用於多重擴增短串聯重複基因座的方法和試劑盒的製作方法

2023-04-22 18:01:36

用於多重擴增短串聯重複基因座的方法和試劑盒的製作方法
【專利摘要】公開了用於在單個多重反應中同時擴增基因組DNA的至少11個特定STR基因座的方法和材料，還公開了用於分析該反應產物的方法和材料。本發明包含了用於在單個多重反應中同時擴增16個特定基因座的方法和材料，包含10個AmpFISTR?SGMplus?STR基因座、Amelogenin基因座、以及5個新STR基因座，包括用於分析這些基因座的方法和材料。
【專利說明】用於多重擴增短串聯重複基因座的方法和試劑盒
[0001]本申請是國際申請日為2008年10月30日、國際申請號為PCT / US2008 /081861、進入國家階段的申請號為200880122932.6、發明名稱為「用於多重擴增短串聯重複基因座的方法和試劑盒」的PCT申請的分案申請。
[0002]與相關申請的交叉引用
[0003]本申請要求根據35U.S.C.§ 119(e)的來自2008年10月30日提交的美國專利申請號60 / 983,737的優先權權益，所述申請在此通過引用併入本文。
[0004]介紹
[0005]本發明的教導一般地涉及基因組系統中遺傳標記的檢測。在各實施方案中，在多重反應中同時擴增多個不同的多態性遺傳基因座，以確定每個基因座的等位基因。所分析的多態性遺傳基因座可以是短串聯重複(STR)基因座，其還可包括產生約200個鹼基對或更少的擴增子的微-STR。
[0006]附圖簡述
[0007]本領域技術人員將理解以下描述的附圖僅用於解釋的目的。該附圖不意圖以任何方式限制本發明教導的範圍。
[0008]圖1是顯示了通過多重擴增15個STR基因座(10個SGMohlS?基因座加上5個
新基因座)和Amelogenin性別決定基因座(Amel)所產生的擴增子的相對大小範圍(以鹼基對為單位)的圖，如實施例中所述。
[0009]圖2是從5-色螢光檢測同時擴增SGMplllS?; STR基因座VWA (vWA)，D16S539(D16)，D2S1338, D8S1179(D8), D21S11(D21), D18S51(D18), D19S433(D19)，THOI,FGA, D3S1358(D3)、性別決定基因座Amelogenin (Amel)以及5個新STR基因座(圈出了)D10S1248 (DlO)，D22S1045(D22)，D2S441, D1S1656(D1)和 D12S391 (D12)的產物所產生的
圖。從人類基因組DNA樣品擴增基因座，並且用ABI PRISM? 3130x1遺傳分析儀進行檢
測，如實施例中所述。從上至下的四個圖相應於6-FAM? VIC?、NED?和PET?染料標記
的峰(第5種染料LIZ?用於標記大小標準品，並且未顯示)。每ー圖的X軸測量了擴增產物的以鹼基對為單位的大小。
[0010]圖3是如在實施例中所使用的5種螢光染料(6-FAM?、VIC?、NED?、PET?和
LIZ?)加上能用於6染料多重反應中的額外的第六種染料(SID)的發射譜圖(波長的單位為 nm)。
[0011]各實施方案描述
[0012]在本說明書中所使用的多數詞語具有本領域技術人員所理解的這些詞的含義。在本說明書中明確定義的詞語具有在本教導上下文中作為整體所提供的、並且如本領域技術人員所一般理解的含義。在詞語或短語的本領域所理解的定義與該詞語或短語的在本說明書中明確教導的定義有矛盾吋 ，以說明書為準。本文所使用的標題僅僅為了方便，並且不理解為以任何方式限制。[0013]如本文所使用的「 DNA」指如本領域所理解的以其各種形式的脫氧核糖核酸，諸如基因組DNA、cDNA、分離的核酸分子、載體DNA以及染色體DNA。「核酸」是指任何形式的DNA或RNA (核糖核酸)。如本文所使用的術語「分離的核酸分子」是指已從其自然環境中移去的核酸分子(DNA或RNA)。分尚的核酸分子的一些實例是在載體中含有的重組DNA分子、維持在異源宿主細胞中的重組DNA分子、部分或基本上純化的核酸分子以及合成的DNA分子。「分離的」核酸可以沒有這樣的序列，即所述序列在該核酸衍生自其中的生物體的基因組DNA中天然地位於該核酸的側翼(即，位於該核酸5』和3』端的序列)。此外，當通過重組技術產生吋，「分離的」核酸分子(諸如cDNA分子)可以基本上沒有其它細胞材料或培養基，或當化學合成時其基本上沒有化學前體或其它化學物質。
[0014]「短串聯重複」或「STR」基因座指含有短、重複序列元件的基因組DNA區域。所述重複的序列元件不限於但一般地為3至7個鹼基對長度。每ー序列元件在STR中至少重複一次，並且在本文中稱為「重複單位」。術語STR還包括這樣的基因組DNA區域，即其中超過一個重複單位串聯地或具有中間鹼基地重複，條件是至少ー個序列串聯地重複至少兩次。
[0015]「多態性短串聯重複基因座」指這樣的STR基因座，其中在基因組DNA特定區域的重複序列元件數目(以及序列淨長度)在等位基因間、以及在個體與個體之間不同。
[0016]如本文所使用的「等位基因梯」是指由擴增的來自基因座的等位基因組成的標準大小標記物。「等位基因」是指與DNA區段相關的遺傳變異，即佔據相同基因座的DNA序列的兩個或多個備選形式之一。
[0017]「生物化學命名法」是指如在本文所使用的標準生物化學命名法，其中核苷酸鹼基命名為腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)。相應的核苷酸例如為脫氧鳥苷-5』 -三磷酸(dGTP)。
[0018]「DNA多態性」是指其中DNA序列中的兩種或更多種不同核苷酸序列共存於同一雜種繁殖的群體中的情況。
[0019]「基因座」或「遺傳基因座」是指染色體上的特定物理位置。基因座的等位基因位於同源染色體上的相同位置。
[0020]「基因座特異性引物」是指與所指明的基因座的部分或其互補鏈特異性雜交的引物，其至少用於該基因座的ー個等位基因，並且在用於該擴增方法的條件下不與其它DNA序列有效地雜交。
[0021]「聚合酶鏈式反應」或「PCR」是指其中使用變性、與引物退火、以及用DNA聚合酶延伸的重複循環來約106倍或更多地擴增靶DNA序列拷貝數的技術。用於擴增核酸的PCR方法由美國專利號4，683，195和4，683，202所覆蓋，其在此通過引用將其全文地併入本文，用於描述該方法。用於任意PCR的反應條件包括反應的化學成分以及它們的濃度、在反應循環中使用的溫度、反應的循環數以及反應循環階段的持續時間。
