基於泛素蛋白的人工結合蛋白的生產的製作方法

2023-05-21 09:22:11 1

專利名稱：基於泛素蛋白的人工結合蛋白的生產的製作方法
技術領域：
本發明涉及修飾的「泛素樣蛋白」蛋白超家族的蛋白質、具有泛素樣摺疊基序的蛋白質及其片段或其融合蛋白，其中，作為這種修飾的結果，所述蛋白質對預定的結合伴侶(binding partner)具有之前並不存在的結合親和力。本發明也涉及製備和使用這些蛋白質的方法。
泛素是小的、單體胞漿蛋白，其序列高度保守，並在從原生動物到脊椎動物的所有已知真核細胞中存在。機體中，它在細胞內蛋白的受控降解調節中起決定性作用。為此目的，經過酶級聯傳遞，預定要降解的蛋白質與泛素或聚泛素鏈共價連接並因為這種標記而選擇性降解。根據最近的結果，泛素或泛素對蛋白質的標記也分別在其它細胞過程如幾種蛋白質的輸入或其基因調節中發揮重要作用(Marx，2002)。
除了其生理功能的闡明以外，泛素成為一種研究對象主要是因為其結構和蛋白質化學特性。泛素的多肽鏈由摺疊成非常緻密的α/β結構的76個胺基酸組成(Vijay-Kumar，1987)多肽鏈的幾乎87％以氫鍵方式參與形成二級結構元件。至於重要的二級結構，可以提到三個半α-螺旋轉角和由四條鏈組成的反平行β片層。這些元件的特徵性排列——反平行β片層暴露於蛋白質表面，所述表面的背側包裝有垂直於其上面的α螺旋——一般認為是所謂的泛素樣摺疊基序。因此，泛素分別用於命名蛋白質超家族(「泛素樣蛋白」)或蛋白質家族(「泛素相關蛋白」)(Murzin et al.，1995)，其中包含蛋白質如SUMO-1(Müller et al.，2001)、FAU(Michiels et.al.，1993)、NEDD-8(Kumar et al.，1993)、UBL-1(Jones und Candino，1993)和GDX(Filippi et al.，1990)，它們具有這種基序並且其一級序列與泛素高度一致。另一個結構特徵是位於蛋白質內部α螺旋和β片層之間的顯著疏水區域。
因為其較小，可以通過化學合成和生物技術方法來進行泛素的人工製備。由於其有利的摺疊性質，可通過基因工程用諸如大腸桿菌(Escherichia coli)的微生物相對大量的在胞漿或周質間隙(periplasmic space)生產泛素。因為周質區主要是氧化性環境，後一種策略通常用於生產分泌性蛋白。由於簡單有效的細菌製備方法，泛素可用作生產有困難的其它待製備外源蛋白的融合伴侶。通過與泛素融合，可實現更高的溶解性，進而實現更高的產量。本發明實施的提供泛素作為通用人工結合蛋白的方法考慮到其蛋白質化學特性的全新利用。
在天然功能被人工應用的蛋白質中間——例如應用於生物技術、生物分析或醫藥——抗體(即免疫球蛋白)佔主要地位。它們可以特異地非共價結合幾乎任何可能物質的能力使它們成為需要識別、結合或分離配體、受體或其它目標分子的幾乎每個生物科學應用中最重要的工具。近年開發的在E.coli中功能性生物合成抗體片段的方法進一步擴展了免疫球蛋白的可能用途，但同時也顯示了其難點所在和局限性。
除了Fab和Fv片段(Skerra und Plückthun，1988)也主要能用常規蛋白質化學方法獲得以外，通過基因工程的方法並由於免疫球蛋白的模塊結構(見綜述Dübel undKontermann，2001)可以開發不同的人工構造物，值得注意的包括單鏈Fv片段(scFv)(Bird et al.，1988)、二硫橋連接的Fv片段(dsFv)(Brinkmann et al.，1993)以及雙價(Carter et al.，1992)和雙特異性抗體片段(例如diabodies，Holliger et al.，1993)。為了診斷和用於治療，可通過重組Ig片段與效應子模塊的基因融合獲得雙功能蛋白質。因此，其中可以得到與鹼性磷酸酶(Muller et al.，1999)和綠色螢光蛋白(GFP；Griepet al.，1999)的融合體。抗體片段與放射性同位素細胞毒性物質的融合體對於癌症治療很是重要(免疫毒素；Reiter和Pastan，1998)。在此情況下，各Ig片段與腫瘤細胞上特異性表面蛋白的選擇性結合被用於治療藥的位點特異性應用(腫瘤靶向治療)。
然而，在大腸桿菌中製備抗體片段的方法不僅能夠以足夠的質和量供診斷和治療，而且能夠簡單而快速的修飾其蛋白質和免疫化學特性。細菌宿主操作簡單，使得可以用標準分子生物學方法直接改變載體編碼的外源蛋白基因。通過靶向抗體工程(Kontermann和Dübel，2001)可以優化抗體片段的結合親和力或宿主相容性。另外，特異性抗體或其片段也可分別人工製備，即在免疫系統之外製備，它們針對最不同的目標物質，如低分子量結構或蛋白質。通過這些進化方法，可以通過引入與人抗體系統接近的隨機誘變製備合成抗體片段庫(Knappik et al.，2000)。使用合適的選擇策略如噬菌體展示或核糖體展示(Winter，1998，Hoogenboom et al.，1998；Hanes et al.，2000)，可以成功分離具有預期結合特性的功能性Ig片段。照這樣，例如也可以獲得針對經典免疫接種中誘發毒性作用或僅有弱免疫應答的抗原的結合蛋白。
儘管有抗體工程提供的上述成績和可能性，某些缺點將限制抗體的實際用途。因此，提供足量抗體是一個問題在真核細胞培養系統中進行功能性抗體生產是極其消耗成本的方法。另外，分別由於其大小和血清中長保留時間(血液清除慢)而導致的抗體分子低組織穿透能力妨礙了很多治療應用。儘管可在細菌中製備更小的抗體片段如scFv或Fab片段(見上文)並因而基本成本較低，然而由於其不利的摺疊性質和需要形成幾個二硫鍵，重組生成的產率低於預期水平。此外，與母體抗體相比，重組抗體片段經常穩定性較差並顯示較低結合活性。
為了克服這些限制，嘗試將抗體結合原理——即通過位於保守性蛋白骨架上的暴露於表面的超變區來結合——賦予其它蛋白質(Skerra，2000)。這意味著改變大量可變環以產生人工結合特性。為此目的，通常天然結合蛋白質如lipocalin(Beste et al.，1999)或III型纖連蛋白結構域(Koide et al.，1998)作為從柔性「環」結構形成結合位點的出發點——以類似於抗體的方式——這種結構的修飾能識別與天然配體不同的配體。
另外，根據WO01/04144，在原本缺乏結合位點的β片層結構蛋白中在蛋白質表面人工產生這種結構。通過這種新生的人工結合位點(見下文)，可以獲得例如γ-crystallin——眼睛晶狀體結構蛋白——的變化形式，它可以可定量的親和力和特異性與之前定義的物質相互作用。與已經存在並從以上舉例說明的柔性「環」結構而形成的結合位點修飾相比較，這些結構是根據WO 01/04144在β片層表面新生的。然而，WO 01/04144僅描述改變較大蛋白以產生新結合特性。由於其大小，根據WO 01/04144的蛋白質僅可以通過較費勁的方法在基因工程水平上進行修飾。此外，在公開的蛋白質中僅佔全部胺基酸較小百分比的部分被修飾，以維持蛋白質的整體結構。因此，只有蛋白質表面的較小區域可用於產生之前不存在的結合特性。而且，WO 01/04144在實驗水平上只公開了對小的、低分子量分子產生了結合特性，並沒有公開較大分子如蛋白質的情況。
