一種人結直腸癌分子標誌物COL3A1及其用途的製作方法
2023-05-20 20:20:46 6
本發明屬於基因工程和醫學檢測領域，涉及一種人結直腸癌分子標誌物COL3A1及其用途，尤其涉及其用於製備人結直腸癌檢測製劑或檢測試劑盒中的用途。
背景技術：
：根據世界衛生組織GLOBOCAN2012的統計報導，結腸癌在世界範圍內已成為第三大男性腫瘤和第二大女性腫瘤，其預後生存很差，其中，在2012年的整體致死率是50.1％(男性)和52.1％(女性)。腫瘤發並影響到個人家庭，並帶來嚴重的社會影響、增加公共衛生支出和財政負擔。因此，早發現、早確證、早治療對於提高結腸癌的治癒率和延長預後生存時間具有非常重要的意義。研究顯示，結腸癌的初發階段一般症狀不明顯，容易被忽略，一旦確診後則往往處於中晚期而使治療效果不佳，更影響手術後的生存。所以，與其他癌症一樣治療結腸癌的一個關鍵在於儘可能早地發現癌。目前臨床實踐中，結腸癌的診斷通常包括觀察排便習慣的改變、便血、腹痛等，直腸指症，實驗室檢查包括血常規、尿常規和大便常規、大便潛血試驗，影像檢查、B超、CT掃描、結腸鏡檢查等等；而血清血液檢查則是最為通行、常規的檢查，常用標誌物為癌胚抗原(CEA)、結直腸癌抗原(CCA)、CA19-9，但是這些抗原檢測的臨床效果差異比較大，且檢測的靈敏度和特異性有待提高。從這個意義上說，發現新的同時具有高靈敏度、高特異性的血液標誌物是一件非常緊迫的任務。利用新型標誌物，有望在常規體檢篩查中儘早地發現早期結腸癌的存在。其次，對於手術後或放化療後病人的預後效果、生存情況的預測，常規方法有賴於病理參數、TNM分期、Dukes分期等方法，但在病理判斷上時常有人為因素幹擾，臨床實踐中需要有差異顯著、靈敏度高、特異性好、操作方便的分子標誌物作為輔助判斷手段，因此，尋找結腸癌的有效標誌物，準確判斷結腸癌的臨床分期和預後成為廣大醫學研究者的迫切任務。基於現有技術的現狀，本發明的申請人擬提供一種人結直腸癌分子標誌物COL3A1及其在製備人結直腸癌檢測製劑或檢測試劑盒中的用途。技術實現要素：本發明的目的是提供一種人結腸癌蛋白質標誌物COL3A1用於製備人結直腸癌檢測製劑或檢測試劑盒中的用途，具體的，本發明提供了一種人結腸癌蛋白質標誌物COL3A1用於製備診斷、預測、檢測或篩查人結腸癌的製劑；特別是用於製備診斷、預測、檢測或篩查人結腸癌的試劑盒。更進一步的，本發明的人結腸癌蛋白質標誌物COL3A1還可以用於製備診斷、預測、檢測或篩查人結腸癌癌細胞擴散、結腸癌淋巴結轉移、結腸癌臨床分期、結腸癌患者預後的製劑；特別是用於製備診斷、預測、檢測或篩查人結腸癌癌細胞擴散、結腸癌淋巳結轉移、結腸癌臨床分期、結腸癌患者預後的試劑盒。本發明所述的結腸癌蛋白質標誌物COL3A1還可作為篩選製備診斷、緩解或治療結腸癌的藥劑的靶標。本發明所述的試劑盒中包括特異性擴增COL3A1的引物，或者針對COL3A1蛋白的抗體；所述的檢測試劑盒含有COL3A1標準品。另一方面，本發明還提供了一種人結腸癌標誌物COL3A1的檢測方法，其包括步驟:(a)分離提取樣本中的基因組DNA或者蛋白；和/或(b)檢測(a)所得的基因組DNA或者蛋白中COL3A1的含量。本發明中，實驗分析COL3A1基因在結腸癌和癌旁組織中的表達，結果表明，COL3A1基因在癌組織中相比於癌旁組織呈現顯著高表達趨勢，證明COL3A1在結腸癌發生發展過程中起作用；進一步檢測證明COL3A1蛋白主要與結腸癌細胞相關，尤其COL3A1蛋白在結腸癌和癌旁中，在上皮細胞中顯著差異表達，但在癌和癌旁的基質部分，表達無差異，說明COL3A1蛋白是癌上皮細胞特異的分子標誌物；同時，COL3A1基因表達上調與腫瘤進展呈正相關，其中男性病人COL3A1基因上調更明顯；而且，COL3A1基因和蛋白(上皮細胞)的高表達與結腸癌病人手術後的生存時間相關，該表達可作為結腸癌預後生存時間的參考判斷指標及預後生存風險預測參考依據。本發明提供了一個用於區分人結腸癌組織以及癌旁正常結腸組織、無淋巴結轉移結腸癌組織和有淋巴結轉移結腸癌組織的質膜蛋白標誌物COL3A1，利用該標誌物製備判斷人結腸癌、結腸癌擴散，結腸癌淋巴結轉移、臨床分期、結腸癌患者預後和預後的製劑。本發明為有效判斷人結腸癌癌變進程提供了科學依據。