用於檢測生物靶點的快速和靈敏的方法

2023-05-21 10:23:16 4

專利名稱：用於檢測生物靶點的快速和靈敏的方法
技術領域：
本發明涉及檢測生物樣品中的至少一種生物標誌。因此，本發明還提供檢測給定樣品中的多種(例如兩種、三種)生物標誌，因此其提供獲得數據的方法，所述數據(例如)為診斷信息、生物標誌的相關表達、蛋白、基因、或一種或多種蛋白和一種或多種基因的組合的組(panel)的數據。作為例子(但非限制性的)，例如可在癌症診斷分析(例如乳腺癌分析)中同時篩選HER2蛋白和HER2基因。另一個非限制性例子包括(例如)篩選三種標誌以檢測子宮癌。標誌可包括Ki67/mib-1和細胞增殖標誌p16(INK4a)、以及諸如蛋白或核酸之類的用於人乳頭瘤病毒的標誌。然而另一個非限制性例子包括篩選與前列腺癌有關的多個標誌。這些標誌可包括AMACR P504S、聚合物量細胞角蛋白(HMW-CK)、和p63。篩選標誌的這種組合提供了一種從惡性前列腺腫瘤中區別良性前列腺腫瘤的方法。
例如在檢測多種標誌時需要使交聯劑之間的交叉反應性最小化。這可通過在檢測步驟中使用不同探針和不同報導分子來實現。這種體系的例子示於圖3中，其中使用下列步驟來檢測兩種不同生物標誌，例如兩種不同細胞受體 (1)孵育樣品和第一探針1(1P1)(例如HRP偶聯的抗體AB1)； (2)在存在交聯劑(例如DAB)的條件下孵育樣品(1)和報導子1(R1)(例如阿魏酸-PNA1偶聯物)； (3)孵育樣品(2)和過氧化氫(＞3％v/v)； (4)孵育樣品(3)和第一探針2(1P2)(例如HRP-偶聯的抗體AB2)； (5)孵育樣品(4)和報導子2(R2)(例如阿魏酸-PNA2偶聯物)； (6)孵育樣品(5)和第二探針1(2P1)(例如PNA1』-FITC)以及第二探針2(2P2)(例如PNA2』-德克薩斯紅)。
結果，從R1沉積的靶位點中檢測到綠色螢光信號(從PNA1』-FITC發出)，從R2沉積的靶位點中檢測到紅色螢光信號(從PNA2』-德克薩斯紅髮出)，並且從R1和R2沉積的靶位點(即同時存在靶A1和A2的位點)中檢測到黃色螢光信號。
該方法的所有步驟(從(a)至(c))可在2-20分鐘內完成。這種快速檢測可有利地用於自動或半自動檢測靶生物標誌。自動染色裝置是本領域中已知的，並且該方法可適用於這些裝置。
自動染色裝置可用在本發明的多種實施方式中，例如用於檢測多種生物標誌。檢測多種生物標誌通常需要從不同可檢測物質中發出的信號的平衡。自動步驟可包括多個將從靶生物標誌中發出的信號放大的步驟。當檢測多種標誌時這是特別有利的。
抗體探針 術語「探針」是指可與靶特異性結合的物質，其中靶可以是生物標誌、另外探針、報導子、或任何與所述生物標誌、另外探針或報導子有關的分子。
在一個實施方式中，探針為抗體探針。
在本文中使用的抗體是指免疫球蛋白或其一部分，其包括任何包含抗原結合位點的多肽，而不論其來源、製備方法和其他特性如何。該術語包括(例如)多克隆、單克隆、單特異性、多特異性、人源化、單鏈、嵌合、合成、重組、雜交、變異和CDR移植的抗體。一部分抗體可包括任何仍能夠結合抗原的片段，例如Fab、F(ab』)2、Fv、scFv。抗體來源通過基因組序列來限定，而不論製備方法如何。
本文中使用的第一抗體是指與生物樣品內存在的目標生物標誌特異性結合的抗體。在某些實施方式中，第一抗體可聚合。第一抗體可衍生自任何溫血種類，例如哺乳動物、鳥。
本文中使用的第二抗體是指具有這樣的抗原結合域的抗體，所述抗原結合域與第一探針(例如第一抗體)、或沉積在靶位點中的半抗原、或者直接或間接與第一探針連接的半抗原特異性結合。
本文中使用的第三抗體是指具有這樣的抗原結合域的抗體，所述抗原結合域與第二探針(例如第二抗體)、或與第二探針連接的半抗原、或與偶聯至第二探針的聚合物連接的半抗原、或沉積在靶位點中的半抗原特異性結合。
有時抗體可同時起到第二抗體和第三抗體的作用。
本發明中使用的抗體(包括第一抗體、第二抗體和第三抗體)可衍生自任何哺乳動物種類，例如小鼠、大鼠、山羊、豚鼠、驢、兔、馬、羊駝(lama)、駱駝、或任何鳥類種類(例如雞、鴨)。本文中使用的衍生自任何哺乳動物或鳥類種類是指編碼特定抗體的至少一部分核酸序列源自特定哺乳動物(例如小鼠、大鼠、山羊、或兔)或特定鳥類(例如雞、鴨)的基因組序列。抗體可以是任何同型，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、或任何亞類，例如IgG1、lgG2、lgG3、lgG4。
在某些實施方式中，第一抗體含有可與生物樣品包含的細胞表達的生物標誌特異性結合的抗原結合區域。所述標誌可表達在細胞表面上，或在細胞膜內(即在細胞的內部，例如在細胞質內、在細胞核內、在內質網內)。在一些實施方式中，生物標誌選自細胞，因此存在於溶液中，例如在細胞培養基中、在血液或血漿中。
在某些實施方式中，第二抗體含有與第一抗體特異性結合的抗原結合區域，例如第一抗體的恆定區域。在某些實施方式中，第二抗體與聚合物偶聯。在一些實施方式中，聚合物與2-20種第二抗體偶聯。在其他實施方式中，聚合物與2-10種第二抗體偶聯。