因此，本發明的一個目的是提供對所選擇結合伴侶具有之前不存在的新結合親和性、不表現出上述缺點的蛋白質。本發明的另一個目的是創建替代抗體卻不表現抗體上述缺點的分子。
根據本發明，通過提供根據權利要求1的修飾蛋白實現這個目的，所述修飾蛋白主要基於起始蛋白例如泛素的蛋白結構，並且在其表面帶有人工產生的結合位點。
具體地，根據本發明提供選自「泛素樣蛋白」超家族的蛋白質、具有泛素樣摺疊基序的蛋白質及具有泛素樣摺疊基序的其片段或其融合蛋白的蛋白質，其中由於所述蛋白質的至少一個表面暴露區域中的一個或多個胺基酸修飾，所述表面暴露區域包括β片層區域的至少一個β片層鏈和任選的非β片層區域，該蛋白質表現出與預定結合伴侶具有之前不存在的結合親和性，同時保留泛素樣摺疊基序。
因此，本發明涉及通過對選自「泛素樣蛋白」蛋白超家族的蛋白質、具有泛素樣摺疊基序及具有泛素樣摺疊基序的其片段或其融合蛋白的蛋白質通過替換、插入、缺失、化學修飾或其組合加以修飾的蛋白質，其中由於這種修飾該蛋白質表現出與預定結合伴侶具有之前不存在的結合親和性，這種蛋白質可經以下方法獲得a)選擇待修飾蛋白；b)確定結合伴侶；c)選擇該蛋白質的至少一個表面暴露區域中的胺基酸，所述表面暴露區域包括β片層區域的至少一個β片層鏈和任選的非β片層區域；d)經替換、插入、缺失和/或化學修飾來修飾所選擇胺基酸，同時保留泛素樣摺疊基序；e)使修飾後蛋白與步驟b)中確定的結合伴侶接觸；f)檢測與步驟b)中確定的結合伴侶有結合親和力的蛋白質。
此外，本發明的一個目的是提供製備上述基於泛素的修飾蛋白的各方法以及這些修飾蛋白的用途。
因此，本發明還描述製備選自「泛素樣蛋白」蛋白超家族蛋白的蛋白質、具有泛素樣摺疊基序的蛋白質及具有泛素樣摺疊基序的其片段或其融合蛋白的蛋白質的方法，其中由於一種或多種修飾該蛋白質表現出與預定結合伴侶具有之前不存在的結合親和性，這種蛋白質可經以下方法獲得a)選擇待修飾蛋白；
b)確定結合伴侶；c)選擇該蛋白質的至少一個表面暴露區域中的胺基酸，所述表面暴露區域包括β片層區域的至少一個β片層鏈和任選的非β片層區域；d)優選經替換、插入、缺失和/或化學修飾來修飾所選擇胺基酸，同時保留泛素樣摺疊基序；e)使修飾後蛋白質與步驟b)中確定的結合伴侶接觸；f)檢測與步驟b)中確定的結合伴侶有結合親和力的蛋白質。
因此本發明提供分別對具有本申請所定義的泛素樣摺疊基序的蛋白質或多肽進行修飾而製備的蛋白質或多肽。這些包括「泛素樣蛋白」蛋白超家族的蛋白質，具有泛素樣摺疊基序的所有蛋白質以及具有泛素樣摺疊基序的這些蛋白質的片段或融合蛋白。分別從這些蛋白質或多肽出發，分別修飾原蛋白質或多肽中的一個或多個胺基酸。這些修飾具體包含胺基酸替換，但也包含一個或多個胺基酸的插入和缺失以及胺基酸的化學修飾。這些修飾在待修飾蛋白的至少一個表面暴露區域進行。至少一個胺基酸的修飾包含β片層區域的至少一個β片層鏈，其中β片層鏈必須位於結合伴侶或配體可接近的蛋白質表面，這些結合伴侶或配體分別能與該修飾蛋白以可測的親和力結合。在本發明另一個實施方案中，除了改變β片層區域的β片層鏈，非β片層區域也被修飾，優選它們暴露於表面，以影響具體是增加與預定結合伴侶的結合親和力並因而增強特異性。
本領域技術人員可使用原本已知的修飾一個或多個胺基酸的不同技術。這些將在下面更詳細描述。此外可參考出版物Ausuebel et al.，1994以及Sambrook et al.，1989。
已經知道泛素非表面暴露的核心區胺基酸的修飾(Finucane et al.，Biochemistry，Vol.38，No.36，1999或Lazar et al.，Protein Science(1997)，61167-1178)。其中所作改變是針對不參與結合的位置，因為它們定位於疏水核心而不能與溶劑或可能的結合伴侶接近。
在下面的內容中，術語「之前不存在的結合特性」和新生的人工結合位點的意思在本發明中將分別被解釋。這些術語意思是指修飾蛋白之前不表現出在修飾區與預定結合伴侶或泛素的天然結合伴侶具有結合特性。在本發明的另一個實施方案中，選擇與預定結合伴侶不具有結合親和性的待修飾蛋白。結合伴侶也可定義為與根據本發明修飾的蛋白質具有可測量的親和力的配體。作為存在可定量結合特性即伴侶結合親和性的最小值，根據本發明可以認為形成複合體的解離常數為KD＝10-5M或更小。10-5M或更小的值可以認為是可定量的結合親和力。根據應用，優選10-6M到10-12M的值，對於例如層析應用優選10-7M到10-11M，或對於例如診斷或治療應用優選10-9M到10-12M。進一步優選的結合親和力是10-7M到10-10M，優選到10-11M。確定結合親和力的方法原本已知，在下文中進一步描述。
根據本發明的修飾意思是指胺基酸替換、插入、缺失或化學修飾。
作為根據本發明的待修飾蛋白，可以使用「泛素樣蛋白」超家族的蛋白質。根據本發明，這個超家族包含Murzin等人(1995)列出的亞組。這些例如包括「泛素相關蛋白」、「UBX結構域」、「GABARAP樣」、「RAS結合結構域」蛋白家族等。優選使用「泛素相關蛋白」蛋白家族的蛋白質。根據本發明也包含具有泛素樣摺疊基序的那些蛋白質。這些蛋白質的實例是SUMO-1、FAU、NEDD-8、UBL-1和GDX以及Rubl、APG8、ISG15、URM1、HUB1、Elongin B、PLIC2(N端結構域)、人Parkin(N端結構域)。
來自泛素樣蛋白超家族的根據本發明可使用的蛋白質已被高度表徵。僅舉例來說，可以參考以下網際網路站點http//bip.weizmann.ac.il/scop/index.html。根據這個站點，泛素樣蛋白家族定義為包括泛素相關蛋白家族的超家族。此超家族所有成員的主要特徵是反平行排列的β片層並且這些蛋白質被分成α段和β段。摺疊定義為β-Grasp並因而為泛素樣的。核心區定義如下β(2)-α-β(2)，其中數字表示鏈數目並且全部鏈形成β片層。混合β片層排列是2143，意思是如果從頂部從左向右看片層時鏈的位置(氨基端在底部，羧基端在頂部)。因此泛素樣蛋白成員的特徵是暴露於蛋白質一個表面的反平行β片層，在所述表面背側包裝有垂直於其上面的α螺旋。這種泛素樣摺疊基序是根據本發明可使用並修飾的蛋白質的特徵，並明確區分該家族成員與其它蛋白質。根據此定義，本發明也包含PLIC-2的泛素樣N端結構域和parkin的泛素樣結構域。
根據稱作比對的序列比較或從結構角度考慮，本領域技術人員能初步判斷蛋白質是否是泛素樣蛋白超家族的成員。最後證據自然總是由結構分析提供，例如X射線晶體衍射或多維核磁共振譜的結構分析。近來，使用遺傳算法的結構分析也能提供良好預測。