附圖說明圖1是利用Oncomine公共資料庫中的基因表達晶片數據分析COL3A1基因在結直腸癌和正常結直腸組織中的表達，其中，圖1-A是利用GaedckeColorectal數據分析COL3A1在65對直腸和直腸癌組織中的表達的散點圖，散點下的數字表示病例或正常樣本的個數，p值為用Studentttest(T檢驗)分析得到的顯著性值，星號代表該T檢驗用的是配對T檢驗；圖1-B是利用HongColorectal數據分析COL3A1在12例結腸和70例結腸癌組織中的表達的散點圖；圖1-C是利用KaiserColon數據分析COL3A1在5例結腸和100例結腸癌組織中的表達的散點圖；圖1-D是利用SkrzypczakColorectal數據分析COL3A1在24例結腸、45例腺瘤和36例結腸癌組織中的表達的散點圖；圖1-E是利用SkrzypczakColorectal2數據分析COL3A1在20例結腸、10例腺瘤和10例結腸癌組織中的表達的散點圖；圖1-F是利用TCGAColorectal數據分析COL3A1在22例結直腸組織、22例盲腸腺癌組織、101例結腸腺癌、22例結腸粘液腺癌、60例結腸癌、6例直腸粘液腺癌和4例乙狀直腸腺癌中的表達的散點圖。圖2是用Westernblot方法檢測COL3A1蛋白在各個結腸癌細胞系中的表達。其中，GAPDH是內參。圖3是利用商業化組織晶片進行COL3A1免疫組織化學分析的結果，其中，圖3-A展示了COL3A1陰性表達的結腸組織；圖3-B是COL3A1陽性表達的癌旁結腸組織；圖3-C是COL3A1低表達的結腸癌組織；圖3-D是COL3A1高表達的結腸癌上皮細胞；圖3-E/F是COL3A1中低表達和高表達的結腸癌基質；圖3-G是COL3A1高低表達的顏色標記(用ImageScope軟體分析標記)；圖3-H是COL3A1蛋白在正常結腸組織和結腸癌組織中的上皮細胞中表達差異統計；圖3-I是COL3A1蛋白在正常結腸組織和結腸癌組織中的基質細胞中表達差異統計。圖4是Kaplan-Meier曲線分析COL3A1的基因和蛋白表達與結腸癌生存的關係圖，其中，圖4-A是COL3A1基因表達與結腸癌病人總體生存的Kaplan-Meier曲線分析圖，基因表達數據來源於Oncomine基因表達公共資料庫；圖4-B是COL3A1基因表達與結腸癌病人無病生存的Kaplan-Meier曲線分析圖，基因表達數據來源於Oncomine基因表達公共資料庫；圖4-C是COL3A1蛋白在結腸癌組織中的上皮細胞表達與結腸癌病人總體生存的Kaplan-Meier曲線分析圖，圖4-D是COL3A1蛋白在結腸癌組織中的基質細胞表達與結腸癌病人總體生存的Kaplan-Meier曲線分析圖。圖5是COL3A1基因和蛋白檢測結腸癌的能力的分析，其中，圖5-A是ELISA分析結腸癌病人和正常人血漿中的COL3A1蛋白表達，根據標準品的量測定COL3A1在病人和正常人血漿中的量，p值為用Studentttest(T檢驗)分析得到的顯著性值，N代表病例數；圖5-B是COL3A1蛋白血漿表達的受試者操作特性(ROC)曲線分析，橫坐標代表假陽性或1-特異性，縱坐標代表真陽性或靈敏度，對角線是參考線，AUC代表線下面積；圖5-C是COL3A1蛋白血漿表達的受試者操作特性(ROC)曲線分析，其中，圖5-DCOL3A1蛋白血漿表達的受試者操作特性(ROC)曲線分析；圖5-E是COL3A1蛋白血漿表達的受試者操作特性(ROC)曲線分析；圖5-F是COL3A1蛋白血漿表達的受試者操作特性(ROC)曲線分析。具體實施方式下面結合實施例對本發明作詳細說明，而不會限制本發明。實施例1利用Oncomine公共資料庫(https://www.oncomine.org/resource/login.html)分析COL3A1基因在結腸癌和癌旁組織中的表達，分析方法：登錄上述Oncomine資料庫，輸入SPON2基因名，腫瘤類型選擇結腸癌，數據類型選擇mRNA，差異分析類型選擇癌和正常分析，繼而分析COL3A1基因在各個數據集中的表達情況，將各個數據集中COL3A1基因在癌和癌旁表達值分別下載、另行分析其表達的差異是否顯著；分析結果證明COL3A1基因在癌組織中相比於癌旁組織呈現顯著高表達趨勢，這被多個數據集的分析所證明，包括GaedckeColorectal(圖1-A，n＝65,p＝8.5E-13)、HongColorectal(圖-1B,n＝70,p＝0.037)、KaiserColon(圖-1C,n＝100,p＝0.029)、SkrzypczakColorectal2(圖-1D,n＝10,癌與癌旁比p＝0.003)和TCGAColorectal(圖-1E)。