利用選擇的乳酸桿菌減少嬰兒腹痛的製作方法

2023-05-07 13:02:01 2

專利名稱：利用選擇的乳酸桿菌減少嬰兒腹痛的製作方法
技術領域：
本發明這裡提供了特定的乳酸桿菌菌株，以及一種選擇這樣菌株的方法，和包含這樣菌株的產品；其中這些菌株由於具有提高細胞因子IL-10水平的能力而被選擇出來， 用於預防和/或治療腹痛。
背景技術：
雖然嬰兒腹痛既普遍又痛苦，但是其特性和原因仍然不清楚。一位母親對這種情況的描述是在一天中本來很高興的嬰兒，開始皺眉頭、臉開始變紅、蹬腿、尖叫並持續哭鬧2 20分鐘，然後這種襲擊突然停止。甚至對於用來描述這種情況的術語也有爭論。這些術語包括「嬰兒腹痛」、「傍晚腹痛」，因為這種疼痛主要局限於晚間，以及「三個月腹痛」籍由這種症狀在嬰兒出生後三個月左右消失(Illingworth RS.Difficulties in breastfeeding.In Ronald S.Illingworth, ed.The Normal Child. IOth edn. Harcourt (India) Pvt. Ltd. 1997 ； 39-44)。不同的作者採用不同的定義。Wessels的定義為腹痛是在至少三個星期的每個星期中三天或者更多天中出現每天三個或更多小時的陣發性哭鬧，是在文獻中最為廣泛接受的(Sondergaard C，Skajaa E， Henriksen TB. Fetal growth and infantile colic. Arch Dis Child Fetal-Neonatal Ed 2000；83(1) :F44-47)。目前，主要的可能誘發因素被分成三組心理與社會的、腸胃的和神經發育的疾病。心理與社會的因素包括正常哭鬧的變體、非典型的養育行為影響、父母與嬰兒之間交流問題的表現。腸胃的疾病在腹痛中被涉及到，因為哭鬧時嬰兒腿部的位置和臉部的扭曲。腸胃的因素主要有以下內容不正確的餵養方法例如奶瓶餵養，水平位置餵養以及餵後缺少缺少使之打嗝的拍打被認為是誘發原因。在開始的六個月內母乳餵養被認為是唯一的保護因素。在非母乳餵養的嬰兒中嬰兒的腹痛的風險性提高了 1.86倍。(Saavedra MA, Dacosta JS, Garcias G, HortaBL, Tomasi Ε, Mendoca R. Infantile colic incidence and associated riskfactors :a cohort study. Pediatr (Rio J) 2003 ；79 (2) :115-122) Lothe 等人認為腹痛是由於對牛奶中乳清蛋白敏感(Lothe L,Lindberg T. Cow' smilk whey protein elicits symptoms of infantile colic in colicky formula-fed infants :k double-blind cross over study. Pediatrics 1989 ；83 262).在一項近期的研究中，得出的結論認為食物的過敏性僅僅只是少部分嬰兒的腹 ΛM Wi^ S (Hill DJ, Hosking CS. Infantile colicand food hypersensitivity. J Pediatr Gastrenterol Nutr 2000 ；30 (Suppl) :S67_76)。近來 Buchanan 已經顯示低過敏原牛奶在嬰兒腹痛中的實驗沒有得到足夠的證據支持(Buchanan P. Effectiveness of treatment for infantile colic。 Trial of hypoallergenic milk is not supported by strongenough evidence. BMJ 1998 ;317 (7170) :1451-1452)。患有嬰兒腹痛的嬰兒被認為具有較高的過敏性疾病風險度。然而，在一項近期的研究中，特應性、過敏性鼻炎、哮喘、喘鳴和呼吸頻率變化的標記，在患有和不患有嬰兒腹痛的嬰兒中是可比對的 (Castro-Rodriguez JA,Stern DA,Halonen Μ,Wright AL,Holberg CJ et al. Relationship between infantile colic and Asthma/atopy :A prospective study in an unselected population. Pediatrics 2001 ； 108 (4) :878-882)。乳糖吸收障礙已經被作者基於呼吸氫檢測報導了(Hyams J，Geerstama M， Etienne N, Treem W. Colonichy drogen production in infants with colic. J Pediatr 1989 ；115 592)。在患有和不患有嬰兒腹痛的嬰兒中沒有發現糞便中氫濃度的差異。然而， 產生較高甲烷水平的嬰兒被發現減少了腹痛，這說明甲烷的產生能起到緩解作用(Belson A, Shetty AK, Yorgin PD, Bujanover Y, Peled Y, Dar MH, Riaf S. Colonichy drogen elimination and methane production in infants with and without infantile colic syndrome. Dig Dis Sci 2003 ；48 (9) :1762-1766)。腸胃的(GIT)激素例如能動素，血管活性腸肽已經顯示在患有腹痛的嬰兒中異常高。