在某些實施方式中，第三抗體含有與第二抗體特異性結合的抗原結合區域，例如第二抗體的恆定區域、或與第二抗體連接的半抗原、或與第二抗體偶聯的聚合物。在某些實施方式中，第三抗體與聚合物偶聯。在一些實施方式中，聚合物與1-20種第三抗體偶聯。在其他實施方式中，聚合物與1-5種第三抗體偶聯。
本發明的方法和組合物中可使用的抗體包括單克隆和多克隆抗體、工程化抗體，包括使用噬菌體展示技術或可選擇的技術製備的嵌合、CDR移植和人工選擇的抗體。
已經公開了多種製備抗體的技術，例如參見Kohler和Milstein，(1975)Nature 256495、Harlow和Lane，Antibodiesa Laboratory Manual，(1988)(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)，其通過引用的方式併入本文。製備重組抗體分子的技術在上述參考文獻中有所公開，此外還在(例如)EP 0623679、EP 0368684和EP 0436597中有所公開。
可以以重組或合成的方式來製備抗體。編碼抗體的核酸可分離自cDNA庫。編碼抗體的核酸可分離自噬菌體庫(例如參見McCafferty et al.1990，Nature 348552，Kang et al.1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884363、EP 0 589877 B1)。編碼抗體的核酸可通過已知序列的基因改組來獲得(Mark et al.1992，Bio/Technol.10779)。編碼抗體的核酸可通過體內重組來分離(Waterhouse et al.1993，Nucl.Acid Res.212265)。本發明的方法和組合物中使用的抗體包括人源化免疫球蛋白(美國專利No.5,585,089，Jones et al.1986，Nature 332323)。
所述抗體可以是包含效應子蛋白(例如毒素或標記(例如可檢測物質))的改變抗體。
抗體可得自動物血清，或在單克隆抗體或其片段的情況下在細胞培養基中製得。根據建立的方法，重組DNA技術可用於在細菌、酵母菌、昆蟲或哺乳動物細胞培養基中製備抗體。在某些實施方式中，選擇的細胞培養基體系優選分泌抗體產物。
核酸探針 在另一個實施方式中，第一探針可以是或包含核酸或核酸類似物分子(例如DNA分子、RNA分子、PNA分子)以用在原位雜交中。核酸探針可以化學合成，或在細胞中重組製備(例如參見Sambrook et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Press)。在一些實施方式中，探針包含肽核酸(PNA)。肽核酸為核酸分子，其中通常存在於DNA和RNA中的脫氧核糖或核糖骨架被肽骨架取代。製備PNA的方法是本領域已知的(例如參見Nielson，2001，Current Opinion inBiotechnology 1216)(通過引用的方式併入本文)。在其他實施方式中，探針包含鎖核酸(LNA)(Sorenson et al.2003，Chem.Commun.7(17)2130)。在一些實施方式中，核酸探針與生物標誌(例如生物樣品中所含的核酸分子)特異性結合。
在特定實施方式中，核酸探針至少包含與生物樣品中的靶序列(例如核酸序列(例如基因組DNA序列或mRNA序列))在特定嚴格條件下特異性雜交的序列。在本文中使用的術語「在特定嚴格條件下雜交」旨在描述在彼此顯著互補的核苷酸序列保持彼此結合的情況下雜交和洗滌的條件。該條件為使得至少70％、至少80％、至少85-90％互補的序列保持彼此結合。互補百分率按照下列文獻所述來測定Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402(通過引用的方式併入本文)。
具體的嚴格條件是本領域已知的，並且可在下列文獻中找到CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(Ausubel et al.1995eds.)，第2、4和6章(通過引用的方式併入本文)。另外，具體的嚴格條件在下列文獻中有所描述Sambrook et al.(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Press，第7、9和11節(通過引用的方式併入本文)。在一些實施方式中，雜交條件為高度嚴格條件。高度嚴格雜交條件的例子為在4X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在65-70℃下雜交或在4X SSC和50％甲醛中在42-50℃下雜交，然後在1X SSC中在65-70℃下進行一次或多次洗滌。應理解另外試劑可加入雜交和/或洗滌緩衝液中，例如封閉劑(BSA或鮭魚精子DNA)、去汙劑(SDS)、螯合劑(EDTA)、Ficoll、PVP等。
