白點症杆狀病毒的鑑定、純化及檢測的製作方法

2023-05-07 02:40:11

專利名稱：：白點症杆狀病毒的鑑定、純化及檢測的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種感染節肢動物，特別是蝦類的新病毒性病原體的鑑定、純化及檢測。該病毒命名為WSBV(白點症杆狀病毒)。近年來，由於疾病的爆發造成亞洲國家的養殖蝦類大量死亡。自1992年起，在臺灣北部爆發一種新的疾病，造成養殖的斑節蝦(Penaeusjaponicus)族群嚴重死亡，此病的特徵為患病蝦體的頭胸甲、附肢及蝦體內面表皮組織會出現明顯的白點，並且發病後2至7天內的死亡率達100％。患病的蝦體通常活動力減弱，肝胰腺略紅。1993年間，白點症亦出現於臺灣的養殖草蝦(P.monodon)及紅尾蝦(P.penicillatus)，目前已有學者針對白點症所造成的危害提出報導(董明澄等，個人報導)在日本，有關斑節蝦的疫情報導亦有類似發現(Nakanoetal.，FishPathology，29(2)135-139，1994)。根據電子顯微鏡的觀察及以病蝦淋巴組織濾液進行的感染試驗結果顯示，造成白點症的病原體為一桿狀病毒，暫稱之為RV-PJ，(rod-shapednuclearvirusofPenaeusjaponicus)(Inouyeetal.，FishPathology，29(2)149-158，1994；Takahashietal.，FishPatyhology，29(2)121-125，1994)。目前養殖對蝦類普遍受到杆狀病毒感染的事實已有明確報導(Lightneretal.，Aquaculture，32209-233，1983)。在這些感染對蝦類的杆狀病毒中，以monodonbaculovirus(MBV)，baculoviralmid-gutnecrosisvirus(BMNV)及Baculovirus(MBV)，baculoviralmid-gutnecrosisvirus(BMNV)及Baculoviruspenaei(BP)最為重要，因其感染養殖蝦類而造成嚴重損失(Couch，Nature247(5438)22-231，1974；J.Invertebr.Pathol.，24311-331，1974；Lihgtneretal.(1983)，supra；Lightneretal.，1987；Sanoetal.，FishPathology，15185-191，1981)。自然界中患白點症的蝦體組織內可觀察到杆狀病毒的存在(董明澄等，個人報導)。此病毒極可能是造成臺灣養殖對蝦類白點症的主要致病原。為避免此病毒的擴散，造成養殖蝦類因白點症的危害而導致經濟上嚴重損失，實在需要發展鑑定致病原及診斷的方法，以期在不犧牲檢測個體的狀況下，能以方便、精準又不費時的方法檢測白點症。本發明是基於一種引起對蝦白點症的新病原的發現。此病原已被分離及純化，為一種無包含體杆狀病毒粒子，具有包膜，長約330±20nm，直徑約87±7nm。此病毒被認定為杆狀病毒科(Baculovirdae)，裸杆狀病毒亞科(Nudibaculovirinae)，無包含體杆狀病毒屬(NOB，Non-OccludedBaculovirus)的一員，本發明所分離的病毒被稱為PmNOBIII，而與白點症相關的病毒則稱之為WSBV(白點症杆狀病毒)。WSBV的基因組DNA文庫已被建立，並基於其中一段克隆的DNA片段序列設計出一對WBSV專一性引物對，用於通過PCR反應檢測對蝦類WSBV的侵染。以此WSBV專一性引物對進行PCR反應的結果顯示，不同蝦種白點症的致病原事實上是密切相關的。因此本發明的結果提供了一有效的檢測工具，適用於篩檢動物宿主生物體特別是蝦類中的白點症杆狀病毒的傳染，所以本發明的使用對於防止此病毒性疾病的蔓延是相當重要的。一個簡易、靈敏、專一性高又立即可用於診斷的產品，其中包括基於一個獨特的白點症杆狀病毒基因組DNA克隆的核苷酸序列所設計的引物對，可被發展成檢測白點症杆狀病毒的存在及防止此病毒性疾病蔓延的工具。本發明的特徵和優點將通過參照附圖對優選實施方案的描述而變得清楚明了。附圖的簡要說明圖1為患白點症草蝦(P.monodon)的照片，示出白點由不易辨到直徑約3mm不等。比例尺1cm。圖2為觀察白點症草蝦頭胸甲外骨骼下的角質狀表皮(C)等組織的光學顯微鏡照片，有分解現象的細胞其細胞核脹大並呈現許多嗜鹼性包含體(箭頭所指處)。比例尺10μm。圖3為白點症草蝦頭胸甲外骨骼下的角質狀表皮(C)等組織的透射電鏡照片，示出在壞死區域脹大的細胞核中有病毒粒子存在(箭頭所指處)。比例尺0.5μm。圖4示出以病草蝦組織過濾液人工感染斑節蝦(P.japonicus)後，在其表皮組織所出現的杆狀病毒粒子。比例尺200nm。圖5為以負染法觀察患病草蝦表皮組織濾液沉澱物中的杆狀病毒粒子的顯微照片。比例尺50nm。圖6示出人工感染斑節蝦剝離的頭胸甲，上有明顯白點(箭頭所指)。圖7示出人工感染斑節蝦(平均體重0.08g)的累計死亡率(％)。實驗組浸泡於病草蝦及病斑節蝦的組織過濾液中，對照組則以健康草蝦組織過濾液浸泡。圖8為以透射電子顯微鏡觀察純化的病毒粒子(負染法)，病毒粒子一端延伸出尾狀凸出物(tail-likeprojection)(P)。比例尺0.1μm。圖9為以透射電子顯微鏡觀察純化的病毒粒子(負染法)，顯示由病毒衣殼蛋白環狀亞基所形成的橫紋，此環狀排列與病毒衣殼長軸垂直。比例尺0.1μm。圖10為由純化病毒提取的PmNOBIIIDNA的溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠上顯示出病毒的單一DNA分子。泳道1為分子量標記(λ/HindIIIDNA片段標記物)；泳道2-4為三次分別純化的PmNOBIIIDNA。圖11為PmNOBIIIDNA以三種限制性內切酶酶切後的瓊脂糖凝膠電泳(經溴化乙錠染色)。凝膠上至少有22個片段。泳道1λDNAHindIII片段標記物；泳道2PmNOBIIIDNA以HindIII酶切的片段。泳道3PmNOBIIIDNA以SalI酶切的片段。泳道4PmNOBIIIDNA以XhoI酶切的片段。泳道51kbDNA梯。圖12示出蝦基因組DNA經PCR反應擴增的18SrDNA片段，經DNA電泳分析及溴化乙錠染色後的瓊脂糖凝膠。反應使用用於節肢動物18SRNA高保守區序列的引物143F，145R，以健康蝦DNA為模板進行PCR反應擴增出一848bp的DNA片段(泳道2)。泳道1pGEMDNA分子量標記物。DNA分子量標記物的大小單位為鹼基對(bp)。圖13示出了以蝦類DNA專一性引物對143F，145R，進行PCR反應，檢測WSBV基因組DNA製備物中是否夾雜蝦DNA的定性分析。PCR反應產物以1％凝膠電泳分析，PCR擴增產物若出現848bp的片段則代表存在蝦DNA的汙染。泳道1pGEMDNA分子量標記物。泳道2-6以各白點病杆狀病毒(WSBV)基因組DNA為模板進行PCR的擴增產物。泳道7-8以健康草蝦DNA為模板進行PCR的擴增產物。泳道9無DNA模板所進行PCR的擴增產物。標記物DNA片段的大小單位為鹼基對(bp)。圖14示出WSBV基因組以SalI酶切割的片段。WSBV基因組DNA以SalI在37℃下作用3小時，取5μl以0.8％凝膠電泳分析，並用溴化乙錠染色，顯示出片段由15kb到1kb不等(泳道2)，自相同反應物中取20μl進一步建立白點症杆狀病毒(WSBV)的基因組文庫。泳道1λ/HindIII片段標記物。DNA分子量標記物的大小單位為鹼基對(bp)。圖15A表示以SalI酶切的1461bp片段的克隆於pms146質粒的位置圖。圖15B示出用於PCR反應的引物在SalI-1461bpDNA片段上的位置。146F1及146R1引導1447bp片段的擴增，而146F2及146R2則引導941bp片段的擴增，SalI1461bpDNA片段中的兩個EcoRI酶切位點也在圖中示出。圖15C示出SalI-1461bp片段的詳細的核苷酸序列，其中也示出兩個引物對(146F1/146R1，146F2/146R2)以及兩個EcoRI酶切位點。圖15D示出由SalI-1461bp片段所設計的六個引物對的核苷酸序列。圖16示出由蔗糖密度梯度離心純化的WSBV病毒DNA為模板進行PCR反應，所擴增的WSBVDNA片段及蝦類DNA特異性片段。泳道2，5，8，11的反應所使用的為WSBV專一性引物對143F1/146R1，擴增出一1447bpDNA片段。泳道3，6，9，12進行PCR反應所使用的為蝦類DNA專一性引物對143F/145R。泳道4，7，10，13則使用143F/145R及146F1/146R1引物對同時反應。PCR擴增產物均以1％瓊脂糖凝膠電泳分析。泳道1pGEMDNA分子量標記；泳道2-4以病蝦(1#)表皮組織所純化的病毒的DNA為模板進行PCR反應的擴增產物，示出蝦類DNA帶和WSBVDNA帶。泳道5-7以病蝦(2#)表皮組織所純化的病毒的DNA為模板進行PCR反應的擴增產物，顯示只擴增出WSBVDNA帶。泳道8-10以病蝦(2#)肌肉組織所純化的病毒的DNA為模板進行PCR反應的擴增產物，顯示擴增出集中的蝦類DNA帶和WSBVDNA帶。泳道11-13以健康蝦DNA為模板進行PCR反應的擴增產物，顯示只擴增出蝦類DNA帶。DNA分子量標記物的大小單位為鹼基對(bp)。圖17顯示由pms146質粒或患白點症的草蝦DNA為模板進行PCR反應所擴增的WSBV及蝦類專一性DNA的片段。泳道2，5，8，11所使用的引物為WSBV專一性引物146F1，146R1，所擴增的產物大小為1447bp，泳道3，6，9，12使用專一於1447bp片段的內部引物146F2，146R2，所擴增的產物大小為941bp，泳道4，7，10所使用的是蝦類DNA專一性引物143F，145R，所擴增的產物大小為848bp。以上擴增產物均以1％瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析。泳道1pGEMDNA分子量標記物，泳道2-4pms146質粒DNA，泳道5-7自然患病草蝦的DNA提取物，泳道8-10自然患病斑節蝦的DNA提取物，泳道11-12為不加模板反應的對照組。DNA分子量標記物的大小單位為鹼基對(bp)。圖18顯示以人工感染WSBV的病草蝦DNA為模板進行PCR反應所擴增的WSBV及蝦類專一性的DNA片段。