的蛋白只要具有足夠的巰基或二硫鍵以形成交聯(例如，在超聲照射中由於氧化作用通過二硫鍵形成)，這些蛋白質都可以使用。蛋白質的適當例子包括白蛋白(含有35個半胱氨酸殘基)，胰島素(含有6個半胱氨酸)，血紅蛋白(每個α2β2單位含有6個半胱氨酸殘基)，溶菌酶(含有8個半胱氨酸殘基)，免疫球蛋白，α—2—巨球蛋白，纖維素壞死蛋白(fibronectin)，玻璃體壞死蛋白(vitronectin)，纖維蛋白原等等，以及它們中的任意兩種或多種的混合物。
目前用於形成聚合物外殼的優選蛋白質是白蛋白。用於形成聚合物外殼的其它優選蛋白質是血紅蛋白。還有用於形成聚合物外殼的其它優選蛋白質是白蛋白和血紅蛋白的混合物。或者，象α—2—巨球蛋白(一種已知的調理素)這樣的蛋白質可以用來促進巨噬細胞樣細胞對包裹有生物製品顆粒的外殼的攝取，或者促進肝臟、脾臟對外殼包裹顆粒的攝取。在形成聚合物外殼過程中，也可以使用其他的功能性蛋白質，如，抗體或酶，它們能夠促進傳送生物製品到達所希望的靶位點。
類似地，含有巰基或二硫鍵的合成多肽對形成具有一種聚合物外殼的顆粒來說也是良好的可選擇物質。此外，聚二醇(如，直鏈或支鏈的)，聚乙烯醇，甲基丙烯酸多羥基乙酯，聚丙烯酸，聚乙基噁唑啉，聚丙烯醯胺，聚乙烯吡咯烷酮等等對化學改性(導入巰基和/或二硫鍵以及殼體形成(通過引起它們的交聯)來說都是良好的可選擇物。
在製備本發明組合物中，人們能夠任意使用一種分散劑來懸浮或溶解生物製品。能夠用於實施本發明的分散劑包括能懸浮或溶解生物製品但不與形成殼體所用的聚合物或者生物製品本身產生化學反應的任何液體。例如水，植物油(如，大豆油，礦物油，玉米油，菜子油，椰子油，橄欖油，紅花油，棉花籽油等)，具有4—30個碳原子的脂族、環脂族、或芳香烴(如正—十二烷，正—癸烷，正—己烷，環己烷，甲苯，苯，等)，具有1—30個碳原子的脂肪醇或芳香醇(如，辛醇等)，具有2—30個碳原子的脂肪酸酯或芳香酯(如辛酸乙酯等)，具有2—30個碳原子的烷基，芳基、環醚(如，二乙醚，四氫呋喃等)，具有1—30個碳原子的烷基滷化物或芳基滷化物(和可以是一個以上的滷素取代基，如，CH3Cl，CH2Cl2，CH2—Cl—CH2Cl等)，具有3—30個碳原子的酮類(如丙酮，丁酮等)，聚二醇(如，聚乙二醇等)，或者它們中任意兩種或多種的混合物。
特別優選的分散劑組合物包括揮發性液體如二氯甲烷，乙酸乙酯，苯等(即，對藥物活性劑有高級溶解性並能溶於所用的其它分散劑的溶劑)和一種揮發性較低的分散劑。當加入到其它分散劑時，這些揮發性添加劑有助於促進藥物活性成份在該分散劑中的溶解。由於該步驟常耗費時間所以這種混合物是最理想的。溶解完成後，可以蒸發除去這些揮發性組分(任選在真空下)。
按本發明所述製備的，基本上完全包含在聚合物外殼中或與之結合的生物製品顆粒，可以是只以顆粒形式給藥，或者是以一種溶於生物相容基質中的混懸液給藥。這種基質可以選自於水，緩衝的含水基質，生理鹽水，緩衝的生理鹽水，任選緩衝的胺基酸溶液，任選緩衝的蛋白溶液，任選緩衝的糖溶液，任選緩衝的碳水化合物溶液，任選緩衝的維生素溶液，任選緩衝的合成聚合物溶液，含脂類的乳化液等等。
按照本發明的其它實施方案，還提供了用於體內傳送的生物製品製劑的製備方法，該方法包括把含有能夠被二硫鍵交聯的生物相容物質的基質和生物製品經過高強度超聲條件處理一段時間，足以促使該生物相容物質被二硫鍵所交聯；其中所述的生物製品基本上完全包含在聚合物外殼中，並且其中該殼的最大橫切直徑不大於10微米。
因此，按照本發明，包含在聚合物外殼中的生物製品是用高強度超聲合成的。在形成穩定的聚合物外殼中包括兩個非線性聲學處理步驟(即，聲波乳化和空化)首先，聲波乳化使該生物製品分散在蛋白水溶液中。然後通過形成二硫鍵來化學交聯和穩定所形成的分散體。用經過聲波空化產生的過氧化物氧化半胱氨酸的殘基(這裡的聚合物是一種蛋白質如白蛋白)來形成二硫鍵。
可選用離心過濾器(100KDa截獲)過濾所得到的懸浮液並把濾得的結構或微囊懸浮於生理鹽水或適當的緩中液中。圖1顯示了這樣一種結構的示意圖。這些結構的平均直徑為2微米左右。用一臺Elzone顆粒計數器所測定的顆粒大小分範圍是相當窄的(一般觀察到平均直徑在3微米左右的高斯分布)。用這種技術得到的顆粒大小範圍是在0.1至20微米之間。優選顆粒大小範圍在0.5到10微米之間，最優選範圍是1到5微米。這種顆粒大小特別適合於醫學應用，這是因為能夠進行靜脈內或動脈內注射，而沒有小血管堵塞和繼發組織(因氧氣缺乏而局部缺血)壞死的危險。作為對照，正常紅細胞直徑大約是8微米。
上述步驟的非顯而易見特徵是分散劑的選擇，物別涉及到分散劑的極性選擇。有關生物製品顆粒的殼體的形成過程包括，在水相和非水相之間的交界處，使生物相容物質重新取向，從而使生物相容物質中的親水區暴露於水相，而生物相容物質中的疏水區定向於非水相。在該生物相容物質是一種蛋白質的情況下，為了完成其構象的有效展開或改變，必須給這種聚合物提供能量。在兩種液相(即水相和非水相)間的界面自由能(界面張力)使界面處的蛋白構象發生改變。熱能也是蛋白構象展開和/或改變所需的能量庫。
熱能輸入是下列變量的函數，即高強度超聲波輻射過程中所用的聲音功率，高強度超聲波輻射的時間，經受高超率超聲波輻射的物質性能，經受高強度超聲波輻射的物質性質等。高強度超聲波輻射過程中的聲音功率變化範圍很大，一般在1到1000特/釐米2的範圍內；50到200瓦特/釐米2是聲音功率的優選範圍。類似地，暴露於高強度超聲波輻射的時間變化範圍也很大，一般在幾秒鐘到大約5分鐘的範圍內。在高強度超聲波輻射中的暴露時間最好在大約15到60秒鐘範圍內。本領域熟練技術人員公知所用的聲音功率越高，需要在高強度超聲波輻射的暴露時間就越短，反之亦然。
界面自由能與兩種液體間極性差值成正比。所以在指定操作溫度下兩種液體間界面處的最小自由能是形成所需聚合物外殼的基本能量。因此，如果使用同源系列的分散劑而逐漸改變其極性，如，烷基酸乙酯，那麼同源性越大就越沒有極性，即，這些分散劑和水間的界面張力是隨著酯類中碳原子數目的增大而增加的。所以，我們發現，儘管乙酸乙酯是與水不溶混的(即，一種兩個碳原子酸的酯)，但是在室溫下(～20℃)，這種分散劑單獨不會產生較大產率的聚合物外殼包裹的顆粒。相反，一種高級酯如辛酸乙酯(一種8個碳原子酸的酯)卻產生較高產率的聚合物外殼包裹的顆粒。實際上，庚酸乙酯(一種7個碳原子酸的酯)產生中等產率的顆粒而較低級的酯(3，4，5或6個碳原子酸的酯類)得到更低的產率。因而，在指定溫度下，人們能夠設定一個形成高產率聚合物外殼包裹的顆粒所需的最小含水分散劑界面張力的條件。
溫度是可以被控制影響聚合物外殼包裹顆粒產率的另一個變量。通常，液體表面張力隨著溫度的增長而降低。溫度對表面張力的變化率經常因不同液體而不同。所以，例如，兩種液體之間的界面張力(Δγ)可以是T1溫度下的Δγ1和T2溫度的Δγ2。如果T1下的Δγ1與形成本發明聚合物外殼所需的最小值接近，並且，如果Δγ2(T2溫度下)大於Δγ1，那麼，從T1到T2的溫度改變將增加聚合物外殼的產率。實際上，這種變化在使用庚酸乙酯的情況下可以觀察到，在20℃庚酸乙酯得到中等產率而在10℃得到較高產率。
溫度也影響所用液體的蒸氣壓。溫度越低，總蒸氣壓就越低。總蒸氣壓越低，空泡的破裂就越有效。超聲波輻射空泡的崩破率增加與過氧化物(HO2-)形成率的增加相關。過氧化物生成率增加可以使較低溫上聚合物外殼的產率增加。但是，儘管如此，與此相反，用過氧化物離子氧化巰基(即，形成二硫鍵)的反應率是隨著溫度的增長而增加的。所以，對一種經過超聲波輻射條件處理的指定液體來說，存在一個能夠獲得高產率聚合物外殼的相當窄的最佳溫度操作範圍。
因而兩種作用的結合，即，表面張力隨溫度的變化(它直接影響到該聚合物的展開和/或構象的改變)和反應產率隨溫度的變化(該反應是指通過形成二硫鍵而發生的聚合物交聯)這兩者的結合表示了聚合物外殼包裹顆粒的總體變化和產率。適合於製備本發明聚合物外殼的溫度在大約0—80℃的範圍內。
可對上述超聲波輻射步驟進行操作來生產含有具有一定大小範圍的生物製品的聚合物外殼包裹的顆粒。這裡優選顆粒半徑在大約0.1至5微米的範圍內。在這個範圍內較窄的大小分布非常適合於生物製品的靜脈內給藥。最好把聚合物外殼包裹的顆粒懸浮於生物相容的基質中(如本文所描述的)，再用適當方式給藥。
此外，可以用一種適當的試劑對該聚合物外殼進行改性，其中該試劑是通過一種任意共價鍵與該聚合物外殼結合的。能夠用於這種結合的共價鍵有酯鍵，醚鍵，氨基甲酸乙酯鍵，二酯鍵，醯胺鍵，仲胺或叔胺鍵，磷酸酯鍵，硫酸酯鍵以及其它類似的鍵。適合於這種任意改性聚合物外殼的適當試劑有合成聚合物(聚二醇(如直鏈或支鏈的聚乙二醇))，聚乙烯醇，甲基丙烯酸多羥基乙酯，聚丙烯酸，聚乙基惡唑啉，聚丙烯醯胺，聚乙烯吡咯烷酮等)，磷脂(如磷脂醯膽鹼(PC)，磷酸醯乙醇胺(PE)，磷脂醯肌醇(PI)，神經鞘磷脂等)，蛋白質(如酶，抗體等)，多糖(如澱粉，纖維表，葡聚糖，藻酸鹽，脫乙醯殼多糖，果膠，透明質酸等)，化學改性劑(如5′—磷酸吡哆醛，吡哆醛的衍生物，二醛，琥珀醯水楊酸酯等)，或者它們中任何兩種或多種的混合物。
用一種聚合物外殼包裹的溶解生物製品的一般情況是可能發生變化的。可以使用生物製品顆粒在生物相容分散劑中的混懸液(替代含有溶解的生物製品的生物相容分散劑)來生產一種含有分散劑懸浮的生物製品顆粒的的聚合物外殼。換句話說，這種聚合物殼體能含有一種生物製品在分散劑中的飽和溶液。另一種變化是含有一種生物製品固體核的聚合物殼體，它是先把生物製品溶於一種揮發性有機溶劑(如苯)中，形成聚合物外殼，再在真空下，如在旋轉蒸發器中，蒸發揮發性溶劑或者將全部懸浮液冷凍乾燥來製成的。這樣就形成了一種用聚合物包衣包裹生物製品團體核的結構。後一種方法對傳送相對小體積大劑量的生物製品是特別有益的。在有些情況下，形成該核外殼的生物相容物質本身可以是一種治療劑或診斷劑，例如，對於胰島素來說，它可以作為上述超聲波輻射步驟中所形成的一種聚合物殼體的一部分來傳送。在其它情況下，形成外殼的聚合物也能參與生物製品的傳送，例如，當生物製品是胰島素時，它可以作為上述超聲波輻射步驟中所形成的聚合物殼體的一部分來傳送，由此來提供一種具有高度氧結合力的血液代用品。
聚合物殼體的變化也是有可能的。例如，含有巰基的少量PEG能包括在該聚合物中。一旦暴露於超聲波輻射，PEG就與該聚合物交聯並形成該聚合物外的一部分。另一方面，可以在製備該殼後將PEG連接在該聚合物外殼上(而不是作為製成該外殼的基質一部分)。
PEG以其非粘合特性為人們所熟知，並且已經把它附著於蛋白質和酶上來增加它們在體內的循環時間(Abu-chowski等，J.Biol.Chem.Vol.252578(1977))。PEG還被附著於脂質體中形成脂質雙層的磷脂上來降低它們在體內的攝取量，並延長它們在體內的停留時間(Klibanov等，FEBS Letters Vol.268235(1990))。因此把PEG摻合進交聯蛋白外殼的壁上能夠改變它們的血液循環時間。這種性能能被用來維持生物製品的較高血液濃度，並能延長該生物製品的釋放時間。
適用於改性聚合物外殼的是親電子PEG衍生物，它包括PEG—咪唑，琥珀酸琥珀醯亞胺酯，碳酸硝基苯酯，tresy-lates，等；親核的PEG衍生物，它包括PEG—胺，胺基酸酯，醯肼，硫醇等。PEG改性的聚合物殼體比未改性的殼體能夠在循環中持續更長的時間。用PEG改性聚合物的外殼可以在形成外殼之前或形成外殼之後進行。現在優選的技術是在形成聚合物外殼後對其進行改性。其它聚合物包括葡聚糖，藻酸鹽，羥乙基澱粉等可以用於該聚合物外殼的改性。
本領域熟練技術人員可預想到在本發明範圍和構思之內可以有一些改變。例如，在形成聚合物外殼壁過程中，可以改變該聚合物外殼中的分散劑，可以使用許多不同的生物製品，以及可以使用大範圍的蛋白質和其它天然和合成的聚合物。它的應用範圍也是相當廣的。除了生物醫學應用，如傳送藥物、診斷劑(在成像中使用)、人造血液(聲化學交聯的血紅蛋白)和胃腸外營養劑，本發明的聚合物殼體結構還可以摻入化妝品中使用，如在皮膚乳劑或護髮產品、香水中使用，在壓敏墨水中使用，在農藥中使用。
按照本發明的一個實施方案，如上所述製成的聚合物殼體可用於體內傳送生物製品，如藥物活性劑，診斷劑或有營養價值的試劑。可用於實施本發明的藥物活性劑的例子有止痛劑(如，醋酸米諾芬(acetominophen)，阿斯匹林，布洛芬，嗎啡及其衍生物等)，麻醉氣體(如，環丙烷，安氟醚，氟烷，異氟烷，甲氧氟烷，氧化亞氮等)，平喘藥(如，苄酞嗪，甲哌噻庚酮，traxanox等)，抗菌素(如，新黴素，鏈黴素，氯黴素，頭孢菌素，氨苄青黴素，青黴素，四環素等)，抗抑鬱藥(如，甲苯噁唑辛，氧苯哌吲哚，丙咪嗪，氯哌三唑酮(trazadone)等)，抗糖尿藥(如，雙胍，激素，磺尿類衍生物等)，抗真菌劑(如，兩性黴素B，制黴菌素，殺念珠菌素等)，抗高血壓藥(如，心得安，苯丙醯苯心安，心得平，心痛定，利血平等)，甾體抗炎藥(如，可的松，氫化可的松，地塞米松，強的松龍，強的松，氟惡米松等)，非甾體抗炎藥(如，消炎痛，布洛芬，拉米芬酮(ramifenizone)，吡氧噻嗪等)，搞腫瘤藥(如阿黴素，環磷醯胺，放線菌素，博來黴素，段諾黴素(duanorubicin)，阿黴素，艾波黴素(epirubicin)，自力黴素，甲氨蝶呤，氟尿嘧啶，碳鉑(Carboplatin)，卡氮芥(BCNU)，順氯氨鉑，鬼臼乙叉甙，幹擾素，苯芥膽甾醇，紫杉醇(這裡所用的術語「紫杉醇」是指包括紫杉醇類似物及其前體藥物，紫杉烷以及其它類似於紫杉醇的藥物，如taxotere等)，喜樹鹼及其衍生物(該化合物列治療結腸癌具有較可靠的療效)，長春花鹼，長春新鹼，以及激素類抗腫瘤藥，如雌激素，孕激素類，三苯氧胺等)，抗焦慮藥(如，硝苯呋海因，安定等)，酶活性劑(如，去氧核糖核酸酶，核蛋白體酶(ribozyme)等)，核酸結構(如，IGF—1編碼序列，VIII因子編碼序列，IX因子編碼序列，反義核苷酸序列等)，免疫促進劑(如，白芥素，幹擾素，疫苗等)，免疫抑制劑(如，環孢菌素(CsA)，硫唑嘌呤，布雷青黴素(mizorobi-ne，FK506，強的松等)，生理活性氣體(如，空氣，氧氣，氬氣，氮氣，一氧化碳，二氧化碳，氮氣，氙氣，一氧化二氮，一氧化氮，二氧化氮等，以及它們中任意兩種兩種或多種的混合物)，還有其它藥物活性劑，如甲氰咪胍，鄰氯苯對氯苯二氯乙烷，維沙定(visadine)，滷代亞硝基脲類(halonitrosoureas)，蒽環類(anthracycline)，橢圓玫瑰樹鹼，苯佐卡因，巴比妥類等。
