一種固定鈦離子親和色譜材料及其製備和應用的製作方法

2023-05-21 09:22:51

專利名稱：：一種固定鈦離子親和色譜材料及其製備和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及磷酸肽的分離和富集，具體地說是一種固定鈦離子親和色譜材料及其製備和在磷酸化肽富集中的應用，本發明應用鈦離子與磷酸基團之間的強相互作用將鈦離子固定在磷酸改性的固相載體上形成固定鈦離子親和色譜材料。磷酸肽由於磷酸基團與固定的鈦離子之間的強相互作用而保留在固定鈦離子親和色譜材料，從而實現特異性地從複雜的蛋白酶解液中分離和富集磷酸肽。
背景技術：
：隨著人類基因組計劃的完成，生命科學進入了功能基因組時代。人類基因組中大約有2%的基因編碼500多個蛋白激酶和100多個磷酸酯酶，對應蛋白的磷酸化和去磷酸化。蛋白磷酸化是最常見、最重要的一種翻譯後修飾，在真核生物中，蛋白質磷酸化是非常重要和普遍的現象，蛋白質可逆磷酸化將胞外信息傳遞到核內，因此在細胞生長、分裂、分化、代謝、癌症的產生等生命活動過程中起著關鍵得作用；對眾多蛋白質生物化學功能擔負開/關調控責任，是一種普遍的調控機制。據統計，在任一給定時刻，細胞內約有三分之一的蛋白質存在磷酸化形式(文獻l.Mann,M.;Jensen,0.N.,Proteomicanalysisofpost隱translationalmodifications,淑腸fec/mo/2003，21,(3),255-61.文獻2.M丄oyee,K.;T.Stults,J.;Amott,D.,MassSpectrometricContritutionstothePracticeofPhosphorylationSiteMappingthrough2003.Mo/.Ce〃.Profeow/cs2005，4,235-245.)。蛋白磷酸化修飾位點的鑑定是目前蛋白組學研究中的研究熱點和難點。最近，質譜技術在蛋白磷酸化的定性中，已經發展成為重要的工具之一(文獻3.Aebersold,R.;Mann,M.,Massspectrometry-basedproteomics.A^mm2003，422,(6928),198-207.)。然而，質譜在鑑定磷酸化蛋白現在仍然是一個巨大的挑戰，其具體體現在第一，磷酸化蛋白在細胞內中屬於低豐度蛋白；第二，磷酸化肽的負電性使其在質譜檢測中難以質子化；第三，酶解產物中存在的大量的非磷酸化肽的質譜信號通常會抑制磷酸化肽的離子信號。因此，複雜蛋白酶解產物中磷酸化肽的分離和富集是質譜成功鑑定磷酸化最為重要的一步(文獻4.Reinders,J.;Sickmann,A.,State-of-the-artinphosphoproteomics.屍ra化麵b2005，5,(16),4052-61.文獻5.McLachlin,D.T.;Chait,B.T.,Analysisofphosphorylatedproteinsandpeptidesbymassspectrometry.C髒(9—.C/2洩腸/2001，5,(5),591-602.)。從磷酸化蛋白的酶解混合物中分離和富集磷酸化肽是目前進行磷酸化研究的比較理想的方法，也是成功實現質譜分析最關鍵的一步。到目前為止，分離和富集磷酸肽最常用的是固定化金屬離子親和色譜(ImmobilizedMetalA伍nityChromatography,IMAC)。IMAC運用於磷酸肽的分離和富集是基於磷酸化肽上的磷酸基團與固定金屬離子之間的螯合作用。在IMAC技術中，最為廣泛使用的金屬離子是Fe"(文獻6.Nuhse,T.S.;Stensballe，A.;Jensen,O.N.;Peek,S.C.,Large-scaleanalysisofinvivophosphorylatedmembraneproteinsbyimmobilizedmetalionaffinitychromatographyandmassspectrometry.Mo/.Ce〃./Vo/eom/cs2003，2,(11)，1234-43.文獻7.Moser，K.;White,F.M.,PhosphoproteomicanalysisofratliverbyhighcapacityIMACandLC-MS/MS.乂Prafeo膨m006，5,(1),98-104.)I口Ga3+(文獻8.Posewitz,M.C.;Tempst,P.,Immobilizedgallium(III)affinitychromatographyofphosphopeptides.屈a/.C/e附1999，71,(14),2883-92.)，而廣泛使用的螯合基團主要是亞氨基二乙酸(IDA)(文獻9.Pan,C.;Ye,M.;Liu,Y.;Feng,S.;Jiang,X.;Han,G.;Zhu,J.;Zou,H.，EnrichmentofphosphopeptidesbyFe3+-immobilizedmesoporousnanoparticlesofMCM-41forMALDIand腿o-LC-MS/MSanalysis.乂細te謹e.T^2006，5,(11),3114-24.)禾口次氮基三乙酸(NTA)(文獻10.D醒，J.D.;Watson,J.T.;Bmening,M.L"DetectionofphosphopeptidesusingFe(III)陽nitrilotriacetatecomplexesimmobilizedonaMALDIplate.Jwa/.C77謹2006，78,(5),1574-80.)。IMAC的一個顯著的缺點是，一些帶有酸性胺基酸殘基的肽段同時也會被保留從而幹擾磷酸肽的檢測。儘管將酸性穀氨酸和天冬氨酸殘基酸中的酸性偵B連酉旨化(文獻11.Ficarro,S.B.;McCleland,M.Stukenberg,RT.;Burke,D.J.;Ross,M.M.;Shabanowitz,J.;Hunt,D.F.;White,F.M.,PhosphoproteomeanalysisbymassspectrometryanditsapplicationtoSaccharomycescerevisiae.7VW,B/ofec/7"0/2002，20,(3),301-5.)，能減少酸性肽的非特異性吸附，但是通常反應並不能完全進行，而且會增加樣品的複雜程度，從而幹擾後續的質譜分析。金屬氧化物(Zr02(文獻12.KweonH.K.;Hakansson,K.,Selectivezirconiumdioxide-basedenrichmentofphosphorylatedpeptidesformassspectrometricanalysis.Jwa/.CTze附2006，78,(6),1743-9.文獻13.Zhou,H.;Tian,R.;Ye,M.;Xu,S.;Feng,S.;Pan,C.;Jiang,X.;Li,X.;Zou,H.,Highlyspecificenrichmentofphosphopeptidesbyzirconiumdioxidenanoparticlesforphosphoproteomeanalysis.￡/e"r—o固.s2007，28,(13),2201-15.),Ti。