在一些實施方式中，核酸探針與樣品中的靶序列在中度嚴格條件下雜交。本文中使用的中度嚴格雜交條件包括本領域普通技術人員基於(例如)DNA的長度可以容易地確定的條件。示例性條件在下列文獻中有所闡述Sambrook et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.Vol.1，pp.1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(通過引用的方式併入本文)，並且包括使用預洗滌液(5X SSC、0.5％ SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0))，雜交條件為50％的甲醛、6X SSC、在42℃下(或其他類似的雜交溶液，例如在50％甲醛中的Stark’s溶液、在42℃下)，洗滌條件為60℃、0.5X SSC、0.1％SDS。
在一些實施方式中，核酸探針與樣品中的靶序列在低度嚴格條件下雜交。本文中使用的低度嚴格雜交條件可包括本領域普通技術人員基於(例如)DNA的長度可以容易地確定的條件。低度嚴格雜交條件可包括(例如)在40℃下、在含有35％甲醯胺、5x SSC、50mM Tris-HCI(pH 7.5)、5mMEDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500μg/ml變性鮭魚精子DNA的溶液中預處理DNA6小時。在相同溶液中進行雜交，不同之處在於進行下列改變0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml變性鮭魚精子DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，並使用5-20x106 CPM探針。將樣品在雜交混合物中在40℃下孵育18-20小時，然後在55℃下在含有2x SSC、25mMTris-HCI(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中洗滌1.5小時。將洗滌液用新鮮溶液取代，並在60℃下另外孵育1.5小時。
探針的其他實施方式包括肽序列，例如所述肽序列衍生自不同蛋白的蛋白或核酸結合域、不同細胞和細胞核受體以及它們的衍生物的配體、可與大的生物分子的某些結構單元特異性結合的小分子，然而這僅僅列出了可用作本發明的目的的探針的物質的非限制性例子。
實施例 1.本發明的報導子和交聯劑分子的實施例 縮寫 MBHA 4-甲基二苯甲基胺 NMPN-甲基吡咯烷酮 HATU 2-(1h-7-疊氮苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽； 甜菜鹼 DIPEA 二異丙基乙胺 DCM二氯甲烷 TFA三氟乙酸 TFMSA 三氟甲基磺酸 Fer阿魏酸 FLU螢光素 Tyr酪氨酸 Lys賴氨酸 Dex葡聚糖 HPLC 高效液相色譜法 equi. 當量 1.1.Fer-L30-Lys(Flu)-NH2(D17158) 使用Fmoc-Lys(ivDDE)來卸載MBHA樹脂至負載量為150微摩爾/g。使用在NMP中的20％的哌啶使200mg樹脂去Fmoc化，並用Boc-L30-OH(1.5mL，在NMP中0.26M，使用0.9當量的HATU、2當量的DIPEA預活化2分鐘)進行一次20分鐘的偶聯。使用NMP中的5％的肼來除去ivDDE基團，用羧基螢光素(Flu)(1.5mL，在NMP中0.2M，使用0.9當量的HATU、2當量的DIPEA預活化2分鐘)標記賴氨酸側鏈2x20分鐘。使用在NMP、NMP、DCM、然後DCM中20％的哌啶處理樹脂。使用TFA∶TFMSA∶間甲酚(7∶2∶1，1.5ml，1小時)將中間產物H-L30-Lys(Flu)-NH2從樹脂上分開，使用二乙基醚沉澱，重新懸浮在TFA，使用二乙基醚沉澱，重新懸浮在NMP，再次使用二乙基醚沉澱。使用100微升DIPEA將其製成鹼性，並直接溶解在用0.9當量的HATU和2當量的DIPEA預活化的0.5mL 0.3M的阿魏酸中。在25分鐘後，將粗產物用二乙基醚沉澱，並溶解在450微升NMP和50微升乙二胺中。在5分鐘後，將產物用二乙基醚沉澱，並溶解在水中的15％乙腈(8mL)中，使用100微升TFA進行酸化，並進行RP-HPLC純化。
1.2.Fer-L150-Lys(Flu)-NH2(D17157) 使用Boc-Lys(Fmoc)來卸載MBHA樹脂至負載量為100微摩爾/g。用Boc-L30-OH對100mg樹脂進行5次偶聯循環(a.如1中那樣使用Boc-L30-OH進行偶聯。b.使用在NMP∶吡啶1∶1中2％的乙酸酐封端2分鐘。c.使用在TFA中的5％的間甲酚去Boc化2x5分鐘)。將賴氨酸側鏈去Fmoc化，並如1中那樣使用羧基螢光素標記。將中間產物H-L150-Lys(Flu)-NH2從樹脂上分開，並用阿魏酸標記N末端，然後如1.1那樣進行純化。
1.3.βα-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(D16127) 使用標準固相化學法(如1.1和1.2)在0.5g的MBHA樹脂上製備Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)。使用在NMP中的20％的哌啶從賴氨酸側鏈中除去Fmoc基團，然後使化合物進行重複的羧基螢光素標記(3x30分鐘)。在使用TFA除去Boc基團後，在固相上使用β-丙氨酸-N，N-二乙酸(βα)叔丁基酯標記N末端。在從樹脂上分開並進行HPLC純化後，分離βα-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2。