Lothe等人發現在日後發展腹痛的嬰兒從出生第一天起就顯示GIT水平增高，其說明在嬰兒腹痛患者的GIT生理狀況異常(Lothe L，Ivassson SA, Ekman R，Lindberg T. Motilin and infantile colic :A prospective study. Acta Pediatr Scand 1990 ； 79(4) :410-416)。已提出的神經發育失調顯示腹部的痙攣和腹痛有可能是蠕動過度的結果。該理論得到的證據支持是利用抗膽鹼能試劑可以減少腹痛症狀(Gupta SK. Is colic a gastro intestinal disorder ？ Curr Opin Pediatr2002 ； 14 :588-92)。大部分嬰兒在4個月左右擺脫了腹痛困擾的事實支持了神經發育因素誘發月復痛白勺觀(Barr RG. Colic and crying syndromes in infants. Pediatrics 1998 ； 102(5suppl E) :1282-6)。根據普遍接受的定義，益生菌是一種活的微生物飼料添加劑，其能通過改善宿主腸內的微生物平衡而有效影響宿主動物。雖然最初指的是用於農場動物飼料的添加劑，用於人類的情況該定義也很容易被接受。人類所攝取的主要益生菌是包含腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌菌種的乳製品形式的食品。其暗示益生菌的攝取影響腸內微生物群落的組成。有人提出益生菌對腸內生態系統的影響有益於攝取者。已經公開的通過使用益生菌改變腸內微生物而帶來的很多可能的益處包括提高傳染性疾病的抵抗力、尤其是腸的、 減少腹瀉的持續時間、降低血液壓力、降低血液膽固醇濃度、減少過敏、刺激外周血淋巴細胞的吞噬作用、調節細胞因子的基因表達、輔助作用、腫瘤衰退、和減少致癌物或輔致癌物的產生。Christensen等人首先報導了益生菌乳酸桿菌的免疫調節作用，其調節樹突狀細胞(DCs)的Thl/Th2/Th3/Trl/Treg-增強能力。他們展示了當鼠科動物細胞DCs暴露於不同乳酸桿菌種類的共培養物時，包括路氏乳酸桿菌，它們產生細胞因子11-6，IL-10，IL-12， 和TNF-α的能力和以濃度依賴的方式上調節MHC II類和CD86表面標記的能力被不同程度地調節。所有乳酸桿菌上調節的表面MHC II類和⑶86標記-顯示出DC成熟。在這些研究中尤其要注意到路氏乳酸桿菌(菌株12M6)是一種弱的IL-12誘導劑，但是當其與約氏乳酸桿菌或乾酪乳酸桿菌共培養時，其能不同程度地抑制前炎症細胞因子信號IL-12，IL-6和TNF-a的產生，而這些物質可被後兩種種類刺激。IL-10的產生在這些情況下保持不變。這些發現推出的結論是「路氏乳酸桿菌可能對腸內的樹突狀細胞產生一種環境調節作用，使其產生對於沒有「危險信號」的抗原有益的耐受性，而同時保持了對通過危險信號例如LPS所識別的病原體完好的應答能力」，而且「路氏乳酸桿菌可能是一種潛在的精細靶向治療，能有效下調節IL-12和TNF-α (和IL-6)產量同時誘導抗炎症因子 IL-10，這樣提供了一種替代的方法抗衡腸內前炎症因子微生物群落」並且因此「可能存在 Thl/Th2/Th3的腸激發作用，根據腸微生物群的組成而被調節，腸微生物群包括攝入的益生菌。，，(Christensen HR, Frokiaer H, Pestka JJ (2002) Lactobacilli differentially modulate expression ofcytokiness and maturation surface markers in murine dendritic cells. J Immunol 168171-178)。Smits等人擴展了這些研究並且發現路氏乳酸桿菌能夠激活DCs以刺激T調節 (TR)細胞產生。他們採用三種不同的乳酸桿菌在體外與人的單核細胞-來源的DCs共培養。其中兩種乳酸桿菌，一種人的路氏乳酸桿菌菌株(ATCC 53609)和乾酪乳酸桿菌，而不是植物乳酸桿菌菌株，激活這些DCs以刺激TR細胞的發育。這些TR細胞被顯示出能產生水平提高了的IL-10並且能夠以一種IL-10-依賴的方式抑制旁路T細胞的增殖(Smits HH, Engering A，van der Kleij D，de Jong EC，Schipper K，van Capel TMM, Zaat BAJ. Yazdanbakhsh M， Wierenga EA, van Kooyk Y， Kapsenberg L(2005)Selective probiotic bacteria induce IL-10-producing regulatory T cells in votro by modulating dendritic cell function through dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule3-grabbing nonintegrin. J Allergy Clin Immunol 115 1260-1267)。關於口服路氏乳酸桿菌對宿主自身的效果第一方面的證據是雞迴腸中觀察到 CD4+/CD8+T 細胞比例上升(Walter J. Dobrogosz，NUTRAfoods 20054 0/3)15-28)。Valeur 等人近來將這項研究擴展到人的迴腸。他們在人類對象中獲得原位證據顯示(a)人特異性的路氏乳酸桿菌ATCC 55730個體細胞分布在整個人的腸中並且(b)路氏乳酸桿菌ATCC 55730參與特異地存在於腸的迴腸區域CD4+T細胞的募集和/或增殖。他們總結認為「路氏乳酸桿菌的施用誘導CD4+T-輔助細胞募集到人的上皮。