可用於實施本發明的診斷劑的例子有超聲對比劑，放射對比劑(如碘辛烷類，滷化碳類，腎造影劑等)，磁對比劑(如，碳氟化合物，脂溶性順磁化合物，GdDTPA，順磁化合物水溶液等)，以及其它試劑(如，氣體，象氬氣，氮氣，一氧化碳，二氧化碳，氦氣，氙氣，一氧化二氮，一氧化一氮，二氧化氮等以及它們中任意兩種或多種的混合物)。
可用於實施本發明的有營養價值的試劑例子包括胺基酸、糖、蛋白質、碳水化合物、脂溶性維生素(如，維生素A，D，E，K，等)或者脂肪，或者它們中任意兩種或多種的混合物。
本發明含生物製品的聚合物殼體與現有技術中的蛋白微球之間的主要區別在於構成的性質和形成該聚合物外殼後蛋白質的最終狀態，以及運送難溶於水或基本不溶於水的試劑的能力。按照本發明，該聚合物(如蛋白質)是通過與許多蛋白質的天然結構中存在的胺基酸。例如半胱氨酸形成二硫鍵來進行選擇性化學交聯的。使用超聲波輻射方法將含有溶解的或懸浮的生物製品的分散劑分散到一種具有巰基或二硫化物基團(如白蛋白)的生物相容物質的水溶液中，由此在非水溶性基小滴的周圍，形成一種交聯聚合物外殼。超聲波輻射步驟在液體中產生空穴作用，引起局部大量產熱，導致過氧化物離子的形成，該離子通過氧化巰基殘基(和/或斷裂已存在的二硫鍵)交聯聚合物而形成新的交聯的二硫鍵。
本發明步驟相反，現有技術中戊二醛交聯的方法是非特異性的，基本上與蛋白質結構中存在的任意的親核基團(如，胺，巰基和羥基)反應。如現有技術中所述的加熱變性作用可明顯而不可逆地改變蛋白質的結構。相比而言，本發明所形成的二硫化物特異性非常強，並且基本上沒有使蛋白質變性。此外，因為本發明方法製備的聚合物外殼比包裹顆粒的直徑相對更薄，所以聚合物外殼中含有的生物製品顆粒或液滴不同於現有技術中交聯或加熱變性了的蛋白微球。(用透射電子顯微鏡檢查法)已經測得聚合物包衣的「外殼厚度」大約為25微米，而被包裹的顆粒直徑為1微米(1000毫微米)。比較起來，現有技術的微球沒有蛋白外殼，但是，卻有分散於整個微球體積中的蛋白質。
含有固體、液體或氣體的生物製品核的聚合物外殼可以用相對小的體積來傳送大劑量的生物製品。這將減少在接受大量液體時患者的不適，並將減少住院時間。此外，聚合物外殼的壁一般可被蛋白水解酶在體內全部降解(如，當聚合物是一種蛋白質時)，使得傳送系統沒有副作用，對現在的製劑來說這是常有的情況。
按照本發明這種實施方案，生物製品的液滴或顆粒被包含在截面直徑不大於10微米左右的外殼中。截面直徑小於5微米是較優選的，而對靜脈內途徑給藥來說，2微米左右截面直徑是最優選的。
按照本發明的另一個實施方案，人們已經發現這裡所述的聚合物外殼，當由血紅蛋白製備時，具有令人驚奇的較高的氧結合能力，因此可被用作血液代用品。血紅蛋白(Lehninger，in Biochemistry，Worth Publishers，Inc.New York，PP.145—149，1975)是由四聚體(兩個α和兩個β鏈)組成的64,500MW的蛋白質。每條α和β鏈以一個非共價鍵連接一個血紅素殘基。α和β鍵也由氫結合和範德伏爾斯力形成的非共價鍵結合在一起。這四個血紅素基團，每個亞單位中有一個能夠結合四分子的氧。這些扁平的血紅素基團在正方平面的配位處含有一個鐵離子。在完整的分子中，這四個血紅素位於相對遠離於另外一個的位置。
在四聚物的血紅蛋白分子中，血紅素單位間在結合氧方面的相互作用或協同作用大大增加了每個血紅素單位的氧結合能力。一般來說，一個單獨的血紅素單位應當能結合一個單一分子的氧。然而，在血紅蛋白分子中相鄰血紅素單位的協同作用增加了每個血紅素單位的氧結合。這種協同作用用術語「希爾係數」來描述，它的數值反應了相互作用的氧結合位點的數目。對天然血紅蛋白來說，希爾係數大約為2.8。
在紅細胞中可溶性血紅蛋白佔總蛋白的90％左右。由於血紅蛋白的結合力，100ml的全血能夠吸收大約21ml的氧氣。與結合氧同樣重要的是，血紅蛋白也能有效地把結合的氧釋放給組織。血紅蛋白結合和釋放氧的這種能力經常被定量表達為P50(或 )。例如，整個血液的P50，即，導致血紅蛋白50％飽和的氧分壓，大約是28mmHg。
氧分壓和血紅蛋白飽和百分比之間的關係可用一個S形曲線來表示，曲線的位置受pH值的影響(波耳氏效應)。在確定的氧分壓下血紅蛋白溶液的pH值越高，氧飽和的百分數就越大，而P50越低；氧飽和曲線在橫坐標上向左移動。相反，血紅蛋白溶液的pH值越低，氧飽和的百分數也越小，而P50就越高；氧飽和曲線在橫坐標上向右移動。因此，當血紅蛋白從相對鹼性pH值的肺部移向相對酸性pH值的缺氧組織(由壓氧呼吸產生乳酸)蛋白時，血紅蛋白將有一個釋放其運載的氧的趨向。所以，血紅蛋白對氧的親和力是與血紅蛋白的P50成反方向變化的。
血紅蛋白分子或其構象的改變是與氧結合親合力的變化有關的。例如，與2，3-二磷酸甘油酯的結合(2，3—DPG，存在於紅細胞中)放鬆了氧與血紅蛋白的結合，從而促進了氧向組織的釋放；例如在高海拔和懷孕期，這些需要增加氧氣輸送的生理條件下，血漿中的2，3—DPG含量上升。在血紅素取代基中由Fe(II)到Fe(III)的鐵離子的氧化導致了高鐵血紅蛋白(met—Hb)的形成，這種高鐵血紅蛋白和水結合得很緊以致於妨礙了氧的運送。這種氧化或者「自身氧化」是在體內進行的一個過程，紅細胞中的氧化還原酶系統一直監視著這種氧化過程。
血紅蛋白，這種運輸和傳遞氧的蛋白質，能從紅細胞壁的膜上或基質中(基質中含有決定血型的特殊抗原)和從其它細胞和血漿組分中分離。如果這種分離和離析是有效的話，所得到無介質的血紅蛋白不含抗原物質；因此，不必要再進行按血型配血。
從紅細胞微環境中提取出的無基質的血紅蛋白(SFH)已被發現具有特別緊密地結合氧的特性(低的P50)，並且輸血後還具有一個較短的循環半衰期。較低的P50，是血紅蛋白氧結合曲線左移的反應，部分原因是無介質血紅蛋白暴露於比紅細胞內的pH值(7.2)更高的血漿pH值(7.4)的結果；而且，當血紅蛋白從紅細胞中除去時，血紅蛋白和2，3-二磷酸甘油酯之間的自然關係被破壞；從而更加降低了P50。就從循環中清除而論，我們觀察到無介質血紅蛋白可由腎迅速清除，輸血半衰期 僅100分鐘左右，SFH的希爾係數在2.3—2.8範圍中。
我們已經測定出化學改性的血紅蛋白克服了無介質血紅蛋白的一些缺點。在現有技術中所描述的改良方法包括無介質血紅蛋白的各種分子內交聯方法；無介質血紅蛋白與低分子量試劑的分子內和分子間的交聯的方法；以及無介質血紅蛋白與其它聚合物配合的方法。
無介質血紅蛋白分子內交聯的方法在現技術中是已知的。例如，見美國專利4,584,130,4,598,064和4,600,531。這種方法是通過一個反丁烯二酸根橋在蛋白質的α鏈上共價連接賴氨酸99殘基的方法來改性無介質血紅蛋白。這種分子內交聯的結果是，雙阿斯匹林交聯的血紅蛋白具有等同於血液的氧親和力。而且，雙阿斯匹林交聯的血紅蛋白(分子量為64,500)不能夠再分解為二聚物(分子量為32,250)。所以，雙阿斯匹林α-α交聯的血紅蛋白的保留時間為4到8小時(這是無介質血紅蛋白保留時間的兩到四倍)。儘管如此，當患者失去大量血液時，由於需要一種能在幾天內運送氧氣的氧載體，對治療急性出血來說這種血紅蛋白還是不能夠提供足夠長的維持時間。雙阿斯匹林交聯的血紅蛋白的P50在生物範圍內(24—28mmHg)希爾係數也是這樣(2.5—2.8)。
使用低分子量的交聯劑也能使血紅蛋白分子進行分子內相互交聯。例如，在美國專利4,336,248中描述了優選加入磷酸吡哆醛之後，使用雙醛使血紅蛋白分子互相之間和/或血漿蛋白以及明膠衍生物進行配合。美國專利NOS.4,001,401,4,001,200,4,05,590和4,061,736中描述了與雙官能團或多官能團的低分子量交聯劑進行的交聯。分子間血紅蛋白交聯產物常常不是單一可溶性四聚物，而是多個血紅蛋白四聚物通過共價鍵連接形成的可溶性低聚物。典型的是，這類分子間交聯的產物通常具有不等同於血液的氧攜帶和輸送性能(與全血的P50值28相比戊二醛聚合的血紅蛋白P50為18—23)並且它的希爾係數在1.8—2.8範圍內。而且，現有技術中已知通過戊二醛進行分子間交聯的產物是具有抗原性的[見D H Marks等，Militry Med.152473(1987)]。
一般來說，血紅蛋白分子內和分子間的交聯降低一些由未改性的血紅蛋白離解為αβ—二聚物所產生的腎的毒性問題。然而，由可溶性血紅蛋白產生的膠體滲透壓(COP)卻並沒有因分子內交聯而顯著降低。所以，這就限制了可溶性血紅蛋白血液代用品適於給藥的劑量。一般來說，COP的增加會引起流體靜壓力的降低和腎小球過濾率的相應降低，引起了少尿，嚴重情況下無尿。現有技術中所述的可溶性血紅蛋白的給藥已經引起了心動過緩，血壓升高和肌酐清除下降。已發現血管收縮和血管梗阻是腎臟效應的病因，這些都是與使用可溶性血紅蛋白血液代用品有關的。使用如本文所述製備的一種高度聚合形式的血紅蛋白作為血液代用品以可緩解這些問題。
高度氟化的化合物，特別是全氟化碳化合物，由於其對氧的高溶解性，也已經被當作是紅細胞代用品，適合於這種用途的高氟化化合物有全氟化碳類如，全氟萘烷，全氟二氫化茚，全氟甲基金剛烷，全氟三丙基胺，全氟三丁胺，全氟辛溴等。在靜脈內使用時，與水不混溶的這些全氟化碳類必須分散成注射乳劑。在這些應用中常用的乳化劑是蛋黃卵磷脂和卵磷脂，二者都具有沉澱變態反應物的能力。例如參見，PCT 92/06517，它描述了含有氟化物和磷脂，如溶血磷脂醯膽鹼和溶血磷脂醯膽胺，作為表面活性劑的一種乳劑，或者PCT 93/11868描述了用蛋黃卵磷脂作乳化劑的乳劑，它含有高氟化的，氯取代的，非環狀有機化合物作為氧載體。
Fluosol—DA(α治療劑)，是一種全氟萘烷和全氟三丙胺的乳濁液，它是FDA唯一批准用於預防球形冠狀血管成形術中暫時局部缺血的藥品。另一個氟化碳產品，含氧劑(Alliance Pharmaceuticals)或全氟辛澳也已被批准作為口服造劑。全氟化合物用作血液代用品的綜述參見Riess等，Angew Chem.Int.Ed.Engl.17.621—634(1978)。
現有技術中所述的血液代用品僅使用溶解性血紅蛋白作氧載體。的確，一般傳統所接受的是，一種不溶性血紅蛋白分子(例如，它是與其它血紅蛋白分子過量聚合或交聯到不溶的程度，或者它是由過度變性引起不溶的，等等)由於很有可能分子中氧結合位置而不適合用作可逆性結合氧。此外，現有技術的可溶性血紅蛋白的希爾係數並不大於未改性的天然血紅蛋白的希爾係數。
比較起來，本文所述的由血紅蛋白製得的聚合物殼體是「巨大」的肉眼可見的分子(由於它大量聚合或交聯了許多血紅蛋白的四聚物分子)，因為它有較大的體積，所以不溶於含水介質。在超聲波輻射步驟中由於蛋白質半胱氨酸殘基上的巰基的交聯而發生聚合。按照本發明所製備的聚合物外殼，一般含有至少104個交聯的聚合物分子，並且有1012個血紅蛋白四聚物交聯成一個肉眼可見的血紅蛋白「大聚合物」(megamer)。出人意料地發現氧能與這些具有親和力的不溶性結構可逆性地結合，對一種紅細胞(RBC)代用品來說它的親和力在可用的範圍中，即P50在約10mmHg到約50mmHg之間。
有關本發明不溶性血紅蛋白結構(IHC)的另一個令人驚奇並出人意料的發現是它有極高的希爾係數(n)。希爾係數是測定血紅蛋白四聚物分子中氧結合位置(血紅素單位)之間協同作用程度的一個指標。天然血紅蛋白最大的希爾係數大約是2.8，而現有技術中改性的血紅蛋白一般報導的希爾係數少於2.8。對本發明不溶性血紅蛋白結構所測得的希爾係數特別大，一般在約5到約25範圍內。不需要由任何作用理論來限制，這些極高的數值是由鄰近交聯四聚物血紅蛋白單位的氧結合位置之間相互作用或相互連接所產生的。基本上，人們相信希爾係數增大，表明在結合氧時不溶結構中多個四聚物在由脫氧—T(緊張的)狀態轉化為氧—R(松馳)狀態過程中起著協同作用。
在本發明血紅蛋白結構中所觀察到的出人意料的大的希爾係數具有的優點在於每個血紅蛋白四聚物單位所運載氧的量遠遠超出了天然血紅蛋白或現有技術中修飾的血紅蛋白所能達到的運載氧的量。這種增長了的氧運載能力大大有益於本發明用作RBC代用品。
在氧分壓約為4—100mmHg範圍內本發明血紅蛋白結構具有最大的希爾係數。換句話說，在這個氧分壓範圍內能達到最大的協同作用。因為典型的肺泡pO2在這個範圍之內，當用本發明結構作為血液代用品時，血紅蛋白結構在肺中可以最大量的攝取氧。
另一方面，本發明結構向組織釋放氧與生理血紅蛋白非常相似，即，在典型的組織pO2(＜40mmHg)時，大部分結合在不溶性血紅蛋白結構上的氧被釋放給了組織充氧。所以，本發明的交聯的不溶性血紅蛋白在典型負載壓下(如肺中)具有比現有技術中的血紅蛋白更高的不尋常的氧結合能力(由於希爾係數較大)，並且，在組織中所遇到的，典型壓力下保持有效的氧釋放能力。
由於本發明不溶性血紅蛋白結構的交聯性質和其體積，它可能比現有技術的紅細胞(RBC)代用品更具有相當長的體內循環時間。而且，由於它們的較大分子(肉眼可見的)體積，它們不可能誘發腎毒性問題，而這正是現有技術中所述的一般性四聚物或寡聚物可溶解形式的血紅蛋白所存在的問題。
本發明的空的(「泡狀」或微泡)不溶性血紅蛋白結構可以在血紅蛋白外殼或膜內裝載一種適當的氣體。所以，當血紅蛋白「微泡」例如在一個外界設備或在肺中用氧平衡時，該結構或泡的中心核被未結合的或游離氧所飽和，這些氧通過分子擴散進入核中。所以這種結構除了與形成微囊外殼或膜的血紅蛋白結合氧外，還在其空核的小空間內攜帶未結合的分子氧。這種系統運送未結合(但被包裹了的)氧的能力大大增加了核系統的氧運載容量，超過了單獨由血紅蛋白所運載的氧的量。現有技術中沒有記載這種在氧與血紅蛋白結合的同時還通過小空泡攜帶未結合氧的能力。
在血管內給藥前也能用氧氣預先裝載或飽和不溶性血紅蛋白結構。這樣可以象冠狀血管成形術或腫瘤治療的短期使用中最大量的送氧。
本發明不溶性血紅蛋白結構的疏散「細胞」性能使得它們能夠以一種生理學方式運送氧，而與體內的紅細胞沒有什麼不同。由於本發明不溶性血紅蛋白結構的「大聚合物」特性，它們產生的膠體滲透壓或膨脹壓與現有技術中任何等量的(就氧運載量而言)可溶性血紅蛋白相比是微不足道的。這就可以把高濃度的本發明血紅蛋白結構進行靜脈輸液，而對現有技術的可溶性血紅蛋白來說，由於擔心滲透梯度引起血管周圍組織嚴重的脫水，只能以最大濃度6—89/dl來輸液。