[0022]本文所使用的「擴増」是指用酶增加特定核苷酸序列量的方法。這ー擴增不限於但一般通過PCR完成。如本文所使用的，「變性」是指將兩條互補核苷酸鏈從退火狀態分開。可通過許多因素，諸如例如破壞鹼基配對相互作用的緩衝液的離子強度、溫度或化學物質來誘導變性。如本文所使用的，「退火」是指核苷酸鏈之間的特定相互作用，其中所述鏈基本上基於如通過Watson-Crick鹼基配對所確定的鏈之間的互補性彼此結合。對於發生退火，不需要100%的互補性。如本文所使用的，「延伸」是指在引物寡核苷酸與靶核酸退火之後的擴增循環，其中聚合酶應用靶核酸作為複製模板實現引物延伸為適當大小的片段。
[0023]「引物」是指單鏈寡核苷酸或DNA片段，其與基因座的DNA鏈以此種方式雜交從而使得該引物的3』端可作為應用DNA聚合酶聚合併延伸的位點。「引物對」是指兩條引物，其包含在待擴增的DNA序列的一端與單鏈雜交的引物I，以及與該待擴增的DNA序列的互補鏈的另一端雜交的引物2。「引物位點」是指引物與之雜交的靶DNA的區域。
[0024]「遺傳標記」一般是具有用於分析(諸如DNA分型)的目的性狀的基因組DNA等位基因，其中個體基於它們DNA中的變異而區別。多數DNA分型方法被設計以檢測和分析群體中已知以至少兩種不同形式或等位基因出現的ー個或更多個DNA標記區域的長度和/或序列差異。此類變異稱為「多態性」，並且其中發生了此類變異的DNA的任何區域稱為「多態性基因座」。進行DNA分型的ー種可能方法包括結合PCR擴增技術(KB Mullis，美國專利號4，683，202)和長度變異多態性的分析。傳統上PCR僅能可靠地用於擴增相對小的DNA片段，即僅能擴增3000個鹼基長度以下的DNA片段(M.Ponce和L.Micol (1992)，NAR20 (3):623 ;R.Decorte 等(1990)，DNA CELL BIOL.9(6):461469)。短串聯重複(STR)、微衛星和可變數目串聯重複(VNTR)是長度變異多態性的ー些實例。含有微衛星或VNTR的DNA片段通常太長而不能通過PCR可靠地擴増。相反，含有約3至7個核苷酸的重複單位的STR足夠短以在PCR應用中用作遺傳標記，因為可以設計擴增方案以產生比可能來自DNA的其它可變長度區域更小的產物。
[0025]通常期望在單個擴增反應和分離的過程中同時擴增並檢測多個基因座。此類同時靶向若干個用於分析的基因座的系統稱為「多重」系統。已描述了含有多個STR基因
座的若干種此類系統。例如參見AMPFLS丁R? SGMPLUS? PCR擴增試劑盒用戶手冊，
AppliedBiosystems, H トx 和トI 至ト 16 頁(2001) ； AMPFLSTR? IDENTIFIER?PCR擴增試劑盒用戶手冊',Applied Biosystems,第 i_x和 1-1 至 1-10頁(2001) ；Jff Schumm等，美國專利號7，008，771。
`[0026]若干個國家的政府保持了 DNA分型信息資料庫。聯合王國的國家DNA資料庫(NDNAD)是最大的此類資料庫，具有約270萬人的DNA概況。H.Wallace (2006)，EMBOREP0RTS7:S26-S30 (引自內政部，2006)。從1999年開始，NDNAD中的DNA概況已基於
Applied Biosystems 開發的SGMplus?系統，同上。在DNA概況分析系統中重複發生的
問題是當他們的DNA樣品降解時如何鑑定個體。在歐洲和美國的實驗室中已進行了許多研究，以比較常規STR(擴增子大小為約100至約450個鹼基對的範圍)和微-STR(約200個鹼基對或更少的擴增子)作為分析降解的DNA樣品的遺傳標記。例如參見LA Dixon等(2006), FORENSIC Sc1.1NT.164(1):33_44。結果表明用更小尺寸的擴增子改善了從分析降解的DNA樣品獲得成功結果的機會，諸如從微-STR基因座獲得。同上，MD Coble和JMButler (2005), J.FORENSIC Sc1.50(1):43_53。歐洲法庭科學研究所網(The EuropeanNetwork of Forensic Science Institutes (ENFSI))和歐洲 DNA 概況分析(EDNAP)組贊同應當重新設計用於DNA分型的多重PCR系統以能夠進行小擴增子檢測，並且歐洲內部的概況分析系統標準化應當考慮微-STR。P.Gill等(2006)，FORENSIC SC1.1NT.156(2-3):242-244。本發明的教導涉及在單個反應中同時分析多個長度變異多態性。本發明教導的各個實施方案將微-STR基因座併入了多重擴增系統中。這些系統可用於各種應用，包括它們在DNA分型中的應用。
[0027]本發明教導的方法考慮了選擇合適的基因座集、引物和擴增方案，以從多個共-擴增基因座產生擴增的等位基因(擴增子)，所述擴增子可被設計以便在大小上不重疊，和/或可被用此種方式標記以使得可區別來自不同基因座的在大小上重疊的等位基因。此外，這些方法還考慮了選擇多個STR基因座，其與使用單擴增方案的應用是兼容的。本文描述的基因座的特定組合在這ー應用中是獨特的。在本發明教導的各個實施方案中，教導了共擴增15個STR基因座，其包含至少8個具有少於約200個鹼基對的最大擴增子大小的微-STR基因座。
[0028]除了本文描述的那些之外的成功組合例如可通過基因座組合的試驗和誤差、通過選擇引物對序列、以及通過調整引物濃度以鑑定其中所有用於分析的基因座均可被擴增的平衡來產生。一旦公開了這些教導的方法和材料，則選擇用於這些教導的方法和試劑盒中的基因座、引物對和擴增技術的各種方法也類似地暗示給了本領域技術人員。預期所有的此類方法均在所附權利要求的範圍之內。
[0029]本發明教導的方法的實施可從選擇包含D16S539，D18S51，D19S433，D21S11，D2S1338, D3S1358, D8S1179, FGA, THOI, VffA,以及 D10S1248, D12S391, D1S1656, D22S1045,和D2S441中至少之ー的至少11個STR基因座的集開始，所有的基因座均可在單個多重擴增反應中共擴增。除了這些15個列出的基因座之外的或附加的其它基因座也可以包含在該多重擴增反應當中。選擇基因座和用於在本發明教導的多重擴增反應中擴增該基因座的寡核苷酸引物的可能方法描述於本文並在以下實施例中闡述。
[0030]可使用許多不同技術的任一個來選擇用於本發明教導的基因座集。開發用於這一分析方法的有用基因座集的一個技術描述於以下實例中。一旦開發了含有該至少11個STR基因座的多重技術，則其可用作核心以產生含有超過這些11個基因座、以及含有除STR基因座之外基因座(例如，性別決定基因座)的多重技木。因此可產生包含該最先的11個STR基因座的超過11個基因座的新組合。