2(文獻14.Cantin，G.T.;Shock,T.R.;Park,S.K.;Madhani,H.D.;Yates,J.R.,3rd，OptimizingTi02-basedphosphopeptideenrichmentforautomatedmultidimensionalliquidchromatographycoupledtotandemmassspectrometry.J腦/.C/z證2007,79，(12)，4666-73.文獻15.Thingholm,T.E.;Jorgensen,T.J.;Jensen,O.N.;Larsen,M.R.,Highlyselectiveenrichmentofphosphorylatedpeptidesusingtitaniumdioxide.TVat屍rotoc2006，1,(4),1929-35.文獻16.Pocsfalvi，G.;Cuccur函，M.;Schlosser,G;Scacco，S.;Papa,S.;Malomi，A.,PhosphorylationofB14.5asubunitfrombovineheartcomplexIidentifiedbytitaniumdioxideselectiveenrichmentandshotgunproteomics.A/o/.Ce〃.屍roteow/cs2007，6,(2),231-7.))也被應用於磷酸肽的分離和富集，並顯示出比一般IMAC對磷酸肽更高的特異性。Zr02、Ti02等金屬氧化物之所以能富集磷酸肽，是由於其中的鋯、鈦等離子與磷酸肽中的磷酸基團有很強的相互作用。雖然Zr02、Ti02等金屬氧化物對磷酸肽有較好的富集作用，但是由於空間位阻的原因，有些磷酸肽可能不容易被富集。而如果Ti"或者Zr"離子固定於色譜材料上，則由於存在間隔臂而使空間位阻減小，進而提高磷酸肽的富集效果。最近發展出了固定鋯離子的新IMAC方法(Zr4+-IMAC)(文獻17.Zhou,H.;Xu,S.;Ye，M.;Feng,S.;Pan,C.;Jiang,X.;Li，X.;Han,G.;Fu,Y.;Zou,H.,Zirconiumphosphonate-modifiedporoussiliconforhighlyspecificcaptureofphosphopeptidesandMALDI-TOFMSanalysis.,/Vo/eo附e.ies2006，5,(9),2431-7.文獻18.Feng,S.;Ye,M.;Zhou,H.;Jiang,X.;Jiang,X.;Zou,H.;Gong,B.,Immobilizedzirconiumionaffinitychromatographyforspecificenrichmentofphosphopeptidesinphosphoproteomeanalysis.Mo/.Ce〃.Prafeom/"2007，6,(9),1656-65.)，與常規IMAC相比，該方法對磷酸肽顯示出更好的特異性和選擇性。本發明提出製備固定鈦離子親和色譜(Ti4+-IMAC)材料的方法以及利用Ti4+-IMAC富集磷酸肽的方法。固定鈦離子親和色譜材料的製備和應用，在此前都未見文獻報導。
發明內容本發明的目的在於提供一種固定鈦離子親和色譜材料及其製備和應用，固定鈦離子的親和色譜材料顯示出對磷酸肽高的特異性和選擇性。為實現上述目的，本發蝗採用的技術方案為一種固定鈦離子親和色譜材料(Ti"-IMAC)，可按如下過程製備獲得，將含有磷酸基團的固相載體與鈦離子溶液接觸，利用鈦離子與磷酸改性的固相載體上的磷酸基團的強相互作用，使鈦離子通過磷酸配體固定在載體上，獲得固定鈦離子親和色譜材料(T產-IMAC)。所述含有磷酸基團的固相載體，磷酸基團與固相載體間為共價鍵合；其結構如下，固定鈦離子親和色譜材料的製備方法將含有磷酸基團的固相載體與鈦離子溶液接觸，利用鈦離子與磷酸改性的固相載體上的磷酸基團的強相互作用，使鈦離子通過磷酸配體固定在載體上，獲得固定鈦離子親和色譜材料7^4+-1^1八。圖la.給出了固定鈦離子的示意圖。將磷酸改性的固相載體置於含鈦離子的溶液中攪拌或接觸一段時間，鈦離子通過與磷酸基團的強螯合作用而固定於色譜材料形成固定鈦離子親和色譜材料。所述鈦離子溶液可為硫酸鈦溶液；所述親和色譜材料可通過對現有的固相載體進行化學衍生，於其表面化學健合磷酸基團製備獲得；所述固相載體為常規色譜載體中的矽膠顆粒、有機聚合物小球或瓊脂糖顆粒，或者是整體柱材料、納米材料、介孔材料(如易於改性的介孔MCM-41)、磁珠、晶片材料或其它顆粒狀載體等固相載體。化學衍生的過程是通過對固相載體表面改性後的氨基化，磷醯化反應得到含有磷酸基團的固相載體材料；也可以是其他如磷酯化反應，或者可以衍生得到磷酸基團的反應均可以使用。所述親和色譜材料可通過將含有磷酸基團的功能單體參與聚合形成的聚合物；所述聚合可為本體聚合、懸浮聚合、乳液聚合或溶液聚合等其他聚合反應均可以使用；功能單體可為2-(甲基丙烯醯氧)-乙基磷酸酯或其他可以提供磷酸基團的單體均可以使用；所使用的交聯劑為亞甲基雙丙烯醯胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯、三丙烯酸季戊四醇酯、二乙烯基苯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯或N,N，-二亞甲基二丙烯醯胺等。本發明提出的磷酸肽的富集方法，以固定鈦離子的親和色譜Ti4+-IMAC為分離材料分離和富集磷酸肽，磷酸肽由於(其上帶有的磷酸基團)與固定的鈦離子之間的強螯合作用而保留在固定鈦離子親和色譜材料上，從而實現特異性地從複雜的蛋白酶解液中分離和富集磷酸肽的目的。圖lb.給出了磷酸肽富集的示意圖，磷酸肽中的磷酸基團由於與固定的鈦離子之間的強螯合作用而獲得保留，而非磷酸肽則由於沒有磷酸基團而沒有保留，從而使磷酸肽從含大量非磷酸肽的肽的混合物中獲得分離。本發明具有如下優點:固定鈦離子的親和色譜材料顯示出對磷酸肽高的特異性和選擇性。同時，固定鈦離子的親和色譜材料顯示出對單磷酸化肽和多磷酸化肽的平等的富集能力。相對於金屬氧化1102和Zr02對磷酸化肽的富集，固定鈦離子親和色譜材料顯示出更高的特異性。圖1a.為製備固定鈦離子親和色譜材料的示意圖，圖1b.為利用固定鈦離子的親和色譜材料用於分離和富集磷酸肽的示意圖；圖2.固定鈦離子的聚合物親和材料對磷酸化蛋白a-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質譜圖。富集和檢測的磷酸肽的序列和位點見表1。圖3.固定鈦離子的聚合物親和材料對磷酸化蛋白(3-酪蛋白，卵清蛋白和標準的酪氨酸混合物中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質譜圖。富集和檢測的磷酸肽的序列和位點見表1。圖4.固定鈦離子的聚合物親和材料對半複雜樣品中磷酸化蛋白oc-酪蛋白和非磷酸化蛋白牛血清白蛋白(BSA)酶解液(摩爾比1:100,l:500)中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質譜圖。(a)直接分析oc-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物；(b)分離和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽；(c.)