本發明還可以擴展到使用其它氧結合蛋白用作RBC代用品。作為一個例子，肌紅蛋白具有一個單獨的氧結合血紅素基團(但沒有可交聯的半胱氨酸殘基)，應當有與本發明相同方式的作用。具有至少兩個可交聯的半胱氨酸殘基的一種遺傳工程產生的肌紅蛋白可被用來生成一種不溶性肌紅蛋白結構。氧結合蛋白與對氧沒有親和力的蛋白的組合物可以用於形成本發明的不溶性結構，例如可以使用血紅蛋白和肌紅蛋白。
本發明組合物比現有技術的微囊包裹血紅蛋白組合物具有更顯著的優點。現有技術的血紅蛋白的脂質體製劑在脂質體外殼含有可溶性血紅蛋白。現有技術的脂質體包裹血紅蛋白組合物具有的一些缺點已被本發明所克服。從脂質體組合物中裂解出的可溶性血紅蛋白有可能會引起腎中毒。本發明不溶性結構由於它大範圍地交聯性質將不會裂解出可溶性血紅蛋白。脂質體的聚集已知能激活補體蛋白C3α。如果是不溶性結構，由於它的體積遠遠大於脂質體的體積範圍，這種聚集將是不可能的。
本發明不溶性交聯的血紅蛋白組合物避免了與現有技術的可溶性血紅蛋白組合物有關的毒性。血紅蛋白的腎中毒或腎毒性主要是與從循環中清除可溶性二聚物，四聚物，或寡聚物血紅蛋白有關。已廣泛交聯的或「大聚合物」的本發明血紅蛋白不能由腎臟清除，因而是不可能有腎毒性的。本發明的不溶性結構不能被腎臟清除，因而解決了這個問題。本發明廣泛交聯的血紅蛋白結構比現有技術具有的另一個優點是由於其不溶的形式，增加了在血管內的保留特性。
用透射電子顯微測定法(TEM)測得不溶性血紅蛋白(IHC)的形態。為獲得牛IHC的橫切片的TEM顯微照片，把IHC用戊二醛固定，用四氧化鋨和亞鐵氰化鉀染色(為提供高蛋白濃度區的對照)，用一種低粘度樹脂包埋並進行超薄切片(片厚為～75nm)。由於在這些步驟中可能會有整個直徑的一些縮小和IHC的一些形狀扭曲，所以IHC的真實直徑最好用溶液顆粒大小的分布(3微米；std.dev.l)來表示，而不是直接測量TEM顯微照片。仔細觀察TEM顯微照片發現三個明確的區域一個清晰的中心區；一個暗的顆粒薄層；和一個與顆粒外表面相關的鬆散附著的，分散的，有斑點的灰色區。黑色薄層就是IHC殼。它含有一種高密度蛋白，在染色步驟中，顯色最明顯。鬆散附著的灰色物似乎是在樣片製備的固定步驟中粘在IHC殼上的天然蛋白。對這個照片和許多其它顯微照片的初步測量表明牛血紅蛋白的IHC的殼厚約為25—35nm。血紅蛋白是一種直徑為5.5mn的粗糙的球體蛋白(L.Stryer，Biochemistry，W.H.Free-man，New York，1988)。所以，IHC的蛋白外殼大約是血紅蛋白分子(四聚物)的4到20倍厚。因此，一個直徑為3.0μm的泡狀物應當能含有大約104到1012個血紅蛋白分子。
用圓二色性檢測本發明的不溶性血紅蛋白結構(IHC)(微泡或微球)發現IHC中α—螺旋和β—摺疊的含量與純化的無介質血紅蛋白(SFH)並沒有明顯差別。這種發現十分重要，因為它表明不溶性血紅蛋白的交聯步驟和形成沒有導致蛋白變性(即，三級和四級結構的改變)。當然用代表合成步驟後保留了可逆性氧結合和氧結合血紅素單位之間的協同作用的功能性數據也證實了這種發現。
現已測出了IHC的氧結合性能。由於met—Fe(III)形式的血紅蛋白不能結合氧，可使用Hyashi等人的還原體系(A.Hyashi，T.suzuki，M.shin.Biochim.Biophys.Acta310,309,1973)來把Fe(III)還原為Fe(II)。該還原體系是由不同濃度的葡糖—6—磷酸，葡糖—6磷酸脫氫酶，NADP，鐵氧化還原蛋白，鐵氧化還原蛋白還原酶和過氧化氫酶組成。在每次氧結合實驗前，向IHC中加入該還原體系並在4℃保持24—36小時。
按照實施例14所述可以合成牛和人的血紅蛋白IHC。象本領域熟練技術人員所知道的，所用的血紅蛋白可來源於任何脊推動物，非脊椎動物或真核源，或者脊椎動物，非脊推動物或真核細胞的基因操作產物。表1提供了本文結果的總結。
表1聲處理過的Hb微泡和未經聲處理的BHb在不同濃度的磷酸酯中n最大和P50的總結表
注BHb微泡的希爾係數(n)是按公式計算的n=log(Y/1-Y)logP02]]>，其中Y是氧合部分而
是氧壓，對微泡而言，每項△log(Y/1—Y)都是五個連續點的平均值全部結合實驗都是在25℃三羥甲基氨基甲烷緩衝液(pH7.4)中進行的。如IHC紫外可見光譜所證實的，IHC保留了它的可逆性結合氧的性能，這表明有met—Fe(III)，氧—Fe(II)和脫氧—Fe(II)形式存在。IHC能夠在脫氧狀態和有氧狀態之間循環，十次以上循環也基本不會被降解。這一點是很重要的，因為它表明在製備IHC紅細胞代用品的方法中不會明顯改變活性血紅素部位周圍的環境。
這些氧結合數據表明IHC基本上不含有變性血紅蛋白。如果它被變性，就不會(或很少)觀察到生理反應性。
在無磷酸酯存在下還原的血紅蛋白IHC和天然無介質血紅蛋白的氧結合曲線在形狀上都是S形，這種曲線表明了氧結合的作用性。在兩種曲線中P50值(血紅蛋白上存在的氧結合位置有一半結合氧所需的壓力)相近(21託與22託)。這種結果表明IHC是在與天然血紅蛋白相似的氧氣壓力下結合併釋放氧的。令人吃驚的是，IHC的最大希爾係數，n最大值(代表氧結合位置間協同作用的程度)明顯高於無介質血紅蛋白溶液(9.5對2.6；見圖2)。用下列公式來計算希爾係數(n)log(Y/1-Y)logPO2]]>其中Y＝氧合部分，和PO2＝氧分壓用5個連續點的平均值獲得每個(△)1og(Y/1—Y)值，然後作一些光滑曲線。
已經證明天然血紅蛋白的變構效應物如肌醇六磷酸酯(IHP)和2，3—雙磷酸甘油酯(2，3—BPG)能夠增加P50(即，較低氧親和力)和提高協同性。IHC中也可以見到相同的作用。即使用P50值的增加相同，也能看到更為引入注目的作用IHC的協同性。在1.7mMIHP(17.6對2.8)和2，3—BPG(14對2.8)存在下n最大值比天然血紅蛋白有更顯著的增加(見圖3和表1)。
協同性上出人意料的較大增強的明顯是因為IHC殼中血紅蛋白四聚物間的共價連接。希爾係數不可能大於相互作用位點數目。天然血紅蛋白中大約2.8的數值反應了一個四聚物的協同性。儘管如此，在IHC殼中，一旦結合氧後就有幾個交聯的四聚物之間有連接(通過形成二硫鍵)。最近四聚物之間的相互作用可能是最強的；然而相距更遠的四聚物之間也存在較弱的相互作用。n最大值基本上表示結合氧後IHC外殼中由脫氧—T轉化到氧—R狀態過程中多個四聚物的協同作用。血紅蛋白IHC的TEM顯微照片也反應了大約6個血紅蛋白聚合物的殼厚度。直徑20μm的泡狀物應當能包含大約104到1012個血紅蛋白分子。
用製備後不同時期的顆粒數目來測定IHC貯存的穩定性。IHC可在和生理鹽水中4℃下存放最多6個月。在第3個月，IHC的濃度已經下降大約10％，而在第6個月，濃度已下降約25—30％。
分別在37℃，25℃和4℃下測出了IHC的自身氧化速率(從Fe(II)向met—Fe(III)轉化)是大於60小時，96小時和25天。保持在惰性氣體中，獲得這些結果就不需採用特殊的預防保護措施。現有技術清楚地證明保存在象氮氣這樣的惰性氣體中對降低血紅蛋白的自身氧化率是有益的。在這種條件下貯放一個較長時期所保存的Fe(II)血紅蛋白部分將有極大的增長。
此外，用如上所述的Hyashi等的還原系統貯存IHC懸浮液可以防止自身氧化。
我們已研究了用巴氏滅菌作為IHC懸浮液最後階段滅菌的一種方法。使用幾種不同的巴氏滅菌條件。用在每種條件下滅菌後的顆粒數目來衡量溫度對IHC的作用。
條件1IHC懸浮液的溫度在8分鐘內從25℃上升到62.8℃，並在這個溫度下保持30分鐘。顆粒數目表明降解低於20％。
條件2IHC懸浮液的溫度在10分鐘內從25℃上升到71.7℃並在該溫度下保持15秒。顆粒數目表明有低於20％的降解。
條件3IHC懸浮液的溫度在12分鐘內從25℃上升到89.5℃並在該溫度下保持2秒鐘。顆粒數目表明有高於70％的嚴重降解。所以，發現條件1和2適合作巴氏滅菌方法。γ射線照射也適合作最後階段的滅菌方法。
用已知的變構效應物對血紅蛋白的化學改性可以改變IHC的氧親和性(或P50)。對血紅蛋白的改性一般都限制了有氧和脫氧這兩種構象之間的轉換，因此氧合功能幾乎總是以某種方式發生改變。例如，在有氧形式下改性血紅蛋白，通常對高氧親和力有好處，而在脫氧條件下進行改性則作用是相反的。由於吡哆醛衍生物分子很象天然變構效應物2，3-二磷酸甘油吡哆酯(DPG)，所以可用吡哆醛衍生物作改性劑。它們能結合血紅蛋白末端的氨基。例如通過類似於2，3—DPG的自然相互作用的5/—磷酸吡哆醛(PLP)與血紅蛋白反應來增加P50。可用作改性劑的還有其它吡哆醛衍生物，如2—去甲—2—甲醯PLP(一種能連接血紅蛋白β鏈的雙官能團試劑)或者四磷酸雙吡哆醛。也可以用其它交聯劑如醯基三甲基磷酸鈉)來交聯β鏈。
還可以使用醛類改性劑。例如用戊二醛聚合血紅蛋白和用戊醛連接PLP。
雙阿司區林酯例如3，5—雙(二澳水楊基)，富馬酸和相應的單阿斯匹林可以用作變構改性劑。阿斯匹林在血紅蛋白的a鏈和單官能團試劑之間結合到一個內部賴氨酸上。這二者都能增加血紅蛋白的P50。
所以，可以製備「低親和力」或「高親和力」結構以用於除外傷和急性失血之外的情況，例如在需要局部傳送氧並且是有益的情況下使用。
以上技術生產的一種「低親和力」結構，即具有較高P50(＞28mmHg)的結構，已在放射或化學方法治療腫瘤中使用氧時作為一種輔劑使用。這種結構在體外裝載最大容量的氧，然後給藥到腫瘤循環中。它使大量氧釋放在腫瘤部位。在放射或化學療法存在下產生的活性氧使腫瘤部位產生較大的細胞毒素活性。
「高親和力」結構(P50＜28mmHg)適用於「局部缺血的氧輸送」。局部缺血或組織缺氧會在許多病理狀態中出現，如中風，心肌梗塞等。在這些部位優先釋放氧將有助於儘可能減少組織的持續受損。具有與全血相似氧親和力的氧載體或RBC代用品在這一類部位不會優先釋放氧。然而，具有高氧親和力(即與全血相比P50較低)並且因時在正常遇到的氧梯度條件下能保留其大部分氧的結構，由於血和組織間氧梯度較大的緣故交替地在這類局部缺血部位優先釋放氧。通過改變交聯性質，用一種具有所需親和力的合適天然血紅蛋白，或用基因工程方法獲得的具有合適親合力的血紅蛋白可以很容易地操作本發明的不溶性血紅蛋白結構的親和力，以獲得一種適合這種使用的數值(P50)。
本發明不溶性血紅蛋白結構能製成膠囊，並由此作為藥中氧載體(如氟化碳類)，藥物，診斷劑等的有效載體。被膠囊包裹的氟化碳類(FC)是有效的氧載體，它與氧分壓是以線性關係運送的釋放溶解的氧，而IHC的血紅蛋白外殼與氧壓卻是以S形曲線關係運送和釋放結合的氧。在同一製劑中血紅蛋白和氟化碳的這種特殊結合使體內能夠最大地運送和釋放氧。
現有技術中都沒有公開同時運送血紅蛋白(Hb)和氟化碳(FC)能力的技術。在血紅蛋白外殼的核內包裹的氟化碳能作為一個氧的貯存庫。這種結合使載體結合的氧的運送對壓力呈S形關係(即對血紅蛋白)以及線性關係(即對氟化碳)。此結合也使其對組織pO2為線性的「背景」釋放氧(從氟化碳)以及S型的「團塊」(bolus)的氧釋放(從血紅蛋白)。特別是例如組織局部貧血或腫瘤治療過程中，短時間內需要大量氧時，它可更有效地進行氧的輸送。
Hb/FC結合可外部監測血管內運送劑量的位置而顯示其優點。因為通過MRI很容易使19F核成像，因此很可能覺察血管和組織內運送懸浮液的累積。這在腫瘤治療中具有很大優點，因在此過程中，氧被同來作為放射或化療劑的輔助劑，所以它可精確地監視載氧血紅蛋白/FC懸浮液輸送到預想的位點。
本發明實踐中，有許多氟化碳(FCs)適合使用，詳述如下。
此外，無氧的結合力但可交聯半胱氨酸殘基或巰基(天然或人工引入)的蛋白質可包裹合適氧親合性的生物相容氟化碳用作血液替代物。作為其例，血蛋白包裹全氟萘烷或全氟三丙胺用作血液替代品。
有一些藥物適合於包裹在本發明血紅蛋白微膠囊中。一些化學治療劑需要有氧存在才可獲得最大腫瘤細胞毒性。在一種氧載體如血紅蛋白的結構中傳送這類藥物可以有效地把細胞毒素的基本成分結合進一種單一包裝中。許多適用的細胞毒素藥物是油溶性的。這些藥物可溶於一種氟化碳或者其它生物相容的油中，如大豆油，紅花油，椰子油，橄欖油，棉花籽油等。將油/藥溶液和一種血紅蛋白溶液一起經超聲波輻射來生產在一種包裹在交聯的不溶性血紅蛋白外殼中的油/藥微球。在血管內給藥前把該懸浮液用氧飽和。油溶性細胞毒性藥物包括環磷醯胺，GCNU，左旋溶肉瘤素，自力黴素，紫杉醇及其衍生物，taxotere及其衍生物，喜樹鹼，阿黴素，鬼臼乙叉甙，阿莫西芬，長春花鹼，新長春鹼等；非甾體類抗炎劑如布洛芬、阿斯匹林、吡氧噻嗪、甲氰咪胍等；甾體類如雌激素，氫化潑尼松，可的松，氫化可的松，二氟松等，一些藥物如膽甾醇對苯乙酸氮芥，鄰氯苯對氯苯二氯乙烷，維沙定(Visadine)，滷代亞硝基脲類(helonitrosoureas)，蒽環類(anthrocydine)，橢圓玫瑰樹鹼，安定，等；免疫抑制劑如環孢菌素，硫唑嘌呤，FK506等。
用雙乳化的方法也可以以膠囊的形式把水溶性藥物包在IHC殼內。首先，用一種生物相容油乳化藥物水溶液得到一種油包水(w/o)乳化液。把w/o乳化液當作油相，並與上述血紅蛋白水溶液一起經受超聲波輻射處理，生成殼中含有IHC的所需水溶性藥物的微浮化液，適用於本發明這個實施方案的乳化劑包括普盧蘭尼克斯(Pluronics)(聚環氧乙烷和聚環氧丙烷的嵌段共聚物)，來源蛋黃的磷脂(如卵磷脂，蛋黃卵磷脂等)；脂肪酸酯(如，單和雙硬脂酸甘油酯，單和雙棕櫚酸甘油酯等)。用於本發明這個實施方案中的水溶性藥物包括抗腫瘤藥，如放線菌素，博來黴素，環磷醯胺，段諾黴素(duanorubicin)，阿黴素，艾波黴素(epirubicin)，氟尿嘧啶，碳鉑(carboplatin)，順氯氨鉑，幹擾素，白芥素，氨甲葉酸，自力黴素，它莫西芬，雌激素，孕激素等。
雙乳化方法也適合於傳送其它水溶性治療劑，診斷劑或有營養價值的物質。例如，以膠囊形式把血紅蛋白微乳化液包裹於IHC中可以增加IHC中的血紅蛋白的含量。