關於泛素超家族的進一步信息可在例如Larsen et al，2002的出版物中發現。此外，也可參考Buchberger et al.，2001。Buchberger描述了典型β-Grasp摺疊作為具有β-β-α-β-β-α-β二級結構組成的泛素樣蛋白的特徵，即在21534的排列中的「混合片層」形式的5個β鏈排列。在此方面，必須指出在一級序列上UBX與例如泛素沒有顯著同源性(Buchberger et al.，2001)，但儘管有這種事實，由於其三維結構與例如泛素的相同，因此UBX也歸類於泛素樣蛋白。在此方面也應該提到，在泛素中48和49位胺基酸有時候也被當作額外β鏈(Vijay-Kümar，1987)。這第五條鏈在泛素結構中位於螺旋之後並給出對「混合片層」的21534的排列，然而該鏈僅由兩個胺基酸組成，很容易懷疑這種兩個胺基酸的鏈是否能被稱為β片層鏈。然而如上解釋，根據Buchberger等人(2001)，也可以毫無疑問的將具有21534排列的蛋白質歸類於泛素樣蛋白超家族。對於本發明，選擇上文更詳細描述的定義2143用於泛素中β鏈的排列。
上述家族和超家族的蛋白質通常高度保守。根據現有知識，例如泛素在所有哺乳動物中具有相同胺基酸序列。酵母的泛素與該序列僅有三個胺基酸不同。人泛素或哺乳動物泛素分別由76個胺基酸組成，並具有開始部分描述的結構。
根據本發明，待修飾蛋白的胺基酸序列與被修飾的起始蛋白例如人泛素應該具有至少30％、優選至少40％或50％、進一步優選至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％一致性，其中無論如何都具有如上詳細定義的泛素樣摺疊基序。
根據本發明，也包括上述蛋白質的片段，只要這些片段包含上述泛素樣摺疊基序，同樣還包括上述蛋白質與其它蛋白質的融合體。在這些片段和融合蛋白的情況下，本發明框架內提及的胺基酸位置總是指人泛素中的對應位置。融合伴侶的實例是(報告)酶、毒素或其它結合蛋白等。而且，例如可以進行與低分子量物質如生物素、地高辛配基、螢光和/或發光物質等的化學偶聯。
在融合蛋白的情況下已經融合的蛋白質可根據本發明修飾。然而，修飾或選擇後融合的片段也包含在本發明內。在每種情況下，這可以根據本領域技術人員已知的方法實現。
根據本發明，選用於製備修飾蛋白的蛋白質優選是人泛素或其他來源的泛素，例如另一種哺乳動物泛素。因此，本發明將在下面具體用人泛素作為例子來描述。將用幾個實例來描述人泛素的修飾，以獲得也可被稱為突變蛋白(mutein)並顯示與預定結合伴侶具有之前不存在的結合親和力的蛋白質。作為哺乳動物泛素，具體使用哺乳動物領域裡嚙齒類、家養動物和農用動物的泛素。如果已知根據本發明製備的蛋白質的使用領域，即如果修飾蛋白例如將用作治療人類疾病的藥物組合物，可優選人蛋白質作為待修飾的起始蛋白；這同樣適用於相應的使用領域。應該指出，下面給出的解釋僅以舉例方式基於人泛素。在這種詳細說明和所述實例的基礎上，本領域技術人員可根據本發明修飾具有泛素特異性摺疊基序的其他蛋白質。因此，本發明不限於人泛素或一般意義的泛素。在此方面的說明和解釋應認為是本發明的示例性實施方案，然而它們是特別優選的。
如上所述，人和哺乳動物泛素分別有76個胺基酸。四個β鏈中助於形成反平行β片層的胺基酸是根據本發明並根據PDB資料庫(http//www.rcsb.org/pdb/index.html)中的1UBQ結構的以下胺基酸位置第一鏈(氨基端)2-7；第二個β片層鏈12-16；第三鏈41-45；第四鏈(羧基端)66-71。如果從頂部(氨基端在底部，羧基端在頂部)從左向右看片層，則鏈的位置是第二、第一、第四、第三鏈，其中第一和第四鏈之間的多肽鏈形成α螺旋。
選擇和修飾待修飾胺基酸基於對應的結構數據，例如可從Protein Data BankTM(Berman et al.，2000；http//www.rcsb.org/pdb)免費獲得的那些數據，可通過計算機分析來定位起始蛋白如泛素蛋白質骨架中側鏈暴露於表面即朝向溶劑或潛在的結合伴侶的那些胺基酸的位置。而且，可通過計算機分析來鑑定起始蛋白如泛素中隨機替換可能對蛋白骨架的穩定性沒有或僅有很小的負面影響的那些胺基酸。這些信息可提供關於每單個胺基酸作為結合位點元件的適用性的初步指徵，還需要進一步的實驗驗證。在本發明的優選實施方案中，例如選擇人泛素中的2、4、6、62、63、64、65和66位胺基酸，因為它們暴露於表面且整體結構耐受它們的隨機替換。所提到的位置在空間上相互臨近，分別位於第一個氨基端β片層鏈的起始(2、4、6位)以及環中(62、63位)或在羧基端β片層鏈的起始(64、65、66位)，並以其胺基酸側鏈形成泛素表面的連續區域(圖1)。因此，通過在分析區域中的隨機胺基酸替換(「隨機化」)可以——以類似於抗體的抗原結合位點的方式——在泛素的完整蛋白質結構上產生表面暴露的超變區。
使用ProSAII軟體(」Protein Structure Analysis」；Proceryon Biosciences，Salzburg)，可確定相對於泛素(WT)的例如104種變體和相同數目的、「對照表位」殘基(隨機位置24、28、31、32、35、37、38、39)被替換的變體的隨機所取樣品的蛋白質穩定性。在此情況下，計算機產生的結合位點區被隨機替換的變體中約19％具有與泛素(WT)至少同樣高的穩定性，而約90％比攜帶「對照表位」的那些更穩定(圖2)。這種計算機產生的結果因而可用作選擇合適胺基酸的基礎。
根據優選實施方案——從人泛素的可用結構數據出發——首先選擇待產生的結合位點區中8個胺基酸位置。通過隨機改變此區域的一級序列(隨機誘變)和隨後經特異性選擇，可以獲得表現出分別與預定半抗原或抗原或一般的預定結合伴侶具有期望結合活性的變體。儘管如此獲得的修飾蛋白被賦予全新的結合特性，它們仍保持與起始蛋白在結構和蛋白質化學性質上的高度一致性。因此，它們提供優點，如尺寸小、高穩定性、成本有效的製備，還容易修飾並對之前預定配體同時具有高親和力和特異性。在此方面，不能期望泛素作為產生人工結合蛋白的骨架結構的適用性，因為1)因為泛素較小，不能期望骨架對廣泛胺基酸替換的耐受性和2)預先不能看出涉及β片層的人工結合位點的功能性，其中片層被認為是硬的和非柔性的。
根據本發明，抗原應指由抗體結合的物質。術語抗原包含半抗原、肽、蛋白質、糖、DNA等。從Roche Lexikon Medizin(4th edition；http//www.gesundheit.de/roche)，可以獲得抗原和半抗原的以下定義，它們也用於本發明抗原(AG)指被免疫系統識別為外來的(「非自身」)的任何物質。在多數情況下啟動導致免疫的免疫反應(＝「免疫原」)；分別在變態反應(＝「變應原」)和特異反應(＝「特應原」)的情況下，這種免疫反應被過度放大。AG誘導體液防禦反應(抗原-抗體反應)和/或細胞防禦反應(見下文免疫性)。如果AG被免疫系統耐受(免疫耐受)，也稱為「耐受原」。作為抗原有效的主要是複雜的和較高分子量的物質(蛋白質體、多糖、核苷酸和很多合成化合物)，它們具有負責免疫應答的化學可鑑定的功能結構(決定簇)。分類成1)完全AG，多數高分子量抗原，自身可引起免疫反應，2)低分子量半抗原(半抗原)，僅在偶聯到較大載體分子後作為免疫原。表示為例如異種的、同種異體的或同基因的、自體同源的AG；自體的、異體的、移植、抗腫瘤病毒AG。