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物中分離和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:500的混合物中分離和富集得到的磷酸肽。圖5固定鈦離子的無機MCM-41材料對磷酸化蛋白a-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質譜圖。富集和檢測的磷酸肽的序列和位點見表l。圖6.固定鈦離子的無機MCM-41材料對磷酸化蛋白P-酪蛋白和標準的酪氨酸磷酸化肽混合物中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質譜圖。富集和檢測的磷酸肽的序列和位點見表1。圖7.固定鋯離子的聚合物親和材料對半複雜樣品中磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液(摩爾比1:100,l:500)中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質譜圖。(a)直接分析磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比1:100的混合物；(b)分離和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽；(c.)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物中分離和富集得到的磷酸肽;(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:500的混合物中分離和富集得到的磷酸肽。圖8.基於GMA-EDMA微球的Zr4+-IMAC對半複雜樣品中磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液(摩爾比1:100,l:500)中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質譜圖。(a)直接分析磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比1:100的混合物;(b)分離和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽;(c〕a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物中分離和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:500的混合物中分離和富集得到的磷酸肽。圖9.Fe3+-IMAC對半複雜樣品中磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液(摩爾比1:100,1:500)中的磷酸化肽的富集和純化的MALDI質譜圖。(a)直接分析磷酸化蛋白oc-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比1:100的混合物；(b)分離和富集得到的ot-酪蛋白酶解液中的磷酸肽；(cja-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物中分離和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:500的混合物中分離和富集得到的磷酸肽。圖10.Ti02對半複雜樣品中磷酸化蛋白oc-酪蛋白和BSA酶解液(摩爾比1:100,1:500)中的分離和富集得到的磷酸肽的MALDI質譜圖。(a)直接分析磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比1:100的混合物；(b)分離和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽；(cja-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物中分離和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:500的混合物中分離和富集得到的磷酸肽。圖11.Zr02對半複雜樣品中磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液(摩爾比1:100,l:500)中的磷酸肽的富集和純化的MALDI質譜圖。(a)直接分析磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比1:100的混合物；(b)分離和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽;(c.)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:100的混合物中分離和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩爾比為1:500的混合物中分離和富集得到的磷酸肽。具體實施方式本發明固定鈦離子親和色譜(Ti4+-IMAC)材料，是利用金屬鈦離子與磷酸基團之間的強螯合作用將鈦離子固載在磷酸基團改性的固相載體上。所述的含鈦離子的溶液可以是硫酸鈦axso4:b:)溶液也可以是其它任何含鈦離子的溶液。將磷酸基團改性的固相載體置於含鈦離子的溶液中靜置或攪拌一段時間二鈦離子就被固定於載體表面形成固定鈦離子親和色譜材料，如圖l(a)所示。所述的磷酸基團改性的固相載體是指在表面帶有磷酸基團的固相載體。這種磷酸基團改性的固相載體主要可以通過兩種方法製備獲得一)通過對固相載體進行化學衍生接上磷酸基團。這裡的固相載體可以是矽膠、聚合物小球、瓊脂糖顆粒等常規色譜載體，也可以是整體柱材料、納米材料、介孔材料、磁珠、晶片材料、其它顆粒狀載體等固相載體。利用這些固相載體表面的活性基團，經過化學反應將磷酸基團固定於固相載體。本發明以MCM-41介孔分子篩為例來說明通過化學衍生來製備磷酸基團改性的固相載體的方法，但本發明並不局限於介孔分子篩，其它任何可以被衍生為磷酸基團改性的固相載體均可以使用。二)直接通過含磷酸基團的單體經聚合後形成帶磷酸基團的聚合物固相載體。本發明以2-(甲基丙烯醯氧)-乙基磷酸酯單體與亞甲基雙丙烯醯胺交聯劑聚合反應為例來說明帶磷酸基團的聚合物固相載體的製備。但含有磷酸基團的單體不局限於本發明中的2-(甲基丙烯醯氧)-乙基磷酸酯，其他可以提供磷酸基團和可供聚合的單體也可以使用。聚合材料中所使用的交聯劑並不局限於本發明中提供的亞甲基雙丙烯醯胺，其他的交聯劑如二甲基丙烯酸乙二醇酯，三丙烯酸季戊四醇酯，二乙烯基苯，三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯，N,N'-二亞甲基二丙烯醯胺等也可以使用。本發明提出的使用固定鈦離子親和色譜材料分離和富集磷酸肽。利用固定鈦離子親和色譜材料分離和富集磷酸肽的過程主要可以分為上樣、淋洗、洗脫三步含磷酸肽的肽混合物首先上樣到固定鈦離子親和色譜材料，磷酸肽由於與固定的鈦離子之間的強相互作用而被保留；上樣後，通過淋洗將不保留或以非特異性保留的非磷酸肽去除，最後將特異性保留的磷酸肽洗脫。