為了使IHC更象紅細胞，可在交聯的血紅蛋白微泡周圍形成磷脂雙層。這類雙層形成了一種真正的「紅細胞類似物」，並可在兩步驟工藝中生成用於形成這種雙層結構的帶電荷磷脂或脂類包括磷脂醯膽鹼，磷脂醯乙醇胺，磷脂醯絲氨酸，磷脂醯肌醇，磷脂醯甘油，神經鞘髓磷脂，雙十四烷基磷酸，雙十六烷基磷酸，肌氨酸酯(肌氨醯胺)，甜菜鹼，單體和雙體醇酸等。在本發明中也可以使用非離子脂類，它包括聚乙烯脂肪酸酯，聚乙烯脂肪酸醚，二乙醇醯胺，長鏈醯基己糖醯胺，長鏈醯基胺基酸醯胺，長鏈胺基酸胺，聚氧乙烯山梨糖醇酯，聚氧單甘油酯和雙甘油酯，單和雙硬脂酸酯甘油酯，單和雙油酸甘油脂，單和雙棕櫚酸甘油酯該技術上的另外一個變化是使用可光聚合的脂類或經化學反應容易被交聯的脂類來生產一種更加穩定的脂類「膜」包衣。可用於本發明中的可光聚合的脂類有丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯取代的脂類(如，磷脂醯膽鹼，磷脂醯乙醇胺，磷脂醯絲氨酸，磷脂醯甘油，雙十四烷基磷酸，雙十六烷基磷酸等)，具有天然可聚合的不飽和的脂類(如具有丙二醛基或可連接的雙烯基的不飽和的磷脂醯膽鹼等)，等等。經硫代—二硫化物交換容易進行交聯的脂類也適合於形成IHC的穩定脂類包衣。這種脂類的例子有用硫辛酸酯化的磷脂醯膽鹼的衍生物，等等。
以超聲波輻射合成的IHC類可以按如上所述以在生物相容介質中的混懸液形成給藥，也可以與其他營養劑一起給藥。
體內給藥的優選途徑是靜脈內，動脈內，肌肉內，皮下，腹膜內，口腔內，吸入，局部，透皮，栓劑，陰道栓等給藥途徑。
總之，本發明不溶性血紅蛋白結構比現有技術的可溶性血紅蛋白，用膠囊包裹的可溶性血紅蛋白，氟化碳血液代用品或氧載體有許多優點。這些優點包括—較高的氧容量；—可變的氧親和力；—不溶性「大聚合物」血紅蛋白，它比現有技術中的四聚物或寡聚物的可溶性血紅蛋白可在循環中保留較長時間；—由於分子體積較大而具有較低可能性的腎細胞毒性；—血紅蛋白滲漏的可能性比脂質體包裹的血紅蛋白更小—由於它的體積比脂質體更大，所以不可能有激發補體蛋白的聚集物形成；—與現有技術的可溶性血紅蛋白相比，由於其獨立的「細胞」性，其作用更象RBC；—在運載與血紅蛋白結合的氧的同時還能運送一個未結合氧的貯存庫；—能作為不含有潛伏變態反應性和毒性乳化劑的一種氟化碳(FC)載體；—Hb/FC結構中的交聯血紅蛋白能提供比現有技術中使用卵磷脂和/或其它合成表面活性劑的乳化系統更強的穩定性；—從Hb/FC的氧釋放曲線是與組織pO2有關的一種S形和線形結合的曲線；—可用19FMRI體內測定和監控Hb/FC結構；—除了運送氧外，血紅蛋白或Hb/FC結構也可用作藥物載體；—可以將脂類雙層膜用於血紅蛋白結構，使其更象生理結構；—用聚合物如PEG改性血紅蛋白結構來進一步增加血管內的保留時間。
本發明的另一方面，可以將一般是疏水的，與水不混容的這種難以給藥的含有機氟化合物包裹在聚合物外殼中(如上所述)，使其容易地傳送。用聚合物外殼包裹的含有機氟化合物是容易使用的，並且是生物相容的。按照本發明所生產的聚合物殼體顆粒大小有大約2微米的平均直徑，因為它用於靜脈內或動脈內注射沒有小血管堵塞並隨後引起組織損傷(例如由於局部失血而引起氧丟失)的危險，所以醫學應用是最理想的，相比較起來，紅細胞直徑大約是8微米(所以為防止血管堵塞注射性生物材料的直徑應當小於8—10微米。
天然產生的氟原子(19F)能給出一個清晰的核磁共振信號，所以在MRI中能作為對比劑或「探針」使用19F的特殊優點包括1)在體內的天然濃度相當低(一般在體內不存在氟)，2)核磁共振的高敏感性，3)與1H相近的磁旋比，所以僅對現有的MRI裝置作微小改動就能用來使19F磁共振成像，以及4)多數含有機氟化合物毒性低。
氟化碳一般無毒，並且是生物相容的。由於氟化碳的碳—氟鍵較強(約130kcal/摩爾)，所以它是穩定的，並不具有反應性的，固此，也不可能被代謝。相比而言，C—H鍵(約100千卡/摩爾)較弱並有反應性較強，FDA已批准了兩種氟化碳，全氟三丙胺和全氟萘烷，以商品名Fluosol DA作為血液代用品在醫學上使用。
在實施本發明中能夠使用許多不同的氟化碳。例如，可把符合下列通式的化合物混入本文所述的本發明方法所用的聚合物外殼中(a)Cx F2x＋y-zAz，其中x＝1－0，優選5－15，
y＝2；或當X≥2時，y＝0或-2；或者當x≥4時，y＝-4，z＝0到(2x＋y－1)的任何整數；和A選自於H，除F外的滷素，—CN，—OR，其中R是H，烷基，氟烷基，鏈烯基，氟代鏈烯基，炔基，氟代炔基，芳香基，氟代芳香基，烷醇基，氟代烷醇基，烯醇基，氟代烯醇基，炔醇基，氟代炔醇基(b)[CxF2x＋y′－zAz]aJRb－a，其中X，Z，A和R如上所定義，Y′＝＋1；當X≥2時Y′＝-1或-3；當X≥4時Y′＝-5，J＝O，S，N，P，Al或Si，a＝1，2，3或4，和b＝對二價J是2，或對三價J是3，對四價J是4，(c)A′—[(CF2)x—O]c—A″，其中X如上所定義，A′選自於H，滷原子，—CN，—OR，其中R是H，烷基，氟烷基，鏈烯基，氟代鏈烯基，炔基，氟代炔基，芳香基，氟代芳香基，烷醇基，氟代烷醇基，烯醇基，氟代烯醇基，炔醇基，氟代炔醇基，A″選自H或R，其中R如上所定義，C＝1－200，優選2－50，或(d) 其中X如上所定義，而c′＝2－20，優選2－8，以及它們中任意兩種或多種混合物。
上述通式中所包括的是具有如下通式的化合物CxF2x，例如，全氟—1—己烯(C6F12)，全氟—正己烯(C6F12)，全氟—3—己烯(C6F12)等；環狀—CxF2x，例如，全氟環己烷(C6F12)，全氟環辛烷(C8F16)等，CxF2x－2，例如，全氟—1—己炔(C6F10)，全氟—2—己炔(C6F10)，全氟—3—己炔(C6F10)等，雙環—CxF2x－2，例如全氟萘烷(C10F18)等，CxF2x＋2，例如，全氟己烷(C6F14)，全氟辛烷(C8F18)，全氟壬烷(C9F20)，全氟癸烷(C10F22)，全氟十二烷(C12F26)等，CxF2x－4例如，全氟—2，4—己二烯等，CxF2x＋1A，例如，全氟三丙胺[(C4F9)3N]，全氟三丁胺，全氟三叔丁胺，等，CxF2x－2A2，例如，C10F18H2，等，以及這類高度氟化的化合物如全氟—1，2—二氫化茚，全氟甲基金剛烷，全氟辛基溴，全氟二甲基環辛烷，全氟環辛溴，全氟冠醚等。
除了如上所述的直鏈，支鏈和環狀含氟化合物外，在實施本發明中還可以使用氟化冠醚(如，全氟—12—冠—4，全氟15—冠—5，全氟18—冠—6等)。
為了獲得具有較高信號噪聲比的好的磁共振圖像，使用大量等價氟是有益的，這裡所用的術語「等價氟」是指那些含氟化合物的存在於基本上類似的微環境(即；基本上相似的磁環境)中的氟取代基，等價氟將會產生一個顯像信號。大量等價氟將會產生一個不被「非等價」氟的對抗信號衝淡的強信號。
這裡所用術語「非等價氟」是指那些與相同含氟化合物上的其他氟取代基相比存在於基本上不相似的微環境(即基本上不相似的磁環境)中的含氟化合物的氟取代基。因此，與等價氟相比，非等價氟由於其不同的化學位移會產生多個信號。所以，儘管具有大量非等價氟的化合物可以滿足MRI的應用，但要獲得最佳的圖像這些化合物是不理想的。
對於血管顯像的應用特別有意義的是具有延長了循環時間的含氟化碳聚合物外殼。目前所用的血管照像技術使用X—射線對比劑，這是一種損傷性的方法。近來已證實1H—MRI能夠用於血管照像術[Edelman和Warach，New Eng-land J.of Medicine 328785—791(1993)]。同樣地，19F—MRI適用於血管照像術，並具有許多優點，例如能獲得與周圍組織(它不合任何天然氟)參照的較強烈的對比。可應用這種方法的例子有診斷和鑑別顱內動脈瘤，動靜脈畸形，上腔靜脈閉塞，下腔靜脈閉塞，門靜脈閉塞，盆腔靜脈閉塞，腎靜脈閉塞，腎腸繫膜動脈閉塞，外周腸繫膜動脈閉塞等。
按照本發明用聚合物外殼包裹的含氟化合物能用於各種目的，如，獲得各種器官和/或組織的磁共振圖像，獲得器官和/或組織的氟分布情況，以及測量局部溫度。本發明對比劑並不僅局限在MRI的使用，而且也能用於超聲波掃描術和放射學的使用中。氟的其它同位素18F也能用作正電子放射X線體層照相中(PET)的對比劑。所以，使用一種含氟對比劑，能夠進行PET和MRI兩種診斷。也能捕獲用於放射對比劑中的其它顯影劑如鎝和鉈化合物。這類對比劑的兩個例子是神經松馳劑(Neurolyte)和心松解劑(Cardiolyte)。
使用本發明組合物測定氧是基於在順磁物質如氧的存在下19F的NMR松馳率的顯著變化。由於氧是順磁性的，它將與氟核相互作用，增加19F從激發態到正常態的松馳率。用監控這種松馳率變化的方法，能夠測定局部區域的氧濃度(把MRI信號校準到一個已知氧濃度)。
例如，這種體系的新穎性在於1)使用MRI能獲得氧的信息；2)利用氧的順磁性影響19FMRI(NMR)信號；3)使用聚合物外殼提供一個對氧也具有通透性的恆定的保護性環境等等。
通過使用經過生理溫度範圍內的相變的固體含氟化合物(如，高分子量的化合物，或含氟化合物的混合物)，也能使用MRI測量局部溫度。固體比液體的松馳時間更長。所以當達到相變轉化(即，從固體到液體)時，松馳時間將顯著降低。在固體到液體的相變中可觀察到NMR譜的顯著變化。把指定含氟化合物的MRI信號形狀可以校正到一個已知溫度。通過使用聚合物外殼內的高分子量含氟化合物(即，具有≥15℃熔點的含氟化合物)，或者通過使用一種聚合物外殼內的含氟化合物與非氟化合物的混合物，來選擇聚合物外殼的內含物，以提供一種發生相變所需的溫度範圍(一般在約22—55℃範圍內)。該殼內的氟化碳將在指定溫度範圍內經過從固體到液體的相變，隨之也改變所觀察到的松馳率，這樣就可以測定體內溫度。局部溫度數據將是特別有用的，例如在癌症的高體溫治療中監控患者或者在測定癌細胞中(癌細胞比正常細胞更冷)使用。
所使用的含氟組合物將決定相變的溫度範圍。所以，只是簡單地通過改變含氟組合物的組分即可在較寬的溫度範圍內使用這種技術。例如，在一種聚合物外殼中包裹的純全氟十二烷(C12F26)將在氟化碳的熔點(75℃)進行固體到液體的相變。然而，這種轉變是急速的，只能得到少量的溫度數據。為得到大量的數據，可以把含氟組合物的熔點擴大到較寬範圍內，例如，只是簡單地向純的含氟組合物中加入其它組分。現有技術中眾所周知混合物比相應純的組分有較低的和較寬的熔點範圍。所以，例如，用一種較低分子量的氟化碳配製成的全氟十二烷將會加寬用膠囊形式包裹的組合物的熔點範圍。相似地，用一種烷烴(如戊烷)和含氟化合物(如，全氟十二烷)的混合物將會加寬包裹組合物的熔點範圍。
此外，在實施本發明中也能使用化學加成氟的化學改性長鏈脂肪酸(如，正十七烷酸[C17H34O2]，十九烷酸[C19H38O2]等)，醇類(如十九烷醇[C19H40O]，二十二烷醇[C22H46O]等)。例如，全氟—叔—丁醇(t—[C4F9—OH；PCR CHEMI-CALS)]與上述任意反應性含氧化合物之間的脫水偶聯反應將會產生經過固體到液體相變的一個分子，和一個具有9個等價氟的分子。同樣，例如，一種氟化脂肪酸加寬熔點範圍，由此可用於進行局部溫度的測定。
這種溫度測定體系的新穎性在於，例如1)可使用MRI獲得空間分解的溫度數據，2)利用溫度與MRI(NMR)信號的依賴關係，3)使用了在指定溫度範圍經過固體到液體相變的一種含氟化碳組合物，4)使用了聚合物外殼對介質提供恆定和保護性的環境，和4)在得到形態數據的同時可得到溫度數據。
按照本發明，在一個截面直徑不大於約10微米(這裡使用的術語「微米」是指毫米的千分之一測量單位)的殼內包裹含氟組合物的顆粒。較優選截面直徑小於5微米，而對靜脈內途徑給藥來說目前最優選的是小於1微米的截面直徑。
根據顯像的需要可用各種方式把本發明的對比劑引入體內部位。例如，由口腔攝取或栓劑形式把懸浮水溶液導入胃腸道(如，以獲得到胃和胃腸道的顯像)，注射到非血管部位如腦脊髓腔，或者注射到血管系統或特定器官的脈管如冠狀動脈中。此外，也能把本發明對比劑注射到其它身體部位，如前，後眼腔，耳朵，膀胱(如，通過尿道)，腹膜腔，輸尿管，尿道腎盂，骨關節腔，淋巴管，蛛網膜下腔，腦室腔，心窒腔等。
含有氟組合物的固體或液體核的聚合物外殼能以相對小的體積直接傳送高劑量的含氟組合物試劑。這就減少了患者在接受大量液體時的不適。
按照本發明的其它實施方案，提供了一種對現有文獻中沒有描述過的基本水不溶性藥物如紫杉醇給藥問題的解決方法。所以，我們已經發現用微米大小顆粒的水懸浮液，或含有這種藥物顆粒或溶於生物相容非水液體中的藥物的水懸浮液，能夠完成這類藥物的傳送。這種方法有利於傳送高濃度的這類藥物，並由此避免了乳化劑的使用和其相關的毒副作用。
按照本發明的又一個實施方案，通過一種新的含藥組合物可以改進上述的給藥方式，其中把基本上不溶於水的藥物如紫杉醇懸浮在一種生物相容液體中，並且所得到的懸浮液含有截面尺寸不大於10微米左右的這類藥物(如紫杉醇)的顆粒，用不同方法如研磨，噴霧乾燥，沉澱，超聲波輻射等能獲得小於10微米的所需大小顆粒。
由於常規方法得到的不溶於水的藥物如紫杉醇的晶體大小大於20微米，所以這種藥物(如紫杉醇)的固體顆粒尚沒有以生理鹽水這類載體的懸浮液形式傳送。然而，本發明卻公開了把基本不溶於水的藥物(如紫杉醇)研成大小低於10微米左右，優選低於5微米左右，最優選低於1微米左右的顆粒，並以該顆粒的懸浮液的傳送給藥，其中所述的顆粒大小能以懸浮液形式進行靜脈內傳送而沒有器官和組織微循環堵塞的危險。
由於被傳送藥物的微粒特性，具有網狀內皮組織系統的器官如脾、肝、和肺能夠從循環中將多數藥物清除。這就使得顆粒形式的生理活性劑能夠達到體內的這些部位。
在這個實施方案中所用的生物相容液體與上述那些相同。此外，非腸道營養劑如Intralipid(用作非腸道營養劑的商業上可買到的脂肪乳化液的商品名；可從Kabi vitrum，Inc.，Clayton，Ncrth(Carolina買到)，Nutralipid(用作非腸道營養劑的商業上可買到的脂肪乳化液的商品名；可從McGaw，Irvine，alifornia買到)，Liposyn III(用作非腸道營養劑的可從商業上買到的脂肪乳化液的商品名(含有20％大豆油，1.2％卵磷脂和2.5％甘油)；可從Abbott Labora-tories，North Chicago，Illinois買到)，等可用作該藥物顆粒的載體。或者，如果生物相容液體含有象大豆油這樣的溶解藥物的物質(如，象Intralipid中)，藥物可部分或全部溶於載體液體中，有助於它的傳送。這種情況的例子是用Intralipid作載體傳送紫杉醇。在這裡用於該實施方案的優選生物相容液體是非腸道營養劑，如上所描述的那些。