1.4.H-Cys-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(D16126) 製備Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)樹脂，並使用1.3中所述的方法利用螢光素來標記。在除去Boc基團後，使用N-Boc-S(4-甲氧基苄基)-Cys-OH來標記N末端。將化合物從柱上分開，並通過HPLC純化。
分子1.1、1.2、1.3和1.4為包含螢光素殘基的報導子的非限制性實施方式。
1.5.Fer-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30Lys(NH2)-NH2(D17128) 將Boc-Lys(Fmoc)(2個循環)、Boc-L30-OH(5個循環)和Boc-Lys(2CIZ)-OH依次偶聯至MBHA樹脂。在存在10％的茴香硫醚清除劑的條件下將中間產物從樹脂分開，從而除去2CIZ基團。如1.1那樣使用阿魏酸標記N末端和5個脫保護的賴氨酸側鏈(2x30分鐘)。然後在純化之前使用在NMP中的10％的乙二胺除去C末端賴氨酸殘基中的N上的Fmoc基團。
1.6.Fer-(Lys(Fer)-L30)5-Lys(NH-βα((L90-Lys(Flu))3-NH2)-NH2(D17134) 將500nmol的βα-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(化合物1.4)溶解在88微升NMP和2微升吡啶中，並通過與10微升二異丙基碳二亞胺反應10分鐘來轉化成環狀酸酐。將該酸酐用二乙基醚沉澱，然後將小球溶解在包含250nmol的Fer-(Fer-L30)5-Lys(NH2)-NH2的100微升NMP中。在20分鐘後，加入5微升乙二胺，在5分鐘後將產物用二乙基醚沉澱，酸化，然後進行HPLC純化。
1.7.Ac-(Tyr(OH)-L30)6-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-Lys(Flu)-NH2(D18044) 在MBHA樹脂上製備Ac-(Tyr(2BrZ)-L30)6-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-Lys(Fmoc)。在固相上除去Fmoc基團，並且使用羧基螢光素來標記賴氨酸側鏈。在從樹脂上分開後，將產物進行HPLC純化。
1.8. Fer-Lys(Fer)-L60-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L60-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L30Lys(NH2)-NH2(D17140) 在MBHA樹脂上製備Boc-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L30-Lys(Fmoc)。在從樹脂上分開後，通過沉澱來分離中間產物H-Lys(NH2)-L60-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L60-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L30-Lys(Fmoc)，並如1.1那樣用阿魏酸標記。通過HPLC來分離最終產物。
例子1.5.-1.8.是具有下式的交聯劑分子的例子 (R1)n-(X)q-R2(m)， 其中 R1和R2為不同的HRP的底物部分(例如Fer或Tyr)， X為具有下式的連接分子
其中R3和R4為Lys的殘基，並且m、n和q為1至6。
具有螢光素、阿魏酸(1.6)和/或酪氨酸(1.7)的數個殘基的線性聚合物交聯劑(例如上述分子1.6.和1.7.)也是可在存在另外交聯劑(例如DAB)的條件下被HRP沉積的報導子的實施方式。當HRP酶部分與不容易在(例如)細胞核(例如DNA)中受到影響或暴露的靶位點結合時，這種線性、相對低分子量(MW＜15kDa)的交聯劑/報導子可以是特別有用的。當過氧化物酶部分位於更容易受到影響的靶位點中時，可使用大的報導分子，例如含有與數十和數百個標記(例如Flu和/或Fer和/或Tyr)偶聯的葡聚糖分子(例如下述分子1.9.)的報導子。