肽的混合物一般用甲酸、三氟乙酸、乙酸等酸酸化後上樣；為了消除非磷酸肽與色譜材料之間由於疏水相互作用和靜電相互作用而引起的非特異性吸附，使用的淋洗溶液一般需要含有一定濃度的有機溶劑和有較強的離子強度，如使用200mMNaCl/50%乙腈(ACN)/6。/。三氟乙酸(TFA)的水溶液衝洗。洗脫磷酸肽一般需要在鹼性條件下進行，如10%氨水。在固定鈦離子親合色譜材料的使用方式上，可以將其填充為色譜柱以色譜分離模式來富集磷酸肽，也可以通過填充在Tip頭裡而使用，還可以直接使用，通過離心等其它方法將固定鈦離子親和色譜材料與溶液分離。以下以一種聚合物和一種介孔分子篩材料為固相載體來說明固定鈦離子親和色譜材料的製備，但本發明並不局限於這兩種材料。以下以上述製備的兩種固定鈦離子親和色譜材料為例說明利用固定鈦離子親和色譜材料分離和富集磷酸肽的方法，但本發明並不局限於這兩種材料。以下實施例中，如果沒有特殊說明，溶液的百分比濃度均為體積1:匕。實施例l.固定鈦離子的聚合物親和材料的製備通過利用帶磷酸基團的單體與交聯劑聚合反應生成帶有磷酸基團的聚合物，該聚合物然後與鈦離子溶液反應得到固定鈦離子的聚合物親和材料，進一步應用於富集和純化磷酸肽。為了製備帶磷酸基團的聚合物材料，首先需要配製聚合物反應液。單體和交聯劑是反應液的主要成份，它們發生聚合反應後形成聚合物骨架。為了調節聚合物的物理化學性質，可以使用多種單體，但其中必須包括一種帶有磷酸基團的單體。多孔材料有更大的表面積，因此有更高的吸附容量。為了製備多孔的聚合物，需要在反應液中加入一定比例的致孔劑，致孔劑是一些有機溶劑，它們不參與聚合反應，在聚合反應發生後它們所佔據的空間將形成孔。通過調節致孔劑在反應液中的比例可以很方便的調節聚合物中孔的大小和機械強度。此外，一般還需要加入少量的引發劑來引發聚合反應。帶磷酸基團的聚合物製備得到後，與鈦離子溶液反應得到固定鈦離子的聚合物親和材料。本例採用單體2-(甲基丙烯醯氧)-乙基磷酸酯與交聯劑亞甲基雙丙烯醯胺聚合反應生成的帶磷酸基團的聚合物。該聚合物具有很好的親水性，因此非特異性很小，是親和色譜良好的載體。聚合物擁有極強的耐酸鹼性，耐壓和耐熱性和良好的親水性,以至能夠完全滿足於磷酸化肽離和富集所需要的強酸上樣，強鹼洗脫的嚴格的基質條件。聚合物然後與鈦離子(如Ti(S04)2)溶液)反應，鈦離子與聚合物上的磷酸基團有強離子和配位相互作用而固定在聚合物材料上，得到固定化鈦離子的親和聚合物材料，因而具有簡單、方便的特點(如圖la所示)。通過固定的鈦離子與磷酸肽中的磷酸基團的強的相互作用來實現特異性的分離和富集磷酸肽。固定在聚合物材料上一的鈦離子可以用於從複雜的蛋白質酶解液中分離和富集磷酸肽(如圖lb所示)。(1)帶磷酸基團聚合物親和材料的製備以2-(甲基丙烯醯氧)-乙基磷酸酯為功能單體，亞甲基雙丙烯醯胺為交聯劑，十二醇(400^L)，二甲基亞碸(540pL)和N,N-二甲基甲醯胺(100pL)為致孔劑，單體、交聯劑、致孔劑按質量百分比分別為13%、10%和77%均勻混合置於20mL的離心管中，接著加入為功能單體質量用量的1%的引發劑偶氮二異丁氰，然後將混合液超聲振蕩20min後，再通入N2脫氧10min，將離心管密塞並浸於60°C水浴中反應12h。反應完成後，研磨成均一性的微米級顆粒後，用甲醇浸泡除去致孔劑、殘留反應試劑以及反應產生的一些低聚合度物質，離心濾去甲醇，得到的聚合物材料然後置於真空乾燥箱中乾燥後備用。(2)固定鈦離子的聚合物親和材料的製備稱取10mg的聚合物材料，與10mL，100mM的Ti(S04)2溶液室溫下攪拌過夜得到固定鈦離子的親和聚合物材料。得到的固定鈦離子的親和聚合物材料用二次蒸餾水清洗，除去殘留的Ti(S04)2溶液和雜質，將清洗過的聚合物顆粒重新分散於體積濃度30%ACN/0.1%TFA溶液中備用。利用製備的固定鈦離子聚合物親合材料的分離和富集磷酸肽見實施例3-1。實施例2.固定鈦離子的無機親和材料的製備MCM-41是一種利用水熱分子自組織方法，即利用一定濃度的有機導向(表面活性劑)與無機物種(單體或者齊聚物)相互作用形成的六方相液晶織態結構的無機介孔矽材料。當通過熱處理或化學手段除去有機導向劑後，所得到的固體稱為MCM-41介孔分子篩。MCM-41介孔分子篩呈現多層次有序結構，可以在多個尺度(例如納米級，微米級或宏觀尺度)層次上具有特定有序結構或形貌。納米量級上，MCM-41呈有序的"蜂巢狀"多孔結構，即有-一維線性孔道或呈六方密堆的陣列，其孔徑可以在1.5-30nm範圍內調解，最典型的孔徑約為4nm，且具有很高的比表面積(通常可達1200m2/g)。MCM-41分子篩的優越性在於它具有均一且可調控的中孔孔徑，穩定的骨架結構，具有一定壁厚且易於摻雜的無定型骨架組成和比表面積大且可修飾的內表面。MCM-41的應用主要是以MCM-41中孔分子篩及其改性產物為主。MCM-41中孔分子篩本身可用作催化劑，吸附劑或催化劑載體等。但是改性MCM-41以滿足不同的需要仍然是MCM-41的一個研究熱點。本例中，無機MCM-41材料通過水熱晶化法合成得到，得到的MCM-41材料按照前面的方法(文獻17)，依次通過酸化引入矽羥基，進一步通過矽烷化反應引入氨基，最後通過磷醯化反應，將內壁引入磷酸基團。含有磷酸基團的無機MCM-41材料與鈦離子反應，鈦離子通過與磷酸基團的強烈的離子和配位相互作用，得到固定鈦離子的無機MCM-41材料。通過固定的鈦離子與磷酸肽中的磷酸基團的強烈的相互作用來實現特異性的分離和富集磷酸肽。固定在無機MCM-41材料的鈦離子可以用於從複雜的蛋白質酶解液中分離和富集磷酸肽(如圖lb所示)。(1)帶磷酸基團的無機MCM-41材料的製備製備無機MCM-41材料合成無機MCM-41材料按照前面的描述的方法(文獻9)。簡之，取2g的十六烷基三甲基溴化銨溶解到205mL的氨水(質量濃度為25%)和270mL的二次蒸餾水中，加熱攪拌均勻後立即加入10mL的四乙氧基矽烷，反應兩個小時後，然後將產物過濾，並用二次蒸餾水洗滌，然後置於真空乾燥箱中乾燥。將乾燥後的產物加入到450mL的乙醇和6mL的鹽酸中，在室溫下攪拌6h，然後過濾，將得到的產物分別用無水乙醇和水清洗，產品在120。C下真空乾燥，得到無機的MCM-41材料。無機材料MCM-41的活化取1.0gMCM-41分散於20mL、6M鹽酸中，輕微攪拌5h。抽濾，濾餅用二次蒸餾水洗滌多次，直到溶液顯中性，再用無水乙醇淋洗一遍，產品在12(TC下真空乾燥。無機材料MCM-41的氨基化取0.5g的活化後的MCM-41放入三頸瓶中，抽真空，在Ar氣保護下，加入25mL重蒸過的無水甲苯，再加入1.5mL3-氨丙基甲氧基矽垸，先常溫攪拌5h，再升溫至ll(TC回流16h。抽濾，濾餅用甲苯洗滌多次，再用乙醇衝洗，在11(TC下真空乾燥。磷酸基團衍生的無機MCM-41材料取0.2g的氨基化的MCM-41分散於15mL的無水甲苯中，再加入0.5mL無水吡啶，0.5mL重蒸過的三氯氧磷，室溫下攪拌18h。抽濾，濾餅先用甲苯清洗，再用二次蒸餾水清洗，最後置於三乙胺水溶液中浸泡20min,用二次蒸餾水清洗，再用乙醇清洗，在6(TC下真空乾燥。(2)固定鈦離子的無機MCM-41材料的製備稱取10mg的磷酸酯衍生的無機MCM-41材料，與10mL，100mM的Ti(S04)2溶液室溫下攪拌過夜得到固定的鈦離子的MCM-41材料。