根據本發明的另一個實施方案，還提供了一種用於體內傳送紫杉醇的組合物，其中將紫杉醇溶於一種非腸道營養劑中。
本發明將通過下列非限定性實施例來更詳細地說明。
實施例1含油的蛋白外殼的製備將3ml USP(美國藥典)5％人血清白蛋白(Alpha治療公司)溶液置入放有聲波探子(Heat System XL2020型)的圓柱形試管。在白蛋白溶液上覆蓋6.5ml的USP等級的豆油(大豆油)。將聲波探子的尖端放於兩溶液的界面，並把此組合裝置保持在20℃的冷浴中。使此系統平衡後，聲波裝置開通30秒。強烈混合得到一種白色乳狀懸浮液。將懸浮液用生理鹽水稀釋成1∶5。利用顆粒計數器(顆粒數據系統Elzone，280PC型)測定含油蛋白殼的大小分布和濃度。測定後的蛋白殼被確定具有約1.35±0.73微米的最大橫徑，其在原懸浮液的濃度為～109個/ml外殼。
作為對照，使上述組合物中不含蛋白，當受到超聲輻射時則不能形成穩定的微乳化液。此結果表明，對於微球體的形成，蛋白是必不可少的。此將通過如下所述的電子顯微照片觀察和透射式電子顯徽鏡研究得到證實。
實施例2影響聚合物外殼形成的參數對幾種變量，如蛋白濃度、溫度、聲波處理時間、管理活性劑的濃度和聲波強度進行測試，以便獲得聚合物外殼的最佳製備方式。這些參數通過含有甲苯的交聯牛血清白蛋白外殼進行確定。
用顆粒計數器測定由蛋白濃度為1％、2.5％、5％和10％的溶液製備的聚合物外殼的大小和數量的變化，發現聚合物外殼的大小不隨蛋白濃度的變化而大幅度地改變，但是每ml由「乳狀懸浮液製備的聚合物外殼的數量，在5％濃度以下隨蛋白濃度的增加而增加。未發現在此蛋白濃度以上，聚合物外殼的數量產生顯著的變化。
對於聚合物外殼的最佳製備，發現試管最初溫度是重要的。典型地，最初試管溫度保持在0～45℃之間。用於聚合物外殼形成的油的水油界面張力是一個重要參數，它也以溫度的函數形式而變化。藥理活性劑對蛋白外殼的產生沒有重要的影響。不管藥理活性劑是以溶解狀態加入，還是懸浮於分散介質中，它是相對不重要的。
聲波處理時間是決定每ml所產生的聚合物外殼數量的重要因素。發現聲波處理時間大於3分鐘，聚合物外殼總量則減少，說明過度的聲波處理可能導致聚合物外殼的破壞，聲波處理時間少於3分鐘，則產生足夠數量的聚合物外殼。
按照發聲器生產廠家提供的列線圖，此外使用的發聲器超聲功率大約為150w/cm2。應用三種逐漸增高的功率設定，發現最高功率的功率設定產生的聚合物外殼數量最多。
實施例3含溶解紫杉醇的聚合物外殼的製備將紫杉醇以2mg/ml的濃度溶解在USP等級豆油中。將3ml USP5％人血清白蛋白溶液置於連接有聲波探子的圓柱形試管中。在白蛋白溶液上覆蓋6.5ml豆油/紫杉醇溶液，聲波探子尖端置於兩溶液的界面上。使此組合進行平衡，發聲器開通30秒。強烈混合，得到一種穩定的白色乳狀懸浮液，其中含有包裹了/油紫杉醇溶液的蛋白壁聚合物外殼。
為獲得此交聯蛋白外殼的較高載荷量，將一種油和藥物的互溶劑(藥物在其中有相當大的溶解度)與油混合在一起。只要此互溶劑相對無毒(例如乙酸乙酯)，它便可以同原始載體一起注射，另一方面，可以在聚合物外殼製備之後，通過真空下液體的蒸發而被去除。
實施例4聚合物外殼的穩定性在3種不同溫度下(即4℃、25℃和38℃)，分析已知濃度的聚合物外殼懸浮液的穩定性。通過特定時間內顆粒數的改變來測定其穩定性。如上所述(參照實施例1)製備出含有豆油的交聯蛋白(白蛋白)外殼，在鹽水中稀釋，使最後的油濃度達到20％，並在上述溫度下保存。所獲得的每個樣品的顆粒數(Elzone)與時間的函數總結於表2中。
表2
上面的數據說明經過實驗時間，所計數的顆粒(即聚合物外殼)的濃度仍保持相當恆定。相當恆定的範圍在7—9×1010/ml之間。它表明，在經過幾乎四周的時間，在不同的溫度下，聚合物外殼具有良好的穩定性。
實施例5活體內生物分布——含有螢光團的交聯蛋白外殼為確定靜脈內注射後，包裹在蛋白聚合物外殼體內的液體的攝取及生物分布，將一種螢光染料(紅熒烯，從Aldrich中得到)包裹在人血清白蛋白(HSA)聚合物外殼體內，用作一種標記物。這樣，將紅熒烯溶解於甲苯中，通過如上所述的超聲輻射製備出含有甲苯/紅熒烯的交聯白蛋白外殼。所得的乳狀懸浮液在生理鹽水中稀釋5倍。然後將2ml稀釋後的懸浮液以10分鐘的速率注射入小鼠的尾靜脈。在注射後1小時處死一隻動物，另一個在注射24小時後處死。在螢光顯微鏡下檢查肺、肝、胃、脾、骨髓的100微米冷凍切片，以確定包裹了螢光染料或釋放了染料的聚合物外殼的存在。在1小時的時候，大多數聚合物外殼是完整的(即呈現明亮的螢光顆粒，直徑大約1微米)，並且位於肺和肝內。24小時的切片，染料在肺、肝、脾、骨髓中都能觀察列。對普通的組織染色進行了觀察，顯示聚合物外殼的殼壁已經被水解(消化)，染料從中釋放出來。此與預期的結果相一致，說明本發明組合物具有延緩和控制內容藥物活性劑(如紫杉醇)釋放的潛在用途。
實施例6含有豆油(SBO)的聚合物外殼的毒性如實施例1所述製備含豆油的聚合物外殼，在生理鹽水中稀釋為兩種不同的溶液，一種含20％豆油，另一種含30％豆油。
內脂，一種商業上可得到的TPN劑，含有20％豆油(SBO)。當以1毫升/分鐘的速度注射內脂時，小鼠的半數致死量是120ml/kg，或者說對於1個30g的小鼠大約為4ml。
用含有豆油的本發明組合物對兩組小鼠(3個為1組，每個重約30g)作如下處理。給每個小鼠注射4ml製備的含豆油聚合物外殼的懸浮液。一組中的每個小鼠接受含20％SBO的懸浮液，另一組的每個小鼠接受含30％SBO的懸浮液。
如此處理後，接受含20％SBO懸浮液組中的3個小鼠全部存活，並且在SBO處理後一周觀察，所有組織或器官均未顯示肉眼所見毒性。接受含30％SBO懸浮液的一組三個小鼠中僅有1個在注射後死亡。此結果清楚地表明，按本發明聚合物外殼內所含的油，與商業上可得到的SBO製劑(內脂)相比，在它的半數致死量時是無毒的。此作用可能是由於聚合物外殼內的油的緩慢釋放(即控制的生物利用率)的結果。與商業上可得到的高油量的乳劑相比，如此的緩慢釋放阻止了油的致死量的出現。
實施例7從聚合物外殼中釋放的豆油的活體生物利用率在向鼠血流中注射聚合物外殼懸浮液後，進行一項試驗以確定被聚合物外殼包裹的物質的緩慢或持續釋放。通過如上所述的聲波處理，製備含有豆油(SBO)的交聯蛋白(白蛋白)壁的聚合物外殼。用生理鹽水將所得到的含油的聚合物外殼混懸液稀釋成最終含20％油的混懸液。用10多分鐘將5ml此種懸浮液注入有插管的小鼠頸外靜脈中。在注射後的幾個時間點，從這些小鼠採血，並通過常規分析確定血中甘油三酯的含量(豆油主要是甘油三酯)。
用5ml商業上可得到的脂肪乳劑(內脂，一種含水非腸道營養劑—含有20％豆油，1.2％蛋黃卵磷酯和2.25％甘油)作對照物。此對照物利用卵磷酯作為乳化劑，以穩定此乳劑。這兩種情況下的甘油三酯的血清水平的比較將得出作為時間函數的油的生物利用率的直接比較。除含油20％的聚合物外殼懸浮液以外，還注射5ml生理鹽水稀釋的最終濃度為含油30％的聚合物外殼懸浮液樣品。三個組中，每個組使用2個小鼠。將每種情況下血中甘油三酯水平列於表3中，其單位為mg/dl。
表3
標有「注射前」的一欄中表示注射前血中甘油三酯水平。很明顯，對於內脂對照物，可以看到注射後甘油三酯水平很高，大約需要24小時的時間甘油三酯開始降到注射前水平。可見，這種油在注射後能被立即利用於代謝中。
與內脂含有相同油總量(20％)的含油聚合物外殼懸浮液，其血清中可測得的甘油三酯則顯示出一種很不同的利用率。其含量升高到其正常值的2倍左右，並且在此水平上維持好幾小時。這表明甘油三酯以一個相當接近於正常值的水平緩慢或持續地釋放入血。接受含油30％的聚合物外殼組顯示較高甘油三酯水平(伴隨較高的給藥量)，並在48小時內降至正常。重複一次，與接受內脂的對照組相比，此組中血甘油三酯水平沒有極大的升高。這又一次表明了本發明組合物中油的緩慢和持續釋放，其優點是避免了聚合物外殼內物質的危險性高血濃度，並且以可接受的水平在較長時間內被利用。
很明顯，本發明的聚合物外殼內所傳送的藥物也將具有同樣的優越性。
這種含豆油的聚合物外殼系統可懸浮於一種由胺基酸、基本電解質、維生素和糖組成的水溶液中，以構成一種全胃腸外營養劑(TPN)。這種TPN不能用目前常用的脂肪乳(如內脂)來製成，因為有電解質存在的乳劑是不穩定的。
實施例8含有藥物活性劑固體核心的交聯蛋白壁聚合外殼的製備在聚合物外殼內傳送水難溶性藥物(如紫杉醇)的另一種方法是製備一種包裹有固體藥物核心的聚合物外殼。這種「蛋白包衣」藥物顆粒可按下述方法獲得。重複實施例3中所描述的步驟，使用有機溶劑溶解紫杉醇達到較高濃度。通常使用的溶劑是有機溶劑，如苯、甲苯、己烷、乙醚等。聚合物外殼的製備如實施例3。將5ml含溶解紫杉醇的聚合物外殼乳狀懸浮液用生理鹽水稀釋至10ml。將此懸浮液放入室溫的旋轉式蒸發器中，揮發性的有機物通過真空而被去除。在旋轉式蒸發器中2小時後，在顯微鏡下觀察，這些聚合物外殼暴露出模糊的核心，這表明基本上所有有機溶劑確實已被除去而固體紫杉醇存在於蛋白殼內。
還可以將帶有有機溶劑溶解的藥物核心的聚合物外殼冷凍乾燥，以獲得一種不幹碎粉沫，它能在使用時再次懸浮於鹽水中(或其它適宜的液體中)。如果是在室溫下不能保持固態的藥物，可獲得液體核心聚合物外殼。這種方法可以用來製備含非稀釋藥物的交聯蛋白壁殼體。顆粒大小分析顯示這些聚合物外殼比含油的聚合物外殼小。儘管目前用於製備聚合物外殼的優選蛋白是白蛋白，其實其它蛋白如α—2—巨球蛋白，一種已知的調理素，也可用來增加巨噬細胞對聚合物外殼的攝取量。還可以，在形成聚合物外殼過程中將PEG—巰其加入其中，以產生一種可延長體內循環時間的聚合物外殼。
實施例9聚合物外殼在體內的循環及釋放動力學按上述(見，實施例3)製備含紫杉醇的固體核心聚合物外殼，並懸浮於生理鹽水中。用下述的HPLC來測定懸浮液中紫杉醇的濃度。首先，聚合物外殼內的紫杉醇被加入的0.1M巰基乙醇游離出來(引起蛋白二硫交聯鍵的互換，並破壞聚合物外殼的交聯)；然後，用乙腈將游離的紫杉醇從懸浮液中提取出來。離心所得的混合液，並將其上清液凍幹。將凍乾物溶解於甲醇中，並注射於HPLC上，以確定懸浮液中紫杉醇的濃度，大約為1.6mg/ml。
通過頸靜脈導管給小鼠注射此懸浮液2ml，2小時時處死此動物，並通過HPLC測定存在於肝臟中的紫杉醇量。此需要對肝臟進行均漿，然後用乙腈提取，在離心後凍幹上清液。將凍乾物溶解於甲醇中，並注射於HPLC上。從2小時的肝臟中回收了約給藥量15％的紫杉醇。顯示出肝臟的有效劑量。此結果與已知的肝臟網狀內皮系統從血中清除小顆粒的功能相一致。
實施例10交聯PEG—壁聚合物外殼的製備製備含巰基的聚乙二醇，它是製備本發明聚合物外殼的含巰基蛋白的替代物，或是製備本發明聚合物外殼的添加劑。已知PEG對細胞無毒性、無炎性、無粘連性，並且通常無生物活性。曾將它連接於蛋白上以減少其抗原性，連接於構成脂類的脂質體上可以延長它們在體內的循環時間。因此，將PEG結合於基本蛋白殼，可以預期地延長聚合物外殼的循環時間和提高其穩定性。通過改變加入到5％白蛋白溶液中的巰基聚乙二醇的濃度，有可能獲得具有不同體內穩定性的聚合物外殼。可以通過文獻中可得到的技術製備巰基聚乙二醇(如Harris和Herati的技術，公開於PolymerPreprints Vol.32154—155(1991))。
將分子量2000g/mol的巰基聚乙二醇以1％(0.1g加入10ml中)的濃度溶解於5％的白蛋白溶液中。在此蛋白/PEG溶液上覆蓋如實施例1所述的油，並於聲處理後產生帶有由交聯蛋白和PEG構成的殼壁的含油聚合物外殼。按實施例4所述檢驗這些聚合物外殼的穩定性。
可被巰基修飾並用來替代PEG的其它水溶性合成聚合物包括聚乙烯醇、異丁烯酸聚羥乙酯、聚丙烯酸、聚乙烯惡唑啉、聚丙烯醯胺、聚乙烯比咯烷酮、多糖等(如聚氨基葡糖、藻酸鹽、透明質酸、右旋糖酐、澱粉、果膠等)。
例如，可延長體內循環時間的含碳氟化物的蛋白殼，對血管系統成像特別有益。與殼壁中不含PEG的外殼相比，這些殼體在延長期中仍保留在循環中。例如，它可使心臟循環直觀化，並提供一種非損傷性的評價冠狀循環的方法，代替了如血管造影術這樣的傳統損傷性技術。
實施例 11通過含免疫抑制劑聚合物殼體的靜脈給藥將免疫抑制劑傳送到移植器官免疫抑制劑廣泛應用於如下的器官移植中以防止排斥反應的發生。特別是，環孢菌素(Cyclosporine)，一種有效的免疫抑制劑，可延長同種異體移植的存活時間，包括皮膚、心臟、腎臟、胰腺、骨髓、小腸和肺的移植。已證明環孢菌素可抑制某些體液免疫和在更大程度上抑制細胞調節的反應如同種移植排斥反應、遲髮型過敏反應、試驗性過敏性腦脊髓炎、布氏佐劑關節炎和許多動物品種中不同器官的移植物對抗宿主的移植性疾病。使用環孢菌素已在人體中成功地進行了腎、肝和心臟的同種異體移植。
環孢菌素目前以口服給藥，可以是以含環孢菌素溶液的膠囊形式給藥，該環孢菌素溶液可以是它的乙醇溶液和油溶液(如玉米油、聚氧乙烯化的甘油酯等)，也可以環孢菌素的橄欖油、聚氧乙烯化的甘油酯等的溶液形式給藥。它也可以通過靜脈注射給藥，這種情況下它被溶解於乙醇(約30％)和Cremaphor(聚氧乙烯化的蓖麻油)溶液中，注射前必須在生理鹽水或5％葡萄糖中稀釋為1∶20至1∶100。與靜脈輸注相比，口服溶液的絕對生物利用率大約是3％(SandozPharmaceutica Corporation，PublicationSDI—Z10(A4)，1990)。通常，環孢菌素的靜脈給藥與目前使用的紫杉醇靜脈給藥存在著相似的問題，即被認為是由靜脈給藥載體Cremaphor引起的過敏和變態反應。另外，如此所述用膠囊包裹藥物(如環孢菌素)的靜脈給藥，可避免給藥後立即出現危險的血液峰值。例如，目前所用的環孢菌素製劑與上述膠囊包裹形式的環孢菌素製劑的比較，顯示出後者的注射後立即出現的血液峰值水平有5倍的下降。