COL3A1在結腸腺瘤中上調，並且COL3A1基因在多種大腸癌組織中都顯著上升，如結腸腺癌、結腸粘液腺癌、盲腸腺癌、乙狀直腸腺癌和直腸粘液腺癌(圖-1E)。實施例2用Westernblot方法檢測COL3A1蛋白在結腸癌細胞系的表達，1、主要溶液配製：1)PBS溶液：量取生工20×PBS溶液25mL，超純水定容至500mL，室溫保存，2)50×Proteininhibitorcocktail(蛋白酶抑制劑母液)：取一粒羅氏蛋白酶抑制劑(completeEDTA-freeProteaseInhibitorcocktailtablets)，加入1mL超純水溶解，分裝，-20℃保存，此即為50×蛋白酶抑制劑母液，3)細胞裂解液：50mMTris-HCl(pH7.4)，1％SDS，2mMEDTA，分裝，-20℃保存，每毫升裂解液用時再加20μL50×Proteininhibitorcocktail，4)丙烯醯胺溶液：30％丙烯醯胺，0.8％甲叉雙丙烯醯胺，5)分離膠緩衝液：1.5mol/LTris-HClpH8.8，6)濃縮膠緩衝液：1.0mol/LTris-HClpH6.8，7)SDS：10％(m/v)，8)過硫酸氨AP：10％(m/v)，9)電泳緩衝液：25mmol/LTris，192mmol/L甘氨酸，0.1％(m/v)SDS，pH8.3，10)3×SDS凝膠加樣緩衝液：150mmol/LTris-HClpH6.8，300mmol/LDTT，6％SDS，0.3％溴酚藍，30％甘油，-20℃分裝保存，一般DTT現用現加，11)電轉緩衝液：25mmol/LTris，192mmol/L甘氨酸，12)TBST緩衝液：8.766gNaCl(即0.15mol/L)，1mLTween20，20mL1MTris-HCl(pH7.4)，加超純水定容到1L，13)封閉液：稱取5g脫脂奶粉溶解於100mLTBST中即為5％脫脂奶粉封閉液；2、培養細胞全蛋白的提取方法：1)用真空泵吸掉培養基，加入PBS洗一遍，吸掉，重複一次，2)將PBS吸掉，培養皿放到冰上，加入適量的細胞裂解液，靜置3min，3)充分裂解後，用乾淨的細胞刮快速地將細胞刮至培養皿一側，然後用槍將細胞碎片和裂解液轉移至1.5mL離心管中，4)4℃12000g離心15min，5)將離心後的上清分裝轉移至1.5mL離心管中，-20℃保存；3、蛋白定量方法：BCA蛋白濃度測定試劑盒碧雲天貨號:P00101)取BSA(Bio-rad)蛋白標準液，PBS稀釋至終濃度為0.5mg/mL，2)根據蛋白樣品數量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B，即50:1配製適量BCA工作液，充分混勻，該BCA工作液室溫24h內穩定，3)將標準液按0，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的標準品孔中，加PBS補足到20μL，4)吸取2μL蛋白樣品到96孔板的樣品孔中，加PBS補足20μL，5)各孔加入200μLBCA工作液，37℃培養箱中放置30min，6)BioTekEpoch多體積分光光度計OD562nm處測定吸光度。根據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度；4、SDS-PAGE凝膠電泳1)取成套Bio-Rad配膠用玻璃板ddH2O清洗乾淨後於烘箱中烘乾，用夾子固定在底座上，按以下配方配製10％分離膠和5％濃縮膠。製備分離膠時，上層用ddH2O封膠，室溫聚合40min以上；製備5％的濃縮膠時，將上層封膠ddH2O吸淨後，加入濃縮膠，插入梳子，並防止產生氣泡，10％分離膠配製如表1所示：濃縮膠配製如表2所示表1表22)待濃縮膠凝固後將凝膠板轉移至垂直電泳槽中，使凝膠板凹面向內。加入電泳緩衝液，拔出梳子，3)已測濃度的蛋白樣品按體積比為2:1加入3×loadingbuffer，沸水中煮5min，12000g離心1min，上樣(上樣量為30μg/泳道)，同時上樣預染蛋白Marker，作為分子量對照，4)電泳：濃縮膠先以45V電壓進行電泳，待溴酚藍指示劑進入分離膠後轉換成65V繼續電泳，待指示劑跑至分離膠底部0.5cm左右停止電泳；5、轉膜及Westernblot1)即時準備電轉緩衝液，根據凝膠大小，切割PVDF膜和濾紙，甲醇活化PVDF膜1min後，將PVDF膜和濾紙在電轉緩衝液中浸泡15min以上；2)撬開玻璃板，取出SDS-PAGE凝膠，放入電轉緩衝液中平衡，按黑板-海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊-白板的順序將凝膠與PVDF膜固定於溼轉電轉夾內，將夾子的黑面對應槽的黑面方向放入電轉槽中，加滿電轉緩衝液進行轉膜(冰浴)。