得到的固定的T產的MCM-41材料用二次蒸餾水清洗，除去殘留的Ti(S04)2溶液和雜質，將清洗過的MCM-41重新分散於30%ACN/0.1%TFA溶液中備用。利用製備的固定鈦離子無機MCM-41親和材料分離富集磷酸肽見實施例3-2。實施例3.固定鈦離子親和色譜材料用於磷酸肽的選擇性富集樣品溶液的製備lmg的ot-酪蛋白和l3-酪蛋白的分別溶解在lmL的50mM的碳酸氫銨溶液中(pH8.2)，按照與胰蛋白酶的質量比40:1的比例加入胰蛋白酶進行酶解反應，反應時間為16h,酶解溫度控制在37。C。獲得的蛋白酶解溶液置於-3(TC冰箱中保存備用。6.6mg的牛血清白蛋白和4.5mg的卵清蛋白分別溶解在lmL的還原性溶液中(pH8.2,8M尿素，50mM的碳酸氫銨溶液)，室溫下放置4h,然後向每管溶液中分別加入25pL，1M的DTT溶液，37。C下還原2h，再向每管溶液中加入50pL，1M的IAA溶液，室溫下暗處靜置30min，再用50mM的碳酸氫銨溶液稀釋十倍，再以胰蛋白酶和蛋白的比例按照l:40(w/w)加入，在37。C水浴下酶解16h。獲得的卵清蛋白酶解液置於-30'C冰箱中保存備用。獲得的牛血清白蛋白溶液分裝凍幹後置於-3(TC冰箱中保存備用。實施例3-1固定鈦離子的聚合物親和材料用於磷酸肽的富集(1).樣品1:(X-酪蛋白酶解液1的標準磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.pL")溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5pL固定的T產的聚合物親和材料(10mg.mU1)室溫下振蕩培育30min,然後依次分別用30的200mMNaCl/80%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，再用10pL，10%NH3.H20(質量濃度)洗脫結合的磷酸化肽，離心收集上層清夜，冷凍乾燥機中凍幹。富集的磷酸肽用2含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基質溶液重新溶解，然後取0.5點靶，用MALDI-TOFMS分析。所有的MALDI-TOF質譜分析在布魯克Autoflex飛行時間質譜儀上(Bruker,Bremen,Germany)完成，質譜儀上裝有延時離子萃取裝置，脈衝雷射的波長為337nm。實驗中得到的質譜數據都在線性正離子檢測模式中進行。質譜分子量的校正採用外標法.，從標準物血管緊縮素II和胰島素鏈B的離子信號對質譜校正。實驗中，每個質譜是30個雷射點的累加。分析結果由圖2可以看出來自a-酪蛋白酶解液中的13個磷酸化肽能夠特異性的被固定鈦離子的聚合物親和材料分離和富集，同時被MALDI-TOFMS質譜檢測。(2).樣品2:標準磷酸化P-酪蛋白，卵清蛋白的酶解液和標準的模型酪氨酸磷酸化肽的混合肽1的標準磷酸化P-酪蛋白,卵清蛋白的酶解液和標準的模型酪氨酸磷酸化肽(RRLIEDAEpYAARG,MW1599.00)的混合肽(1pmol.^iL—"溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5fiL固定鈦離子的聚合物親和材料(10mg.mL—1)室溫下振蕩培育30min,然後依次分別用30的200mMNaCl/50%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，在用10pL，10%NH3.H2O洗脫結合的磷酸化肽，離心收集上層清夜，冷凍乾燥機中凍幹，加入2|iL含1%H3P04的DHB(25mg.mL—"的基質溶液，重新分散純化的磷酸肽，然後取0.5點靶，用MALDI-TOFMS分析。分析結果由圖3可以看出來自P-酪蛋白,卵清蛋白的酶解液和標準的模型酪氨酸磷酸化肽的混合肽的7個磷酸化肽能夠特異性的被固定鈦離子的聚合物親和材料分離和富集，同時被MALDI-TOFMS質譜檢測。同時，酪氨酸磷酸化肽同樣能被有效的富集。因此，卵清蛋白酶解過程中引入的DTT,IAA，尿素以及酶解液中的糖基化肽段都不會干擾磷酸化肽的分離和富集。(3)樣品3:半複雜樣品的酶解混合物1^L的標準磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.(aL")分別與1|iL，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.^L")混合得到半複雜的肽段混合物溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5固定化Ti"的聚合物親和材料(10mg.mL—"室溫下振蕩培育30min,然後依次分別用30jiL的200mMNaCl/50%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，再用10jiL，10%NH3.H2O洗脫結合的磷酸化肽，離心收集上層清夜，冷凍乾燥機中凍幹，加入2iiL含P/。H3P04的DHB(25mg.mL")的基質溶液，重新分散純化的磷酸肽，然後取0.5點耙，用MALDI-TOFMS分析。分析結果由圖4可以看出，磷酸肽在高豐度的非磷酸化肽的背景幹擾下C非磷酸化蛋白酶解液的幹擾比例高達100倍和500倍)，圖4(a)可以看出，當BSA酶解液與a-酪蛋白酶解液比例在100:1時，大量的非磷酸化肽的峰主導MALDI質譜圖。圖4(c)和(d)可以看出，非磷酸化蛋白酶解液幹擾比例在100倍和500倍的情況下，磷酸化肽仍然能被固定鈦離子的聚合物親和材料特異性的分離和富集，而得到的MALDI質譜圖，13個磷酸肽的質譜峰清晰可見，而非磷酸肽沒有任何保留，所獲得的磷酸肽與直接富集單獨的(x-酪蛋白酶解液(圖4(a))中的磷酸肽的質譜圖很好的匹配。實施例3-2固定鈦離子的無機MCM-41材料用於磷酸肽的富集(1).樣品Ol-酪蛋白酶解液1JliL的標準磷酸化(x-酪蛋白酶解液(1pmol.)iL")溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5(iL固定化鈦離子的MCM-41(10mg.mL")室溫下振蕩培育30min,然後依次分別用30的80%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，在用10pL，10%NH3.H2O洗脫結合的磷酸化肽，離心收集上層清夜，冷凍乾燥機中凍幹，加入2pL含l。/。H3P04的DHB(25mg.mL")的基質溶液，重新分散純化的磷酸肽，然後取0.5pL點靶，用MALDI-TOFMS分析。分析結果由圖5可以看出來自(x-酪蛋白酶解液中的13個磷酸肽能夠特異性的被固定鈦離子的無機MCM-41材料分離和富集，同時被MALDI-TOFMS質譜檢測。(2).樣品2:標準磷酸化P-酪蛋白的酶解液和標準的模型酪氨酸磷酸化肽的肽混合物1的標準磷酸化卩-酪蛋白和標準的模型酪氨酸磷酸化肽的混合肽(lpmol.