半抗原簡單的低分子量化合物，與抗原(AG)特異性有關，或由於其結構(決定簇)而能特異性結合抗體，但與完全AG相比不能產生變態反應。在結合到稱為載體的蛋白體後變成完全抗原(抗原)。
應該指出，使用本發明也能產生對作為結合伴侶的非免疫原性物質如腫瘤標誌物具有結合特性的泛素變體。
在本發明的優選實施方案中，至少部分在一級序列直接臨近的兩個或多個胺基酸處進行修飾，優選替換，其中在三級結構中互相直接臨近的胺基酸進一步優選至少部分定位於蛋白質的β片層鏈中。一般來說，蛋白質中胺基酸的每個替換伴隨蛋白質穩定性的降低。由於臨近胺基酸的影響，單個替換多數能被耐受，沒有大幅度的去穩定作用。然而，如果整個區域即例如由幾個臨近胺基酸組成的結構實體被改變，不再能期望直接臨近胺基酸所致的穩定作用。因此，直到如今，在現有技術中只有泛素的不互相直接臨近的胺基酸被修飾。令人驚奇的是在通過修飾直接臨近的胺基酸而導致該蛋白區域如此寬範圍區域改變後，該蛋白質的穩定性沒有大大降低。泛素或具有泛素樣摺疊基序的蛋白質中兩個直接臨近的胺基酸可以被替換而對蛋白質的穩定性和結構沒有不利影響，單獨這種事實是令人驚奇的並且不能被預料。
特別是在較小的泛素的情況下，修飾直接臨近胺基酸的優點還在於與修飾不相互直接臨近胺基酸的情況相比，通過基因工程更容易製備這種修飾。因此，根據這個實施方案，可以在蛋白質和DNA水平上提供大量修飾蛋白的簡化產生方法。
優選的，直接臨近胺基酸的替換數目是2-10個一級序列中互相直接臨近的胺基酸，更優選2-8個，進一步優選3-7個或4-6個一級序列中互相直接臨近的胺基酸。
如果一級序列中互相直接臨近的胺基酸被替換，這些胺基酸的一部分可以延伸到β片層鏈區域。延伸到β片層鏈區域的這部分的長度可以是兩個或更多個胺基酸，優選兩個或三個胺基酸。因此直接臨近胺基酸的區域位於β片層鏈區域的開始或末端，優選長度為具有約2-3個胺基酸。
在另一個優選實施方案中，修飾優選替換5個或更多個直接臨近胺基酸，其中兩個或更多個、優選兩個或三個直接臨近胺基酸形成β片層鏈區域的開始或末端。在此情況下，優選8、9或10個胺基酸、特別優選8個胺基酸可作為直接臨近修飾胺基酸總數的上限。
在修飾泛素β片層鏈中直接臨近胺基酸的情況下，如果這些胺基酸位於β片層鏈區域的開始或末端，這些胺基酸一般全部暴露於表面。在此情況下，可以認為所有胺基酸參與產生新結合特性。
在本發明的優選實施方案中，修飾一些胺基酸以產生具有新結合特性的區域，它們形成蛋白質表面的連續區域。這樣，可以產生具有之前不存在的結合特性的連續區域。根據本發明的「連續區域」表示如下由於電荷、空間結構和側鏈的疏水性/親水性，胺基酸與其環境以相應方式相互作用。環境可以是溶劑，一般是水，或其它分子，例如空間臨近的胺基酸。通過有關蛋白質的結構信息以及各自的軟體，可以表徵蛋白質表面。例如，蛋白質和溶劑的原子之間的界面區域可以這樣顯示，其中包括有關此界面區域結構如何形成、哪些表面區域可被溶劑接近或表面上電荷如何分布的信息。例如可以通過使用合適軟體顯示這種類型來展現連續區域。這些方法是本領域技術人員公知的。根據本發明，整個表面暴露區域基本上也可用作待修飾產生新結合特性的表面連續區域。優選的，為此目的修飾也可包含α螺旋區域。
包含β片層區域的至少一個β片層鏈的蛋白質的至少一個表面暴露區域中的胺基酸修飾是關鍵的。β片層結構定義為是基本片層樣的且幾乎完全伸展。與由多肽鏈不間斷片段形成的α螺旋比較，β片層可由多肽鏈的不同區域形成。這樣，一級結構中遠離的區域可以互相緊密靠近。β片層通常長度為5-10個胺基酸，並且具有幾乎完全伸展的構象。β鏈互相非常靠近，以至於一條鏈上的C＝O基團和另一條鏈上的NH基團形成氫鍵，反之亦然。β片層可由幾條鏈形成並具有片層樣結構，其中Cα原子的位置交替在片層樣平面的上下。胺基酸側鏈服從這種模式並且因此交替指向頂部或底部。根據β鏈取向，片層分為平行片層和反平行片層。根據本發明，兩者都可被突變，用於製備要求保護的蛋白質。
為了誘變β片層結構，選擇蛋白質中靠近表面的β片層區域。通過可用的X射線晶體衍射結構可以識別表面暴露的胺基酸。如果沒有晶體結構，可嘗試根據可用的一級結構通過計算機分析預測表面暴露的β片層區域和單個胺基酸位置的可接近性(www.emblheidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html)或建立三維蛋白質結構模型(www.expasy.ch/swissmo/SWISS-MODEL.html)，如此獲得有關潛在的表面暴露胺基酸的信息。
然而也可以對β片層進行誘變，其中可以省略耗時的胺基酸位置預選擇。編碼β片層的DNA區域從其DNA環境中分離，經歷隨機誘變並隨後重新整合入之前從中去除的編碼蛋白質的DNA中。隨後是選擇具有期望結合特性的突變體的過程。
在本發明的另一個實施方案中，如上所述選擇接近表面的β片層區域並鑑定這些選擇區域內待誘變的胺基酸位置。然後將如此選擇的胺基酸位置在DNA水平上進行誘變，所述誘變通過定點誘變進行，即編碼特定胺基酸的密碼子被編碼另一個預先選擇的特定胺基酸的密碼子替換，或者這種替換在隨機誘變環境中進行，其中待替換的胺基酸位置是確定的，但編碼新的、未確定胺基酸的密碼子不確定。
表面暴露的胺基酸可接近周圍溶劑。與模式三肽Gly-X-Gly中胺基酸可接近程度比較，如果蛋白質中胺基酸的可接近程度超過8％，則胺基酸稱為表面暴露的。這些蛋白質區域或單個胺基酸位置也分別是可能結合伴侶的優選結合位點，這些位點根據本發明進行選擇。此外，可參考Connolly et al.，1983和Shrake et al.，1973，它們全部公開內容引入本申請中作為參考。
新生的人工結合位點區域因胺基酸替換而與母體蛋白不同或互相不同的泛素蛋白骨架變化可通過定向誘變各自的序列片段而產生。在此情況下，具有某些特性如極性、電荷、溶解性、疏水性或親水性的胺基酸可以分別被具有各自其它特性的胺基酸取代或替換。除了這些替換，術語「誘變」也包含插入和缺失。也可根據本領域技術人員已知的方法通過化學改變胺基酸側鏈而在蛋白質水平進行修飾。
作為各序列片段誘變的起點，例如可以使用泛素樣蛋白的cDNA，它們可以用本領域技術人員已知的方法製備、改變和擴增。對於泛素的一級序列的較小區域(約1-3個胺基酸)中的位點特異性改變，有現有的商品化試劑和方法(″Quick Change″，Stratagene；″MutaGene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit″，Biorad)。對於較大區域的定點誘變，本領域技術人員可用例如聚合酶鏈式反應(PCR)的具體實施方案。為此目的，在期望位置具有簡併鹼基對組成的合成寡聚脫氧核苷酸的混合物可用於例如引入突變。通過使用不天然存在於基因組DNA中的鹼基對類似物如肌苷也可以實現此目的。
β片層區域的一或多個β片層鏈以及任選的非β片層區域的誘變出發點例如可以是泛素樣蛋白的cDNA或基因組DNA。另外，編碼所述蛋白質的基因也可以經合成製備。
原本已知的不同方法可用於產生誘變，它們是定點誘變方法、隨機誘變方法、通過PCR的誘變方法或其它相當的方法。