PCR反應使用引物146F1，146R1，其所擴增的產物大小為1447bp，擴增產物以1％瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析。泳道1pGEMDNA分子量標記物，泳道2-4分別為以三尾人工感染的草蝦DNA為模板進行PCR所擴增的產物，泳道5-7分別為以三尾健康草蝦DNA為模板進行PCR所擴增的產物。DNA分子量標記物的大小單位為鹼基對(bp)。圖19為WSBV感染的健康草蝦的DNA與DIG標記的1447bpPCR產物進行的斑點雜交反應。將兩尾受WSBV感染的病蝦DNA(1，2)及兩尾健康蝦DNA(3，4)以雙份(A，B)點在Hybond-Npaper上，接著以DIG標記的1447bpPCR產物片段為探針進行斑點雜交反應，此探針只與受感染的蝦的DNA雜交，而不與健康蝦DNA雜交。圖20為來自患病草蝦或斑節蝦的WSBVDNA與DIG標記的1447bpPCR產物進行的Southern雜交。來自草蝦或斑節蝦的WSBVDNA以SalI酶切後，轉印至Hybond-Npaper上並以DIG標記的1447bpPCR產物進行探測。結果顯示探針以相同的強度與由草蝦或斑節蝦來源的WSBVDNA經SalI酶切後的1461bp片段雜交，因此顯示它們密切的相關性。A以溴乙錠染色的0.8％瓊脂糖凝膠，B凝膠(A)的Southern印跡的放射自顯影圖。泳道1pGEMDNA分子量標記物，泳道2由草蝦分離純化的WSBV的基因組DNA的SalI酶切片段，泳道3由斑節蝦分離純化的WSBV基因組DNA的SalI酶切片段。圖21示出以疫區收集的節肢動物的DNA為模板，並利用WSBV專一性引物對146F1/146R1進行的PCR擴增反應。泳道1pGEMDNA分子量標記物，泳道2草蝦，泳道3斑節蝦，泳道4螃蟹，泳道5橈足類，泳道6昆蟲(水蠅科)，泳道7正反應對照組，DNA來自己知的病蝦，泳道8負反應對照組，樣品末加模板。臺灣的養殖對蝦近來相繼爆發病害，造成經濟上的嚴重損損，其中包括草蝦(Penaeusmonodon)、斑節蝦(P.japonicus)、紅尾蝦(P.penicillatus)等。其共同病徵為頭胸甲、附肢及蝦體內表面上出現明顯白點。為鑑定造成對蝦白點症之病原體，使用電子顯微鏡觀察患病的蝦體組織。取具有明顯白點患病草蝦及斑節蝦的表皮萃取液浸泡不同大小的健康斑節蝦，進行感染實驗。利用電子顯微鏡觀察人工感染或自然感染的患病斑節蝦，均發現一種無包含體的杆狀病毒粒子存在於病蝦的表皮組織中。此病毒粒子具包膜，長約330±20nm，直徑約87±7nm。這些人工感染的蝦很象自然感染的蝦。將含此病毒的濾液直接接種於魚類細胞株，未發生細胞病變的現象。在人工感染實驗中，累計死亡率在5-7天內高達100％，且實驗蝦易受撈捕及溫度改變等緊迫因子影響而死亡。由於自然界中患病的病蝦與人工感染的病蝦的病徵及所見到的病毒形態非常相似，因此可判斷此杆狀病毒是造成臺灣養殖對蝦白點症的主要病原體，因此，這種病毒性疾病被命名為「白點症」(W.S.S)，而此病原體的分類地位則以進一步研究分離自患W.S.S病草蝦的病原體(白點症病毒)來判定。所述的病原體自患白點症的草蝦純化得到。此病毒粒子以負染法觀察時是多態的，呈橢圓形或紡錘形或杆形，長約250-380nm，最寬處約70-150nm，部分病毒粒子的一端具有尾狀凸出物。病毒衣殼是由亞基環繞相疊而成，呈現與病毒衣殼縱軸垂直的特殊橫紋狀。病毒基因組為雙鏈DNA分子，經由HindIII酶切後，至少可分為22個片段，總長約150kb，基於形態特徵及基因組結構，可確認此病毒屬於杆狀病毒科(Baculoviridae)，裸杆狀病毒亞科(Nudibaculovirinae)，無包含體杆狀病毒屬(Non-OccludedBaculovirus)，因此稱最近所分離的病毒為PmNOBIII，而與PmNOBIII相關的病毒則稱為WSBV(白點症杆狀病毒)。目前推測和PmNOBIII相類似的WSBV包括在大陸地區於1993-1994年間所發生的EEDS致病原—皮下及造血組織壞死杆狀病毒(hypodermalandhematopoieticnecrosisbaculovirus，HHHNBV)(Caietal.，J.Fish.China，19112-117，1995)以及發生於泰國地區養殖草蝦的系統性外胚層及中胚層組織杆狀病毒(Systematice.ctodermalandmesodermalbaculovirusSEMBV)，(Wangetal.，Dis.aquat.Org.，23239-242，1996；Wongteerasupayaetal.，Dis.aquat.Org，2169-77，1995)這種新病毒疾病的主要臨床症狀為病蝦的外骨骼及表皮上出現明顯白點或白斑，白點大小從肉眼幾乎不可見到直徑3mm不等，從病理組織學的研究可證明WSBV主要攻擊的部位是角質狀表皮，在這些病灶組織中可發現許多細胞核脹大的細胞(Momoyamaetal.，FishPathol.，29141-148，1994，Chouetal.，Dis.aquat.Org.，23165-173，1996；C.H.Wangetal.，1995)，因此對蝦類的白點症可確知是由無包含體杆狀病毒所引起的，在前期研究中，本發明人以從草蝦中分離的WSBV為起始材料以開發一種檢測蝦中WSBV的診斷工具。為發展檢測蝦體是否受WSBV及相關病毒體感染的準確診斷法，本實驗室由受WSBV嚴重感染的草蝦組織中純化出病毒粒子，並由純化的病毒粒子提取基因組DNA，其中包括用蛋白酶K及十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)處理病毒粒子、苯酚—氯仿萃取、酒精沉澱等步驟。所純化的病毒DNA以蝦類DNA專一性引物對進行PCR定性檢測，以確定其中無蝦DNA的汙染，並以此病毒DNA建立WSBV基因組文庫且由克隆的DNA片段的序列設計出一套專一性引物。以此套專一性引物對含有WSBVDNA的樣品進行PCR反應，結果正如預期的出現一約1447bp的DNA片段，而健康蝦的DNA樣品則不出現此片段，所以肯定了此套引物對於WSBVDNA的專一性。由於患白點症之不同蝦種，均能以此套WSBV專一性引物以PCR反應檢測出，因此可證明不同蝦種白點症的病原是很相近的。至於其他生物，如橈足類、蟹類及昆蟲等以此套引物進行PCR反應均出現正反應。本發明結果提供了節檢蝦體是否受WSBV感染的有效檢測工具，這對於防止此病毒性疾病的擴散是相當重要的。材料與方法蝦類來源作為感染試驗的健康斑節蝦取自於臺灣南部一不曾出現病毒性疾病的斑節蝦繁殖場。所有斑節蝦均飼養於水族箱，水溫25-28℃，充分曝氣並每日二次餵食人工飼料。患病的斑節蝦得自於臺灣北部的養殖場，而患病垂死的草蝦(平均重量30g/每尾)則於1994年11月收集自臺灣南部的養殖場。所有樣品均以解剖、光學顯微鏡及電子顯微鏡觀察，以確定此病症，所使用的方法詳述如下光學顯微鏡觀察正常蝦及具有白點的斑節蝦先以Davison’s固定液浸泡(BellLighter1988)，固定48小時後，將樣品轉移至50％酒精中，然後進行脫水、包埋、切片等過程製成5μm石蠟切片，並以HemtaoxylinandEosin(HE)染色。透射電子顯微鏡觀察取自然或人工感染斑節蝦頭胸甲下方、鰓部上方的表皮組織，立即以2.5％戊二醛(於0.1M冷磷酸緩衝液中，pH7.4，PBS)於4℃浸泡2小時，之後用冷PBS清洗數次，再用1％四氧化鋨4℃固定3小時，接著進行脫水過程並以Spurr’s樹脂包埋。使用Richert-jungUltracutEUltrome進行超薄切片，續以乙酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色，觀察時則使用HITACHIH-600透射電子顯微鏡。感染試驗負染法觀察病毒粒子取病草蝦表皮組織與海水在4℃下勻漿(組織∶海水＝1∶9)，之後以8510×g離心5分鐘(Sigma2K15rotor12141)，上清液用0.45μm濾膜過濾，濾液再14549×g離心1小時，(Sigma2K15rotor12139)，得到的沉澱物用滅菌海水懸浮，作為負染之用。負染時取1滴懸浮液加上4滴0.1％牛血清白蛋白和2％磷鎢酸(1∶2；pH7.0)混合液，將此混合物置於300目載網上，30-60分鐘後以濾紙吸去多餘液體待其乾燥後進行電鏡觀察，所使用的透射電子顯微鏡為HITACHIH-600透射電子顯微鏡。細胞病理分析先將EPC(epithliomapapulosumcyprini)，CHSE-214(chinooksalmonembryow)，FHM(fatheadminnow)，SSE-5(sockeyesalmonembryo)等細胞接種於24孔的微滴定板上，病蝦表皮組織過濾液則以5倍連續稀釋成1/20至1/12500等倍數，用稀釋的濾液直接與上述四種魚類細胞株共同培養，培養溫度為20℃，共培養觀察4星期。感染試驗使用病蝦表皮組織濾液用海水稀釋500-750倍後以浸泡方式進行，蝦體為活的或冰凍過的自然感染的病斑節蝦和草蝦。實驗時將35尾斑節蝦浸泡於稀釋濾液中2小時(所使用的蝦年齡為一個月，平均體重0.08g)，對照組則浸泡於健康草蝦表皮組織濾液或Grace昆蟲培養液中。浸泡感染後的斑節蝦飼養於玻璃水族箱中，水溫25-28℃，鹽度維持25-30ppt，並充分打氣。每日觀察並計算死亡率，同時收集垂死蝦體以透射電子顯微鏡觀察研究。WSBV的純化、基因組構造及分類地位由草蝦分離純化WSSV病毒粒子的方法如下，蝦體先用冰的一倍TE緩衝液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH7.6)潤溼體表，由一到五隻活蝦或冰凍蝦體取下的外骨骼及其下表皮，加入20毫升冰的萃取緩衝液(20mMHEPES，0.4NNaCl，1mMEDTA，1mMEGTA，1mMDTT，2.5mM苯甲基磺醯氟、1μg/ml亮抑酶肽、1.6μg/ml抑胃酶肽，2μg/ml抑蛋白酶肽，1μg/ml苯丁抑制素)進行萃取，接著使用重量百分比35％到65％梯度濃度的遮糖溶液，進行74,700xg(HitachiSRP285rotor24,000rpm)超高速離心一小時。將梯度中段肉眼可見的病毒層移出，並在4℃下以74,700xg離心30分鐘，沉澱物用冰的一倍TE緩衝液洗兩次，視沉澱物的大小以300到500毫升不等的冰的一倍TE緩衝液重新溶解，並且立刻進行病毒DNA的提取，另取一小部分純化的病毒懸浮液用2％磷鎢酸(PTA)(pH＝7)進行負染，用做病毒粒子超微結構的研究。