這種募集作用可以作為解釋這種路氏乳酸桿菌菌株在人體中益生菌效應的一個因素(Valeur N, Engel P，Carbajal N， Connolly Ε, Ladefoged K(2004)Colonization andimmunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the human gastrointestinal tract, Appl Environ Microbiol 70 1176-1181)。Toll類受體(TLRs)識別微生物的結構基序並且激活一系列引發細胞因子產生的基因。通常，TLRs被認為是微生物感染的感受器，並且它們的角色是誘發炎症應答。然而， 能夠被TLRs識別的結構基序並不是病原體特有的，而是所有微生物種類所共用的通用結構基序，而且免疫系統怎樣通過TLRs區分共生菌和病原菌還不完全清楚。近來，數據顯示 TLRs，雖然其在誘導炎症應答中起作用，但是也通過識別共生微生物群而在維持腸內菌群
(Rakoff-Nahoum S,Paglino J,Eslami-Varzaneh F,Edberg S,MedzhitovR. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 2004 Jul 23 ；118(2) :229-41)。各種乳酸菌菌種，包括路氏乳酸桿菌已經被用於配製益生菌製劑。路氏乳酸桿菌是動物腸胃的道中天然發生的居住菌，並且通常發現於健康動物的腸中，包括人類。已知其具有抗微生物活性。例如，參見美國專利US 5，439，678,5, 458，875,5, 534，253,5, 837，238、 和5，849，觀9。當路氏乳酸桿菌細胞生長在存在甘油的厭氧性條件下時，它們產生已知為 β-羥基-丙醛(3-ΗΡΑ)的抗微生物物質。腸內的免疫系統和共生菌群之間存在一個清楚而複雜的關係。近來，已經證明腔內生的菌群可以通過toll樣受體(TLRs)和NOD-受體起始所誘導的桿菌在腸上皮細胞上的內生和適應宿主應答的關鍵過程(Haller D, Jobin C. Interaction between resident liminal bacteria and the host :can a healthy relationship turn sour ？ J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004 ；38 :123-36. Rakoff-Naholm S, Paglino J, Eslami-Varzaneh F, Edberg S, Medzhitov R. Recognition of comm. ensal microflora by Toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell 2004;118:229-241)。在動物模型中，細胞因子能夠通過神經-和肌-免疫相互作用起始腸內神經肌肉的過反射應答(Milla PJ. Inflammatory cells and theregulation of gut motility. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004 ；39 :S750.)。腸內的免疫系統和共生菌群之間存在一個清楚而複雜的關係。近來，已經證明腔內生的菌群可以通過激活腸上皮細胞上的toll樣受體(TLRs)和NOD-受體而啟動細菌誘導的天然和獲得性宿主應答的關鍵過程(Haller D，Jobin C. Interaction between resident liminal bacteria and the host :can a healthy relationship turn sour ？ J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004；38 :123-36.Rakoff-Naholm S, Paglino J, Eslami-Varzaneh F, Edberg S, Medzhitov R. Recognition of comm. ensal microflora by Toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell 2004 ; 118 : 229-241)。在動物模型中，細胞因子能夠通過神經-和肌-免疫相互作用啟動腸內神經肌肉白勺過反身寸(Milla PJ. Inflammatory cells and the regulation of gut motility J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004 ；39 :S750)。在實驗和臨床研究中已經證明特異的益生菌菌株抑制T細胞的增殖並降低Thl 和Th2兩種細胞因子的分泌，同時優先產生抑制性細胞因子例如IL-IO和TGF-β (Rautava S, Kalliomaki Μ, Isolauri Ε. Probiotics during pregnancy and breast-feeding might conferimmunomodulatory protection against atopic disease in the infants. JAllergy Clin Immunol 2002;109:119-121)。