在本發明的優選實施方案中，待誘變的胺基酸位置被預先確定。根據待修飾蛋白和/或根據所選結合伴侶進行待修飾胺基酸的選擇。在每種情況下，一般建立不同突變體的文庫並用原本已知的方法篩選。如果已有待修飾蛋白的足夠結構信息，自然特別容易進行待修飾胺基酸的預先選擇。然而，即使沒有這些結構信息，用使用隨機誘變並隨後選擇的方法也可以改變具有泛素樣摺疊基序的蛋白質，使之具有分別對預定配體或結合伴侶的結合親和力。
定向誘變以及更長序列片段誘變的方法，例如通過PCR、通過化學誘變或用細菌增變菌株，也屬於現有技術，可以根據本發明使用。
在本發明的一個實施方案中，通過組裝攜帶胺基酸密碼子NNK的DNA寡核苷酸進行誘變。然而應該明白也可使用其它密碼子(三聯體)。
突變以維持β片層結構的方式進行。一般來說，誘變發生在暴露於蛋白質表面的穩定的β片層區域之外。它包含定點誘變和隨機誘變。包含一級結構中較小區域(約3-5個胺基酸)的定點誘變可以用Stratagene(QuickChange)或BioRad(MutagenePhagemid in vitro mutagenesis kit)(cf.US-A-5,789,166；US-A-4,873,192)的商品化試劑盒產生。
如果要對更廣泛區域進行定點誘變，必須製備DNA盒，其中待誘變區域通過組裝含有突變和未變化位置的寡核苷酸而獲得(Nord et al.，1997；McConell和Hoess，1995)。可通過在增變菌株中擴增或通過PCR擴增(易錯PCR)(例如Pannekoek et al.，1993)引入隨機誘變。為此目的，使用錯誤率增加的聚合酶。為分別增強引入的誘變程度或合併不同突變，可通過DNA改組(Stemmer，1994)合併PCR片段中的突變。有關酶的這些誘變策略的綜述在Kuchner和Arnold(1997)的綜述中提供。為在選定DNA區域進行這種隨機誘變，也必須構建用於誘變的DNA盒。
根據本發明的一個實施例，泛素的第2、4、6、62、63、64、65和66位胺基酸的隨機替換可特別容易的用PCR方法進行，因為所提及位置位於靠近所述蛋白質氨基或羧基末端的位置。因此，待操作密碼子位於相應cDNA鏈的5』和3』末端。因此用於誘變PCR反應的第一個寡聚脫氧核苷酸——除了第2、4和6位待突變密碼子以外——對應編碼泛素氨基端鏈的序列。因此第二個寡聚脫氧核苷酸——除了第62、63、64、65和66位待突變密碼子以外——至少部分對應羧基端多肽序列的非編碼鏈。通過這兩個寡聚脫氧核苷酸，可用編碼泛素蛋白骨架的DNA序列作模板進行聚合酶鏈式反應。
另外，所得擴增產物可加到另一個用旁側寡聚脫氧核苷酸的聚合酶鏈式反應中，旁側寡聚脫氧核苷酸可引入例如限制性內切酶的識別位點。用適當的限制性內切酶水解後，所得的合成DNA分子可被連接即連到相應準備的例如克隆或表達載體的核酸序列上。這些方法和系統對本領域技術人員已知。那些系統例如是來自Novagen(Madison，WI)、IBA(Gttingen)或New England Biolabs(Beverly，MA)的商品根據本發明優選將所得基因盒導入適用於隨後選擇程序的載體系統中，以分離與預定半抗原或抗原具有結合特性的泛素變體。
根據本發明的優選實施方案，只修飾不屬於未修飾泛素中參與連接到泛素的天然結合伴侶的區域的胺基酸位置，以產生新的結合特性。這確保只有泛素中已經存在的結合特性不改變。
基本上可以根據它們能否被可能的結合伴侶接近和蛋白質的整體結構是否可能顯示對修飾的耐受性而選擇修飾區域。
在蛋白質中，優選來自哺乳動物的泛素中，β鏈上胺基酸的至少15％、優選至少20％、進一步優選至少25％可以根據本發明被修飾，優選替換，以產生之前不存在的結合特性。最大優選β鏈上胺基酸的約40％、進一步優選最大約35％，甚至更優選約30％被修飾，優選替換。
根據本發明的一個實例，例如β鏈上24個胺基酸中的6個被修飾，以產生與預定結合伴侶的結合特性。選擇更大數目的胺基酸進行修飾提供產生具有結合親和力的蛋白質的更大文庫的可能性，以至於增加這些修飾蛋白質中的一個與預定結合伴侶具有可定量和/或高結合親和力的可能性。
此外，除了β鏈修飾，也可對蛋白質中的其它表面暴露區域進行修飾，優選例如在環區域。除了β鏈中的修飾區域外，這些修飾區域也可參與新產生的結合。
根據本發明的另一個優選實施方案，泛素優選哺乳動物或人泛素中至少6個、優選至少8個表面暴露胺基酸可以被修飾，其中修飾優選是替換。這些至少6個表面暴露的胺基酸然後形成與預定結合伴侶具有結合親和力的區域。在此方面，特別優選至少4個、優選至少6個、進一步優選至少8個表面暴露的胺基酸位於β片層區域，即位於一個β片層鏈或分布於幾個β鏈。進一步優選至少5個修飾優選替換的胺基酸在一級序列上互相直接臨近。
在本發明的另一個優選實施方案中，在所述蛋白質的四個β鏈中至少兩個、優選恰好兩個鏈內的胺基酸被修飾以產生新結合特性。也優選在所述四個β鏈中的三或四個中進行修飾，以產生與選定結合伴侶的之前不存在的結合特性。
特別優選氨基端和羧基端鏈中的胺基酸被修飾，優選被替換，以產生新結合特性。在此方面，還優選臨近羧基端β片層鏈的環中的胺基酸被修飾，優選被替換。
特別優選在哺乳動物泛素優選人泛素中的以下位置進行修飾，優選替換2、4、6、62、63、64、65、66。這些胺基酸在泛素表面形成連續的表面暴露區域，發現其特別適於產生與結合伴侶具有之前不存在的新結合特性的修飾蛋白。
根據本發明可用任何期望胺基酸進行胺基酸替換以產生新結合特性，即如果進行修飾以產生新結合特性，不必考慮所述胺基酸是否分別具有與被替換胺基酸相似的化學特性或側鏈，因此任何期望胺基酸可用於此目的。
根據本發明，作為被修飾以產生與選定結合伴侶具有之前不存在的結合特性的蛋白質，可以顯示其它修飾如替換、插入、缺失和/或化學修飾，以關閉或新加這種修飾之前蛋白質的生物學和/或蛋白質化學功能。因此，舉例來說，泛素與其天然結合伴侶的結合特性可以被關閉。
因此，在本發明的一個實施方案中，使用人泛素變體，其中第45位胺基酸苯丙氨酸被色氨酸替換。這樣，與泛素比較，可以提供由於替換而改進分光光度特性的蛋白質，同時維持泛素的結構和穩定性。
在本發明的另一個實施方案中，例如人泛素的第44、48、54、70、72和75位被替換，第76位胺基酸缺失。這樣，可以提供不再行使泛素天然功能而仍維持泛素結構和穩定性的蛋白質。
如果這種類型的已經預修飾的泛素用於產生之前不存在的結合特性，最後優選獲得一種泛素，其中野生型泛素或一般的哺乳動物泛素中總共至少10個、優選至少15個胺基酸被替換。根據一個實施例，這樣可以獲得具有14個替換和1個缺失而仍維持其原始結構的修飾泛素。基於泛素的胺基酸總數，這對應於約20％的百分比。這是非常令人驚奇的並且不能預料，因為通常非常低的百分率已經足以擾亂所述蛋白質的摺疊。
選定胺基酸的修飾步驟根據本發明優選通過隨機誘變在遺傳水平上誘變來進行，即隨機替換選定胺基酸。優選的是，步驟d)的修飾通過基因工程方法改變屬於各蛋白質的DNA進行。優選的是，然後在原核或真核生物中進行所述蛋白質的表達。