[0031]不管應用何種方法選擇通過本發明教導的方法進行分析的基因座，所選擇的用於各實施方案中多重分析的基因座共有以下特徵的ー個或更多個:(I)它們產生足夠的擴增產物以允許進行DNA的等位基因評估；(2)在多重擴增步驟期間，它們產生很少的(如果有的話)由於在有效靶基因座的延伸期間摻入其它的鹼基或產生非特異性擴增子而產生的假象；以及(3)它們產生很少的(如果有的話)由於通過聚合酶的擴增反應的過早終止而產生的假象。例如，參見 JW Schumm等(1993) ,FOURTH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON HUMANIDENTIFICATION，第 177-187 頁，Promega Corp0
[0032]如本文所使用的用於特定STR基因座的術語是指本領域公知的對這些基因座的命名。例如，在以下列表中的各種參考文獻中以及通過不同的登錄號識別基因座，其在此通過引用全文併入本文。以下的參考文獻列表僅僅意圖是例示基因座信息的來源。關於包含這些基因座並預期用於靶擴增的DNA區域的信息是公眾可獲得的，並且通過查詢以下或其它參考文獻和/或登錄號而很容易地獲得。在合適的情況下，呈現了提交時的當前登錄號，如通過 GenBank? (National Centerfor Biotechnology Information, Bethesda,
MD)所提供的那樣。例如，對於基因座D3S1358，參見H.Li等(1993)，HUM.M0L.GENET.2:1327 ;對於 D12S391,參見 MV Lareu 等(1996)，GENE182:151-153 ;對於 D18S51,參見 REStaub 等(1993)，GENOMI CS 15:48-56 ;對於 D21S11，參見 V.Sharma 和 M.Litt (1992)，Hum.MOL.GENET.1:67 ；對於 FGA(FIBRA)，參見 KA Mills 等(1992)，HUM.MOL.GENET.1:779 ；對於 THOl，參見 A.Edwards (1991)，AM.J.HUM.GENET.49:746-756 和 MH Polymeropoulos等(1991)，NUCLEIC ACIDS RES.19:3753 ；對於 VWA(vWF)，參見 CP Kimpton 等(1992)，HUM.MOL.GENET.1:287 ;對於 D10S1248,參見 MD Coble 和 JM Butler (2005)，J.FORENSICSC1.50(1):43-53 ;對於 D16S539，參見 J.Murray 等(1995)，未出版的，Cooperative HumanLinkage Center,登錄號 G07925 ；對於 D2S1338，參見 J.Murray 等(1995)，未出版的，Cooperative Human Linkage Center,登錄號 G08202 和 Watson 等 PROGRESS IN FORENSICGENETICS7 PROCEEDINGS OF THE17?INT』 L ISFH⑶NGRESS， OSLO，1997 年 9 月 2-6，B.0laisen 等，編輯，第 192-194 頁(Elsevier, Amsterdam);對於 D8S1179,參見 J.Murray等(1995),未出版的，Cooperative Human Linkage Center,登錄號 G08710,以及NJOldroyd等(1995)，ELECTROPHORESIS 16:334-337 ;對於 D22S1045,參見 J.Murray 等(1995)，未出版的，Cooperative Human Linkage Center,登錄號 G08085 ;對於 D19S433,參見 J.Murray等(1995),未出版的，Cooperative Human Linkage Center,登錄號 G08036,以及 MVLareu等(1997)，PROGRESS IN FORENSIC GENETICS7 PROCEEDINGS OF THE17TH INT』 L ISFHCONGRESS,OSLO, 1997 年 9 月 2_6，B.0laisen 等編輯，第 192-200 頁，Elsevier，Amsterdam ；對於 D2S441,參見 J.Murray 等(1995),未出版的，Cooperative Human Linkage Center,登錄號 G08184 ;對於 D1S1656,參見 J.Murray 等(1995),未出版的，Cooperative HumanLinkage Center,登錄號 G07820。
[0033]微-STR(少於約200鹼基對的基因座)擴增允許對高度降解的DNA進行概況分析，如在MD Coble (2005), J.FORENSIC SC1.50(1):43-53中所證實的那樣，其在此通過引用併入本文。圖1顯示了對於所有15個上述基因座加上用於確定大小的Amelogenin基因座的基因座大小範圍。如可在圖1中看到的那樣，在前述列表中鑑定的8個基因座包括此類微-STR 基因座:D10S1248,VWA, D8S1179, D22S1045, D19S433, D2S441, D3S1358 和 D1S1656。
[0034]選擇用於根據這些教導的共擴增和分析的基因座集可以除了該至少11個STR基因座外還包含至少ー個基因座。附加的基因座可以包含STR或其它序列多態性，或任意其它特徵，例如，其鑑定了將ー個個體的DNA與該群體中其它個體的DNA分開的特性。附加基因座還可以是鑑別所分析的DNA樣品來源性別的基因座。當DNA樣品是人類基因組DNA時，可以選擇諸如Amelogenin基因座的性別鑑定基因座用於根據本發明方法的共擴增和分析。Amelogenin基因座被GenBank鑑定為HUMAMELY(當用於鑑定男性DNA中存在的Y染色體中的基因座時)，或鑑定為HUMAMELX (當用於鑑定男性或女性DNA中存在的X染色體中的基因座吋)。
[0035]一旦鑑定了用於在單個多重反應中共擴增的基因座集，則可確定適於共擴增該集中每一基因座的引物。可將寡核苷酸引物添加到反應混合物中並用來界定擴增的DNA片段5』和3』端。一個寡核苷酸引物退火至變性模板DNA的有義(+)鏈,並且另ー寡核苷酸引物退火至該變性模板DNA的反義(-)鏈。寡核苷酸引物一般可為約12-25個核苷酸長，但是它們的大小可取決於諸如以下的參數而很大不同，例如待擴增模板序列的鹼基組成、擴增反應條件等。引物的具體長度對於這些教導的操作不是關鍵的。可以設計寡核苷酸引物以退火至目的基因座側翼的DNA的特定部分，以便特異性地擴增引物互補位點之間的DNA部分。