而且，在人類志願者中，路氏乳酸桿菌在人的腸胃道中群集並且能夠發揮免疫調節活性，包括在人的迴腸上皮募集CD4+T-輔助細胞(Valeur N, Engel P, CarbajalN, Connolly Ε, Ladefoged K. Colonization and immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the human gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 2004 ;70 :1176_81) 。 DCs 白勺)將不成熟的DCs轉變成成熟的抗原提呈細胞並移居淋巴結的過程。這一過程導致不成熟的DCs的特徵即強有力的抗原攝取能力的喪失，並且上調節各種細胞因子和共刺激分子的表達(Mellman I，Steinman RM :Dendritic cells !specialized and regulated antigen processing machines. Cell 2001,106 :255-8. Banchereau J，Briere F，Caux C，Davoust J， Lebecque S， Liu YJ, Pulendran B， Palucka K Jmmunobiology of Dendritic cells. Annu Rev Immunol 2000,18:767-811)。
已知成熟的條件是基於DCs在暴露於抗原期間或之後與之相遇的環境。這種情況的最好實施例是利用單核細胞-條件的培養基(MCM)。MCM是通過培養的單核細胞在體外產生的並且隨後採用培養液的上層清液作為成熟因子的來源。在MCM中負責成熟的主要成分是前炎症細胞因子白細胞介素-lbetadL-Ιβ)，IL-6和TNF-α (Reddy A, Sapp Μ, Feldman Μ,Subklewe Μ,Bhardwaj N :Α monocyte conditioned medium is more effective than defined cytokines in mediating the terminal maturation of human dendritic cells. Blood 1997,90 :3640-6.)。成熟的DCs產生各種細胞因子，其刺激和介導T細胞應答。這些細胞因子中的兩種是IL-10和IL-12。這些細胞因子在誘導的T細胞應答的方面具有相反的效應IL_12誘導Thl型應答而IL-10則抑制這樣的應答。因此，APCs的活化狀態(抗原提呈細胞)，包括DCs，決定了⑶4+T細胞應答的類型和大小。靜止的APCs(包括胸腺中的上皮細胞)可以促進⑶4+⑶25+TR細胞的發育。在病原體感染期間，通過TLRs識別微生物分子導致APCs的活化。隨後APCs產生IL-6和其它能一起使TR細胞抑制效應失效的可溶性因子，以允許有效產生TE (T效應細胞)細胞對抗病原體。靜止的和活化的APCs之間的動態平衡也將受TR和TE細胞兩者活動的影響(圖 1)。Pessi等人Q000)公開了 IL-10在特應性兒童口服鼠李糖乳酸桿菌之後的產生情況。但是不像本發明，該研究沒有公開能夠產生高數量的IL-10的特異性菌株， 其因為對抗能動性失調和腹痛的效率而被選擇(Pessi T，Sutas Y，Hurme M，Isolauri E. Interleukin-IOgeneration in atopic children following oral Lactobacillus rhamnosus. GG. Clin Exp Allergy. 2000Dec ；30 (12) :1804-8)。Hermelijn等人的一項研究Q005)顯示路氏乳酸桿菌和乾酪乳酸桿菌，但不是植物乳酸桿菌，誘發單核細胞-來源的DCs以驅動TR細胞的發育。所產生的這些TR細胞產生水平提高了的IL-10。不象這裡的本發明，該作者沒有把IL-10的提高與腸能動性或腹痛聯繫起來。即使在提到菌株時，該作者介紹了兩種能有效提高IL-10水平的不同的細菌種類。這與本發明形成了對比，本發明顯示最有效地減少腹痛的益生菌必須在菌株水平上確定和選擇，因為相同種類的不同菌株有效增加IL-10水平的能力不同。目前沒有腹痛的有效療法。目前治療腹痛的範例由藥理學的和/或非-藥理學的方法組成，使症狀減小到最低限度。通常提供給父母的腹痛治療性幹預包括四個策略包括飲食的、物理的、行為的和藥理學。飲食操作法包括各種餵養技術的專業建議，或者採用低過敏原的牛奶，豆奶或無乳糖的配方奶，以及提早引入固體食物(Lothe， L，et al. cow' s milk formula as a cause of infantile colic :a double-blind study. Pediatrics 1982 ；70 :7-10 ；Forsyth B W C. Colic and the effect of changing formulas :a double-blind multiple-crossover study.J Pediatr 1989 ； 115，521—6 ； Treem, W R，et al. Evaluation of the effect ofa fiber-enriched formula on infant colic. J Pediatr 1991 ;119695_701)。然而，不管是釆用豆奶配方還是改變餵養技術並不是對各種腹痛的情況都有效。