為了避免與Cremaphor相關的問題，包裹於如上所述的聚合物外殼內的環孢菌素可通過靜注給藥。可以將它溶解於一種生物適合性油類或許多其它溶劑。然後通過如上所述的聲波處理，將它分散入聚合物外殼內。另外，聚合物外殼包裹的環孢菌素(或其它免疫抑制劑)給藥的重要優點是由於肝內網狀內皮系統對注射物質的攝取而具有局部定位特點。在一定程度上，由於局部定位特點可避免系統毒性作用並減少有效劑量。在實施例9中描述了靜脈給藥之後，可將聚合物外殼包裹的紫杉醇有效地輸送到肝臟。根據本發明輸送環孢菌素(或其他可能的免疫抑制劑)會得到類似的結果。
實施例12聚合物外殼的抗體靶作用本發明的聚合物外殼的特徵是可以把單克隆或多克隆抗體附著在聚合物外殼上，或者把抗體結合到聚合物外殼內。當製備聚合物微型膠囊殼時，可以把抗體結合到聚合物外殼內，或者在製備之後將抗體附著在聚合物微型膠囊殼上。可用標準蛋白固定技術來實現這一目的。例如，蛋白質如白蛋白製備的蛋白微型膠囊，白蛋白賴氨酸殘基上的大量的氨基基團可以用來附著適宜的改性抗體。例如，製備聚合物外殼時，將抗腫瘤抗體結合到聚合物外殼內；或者在製備之後將抗腫瘤抗體附著在聚合物微型膠囊殼上，從而將抗腫瘤劑輸送到腫瘤部位。再如，在製備聚合物外殼時，將抗靶細胞上受體的抗體結合到聚合物外殼內，者在製備之後，將抗靶細胞上受體的抗體附著在聚合物微型膠囊殼上。使基因產品被傳送到特定細胞上(如肝細胞上或骨髓中的某些幹細胞上)；另外，可用抗核心受體的單克隆抗體將包裹的產品作用於特定細胞類型的細胞核。
實施例13聚合物外殼作為多核苷酸結構、酶和疫苗的載體基因療法作為一個可行性的選擇性療法，越來越被廣泛接受(目前，40多項人基因轉移的方案已經被NIH和/或FDA檢查委員會認可)。但實行這種療法的障礙之一就是人們不願意使用病毒載體將基因物質導入到人細胞基因組中。病毒本身是具有毒性的，因此，在基因療法中冒險使用病毒載體，特別是對非致死性、非遺傳性疾病的治療來說是不被接受的。可惜的是，沒有利用病毒載體而轉移的質粒通常不被導入到靶細胞的基因組中。另外，如同常規藥物一樣，這種質粒在體內的半衰期是有限的。因此，使用基因療法(以及反義療法，它是一種相反形式的基因療法。其中將核酸或寡聚核苷酸導入來抑制基因表達)的一般限制不能有效地向體內傳送核酸或寡聚核苷酸，因為它們太大不能透過細胞膜。
將DNA、RNA、質粒、寡聚核苷酸、酶等包裹在本發明所述的蛋白微膠囊殼中，可以促進它們向肝、肺、脾、淋巴和骨髓的靶傳送。因此，按照本發明，可以將這些生物製品傳送到細胞內部而不會伴隨有與使用病毒(載體相關的危險性)。這種類型的製劑可以促進從血流中直接對聚合物外殼的非特異性攝入或者RES細胞的攝粒作用。或者通過肌肉注射進入肌肉細胞中，或者通過直接注射進入腫瘤中。另外，可以用抗核心受體的單克隆抗體將包裹產物靶傳送到某種細胞類型的細胞核。
用這種結構可以治療的疾病包括糖尿病、肝炎、血友病、膀胱纖維變性、多發性硬化症、腫瘤、流感、愛滋病等疾病。例如，可以將類胰島素生長因子基因(IGF—1)包裹在蛋白微囊外殼中給藥來治療糖尿病性外周神經病和惡病質。可以將編碼IX因了和VIII因了(用於治療血友病)的基因包裹在本發明的蛋白微囊外殼中，以特異性地傳送肝臟。同樣，可以將低密度脂蛋白(LDL)受體基因包裹在本發明的蛋白微囊殼體中，特異性地傳送到肝臟以治療動脈粥樣硬化。
適用於實施本發明的其它基因是那些重新激活機體對癌細胞的免疫反應的基因。例如，由質粒中所含DNA編碼的抗原，如HLA—B7，可以加入到本發明的蛋白微囊殼體中，直接注射入癌灶(例如皮膚癌)。一旦進入癌灶，抗原將激發癌特異性細胞，使細胞激活素(如，IL—2)水平升高，它能使腫瘤具有免疫系統所攻擊的靶目標。
再如，也可以將含有部分腺相關病毒基因組的質粒包裹到本發明的蛋白微膠囊殼體中。另外，本發明的蛋白微囊殼體可以用於傳送治療基因到達CD8＋T細胞，作為對各種癌症和感染性疾病的可接受性免疫治療。
本發明的蛋白微囊殼體還可用作抵抗感染性疾病的給藥系統，來靶傳送如抗肝炎B病毒的反義核苷酸。這種反義寡聚核苷酸的一例子是一種抗肝炎B病毒的聚腺苷酸信號的21聚體含磷硫的核苷酸(phosphoro thioate)。
本發明的蛋白微囊殼體還可用來傳送囊性纖維變性透膜調節基因(CFTR)。缺乏這種基固的人會發生囊性纖維變性，可以通過噴霧含有CFTR基因的本發明的蛋白微囊殼體，並直接吸入肺中來治療這種疾病。
用本發明的微囊殼體也可以傳送酶。例如，可以將酶(DNAse)包裹，並通過在聚合物殼體外部連接上合適的抗體而將它靶傳送到病毒包裹蛋白或病毒感染的細胞。也可以將疫苗包裹在本發明的聚合物微囊中，並用於皮下，肌肉內或靜脈內給藥。
實施例14用作血紅細胞代用品的不溶性血紅蛋白結構(HIC)的製備合成前用乙醇和無菌生理鹽水衝洗一個20ml玻璃反應皿、鈦發生器和墊圈、以及所用的全部儀器。在典型反應中，將3.5ml 5％w/v血紅蛋白(人或牛的)加入反應皿，連接上超聲波發聲器(Heat Systems XL2020，20KHz，最大功率400W)。然後將此發聲器和反應皿浸入55℃的控溫槽中，雖然產物可以在較寬的溫度範圍內(0～80℃)合成，但最佳溫度為55℃，pH值為6.8。對於物質的高收率，溫度控制是關鍵，並且最佳溫度依賴於特殊的實驗設計。超聲波源在功率7位置上開通。利用廠家的列線圖推測輸出功率大約為150W/cm2。在30秒內完成反應。較長或較短的反應時間，其產量都比較少。對於牛血紅蛋白來說，使2.5％w/v溶液通過一種Sephadex G—25凝膠滲透柱以除去所有陰離子，如磷酸根。在典型的人血紅蛋白IHC的合成中，將超聲發生器置於氣和水的交界面上。產生的均勻懸浮液含有蛋白質類血紅細胞。將水懸浮液貯藏於4℃的無菌容器內。
典型的反應產生每ml含有大約3×108IHC殼體的溶液，其殼體平均直徑3微米，標準誤差為1微米。此合成過程產生了高濃度的微米大小的生物物質，其大小分布範圍很窄。
合成以後，IHC仍保持為天然蛋白溶液中的懸浮體。為了從未反應的蛋白中分離出IHC，可用如下幾種方法過濾、離心和透析。第1種方法包括過濾混合物，通過一種Anotop注射過濾器，其孔徑為0.2μm(Whatman，Inc.)，用幾體積的水衝洗過濾器，直到濾液含有很少或不含蛋白(通過UV—可見光譜測定)。IHC被回衝(backwashed)出過濾器，重新懸浮於相同容積的鹽水中。第二種純化過程包括向心或離心過濾器的應用，其截止分子量為100KD。離心過濾是一種被濾過膜從中間隔開的離心管。在1000G將IHC溶液離心5分鐘，可使大多數未反應的血紅蛋白(64.5KD)通過濾過膜。最後，用大分子量(300KD)的濾過膜透析以純化IHC。然而，此方法需要透析2天左右。純化IHC的優選方法是應用向心離心。
實施例15用作紅細胞替代物的不溶性血32蛋白/白蛋白結構(IHAC)的製備合成前用乙醇和無菌生理鹽水衝洗一個20ml玻璃反應皿、鈦發聲器和墊圈以及所用的全部儀器。在典型反應中，將3.5ml 5％m/v血紅蛋白和白蛋白(人或牛的，血紅蛋白/白蛋白比值在0.5～2之間)加入反應皿，連接超聲發生器(Heat Systems，XL2020，20kHz，最大功率400W)，然後將此發聲器和反應皿浸入55℃的控溫槽中。雖然產物可在較寬的溫度範圍內(0～80)合成，但在55C下反應進行最佳。pH值為6.8。對於產物的高收率，溫度的控制是關鍵，並且最佳溫度依賴於特殊的實驗設計。超聲波源在功率7位置上開通，利用廠家的列線圖推測其輸出功率大約為150W/cm2。在30秒內完成反應。較長或較短的反應時間，其產量都比較少。所產生的均勻懸浮液中含有蛋白類血紅細胞的替代物。含水懸浮液經過過濾、衝洗，重新懸浮於無菌緩衝鹽水中，並在4℃的無菌容器內貯存。
如上所述，典型的反應產生每ml含有大約108個殼體的溶液，其殼體平均直徑為3微米，標準誤差為1微米。此合成過程產生高濃度、大小分布狹窄的微米大小的生物物質。
還可以利用一種流水線系統，使IHC的生成反應連續進行。這種系統由蠕動泵組成，它可持續地將血紅蛋白流以及任意一種的生物可溶性油或碳氟化物泵入帶有聲波發聲探針的反應皿中。在反應皿中停留一段合適的時間，IHC通過從反應皿中溢出進入回收罐而得到回收。未反應血紅蛋白溶液重新循環進入反應皿中。
實施例16含有包裹碳氟化物的不溶性血紅蛋白結構的製備合成前用乙醇和無菌生理鹽水衝洗一個20ml玻璃反應皿、鈦發生器和墊圈，以及所用的全部儀器。在典型的反應中，將3.5ml 5％m/v血紅蛋白(人或牛的)加入反應皿，連接超聲發聲器(Heat Systems XL2020，20KHz，最大功率400W)。將一種碳氟化物，全氟萘烷3.5ml，加入反應皿中。然後將此超聲發聲器和反應皿浸入20℃的控溫槽內。此水相pH為6.8。超聲波源在功率7位置上開通。利用廠家的列線圖推測出輸出功率大約為150W/cm2。在30秒內完成反應。所得的均勻懸浮液中含有在內部包裹有全氟萘烷的交聯不溶性血紅蛋白殼體的微囊或微球體。此乳狀懸浮液經過過濾、衝洗，重新懸浮於上述的無菌緩衝生理鹽水中，並在4℃的無菌容器內貯存。
如上所述，典型的反應產生每ml含有大約108個殼體的溶液，其殼體平均直徑為3微米，標準誤差是1微米。此合成過程產生了高濃度、大小分布狹窄的微米大小的生物物質。
實施例17含有包裹碳氟化物的不溶性白蛋白結構的製備合成前用乙醇和無菌生理鹽水衝洗一個20ml玻璃反應皿、鈦發聲器和墊圈，以及所有的全部儀器。在典型反應中，將3.5ml 5％w/v白蛋白(人或牛的)加入反應皿中，連接超聲發聲器(Heat Systems XL2020，20KHz，最大功率400W)。將一種碳氟化物，全氟萘烷(或全氟三丙胺)3.5ml加入反應皿中。然後將超聲發聲器和反應皿浸入20℃的控溫槽內。此水相pH為6.8。超聲波源在功率7位置上開通。利用廠家的列線圖推測出輸出功率約為150W/cm2。在30秒內完成反應。所得的均勻懸浮液中含有在內部包裹有全氟萘烷(或全氟三丙胺)的交聯不溶性白蛋白殼體的微囊或微球體。此乳狀懸浮液經過過濾、衝洗，重新懸浮於上述無菌緩衝鹽水中，並在4℃的無菌容器中貯存。
如上所述，典型的反應產生每ml含有大約108個殼體的溶液，其殼體平均直徑為3微米，標準誤差為1微米。此合成過程產生了高濃度、大小分布狹窄的微米大小的生物物質。
實施例18用變構改良劑如5′—磷酸吡哆醛(PLP)進一步改良的不溶性血紅蛋白結構為獲得對氧具有不同親合力(即不同的P50的血紅蛋白結構，用IHC與PLP(一種已知的變構調節劑)作進一步反應。將三羥甲基氨基甲烷緩衝液中的IHC(按實施例14獲得)懸浮液，在10℃氮氣下脫氧。將10ml脫氧後的IHC懸浮液分別放入6個獨立的反應皿中。每個反應皿中加入的PLP/Hb摩爾比不同，它們是0.1/3.0，0.75/3.0，1.5/3.0，3.0/3.0，4.2/3.0，6.0/3.0。30分鐘後，加入超過10倍量的硼氫化鈉，持續30分鐘以減少席夫鹼。然後通過離心過濾此懸浮液，用緩衝鹽水回衝3次，重新懸浮於緩衝鹽水中，並在4℃下貯存。這種修飾作用於脫氧血紅蛋白中6—珠蛋白鏈上的氨基末端基因。從這種意義上講，在穩定脫氧構象方面，此種改性與2，3—DPG它連接於賴氨酸EF6(82)b上的作用非常相似。
這六種不同程度改性的結果是IHC的P50隨著PLP取代的增多而遞增(P50的遞增，也就是氧親合力的下降)。
實施例19帶有血紅蛋白和聚乙二醇交聯殼體的不溶性結構物已知聚乙二醇(PEG)對細胞無毒性、無炎症性、無粘連性，通常無生物活性。附著在PEG上的蛋白很少發現有抗原性。發現脂質體的循環會固PEG的聯接或結合而增加。因此，這種將PEG結合入RBC中，將會預期地延長循環時間。通過改變加入蛋白(如血紅蛋白)的巰基PEG的濃度，可製備出具有不同穩定性的PEG血紅蛋白RBC。巰基PEG可通現有技術製備(如Harris和Heart Polymer Preprints 32154(1991))。
將分子量為2000g/mol的巰基PEG以1％的濃度(即0.1g加入10ml)溶解於5％血紅蛋白溶液中。用聲波處理這種蛋白—Peg溶液以生成如實施例14中描述的蛋白類紅細胞替代物。
實施例20帶有以共價鍵附著於殼體外部的聚乙二醇的不溶性血紅蛋白結構按實施例14所述製備IHC。採用文獻中(Beauchamp etal.Analytical Biochemistry 13125—33，1983)的技術，將分子量為10,000的聚乙二醇(PEG 10K)與1，1′-羰基二咪唑(CDI)反應。將IHC懸浮於50mM pH為8.0的硼酸緩衝液中，並且加入PEG—CDI(超過血紅蛋白賴氨酸總量的2倍摩爾量)，在室溫下攪拌反應混合物6小時，所得的PEG—IHC通過過濾分離，用鹽水衝洗，重新懸浮於無菌緩衝鹽水中。
實施例21
影響不溶性血紅蛋白結構形成的參數檢驗幾個變量，如蛋白濃度，溫度，聲處理時間，聲強度，pH值，以獲得IHC的最佳生成方式。
由1％，2.5％，5％和10％的血紅蛋白溶液製備這些物質，也可由混和蛋白溶液製備，如血紅蛋白和人、牛的白蛋白，其濃度變化為1—10％。用粒子計數器測定其大小和濃度。發現其大小不隨蛋白起始濃度出現有意義的變化。在蛋白自起始濃度至5％之間時，所得數量隨濃度增加而增加。在此濃度以上，其數量沒有發現有明顯變化。
發現初始試管溫度對IHC的最佳製備有重要意義。典型初始溫度保持在0—80℃，最佳初始溫度為70℃左右。
超聲處理時間也是決定每ml產生IHC數量的重要因素。超聲處理約30秒左右，有利於合成高濃度的IHC。更長或更短的超聲處理時間產生足量但較前為少的IHC。
按照超聲發生器廠家提供的列線圖，用於此實驗的超聲發生器的聲音功率約為150W/cm2。其它設定功率也可產生大量的IHC。
實施例22作為油溶性藥物的載體的不溶性血紅蛋白結構幾種抗腫瘤藥物的細胞毒作用在有氧情況下大大提高。因此，在將藥物輸送到腫瘤灶的同時，需要提高那個部位的氧濃度。本發明的血紅蛋白微球體具有此作用。上面實施例16描述了不溶性血紅蛋白殼體對碳氟化物液體的包裹。細胞毒藥物，例如環磷醯胺、BCNU、左旋苯丙氨酸氮芥、紫杉醇、喜樹鹼、阿黴素、鬼臼乙叉戒等等，可被溶解在碳氟化物或其它適宜的油中，例如豆油，並且被包裹於血紅蛋白結構內。
以5mg/ml的濃度將紫杉醇溶解於豆油(SBO)中，將3.5ml 5％的血紅蛋白溶液加入反應中，然後再加入3.5ml的SBO/紫杉醇。對兩相混合物進行如實施例16中的聲波處理，得到含有SBO/紫杉醇的交聯不溶性血紅蛋白殼體。