[0036]寡核苷酸引物可包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶，以及尿嘧啶、核苷類似物(例如，但不限於次黃嘌呤核苷、鎖定核酸(LNA)、非核苷酸連接子、肽核酸(PNA)和phosporamidites)以及含有或與化學部分綴合的核苷,其中所述化學部分諸如放射性核素(例如，32P和35S)、螢光分子、小溝結合物(MGB)、或本領域公知的任何其它核苷綴合物。
[0037]—般地，可化學合成寡核苷酸引物。在PCR優化中引物設計和選擇是常規步驟。本領域普通技術人員可容易地設計用於擴增目的靶基因座的特異引物，或從本文列出的參考文獻中獲得引物集。所有的這些引物都在本發明教導的範圍之內。
[0038]在選擇用於多重反應的引物序列時應當小心。引物的不恰當選擇可能產生不期望的結果，諸如缺乏擴增、在預期的靶基因座之外的ー個或多個位點擴增、引物-二聚體形成、不同基因座的引物間的非期望相互作用、從與來自另一基因座的等位基因重疊(在大小上)的ー個基因座的等位基因產生擴增子、或需要特別地適於每一不同基因座的擴增條件或方案，其中所述條件/方案在單個多重系統是不兼容的。例如可通過本領域普通技術人員很熟悉的多重優化的反覆過程開發和選擇用於這一教導的多重系統的引物:選擇引物序列、混合用於共擴增所選擇的基因座的引物、共擴增該基因座、然後分離並檢測擴增產物以確定擴增中的引物有效性。
[0039]作為引物選擇的實例，可以選擇在本文所引用的參考文獻中鑑定的或在其它參考文獻中描述的能用於擴增上述基因座中任一個的單個引物和引物對來擴增和分析根據本發明教導的STR基因座。作為另ー實例，可通過應用可獲得的並且本領域公知用於開發擴
增和/或多重系統的各種軟體程序的任ー個來選擇引物。例如參見Primer Express?軟
件(Applied Biosystems, Foster City,Calif)。在應用軟體程序的實例中，可將來自目的基因座區域的序列信息輸入該軟體。`該軟體然後應用各種算法來選擇最符合用戶技術要求的引物。
[0040]開始，這ー引物選擇過程可能產生任意的上述擴增中的非期望效果，或者擴增產物的不平衡，即從ー些基因座產生比其它基因座更多的產物，這是因為ー些引物和它們各自的靶之間比其它引物更強的結合強度，例如導致對於ー些基因座的優選的退火和擴增。或者，引物可能產生不代表靶基因座等位基因本身的擴增產物，即可能產生非特異性擴增產物。這些由不好的引物設計所產生的無關產物可能是由於例如引物與樣品DNA中非靶區域退火，或甚至與其它引物退火，隨後在退火之後擴增。
[0041]當在引物選擇期間在多重系統中存在非平衡或非特異性擴增產物時，可從總多重集中取出單個引物，並且與來自相同或其它基因座的引物用於擴增，以鑑定哪些引物促成了擴增不平衡或假象。一旦鑑定了產生ー種或更多種假象或不平衡的兩個引物，則可修飾一個或兩個貢獻者，並且單獨成對地或在多重系統(或多重系統的子集)中再測試。可重複這ー過程，直到在多重系統中產物評估產生沒有擴增假象或有可接受水平的擴增假象的擴增的等位基因。
[0042]弓丨物濃度的優化可在確定最終引物序列之前或之後進行，但是最經常在引物選擇之後進行。一般地，増加任何特定基因座的引物的濃度會増加為該基因座產生的產物量。然而，引物濃度優化也是反覆的過程，因為例如増加來自ー個基因座的產物產量可能會減少來自另一基因座或其它複數的基因座的產量。此外，引物可能會相互作用，其可能直接影響來自各基因座的擴增產物產量。總之，特定引物集濃度的線性增加並不必然地等於相應基因座擴增產物產量的線性增加。有關基因座特異性引物更詳細的描述，參見MJ Simons美國專利號5，192，659，其教導通過引用而全文併入本文。
[0043]在多重反應中基因座-基因座間擴增產物平衡還可能受到擴增方案的許多參數的影響，例如，諸如模板(樣品DNA)輸入量、所使用的擴增循環數、熱循環方案的退火溫度以及在循環步驟的的末尾包括或不包括額外的延伸步驟。在所有等位基因和基因座中擴增產物產量的絕對均勻平衡儘管在理論上是期望的，但一般無法在實踐中實現。
[0044]確定包含多重系統的基因座和開發這一系統反應條件的步驟也可以是反覆的步驟。也就是，可首先開發用於小量基因座的多重系統，這一系統沒有或幾乎沒有擴增假象和產物不平衡。然後可將這一系統的引物與期望用於分析的另一基因座或若干個其它基因座的引物聯合。這ー擴增的引物組合可能或可能不產生擴增假象或不平衡產物產量。反過來，可從該系統移除ー些基因座，和/或可引入並評估新基因座。
[0045]可重複上述ー個或更多個反覆選擇步驟，直到鑑定出完整的引物集，其可用於共擴增上述至少11個選擇用於共擴增的基因座，包括STR基因座VWA，D16S539，D2S1338，D8S1179, D21S11，D18S51，D19S433，THOI, FGA, D3S1358,以及 D10S1248, D22S1045, D2S441,D1S1656，和D12S391中的一個或更多個。應當理解可以開發許多不同的引物集，以擴增特定的基因座集。用於本發明教導的引物的合成可應用本領域技術人員公知的用於寡核苷酸合成的任意標準方法進行，和/或可商購獲得。在本發明的各實施方案中，可在ー個多重擴增系統中擴增所有 15 個這些 STR基因座? VWA，D16S539，D2S1338，D8S1179，D21S11，D18S51，D19S433, THOI, FGA, D3S1358, D10S1248, D22S1045, D2S441, D1S1656，和 D12S391。在本發明教導的其它實施方案中，可在ー個多重擴增系統中共擴增所有15個這些STR基因座，以及且包括用於確定DNA樣品來源性別的Amelogenin基因座。
[0046]可使用與隨後的 DNA擴增相容的任何樣品製備方法製備用於本發明教導的方法的基因組DNA樣品。許多此類方法是本領域技術人員公知的。ー些實例是通過苯酚抽提的 DNA 純化(J.Sambrook 等(1989)，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., pp.9.14-9.19)、以及通過鹽沉澱(S.Miller 等(1988)，NUC L.ACIDS RES.16:1215)或 chelex(PS Walsh 等(1991),B10TECHNIQUES10:506-513 ；CT Comey 等(1994),J.FORENSIC Sc1.39:1254)的部分純化，以及應用未處理的血釋放未純化的材料(J.Burckhardt (1994)，PCR METHODS ANDAPPLICAT10NS3:239-243 ；RBE McCabe(1991)，PCR METHODS AND APPLICAT10NS1:99-106 ；BY Nordvag(1992)，BIOTECHNIQUES12:4pp.490-492)。