研究這些建議的統計數據表明釆用低過敏原配方奶，例如部分水解的或胺基酸基的，可能對僅僅大約25%嬰兒有益(Lucassen，P L B J， et al. infantile colic :crying time reduction with a whey hydrolysate :a double-blind,randomized placebo-controlled trial. Pediatrics 2000 ；106 :1349-54 ；Estep,D C,et al. Treatment of infant colic with amino acid-based infant formula a preliminary study. Acta Paediatr2000 ；89 :22_7)。用於治療腹痛的物理策略包括物理移動身體位置以減輕氣體/逆流的產生、抱著嬰兒走、包裹、對腹部施壓、或給嬰兒按摩。其它方法包括使嬰兒分心以減輕其對腹痛的警覺性例如帶嬰兒坐車、利用坐車模擬器、利用嬰兒床振蕩或搖籃(Lipton E L. Swaddling and child care practice -historical， cultural and experimental observations. Pediatrics 1965 ；35 :521-67 ；Byrne J M，Horowitz F D. Rocking as a soothing intervention :the influence of direction and type of movement. Infant Behav Dev 1981 ；4 :207-18)。另一種方法是播放一些據說能使嬰兒放鬆的錄音。然而，在醫學文獻中有證據顯示這些方法不起作用(Parkin P C，Schwartz C J，Manuel B A. Randomized controlled trial of three interventions in the management of persistent crying of infancy. Pediatrics 1993 ；92 (2) : 197-201)。這些策略，最好的情況下，只是輔助減輕腹痛的症狀。建議進行行為幹預而治療腹痛是目前矛盾最多的療法。一些作者主張提高感官剌激，而其它則主張降低這樣的剌激(Balon A J. Management of infantile colic. Amer Pham Physician 1997 ；55 :235-242 ；Lucassen PLB JiAssendelft W J JiGubbels J W， van Eijk T M， vanGeldrop W J， Effectiveness of treatments for infantile colic systematic review. BMJ 1998 ；316 (5) :1563-9 ；and Carey W B，「 Colic" —primary excessive crying as an infant-environmental interaction. Pediatr Clin North Am 1984 ；31 :993-1005)。其它建議包括提早對哭鬧作出反應，或者允許嬰兒哭鬧，提供橡皮奶頭，執行固定的餵食時間表，採用眼神交流和互動遊戲。治療腹痛的藥理幹涉導致利用處方或非處方藥物。目前採用的處方藥物包括顛茄鹼和鎮靜劑(鎮痛劑)，其可以減輕疼痛，但是伴隨的風險包括錐體外系症狀、呼吸阻抑、 和便秘。例如，抗膽鹼能的藥物，其作用類似於阿託品，例如，莨菪鹼(LEVISINE ,或 GASTROSED )和雙環胺泡騰片，會加快心跳，減少唾液的產生，解除腸胃和尿道以及支氣管的痙攣。雖然抗膽鹼能的藥物是唯一在美國市場上用於一直顯示對於嬰兒腹痛有效的處方藥物，不幸的是，有超過5%受治療的嬰兒產生副作用，包括呼吸困難、呼吸暫停、 癲癇發作、暈厥、窒息、昏迷和肌肉張力過低(Williams J，Watkin-Jones R. Dicyclomine worrying symptoms associated with its use in some small babies(BMJ 1984 ；288 901 ；Myers J H,Moro-Sutherland D,Shook J E. Anticholinergic poisoning in colicky infants treated with hyoscyamine sulfate. Am J Emerg Med 1997;15:532-5)。此夕卜， 在服用雙環胺的嬰兒中還有幾例死亡的報導(Garriott J C,Rodriguez R,Norton L E. Two cases of death involving dicyclomine ininfants. Clinical Toxicol 1984 ；22 (5) 455-462)。已報導的對於治療嬰兒腹痛有效的非處方藥物包括幾種鎮靜或催眠藥物，包括超藥理學劑量的(高劑量)苯海拉明(BENADRYL )、苯巴比妥、水合氯醛、甚至酒精。 然而，在患有呼吸疾病的兒童中這些物質可能存在嚴重的副作用，因此限制了它們在治療腹痛中的廣泛應用(Balon A J. Management of infantile colic. Amer Pham Physician 1997；55 :235-242 ；Gurry D.infantile colic.Australian Pham Phys 1994 ；23 (3)337-34632)。比較安全的治療腹痛的非處方藥物主要包括施用西甲矽油或者聚二甲矽氧烷，一種不易吸收的非處方藥，其能減小腸內氣泡的大小。