實施例23作為水溶性藥物的載體的聚合物殼體幾種水溶性藥物被選用包裹於聚合物殼體內。例如，將氨基甲葉酸以5mg/ml的濃度溶於水中。使用普盧蘭尼克—65(聚環氧乙烷和聚環氧丙烷的嵌段共聚物)將每ml這種水溶液和4ml的豆油一起乳化，形成一種穩定的油包水(w/o)微乳液。在3.5ml 5％血紅蛋白溶液上覆蓋3.5ml這種w/o微乳化液。聲處理30秒後得到含有包裹的氨基甲葉酸微乳化液的不溶性血紅蛋白結構。
實施例24作為蛋白載體的聚合殼體幾種蛋白被選用包裹於聚合物外殼內，如血紅蛋白，白蛋白等等。例如，作為一種增加IHC的血紅蛋白負荷量的方法，把血紅蛋白包裹入IHC中，取代實施例23中的水溶性藥物。將血紅蛋白以10％的濃度溶於水中。使用普盧蘭尼克(Pluronic)—65(聚環氧乙烷和聚環氧丙烷的嵌段共聚物)將1ml的這種水溶液與4ml的豆油一起乳化，以形成一種穩定的油包水(w/o)微乳化液。在3.5ml 5％的血紅蛋白溶液上覆蓋3.5ml這種含有血紅蛋白的油包水微乳化液。這兩相混合物經聲波處理30秒後得到不溶性血紅蛋白結構，這種結構含有本身也含血紅蛋白的包裹的微乳化液。這種方法可提高每個IHC微球體的血紅蛋白總量，因而為結合氧提高了攜氧能力。
實施例25白蛋白/碳氟化物結構的體內給藥——磁共振成像(19F—MRI)檢測生物分布按實施例17製備含全氟壬烷的白蛋白結構。最後的懸浮液由含20％體積的碳氟化物的無菌鹽水構成。將2ml此懸浮液經尾靜脈注入氯胺酮麻醉的Sprague Dawley小鼠。通過使用Bruker 500MHz NMR儀器以19F—MRT檢測碳氟化物的活體分布。將小鼠放入一個10cm19F線圈內使用T1加權序列以TR＝1秒，TE＝20毫秒和256×128數據矩陣而獲得影像。
給藥後1小時發現大多數FC蓄積在肝、肺、脾中。一些FC也能在骨髓中檢測到。在組織定位和蓄積方面，血紅蛋白結構有預期的完全相同的作用。這些觀察結果對肝、肺腫瘤的治療，以及在用高劑量氧配合細胞毒藥物的定位給藥或作為放射治療的輔助藥物治療骨髓腫瘤細胞方面具有重要的啟示。
實施例26帶有藥物的結構的活體給藥按實施例22製備含包裹的紫杉醇(在SBO中)的不溶性血紅蛋白結構，所得的懸浮液由含20％體積的SBO的無菌鹽水構成。將2ml此懸浮液經尾靜脈注入氯胺酮麻醉的Sprague Dawley小鼠中。
注射2小時後，處死小鼠，取出肝臟。用少量的鹽水使肝臟勻漿，並用乙酸乙酯提取。將提取物凍幹，溶於甲醇中並注入到一種HPLC柱。從肝中回收了未代謝的起始劑量大約15％的紫杉醇。這說明，在向這些部位傳送氧的同時將抗腫瘤藥物特異性地輸送到肝臟是可行的。
實施例27作為不溶性血紅蛋白血液代用品的穩性血液置換模型通過頸外靜脈，給麻醉的Sprague—Dawley小鼠插管。在10分鐘時間取出其血量的70％左右。小鼠保持此狀態再經過10分鐘。然後重新注入一種P50為28mmHg的充氧的IHC等滲懸浮液。連續監測小鼠的平均動脈壓，心率和呼吸頻率。隨著時間的推移這些小鼠存活下來。
實施例28難溶性血紅蛋白對組織局部缺血逆轉的作用對難溶性血紅蛋白(IHC)選擇性地將氧氣傳輸到局部缺血部位的功能進行研究。具有「高親合力」，即P50(28mmHg的IHC適用於這一目的，因為它們僅在此循環系統中正常碰到氧梯度大的部位，也就是所說的在局部缺血部位釋放氧氣。將具有P50為20mmHg的IHC用於這目的。
用大鼠雙側頸動脈閉塞模型作為「中風」或大腦局部缺血模型。通過臨時結紮使氯胺酮麻醉的Sprague—Dawley小鼠的兩側動脈閉塞，在對照組中，15分鐘後移去結紮而恢復正常的血液流動。在實驗鼠中，用加氧設備使IHC混懸液在外部充氧後，直接將1ml高親合力的IHC鹽水混懸液注入每一側的頸動脈。治療24小時後，處死小鼠，取出它們的大腦，固定，切片並用氮藍四唑(NBT)或錐蟲藍染色來測定細胞死亡的程度。通過錐蟲藍染色的測定得知在接受了本發明IHC的實驗小鼠中細胞死亡程度較低。
實施例29不溶血紅蛋白結構在活體循環系統中半衰期的估價通過外頸靜脈向麻醉的Sprague—Dawley小鼠(350—400g)插入導管。將相當於20％動物血容量的IHC等滲混懸濃注射液通過導管給藥。在0.25到92小時之間的採樣時間範圍內採血。離心血樣並且觀察血漿的溶血跡跡象或可溶血紅蛋白的出現。由於IHC中的「微泡」具有氣態的空間(並且因此比水的密度低)，它們在離心後上升到血漿的表面。濾除這些微泡，在鹽水中重新懸浮，並且用粒子計數器計數。循環系統中IHC半衰期就測定出來了。與現有技術的源於血紅蛋白的人工血漿代用品相比，發現本IHC顯示出增加了的循環半衰期。
實施例30IHC的器官保存作用—對大鼠心臟的保藏作用用外科手術摘除麻醉Sprague—Dawley鼠的心臟並利用室內空氣對其進行人工呼吸。將心臟浸入具有同IHC(或IHC/FC，或白蛋白/FC)保藏基質有相同組分而沒有血紅蛋白組分的晶體基質(「心臟麻痺基質」——CM)中。心臟用CM浸泡幾分鐘，將其冷卻到10℃。然後用140mlIHC保藏基質在12℃保藏心臟12小時。連續以低壓(18mmHg)使IHC基質通過心臟，並且以95％O2/5％CO2使其持續地平衡。保藏12小時後，通過使用離體的工作大鼠心臟檢測設備檢測心臟的收縮、舒張和功能活動實施例31利用IHC基質在心臟外科手術中進行心臟麻痺進行心肺分流術，並且在恰當的主動脈交叉關閉和開口之後，將含有IHC(或IHC/FC，或白蛋白/FC)的等滲混懸液作為氧載體，在4℃經團塊注射把500至100ml的團塊輸送到主動脈根部。向左側、右側冠狀動脈口輸送另外劑量的冷基質，在外科分流術的情況下，在最終的吻合術之前也將介質傳輸到移植物的末端。每15到20分鐘以足以保持較低的心肌溫度的量輸送該基質。完成整個操作過程後，移去主動脈夾，使心臟開始恢復溫暖。
實施例32IHC基質在血管成形術或動脈疏通術(Atherectomy)中的應用在用來恢復向器官的閉塞或灌注不足區域灌注的介入手術過程中給藥IHC(或IHC/F，或白蛋白/FC)介質。這種手術的例子有血管成形術或動脈通術。在經皮透腔狀血管成形術方法的膨脹充氣過程中通過膨脹充氣導管的中心腔以大約60ml/分鐘的速度給藥充氧的IHC基質可以緩解局部的缺血情況。以體溫的溫度將這種基質給藥，它含有例如生理相容的Ringer氏電解質和底物。在每一膨脹充氣期間注入一定劑量的氧氣平衡的IHC基質。還可以在動脈疏通術的充氣膨用戶階段使用類似的方法，該手術可用來以刀或雷射的形式物理清除血管中的障礙。在酶促溶血過程中把基質直接注入被堵塞的血管能夠在堵塞物溶解時為堵塞物提供氧。目前在一些血管成形術過程中使用Fluosol—DA，本發明的IHC(或IHC/FC，或白蛋白/FC)基質能夠取代Fluosol-DA。
實施例33合成由聚合物外殼包裹的十二氟壬烷(C9F20)必須在合成反應進行之前將一個20ml的玻璃反應槽、鈦制的發聲器、套管以及使用的全部設備用乙醇和無菌鹽水洗滌乾淨。在這一典型反應中，將3.5ml無菌5％W/v USP(美國藥典標準)人體血清白蛋白(Alpha醫療公司提供)加入到反應槽中，反應槽連接於超聲波發聲器(Heat Systems，XL2020，20KHz，最大功率400W)。然後將發聲器與槽一起浸入溫度恆定在22℃的水浴中。反應在22℃進行為最適宜條件，而產品能在更寬的溫度範圍內(0℃到約40℃)合成。溫度控制是高產量的關鍵，而最適宜溫度條件則依賴於特定的實驗條件。
接著加入6ml十二氟壬烷(C9F20)，超聲波旋鈕旋至第七擋功率處。加入的碳氟化合物的量可在小於1ml到約13ml之間變化，這時的蛋白質聚合物外殼產率良好。反應在約30秒內完成。反應時間過短和過長產量都會減少。所生產的均勻的混懸液包含由蛋白質聚合物外殼包裹的十二氟壬烷，按體積計算為大致60％體積的全氟壬烷。在4℃的無菌容器內保存這一含水混懸液。
典型的反應生產的溶液每ml含大致1×109個外殼。平均外殼直徑為2微米，標準差為1微米。觀察到這一合成過程生產出高濃度的、大小分布範圍較窄的微米大小的生物製品。
實施例34合成由聚合物外殼包裹的全氟三丁基胺(C12F27N)或全氟三丙基胺(C9F21N)將5％w/vUSP的人體血清白蛋白(3.5ml)和氟胺化合物(6ml)加入到玻璃反應槽中並用高強度的超聲波輻射，反應條件是功率定在第7檔，水浴溫度為22℃，反應時間大致在30秒。又一次合成了高濃度的由蛋白質聚合物外殼包裹的高濃度的全氟三丙基胺[(C3F7)3N]和全氟三丁基胺[(C4F9)3N](1×109個外殼/ml)，外殼平均直徑為2微米。
實施例35合成由聚合物外殼包裹的全氟萘烷(C10F18)
將5％w/vUSP的人體血清白蛋白(3.5ml)和全氟萘烷(C10F18；6ml)加入到玻璃反應槽中，並用高強度的超聲波輻射。反應條件為功率定在第七擋，水浴溫度為22℃，反應時間大致在30秒。合成了由蛋白質聚合物外殼包裹的高濃度、大小分布範圍較窄的全氟萘烷。此外，由於全氟萘烷和全氟三丙基胺都是FDA批准的碳氟化合物，Fluosol DA的主要成分，因此將這些化合物用於醫學成像很容易被管理機構所認可。
實施例36合成由聚合物外殼包裹的全氟15—冠—5(C10F20O5)將5％w/vUSP的人體血清白蛋白(3.5ml)和氟冠醚(C10F20O5；6ml)加入到玻璃反應槽中，並且用高強度的超聲波輻射。反應條件定在功率的第七擋，水浴溫度為22℃，反應時間大致在30秒。同前，合成了高濃度的由蛋白質聚合物外殼包裹的氟冠醚，其顆粒大小分布較窄。事實上這一合成由聚合物外殼包裹的碳氟化合物的實驗過程是典型的所有碳氟化合物的研究方法。
實施例37合成由聚合物外殼包裹的全氟—叔丁基丁烯(C10F18H2)
將5％w/vUSP的人體血清白蛋白(3.5ml)和C10F18H2(6ml)加入到玻璃反應槽中，並用高強度的超聲波輻射，功率定在第七擋，水浴溫度為22℃和反應時間大致在30秒。通過這一過程，能夠合成由蛋白質聚合物包裹的高濃度的全氟—叔丁基丁烯。
實施例38由聚合物外殼包裹的碳氟化合物的毒性在10分鐘內給五隻大鼠通過外插的靜脈導管注射5ml2％v/v碳氟化合物混懸液(由HSA蛋白質聚合物外殼包裹的全氟壬烷)。一般的碳氟化合物由於其牢固的氟—碳鍵而沒有毒性；的確，碳氟化合物已經被成功地用作FDA批准的人工血漿代用品(Fluosol DA)。在特定的時間收集大鼠並且解剖。除了觀察大鼠的一般性健康之外，要仔細檢查肝、脾、肺和腎。在0.5，2，8和24小時檢查時大鼠都是健康的，沒有發炎的組織或器官。90天後第五隻大鼠仍然存活，而且仍很健康。作為對照組，這一FDA批准的大鼠體內豆油的用量為半數致死量，進一步證實了碳氟化合物是無毒的和安全的。
實施例39純碳氟化合物和由聚合物外殼包裹的碳氟化合物的19F核磁共振光譜由蛋白質聚合物外殼包裹的碳氟化合物和純碳氟化合物的NMR光譜可以在Bruker500MHzNMR光譜儀上獲得。儀器調到19F，它的共振頻率為470.56NHz。用氘溶劑作為阻斷劑，並且所有光譜都以在0ppm的Freon(CCl3F)為客觀的參考標準。將全氟壬烷和CDCl3放入5mm NMR試管中。純全氟壬烷的光譜得到兩組尖峰，一組在—87ppm，第二組在—127，—128和—133ppm。
由HSA蛋白質聚合物外殼包裹的全氟壬烷混懸液在D2O中重新混懸，並且獲得了類似的NMR光譜。從20％v/v碳氟化合物混懸液得到強的信號，其峰值或共振頻率是在—81，—121，—122和—126ppm處。由聚合物外殼包裹的碳氟化合物在超聲波輻射期間沒有引起全氟壬烷化學或結構的改變。例如，對於C9F20分別觀察到兩組共振頻率一組相應的是在大約—80ppm，第二組共振頻率大致在—125ppm，與CF2基團相符合。
實施例40利用碳氟化合物的19F核磁共振光譜測定局部溫度在Bruker500MHzNMR光譜儀上測得碳氟化合物的可變溫度NMR光譜。儀器調整至19F，它的共振頻率為470.50Hz。用氘溶劑(d6—二甲基亞碸[d6—DMSO)])作為阻斷劑，並且所有光譜以在0ppm的Freon(CCl3F)為客觀的參考標準。全氟十二烷的熔點為77℃，將它與d6—MDSO一同在室溫下放入5mmNMR試管。在不同的溫度下檢測到氟的光譜，並測量其譜線寬度，將—81ppm處的譜線寬度以溫度的函數形式表述如下—81ppm(Hz)的譜線寬度溫度(℃)51.110257.08264.65 60隨著溫度上升，低溫時的寬譜開始變尖銳，這是由於全氟十二烷正處於從固態到液態的相變階段。這種變化隨著溫度變化而尖銳、迅速變化，如同純物質所測得的結果。
為了減低溶點溫度、加寬溶點溫度範圍，在全氟十二烷中加入(約2％v/v)的戊烷。如上所示，在全氟十二烷從固態向液態相變階段，低溫時的寬峰變尖銳了。全氟十二烷/戊烷混合物的譜線寬度作為溫度的函數表示如下譜線寬度(Hz)—82ppm—123.3ppm溫度(℃)21.2687.1777165.89 280.50 67216.6341.257290.77 436.15 47578.27 451.33 37577.62 525.11 27
全氟十二烷/戊烷混合物具有所要求的有較寬範圍的低熔點。使用這一系統，可在27℃至77℃範圍內進行溫度測定。因此，只要給出一個譜線寬度值，就能測定當時的溫度。
舉例來說，利用這種技術測量活體的局部溫度，包括注射含有碳氟化合物混合物(如上所述)的蛋白質外殼，該混合物的寬的熔化相變過程具有溫度——譜線寬度的相互關係(能從實驗中獲得)。這種製劑除了可以作為19FMRI的對比劑之外，它可以作用於肝臟和脾臟，因此同時可用測定器官內的局部變化溫度(以闡明組織內明顯異常的病理狀態)。
實施例4119F核磁共振模型圖象將兩種類型的聚合物外殼包裹的碳氟化合物用於這種模擬成像的研究。按照如實施例33和34所述合成由HSA蛋白質聚合物外殼包裹的全氟壬烷和全氟三丁基胺。用鹽水稀釋合成的每個體積含60％碳氟化合物的混懸液，然後取2ml放入聚苯乙烯試管。將這些聚苯乙烯管放入商業上可得到的在1.5特斯拉下工作的Siemens 2T MRI儀器(10cm19F線圈)。在5分鐘時間內以10毫秒的回聲時間(TE)和300秒的重複時間(TR)(256×256矩陣)獲得試管的19F核磁共振圖象。
聚合物外殼包裹的全氟壬烷稀釋[濃度]，M成象清晰度