1.9.與交聯劑1.5.和交聯劑1.4.偶聯的Dex70(D17130) 使10nmol的葡聚糖(MW 70kDa，用二乙烯基碸活化)與500nmol的Fer-(Fer-L30)5-Lys(NH2)-NH2(化合物1.5)在總體積300微升的0.16M的NaHCO3(pH9.5)中在40℃下反應30分鐘。在觀察到少量沉澱後，進一步加入100微升的水，並使反應進行另外30分鐘。進一步加入200微升的0.15M的NaHCO3和500nmol的H-Cys-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(化合物1.4)。在40℃下1小時後，通過加入50微升的0.165M的半胱氨酸使反應混合物淬火30分鐘，將溶液過濾，將產物通過FPLC在superdex200上用在含有10mM CHES、pH 9.0和0.1M NaCl的水溶液中的20％EtOH進行純化。洗脫產物為包含約56個螢光素和113個阿魏酸殘基的葡聚糖偶聯物。
1.10.山羊-抗-小鼠-Dex70-HRP(D18033) 將葡聚糖(70kDA MW)用13.7nmol的二乙烯基碸活化，並在600微升緩衝液(100mM NaCl、25mM NaHCO3、pH 9.5)中和602nmol HRP在30℃下反應3小時。然後加入在105微升水中的41.1nmol的山羊-抗-小鼠F(ab)2抗體，繼續反應另外16小時。通過加入70微升的0.165M的半胱氨酸來使反應混合物淬火30分鐘，將產物在superdex 200上在100mM NaCl、10mM HEPES(pH 7.2)中純化。洗脫產物為包含山羊-抗-小鼠(GaM)和HRP的葡聚糖偶聯物(dex∶GaM∶HRP的比＝1∶1∶1)。
1.11.抗-FITC-Dex70-HRP(D18058) 將葡聚糖(70kDA MW)用10nmol的二乙烯基碸活化，並在400微升緩衝液(100mM NaCl、25mM NaHCO3、pH 9.5)中和440nmol的HRP在30℃下反應3小時。然後，加入在80微升水中的30nmol的抗-小鼠F(ab)2抗體，在40℃下繼續反應另外90分鐘。通過加入50微升的0.165M的半胱氨酸來使反應混合物淬火30分鐘，將產物在superdex 200上在100mM NaCl、10mM HEPES(pH 7.2)中純化。洗脫產物為具有抗-FITC和HRP的葡聚糖偶聯物(dex/抗-FITC/HRP比＝1/2/9)。
1.12.抗-FITC-Dex70-HRP(D17030) 將葡聚糖(70kDA MW)用10nmol的二乙烯基碸活化，並在374微升緩衝液(100mM NaCl、25mM NaHCO3、pH 9.5)中和440nmol HRP以及25nmol F(ab)2抗-FITC在30℃下反應16。通過加入50微升的0.165M的半胱氨酸來使反應混合物淬火30分鐘，將產物在superdex 200上在100mMNaCl、10mM HEPES(pH7.2)中純化。洗脫產物為包含抗-FITC和HRP的葡聚糖偶聯物(比為1∶1∶1)。
分子1.10、1.11和1.12表示可用作檢測沉積的報導分子的探針的抗體-葡聚糖-HRP偶聯物的實施方式。偶聯物1.10.還可用作檢測與沉積的報導子結合的探針的另外的探針(例如上述在檢測靶位點中的標誌的方法中的步驟(b)中)。
3.使用本發明的方法進行IHC染色的實施例 在福馬林固定、石蠟嵌入的扁桃體上進行IHC。將3-5個微切片切削、烘烤並儲存在4℃下直到使用為止。然後通過二甲苯(2x5分鐘)、99％乙醇(2x2分鐘)、70％乙醇(2x2分鐘)、並最終通過水來除去石蠟。將玻片置於靶修復溶液(pH 9)(DAKO S2367)中，然後在微波爐中加熱(沸騰10分鐘)。此後，使玻片冷卻，然後轉移至洗滌緩衝液(DAKO S3006)。該步驟後面是使用3％過氧化氫封閉內源性過氧化物酶活性5分鐘的步驟，然後再次將玻片轉移至洗滌緩衝液中，然後進行染色。為了使玻片與玻片之間差異最小化，在相同日子使用連續切片進行各種比較試驗。使用從0至4的評分等級來對具體和背景信號進行評分，其中0表示根本沒有染色，1表示較弱程度染色，2表示中等程度染色，3表示較強程度染色，4表示過度染色。
IHC試驗1. 將細胞角蛋白、山羊-抗-小鼠-HRP和抗-FITC-HRP分別稀釋在BCPT-緩衝液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。將報導子D17128和DAB(DAKO K5007C)稀釋在DAB的底物緩衝液(DAKO K5007 B)中。所有孵育持續5分鐘，接著在DAKO洗滌緩衝液中洗滌2分鐘，除了在孵育後使用D17128的情況以外，在該情況中在10mM CHES(pH 9)+0.1％Tween20中進行洗滌。下表和描述概括了試驗的實施方式 玻片1-標準DAB-HRP染色(沒有放大)。標準DAB DAKO試劑(K7005C)含有3mM DAB。
玻片4-在存在1mM DAB-GaM-HRP偶聯物D18033(與玻片1相比其稀釋25倍)的條件下沉積報導子D17128-一步放大。
玻片7和玻片9-與玻片1相比進一步稀釋GaM-HRP偶聯物D18033，並且進行另外的報導子沉積步驟。
玻片1、4和7都具體染色評分為2.5至3。由於在存在DAB的條件下沉積報導子D17128、接著通過抗-FITC-HRP探針D17030來識別該報導子，因此獲得放大250倍的信號(與玻片1相比的玻片9)。玻片7和9的明顯染色保持鮮明(即非擴散的)，其中染色和未染色區域之間的強烈邊界表明在沉積位點發生非常少的擴散。