西甲矽油非常安全並且經常被推薦，但是仍然有幾個研究顯示西甲矽油對於嬰兒的腹痛的效果並不比安慰劑的好(Metcalf，T J， etal. ， Pediatrics 1994 July ；94(1) :29-34. Sferra, T J, et al. ， Pediatr Clin North Am 1996 April ；43 (2) :489-510. Danielson, B. et al. ， Acta Paediatr Scand 1985 May ； 74(3) :446-50. Colon,A R，et al. ,Am Fam Physician 1989 December ；40 (6) :122-4)。因此，當今最常用的腹痛治療只是等待嬰兒長大到不會再患腹痛。因此，目前需要一種對於治療嬰兒和幼兒腹痛有效並安全的化合物和組合物以及技術。本發明的組合物和方法，符合這種需要，提供的產品能夠安全而有效地治療與嬰兒腹痛相關的症狀。專利申請EP1364483A10公開了用於治療腸-神經肌肉紊亂例如嬰兒腹痛的益生菌。申請人介紹了幾種不同的細菌種類可以作為益生菌。這與本發明形成對比，本發明的最有效減少腹痛的益生菌是一種特異的乳酸桿菌，其因為有效提高IL-10的水平而被選擇，而不是一個整個的細菌種類，本發明的發明者已經證明在相同種類的不同菌株之間在刺激IL-10產量上具有顯著差異。在2005年，Savino證明在7天的治療中補充路氏乳酸桿菌ATCC55730與採用西甲矽油的標準治療法相比能顯著改善哺乳嬰兒腹痛症狀。採用路氏乳酸桿菌治療的有效率為95%而只採用西甲矽油的嬰兒中僅僅為7%。他在2005年8月31日至9月3日在義大利西恩那召開的會議上將結果提交給了歐洲兒科研究學會(ESPR) (Pediatr Res. 2005 ； 58(2) 411) 0雖然Mvino』 s的結果顯示出有益的效果，他不知道提高IL-10產量的特異菌株與降低腸能動性並因此減少腹痛之間的關係。這裡本發明提供了選擇這樣的最佳菌株的方法。Collins公開了運動功能失調產生的一系列症狀，其能增加腸的各個區域和其附近器官的炎症和免疫激活狀態，例如食道炎、胃炎、和自發性腸炎(IBD)。這些研究表明腸的能動性也受免疫系統的影響。在這種情況下，運動系統可能在腸抵抗存在於內腔中的有害刺激的過程中起到重要作用(Collins S.，The Immunomodulation of Enteric Neuromuscular Function !Implications for Motility and Inflammatory Disorders. Gastroentrology 1996 ；111 :1683-1699)。這種觀點被反映，例如，通過 Vantrappen 等人的研究，其顯示細菌在小腸中過度生長伴隨著小腸中消化運動正常循環模式的瓦角軍(Vantrappen G, Jannssens J, Hellemans J, Ghoos Y.The interdigestive motor complex of normal subjects and patients with bacterial overgrowth of the small intestine. J Clin Invest 1977;9:1158-1168)。很多年前就已知提高IL-10的水平會抑制過度活化的免疫系統。以前還證明了腸能動性受神經信號的控制，該信號與腸內的免疫系統相關聯而腹痛就是腸能動性增加了的結果，例如，由於細菌的過度生長。在工業化國家，早在分娩過程就開始採取衛生措施，其擾亂了初生兒獲取母親腸微生物菌群的能力。結果，不同的微生物菌群在嬰兒體內建立起來。代替受到例如大腸桿菌和乳酸桿菌的保護，在新生兒身體更常有金黃色葡萄球菌和其它皮膚細菌的集群。本發明的發明者出乎意料的發現當皮膚細菌過度生長時會過度活化嬰兒的免疫系統，導致腸能動性的過度活化並導致腹痛的結果，較高數量的特異腸道細菌，例如路氏乳酸桿菌DSM 17938，具有提高IL-10產量的能力，導致TR系統的成熟即CD4+CD25+TR細胞的增殖。CD4+CD25+細胞的上調節導致腸能動性的降低從而對患有腹痛的嬰兒產生有益的效由於這些發現，非病原菌菌株因為提高IL-10的特性而被選擇，並令人驚奇的發現具有這種特性的菌株與減少嬰兒腹痛的關係。因而，本發明涉及採用路氏乳酸桿菌DSM 17938用於製造一種用於預防和/或治療腹痛的醫藥用品，並且以相同的方法選擇的其它菌株。本發明的又一個目的是提供包含所述菌株並且施用給動物，包括人類的產品。其它的目標和優點將通過以下公開和附屬的權利要求而更加清楚。發明概述本發明這裡提供一種特定的乳酸桿菌菌株、一種選擇這樣的菌株的方法、以及包含這樣菌株的產品。其中，該乳酸桿菌菌株由於具有提高IL-10的產量並因此促進 CD4+CD25+TR細胞增殖的能力而被選擇，用於預防和/或治療腹痛。其它的目的和特徵將通過以下說明和權利要求而更加清楚。


圖1表示所選擇的特定的乳酸桿菌菌株在促進CD4+CD25+TR發育過程中的作用。圖加表示通過DC細胞產生IL-10產量的條形圖；圖2b表示通過DC細胞產生IL-10產量的表格。
具體實施例方式皮膚細菌在腸中的集群和缺乏TR細胞而使新生兒免疫系統過度活化，導致腸能動性的過度活化而引起腹痛。大量的特異腸桿菌細胞，例如路氏乳酸桿菌DSM 17938，具有提高IL-10產量的能力，導致TR系統的成熟，即CD4+CD25+TR細胞增殖。以前很多研究者曾報導的其它乳酸桿菌菌株能誘導IL-10的產量例如Rautava等人(前述)。CD4+CD25+細胞的上調節導致腸能動性降低並且因而對腹痛產生有益的效果。令人驚奇的是發現引起細胞因子IL-10水平提高的菌株與能夠降低平均哭鬧時間的菌株是同一菌株(實施例2)。本發明這裡包括已選擇的乳酸桿菌菌株，包括路氏乳酸桿菌(LactcAaciIlus reuteri)DSM 17938，該乳酸桿菌菌株由於具有減輕腹痛的能力而被選擇。