從蔗糖梯度濃度純化出的病毒粒子，進行病毒基因組DNA的提取，使用蛋白酶K及N-十六烷基-N，N，N-三甲基溴化銨(CTAB)處理後用苯酚-氯仿萃取及酒精沉澱(Wilson(1994)，PreparationofgenomicDNAfrombacteria.MiniprepofbacterialgenomicDNA.inAusubel，F.M.etal(.(eds.)CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.1.GreenePub.Assoc.andWiley-Interscience，NY，p.2.4.1-2.4.5)。利用限制性內切酶酶切分析，估算病毒基因組的大小。病毒DNA利用限制性內切酶HindIII，SalI及XhoI(BoehringerMannheimCompany)酶切之後，酶切片段在0.8％瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，其中緩衝液為含0.5μg/ml溴化乙錠的Tris-乙酸緩衝液(0.04MTris乙酸鹽，0.1mMEDTA，pH8.0)，並同時使用1kb的DNA梯及HindIII片段二種標記物(LifeTechnlolgies，Inc.)做為估算DNA大小的參考標準。有效診診斷工具的開發為了開發有效的診斷工具，以從病毒粒子中提取的「超純」WSBV基因組DNA為材料，構建WSBV基因組文庫，並且使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增選定的DNA片段，此方法是證明病原存在與否的非常有利的診斷工具。(Erlichetal.，Nature331461-462，1988；Oste，C.，Biotechniques6162-167，1988)。依據克隆的WSBVDNA片段序列，設計了一組專一於WSBV的PCR引物對。I.WSBV基因組文庫的構建A.病毒純化及病毒DNA的提取利用與分類研究同一批的冰凍感染病毒草蝦做為純化病毒的材料，這株WSBV病毒依據Franki等人(Arch.Virol.，21-450，1991)的標準命名為PmNOBIII(thethirdnon-occludedbaculovirusreportedfromP.monodom)。純化病毒的方法如前文所述。病毒基因組的提取是將純化的病毒粒子用蛋白酶K及N-十六烷基-N，N，N-三甲基澳化銨(CTAB)處理，並用苯酚-氯仿萃取及酒精沉澱(Wilson(1994)，supra)。簡單說明如下，梯度純化出的病毒粒子，在含有100mMKCl，1％SLS(N-十二烷基肌氨酸)及0.2mg/ml蛋白酶K的TE緩衝液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH7.6)中置於65℃下溫育三小時。之後加入5MNaCl使DNA溶液中NaCl的濃度達到0.7M，再緩慢加入十分之一體積的CTAB/NaCl(10％CTAB於0.7MNaCl中)，充分混勻後置於65℃溫育十分鐘。經二次等體積的氯仿/異戊醇提取之後，再進行二次等體積的苯酚/氯仿/異戊醇萃取，DNA以二倍體積的100％乙醇進行沉澱，之後以冰的70％乙醇清洗。乾燥的DNA沉澱溶於適量的0.1倍TE緩衝液中，65℃下水浴30分鐘，然後保存於4℃直到使用。B.蝦DNA的製備，以供做PCR反應的對照組為了監測WSBV基因組DNA純化的過程中是否遭受蝦DNA的汙染，因此設計一組專一於蝦基因組DNA的PCR引物對。為了這個目的，搜尋電腦資料檔案(GenBank，NationalIustituteofHealth，MD，U.S.A)中已發表的十足類基因序列(KimAbeleJ.Crust.Biol.10，1-13，1990)，以PC/GENE程序(Intelligenetics，Inc.)進行序列對比分析，在18SrRNA序列中高度保守的區域設計二個引物，143F正向引物(5』-TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG-3』，N表示G、A、T或C)及145R反向引物(5』-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3』)。通過二者配對以供PCR反應的進行，蝦DNA如預期產生了長848bp的PCR產物，相對於P.aztecus18SrRNA的核苷酸序列中第352到第1200位核苷酸。以健康草蝦及斑節蝦肌肉提取的基因組DNA為PCR反應的正對照。提取去蛋白質的蝦基因組DNA的方法，是依照提取哺乳動物組織的基因組DNA的方式進行(Strauss，WM(1994)，PreparationofgenomicDNAfromMammaliantissue.InAusubel，FM，BrentR，KingstonRE，MooreDD，SeidmanJG.SmithJA，StruhlK(ED.s)CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.1.GreenePublishingAssociatesInc.andJohnWileyandSons，Inc.，NewYork，p.2.2.1-2.2.3)。簡單說明如下，從蝦腹部切下重約200毫克的肌肉組織後，置入液氮中急速冷凍並磨碎成粉末狀，處理過的組織加入2.4毫升消化緩衝液(100mMNaCl，10mMTris-HCl，pH8，25mMEDTA，pH8，0.05％十二烷基硫酸鈉，0.1mg/ml蛋白酶K)並置於65℃水浴12到18小時。消化之後利用苯酚/氯仿/異戊醇萃取以去除蛋白質，並以酒精沉澱DNA，DNA乾燥後用0.1倍TE緩衝液重新溶解，置於65℃水浴30分鐘，然後保存在4℃下直到PCR反應時使用。C.構建WSBV基因組文庫如下構建兩個WSBV基因組文庫PmNOBIII(pms)及PmNOBIIIHindIII(pmh)無蝦體DNA汙染的WSBV基因組DNA，用SalI或HindIII限制酶(BRL，LifeTechnologiesInc.)在37℃下作用3小時，以得到DNA片段，利用T4連接酶將這些DNA片段與已被SalI或HindIII酶切的pUC19質粒載體進行連接反應，16℃下反應過夜。得到的質粒DNA轉化EscherichiacoliDH5α感受態細胞，並塗布在氨苄青黴素/異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳吡喃糖苷(X-gal)瓊脂培養基上。以小量製備法篩選抗氨苄青黴素的白色轉化子，以確定是否得到適當的重組質粒，之後用雙鏈DNA模板、測序試劑盒(UnitedStatesBiochemicalCorp.)及M13/pUC測序引物(GIBCOBRLLifeTechnologies)測定插入的DNA片段的兩條鏈的序列，並接著設計序列內具有專一性的引物。從轉化子中分離出重組質粒，利用SalI或HindIII酶切篩選插入片段的在與否。插入片段的大小列於表1。II.利用由純的WSBV病毒粒子提取的DNA擴增WSBVDNA片段寡核苷酸引物(146F及146R)用於擴增WSBVDNA片段。引物146F及146R的設計是依據一段來自於重組質粒pms146的克隆的WSBV1461bpSalIDNA片段的序列，在這段DNA片段中設計了六對引物，如圖15D所示。146R1及146F1引物對的序列如下146R1，5』-TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA-3′；146F1，5』-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3』，利用這對引物，預期可從WSBV基因組DNA中擴增出一段1447個鹼基對的DNA片段。而內部的引物對146R25』-TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT-3』及146F25』-GTAACTGCCCCTTCCATCTCC-3』則用於確定擴增片段的確來自WSBV941bp的SalIDNA片段。PCR反應中用來測定引物專一性的DNA模板是用從純的WSBV病毒粒子及健康蝦肉中提取的去蛋白的DNA樣品。III.由自然感染及人工感染WSBV的蝦體中提取的DNA進行WSBVDNA片段的擴增反應病蝦包括自然感染及人工感染WSBV的蝦體。人工感染是指健康蝦(平均體重0.5克)利用前述的方法感染WSBV，感染五天後取三隻人工感染的蝦及三隻健康蝦提取其DNA，並用專一於WSBV的引物對(146F1及146R1)與專一於蝦DNA的引物對(143F及145R)進行PCR檢測反應。IV.PCR擴增反應及產物分析進行擴增反應的去蛋白DNA樣品用量約0.1-0.3μg，最後的反應混合物體積為100μl，其中包含10mMTris-HCI，25℃時pH9，50mMKCl，1.5mMMgCl2，0.1％TritonX-100，每種dNTP200μM，每種引物100pmol及2.5單位的TaqDNA聚合酶(Promega)。擴增反應由AG-9600ThermalStation(BiotronicsCorp.)完成，其反應程序為94℃4分鐘，55℃1分鐘及72℃3分鐘一個循環，94℃1分鐘，55℃1分鐘及72℃3分鐘39個循環，共40個循環後再72℃5分鐘。每次PCR反應的對照組中均不加入DNA模板，有些PCR反應的對照組則在反應混合物中還加入提自健康蝦的DNA，PCR產物利用含有0.5μg/ml溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠電泳分析，在UV光照射下可用肉眼辨認。V.利用DIG標記的1447bp的PCR產物與提取自WSBV感染草蝦或健康草蝦的DNA進行斑點雜交反應將從WSBV感染草蝦或健康草蝦提取的DNA利用96孔斑點印跡真空過濾裝置(SchleicherandSchuellInc.)點在Hybond-Npaper上，自然乾燥後用1.5MNaCl及0.5NNaOH使DNA變性10分鐘，然後用1.5MNaCl及1MTrispH7.4中和10分鐘。