IHC試驗2. 將細胞角蛋白、GaM-HRP和抗-FITC-HRP都稀釋在BCPT-緩衝液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。將D17128和DAB(DAKO K5007 C)稀釋在DAB的底物緩衝液(DAKO K5007 B)中。所有孵育持續5分鐘，接著在DAKO S3006中洗滌2分鐘，除了在孵育後使用D17128的情況以外，在該情況中在10mMCHES(pH 9)+0.1％Tween20中進行洗滌。
下表和描述概括了試驗的實施方式 玻片12和14強烈和特異性地染色(評分都為2)，而玻片9未被染色(評分為0)。結果表明在沒有交聯劑(例如DAB(玻片14)或D17140(玻片12))的情況下HRP不會引起報導子沉澱。
試驗進一步示出減少預孵育(10分鐘)第一抗體和第二抗體-HRP偶聯物的步驟次數的可能性。
IHC試驗3. 將細胞角蛋白、GaM-HRP和抗-FITC-HRP分別稀釋在BCPT-緩衝液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。將D17128和DAB(DAKO K5007C)稀釋在DAB的底物緩衝液(DAKO K5007B)中。所有孵育持續5分鐘，接著在DAKO S3006中洗滌2分鐘，除了在孵育後使用D17128和D18044的情況以外，在該情況中在10mM CHES(pH 9)+0.1％Tween20中進行洗滌。當具有DAB的玻片(玻片3和5)在底物緩衝液中進行第三孵育步驟時，孵育時間為1分鐘。
下表和描述概括了試驗的實施方式 玻片2是染色密度最高的玻片(評分3)，這表明第三步驟的對於玻片3(評分2，5)特別施加1分鐘的DAB不是很大改善，而是相當輕微降低染色密度。在缺乏交聯劑的條件下對於缺乏對於玻片4(評分0)的染色符合IHC試驗2(上述)中獲得的結果。在玻片5(其中在施加報導子偶聯物D17128之前施加DAB)上觀察到染色(評分2)，儘管這些染色不如玻片3上的染色那樣密度高。
該結果表明在孵育具有報導子和交聯劑的玻片(即預孵育步驟)之前可以首先在單獨步驟施加交聯劑。所觀察到的在沉積標記的報導子前施加DAB的另一種積極作用是明顯降低背景染色(玻片2評分為0.5-1，玻片3評分為0)，儘管特定信號強度並沒有降低太多。在許多情況下通過在沉積前1分鐘的額外DAB步驟，實質上消除了與山羊-抗-小鼠-HRP偶聯物的非特異性結合有關的特別弱的擴散背景染色。
IHC試驗4. 將細胞角蛋白、GaM-HRP和抗-FITC-HRP全部稀釋在BCPT-緩衝液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。將D17128、D18044和DAB(DAKO K5007C)稀釋在DAB的底物緩衝液(DAKO K5007B)中。所有孵育持續5分鐘，接著在DAKO S3006中洗滌2分鐘，除了在孵育後使用D17128和D18044的情況以外，在該情況中在10mM CHES(pH9)+0.1％Tween20中進行洗滌。
下表和描述概括了試驗的實施方式 該試驗示出了交聯劑濃度對於兩種不同類型的報導子沉積的影響。玻片9是染色濃度最高的玻片(評分4)。以稀釋度1∶150將作為交聯劑的DAB(1mM)施加在玻片9上。DAB的更高(1∶50(3mM)，玻片8)或更低(1∶500(30mM)，玻片10)濃度產生密度稍低的染色(評分3.5)。和DAB的預孵育的背景降低效果也是可見的；6個玻片(上表)中沒有一個具有明顯的背景染色。
低分子量報導子(例如上述報導子18044)在較低濃度的DAB(玻片13；評分3)下被更好地沉積，隨著DAB濃度的增加(玻片12，評分2.5；玻片11，評分2)，染色密度降低。
該試驗還示出為了獲得相同或甚至更好的染色結果，與包含相同但更少的過氧化物酶的底物部分的小的報導分子(例如D 18044，t 5μM)相比，可以使用更少量的包含多個過氧化物酶的底物部分的大的報導分子(例如螢光素-阿魏酸葡聚糖偶聯物D17128，50nM)。
4.使用本發明的方法放大核酸探針信號的實施例 通過在Chromogen溶液和信號增強溶液中使用和不使用DAB來試驗樣品，可以示出DAB的沉澱效果。通過進一步稀釋探針、抗體或通過省略第二過氧化物酶-封閉步驟，可以獲得本發明信號放大的進一步解釋。
組織福馬林-固定石蠟嵌入的扁桃體。
螢光素標記的探針靶向於染色體11的著絲粒。
在實施例中使用下列溶液 抗原修復/預處理(Dako K 5599) 洗滌緩衝液1(Dako K5331) 洗滌緩衝液2(Dako S 3006) 胃蛋白酶RTU(Dako K 5331) 嚴格的洗滌緩衝液(Dako K 5331) R-a-Fitc/HRP，F(ab)(Dako P 5100) 抗體稀釋液(Dako S 2022) 探針(Dako Y 5505) 過氧化物酶-封閉液(Dako S 2023) 核快紅(Dako S1968) Chromogen緩衝液(Dako K5007) 雜交劑(Dako S2451)被用於雜交探針。