^L—J)溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5固定化鈦離子的MCM-41(10mg.mL—1)室溫下振蕩培育30min,然後依次分別用30pL的80%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，在用10pL，10%NH3.H20洗脫結合的磷酸肽，離心收集上層清夜，冷凍乾燥機中凍幹，加入2)iL含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基質溶液，重新分散純化的磷酸肽，然後取0.5pL點靶，用MALDI-TOFMS分析。分析結果由圖6可以看出來自(3-酪蛋白和標準的模型酪氨酸磷酸化肽的混合肽的5個磷酸肽能夠特異性的被固定鈦離子的無機MCM-41材料分離和富集，同時被MALDI-TOFMS質譜檢測。同時，酪氨酸磷酸化肽同樣能被有效的富集。比較例1.與固定鋯離子親和色譜應用於分離和富集磷酸肽的比較比較例1-1聚合物親和材料作為基質(1)固定鋯離子聚合物親和材料固定鋯離子的聚合物材料與實施例3.1中的帶磷酸基團材料完全一樣。稱取10mg的聚合物材料，與10mL，100mM的ZrOCl2溶液室溫下攪拌過夜得到固定鋯離子的親和聚合物材料。得到的固定鋯離子的親和聚合物材料用二次蒸餾水清洗，除去殘留的ZrOCl2溶液和雜質，將清洗過的聚合物顆粒重新分散於30%ACN/0.1%TFA溶液中備用。(2)固定鋯離子聚合物親和材料應用於半複雜樣品分離和富集磷酸化肽1pL的標準磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.pL")分別與1pL，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol^L")混合得到半複雜的肽段混合物溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5|iL固定鋯離子的聚合物親和材料(10mg.mL")室溫下振蕩培育30min,然後依次分別用30的200mMNaCl/50%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，再用10|aL，10%NH3.H20洗脫結合的磷酸肽，離心收集上層清夜，冷凍乾燥機中凍幹，加入2|iL含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基質溶液，重新分散純化的磷酸肽，然後取0.5pL點靶，用MALDI-TOFMS分析。分析結果圖7(a)是直接分析(x-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩爾比在1:100時的MALDI質譜圖，可以看出，大量的非磷酸肽主導MALDI質譜圖。圖7(b)顯示了來自於oc-酪蛋白酶解液中的13個磷酸肽的MALDI質譜圖。圖7(c)和(d)可以看出，非磷酸化蛋白酶解液幹擾比例在100倍時，來自於(x-酪蛋白酶解液中的13個磷酸肽能被固定鋯離子的聚合物親和材料特異性的分離和富集，當幹擾物比例在500倍時得到的MALDI質譜圖，12個磷酸肽的質譜峰清晰可見，非磷酸肽沒有任何保留。儘管Zr"-IMAC對磷酸肽同樣顯示出高的特異性。然而，Ti4+-IMAC和Zr4+-IMAC顯示出對不同磷酸肽的偏愛。從圖4c和4d可以看出，單磷酸化肽(a6,YKVPQLEIVPNpSAEER)在所有的磷酸肽的峰裡面，顯示出最強的質譜信號。從圖7c和7d可以看出，二磷酸化肽(a7,DIGpSEpSTEDQAMEDIK)顯示出最強的質譜信號。因此，Ti"-IMAC顯示出對單磷酸化肽更強的富集能力，而Zr4+-IMAC顯示出對多磷酸化肽更強的富集能力。比較例1-2GMA-EDMA微球作為基質(1)基於GMA-EDMA微球的Zr4+-IMAC的製備本比較例中使用的GMA-EDMA微球的Zr4+-IMAC為前面非專利文獻18作者所提供。詳細的製備方法見文獻18。(2)基於GMA-EDMA微球的Zr4+-IMAC應用於半複雜樣品中分離和富集磷酸化肽1|iL的標準磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.^L—"分別與1(iL，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.^iL")混合得到半複雜的酶解液，再分別與10Zr4+-IMAC(10mg.mU1分散在100%ACN溶液)混合，再加入10%HAC溶液至總體積為100jiL室溫下振蕩培育30min,然後依次分別用100|iL的200mMNaCl/10%HAC;10%HAC的溶液振蕩淋洗10min，最後加入10(iL，10%NH3.H2O洗脫結合的磷酸化肽，離心收集上層清夜，冷凍乾燥機中凍幹，加入2|iL含1%H3P04的DHB(25mg.ml/')的基質溶液，重新分散純化的磷酸肽，然後取0.5點靶，用MALDI-TOFMS分析。分析結果圖8(a)是直接分析ot-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩爾比在1:100時的MALDI質譜圖，可以看出，大量的非磷酸化肽主導MALDI質譜圖。圖8何顯示了來自於cx-酪蛋白酶解液中的13個磷酸化肽的MALDI質譜圖。圖S(c)是非磷酸化蛋白酶解液幹擾比例在100倍時，來自於ot-酪蛋白酶解液中的13個磷酸化肽能被Zr"-IMAC特異性的分離和富集，當千擾物比例在500倍時得到的MALDI質譜圖(圖8(d),10個磷酸化肽的質譜峰清晰可見，非磷酸化肽沒有任何保留，而且磷酸化肽的峰強度明顯弱於相同量的ot-酪蛋白酶解液分離和富集得到的磷酸化肽的峰。儘管基於GMA-EDMA的Zr4+-IMAC對磷酸肽同樣顯示出高的特異性，由於化學反應的不完全性以至得到的磷酸基團的數量有限，因此，基於GMA-EDMA的Zr4+-IMAC的表面含有相對少的活性磷酸基團而導致更少的磷酸肽的結合位點。圖8c和8d可以看出，磷酸肽的質譜信號幾乎比用T嚴-IMAC富集方法得到的質譜信號(圖4c和4d)兒乎要低一倍。從圖8c-d和圖4c-d的比較可以看出，與聚合物基質相同的是基於GMA-EDMA的Zr4+-IMAC顯示出多磷酸化肽的更強的富集能力，Ti4+-IMAC顯示出對單磷酸化肽更強的富集能力。比較例2.與固定化金屬離子(F^+)親和色譜應用於分離和富集磷酸肽的比較(1)固定化金屬離子(F^+)親和色譜的活化Fe3+-IMAC(Porous20MCbeads)活化按照推薦的方法活化。稱取10mg的粒子，先分別用50mMEDTA，1MNaCl清洗兩遍，接著用二次蒸餾水清洗三遍，然後將清洗過的粒子分散於100mMFeCl3溶液中培育30min,此步重複三次。螯合Fe3+-IMAC粒子然後依次用0.1%HAC,500mMNaCl，ddH20清洗，最後分散於1mL二次蒸餾水中備用。(2)固定化金屬離子(F^+)親和色譜從半複雜樣品中分離和富集磷酸化肽一分別取10的活化過的Fe3+-IMAC用上樣緩衝液50%ACN,0.1%TFA活化30min,然後離心除去溶液，餘下的Fe3+-IMAC粒子分別與半複雜的酶解液(組成為1的標準磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.pi;1)分別與1^L，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.^iL")混合溶解在50。/。