根據標準的分子克隆技術(SambrookJ，FritschEF，ManiatisT(1989，)MolecularcloningALaboratoryManual，2nd.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)將這些印跡與DIG標記的1447bp的PCR產物進行雜交反應。首先在37℃下，這些斑點印跡置於預雜交液中(50％甲醯胺，5XSSC，1mMEDTA，50mMTris(pH8)，5XDenhardt′s試劑(0.1％Ficoll-400，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％BSA))進行預雜交反應12小時，然後將這些斑點印跡與DIG標記的探針進行斑點印跡雜交反應，37℃16小時。以1447bp的PCR產物為模板，利用隨機引物方法(BoehringerMannheim)製備探針，雜交反應之後，利用DIG發光檢測試劑盒(BoehringerMannheim)進行呈色反應，檢測斑點印跡上具有DIG標記的核苷酸。37℃下，這些斑點曝露在柯達底片XAR-5上30分鐘，以記錄發光訊號。VI.利用DIG標記的1447bpPCR產物與病草蝦或病斑節蝦提取的WSBVDNA進行Southern雜交反應進行Southern雜交反應以確定1447bpPCR產物在由感染白點症的病草蝦或病斑節蝦純化而來的WSBV基因組DNA中的位置。為此目的，從病蝦分離而來的200ngWSBV基因組DNA用SalI限制酶酶切，並以0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳分離，凝膠經過酸化(0.25NHCl)去嘌呤及鹼處理(1.5MNaCl-0.5NNaOH)使DNA變性後，用1MTris(pH7.4)及1.5MNaCl中和處理，之後將DNA轉移至Hybond-N尼龍膜上，轉移步驟利用抽真空轉移裝置進行60分鐘，轉移緩衝液是20XSSC(3MNaCl，1.5M檸檬酸鈉)(Sambrooketal.(1989)，supra)，Hybond-N膜與DIG標記的1447bpPCR產物進行雜交反應。VII.檢測疫情流行區收集到的節肢動物感染WSBV的情況從疫情流行區收集到的節肢動物提取其DNA做為DNA模板，利用146F1及146R1引物對進行PCR反應，檢測試驗生物體內是否有WSBV的存在。結果A.組織病理研究對蝦類白點症的爆發不再只是局限於局部地區的問題，它已帶來整個亞洲養蝦工業的危機。為了更清楚地將這些致病病毒分類，並能發展快速的診斷方法，對於此病毒的物理化學特徵，做更進一步的研究。病草蝦的主要臨床症狀是外骨骼出現白點(圖1)，尤其蝦殼剝下後的頭胸甲上的白點最為明顯，即使在輕微感染個體的頭胸甲亦可見。組織病理學的研究證明病蝦表皮是此病毒的攻擊部位，因為這類組織會出現核脹大並有內含體的退化細胞(圖2)。利用白點症病蝦角質層下的表皮做超薄切片，在電子顯微鏡下觀察，可見到壞死區域具有大量無包含體杆狀病毒顆粒，也很容易看見脹大的核中充滿病毒粒子(圖3)。這些病毒顆粒長約330±20nm，直徑為87±7nm(n＝30)，病毒顆粒中的電子緻密中心是核衣殼，大小約220×70nm，自然感染及人工感染病蝦中的病毒粒子在外觀上沒有差異(圖4)。B、負染色及濾液毒性測定的感染試驗從病草蝦表皮製得的濾液沉澱的負染結果如圖5所示，病毒粒子可見杆狀外型，與自然界感染蝦體做超薄切片後所見的病毒粒子相似，沒有觀察到細菌的存在。已試過的四株魚類細胞株中，沒有發現任何一株出現細胞致病反應(CPE)，用於浸泡接種的濾液對於細胞沒有毒性。C、感染試驗將健康蝦暴露於白點症病斑節蝦及病草蝦外表皮濾液中。這些人工感染的蝦相似於自然界被感染的蝦(圖6)，並且在5到7天內累積死亡率高達100％(圖7)，而對照組則無蝦死亡。另外，WSBV接種對於試驗中最小的蝦(平均體重0.08克)具有高致病力，在五天內所有這些蝦均死亡；然而在0.16克大小的蝦群中，雖然在十二天達到100％的累計死亡率，但是七天後只有35％的累計死亡率；而試驗中最大的蝦群(平均體重0.26克)則在二星期內只有10％的死亡率。對照組均無死亡。D、WSBV的純化、基因組結構及分類地位純化的病毒粒子呈紡錘形或兩端鈍圓的杆狀，負染製備下，病毒粒子最寬點為70-150nm，長為250-380nm，比超薄切片約大了10％。有些病毒粒子則可觀察到某一端延伸出尾狀凸出物(圖8)。無包膜的核衣殼通常直徑約58-67nm，長約330-350nm。衣殼部分呈平行橫紋(圖9)，因此衣殼看起來由相疊的亞基環組成，這些環的厚度(20nm)非常一致且垂直於衣殼的縱軸。就病毒外型來看，WSSV相近於SEMBV(SystemicEctodermalandMesodermalBaculovirus)而不同於BMN(BaculoviralMid-gutGlandNecrosisVirus)及PmSNPV(PenaeusmonodoonSingleNucleocapsidNclearPolyhedrosisvirus-MBV)(Marietal.，Disaquat.Org.162-7-215，1993；Sanoetal.，Dis.aquat.Org.2169，1995)。然而SEMBV感染的蝦體並末被報導具有如同WSSV感染呈現白點的主要臨床特徵，因此目前為止很難推測WSSV及SEMBV間的相關性。圖10是純化的WSBV病毒粒子中提取的一條DNA分子，圖11則是WSBV的基因組DNA用限制性內切酶HindIII、SalI及XhoI酶切後的圖譜，WSSV的基因組DNA用HindIII酶切割後，在瓊脂糖凝膠上電泳後可見到至少有22個片段，其大小分另約為19.4，16.9，14.9，12.5，10.0，9.6，8.4，8.0，7.3，6.1，5.5，4.8，4.3，3.9，3.6，3.3，3.0，2.5，2.0，1.6，1.4及1.1kbp。若尚有小於1kbp的片段則已走出凝膠無法辨識。估算WSBV的DNA長度大於150kbp，其位於昆蟲杆狀病毒基因組大小90-230kbp的範圍內(Franckietal.Arch.Virol.，suppl.121-450，1991)。依據形態特徵及基因組結構，將白點症病毒分類於杆狀病毒科(Baculoviridae)，裸杆狀病毒亞科(Nudibaculovirinae)的無包含體杆狀病毒屬(NOB)(Franckietal.(1991)，supra)，且由於其為記錄中草蝦體內第三種無包含體狀病毒，而命名為PmBOBIII(thethirdnon-occludedbaculovirusrepeotedforp.monodon)(D.V.Lightner，BocaRaton，p.393-486，1993；Wongteerasupayaetal.，1995，supra)。本發明的病毒分離物PmNOBIII根據布達佩斯條約已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日為1996年1月11日，保藏號為CCTCC-V96001。我們也建議可用WSBV(Baculovirusassociatedwithwhite-spotsyndrome)表示與PmNOBIII相關的病原。E、有效診斷WSBV感染的工具的開發I、WSBV基因組文庫的構建a)病毒純化及病毒DNA的提取經過蔗糖梯度離心濃縮及純化之後，可見到典型杆狀的WSBV病毒粒子，這些病毒粒子可用以提取病毒DNA。利用PCR反應及專一於18srRNA的引物對擴增蝦DNA，的確可見到如預期中的848的bp的片段(圖12)。如此提供了一個簡單且靈敏度高的方法檢測少量蝦DNA的存在，因此在構建WSBV基因組文庫的過程中，利用此法可以監測WSBV基因組DNA製備的過程中蝦DNA汙染的情況。圖13中PCR反應的分析可見大部分WSBV基因組DNA製備物中均有宿主DNA的汙染，然而少量從純化病毒提出的WSBV基因組DNA樣本的沒有宿主DNA的汙染，例如圖13中泳道3。b)基因組文庫的構建利用SalI或HindIII限制性內切酶(BRL，LifeTechnologiesInc.)及pUC19質粒載體構建二個基因組文庫，PmNOBIIISaI(pms)及PmNOBIIIHindIII(pmh)。例如，取5μlSalI酶切後的WSBVDNA，以含有溴乙錠的0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析，確定WSBV基因組DNA已被SalI酶切完全後(圖14)，取20μl同一批酶切的DNA片段進行基因文庫的構建。用SalI或HindIII酶切篩選轉化子中分離出的重組質粒，其中pms基因文庫的592個克隆(pms1-pms592)，pmh基因文庫的410個克隆(pmh1-pmh245及pmh419-pmh584)通過SalI或HindIII酶切篩選插入片段的存在，插入片段的大小從15kbp到小於100bp不等，如表1。這些基因文庫提供了大量WSBVDNA的材料，以供病毒分子生物學更進一步的研究，並且開發核酸及免疫診斷試劑盒。II、擴增從純化病毒粒子提取的去蛋白WSBVDNA片段依據WSBVSalIDNA片段的基因序列(末顯示資料)，設計了幾對引物對，並通過PCR反應評價這些引物證明WSBV存在於感染組織的能力。圖15A顯示出質粒pms146中克隆的SalI-1461bpDNA片段。圖15B則表示用做PCR擴增反應的引物對在SalI1461-bpDNA片段中的位置。146F1及146R1引導擴增反應產生1447bpDNA片段，而146F2及146R2則引導擴增出941bpDNA片段，圖中亦標明SalI1461bpDNA片段中兩個EcoRI位點的位置。圖15C顯示SalI1461bpDNA片段的詳細核苷酸序列，其中還標出了二套引物對(146F1/146R1及146F2/146R2)及兩個EcoRI位點的位置。圖15D顯示自SalI1461bpDNA開發的六對引物對的核苷酸序列，其中146F1/146R1引物對對於WSBVDNA的擴增反應一直是有效且穩定的，而對蝦DNA則無反應，因此之後的研究工作選用這對引物進行。