根據本發明，修飾蛋白還優選通過化學合成而製備。在這種實施方案中，在一個步驟中進行權利要求1的步驟c)到d)。
分別選擇並確定與預定結合伴侶具有結合親和力的胺基酸通過修飾選定胺基酸而建立蛋白質文庫以後，根據本發明使所述修飾蛋白與預定結合伴侶接觸，如果存在結合親和力，任選地使得可以與所述伴侶互相結合。
根據本發明的接觸優選通過適合的展示和選擇方法如噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示或細胞表面展示、酵母表面展示或細菌表面展示方法進行，優選通過噬菌體展示方法進行。為充分公開，也參考以下參考文獻Hoess，Curr.Opin.Struct.Biol.3(1993)，572-579；Wells and Lowmann，Curr.Opin.Struct.Biol.2(1992)，597-604；Kay etal.，Phage Display of Peptides and Proteins-A Laboratory Manual(1996)，Academic Press。
上述方法對本領域技術人員已知，可根據包括其中修飾的本發明使用。
根據本發明優選的可以通過以下一種或多種方法確定所述修飾蛋白與預定結合伴侶是否具有可定量的結合親和力ELISA、等離子體表面共振光譜、螢光光譜、FACS、等溫滴定量熱法和分析超離心。
作為根據本發明的顯示結合特性的泛素變體的篩選方法實例，下面描述適於本應用的一種類型的噬菌體展示方法。以相同方式，例如展示到細菌(Bacterial SurfaceDisplay；Daugherty et al.，1998)或酵母細胞(Yeast Surface Display；Kieke et al.，1997)的方法或無細胞選擇系統如核糖體展示(Hanes and Plückthun，1997；He and Taussig，1997)或反式展示(Odegrip et al.，2003)或mRNA展示可以被應用。在後者的情況下，通過將蛋白質變體經由核糖體偶聯到適當的mRNA上而實現基因型和表型的短暫物理聯繫。
在此處描述的噬菌體展示方法中，重組泛素變體展示在絲狀噬菌體上，同時所展示變體的編碼DNA以單鏈形式包裝在噬菌體包膜中。因此在親和富集的框架中，可以從文庫中選擇具有某種特性的變體，其遺傳信息可以分別通過感染合適的細菌或加到另一個富集循環得以擴增。可以通過基因融合到氨基端信號序列——優選PelB信號序列——和噬菌體的衣殼蛋白或表面蛋白——優選是羧基端融合到衣殼蛋白pIII或其片段上，實現將突變泛素在噬菌體表面的展示。此外，編碼的融合蛋白還可以含有功能性元件，如便於通過親和層析檢測和/或純化的親和標籤或抗體表位，或便於在親和富集過程中特異性切割融合蛋白的蛋白酶識別序列。
另外，琥珀終止密碼子可以存在例如於泛素變體基因和噬菌體衣殼蛋白或其片段的編碼區之間，部分由於引入一個胺基酸而在合適的抑制菌株中的翻譯過程中該終止密碼子不被識別。
適用於分離與預定半抗原或抗原具有結合特性的泛素變體選擇方法的、並且所述融合蛋白的基因盒插入其中的細菌載體被稱為噬粒。其中，它含有絲狀噬菌體(例如M13或f1)的基因間區域或其部分，在通過輔助噬菌體如M13K07而進行攜帶所述噬粒的細菌細胞超數感染的情況下，所述基因間區域或其部分導致將閉合鏈的噬粒DNA包裝到噬菌體衣殼中。這樣產生的噬粒被細菌分泌並展示編碼的各泛素變體——由於它與衣殼蛋白pIII或其片段融合——到其表面。天然pIII衣殼蛋白存在於噬粒中，使得它保留重新感染合適細菌株的能力以及因此擴增對應DNA的可能性。因此而確保泛素變體表型——即其潛在結合特性——和其基因型之間的實際聯繫。在本實施例中，為此目的已經構建的噬粒pMUBI-1(圖3)用於插入泛素變體的編碼序列並用於製備噬粒。
通過本領域技術人員已知的方法可根據所展示的泛素變體與預定半抗原或抗原的結合來選擇所得噬粒。為此目的，所展示泛素變體可以暫時固定於例如與微滴定板結合的靶物質，並可以在分離非結合變體後被特異性洗脫。優選用鹼性溶液如100mM三乙胺進行洗脫。作為替代方案，也可在酸性條件下、經蛋白水解或直接加入受感染細菌來進行洗脫。通過選擇和擴增與預定半抗原或抗原具有結合特性的泛素變體的連續循環，如此所得噬粒可以被重新擴增並富集。
以噬粒形式即與噬菌體融合的形式，或克隆相應基因盒到合適的表達載體中後以可溶性蛋白形式，可以對如此所得的泛素變體進行進一步表徵。適當的方法對本領域技術人員已知或已在文獻中描述。表徵例如可包含確定DNA序列和隨後確定分離變體的一級序列。此外，例如可以通過標準免疫學方法如ELISA或等離子體表面共振光譜、螢光光譜、FACS、等溫滴定量熱法或分析超離心，檢測所分離變體的親和力和特異性。關於穩定性分析，例如與化學或物理解摺疊相關的光譜學方法對本領域技術人員已知。
在另外使用的核糖體展示方法中，泛素變體通過無細胞轉錄/翻譯系統製備並作為與相應mRNA以及核糖體結合的複合體展示。為此目的，如上所述的DNA文庫用作基礎，其中變體基因以與用於表達和蛋白生物合成的相應調節序列的融合體形式存在。由於在基因文庫的3』端缺失終止密碼子以及合適的實驗條件(低溫、高Mg2+濃度)，由新生蛋白、mRNA和核糖體組成的三元複合體在體外轉錄/翻譯期間被維持。
可以根據展示於其上的泛素變體與預定半抗原或抗原的結合通過本領域技術人員已知的方法選擇這些複合體。為此目的，展示到核糖體複合體上的泛素變體分別可以被暫時固定到例如與微滴定板結合的靶物質上或者可以在溶液中結合以後再被結合到磁性顆粒上。分離出非結合變體之後，通過破壞核糖體複合體而使具有結合活性的變體的遺傳信息可以以mRNA形式被特異性洗脫。優選用50mM EDTA進行洗脫。如此獲得的mRNA可以被分離並用合適的方法(逆轉錄反應)逆轉錄成DNA，如此所得的DNA可被再擴增。
通過體外轉錄/翻譯、選擇和擴增的連續循環，可以富集與預定半抗原或抗原具有結合特性的泛素變體。
克隆相應基因盒到合適表達載體中後，可以如上述可溶性蛋白形式進一步表徵如此所得的泛素變體。適合的方法對本領域技術人員已知或已在文獻中描述。
優選地，步驟(d)即檢測與預定結合伴侶具有結合親合力的蛋白質的步驟之後是分離和/或富集所述檢測蛋白質的步驟。
根據本發明修飾並具有泛素樣摺疊基序的蛋白質表達之後，可用原本已知的方法對它們進行進一步純化和富集。所選方法依賴於幾種本領域技術人員原本已知的因素，例如所用表達載體、宿主生物、目標使用領域、蛋白質大小和其它因素。對於簡化的純化，根據本發明修飾的蛋白質可以與對分離材料具有更高親和力的其它肽序列融合。優選地，選擇這些融合應注意對所述泛素蛋白的功能沒有不利影響或由於引入特異性蛋白切割位點而能在純化之後得以分離。這些方法也是本領域技術人員原本已知的。
根據本發明，具體根據上面剛剛描述的方法，與預定結合伴侶如半抗原或抗原具有結合親和力的泛素變體一般可以被分離。
作為根據本發明提供的所述修飾蛋白的結合伴侶，可以使用所有生物學和醫學活性的和相關的分子。可能的結合伴侶將在下面以示例方式描述。然而應該注意，多種其它可能的配體可以加到這個列表中。與抗體和抗原之間的關係相似，潛在結合伴侶的列表可進一步用潛在配體完成。