[0047]當待應用這一教導的方法進行分析的至少ー個DNA樣品是人類基因組DNA時，可從組織樣品製備DNA,所述組織樣品例如,諸如是血液、精液、陰道細胞、毛髮、唾液、尿、骨、口腔樣品、含有胎盤細胞或胎兒細胞的羊膜水、絨膜絨毛、和/或任意這些的混合物或其它組織的一種或更多種。
[0048]任選地，可在用於本發明教導的方法之前使用本領域技術人員公知的DNA定量的任何標準方法測量DNA濃度。此類定量方法例如包括如由J.Sambrook等(1989)，同上，Appendix E.5中描述的分光光度測量；或應用諸如由CF Brunk等(1979)，ANAL.BIOCHEM.92 =497-500描述的測量技術的螢光測定方法。可通過比較DNA標準品與諸如由JS Waye 等(1991)，J.FORENSIC SC1.36:1198-1203 (1991)中描述的人特異性探針的雜交量測量DNA濃度。在擴增反應中使用太多的模板DNA可能產生可能不代表真實等位基因的擴增假象。
[0049]一旦製備了基因組DNA樣品，可在本發明教導的多重擴增步驟中共擴增靶基因座。可以使用許多不同擴增方法中的任ー種擴增該基因座，例如，諸如PCR(RK Saiki等(1985)，SCIENCE230:1350-1354)、基於轉錄的擴增(DY Kwoh 和 TJ Kwoh (1990)，AMERICANBIOTECHNOLOGY LABORATORY，1990 年 10 月)以及鏈置換擴增(SDA) (GT Walker 等(1992)，PR0C.NATL.ACAD.SC1.,U.S.A.89:392-396)。在本發明教導的ー些實施方案中，可通過PCR實現多重擴增，其中使用特異於該多重中每一基因座的引物對進行DNA樣品的擴蹭。
[0050]標準PCR的化學成分一般包括溶剤、DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸(「dNTPs」)、寡核苷酸引物、二價金屬離子、以及預期含有PCR擴增靶的DNA樣品。一般可使用水作為PCR的溶劑，其一般包含緩衝劑和非緩衝鹽諸如KC1。緩衝劑可以是本領域公知的任意緩衝劑，諸如，但不限於Tris-HCl，並且可通過常規實驗進行變化以最優化PCR結果。本領域普通技術人員能很容易地確定最佳的緩衝條件。可依賴於用於擴增的特定酶優化PCR緩衝液。 [0051]二價金屬離子通常對於允許聚合酶有效工作是有利的。例如，鎂離子是允許ー些DNA聚合酶有效工作的ー種離子。一般地，可將MgCl2或MgSO4加入到反應緩衝液中以提供最佳的鎂離子濃度。最佳PCR擴增所需的鎂離子濃度可能取決於所使用的特定引物集以及模板。通常經驗地確定為達到最佳擴增所添加的鎂鹽量，並且是本領域的常規實踐。一般地，對於最佳PCR的鎂離子濃度可以在約I至約IOmM之間變化。在PCR中鎂離子濃度的一般範圍可以是約1.0至約4.0mM，在約2.5mM的中點周圍變化。備選地，可使用二價離子錳，例如以二氧化錳(MnO2)的形式，滴定至適於最佳聚合酶活性的濃度，這可通過本領域技術人員使用標準實驗室方法而很容易地確定。
[0052]在擴增核酸分子中使用的構件模塊dNTP —般可以以例如約40-200 U M的脫氧腺苷三磷酸(「dATP」)、脫氧鳥苷三磷酸(「dGTP」)、脫氧胞苷三磷酸(「dCTP」)和脫氧胸苷三磷酸(「dTTP」)的每ー種的濃度在標準PCR中提供。還可以使用其它dNTP，諸如脫氧尿苷三磷酸(「dUTP」 )、dNTP類似物(例如，次黃嘌呤核苷)、以及綴合的dNTP，並且它們也由本文所使用的術語「dNTP」所包括。儘管使用約40-200 u tM濃度的每ー種dNTP適於這一教導的方法，但是超過約200 y M每ー dNTP的濃度將是有利的。因此，在這些教導的方法的一些實施方案中，每ー dNTP的濃度一般至少約500 u M並且可高達約2mM。在一些其它的實施方案中，每ー dNTP的濃度為約0.5mM至約ImM。用於任意多重擴增的特定dNTP濃度可依據多重的條件而變化，並且可通過本領域技術人員應用標準實驗室方法經驗地確定。
[0053]在PCR中使核苷酸三磷酸聚合為擴增產物的酶可以是任意DNA聚合酶。DNA聚合酶可以是例如本領域公知的任何耐熱聚合酶。可用於這一教導的ー些聚合酶的實例是來自諸如水生棲熱菌(Thermus aquaticus)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus) >Thermococcuslitoralis、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)、火球菌屬物種(Pyrococcus sp.)的生物的DNA聚合酶。可通過幾種可能方法的任ー種獲得該酶；例如從來源細菌分離、通過重組DNA技術產生或購自商業途徑。此類可商購的DNA聚合酶的一些實例包括AmpliTaq Gold? DNA聚合酶；AmpliTaq? DNA聚合酶；
AmpliTaq? DNA聚合酶Stoffel片段；rTth DNA聚合酶；以及rTth DNA聚合酶，XL (所
有均通過Applied Biosystems, Foster City, Calif.生產)。合適的聚合酶的其它實例包括來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的Tne,Bst DNA聚合酶大片段、來自Thermococcus litoralis的Vent和Vent Exo-、來自海棲熱袍菌的Tma、來自火球菌屬物種的Deep Vent和Deep VentExo-以及Pfu，以及前述那些的突變體、變體和衍生物。
[0054]PCR的其它已知成分可在本教導的範圍內使用。此類組分的一些實例包括山梨醇、去垢劑(例如Triton X-100、Nonidet P-40 (NP-40)、Tween-20)和破壞核苷酸對錯配的試劑，例如，諸如二甲亞碸(DMSO)、和氯化四甲銨(TMAC)以及尿嘧啶N-轉葡糖基酶，或預防PCR的擴增子汙染和/或在PCR步驟開始之前的PCR溫育或預備期間產生不想要的產物的其它試劑。[0055]PCR循環溫度、循環數和它們的持續時間可以改變以優化特定的反應，這是常規實驗內容。本領域普通技術人員將認識到以下是作為確定PCR各種參數的指引，並且也將認識到ー個或更多個條件的變化在本教導的範圍內。為PCR的三個階段確定了溫度和循環時間:變性、退火和延伸。ー輪變性、退火和延伸稱為ー個「循環」。通常在足夠高以允許DNA鏈分離、而又沒高到破壞聚合酶活性的溫度下進行變性。一般地，可在反應中使用耐熱性聚合酶，其在升高的溫度下不會變性而是保留了一定水平的活性。然而，如果在PCR的每ー變性步驟之後補充它們的話，也可以使用熱不穩定聚合酶。一般地，可在高於約90°C並低於約100°C進行變性。在一些實施方案中，可在約94-95°C進行變性。DNA變性一般地可進行至少約I至約30秒。在一些實施方案中，變性可進行約I至約15秒。在其它實施方案中，變