圖16示出用純化的WSBV基因組DNA做為模板，用專一於WSBVDNA或蝦DNA的引物進行PCR擴增的結果，其中泳道2、5和8表示利用專一於WSBVDNA的引物對146F1/146R1及三種獨立製備的WSBVDNA進行擴增反應的結果，結果顯示這幾個泳道中1447bpPCR產物很亮，證明這三個試驗樣品中都含有相對大量的WSBV基因組DNA，而由於圖16中第6泳道沒有可檢測到的蝦DNA的PCR產物，可以證明至少有一個WSBVDNA的樣品是沒有蝦DNA汙染的。在反應混合物中同時使用專一於WSBVDNA的引物對146F1/146R1及專一於蝦DNA的引物對143F/145R以證明DNA模板中WSBVDNA所佔的大約比例。圖16中資料證明，在三種獨立製備的WSBVDNA樣品中可檢測到WSBV特異性DNA片段均是主要的DNA帶(泳道4、7和10)，然而三個樣品中有二個WSBVDNA的樣品(泳道4和10)可以檢測到蝦DNA的存在，因此DNA模板中含有不同比例蝦DNA及WSBVDNA。還可很清楚地看到雖然有蝦DNA的汙染，但經過蔗糖梯度離心後純化的WSBV病毒粒子提取的DNA大部分仍是WSBVDNA。同時PCR反應混合物中使用臨床上健康蝦組織提取的核酸及專一於WSBVDNA的引物對146F1/146R1，擴增反應結果都是負的。(圖16，泳道11)，因此證明這套引物對的專一性。III.以自然感染及人工感染WSBV病毒的蝦組織提取的DNA進行WSBVDNA片段的擴增反應。圖17顯示利用pms146質粒DNA和從自然感染WSBV的草蝦或斑節蝦組織提取的DNA做為DNA模板進行擴增反應的結果，這些DNA模板利用專一於WSBV的引物對146F1/146R1或專一於蝦DNA的引物對143F/145R進行擴增反應。從純的pms146質粒DNA擴增出的DNA與1447bpPCR產物共遷移，證明WSBVDNA存在於每一個自然感染的蝦提取的核酸中，如圖17泳道2、5和8所示。10μl的上述PCR產物利用內部引物對146F2/146R2可以再擴增產生預期為941bp的PCR產物(圖17泳道3、6和9)，結果證明擴增產物與模板間的一致性。利用專一於蝦DNA的引物對143F/145R可以非常有效地擴增蝦DNA，如圖17泳道7和10。圖17中泳道5-10的結果顯示利用專一於WSBVDNA的引物對146F1/146R1及146F2/146R2即使有很大部分的蝦DNA存在，也可以有效地檢測WSBVDNA的存在。圖18示出PCR反應的擴增結果，此反應利用從人工感染WSBV的草蝦組織中提取出的DNA做為DNA模板，並用146F1/146R1做為引物，所有人工感染的蝦體均擴增出如預期的1447bp的PCR產物。而對照組的健康蝦進行的擴增反應則無1447bp的PCR產物存在。IV.DIG標記的1447bpPCR產物與提取自WSBV感染的草蝦或健康草蝦的DNA的斑點印跡雜交反應斑點印跡雜交反應的結果證明，所述的PCR產物與WSBV感染蝦提取出的DNA能雜交，但不與健康蝦提取出的DNA雜交(圖19)，此結果證明1447bpPCR產物的專一性。V.DIG標記的1447bpPCR產物與提取自病草蝦或病斑節蝦的WSBVDNA的Southern雜交。為了確定1447bpPCR產物在WSBV基因組DNA中的位置，用DIG標記的1447bpPCR產物為探針，與WSBV基因組SalIDNA片段進行Soutbern雜交反應，結果證明1447bpPCR產物專一地與WSBV基因組DNA中1461bp長的SalI片段雜交(圖20)。從草蝦或斑節蝦分別製備的WSBV基因組DNA中的1461bpSalI片段均與探針產生正反應。VI.檢測疫情流行區收集到節肢動物感染WSBV的情況在試驗的生物體中，草蝦、斑節蝦、螃蟹、橈足類及昆蟲(Ephydridaefamily)均呈現WSBV正反應(圖21)。計論病蝦的頭胸甲、附肢及體表內側均會出現明顯白點，並出現活力降低、肝胰腺變紅的情況。導致疾病爆發的可能原因有包括弧菌感染、病毒感染、環境管理不良及營良不均衡等多種推測出現。然而依據電子顯微鏡下的觀察，一種杆狀病毒被認為是主要的病原。具有白點的病斑節蝦及病草蝦體內分離出的致病病毒，在目前研究中首先研究其致病力。自然感染及人工感染的蝦體中可以見到相似的白點病徵及相近的病毒形態，由此可以證明這種病毒的確是導致疾病爆發的病原。這種病毒具有高致病力並持續對蝦類造成威脅，健康蝦餵食病蝦的實驗中，推測病毒可以經口傳染以及經水傳染。除了WSBV外，根據報導有一群不同的杆狀病毒可以感染甲殼綱十足類，首先出現在Couch的報導中(Nature，247(5438)229-231，1974；J.Inverteba.Pathol.，24311-311，1974)，並且有些病毒對發病生物有很高的致死率(LightnerRedman，J.Inverteba.Pathol.，38299-302，1981；Sonaetal.，FishPathol.，15185-191；Lesteretal.，Disaquat.Org.，3217-219，1987；JohnsonP.T.，Disaquat.Org.，5111-122，1988；JohnsonLightner，Disaquat.Org.，5123-141，1988；Bruceetal.，J.Virol.methods，34245-254，1991；Changetal..FishPathol.，27(3)127-130，1992；Changetal.，J.Invertebr.Pathol.，62116-120，1993；Marietal.，Dis.aquat.Org.16207-215，1993；Wongteerasupayaetal.，Dis.aquat.Org.2169-77，1995)。這些病素在外型上十分相近，大部分的研究者都同意在病毒因組結構方面應該有更多的參考資料，以供確定甲殼類杆狀病毒的分類地位。利用分子生物學技術開發快速且可信度高的診斷方法，將在病毒之間認定及比較方面非常有用，並且可用以篩選蝦苗及種蝦是否為帶原者。有鑑於這些原因，目前的研究者重於分析WSBV基因組的結構及發展有效且靈敏的診斷方法。實驗中，專一於蝦DNA的引物對用於幾項分析，在目前研究中使用專一於蝦DNA的引物對有以下幾項目的(i)分析WSBV基因組製備的純度，(ii)評價用於提供足以擴增的DNA模板的核酸提取方法，(iii)估算從感染組織提出的所有核酸製備的DNA模板中蝦DNA及WSBVDNA所佔的比例。我們嘗試從不同組識中純化WBSV病毒粒子，這些組識包括表皮、肌肉及鰓，利用專一於蝦DNA的引物對分析，我們從這些病毒粒子中可以得到不同純度的WSBVDNA，這些分析的例子如圖13及圖16所示。從肌肉提得的核酸中含有大量的WSBVDNA，但被蝦DNA汙染也很嚴重(圖16，泳道9)，從感染嚴重的外骨骼底下的表皮純化出的病毒粒子則是很好的起始材料，用以提取「非常純」的WSBV基因組DNA(圖16，泳道2和5)，利用專一於蝦DNA的引物對及PCR反應，是第一個可以分析蝦病毒基因組DNA製備中蝦DNA汙染與否的工具。利用專一於WSBVDNA的引物對，所有純化出的WSBV基因組DNA樣品都可產生如預期中1447bp的DNA片段的擴增產物，從自然界有白點的病蝦及用WSBV人工感染的病蝦組織中提得的核酸，亦可得到同樣大小的PCR產物，但從臨床上健康的蝦體提得的核酸則無正反應的結果，這些結果證明目前研究設計的這些專一於WSBVDNA的引物對其專一性非常高。另外，1447bpPCR產物可製備專一於WBSV核酸的探針，利用斑點印跡雜交法檢測蝦中WBSV的感染情況，如圖19。實際上，目前的研究提供了三種足以篩檢對蝦感染WSBV與否的有效檢測方法，如圖17、19、20。利用PCR(圖17)及Southern雜交(圖20)，我們證明導致不同蝦體產生白點症的病原實際上十分相近，篩檢WSBV感染的蝦需要立刻進行，以避免這種病毒疾病進一步擴散。另一方面，目前研究中開發的PCR診斷WSBV的方法，提供了有效的工、具用於比較蝦無包含體杆狀病毒間的關係，如日本的PV-PJ(Inouyeetal(1994)，supra)、中國大陸的HHNBV(Caietal.，J.Fish.China，19112-117，1995)、泰國的SENBV(Wongteerasupayaetal.(1995)，supra)、目前分離出的PmNOBIII及其他甲殼類的無包含體杆狀病毒。根據上述描述，在不背離本發明的實質和範圍內可以作出各種改動和變化是顯而易見的。因此應理解的是本發明可以以不同於已具體描述的方式進行實施。表1PmNOBIIISalI(pms)和PmNOBIIIHindIII(pmh)基因文庫的克隆中的插入片段的大小(kb)續表1續表1續表1續表1續表1續表1續表1續表1續表1續表1續表1續表1續表1續表1續表1續表1續表1續表1續表1序列表(1)一般信息(i)申請人郭光雄王重雄羅竹芳(ii)發明名稱白點症杆狀病毒的鑑定、純化及檢測(iii)序列數13(iv)通訊地址(A)收信人(B)街道(C)城市(D)州(E)國家(v)計算機可讀形式(A)媒介類型3.5寸軟盤，1.44M內存(B)計算機IBMPC、386兼容機(C)作業系統MS-DOS5.0(D)軟體PE2(vi)本申請資料(A)申請號(B)申請日(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請號(B)申請日(viii)代理人信息(A)姓名(B)註冊號(C)編號/文檔號(ix)通訊信息(A)電話(B)傳真(C)電傳(2)SEQIDNO1信息(i)序列特徵(A)長度1461bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(只示出一條鏈)(D)拓撲學線性(ii)分子類型基因組DNA(vi)最初來源(A)生物體WSBV(白點症杆狀病毒)(B)病毒株PmNOBIII(vii)現來源(A)文庫(B)克隆(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞(B)位置(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞(B)位置(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞(B)位置(xi)序列描述SEQIDNO1GTCGACAGACTACTAACTTCAGCCTATCTAGTAAAACAAGCTAAAAGATTCGACGGAGTT60GACCCAGCCTTCCCTGCCGCCCTCACCTGCGCTTCTCACCTCATGCTTTCTTCCATGGAT120TCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAACATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGC180TTCTTCAAGAACATTGAACGATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCC240ATGTCCCACAAGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCA300GATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTCCATGGAAGAA360ATTAGAGCCACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTGACAAACATTACGTGATGAAC420ATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAACAGGATCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGG480ACTGAAATGAGAATGAACTCCAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTC540TCCAACTCTGGCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAAT600GCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCACCGCCGACGCC660AAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGGCAACCGATGGAAACGGTAAC720GAATCTGAACTGATCCAGAATGCTCTGCCAAGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATG780AACGCTCAAACTGTCGTGTTTGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAG840GTTATCGTGAACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAA900AACACCAAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATCTAATAATAAT960GGAGGAGTAGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAACATCCAACAATGGTCCCGTC1020CTCATCTCAGAAGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCT1080CGCCCGGAAAATGTACCATTCGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTT1140CTGTCAAAGGGAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTA1200TCCTCTACCTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGCTCGAGTTTTC1260GAAGCCATCTCTAAGCAAGTAACTGATGCTGAATTCAAGGATATCCTCAACGATATCGAA1320CGTAATATTTCTTCTGACTATACTAACTGTCCACCAAATACTAACCAAAATGCCTTTGCT1380CTAGCTATCAAGAGAGAATTCAGCAGAATTGTTTCCTTCTTAACCATTCTTCGTAAGAAC1440ATTACACCCGCATTAGTCGAC(2)SEQIDNO2信息(i)序列特徵(A)長度1447bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(只示出一條鏈)(D)拓撲學線性(ii)分子類型基因組DNA(vi)最初來源(A)生物體WSBV(白點症杆狀病毒)(B)病毒株PmNOBIII(vii)現來源(A)文庫(B)克隆(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞(B)位置(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞(B)位置(ix)特徵(A)名稱/關鍵詞(B)位置(xi)序列描述SEQIDNO2ACTACTAACTTCAGCCTATCTAGTAAAACAAGCTAAAAGATTCGACGGAGTTGACCCAGC60CTTCCCTGCCGCCCTCACCTGCGCTTCTCACCTCATGCTTTCTTCCATGGATTCCCATAC120AAAGTCATCTTTCATGGACAACATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGCTTCTTCAA180GAACATTGAACGATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCCATGTCCCA240CAAGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCAGATAACGA300GCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTCCATGGAAGAAATTAGAGC360CACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTGACAAACATTACGTGATGAACATGTCCAA420GATCGATTCTAGAGTAACAGGATCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGGACTGAAAT480GAGAATGAACTCCAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTCTCCAACTC540TGGCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAATGCAAGAAG600TGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCACCGCCGACGCCAAGGGAAC660TGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGGCAACCGATGGAAACGGTAACGAATCTGA720ACTGATCCAGAATGCTCTGCCAAGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGAACGCTCA780AACTGTCGTGTTTGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTATCGT840GAACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAAAACACCAA900GGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATCTAATAATAATGGAGGAGT960AGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAACATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTC1020AGAAGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGA1080AAATGTACCATTCGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAA1140GGGAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTATCCTCTAC1200CTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGCTCGAGTTTTCGAAGCCAT1260CTCTAAGCAAGTAACTGATGCTGAATTCAAGGATATCCTCAACGATATCGAACGTAATAT1320TTCTTCTGACTATACTAACTGTCCACCAAATACTAACCAAAATGCCTTTGCTCTAGCTAT1380CAAGAGAGAATTCAGCAGAATTGTTTCCTTCTTAACCATTCTTCGTAAGAACATTACACC1440CGCATTA(2)SEQIDNO3信息(i)序列特徵(A)長度23bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(5』-3』)(D)拓撲學線性(ii)分子類型寡聚核苷酸探針(iv)反義(xi)序列描述SEQIDNO3ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG(2)SEQIDNO4信息(i)序列特徵(A)長度25bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(5』-3』)(D)拓撲學線性(ii)分子類型寡聚核苷酸探針(iv)反義(xi)序列描述SEQIDNO4TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA(2)SEQIDNO5信息(i)序列特徵(A)長度22bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(5』-3』)(D)拓撲學線性(ii