優選地，結合伴侶是生物受體，優選G蛋白偶聯受體(GPCR；例如人GLP-1受體、人PTH受體)或EGF受體、HER2、HER3、VEGF/R1-4、Ep-CAM或其配體或結構域、腫瘤標誌物(前列腺特異性膜抗原(PSMA))、細胞因子(腫瘤壞死因子α(TNF-α)、腫瘤壞死因子β(TNF-β))、白介素(例如IL-2/IL-6、IL-11、IL-12)、生長因子(例如NGF(神經生長因子)和其前體、ProNGF、BMP、EGF、MIA、MIA-2、FGF、血管內皮生長因子(VEGF)、PDGF、P1GF、IGF)、激酶、整合素(例如糖蛋白受體IIb/IIIa(GPIIb/IIIa))、HSA(人血清白蛋白)、F4絲束蛋白(fimbine)、T和B細胞抗原，優選CD4、CD11、CD14、CD16、CD20、CD22、CD25、CD34、CD47、CD56、CD83、CD154、CTLA-4；免疫球蛋白或其部分，例如完整抗體(例如免疫球蛋白G、E、M)、例如人免疫球蛋白M的Fc部分或抗原結合位點區域中的抗體片段；或糖(Lewis Y、Lewis X)；或毒素，例如黴菌毒素；或激素，例如氫化可的松。
本發明的具體優點在於修飾蛋白或泛素在細胞內、外環境中都有活性，即在細胞內和外都可以結合它們相應的結合伴侶。
特別有利的是本發明的修飾蛋白或泛素可以可定量的方式結合半抗原即小分子和抗原即大分子如蛋白質。通過根據本發明的修飾蛋白的這種可變性，因此完全可以為各種結合伴侶提供可能的新產生的結合伴侶。
本發明的蛋白質還可用於檢測和定量測定以及分離和提取對應的結合伴侶。
另一個應用是診斷和治療對應結合伴侶參與的疾病。
正如已經提到的，本發明也涉及定向改變位於新生的人工結合位點以外的單個胺基酸位置。這樣，例如，由與天然泛素的生物功能相關的胺基酸佔據的位置可被其它胺基酸佔據。這樣可獲得一種泛素蛋白骨架，其中其生物功能如和泛素化級聯反應的酶相互作用是無活性的，但其結構和蛋白質化學特性與起始蛋白大體一致。這可以通過以下方法進行，例如測定大腸桿菌中的表達速率、用光譜學方法如螢光或圓二色性測量並結合化學或物理解摺疊分析其穩定性、或用標準免疫學測試如ELISA來檢測。
例如通過將Arg54和Arg72替換成Leu，可以阻斷與泛素活化酶E1的相互作用(Burch and Haas，1994)。另外，在所有胺基酸中，胺基酸Lys48以及Val70到Gly76參與與泛素連接酶E2的相互作用，該相互作用通過適當替換而消除(Miura et al.，1999)。另外，泛素與預定要經歷蛋白水解性降解的蛋白質的連接或與多聚泛素鏈的共價且選擇性的連接分別通過殘基Gly75和Gly76發生，並可以用適當替換而消除。最後，替換Ile44Ala和Val70Ala大體消除了泛素與26S蛋白酶的接觸和泛素標記的蛋白質的降解(Beal et al.，1996)。因此，在本發明的優選實施方案中，攜帶替換Ile44Ala、Lys48Arg、Arg54Leu、Val70Ala、Arg72Leu、Gly75Ala以及缺失Gly76的修飾泛素蛋白骨架用作製備具有新結合特性的修飾泛素的起始點。經上述方法測定，這種修飾泛素蛋白骨架與泛素在結構和蛋白質化學特性上大體一致，所述蛋白質化學特性即穩定性、摺疊、大腸桿菌中的生成、與泛素抗血清的相互作用等。
令人驚奇的是，在不同文獻記錄中分別提到的修飾可以被合併到一種泛素中，而基本不改變其結構或穩定性。
令人驚奇的，通過本發明中所述方法可以在蛋白質具有泛素樣摺疊基序的基礎上獲得修飾蛋白，所述蛋白質一方面顯示新產生的結合特性，另一方面在很大程度上具有泛素的蛋白質化學特性。在此方面，基於泛素的修飾蛋白的解離常數優選為10-6M或更低，例如10-6M-10-12M，這分別與抗體或其片段的解離常數相當。另外，令人驚奇的，可以產生具有特異性結合特性的修飾蛋白，其任選的針對大分子如蛋白質，或者也針對小分子如半抗原或激素。之前定義的靶物質或靶物質類可以被高選擇性地結合。新生的人工結合位點關於親和力和特異性的所觀察到的功能不能被提前預料，因為廣泛區域的結合位點位於一般認為剛性和非柔性的β片層中。另一方面，天然的通用結合位點——如抗體的結合位點——由柔性的「環」結構形成。
還令人驚奇的是，用於本發明情況的泛素蛋白骨架明顯耐受一級序列的大幅度改變，而對多肽鏈摺疊沒有任何不利影響。不僅胺基酸替換數目在預料之外——野生型泛素約20％的序列可被改變——而且由於改變位置位於蛋白質骨架上。因此，舉例來說，對通常被認為是剛性和非柔性的β片層中的、具體是直接臨近胺基酸的替換的耐受性不能事先被預料。
從所得的基於泛素的修飾蛋白的突變DNA序列起始，可以通過已知的基因工程方法製備所述的修飾蛋白。在此方面，優選在原核宿主中進行生產——因為低成本和高產量——然而不排斥使用真核或無細胞系統。通常，在將DNA序列插入合適的表達載體並轉化、轉染或感染適當生物體後，外來修飾蛋白被細菌轉錄/翻譯系統合成。為此x製備方法可適用於具有新結合特性的單個修飾蛋白。因此，如果例如大腸桿菌用作宿主，基於泛素的修飾蛋白可以藉助合適的信號序列分泌到周質間隙，或者可在細胞溶質中製備。如果本發明修飾蛋白不在細胞內摺疊而聚集，也可以對這些包含體進行功能性重摺疊。無細胞系統是有利的，例如對於具有低表達速率或對宿主生物有毒性作用的變體。分別製備和純化重組蛋白的合適的基因工程方法對本領域技術人員已知並且已經在文獻中描述(如Sambrook et al.，2001)。
因此，可以通過產生人工結合位點提供具有新結合親和力的基於泛素的修飾蛋白，這些蛋白質的高度可變的表面使得可以分子識別預定配體如半抗原、肽、蛋白質和其它大分子或較小分子例如激素。
此外，由於隨機區域的可變表面特性，通過合適的選擇方法也可以獲得具有不同於結合特性之其它特性的基於泛素的修飾蛋白。這些例如包括對於預定化學反應的之前不存在的新催化活性。舉例來說，如果結合伴侶是與修飾蛋白以催化對應反應的方式結合的分子或過渡態，則獲得了這種特性。
因此，本發明包含提供作為骨架分子的分子如泛素，以引入之前不存在的新結合特性。
此外，根據本發明，例如通過隨機誘變的方法，可以在所述方法的步驟d)中建立基因文庫(genetic library)。根據其中一個實施方案，本發明也包含如此製備的基因文庫。具體包含由在胺基酸位置2、4、6、62、63、64、65和66替換的人泛素而建立的基因文庫。
此外，可以在人工結合位點以外以定向方式修飾蛋白質骨架以賦予修飾蛋白質其它功能。這可以包括例如引入額外的胺基酸或替換單個胺基酸或肽——優選在氨基和羧基末端——以通過與合適試劑化學偶聯而獲得蛋白質結合物。這種融合體也可以用基因工程方法連接所述修飾蛋白和融合伴侶的基因而直接製備。與抗體相比，這被簡化，因為僅一個外源基因被細菌宿主表達，因而僅一條多肽鏈分必須被功能性摺疊。這些融合伴侶分別可以是酶、細胞毒素、結合和多聚化結構域以及具有相同或不同結合特異性的修飾蛋白。