通常使用110V2h電轉分子量較大的蛋白，也可在4℃冰箱中30V恆壓電轉過夜；3)封閉：轉膜結束後取出PVDF膜，將緊貼凝膠的一面(蛋白面)朝上放入孵育盒中，5％脫脂奶粉室溫封閉1h；4)一抗孵育：將抗COL3A1蛋白一抗(購自Sigma-Aldrich)用封閉液1:1000稀釋，4℃搖床上孵育過夜；5)TBST洗滌3次，每次5-10min；6)二抗孵育：將與一抗相對應的羊抗兔二抗用封閉液稀釋到適當濃度(1:5000-1:8000)，室溫搖床上孵育1h；7)TBST洗滌3次，每次5-10min；8)剪取合適大小的封口膜，在上面加入200-400μLThermoSuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrate超敏顯色液(按1:1現用現配工作液)，室溫靜置1min，使用Las-3000成像系統獲取Westernblot結果；；結果顯示：COL3A1蛋白在大部分所檢測的細胞系裡有表達，包括結腸癌細胞系SW620、SW480、Caco-2、HCT-116、HT-29，只有LoVo例外；而在SW620、SW480、HCT-116中豐度比較高，證明COL3A1蛋白主要與結腸癌細胞相關(如圖-2所示)。實施例3用免疫組化方法分析COL3A1蛋白在結腸癌和癌旁正常組織中的表達1、組織晶片：使用商業化組織晶片(上海芯超生物公司)，HCol-Ade180Sur-04包括90例、180點癌和癌旁組織，臨床信息包括性別、年齡、TNM、腫瘤大小、分期、分級、隨訪信息等。晶片樣本點的直徑都為1.5mm，固定方式為福馬林固定；2、烘蠟1)將組織晶片放入烘箱中，溫度調至63度，烘蠟一小時；2)配製試劑：10×PBS緩衝液(配方：80gNaCl、2gKCl、15.35gNa2HPO4、2gKH2PO4，用純水定容至1000毫升)：將10×PBS緩衝液稀釋至1×PBS緩衝液，再在1×PBS緩衝液中加入佔總體積0.05％的吐溫試劑；抗原修復液：82mL0.1mol/L的檸檬酸鈉溶液+18mL0.1mol/L的檸檬酸溶液+900mL的純水置於高壓鍋中；3、抗原修復1)片子烘烤完成後，從烘箱內取出，放入全自動染色機中，進行脫蠟；2)脫蠟過程：二甲苯兩缸，每缸15分鐘；無水乙醇兩缸，每缸7分鐘；90％酒精1缸，7分鐘；80％酒精1缸，7分鐘；70％酒精1缸，7分鐘；3)從染色機中取出片子，用純水衝洗3次，一次3分鐘。衝洗過程中將檸檬酸修復液放至電爐上開始加熱；4)抗原修復：檸檬酸修復液沸騰後，將片子放入高壓鍋中，蓋上高壓鍋蓋，待出氣後開始計時，5分鐘。時間到後終止加熱，將高壓鍋蓋打開，使其自然冷卻至室溫；4、阻斷配製內源性過氧化物酶阻斷劑。38.4mL無水甲醇+12mL30％濃度的H2O2+9.6mL純水；將片子放入阻斷劑中10分鐘；5、加入一抗1)取出片子，用PBS緩衝液衝洗3次，一次5分鐘；2)冰箱中取出COL3A1抗體，放入離心機裡7200轉離心30秒；3)取出抗體，按照稀釋度用DAKO抗體稀釋液1：800稀釋(稀釋度用預實驗確定，分別測試2種稀釋度)；4)滴加抗體；5)將溼盒放入冰箱，4℃過夜；6、加入二抗1)從冰箱裡取出溼盒，靜置1小時待其恢復到室溫；2)將片子用PBS緩衝液衝洗3次，一次5分鐘；3)滴加EnVisionTM+/HRP兔工作液(來自DAKO公司)，30分鐘；4)時間到後用PBS衝洗3次，一次5分鐘；7、DAB顯色：從冰箱裡取出DAB試劑盒，按1mLDAB稀釋液+1滴DAB色原進行配製；(來自DAKO液體DAB+底物系統)。在片子上滴加稀釋後的DAB，顯色5分鐘，到時後自來水衝洗15分鐘；8、蘇木素復染1)在片子上滴加蘇木素2分鐘，時間到後在0.25％的鹽酸酒精中浸沒2秒，用自來水衝洗2分鐘；2)將片子放入全自動染色機進行脫水，取出封片；3)脫水過程：75％酒精1缸，3分鐘；85％酒精1缸，3分鐘；95％酒精1缸，3分鐘；無水乙醇兩缸，每缸5分鐘；二甲苯兩缸，每缸5分鐘；9、掃描：用晶片掃描儀ScanscopeXT(Aperio公司)掃描；10、晶片染色的軟體分析1)用軟體AperioImageScopev.12打開晶片掃描文件，用軟體的注釋工具，分別選取上皮細胞部分和基質部分，將不需要的部分用反向選取工具剔除；有的樣本點，缺乏腫瘤上皮細胞，無法統計表達情況，這樣的點放棄；2)用軟體自帶的positivepixelcountalgorithm(v9.1)工具，採用默認參數，計算選取部分的像素點及光密度值，像素點統計分為4類：陰性，弱陽性，陽性和強陽性。