)分子類型寡聚核苷酸探針(iv)反義(xi)序列描述SEQIDNO5GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA(2)SEQIDNO6信息(i)序列特徵(A)長度22bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(5』-3』)(D)拓撲學線性(ii)分子類型寡聚核苷酸探針(iv)反義(xi)序列描述SEQIDNO6TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT(2)SEQIDNO7信息(i)序列特徵(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(5』-3』)(D)拓撲學線性(ii)分子類型寡聚核苷酸探針(iv)反義(xi)序列描述SEQIDNO7TGGGAAGATATGGGGAACGAAT(2)SEQIDNO8信息(i)序列特徵(A)長度23bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(5』-3』)(D)拓撲學線性(ii)分子類型寡聚核苷酸探針(iv)反義(xi)序列描述SEQIDNO8CGAAGAGTAGTGTTAGAAGAGGA(2)SEQIDNO9信息(i)序列特徵(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(5』-3』)(D)拓撲學線性(ii)分子類型寡聚核苷酸探針(iv)反義(xi)序列描述SEQIDNO9AGAAAGGTTAGCGAATGGACTG(2)SEQIDNO10信息(i)序列特徵(A)長度21bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(5』-3』)(D)拓撲學線性(ii)分子類型寡聚核苷酸探針(iv)反義(xi)序列描述SEQIDNO10TTGAAGAGGTCGTCAGAGCCT(2)SEQIDNO11信息(i)序列特徵(A)長度23bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(5』-3』)(D)拓撲學線性(ii)分子類型寡聚核苷酸探針(iv)反義(xi)序列描述SEQIDNO11GAAACGGTAACGAATCTGAACTG(2)SEQIDNO12信息(i)序列特徵(A)長度18bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(5』-3』)(D)拓撲學線性(ii)分子類型寡聚核苷酸探針(iv)反義(xi)序列描述SEQIDNO12CAGTCCATTCGCTAACCT(2)SEQIDNO13信息(i)序列特徵(A)長度18bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(5』-3』)(D)拓撲學線性(ii)分子類型寡聚核苷酸探針(iv)反義(xi)序列描述SEQIDNO13CGTCCCCATATCTTCCCA權利要求1.白點症杆狀病毒實際上純的病毒分離物。2.根據權利要求1的白點症杆狀病毒，其中病毒包含的基因組具有如圖11所示的限制性內切酶酶切片段圖譜。3.根據權利要求1或2的白點症杆狀病毒，其中病毒基因組合有核苷酸序列如下所示的一段SalIDNA片段。1GTCGACAGACTACTAACTTCAGCCTATCTAGTAAAACAAGCTAAAAGATT51CGACGGAGTTGACCCAGCCTTCCCTGCCGCCCTCACCTGCGCTTCTCACC101TCATGCTTTCTTCCATGGATTCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAAC151ATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGCTTCTTCAAGAACATTGAACG201ATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCCATGTCCCACA251AGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCA301GATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTC351CATGGAAGAAATTAGAGCCACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTG401ACAAACATTACGTGATGAACATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAACAGGA451TCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGGACTGAAATGAGAATGAACTC501CAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTCTCCAACTCTG551GCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAAT601GCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCAC651CGCCGACGCCAAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGG701CAACCGATGGAAACGGTAACGAATCTGAACTGATCCAGAATGCTCTGCCA751AGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGAACGCTCAAACTGTCGTGTT801TGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTATCGTGA851ACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAA901AACACCAAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATC951TAATAATAATGGAGGAGTAGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAA1001CATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTCAGAAGCCATGAAGAATGCCGTC1051TATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGAAAATGTACCATT1101CGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAAGG1151GAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTA1201TCCTCTACCTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGC1251TCGAGTTTTCGAAGCCATCTCTAAGCAAGTAACTGATGCTGAATTCAAGG1301ATATCCTCAACGATATCGAACGTAATATTTCTTCTGACTATACTAACTGT1351CCACCAAATACTAACCAAAATGCCTTTGCTCTAGCTATCAAGAGAGAATT1401CAGCAGAATTGTTTCCTTCTTAACCATTCTTCGTAAGAACATTACACCCG1451CATTAGTCGAC4.根據權利要求1的白點症杆狀病毒，其中病毒基因組包含一段具有權利要求3所示核苷酸序列的第9-1455位核苷酸部分序列的SalIDNA片段。5.根據權利要求1的白點症杆狀病毒，其中病毒是PmNOBIII或與PmNOBIII相關的病原。6.從感染宿主生物中得到大量實質上純的無包含杆狀病毒的方法，其步驟如下a.從被無包含體杆狀病毒感染的宿主生物體得到樣品；b.用足夠量的蛋白酶抑制劑處理樣品以抑制無包含體杆狀病毒的降解；和c.純化病毒。7.根據權利要求6的方法，其中的純化步驟c由離心完成。8.根據權利要求7的方法，其中的純化步驟c由蔗糖濃度梯度離心完成。9.根據權利要求7的方法，其中蛋白酶抑制劑在離心之後除去。10.根據權利要求6的方法，其中病毒是白點症杆狀病毒。11.根據權利要求6的方法，其中病毒是PmNOBIII或與PmNOBIII相關的病原。12.