ACN/0.1。/。TFA溶液中)室溫下振蕩培育30min,然後依次分別用100|iL的50%ACN/0.1%TFA;75%ACN/10%CH3OH/10%HAC;100|iL的10%HAC的溶液振蕩淋洗10min，最後加入用10|aL，10%NH3.H2O洗脫結合的磷酸肽，離心收集上層清夜，冷凍乾燥機中凍幹，加入2pL含l%H3POj9DHB(25mg.mL—^的基質溶液，重新分散純化的磷酸肽，然後取0.5點耙，用MALDI-TOFMS分析。分析結果圖9(a)是直接分析a-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩爾比在1:100時的MALDI質譜圖，可以看出，大量的非磷酸化肽主導MALDI質譜圖。圖9(b)顯示了來自於a-酪蛋白酶解液中的13個磷酸化肽的MALDI質譜圖。圖9(c)和圖9(d)是非磷酸化蛋白酶解液幹擾比例在100倍和500倍時，僅僅有來自於a-酪蛋白酶解液中的5個多磷酸肽能被Fe3+-IMAC特異性的分離和富集，同時伴隨有大量的非磷酸肽被保留。因此，Fe3+-IMAC相比與Ti4+-IMAC禾t]Zr4+-IMAC，顯示出更差的特異性。比較例3.與二氧化鈦(Ti02)應用於半複雜樣品中分離和富集磷酸化肽的比較1|iL的標準磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmoLpL")分別與1pL，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.pL")混合得到半複雜的肽段混合物溶解在80%ACN/6%TFA溶液中與5pLTi02(GLsciencesInc.Tokyo,Japan)(10mg.mL-1分散在30%ACN/0.1%TFA溶液中)室溫下振蕩培育30min,然後依次分別用30的200mMNaCl/50%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振蕩淋洗10min，再用10pL，10%NH3.H2O洗脫結合的磷酸化肽，離心收集上層清夜，冷凍乾燥機中凍幹，加入2iiL含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基質溶液，重新分散純化的磷酸肽，然後取0.5(iL點耙，用MALDI-TOFMS分析。分析結果圖lO(a)是直接分析a-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩爾比在1:100時的MALDI質譜圖，可以看出，大量的非磷酸肽主導MALDI質譜圖。圖lO(b)顯示了來自於a-酪蛋白酶解液中的13個磷酸肽的MALDI質譜圖。圖10(c)是非磷酸化蛋白酶解液幹擾比例在100倍時，來自於CC-酪蛋白酶解液中的7個磷酸肽能被Z/+-IMAC特異性的分離和富集，當幹擾物比例在500倍時得到的MALDI質譜圖(圖10(d)，4個磷酸肽的質譜峰清晰可見，非磷酸化肽沒有任何保留，而且磷酸肽的峰強度明顯弱於相同量的a-酪蛋白酶解液分離和富集得到的磷酸肽的峰。因此，Ti02用於半複雜樣品中磷酸肽的分離和富集，其特異性和容量明顯低於Ti4+-IMAC和Zr4+-IMAC。比較例4.與二氧化鋯(ZK)2)應用於半複雜樣品中分離和富集磷酸化肽的比較Zr02的製備和用於分離和富集磷酸化肽按照非專利文獻13的方法。1pL的標準磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.^iL力分別與1^L，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.pL")混合得到半複雜的肽段混合物溶解在50%ACN/10%HAC溶液中與5[xLZr02粒子(10mg.mL-1分散在50%ACN/10%HAC溶液中)室溫下振蕩培育30min,然後依次分別用30pL的50%ACN/10%HAC;50%ACN的溶液振蕩淋洗10min，再用10jiL，10%NH3.H2O洗脫結合的磷酸肽，離心收集上層清夜，冷凍乾燥機中凍幹，加入2jiL含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基質溶液，重新分散純化的磷酸肽，然後取0.5pL點靶，用MALDI-TOFMS分析。分析結果圖ll(a)是直接分析a-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩爾比在1:100時的MALDI質譜圖，可以看出，大量的非磷酸化肽主導MALDI質譜圖。圖ll(b)顯示了來自於(x-酪蛋白酶解液中的13個磷酸肽的MALDI質譜圖。圖11(c)是非磷酸化蛋白酶解液幹擾比例在100倍時，來自於ct-酪蛋白酶解液中的8個磷酸肽能被Zr4+-IMAC特異性的分離和富集，當幹擾物比例在500倍時得到的MALDI質譜圖(圖ll(d))，2個單磷酸化肽的質譜峰清晰可見，伴隨著少量的非磷酸肽被保留。因此，Zr02用於半複雜樣品中磷酸肽的分離和富集，其特異性和容量明顯低於Ti4+-IMAC和Zr4+-IMAC。表1.固定鈦離子聚合物親和材料從模型磷酸化a-酪蛋白|3-酪蛋白,卵清蛋白的酶解液和標準的模型酪氨酸磷酸化肽分離和富集所得到的磷酸肽的分子量，序列和磷酸化位點tableseeoriginaldocumentpage19磷酸化肽SEQUENCELISTING中國科學院大連化學物理研究所—種固定鈦離子親和色譜材料及其製備和應用〈130>〈160〉20<170〉Patentlnversion3.1〈210〉110〈212〉PRTartificial<220〉〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(I)..(IO)<223〉〈400〉1ThrValAspMetGluSerThrGluValPhe15102〈211〉12〈212>PRTartificial〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(12)2ThrValAspMetGluSerThrGluValPheThi'Lys1510磷酸化肽〈210〉3<211〉12<212〉PRTartificial〈220>PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(12)3GluGlnLeuSerThrSerGluGluAsnSerLysLys1510<210〉414<212〉PRT<213〉artificialPHOSPHORYLATION(1)..(14)〈400〉4ValProGinLeuGlulieValProAsnSerAlaGluGluArg1510〈210〉5<211〉15artificial〈221>PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(15)〈223〉5磷酸化肽TyrLeuGlvGluTyrLeulieValProAsnSerAlaGluGluArg1.510156〈211〉16〈212〉PRTPHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(16)〈223〉<400〉6AsplieGlvSerGluSerThrGluAspGinAlaMetGluAsplieLys151015〈210〉7<211〉16PRTartificial〈220〉〈221〉PHOSPHORYLATION(1)..