表達高低用軟體計算的陽性率表示，陽性率＝所有陽性像素點個數/(所有陽性像素點個數+所有陰性像素點個數)；3)癌的上皮細胞，癌的基質部分，癌旁的上皮細胞，癌旁的基質部分，這4種組織部分分別統計；4)為比較，COL3A1蛋白表達按照陽性率的中位數分為2部分，即低表達和高表達；5)用GraphPadPrism6軟體作圖；結果顯示，癌旁COL3A1陰性表達的樣本如圖-3A所示，癌旁COL3A1陽性表達的樣本如圖-3B所示，結腸癌COL3A1陰性表達的樣本如圖-3C所示，結腸癌COL3A1高表達的樣本如圖3D所示，結腸癌基質COL3A1低表達如圖-3E所示，結腸癌基質COL3A1高性表達如圖-3F所示，圖3-G是圖3-D中的腫瘤組織，在ImageScope軟體注釋並用positivepixelcountalgorithm(v9.1)工具分析後生成的顏色標記圖，紅色表示強陽性表達，橙色表示陽性表達，黃色表示弱陽性表達，藍色表示陰性表達，綠色虛線框住的區域，是分析上皮細胞表達時剔除的基質區域；使用HCol-Ade180Sur-04組織晶片，在上皮區域表達分析中，有效的癌旁點是82例，有效的癌點是84例，經T檢驗，顯示COL3A1蛋白在結腸癌樣本中的表達顯著高於癌旁正常組織(p＝3.4E-33，不配對t檢驗；p＝4.6E-22，配對t檢驗，n＝76)(如圖-3H所示)；在基質區域分析中，有效的癌旁點是83例，有效的癌點是85例，經T檢驗，顯示COL3A1蛋白在結腸癌樣本中的表達顯著高於癌旁正常組織(p＝0.3161，不配對t檢驗；p＝0.3353，配對t檢驗，n＝79)(如圖-3I所示)；結果表明，COL3A1蛋白在結腸癌和癌旁中，在上皮細胞中的表達是顯著差異表達，但在癌和癌旁的基質部分，COL3A1蛋白表達無差異，說明COL3A1蛋白是癌上皮細胞特異的分子標誌物。實施例4COL3A1表達與結腸癌病人臨床參數的關係第一，COL3A1基因表達與結腸癌病人臨床參數顯著相關：用Oncomine基因表達資料庫分析(獲取數據方法同前)，結腸癌樣本按照COL3A1基因的表達的中位數分為2組，一組為大於中位數的高表達組，一組為小於中位數的低表達組，用K平方法分析COL3A1基因的高、低表達與臨床參數的關係。所用軟體為PASWStatistics18；結果顯示：COL3A1基因的表達與分期(SmithColorectal,χ2＝10.468,p＝0.015)、T分期(BittnerColon,χ2＝10.073,p＝0.018)、Dukes分期(BittnerColon,χ2＝7.607,p＝0.022；JorissenColorectal3,χ2＝22.850,p＝0.000)、吸菸(BittnerColon,χ2＝4.523,p＝0.033)、性別(VilarColorectal2,χ2＝10.650,p＝0.014；JorissenColorectal3,χ2＝9.491,p＝0.050)、復發(SmithColorectal,χ2＝7.502,p＝0.006；JorissenColorectal3,χ2＝6.641,p＝0.008)和生存(SmithColorectal,χ2＝12.78,p＝0.000)有顯著關係(如表3所示)，總體上，COL3A1基因表達上調與腫瘤進展呈正相關，男性病人COL3A1基因上調更明顯；表3.利用Oncomine資料庫中的數據集分析COL3A1基因表達與結腸癌病人臨床病理參數的關係。第二，COL3A1蛋白表達也與結腸癌病人臨床參數顯著相關：根據組織晶片的免疫組化分析結果，我們發現COL3A1蛋白的表達與分級(χ2＝6.731,p＝0.02)、T分期(χ2＝6.923,p＝0.01)和分期(χ2＝8.438,p＝0.000)有顯著關係(如表4所示)；表4COL3A1蛋白表達與結腸癌病人臨床病理參數的關係(組織晶片的免疫組化分析)結果表明，COL3A1的基因高表達和蛋白高表達都與結腸癌的臨床參數相關，COL3A1具有結腸癌的分子標誌物的潛在作用。