Chromogen溶液和信號增強溶液的製備 溶液A 將102.5mg的5-氨基-2-(3-[5-氨基-1，3-二氫-3，3-二甲基-1-(4磺基丁基)-2H吲哚-2-亞基]-1-丙烯基]-3，3二甲基-1-(4磺基丁基)-3H-吲哚鎓三氟乙酸鹽溶解在4,525mL的丙二醇/水(8∶2)中。
溶液B 將59,6mg的3，3』-二氨基鹽酸聯苯胺溶解在5,96mL的丙二醇/水(8∶2)中。加入13,7μL 12M的鹽酸。
溶液C 按照1mL A∶9mL B的比混合溶液A和溶液B。
Chromogen溶液 為了染色，將這些儲存液稀釋成試劑盒(得自Dakocytomation code#K5007)的chromogen緩衝液。
將1mL的溶液C與19mL的Chromogen緩衝液混合。
溶液D 將1mL的溶液B用499mL的Chromogen緩衝液稀釋。
信號增強溶液 其為在20％的乙醇中的D1734、0,1M NaCl、10mM CHES(pH 9,0)的溶液，用溶液D稀釋至Fer-L30-FITC濃度為250nM或50nM。在溶液中沒有DAB的情況下，直接在Chromogen緩衝液中進行稀釋。
組織染色過程 將人扁桃體組織玻片去石蠟化、洗滌並在微波爐中進行10分鐘的抗原修復。在另一次洗滌後，在37℃下進行胃蛋白酶處理，洗滌，使玻片脫水並和PNA探針孵育。在85℃下使樣品變性5分鐘後，將探針在45℃下雜交1小時。將玻片在65℃下嚴格洗滌10分鐘。將過氧化物酶封閉3分鐘，將玻片洗滌並和兔-抗-FITC/HRP(以1∶20稀釋)孵育。在30分鐘後，將玻片洗滌並和信號增強溶液孵育。在30分鐘後，將玻片洗滌，並將過氧化物酶封閉3分鐘，再次洗滌，將玻片和兔-抗-FITC/HRP(以1/20稀釋)孵育。在30分鐘後，將玻片洗滌並和Chromogen溶液孵育。在使用水洗滌後，將玻片用核快紅復染，洗滌和設置。
試驗建立和染色結果示於下表中
玻片1為示出探針需要獲得信號的對照。
玻片2示出在信號增強溶液中沒有交聯劑，無法獲得特定信號。
玻片3示出向信號增強溶液中加入交聯劑(DAB)導致高的信號放大。這僅是chromogen溶液中沒有DAB的玻片。
玻片4示出向chromogen溶液中加入交聯劑進一步增強了信號(與玻片3相比)。
玻片6示出通過增加信號增強劑(D17134)的濃度，可以在沒有交聯劑的情況下獲得弱的信號。然而，加入交聯劑導致該信號更強的放大(如玻片5所示)。
權利要求
1.一種在靶位點沉積報導子的方法，所述方法包括在包含報導子和交聯劑的介質中孵育靶位點，其中所述靶位點具有過氧化物酶活性，其中所述報導子為可檢測分子，以及其中所述交聯劑是包含至少兩個過氧化物酶的底物部分的分子。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述過氧化物酶活性與所述靶位點中存在的至少一個過氧化物酶部分有關。
3.權利要求2所述的方法，其中所述過氧化物酶選自辣根過氧化物酶(HRP)或大豆過氧化物酶(SP)。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述交聯劑為具有下式的分子
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2為過氧化物酶的底物的部分，
X為連接基團或化學鍵，以及
m、n和q為1至10的整數。
5.根據權利要求4所述的方法，其中
R1和R2為鄰苯二胺的部分，
X為共價鍵，以及
m、n和q為1。
6.根據權利要求4所述的方法，其中
R1和R2為阿魏酸的部分，
X為具有下式的連接基團
其中R3和R4為胺基酸賴氨酸的殘基，和
m和n為2至10的整數，
以及q為1至10的整數。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述交聯劑在所述介質中的存在量為約10-5至約10-2M。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述報導子為包含骨架聚合物和至少一種可檢測物質的分子，其中所述至少一種可檢測物質通過化學鍵或通過連接基團與所述骨架聚合物相連。
9.根據權利要求9所述的方法，其中所述報導子包含至少兩種相同或至少兩種不同的可檢測物質。
10.根據權利要求9或10所述的方法，其中所述可檢測物質選自螢光標記、發光標記、生物發光標記、放射性標記或顯色標記、酶、酶的底物、半抗原或特異性結合對的成分。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述報導子是小分子。
12.根據權利要求12所述的方法，其中所述小分子選自螢光或顯色物質、半抗原、特異性結合對的成分或酶的底物。
13.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶位點包含生物標誌。
14.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述介質包含過氧化物化合物。
15.一種具有下式的化合物
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2為過氧化物酶的底物的部分，