(16)<223〉7TyrLvsValProGinLeuGlulieValProAsnSerAlaGluGluArg1.51015〈210〉8〈211>19PRT<213〉artificial〈220〉〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(19)〈223〉磷酸化肽〈400〉8LysLysTvrLysValProGinLeuGlulieValProAsnSerAlaGlu151015GluArgLeu<210〉9<211〉21PHOSPHORYLATION〈222>(1)..(21)〈223〉<400〉9AsnThrMetGluHisValSerSerProSerGluGluSerlielieSer151015GinGluThrTvrLys<210〉10〈211〉24<212〉PRT<213〉artificial〈220〉<221〉PHOSPHORYLATION(1)..(24)〈223>〈400〉10GinMetGluAlaGluProSerlieSerSerSerGluGlulieValPro151015AsnProAsnSerValGluGinLys20'〈210〉1126磷酸化肽〈212〉POT〈213〉artificial〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(26)<223〉<400〉11GluLysValAsnGluLeuSerLysAsplieGlvSerGluProSerThr1'51015GluAspGinAlaMetGluAsplieLvsGin202^〈210〉1225PRTartificialPHOSPHORYLATION(1)..(25)12AsnAlaAsnGluGluGluTyrSerlieGlvSerSerSerGluGluSer151015AlaGluValAlaThrGluGluValL、's20〈210>13〈211>25〈212>PRT磷酸化肽〈400>13AsnAlaAsriGluGluGluTvrSerlieGlvSerSerSerGluGluSer151015AlaGluValAlaThrGluGluValLys2025〈210〉14〈211〉15〈212>PRT〈213〉artificial〈221〉PHOSPHORYLATION<222〉(1)..(15)<223〉14PheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeuGinLys1510lb15〈211>19PRT〈213〉artificialPHOSPHORYLATION〈222>(1)..(19)15lieGluLysPheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeu151015GinAspLys〈210>16〈211〉20〈212〉PRTartificial磷酸化肽〈220>PHOSPHORYLATION〈222>(1)..(20)<223〉<柳〉16PheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeuGinAspLvs151015lieHisProPhe20<210〉1725〈212〉PRT〈213〉artificialPHOSPHORYLATION(1)..(25)17ArgGluLeuGluGluLeuAsnValProGlvGlulieValGluSerLeu151015SerSerSerGluGluSerlieThrArg202518〈211〉20<212〉PRT〈221〉PHOSPHORYLATION〈222>(1).(20)〈223〉〈400〉18GluValValGlySei'AlaGluAlaGlyValAspAlaAlaSerValSer磷酸化肽151015GluGluPheArg2019<211〉26〈212〉PRT<221〉PHOSPHORYLATION<222〉(1)..(26)<223〉20<211〉13PRTartificialPHOSPHORYLATION(1)..(13)<400〉20ArgArgLeulieGluAspAlaGluTvrAlaAlaArgGlv1510權利要求1.一種固定鈦離子親和色譜材料，其特徵在於其可按如下過程製備獲得，將含有磷酸基團的固相載體與鈦離子溶液接觸，利用鈦離子與磷酸改性的固相載體上的磷酸基團的強相互作用，使鈦離子通過磷酸配體固載在載體上，獲得固定鈦離子親和色譜材料Ti4+-IMAC。2.按照權利要求l所述的固定鈦離子親和色譜材料，其特徵在於所述含有磷酸基團的固相載體，磷酸基團與固相載體間為共價鍵合;;結構如下，formulaseeoriginaldocumentpage23.—種權利要求1所述固定鈦離子親和色譜材料的製備方法，其特徵在於將含有磷酸基團的固相載體與鈦離子溶液接觸，利用鈦離子與磷酸改性的固相載體上的磷酸基團的強相互作用，使鈦離子通過固載在載體上的磷酸配體，獲得固定鈦離子親和色譜材料T,-IMAC。4.按照權利要求3所述的製備方法，其特徵在於所述鈦離子溶液為硫酸鈦溶液。5.按照權利要求3所述的製備方法，其特徵在於所述親和色譜材料可通過對現有的固相載體進行化學衍生，於其表面化學健合磷酸基團製備獲得。6.按照權利要求5所述的製備方法，其特徵在於所述固相載體為常規色譜載體中的矽膠顆粒、有機聚合物小球或瓊脂糖顆粒，或者是整體柱材料、納米材料、介孔材料、磁珠或晶片材料。7.按照權利要求3所述的製備方法，其特徵在於所述親和色譜材料可通過將含有磷酸基團的功能單體參與聚合形成的聚合物。8.按照權利要求7所述的製備方法，其特徵在於所述功能單體為2-(甲基丙烯醯氧)-乙基磷酸酯；所使用的交聯劑為亞甲基雙丙烯醯胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯、三丙烯酸季戊四醇酯、二乙烯基苯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯或N,N，-二亞甲基二丙烯醯胺；所述聚合可為本體聚合、懸浮聚合、乳液聚合或溶液聚合。9.一種權利要求1所述固定鈦離子親和色譜材料的應用，其特徵在於:以固定鈦離子的親和色譜Ti4+-IMAC為分離材料分離和富集磷酸肽，磷酸肽由於與固定的鈦離子之間的強螯合作用而保留在固定鈦離子親和色譜材料上，從而實現特異性地從複雜的蛋白酶解液中分離和富集磷酸肽的目的。全文摘要本發明提供了一種固定鈦離子親和色譜材料及其製備和應用，利用鈦離子與磷酸改性的固相載體上的磷酸基團的強相互作用而將鈦離子固定於載體上。本發明使用固定鈦離子親合色譜材料富集磷酸肽，磷酸肽由於與固定的鈦離子之間的強螯合作用而保留在親和色譜材料上使其獲得分離。文檔編號B01J20/286GK101396650SQ20071001296公開日2009年4月1日申請日期2007年9月26日優先權日2007年9月26日發明者葉明亮,周厚江,鄒漢法申請人:中國科學院大連化學物理研究所