實施例5Kaplan-Meier方法分析COL3A1基因和蛋白的表達與結腸癌病人預後的關係第一，COL3A1基因高表達與結腸癌病人手術後預後不良顯著相關：利用Oncomine資料庫的基因表達數據集SmithColorectal分析COL3A1基因表達高低與手術後結腸癌病人的生存時間的關係，COL3A1基因的表達分為大於中位數(88例)和小於中位數(89例)兩組，用Kaplan-Meier曲線分析方法做圖，兩組數據顯著性用Log-rank檢驗方法來檢驗，結果證明COL3A1基因表達高的一組病人，其整體生存期(Overallsurvival)顯著縮短(Log-rank檢驗，p＝0.0029)(圖-4A)，低表達時的平均生存時間為103.805個月(預測值，標準誤6.544，置信區間90.978-116.632)，而高表達時的平均生存時間為71.019個月(預測值，標準誤6.140，置信區間58.985-83.053)；如果考慮復發的因素，統計無病生存率(Diseasefreesurvival)，則同樣COL3A1基因表達高的一組病人，其無病生存期也顯著縮短(Log-rank檢驗，p＝0.0252)(圖-4B)，低表達時的平均無病生存時間為91.411個月(預測值，標準誤7.286，置信區間77.131-105.692)，而高表達時的平均無病生存時間為66.951個月(預測值，標準誤6.031，置信區間55.131-78.770)；第二，COL3A1蛋白的高表達也與結腸癌病人的預後不良顯著相關：利用組織晶片進行免疫組化分析，研究COL3A1蛋白與結腸癌病人預後生存的關係；COL3A1蛋白在腫瘤上皮細胞表達高的病人，其生存期比COL3A1蛋白在腫瘤上皮細胞表達低的病人顯著縮短(Log-rank檢驗，p＝0.0298)(圖-4C)；。COL3A1蛋白在腫瘤上皮細胞表達低的病人整體生存平均生存時間為72.129個月(預測值，標準誤6.081，置信區間60.210-84.048)，而COL3A1蛋白在腫瘤上皮細胞表達高的病人的平均整體生存時間為52.565個月(預測值，標準誤5.203，置信區間42.368-62.763)；作為對比，腫瘤和正常組織的基質中的COL3A1蛋白表達高低，與結腸癌病人的預後無顯著相關性(Log-rank檢驗，p＝0.6693)(圖-4D)；實驗結果證明，COL3A1基因和蛋白(上皮細胞)的高表達縮短了結腸癌病人手術後的生存時間，COL3A1基因和蛋白(上皮細胞)的表達可以作為結腸癌預後生存時間的判斷指標。實施例6單變量和多變量Cox回歸分析分析COL3A1基因和蛋白與預後風險的關係第一、COL3A1基因與預後風險有關，但不是獨立的風險因素，利用Oncomine資料庫的基因表達數據集SmithColorectal分析COL3A1基因與結腸癌病人預後風險的關係，單變量Cox回歸分析結果發現與整體生存和無疾病生存的預後風險顯著相關的因素包括COL3A1基因的高表達、高分級、有復發、高分期，多變量Cox回歸分析發現有復發、高分期是結腸癌病人預後的獨立風險因素(如表5所示)；表5.COL3A1基因表達及其他臨床參數影響結腸癌病人整體生存及無疾病生存時間的單變量和多變量分析第一、COL3A1在上皮細胞中的表達與預後風險有關，但不是獨立的風險因素，本發明使用單變量和多變量Cox回歸方法，進一步分析COL3A1蛋白(上皮細胞)表達及其他臨床參數與結腸癌病人生存風險的關係，單變量Cox回歸分析結果表明，結腸癌病人的T分期(p＝0.018,風險比1.889,95％置信區間1.259-2.834)、N分期(p＝0.000,風險比＝1.534,95％置信區間＝1.266-1.859)、M分期(p＝0.000,風險比＝10.484,95％置信區間＝3.075-35.747)、分期(p<0.001,風險比＝1.311,95％置信區間＝1.147-1.499)、轉移(p＝0.002,風險比＝10.123,95％置信區間＝2.294-44.664)和COL3A1蛋白(上皮細胞)表達(p＝0.030,風險比＝2.053,95％置信區間＝1.071-3.935)與結腸癌預後風險顯著相關(表6)；作為比較的是，基質表達的COL3A1與預後風險無顯著相關；多變量回歸分析表明，高的T、N、M分期顯著影響結腸癌病人的預後，增加預後風險，是獨立的風險因素；表6.COL3A1蛋白表達及其他臨床參數影響結腸癌病人生存時間的單變量和多變量分析(組織晶片及免疫組化分析)。結果表明，COL3A1蛋白(上皮細胞)表達是影響結腸癌病人生存的潛在風險因素，單不是獨立風險因素。通過檢測結腸癌病人癌組織中的COL3A1蛋白的表達，結合其他臨床指標，就可以預測結腸癌病人的預後生存風險情況。