1 1.8 極佳1/2 0.9 極佳1/4 0.45 較好1/10 0.18 較好1/50 0.09 較好1/100 0.02 勉強良好的MR模擬成象甚至在低濃度的由聚合物外殼包裹的全氟壬烷情況下就可觀測到。也可以在由聚合物外殼包裹的全氟三丁基胺中觀測到非常接近的數值。僅在高稀釋度(1/100；0.02M)時成象質量和解析度較差。
實施例42離體肝脾的19F核磁共振成象向300g大鼠體內注射2ml 20％v/v由HSA蛋白質聚合物外殼包裹的全氟壬烷混懸液。分別在2小時後和5天後處死大鼠，摘除肝、脾、腎和肺。例如，將整個兒肝臟立即放入一個4特斯拉的MRI儀器，使用一隻10cm的19F線圈工作。使用T1加權序列且TR＝1秒，TE＝20毫秒，數據矩陣為256×128(即，128個相編碼步驟，16個信號平均值)獲得肝、脾和腎的19F磁共振圖像。
肝臟的19F MRI圖象表現出與肝臟吸收聚合物外殼的可變度有關的局部可變強度。例如，可以觀察到與門靜脈相應的暗區，在該區域看不到聚合物外殼包裹的全氟壬烷出現，因為多數殼體都集中在肝的RES細胞內。
在注射兩小時後掃描的肝臟平均成象強度大約比注射五天後掃描記錄的成象強度高20—30％。這表明可能由於聚合物外殼的破裂而使部分全氟壬烷彌散了。總之，獲得了表現肝臟形態的高質量的成象。表明這一技術在診斷以及定位肝臟內部異常病理改變方面的可行性。
實施例43體內肝、脾的19F核磁共振成象在10分鐘內給150g的大鼠注射2ml 20％v/v由HSA聚合物外殼包裹的全氟壬烷(c9F20)。然後將大鼠置於4特斯拉MRI儀器內，使用10cm19F線圈工作。在收集圖象前用氯胺酮麻醉大鼠。用T1加權序列和TR＝1秒，TE＝20毫秒，以及數據距陣256×128(即128個相編碼步驟，16個信號平均數)來獲得整個大鼠和單個器官如肝、脾和腎的19F磁共振圖像。
分別在注射由HSA蛋白質聚合物外殼包裹的全氟壬烷15分鐘，2小時和24小時後使大鼠成象。總之，獲得了表現肝和脾形態的高質量成象，表明了這一技術在診斷以及定位含肝臟RES的器官內異常病理改變可行性。
實施例44利用體內19F核磁共振成象測定局部溫度在10分鐘內給300g.的大鼠注射5ml20％v/v由HSA聚合物外殼包裹的全氟壬烷/2％戊烷(或全氟十九酸和1％膽固醇)。然後將該鼠放入1Scm線圈內(Siemens 1.5特斯拉MRI磁共振機)。以TE為10毫秒和TR為300秒來收集成象(256×256矩陣)。在採集數據前用氯胺酮麻醉大鼠。在15分鐘時間內以5毫米的片厚使肝、脾成象。用加熱墊包住溫和的大鼠，分別在室溫和約37℃時採集數據。
實施例45利用19F核磁共振成象進行體內氧測定在10分鐘內給300g的大鼠注射5ml 20％v/v由HSA聚合物外殼包裹的全氟壬烷。然後將大鼠放入16cm線圈中(Sienens 1.5特斯拉MRI磁共振機)。以TE為70毫秒和TR為3秒來採集成象(256×256矩陣)。在採集數據前將大鼠放入一可控制裝置中。首先將大鼠放入氧氣室以增加氧氣的新陳代謝，然後收集譜線寬度和成象。下一步給大鼠注射氯胺酮以減少氧氣的消耗量，並再一次收集譜線寬度和成象，觀察到譜線寬度和成象強度發生改變，這與大鼠體內溶解氧的含量一致。在較高的氧濃度下測到最大的譜線寬度。用5毫米厚的片使肝脾在15分鐘後成象。用加熱墊包住麻醉鼠，分別在室溫和37℃時採集到兩組數據。
實施例46製備紫杉醇顆粒用球磨機研磨紫杉醇晶體(Sigma Chemical)直到獲得低於10微米粒度的紫杉醇固體顆粒。將顆粒懸浮於等滲鹽水中，並藉助粒子計數器(Elzone，Particle Data)計數來測定其顆粒大小。繼續研磨直到顆粒的粒度100％均低於5微米。用於靜脈輸液的優選粒度是低於5微米，最理想的是低於1微米。
另外還可通過在水中對紫杉醇混懸液進行聲處理直到所有顆粒粒度低於10微米而獲得紫杉醇顆粒。
通過向紫杉醇乙醇溶液中加水直至得到混濁液而使紫杉醇從其乙醇液中沉澱出來，也能獲得低於10微米的紫杉醇顆粒，也可以在加水過程中對紫杉醇溶液進行聲處理，直到獲得混濁液。對最終的混合液進行過濾和乾燥，就獲得了理想粒度的純紫杉醇顆粒。
通過對溶於揮發性有機溶劑如乙醇的紫杉醇溶液進行噴霧乾燥可製備優質的紫杉醇顆粒。使溶液流過超聲噴嘴形成含乙醇的紫杉醇液滴。隨著乙醇在噴霧乾燥器中蒸發，得到優質紫杉醇顆粒。可通過改變紫杉醇乙醇液的濃度、調節流過噴嘴的液體流速和聲處理強度而改變粒度。
實施例47合成附著於聚陰離子的順磁性陽離子舉例來說，經過把藻酸鹽分散到二氯化釓(GdCl3)溶液中，可實現藻酸釓的合成，例如，可以通過對含釓離子(如，GdCl3)的溶液進行超聲波輻射和加入少量藻酸鈉溶液來合成適於細胞內注射的小球型藻酸釓。將藻酸鹽分散到釓離子溶液中，經超聲波輻射和多價釓離子的交聯。產生微米粒度的藻酸釓顆粒。除了使用超聲波輻射以外，也能應用低或高速混合法。
或者，將藻酸鈉溶液覆蓋在不相混溶的有機溶劑或油(例如豆油、葵花油、甲苯，二氯甲烷，氯仿以及類似物)上或被其覆蓋，使液體接受超聲波輻射，並由此使含藻酸鹽水相分散到有機相中，然後加入多價離子溶液(例如GdCl3，Mn-Cl3，FeCl3以及類似物)。因此藻酸鈉被交聯，產生出適合於在血管內注射後作MRI對比劑使用的極小的藻酸釓球型粒子。可使用任何基本的合成技術用藻酸鹽和多價陽離子用來製造球體，纖維，平片等等。
本發明以其特定優選的實施例進行了具體介紹，應當指出，任何修改和變化都在所描述的和權利要求的範圍之內。
權利要求
1.一種用於體內傳送生物製品的組合物，其中所述的生物製品選自一種固體，任意分散於一種生物相容分散劑中，它基本上完全被包裹在一種聚合物外殼中，一種液體，任意分散於一種生物相容分散劑中，它基本上完全被包裹在聚合物外殼中，一種氣體，任意分散於一種生物相容分散劑中，它基本上完全被包裹在聚合物外殼中，一種與聚合物外殼結合的氣體，或它們任何兩種或多種的組合，其中所述外殼的最大截面直徑不大於約10微米，其中所述的聚合物外殼含有一種基本上是通過二硫鍵方式交聯的生物相容材料，和其中所述的聚合物外殼任意被某合適的試劑修飾，其中所述的試劑任意與所述的聚合物外殼通過一種任意地共價健相連。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述的聚合物外殼，包括與之相結合的固體、液體或氣體，適合用作血液代用品。
3.根據權利要求1的組合物，其中所述的生物製品是選自藥物活性試劑、診斷試劑或營養試劑。
4.根據權利要求3的組合物，其中所述的藥物活性試劑是選自止痛劑，麻醉劑，抗喘劑，抗生素、抗抑制劑、抗糖尿病藥，抗真菌劑、抗高血壓藥、抗炎劑、抗腫瘤劑、抗焦慮劑、酶活化劑、核酸結構，免疫刺激劑，免疫抑制劑，生理活性氣體或疫苗。
5.根據權利要求4的組合物，其中所述的藥物活性試劑是核酸結構。
6.根據權利要求3的組合物，其中所述的診斷試劑選自超聲對比劑，放射對比劑，或磁對比劑。
7.根據權利要求6的組合物，其中所述的磁對比劑是一種含氟的磁共振成像劑。
8.根據權利要求7的組合物，其中所述的含氟的磁共振成像劑選自(a)CxF2x＋Y－zAz，其中X＝1－30，Y＝2；或當x≥2時是0或-2；或當x≥4時是-4，Z＝0至(2x＋Y－1)的任何整數，和A是選自氫，除氟外的滷素，-CN，-OR，其中R是氫，烷基，氟烷基，鏈烯基，氟鏈烯基，炔基，氟炔基，芳基，氟芳基，鏈烷醇基(alkanoyl)，氟鏈烷醇基(fluoroalkanoyl)，鏈烯醇基(alkenoyl)，氟鏈烯醇基(fluoroalkenoyl)，炔醇基(alkynoyl)，氟鏈炔醇基(fluoroalkynoyl)，(b)[CxF2x＋Y′－zAz]aJRb－a，其中X，Z，A和R如上所定義，Y′＝＋1；或當X≥2時是-1或-3；或當X≥4是-5，J＝O，S，N，P，A1或Si，a＝1，2，3，或4和b＝對2價的J是2，或對3價的J是3，或對4價的J是4，(c)A′－[(CF2)x－O]C-A″，其中x如上所定義，A′是選自氫，滷素，-CN，-OR，其中R是H，烷基，氟烷基，鏈烯基，氟鏈烯基，炔基，氟炔基，芳基，氟芳基，鏈烷醇基，氟鏈烷醇基，鏈烯醇基，氟鏈烯醇基，炔醇基，氟鏈炔醇基，A″是選自H或R，其中R同上所定義，C＝1－300，或 其中X是同上定義，和c′＝2－20，以及它們任何兩者或更多的混合物。
9.根據權利要求7的組合物，其中所述的診斷試劑能夠由於局部氧濃度的改變而發生松馳率的改變。
10.根據權利要求7的組合物，其中所述的診斷試劑能夠在大約22至55℃的溫度範圍內發生由固體向液體的相變。
11.根據權利要求3的組合物，其中所述的營養劑是選自胺基酸，蛋白質，核酸，糖，碳水化合物，脂溶性維生素，脂類，或它們任何兩者或更多的組合。
12.根據權利要求3的組合物，其中所述的在所述外殼內的藥物活性試劑溶解於或懸浮於一種生物相容分散劑中。
13.根據權利要求12的組合物，其中所述的生物相容分散劑是選自豆油，椰子油，橄欖油，紅花油，棉籽油，具有4—30個碳原子的脂肪族、環脂族或芳香族的烴，具有2—30個碳原子的脂族或芳族的醇，具有2—30個碳原子的脂族或芳族的酯，具有2—30個碳原子的烷基、芳基或環醚，具有1—30個碳原子並且還可以有一個以上滷素取代基的烷基或芳基滷化物，具有3—30個碳原子的酮，聚二醇，或它們任意兩者或更多的組合。
14.根據權利要求3的組合物，其中所述的藥物活性試劑是完整地包裹在所述外殼之內。
15.根據權利要求1組合物，其中所述的交聯聚合物是一種天然存在的聚合物，一種合成聚合物，或它們的組合，其中所述的聚合物，在交聯之前，已共價連接上了巰基或二硫鍵。
16.根據權利要求15的組合物，其中所述的天然存在的聚合物是選自含有巰基和/或二硫基的蛋白質，含有巰基和/或二硫基的多肽，含有巰基如/或二硫基的脂，含有巰基和/或二硫基的多聚核酸，或含有巰基和/或二硫基的多糖。
17.根據權利要求16的組合物，其中所述的蛋白質是選自血紅蛋白、肌紅蛋白、白蛋白，胰島素，溶菌酶，免疫球蛋白，α—2—巨球蛋白，纖維壞死蛋白(fibronectin)，玻璃體壞死蛋白(Vitronectin)，纖維蛋白原，或它們任意兩者或更多的組合。
18.根據權利要求17的組合物，其中所述的蛋白質是白蛋白。
19.根據權利要求17的組合物，其中所述的蛋白質是血紅蛋白。
20.根據權利要求17的組合物，其中所述的蛋白是白蛋白與血紅蛋白的組合物。
21.根據權利要求16的組合物，其中所述的多糖是選自藻酸酯(鹽)、高M—含量的藻酸酯(鹽)、多聚甘露糖醛酸、多聚甘露糖醛酸鹽，透明質酸，透明質酸鹽，肝素，葡聚糖，脫乙醯殼多糖，幾丁質，纖維素，澱粉，糖原，瓜耳膠，刺槐豆膠，葡聚糖，果聚糖，旋復花粉，環葡聚糖，瓊脂糖，黃原膠，carageenan，肝素，果膠，gellan膠，硬葡聚糖，或它們任意兩者或更多組合。
22.根據權利要求15的組合物，其中所述的合成聚合物是選自合成的含有半胱氨酸殘基和/或二硫基的多(聚)胺基酸，含有巰基和/或二硫基的合成多肽，含有游離巰基和/或二硫基的改性的聚乙烯醇，經改性含有游離巰基和/或二硫基的聚羥乙基異丁烯酸酯，經改性含有游離巰基和/或二硫基的聚丙烯酸，經改性含有游離巰基和/或二硫基的聚乙基惡唑啉，經改性含有游離巰基和/或二硫基的聚乙烯吡咯烷酮，經改性含有游離巰基和/或二硫基的聚丙烯醯胺，經改性含有游離巰基和/或二硫基的聚二醇，以及它們任意兩者或多者的混合物。
23.根據權利要求1的組合物，其中所述的氣體是選自空氣、氧氣、氬氣、氮氣、一氧化碳、二氧化碳、氦、氙、一氧化二氮、一氧化一氮、或它們任意二者或多個的組合。
24.根據權利要求1的組合物，其中交聯聚合物上的二硫鍵是由超聲輻射形成的。
25.根據權利要求1的組合物，其中所述的含有生物製品的聚合物外殼是懸浮在一種生物相容介質中，並且其中所述的生物相容介質是選自水，緩衝水溶液介質，鹽水，緩中的鹽水，胺基酸溶液，蛋白質溶液，糖溶液，維生素溶液，碳水化合物溶液，合成的聚合物溶液，含有脂類的乳化液，或它們任意兩者或多個的組合。
26.根據權利要求1的組合物，其中所述的聚合物外殼是被一種合適的試劑改性的，其中所述的合適的試劑是選自合成的聚合物，磷脂，蛋白質，多糖，表面活性劑，化學改性劑，或它們的組合，其中所述的試劑與所述的聚合物外殼通過任意的共價鍵相結合。
27.一種製備用於體內傳送的生物製品的方法，所述方法包括將含有能夠被二硫鍵交聯的生物相容材料的水介質與生物製品經過高強度超聲條件處理一段時間，足以促使所述生物適其中所述試劑基本上被完全包裹在聚合物外殼中，並且其中所述外殼的最大截面直徑不超過10微米。
28.一種向患者體內傳送生物製品的方法，所述方法包括給患者使用有效量的權利要求1的組合物。
29.一種給患者輸送血液代用品的方法，所述方法包括給所述患者使用有效量的權利要求2的組合物。
30.一種給患者傳送生物製品的方法，所述方法包括給所述患者使用有效量的權利要求25的組合物。
31.一種獲得體內磁共振影像的方法，它是通過給患者使用權利要求8所述組合物而獲得的。
32.一種用於體內傳送紫杉醇的組合物，其中紫杉醇是懸浮於一種生物相容液體中，並且其中所得到的混懸液含有截面直徑不超過約10微米的紫杉醇顆粒。
33.一種製備用於體內傳送的紫杉醇的方法，所述方法包括將紫杉醇和合適的介質經過超聲輻射或研磨處理一段時間，以足以產生具有最大直徑不超過約10微米的顆粒。
34.一種含有與多陰離子結合的順磁陽離子的組合物。
35.一種向患者傳送可用作MRI對比劑的順磁陽離子的方法，所述方法包括給所述患者使用有效量的權利要求34的組合物。
全文摘要
本發明提供了用於體內傳送生物製品的組合物，其中生物製品與由生物相容材料製備的聚合物外殼相結合。該生物製品可以與聚合物外殼本身相結合，和/或生物製品選擇性地懸浮/分散於生物相容的分散劑中，被聚合物外殼所包裹。另一方面，把與聚合物外殼相結合的生物製品給某主體給藥，可以是分散在一種合適的生物相容液體中給藥。
文檔編號A61K9/00GK1118136SQ94191236
公開日1996年3月6日 申請日期1994年2月22日 優先權日1993年2月22日
發明者馬克·W·格瑞恩斯達夫, 派屈克·樹恩雄, 麥可·王, 保羅·A·桑福德, 肯尼思·S·沙斯利克, 內爾·P·迪塞 申請人:維沃Rx藥物公司