包含取自這些菌株的整個細胞或成分的產品例如食物、營養添加劑和組合物、藥物和醫藥設備可以通過本領域公知的方法製備，並且通常包括一種加入了乳酸桿菌-菌株、或者從其中獲得的成分的可吸收支持物。一種在體外的研究方法被用作選擇乳酸桿菌菌株的方法，菌株由於具有刺激 IL-10從單核細胞來源的DCs產生的能力而被選擇，並且因此具有誘導⑶4+⑶25+TR細胞發育的能力(實施例1)。數據顯示IL-10受到特異菌株路氏乳酸桿菌ATCC 55730和路氏乳酸桿菌DSM 17938的有力刺激，並且這種調節是通過這兩種特異菌株在對數/靜止生長期間釋放到培養基中的一種物質介導的。相反，兩種其它的路氏乳酸桿菌菌株不能刺激相應的IL-10產量。為了確認所選擇菌株用於防止或治療腹痛的臨床相關性，在診斷患有嬰兒腹痛的母乳餵養嬰兒中進行了進一步的研究。本發明的特徵將通過參考以下的實施例而更加清楚，但這些實施例不應該被看成是對本發明的限制。實施例1益生菌菌株對於通過單核細胞來源的DC增加IL-10產量的能力的研究將自外周血單核細胞而產生的不成熟的DCs (HiIkens，C. Μ. U.，P. Kalinski， Μ. de Boer, and Kapsenberg. 1997. Human dendritic cells require exogenous interleukin-12-inducing factors to direct the development of naive T-helper cells toward the Thl phenotype. Blood90 :1920)培養在 IMDM 中(Life Technologies, Paisley, U.K.)，該培養基包含10%胎牛血清(HyClone公司，Logan, UT, USA)、重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(Recombinant Human rh GM-CSF) (500U/ml ；荷蘭於登 Schering-Plough 公司)、和重組人白介素-4Q50U/ml ；德國漢諾瓦Pharma Biotechnology 公司)(Kalinski, P. , J. H. N. Schuitemaker, C. M. U. Hilkens, E. A. ffierenga, and Μ. L. Kapsenberg. 1999)。最終成熟的樹枝細胞與對IFN- γ和對桿菌的IL-12誘導子的響應度降低相關聯成熟樹枝細胞在與Th細胞相互作用期間產生IL-12的能力降低 (J. Immunol. 162 :3231)。在本實施例中被檢測的菌株是路氏乳酸桿菌ATCC 55730、路氏乳酸桿菌DSM 17938、路氏乳酸桿菌ATCC PTA 4660和路氏乳酸桿菌ATCC PTA 4964，它們均可以從 ATCC(美國維吉尼亞州馬納薩斯)、和DSMZ(德國布朗斯威克)獲得。菌株被培養在包含 6. 25%綿羊血的哥倫比亞瓊脂中(英國，貝辛斯託克，Oxoid公司)。乳酸桿菌在37°C在5% CO2氣氛中孵育。3天之後，細菌的數目通過在620nm(0D620)處測量光密度而被測定。通常，對於所有待測菌株0D620值0. 35對應著IxlO8克隆形成單位(cfu)。在第6天，由LPS(大腸桿菌，美國聖路易的Sigma-Aldrich公司)誘導不成熟的 DCs使其成熟，在含有細胞因子IL-I β (25ng/mL)和TNF-α (50ng/mL)組合物的存在下測試乳酸桿菌，並且全部用作成熟因子(細胞因子購自美國新澤西洲洛基山的Peprotech公司)。正如Vieira PL等人所描述，由成熟的DCs產生的IL_12、IL_10、和IL-6細胞因子通過⑶40配體表達小鼠漿細胞瘤細胞刺激M小時的方式而被測定(Vieira PL,de Jong EC, ffierenga EA, Kapsenberg ML, Kalinski P. Development of Thl-inducing capacity in myeloid dendritic cells requires environmental instruction. J Immunol 2000 ； 164:4507-12)。M小時之後，收集上清液，並通過ELISA檢測IL-10的濃度。結果見圖2。 從結果可以看到，不同的乳酸桿菌菌株提高DCs產生IL-10的能力是具有顯著差異的。實施例2所選擇的益生菌菌株與西甲矽油在治療嬰兒腹痛的比較兒科及青少年科學部門徵募診斷患有嬰兒腹痛的母乳餵養的嬰兒(Drottning Silvias University Hospital, Goteborg ) 0 患者年齡為 21-90 天，足月分娩，出生重量為2500至4000g，腹痛症狀符合Vessel's標準，並且在登記之前發病差不多6士 1天，被認為可以用於本研究(Wessel MA,Cobb JC, Jackson EB,Harris GS,Detwiler AC. Paroxismal fussing in infancy, sometimes called "colic，，tries 1954;14:421-35)。所有登記的嬰兒嚴格進行母乳餵養從而減少腸內的微生物菌群由於飲食變化而產生變化，這種變化可能轉而影響對益生菌的反應。如果有臨床證據顯示嬰兒患有慢性疾病或腸胃疾病或者在徵募前一個星期接受過抗生素或益生菌，他們將被排除在外。在本研究中，腹痛嬰兒在以下治療中隨機接受益生菌或西甲矽油(Pl)路氏乳酸桿菌菌株ATCC 55730也稱為SD2112，(P2)路氏乳酸桿菌菌株DSM 17938，根據布達佩斯協議於2006年01月30日保藏於德國 DSMZ 微生物菌種保藏中心(Mascheroder Weg lb，D-38124 Braunschweig),(P3)路氏乳酸桿菌菌株ATCC PTA 4660以及(S)西甲矽油。