實施例7檢測結腸癌病人血液中的COL3A1蛋白的表達水平及其區分結腸癌病人與正常人的能力，COL3A1蛋白酶聯免疫試劑盒試劑盒(Cloud-CloneCorp公司產品)購自上海武昊公司。1、結腸癌病人68例，和正常人的血漿86例，其中結腸癌病人經過手術確診；2、主要溶液配製：1)標準品(凍幹品)稀釋：每瓶標準品加入標準品稀釋液1mL，蓋好後室溫放置大約10分鐘，同時反覆顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10,000pg/mL(貯液)，然後再將其進行梯度稀釋，依次稀釋成5,000pg/mL，2,500pg/mL,1,250pg/mL,625pg/mL,312pg/mL,156pg/mL,78pg/mL，標準品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔；2)血清樣本稀釋：稀釋10倍，取20μL血清或血漿加入180μLPBS；3)檢測溶液A及檢測溶液B配製：DetectionA及DetectionB使用前甩動使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底，用前分別用去離子水以1:100稀釋(如：10μL檢測溶液A/990μL去離子水)，充分混勻，稀釋前根據計算好的每次實驗所需的總量配製(100μL/孔)，實際配製時應多配製0.1-0.2mL；4)洗滌液：用580mL去離子水將20mL濃洗滌液稀釋至600mL，進行30倍稀釋；3、操作步驟：1)加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標準品。空白孔加100μL標準品稀釋液，餘孔加待測樣品100μL，酶標板加上覆膜，37℃溫育2小時；2)棄去液體，甩幹；3)每孔加檢測溶液A工作液100μL，酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時；4)棄去孔內液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，甩掉酶標板內的液體，在實驗臺鋪墊吸水紙，酶標板朝下拍，重複洗板3次，洗滌後，甩幹孔內洗滌液；5)每孔加檢測溶液B工作液100μL，加上覆膜，37℃溫育30分鐘；6)棄去孔內液體，甩幹，洗板5次，方法同步驟4；7)每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色20分鐘；8)每孔加終止溶液50μL，終止反應；9)確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡後，立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(O.D.值)；以標準品的濃度為縱坐標，O.D.值為橫坐標，繪製標準曲線；根據樣品O.D.值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(20倍)，即為樣品的實際濃度(ng/mL)；結果顯示：1)結腸癌病人及正常人血液中的COL3A1蛋白的表達水平酶聯免疫吸附檢測法測定了結腸癌病人及正常人血液中的COL3A1蛋白的表達水平，證明COL3A1蛋白在結腸癌病人(86例)血漿中的水平顯著高於正常人(68例)(p＝1.3E-10)(如圖-5A所示)，結腸癌病人血漿中COL3A1蛋白的平均濃度為159.2ng/mL，而正常人則為45.34ng/mL，病人遠高於正常人；2)血漿中COL3A1蛋白的表達水平區分結腸癌病人與正常人的能力根據酶聯免疫吸附實驗的結果，利用受試者操作特徵曲線分析，COL3A1蛋白的線下曲線面積(AUC)值為0.92(如圖-5B，表7所示)，說明COL3A1蛋白作為血漿標誌物可以很好地將結腸癌病人與正常健康人區分開來，COL3A1蛋白可以作為結腸癌診斷的血漿指標；3)血漿COL3A1蛋白檢測結腸癌的靈敏度和特異性：根據酶聯免疫吸附實驗的結果，可以獲知血漿COL3A1蛋白檢測結腸癌的靈敏度和特異性，當血漿COL3A1蛋白濃度為54.23ng/mL時，結腸癌檢測的靈敏度是98.8％，而特異性是69.1％(如表8所示)。表7.受試者特性曲線分析的曲線下的面積(AUC)。a.在非參數假設下，b.零假設：實面積＝0.5。表8顯示接受者操作特徵曲線分析結腸癌病人及正常人血漿中COL3A1的表達檢測結腸癌的靈敏度和特異性，a最小界限值是最小觀測檢驗值減1，最大界限值是最大觀測檢驗值加1。