性可進行達約I分鐘或更久。除了 DNA變性，對於某些聚合酶，諸如AmpliTaq Gold?,在
變性溫度下溫育還可以活化該酶。因此，當使用這些聚合酶時，允許PCR的第一個變性步驟比隨後的變性步驟更長是有利的。
[0056]在退火期間，寡核苷酸引物與靶DNA在它們的互補區域退火，並且一旦DNA聚合酶與引物-模板雙鏈體結合，則通過DNA聚合酶大大地延伸。在常規PCR中，退火溫度一般地可在或低於最不穩定的引物-摸板雙鏈體的解鏈點(TJ，其中Tm可通過本領域技術人員公知的幾種理論方法的任ー種估計。例如，可通過以下公式確定Tm:
[0057]Tm= (40C XG 和 C 鹼基數) + (2°C X A 和 T 鹼基數)。
[0058]一般地，在標準PCR中，退火溫度可以是比最不穩定的引物-模板雙鏈體的估計Tni低約5-10°C。退火時間可以是約30秒至約2分鐘。退火期之後一般是延伸期。延伸可進行足夠的時間量以允許聚合酶完成引物延伸至合適大小的擴增產物。
[0059]PCR的循環數(一個循環包括變性、退火和延伸)決定擴增的程度和隨後的擴增產物量。PCR導致DNA分子的指數擴增。因此，理論上，在PCR的每ー循環之後，產物的數量是前ー個循環中存在的產物的兩倍，直到PCR試劑耗竭並達到了不再產生其它擴增產物的平臺期。一般地，可進行約20-30個循環的PCR，以達到這一平臺期。更一般地，可進行約25-30個循環，儘管循環數沒有特別地限制。
[0060]對於ー些實施方案,在PCR最後ー個循環的最後階段之後在某些溫度溫育該反應是有利的。在一些實施方案中，可選擇延長的延伸期。在其它實施方案中，可選擇在低溫(例如，約4°C )溫育。
[0061]可使用各種方法評估從多重反應中獲得的擴增產物混合物中擴增的等位基因產物，包括例如，檢測螢光標記的產物、檢測放射性同位素標記的產物、擴增產物的銀染、或使用DNA插入劑染料(諸如溴化こ錠(EtBr)和SYBR綠花菁染料)以顯現雙鏈擴增產物。適幹與用於本教導的引物附著的螢光標記有很多，可商業獲得，並且是本領域公知的。對於螢光分析，可以使用至少ー個螢光標記的引物擴增每一基因座。螢光檢測可比放射性標記方法和產物檢測更值得期待，例如，因為螢光檢測不需要使用放射性材料，並且因此避免了與使用放射性材料相伴的管理和安全問題。使用經標記的引物的螢光檢測也可在其它非放射性檢測方法(諸如銀染和DNA插入劑)之上選擇，因為螢光檢測方法一般比銀染和DNA插入劑顯示更少的擴增假象。這一部分原因是因為這樣的事實，即在螢光檢測中僅檢測在其上附著了標記的DNA擴增鏈，而使用銀染和插入劑檢測方法則染色並檢測每一擴增產物的兩條鏈，這導致顯現了許多非特異性擴增假象。此外，還存在與使用EtBr和SYBR相關的潛在的健康風險。EtBr是已知的誘變劑；SYBR儘管是不如EtBr的誘變劑，但其通常懸浮在能迅速通過皮膚的DMSO中。
[0062]當在多重反應中使用引物的螢光標記時，通常可使用至少三種不同的標記來標記不同的引物。當使用大小標記物評估多重反應產物時，用於製備大小標記物的引物可以用與在該反應中擴增目的基因座的引物不同的標記來進行標記。由於自動螢光成像和分析的出現，可以達到多重擴增產物的更快的檢測和分析。
[0063]在本發明教導的ー些實施方案中，可以使用螢光團來標記多重擴增中的至少ー種引物，例如，通過共價結合至引物，因此產生螢光標記的引物。在一些實施方案中，可以使用不同的螢光團標記多重中用於不同靶基因座的引物，每ー螢光團產生取決於該螢光團的發射波長的不同的著色產物。可在同一多重反應中使用這些不同地標記的引物，並且隨後一起分析它們各自的擴增產物。可標記擴增特定基因座的引物對的正向或反向引物之一，儘管更通常標記正向引物。
[0064]以下是本領域公知的並且適於在本發明教導中使用的可能的螢光團的ー些實例。該列表意在示例性並且不意味著是窮舉的。ー些可能的螢光團包括:螢光素(FL)，其在492nm處最大吸收並且在520nm處最大地發射；N，N，N』，N』 -四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA?)，其在555nm處最大吸收並且在580nm處最大地發射；5_羧基螢光素(5-FAM?)，其在495nm處最大吸收並且在525nm處最大地發射；2』，7』 - 二甲氧基-4』，5』 -二氯_6_羧基螢光素(J0E?)，其在525nm處最大吸收並且在555nm處最大地發射；6_羧基-X-羅丹明(R0X?)，其在585nm處最大吸收並且在605nm處最大地發射；CY3?，其在552nm處最大吸收並且在570nm處最大地發射；CY5?，其在643nm處最大吸收並且在667nm處最大地發射；四氯-螢光素(TET?)，其在521nm處最大吸收並且在536nm處最大地發射；以及六氯-螢光素(HEX?)，其在535nm處最大吸收並且在556nm處最大地發射；NED?，其在546nm處最大吸
收並且在575nm處最大地發射 ；6-FAM?，其在約520nm處最大地發射；VIC?,其在約550nm處最大地發射；PET?其在約590nm處最大地發射；以及LIZ?，其在約650nm處最大地發射。參見 SR Coticone 等，美國專利號 6，780, 588 ； AMPFLSTR? IDENTMLER?PCR 擴增試劑盒用戶手冊'，PP.1-3, Applied Biosystems (2001)。注意到上面列舉的發射和/或吸收波長是典型的並且僅可用於一般地指引作用；對於不同的應用和在不同的條件下真實的峰波長可能不同。
[0065]本發明教導的各實施方式可以包括單個多重擴增系統，其包含了至少4種不同的染料。這些至少4種染料可以包含任意4種上述列出的染料，或任何其它4種本領域公知
的染料，或6-FAM?、VIC?, NED?和PET?。本教導的其它實施方案可包含包括至少5種
不同染料的單個多重系統。這些至少5種染料可以包含任意5種上述列出的染料，或任何
其它5種本領域公知的染料，或6-FAM?、VIG?、NED?、pgT?和LIZ?。參見圖2，其為從
16個基因座的多重擴增中應用5種染料6-FAM?、VIC?、NED?、PET?和LIZ?產生的DNA
概況的實例，如在實施例中所描述的那樣(沒有顯示LIZ?的擴增峰，因為LIZ?用於標記大小標準品)。本教導的其它實施方案可包含包括至少6種不同染料的單個多重系統。這些至少6種染料可以包含任意6種上述列出的染料，或任何其它6種本領域公知的染料，或