路氏乳酸桿菌以IO8克隆形成單位(CFU)的計量添加在5滴有商業出售的MCT-油 (中鏈甘油三酸酯)中懸浮30分鐘之後餵食，一天一次時間為觀天。MCT油是天然發生的，最豐富的來源是椰子油。絕大多數MCT油是從椰子油中精煉而來。MCT油是清亮的、且無味的、低黏度的液體。這種油的懸浮液在2 8°C能穩定21個月(根據製造商的文獻， 瑞典斯德哥爾摩，Biofeiia AB公司)(可替代的MCT油來源是瑞典卡爾斯哈門，Biofeiia AB 公司)。在研究過程中，父母被指導在不使用產品時將其放在冰箱中。西甲矽油(S)的施用劑量為 60mg/天，以 3mL 市售溶液(Mylicon Infants Gas Relief Drops, J&J, 7050Camp Hill Rd. ,Fort Washington，Pennsylvania，19034-2210，USA)，在餵食後施用，一天兩次共觀天。在登記冊的所有母親被要求遵守如報導的無牛奶飲食避免牛奶，酸乳酪，新鮮的和幹的奶酪，奶油，黃油，餅乾。在所有治療期間對食譜的堅持通過飲食日記被監控。在第7、 14,21和28天研究者會檢查這個食譜的堅持情況。研究所的道德委員會同意本研究的各項條件而只有在獲得了父母的書面同意書之後嬰兒才參與到這項研究中。隨訪兒科醫生首次見到嬰兒的時間定為第一天(Day-I)。在這個場合，嬰兒進行醫學檢查而父母被接見以獲得涉及分娩類型、出生體重和妊娠年齡、家族腸胃病歷史和遺傳性過敏症等的背景數據。特別是，如果嬰兒的一個或更多家庭成員(母親、父親和/或年長的兄姐)患有過敏性溼疹、過敏性鼻炎或哮喘的話，最後一項認為是陽性的。而且，在研究期間任何遺傳性過敏疾病的信號和症狀都會被記錄。父母還被要求在徵募第O天(Day 0)之後記錄每天平均哭鬧次數和腹痛情節數量。醫生將嬰兒隨機分配至任何研究小組。研究產品在第一天(Day 1)開始施用。父母被要求採用固定的筆記本從第0天到第觀天書面寫下研究的信息並且被要求記錄每天傷心哭鬧情節的數量和持續時間、大便粘度和頻率以及任何所觀察到的副作用 (便秘、嘔吐、感染反應等)。為了確保所有的父母以相同的方式記錄哭鬧時間並確保嬰兒被正確的給予醫藥製品，研究者之一總是與父母保持電話聯繫以幫助父母。每個患者在第1，7，14，21和觀天由同一名兒科醫生再次檢查。MM所登記的120名母乳餵養的腹痛嬰兒中，30名隨機的採用路氏乳酸桿菌ATCC55730 (Pl)治療，30名隨機的採用路氏乳酸桿菌DSM 17938 (P2)治療，30名隨機的採用路氏乳酸桿菌ATCC PTA4660(P3)治療並且30名隨機的採用西甲矽油(S)治療。沒有嬰兒退出，因為沒有任何與實驗相關的副作用。各小組的年齡、出生體重、性別、分娩類型、過敏或腸胃疾病家族史、以及被動吸菸等方面相似。在第0和第1天，各治療小組的每天平均哭鬧時間是相似的。接受路氏乳酸桿菌 ATCC 55730 (Pl)和DSM 17938 (P2)的嬰兒在第7天的日常哭鬧時間與接受ATCC PTA 4660 和西甲矽油( 的嬰兒相比顯著減少。在第14、21和觀天這四個治療組的哭鬧時間顯著不同。在觀天中，(Pl)和(S)之間平均每天哭鬧時間的差異從開始到研究結束是82分鐘，(P2)和(S)之間平均每天哭鬧時間的差異從開始到研究結束是83分鐘(表1)。從結果可以看到四個小組在接受治療產品之前基本上是一致的。7天之後路氏乳酸桿菌菌株 ATCC55730和DSM 17938的效果比另外兩種添加劑的具有清楚的差異。觀天之後差異更加巨大。表1.路氏乳酸桿菌和西甲矽油小組的哭鬧時間(平均分鐘/天)
權利要求
1.一種能夠促進人體IL-10表達的乳酸桿菌菌株在製備用於減少嬰兒腹痛的含有乳酸桿菌菌株的藥物中的應用，其中，所述乳酸桿菌菌株通過測試能夠促進宿主細胞IL-10 表達的乳酸桿菌菌株以及通過選擇能夠提高宿主細胞IL-10水平的乳酸桿菌菌株予以鑑定；如果宿主細胞是人細胞，則是間接體內療法。
2.如權利要求1所述的應用，其中，所述乳酸桿菌菌株是一種路氏乳酸桿菌菌株。
3.一種用於製備組合物的方法，所述方法包括下列步驟(a)培養一種乳酸桿菌菌株；(b)評價所述乳酸桿菌菌株對宿主細胞IL-10表達的效果；(c)選擇提高宿主細胞IL-10水平的乳酸桿菌菌株；以及(d)產生包括由步驟(c)所選擇的所述乳酸桿菌菌株的一種生物純培養物的組合物； 其中，所述組合物適合於給藥嬰兒，以減少嬰兒腹痛；如果宿主細胞是人細胞，則是間接體內療法。
4.一種用於減少嬰兒腹痛的產品，包括一種由權利要求3獲得的組合物。
5.如權利要求4所述的產品，其中，在所述組合物中的乳酸桿菌菌株是路氏乳酸桿菌菌株。
6.如權利要求4或5所述的產品，還包括中鏈甘油三酸酯油。
7.一種用於減少嬰兒腹痛的藥用產品，包括能夠提高IL-10水平而被選擇的乳酸桿菌菌株。
8.如權利要求7所述的藥用產品，其中，所述乳酸桿菌菌株是路氏乳酸桿菌菌株。
9.一種乳酸桿菌菌株，所述乳酸桿菌菌株能夠促進人體IL-10表達以減少嬰兒腹痛。
10.如權利要求9所述的乳酸桿菌菌株，其中，所述乳酸桿菌菌株是路氏乳酸桿菌菌株。
全文摘要
本發明提供了所選擇的特定乳酸桿菌菌株、一種選擇這樣的菌株的方法，以及包含這樣菌株的產品，其中，該菌株能提高IL-10的產量從而使CD4+CD25+TR細胞增殖而被選擇，並且用於預防和/或治療嬰兒腹痛。
文檔編號C12Q1/04GK102488717SQ20111043210
公開日2012年6月13日 申請日期2007年5月30日 優先權日2006年6月5日
發明者埃蒙·康諾利, 布·莫爾斯泰姆 申請人:生命大地女神有限公司