X為連接基團，以及
m、n和q為1至10的整數。
16.根據權利要求16所述的化合物，其中
R1和R2為阿魏酸的部分，
X為具有下式的連接基團
其中R3和R4為胺基酸賴氨酸的殘基，和
m和n為2至10的整數，
以及q為1至10的整數。
17.一種水緩衝化介質，包含
(i)能夠在存在過氧化物酶活性的條件下使至少兩種報導分子交聯的化合物，其中所述化合物為包含至少兩個過氧化物酶的底物部分的分子，並且其中所述兩種報導分子為可檢測分子，以及
(ii)過氧化物化合物，
所述介質的pH為約4至約9。
18.根據權利要求17所述的介質，其中所述能夠在存在過氧化物酶活性的條件下使至少兩種報導分子交聯的化合物為具有下式的分子
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2為過氧化物酶的底物的部分，
X為連接基團或化學鍵，以及
m、n和q為1至10的整數。
19.根據權利要求18所述的介質，其中所述化合物為二氨基聯苯胺。
20.根據權利要求18所述的介質，其中所述化合物為權利要求15或16中所限定的化合物。
21.根據權利要求17至20中任一項所述的介質，其中所述介質中所述化合物的量為約10-5至約10-2M。
22.根據權利要求17至21中任一項所述的介質，其中所述介質中所述過氧化物化合物的量為約10-4至約10-2M。
23.根據權利要求22所述的介質，包含0-20％的有機改性劑和0-2M的有機鹽或無機鹽。
24.根據權利要求23所述的介質，還包含過氧化物酶活性增強劑。
25.根據權利要求23或24所述的介質，還包含鐵螯合劑。
26.根據權利要求23、24或25任一項所述的介質，還包含去汙劑。
27.根據權利要求17所述的介質，其中所述報導子為包含骨架聚合物和至少一種可檢測物質的分子，所述至少一種可檢測物質通過化學鍵或通過連接基團與所述骨架聚合物相連，其中所述至少一種可檢測物質選自螢光標記、發光標記、生物發光標記、放射性標記或顯色標記、酶、酶的底物、半抗原或特異性結合對的成分，或其中所述報導分子為選自螢光或顯色物質、半抗原、特異性結合對的成分或酶的底物的小分子。
28.一種體外檢測生物樣品中的生物標誌的方法，包括下列步驟
d)將推測包含生物標誌的生物樣品與一種或多種探針進行孵育，其中所述一種或多種探針中的至少一種包含辣根過氧化物酶(HRP)的至少一個部分，從而所述生物標誌與包含HRP至少一個部分的至少一種探針形成絡合物；
e)在包含報導子和交聯劑的介質中孵育樣品，所述樣品含有步驟(a)的所述生物標誌與包含HRP至少一個部分的至少一種探針形成的絡合物，從而使所述報導子沉積在存在步驟(a)的絡合物的位點中；
f)檢測(b)的所述沉積的報導子，從而檢測所述生物標誌。
29.根據權利要求24所述的方法，其中所述生物標誌為選自蛋白、核酸、脂質、碳水化合物中的生物分子，或者為包含兩種或多種所述生物分子或其衍生物的分子絡合物或聚合物，或者為細胞狀結構。
30.根據權利要求24所述的方法，其中所述探針為特異性結合對的成分，或為包含特異性結合對的成分的偶聯物，其中所述特異性結合對的成分能夠與所述生物標誌特異性結合。
31.根據權利要求26所述的方法，其中所述探針選自核酸、核酸類似物、肽或蛋白。
32.根據權利要求24所述的方法，其中步驟(b)的所述孵育介質為權利要求18至23中任一項所限定的介質，其中所述介質還包含報導子。
33.根據權利要求24或28所述的方法，其中孵育步驟(b)包括至少如下兩個步驟
(iii)在根據權利要求22或23所述的介質中孵育所述樣品；然後
(iv)在包含報導子的根據權利要求22或23所述的介質中孵育所述樣品。
34.根據權利要求24、28或29任一項所述的方法，其中所述報導子如權利要求9至13中任一項所限定。
35.根據權利要求29所述的方法，其中所述步驟(i)和(ii)重複進行。
36.根據權利要求24所述的方法，其中步驟(c)包括下列步驟將所述樣品和能夠與所述沉積的報導子特異性結合的物質進行孵育。
37.根據權利要求32所述的方法，其中所述物質被可檢測地標記。
38.根據前述權利要求24至33中任一項所述的方法，其中所述方法在2至20分鐘內進行。
39.根據權利要求24至34中任一項所述的方法，其中所述方法用於生物標誌的自動、半自動或人工檢測。
全文摘要
本發明涉及通過自由基鏈式反應發生的生物標記方法。由於可檢測的報導分子從包含含有至少兩個過氧化物酶的底物部分的物質(本文中稱為「交聯劑」)的介質中沉積到包含過氧化物酶活性和生物標誌的靶位點中，因此發生標記。本文中所述的標記反應可通常用於檢測試驗方案(其用於檢測並使生物或化學靶可視化)的宿主中的靶，所述試驗方案包括免疫組織化學法(IHC)，原位雜交法(ISH)例如ELISA、DNA印跡法、RNA印跡法和蛋白質印跡法的抗體基染色法，和其他方法。
文檔編號G01N33/58GK101836117SQ200880112656
公開日2010年9月15日 申請日期2008年9月16日 優先權日2007年9月18日
發明者J·洛澤, K·H·彼得森 申請人:丹麥達科有限公司