6-FAM?、VICffl、NED?、PET?, LIZ?和在約620nm處具有最大發射的第6種染料(SID)。
參見圖3。
[0066]可在篩選或非篩選介質上分析PCR產物。在這些教導的一些實施方案中，例如，可通過電泳分析PCR產物；例如毛細管電泳，如在H.Wenz等(1998) ,GENOME RES.8:69-80 (還參見E.Buel等(1998)，J.FORENSIC SC1.43:⑴，第164-170頁)中所描述的那樣；或平板凝膠電泳，如在 M.Christensen 等(`1999)，SCAND.J.CLIN.LAB.1NVEST.59(3):167-177 中所描述的那樣；或變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(例如，參見J.Sambrook等(1989) ,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL, SE⑶ND EDITION, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y?,第 13.45-13.57 頁)。電泳中 DNA 片段的分離主要基於不同的片段大小。還可通過色譜法分析擴增產物，例如通過尺寸排阻色譜法(SEC)。
[0067]一旦分離了擴增的等位基因，則然後可顯現並分析例如在凝膠或毛細管中的這些等位基因以及其它DNA (例如，DNA大小標記物或等位基因梯)。可應用本領域公知的許多技術中的任ー種完成DNA的顯現，例如諸如，銀染或通過應用報告物，諸如如本文描述的放射性同位素和螢光染料，或化學發光劑以及與可檢測底物聯合的酶。通常，多重基因座的檢測方法可通過螢光。例如參見 JW Schumm 等，PROCEEDINGS FROM THE EIGHTH INTERNATIONALSYMPOSIUM ON HUMAN IDENTIFICATION, 1998 由 Promega Corporation 出版，第 78-84 頁；E.Buel等(1998),同上。當在多重反應中使用突光標記的引物檢測甸一基因座時，可在擴增之後應用螢光測定檢測儀檢測標記的產物。參見上面的螢光染料的描述。
[0068]可通過與電泳中的大小標準品(諸如已知大小的DNA標記物)相比較而確定DNA樣品中在每一基因座上存在的等位基因大小。用於評估含有兩個或更多個多態性STR基因座的多重擴增的標記物還可包含基因座特異性等位基因梯或用於每ー進行評估的基因座的等位基因梯的組合。例如參見C.Puers等(1993)，AM.J.HUM.GENET.53:953-958 ；
C.Puers 等(1994)，GENOMICS 23:260_264。還參見美國專利號 5，599，666 ;5，674，686 ;和5，783，406，用於描述適於在檢測STR基因座中使用的ー些等位基因梯，以及其中公開的梯構建的ー些方法。在構建了單個基因座的等位基因梯後，可在與擴增產物相同的時間電泳該梯。每ー等位基因梯與來自相應基因座的等位基因共遷移。
[0069]還可使用內部泳道標準品來評估本教導的多重反應的產物，所述內部泳道標準品即配置以進行電泳的特定類型的大小標記物，例如作為擴增產物在相同的毛細管中。該內部泳道標準品可包含一系列的已知長度片段。還可用螢光染料標記該內部泳道標準品，其中所述螢光染料可與在擴增反應中的其它染料相區分。該泳道標準品可與經擴增的樣品或大小標準品/等位基因梯混合，並且與任一進行電泳以比較在凝膠電泳不同泳道中或在毛細管電泳不同毛細管中的遷移。內部泳道標準品遷移的不同可用於指示分離介質性能的不同。這ー不同的定量以及與等位基因梯的關聯可提供在不同泳道或毛細管中電泳的擴增產物的校準，並且校正未知樣品中等位基因的大小確定。
[0070]當使用螢光染料標記擴增產物時，可使用螢光檢測儀器分析經電泳井分離的產
物，所述儀器例如諸如是ABI PRISM? 310或3130x1遺傳分析儀，或ABI PRJSM?
377DNA 測序儀(Applied Biosystems, Foster City, Calif.);或 Hitachi FMB10? II 焚光掃描儀(Hitachi Software Engineering America，Ltd.，South San Francisco，Calif)。
在本教導的各實施方案中，可通過與諸如ABI PRISM? 3130x1遺傳分析儀(Applied
Biosystems)的電泳設備聯合的毛細管凝膠電泳方案分析PCR產物，並且可進行經電泳
的擴增產物的等位基因分析，例如使用來自Applied Biosystems的GeneMapper? ID
Software v3.2。在其它實施方案中，可在例如約4.5%,29:1的丙烯醯胺:雙丙烯醯胺，8M
尿素凝膠中電泳分離擴增產物， 其中所述凝膠如為ABI PRISM? 377自動螢光DNA測序儀
所製備的那樣。
[0071]本發明的教導還涉及使用上述方法的試劑盒。在一些實施方案中，基礎試劑盒可包括容器，其具有ー個或更多個基因座特異性引物。試劑盒還可任選地包含使用說明書。試劑盒還可包含其它任選的試劑盒成分，例如諸如以下中的ー種或更多種:針對每ー個特定基因座的等位基因梯、用於擴增的足量的酶、促進擴增的擴增緩衝劑、促進酶活性的二價陽離子溶液、在擴增期間用於鏈延伸的dNTP、用於製備用於電泳的擴增材料的上樣溶液、作為模板對照的基因組DNA、保證材料如預期的那樣在分離介質中遷移的大小標記物、以及教導用戶以及限制使用中的誤差的方案和手冊。各試劑在試劑盒中的量也可以依據許多因素而不同，諸如該方法的最佳敏感性。提供用於手工應用的測試試劑盒或使用自動化檢測儀或分析儀的測試試劑盒在這些教導的範圍之內。
[0072]可在含有核酸的任意標本(諸如骨、毛髮、血液、組織等)上進行個人鑑定測試、或DNA分型。可從該標本提取DNA，並且在多重中使用一組引物擴增該DNA的期望的STR基因座集，以產生擴增產物集，如本文所描述的那樣。在法庭測試中，可將特定標本的擴增模式或DNA概況與取自假定受害者(假定的匹配源)的已知樣品進行比較，或可與其中擴增了相同的STR基因座集的衍生自該假定受害者的家族成員(例如，母親和/或父親)的經擴增的基因座模式進行比較。STR基因座擴增的模式可用於確定或排除該受害者的身份。在親權測試中，測試標本一般地可來自孩子並且可與來自假定的父親的STR基因座模式進行比較，和/或可與來自該孩子母親的STR基因座模式進行匹配。STR基因座擴增的模式可用於確定或排除父親的身份。特定基因座的擴增和比較還可用於育種背景中的親權測試，例如用於牛、狗、馬和其它動物。CR Primmer 等(1995)，MOL.EC0L.4 =493-498?