所有其它的界限值都是兩個鄰近的觀測檢驗值的平均值。表8實施例8結腸癌病人癌組織中的COL3A1蛋白的表達水平及其區分結腸癌病人與正常人的能力利用組織晶片-免疫組化的結果，分析COL3A1在上皮細胞及基質細胞中的表達在區分結腸癌病人與正常人的使用中的能力，方法：接受者操作特徵曲線分析；結果顯示：利用受試者操作特徵曲線分析，COL3A1蛋白(上皮表達)的線下曲線面積(AUC)值為0.976(如圖-5C，表9所示)，說明COL3A1蛋白(上皮表達)作為標誌物可以很好地將結腸癌病人與正常健康人區分開來，COL3A1蛋白(上皮表達)可以作為結腸癌診斷的分子標誌物。表9.COL3A1蛋白(上皮表達)受試者特性曲線分析的曲線下的面積(AUC)。a.在非參數假設下，b.零假設：實面積＝0.5，COL3A1蛋白(上皮表達)檢測結腸癌的靈敏度和特異性：根據ROC分析的結果，可以獲知COL3A1蛋白(上皮表達)檢測結腸癌的靈敏度和特異性，當COL3A1蛋白(上皮表達)的陽性率為82.09％時，結腸癌檢測的靈敏度是95.2％，而特異性是91.5％(表8)；表10顯示了接受者操作特徵曲線分析結腸癌病人及正常人腫瘤中COL3A1(上皮表達)的表達檢測結腸癌的靈敏度和特異性；a最小界限值是最小觀測檢驗值減1，最大界限值是最大觀測檢驗值加1。所有其它的界限值都是兩個鄰近的觀測檢驗值的平均值。表10與上皮表達相比，基質表達的COL3A1診斷結腸癌效果較差，其AUC值為0.573(如圖5-D所示)，無診斷價值；結果表明：腫瘤上皮細胞表達的COL3A1蛋白具有診斷價值，AUC為0.976，比血漿中的COL3A1蛋白的AUC值高，並且靈敏度達95.2％(與血漿COL3A1相當)，而特異性為91.5％(比血漿COL3A1明顯好)。實施例9結腸癌病人癌組織中的COL3A1基因的表達水平及其區分結腸癌病人與正常人的能力利用Oncomine資料庫的基因表達數據集，分析COL3A1基因表達在區分結腸癌病人與正常人的使用中的能力，方法按接受者操作特徵曲線分析。結果顯示：第一、利用GaedckeColorectal數據集，結腸癌65例，正常組織65例，受試者操作特徵曲線分析，COL3A1基因的線下曲線面積(AUC)值為0.829(如圖-5E，表11所示)，說明COL3A1基因表達作為標誌物可以很好地將結腸癌病人與正常健康人區分開來，COL3A1基因可以作為結腸癌診斷的分子標誌物；表11.COL3A1蛋白(上皮表達)受試者特性曲線分析的曲線下的面積(AUC)。a.在非參數假設下，b.零假設：實面積＝0.5；COL3A1基因(GaedckeColorectal數據集)檢測結腸癌的靈敏度和特異性：根據ROC分析的結果，獲知COL3A1基因檢測結腸癌的靈敏度和特異性，當COL3A1基因的晶片檢測表達值為5.8時，結腸癌檢測的靈敏度是76.9％，而特異性是92.3％(如表12所示)。表12是接受者操作特徵曲線分析結腸癌病人及正常人腫瘤中COL3A1基因表達檢測結腸癌的靈敏度和特異性；a最小界限值是最小觀測檢驗值減1，最大界限值是最大觀測檢驗值加1。所有其它的界限值都是兩個鄰近的觀測檢驗值的平均值。表12第二、利用TCGAColorectal數據集，結腸癌215例，正常組織22例，受試者操作特徵曲線分析，COL3A1基因的線下曲線面積(AUC)值為0.863(如圖-5F，表13所示)，說明COL3A1基因表達作為標誌物可以很好地將結腸癌病人與正常健康人區分開來，COL3A1基因可以作為結腸癌診斷的分子標誌物。表13.COL3A1蛋白(上皮表達)受試者特性曲線分析的曲線下的面積(AUC)a.在非參數假設下，b.零假設：實面積＝0.5，COL3A1基因(TCGAColorectal數據集)檢測結腸癌的靈敏度和特異性：根據ROC分析的結果，獲知COL3A1基因檢測結腸癌的靈敏度和特異性，當COL3A1基因的晶片檢測表達值為6.0時，結腸癌檢測的靈敏度是82.8％，而特異性是81.8％(如表14所示)；表14顯示接受者操作特徵曲線分析結腸癌病人及正常人腫瘤中COL3A1基因表達檢測結腸癌的靈敏度和特異性，a最小界限值是最小觀測檢驗值減1，最大界限值是最大觀測檢驗值加1，所有其它的界限值都是兩個鄰近的觀測檢驗值的平均值；表14結果說明，COL3A1基因表達可以作為結腸癌診斷的分子標誌物，結腸癌檢測的靈敏度是76.9％-82.8％，而特異性是81.8％-92.3％。當前第1頁1 2 3