一種多核苷酸，包含(i)一段如下所示的核苷酸序列1GTCGACAGACTACTAACTTCAGCCTATCTAGTAAAACAAGCTAAAAGATT51CGACGGAGTTGACCCAGCCTTCCCTGCCGCCCTCACCTGCGCTTCTCACC101TCATGCTTTCTTCCATGGATTCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAAC151ATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGCTTCTTCAAGAACATTGAACG201ATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCCATGTCCCACA251AGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCA301GATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTC351CATGGAAGAAATTAGAGCCACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTG401ACAAACATTACGTGATGAACATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAACAGGA451TCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGGACTGAAATGAGAATGAACTC501CAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTCTCCAACTCTG551GCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAAT601GCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCAC651CGCCGACGCCAAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGG701CAACCGATGGAAACGGTAACGAATCTGAACTGATCCAGAATGCTCTGCCA751AGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGAACGCTCAAACTGTCGTGTT801TGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTATCGTGA851ACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAA901AACACCAAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATC951TAATAATAATGGAGGAGTAGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAA1001CATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTCAGAAGCCATGAAGAATGCCGTC1051TATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGAAAATGTACCATT1101CGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAAGG1151GAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTA1201TCCTCTACCTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGC1251TCGAGTTTTCGAAGCCATCTCTAAGCAAGTAACTGATGCTGAATTCAAGG1301ATATCCTCAACGATATCGAACGTAATATTTCTTCTGACTATACTAACTGT1351CCACCAAATACTAACCAAAATGCCTTTGCTCTAGCTATCAAGAGAGAATT1401CAGCAGAATTGTTTCCTTCTTAACCATTCTTCGTAAGAACATTACACCCG1451CATTAGTCGAC(ii)互補於(i)的核苷酸序列的一段核苷酸序列；或(iii)可以和(i)或(ii)的核苷酸序列雜交的一段核苷酸序列。13.一種從權利要求12的多核苷酸衍生出的核苷酸片段，所這的核苷酸片段可以和白點症杆狀病毒的基因組DNA雜交。14.根據權利要求13的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段由報導分子地高辛配基標記。15.一種權利要求12的多核苷酸衍生出的核苷酸片段，所述的核苷酸片段可以在用PCR反應擴增WSBV的基因組DNA時作為引物。16.根據權利要求15的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段用地高辛配基標記。17.根據權利要求13至16中任一項所述的核苷酸片段，包括146F1、146R1、146F2或146R2。18.用於檢測蝦體內白點症杆狀病毒病毒感染的方法，包括如下步驟(a)從活蝦的一隻步足或血液取樣；(b)利用以下的方法檢測樣品中的白點症杆狀病毒的存在(i)用權利要求13的核苷酸片段進行Southern雜交反應；(ii)用權利要求13的核甘酸片段進行斑點雜交反應；或(iii)用權利要求15的一對引物進行PCR擴增反應。19.根據權利要求18的方法，其中所述的核苷酸片段用報導分子地高辛配基標記以用於斑點雜交反應。20.一種多核苷酸，包含(i)下列序列中第9至第1455位核苷酸的一段核苷酸序列；1GTCGACAGACTACTAACTTCAGCCTATCTAGTAAAACAAGCTAAAAGATT51CGACGGAGTTGACCCAGCCTTCCCTGCCGCCCTCACCTGCGCTTCTCACC101TCATGCTTTCTTCCATGGATTCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAAC151ATCAAATTGCACATGACTGATACTCAATGCTTCTTCAAGAACATTGAACG201ATTTGAGAAATTCTTGGGAAGATATGGGGACGAATACGCCATGTCCCACA251AGCAAAATTGTAACTGCCCCTTCCATCTCCACCACACTTTTACTCCCTCA301GATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTTCGCATTCGCCCGCCCAGAAGTCTC351CATGGAAGAAATTAGAGCCACACCCTATCAGGCCAACAAGCTTATTAGTG401ACAAACATTACGTGATGAACATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAACAGGA451TCTTCCCTCCTTAAGAAGGTTAGCGAATGGACTGAAATGAGAATGAACTC501CAACTTTAATGGAACATTTGAACCATCAAGACTCGCCCTCTCCAACTCTG551GCATGACAACGGCAGGAGTCAACCTCGACGTTATTGTCAAACCAAATAAT601GCAAGAAGTGTACTAGGAATATTGGAATGTCATCGCCAGCACGTGTGCAC651CGCCGACGCCAAGGGAACTGTCGCTTCAGCCATGCCAGCCGTCTTCCAGG701CAACCGATGGAAACGGTAACGAATCTGAACTGATCCAGAATGCTCTGCCA751AGGAACAGATACATCCAAAAGAGCACAATGAACGCTCAAACTGTCGTGTT801TGCTAATGTTTTGGAACAACTTATCGCCGATCTTGGAAAGGTTATCGTGA851ACGAACTGGCCGGCACCATCGCTGAATCTGTACCAGAAAGCGTATATGAA901AACACCAAGGAAATGATTGATAGACTAGGCTCTGACGACCTCTTCAAATC951TAATAATAATGGAGGAGTAGAATCAATGGATTATGAAGATAGCGAAACAA1001CATCCAACAATGGTCCCGTCCTCATCTCAGAAGCCATGAAGAATGCCGTC1051TATCACACACTAATTTCCGGCAAGGCAGCTCGCCCGGAAAATGTACCATT1101CGCCTCATGCGCCAGCGGCCCTCTCGCCTTTGATTTCCTTCTGTCAAAGG1151GAGATACATTCGAAGAAAAGAACGCCGAACAAGGTGCAGCAGCTGCCGTA1201TCCTCTACCTATTCTTCCTCTTCTAACACTACTCTTCGTAAGCATTTGGC1251TCGAGTTTTCGAAGCCATCTCTAAGCAAGTAACTGATGCTGAATTCAAGG1301ATATCCTCAACGATATCGAACGTAATATTTCTTCTGACTATACTAACTGT1351CCACCAAATACTAACCAAAATGCCTTTGCTCTAGCTATCAAGAGAGAATT1401CAGCAGAATTGTTTCCTTCTTAACCATTCTTCGTAAGAACATTACACCCG1451CATTAGTCGAC(ii)互補於(i)的核苷酸序列；或(iii)可以和(i)或(ii)的核苷酸序列雜交的一段核苷酸序列。21.一種由權利要求20的多核苷酸衍生出的核苷酸片段，所述的核苷酸片段可以和白點症杆狀病毒基因組DNA雜交。22.根據權利要求21的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段用報導分子地高辛配基標記。23.根據權利要求22的由多核苷酸衍生出的核苷酸片段，所述的核苷酸片段可以在用PCR反應擴增白點症杆狀病毒的基因組DNA時作為引物。24.根據權利要求23的核苷酸片段，其中所述的核苷酸片段用報導分子地高辛配基標記。25.根據權利要求21至24的任一項所述的核苷酸片段，包括146F1、146R1、146F2或146R2。26.用於檢測蝦體內白點症杆狀病毒病毒感染的方法，包括如下步驟(a)從活蝦的一隻步足或血液中取樣，(b)利用以下的方法檢測樣品中白點症杆狀病毒的存在(i)用權利要求21的核苷酸片段進行Souther雜交反應；(ii)用權利要求21的核苷酸片段進行斑點雜交反應；或(iii)用權利要求23的一對引物進行PCR擴增反應。27.根據權利要求26的方法，其中核苷酸用報導分子地高辛配基標記以用於進行斑點雜交反應。全文摘要本發明涉及一種感染節肢動物，特別是蝦類的新病毒性病原體的鑑定、純化及檢測。該病毒命名為WSBV(白點症杆狀病毒)。構建了兩個WSBV基因組文庫，並由其中一個克隆片段的DNA序列設計出專一性引物對，可用於PCR擴增反應以檢測對蝦類是否受WSBV感染。本發明的結果提供了一有效的檢測工具，適用於篩檢白點症杆狀病毒的帶原生物體，特別是蝦類，從而可避免此病毒性疾病的進一步蔓延。文檔編號C07K14/01GK1155009SQ9610281公開日1997年7月23日申請日期1996年4月5日優先權日1996年1月17日發明者郭光雄,王重雄,羅竹芳申請人:郭光雄,王重雄,羅竹芳