[0073]在臨床環境下，此類STR標記可用於例如在骨髄移植中監測供體移植物移入的程度。在醫院中，這些標記還可用於標本匹配和跟蹤。這些標記還已進入了其它科學領域，諸如對人種和種族差異(DBGoldstein 等(1995)，PROC.NATL.ACAD.SC1.U.S.A.92:6723-6727)、進化和物種趨異、以及動物和植物分類群中的變異(MW Bruford等(1993)，CURR.BIOL.3 =939-943)的群體生物學研究。
[0074]本文引用的參考工作、專利、專利申請、科學文獻和其它印刷出版物、以及GenBank資料庫序列的登錄號均在此通過引用全文併入本文。
實施例
[0075]本教導的各方面可根據以下實施例進ー步理解，所述實施例不應理解為以任何方式限制本教導範圍。
[0076]在一些實施方案中，在PCR混合物中使待分析的DNA樣品與STR及Amelogenin特異性引物集聯合，以擴增基因座 D16S539，D18S51, D19S433, D21S11, D2S1338, D3S1358,D8S1179, FGA, THOI, VWA, Amelogenin，和 5 個新 STR 基因座 D10S1248，D12S391, D1S1656,D22S1045，和D2S441。根據本文提供的方法設計用於這些基因座的引物集，上文。用6-FAM?螢光標記來標記來自擴增D10S1248、VWA、D16S539和D2S1338的引物集中每ー個的一條引
物。用V1G?螢光標記來標記來自擴增Amel0genin、D8S1179、D21S11和D18S51的引物集中每ー個的一條引物。用NED?螢光標記來標記來自擴增D22S1045、D19S433、THOl和FGA的引物集中每ー個的一條引物。用PET?螢光標記來標記來自擴增D2S441、D3S1358、D1S1656和D12S391的引物集中姆一個的一條引物。第五個突光標記LIZ?用於標記大小標準品。
[0077]然後使該反應混合物進行聚合酶鏈式反應。從STR和Amelogenin基因座產生擴增產物，其中標記的引物摻入擴增產物中。擴增產物因此被6-FAM?、VIG?、NED?或PET?
螢光標記進行了標記。擴增後使所有或部分反應混合物在單毛細管通道中進行毛細管電泳。還電泳了 LIZ?標記的大小標準品。檢測從螢光標記的發射並在單輸出中展示。來自應用5種染料(LIZ?標記的大小標準品未顯示)擴增16個基因座的DNA概況參見圖2。STR和Amelogenin基因座通過該通道的遷移速率是它們的大小的函數。STR和Amelogenin擴增產物的大小以及它們標記的顔色鑑定每一基因座上的等位基因。
[0078]如本領域技術人員所理解的那樣，可對本發明教導的各實施方案進行許多改變和修飾而不背離本教導的精神。預期所有此類變形均在本教導的範圍之內。
【權利要求】
1.方法，其包括 (a)在多重擴增反應中共擴增至少ー個待分析的DNA樣品的基因座集，其中所述反應的產物是來自共擴增的所述集中的基因座的經擴增的等位基因混合物，其中所述的基因座集包含10個STR基因座
D16S539, D1SS5UD19S433, D21S11, D2SI338, D3S1358, DSSl 179, FGA, IllOl1 VWA
；以及來自 STR 基因座 D1.0S12幼,D12S391, DlS1656,和 D2S441 的一個或更 多個； (b)評估混合物中經擴增的等位基因，以確定在所述至少ー個DNA樣品之內的所述基因座集中所分析的基因座的每ー個上存在的等位基因。
2.權利要求1的方法，其中步驟(a)中的基因座集還包含可用於鑑定所述至少ー個DNA樣品來源的性別的基因座。
3.權利要求2的方法，其中所述的DNA樣品來源是人類，並且用於鑑定所述人類性別的基因座是Amelogenin基因座。
4.權利要求1的方法，在所述評估步驟之前還包括分離經擴增的等位基因的步驟。
5.權利要求4的方法，其中通過毛細管凝膠電泳分離所述經擴增的等位基因。
6.權利要求1的方法，其中所述的共擴增步驟包括使用用於所述基因座集中每一基因座的寡核苷酸引物對，所述引物對的每一個位於多重反應中所述基因座集的基因座的側翼。
7.權利要求6的方法，其中每ー對寡核苷酸引物的至少ー個引物是經標記的引物。
8.權利要求7的方法，其中所述經標記的引物的標記是螢光標記。
9.權利要求8的方法，其中所述的共擴增步驟包括應用至少5個螢光標記的寡核苷酸引物，其中所述至少5個標記的引物具有分別共價地附著於其上的至少5種不同的螢光標記。
10.包含用於共擴增待分析的至少ー個DNA樣品的基因座集的寡核苷酸引物的試劑盒；其中所述的基因座集可被共擴增；其中所述的引物在一個或更多個容器中；並且其中所述的基因座集包含Amelogein基因座，10個STR基因座D16S539, D18S51, D19S433, D2IS11, D2S1338, IMSI358, D8S1179, FGA1 THOl, VWA5 以及 STR 基因座 D10S1248，D12S391, D1S1656, D22S1045,和 D2S441 的一個或更多個。
【文檔編號】C12Q1/68GK103555830SQ201310476099
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2008年10月30日 優先權日:2007年10月30日
【發明者】L.K.亨尼西, R.格林 申請人:應用生物系統有限責任公司