根據本發明提供的具有典型泛素摺疊基序的修飾蛋白可以位點特異性和共價的方式連接到具有相同或不同特異性的蛋白質上，如此分別獲得與一個或多個結合伴侶的雙價或雙特異性結合特性。
因此，例如由上述方法獲得的並結合相同抗原的兩個相同泛素變體可以用本領域技術人員已知的方法經單個外加的半胱氨酸殘基以位點特異性的方式彼此共價連接。與單價的蛋白質比較，根據經驗這些雙價結合蛋白的特徵在於具有更強的表觀結合(親和效應)。
以相同方式，兩個結合不同抗原的泛素變體可用適當方法相互連接，由此獲得雙特異性結合分子。為了選擇性形成這些異二聚體，可以使用由帶正或負電的胺基酸組成並且每個都融合到融合伴侶的羧基端的多肽。如果使用帶相反電荷的胺基酸，這些所謂多離子標籤將選擇性經歷相互之間的靜電相互作用，並以預期的1∶1比率互相連接不同特異性的結合蛋白。在癌症治療中，這些雙特異性藥劑可與免疫系統的效應細胞接觸，尋找適當的表面結構例如腫瘤細胞，從而以定向方式破壞後者。
此外，由上述選擇方法之一分離的泛素變體因此已經表現出與特異性抗原的結合特性，它們可以被修飾以進一步增強其親和力和/或特異性。為此目的，可以在結合位點之內和/或之外產生新的定向和/或隨機胺基酸替換。這種成熟(maturation)操作的適當方法對本領域技術人員已知。使已經獲得的泛素變體成熟可包含親和力和特異性但不限於這些。可以改進的其它蛋白質特性例如是穩定性、溶解性和原核生產水平。在本發明範圍內，例如通過在結合位點內定向替換兩個胺基酸，泛素變體與免疫球蛋白M的Fc部分的親和力以此方式增加10倍。
本發明提供的基於泛素的修飾蛋白——以與抗體及其片段類似的方式——發現有廣泛的應用領域。這包含診斷和治療應用以及層析方法。因此，可以諸如ELISA、Western印跡等的任何生物分析測試直接檢測靶物質。此外，根據本發明修飾的結合例如免疫球蛋白並偶聯到酶或螢光基團的蛋白質適於用作適當測試系統中的通用二級報告分子。由於其有利特性，發現基於泛素的修飾蛋白優選用於治療用途，例如用於治療腫瘤或傳染性疾病。這樣，可以利用基於受體或配體被特異性結合所述修飾蛋白阻斷的作用。相似的，結合腫瘤細胞的表面蛋白的具有新結合特性的修飾蛋白由於與合適的效應子偶聯，分別可以定向方式破壞這些細胞或選擇性活化腫瘤組織中的適當的前毒素。
因此對於根據本發明修飾並選擇的蛋白質，可以有廣泛的潛在應用。它們不僅可用於醫學-製藥領域，而且可用於營養和食品工業、營養補充劑、化妝品、醫學和非醫學診斷和分析等的分析領域。應用領域自然依賴於所選結合伴侶的類型。
在人和獸醫治療和預防領域，可用原本已知的方法製備製藥有效的藥劑。根據蓋倫製劑，這些組合物可以通過靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、透皮或其它給藥方法施用。藥物製劑的類型依賴於待治療疾病類型、疾病嚴重程度、待治療患者和醫學領域技術人員已知的其它因素。可以胃腸道外經注射給藥，或者用其它常用方法經灌輸、系統性的、經直腸給藥。
所述組合物適於含有治療有效劑量。給藥劑量的量依賴於待治療機體、疾病類型、患者年齡和體重以及其它原本已知的因素。
所述組合物可含有原本已知的輔劑。這些例如包括穩定劑、表面活性劑、鹽、緩衝劑、著色劑等。
藥物組合物可以是液體製劑、乳膏、局部用洗劑、氣溶膠，粉劑、顆粒、片劑、栓劑或膠囊形式，乳液或脂質體製劑形式。所述組合物優選是無菌、無致熱源且等滲的，並含有製藥常用的且可接受的原本已知的添加劑。另外，參考美國藥典的規定。
提供以下實例以進一步說明本發明。本發明具體以泛素修飾為例說明。然而本發明不限於此，以下實施例只是表明基於以上說明書的本發明的可實施性。為充分公開本發明，也參考本申請和附件中引用的文獻，它們的全部內容都引入本申請作為參考。


下面將參考實施例及附圖更詳細描述本發明，其中圖1表示在野生型泛素(PDB碼lubi)表面上的新生的人工結合位點區域；圖2表示與泛素(WT)和對照表位比較在2、4、6、62、63、64、65、66位隨機替換的104個變體中的每一個的蛋白質穩定性的計算機分析結果；
圖3說明用於選擇具有新結合特性的基於泛素的修飾蛋白的噬粒載體pMUBI-1；圖4說明構建泛素變體文庫的過程；圖5表示檢測經噬菌體展示選擇的基於泛素的修飾蛋白與對應蛋白的結合的ELISA實驗結果；圖6表示檢測經核糖體展示選擇的基於泛素的修飾蛋白與對應蛋白的結合的ELISA實驗結果；圖7表示檢測經核糖體展示選擇的基於泛素的修飾蛋白與對應蛋白的結合的BIACORE實驗結果；圖8表示檢測經噬菌體展示選擇的基於泛素的修飾蛋白與對應半抗原的結合特異性的ELISA實驗結果；圖9表示檢測經噬菌體展示選擇的、針對其抗原經二次誘變而獲得的基於泛素的結合蛋白SPU-3-A7變體與IgM Fc的改進結合的ELISA實驗結果；圖10表示使用雙馬來醯亞胺己烷經單個羧基端半胱氨酸殘基位點特異性、共價偶聯兩個基於泛素的蛋白質的實驗結果。
圖1在表面上具有人工產生的結合位點的野生型泛素(PDB碼lubi；Vijay-Kumar etal.，1987)的晶體結構。用PyMOL程序(DeLano Scientific，San Francisco)進行二級結構元件的三維顯示。作為實例製備的文庫中待隨機替換的殘基包含2、4、6、62、63、64、65、66位並用其側鍊表示。
圖2在野生型泛素(PDB碼lubi)表面產生結合位點。經計算機分析分別根據其對溶劑的暴露和穩定或去穩定作用選擇待製備文庫中待隨機替換的殘基(2、4、6、62、63、64、65、66位，用淺灰色表示)，其中可以在各自位置有胺基酸替換。然後用ProSAII軟體確定104個變體中的每個的蛋白質穩定性，與泛素(WT)和相同數目的隨機採取的變體樣品——其中「對照表位」的殘基(24、28、31、32、35、37、38、39位，用暗灰色表示)被替換——作比較。將組合的Cα/Cβ勢的值(「zp-comb」)標註為穩定性的量度。計算機產生的結合位點區被隨機替換的變體中約19％具有與泛素(WT)至少同樣高的穩定性，而約90％比攜帶「對照表位」的那些更穩定。泛素的蛋白質結構應該耐受分析區域中經隨機胺基酸替換的結合位點的產生，其穩定性不受嚴重影響。這種計算機方法輔助選擇合適的表面暴露的胺基酸。
圖3用於通過噬菌體展示選擇MUBI變體的噬粒載體pMUBI-1。pMUBI-1用於製備噬菌體文庫並在四環素啟動子/操縱子(tetp/o)的轉錄調控下編碼PelB信號序列、泛素變體基因、MyCUT標籤和噬菌體衣殼蛋白的C端片段(aa253-406，ΔgpIII)的融合蛋白。「琥珀」表示融合基因中琥珀終止密碼子的位置。通過兩個SfiI限制位點插入MUBI的突變基因盒。f1Ig、blap、tetR、Ori、ColE1和Cat分別表示噬菌體f1的基因間區、在β-內醯胺酶啟動子控制下的四環素阻遏蛋白基因、複製起點和氯黴素乙醯轉移酶基因。
圖4構建泛素變體噬菌體展示文庫的過程。
圖5在ELISA中用噬菌體展示經針對recGLP1-R選擇獲得的泛素變體SPU-1-D10與重組製備的人GLP-1受體的氨基端結構域的結合。分別用recGLP1-R和BSA或重組製備的人PTH受體(recPTH-R)的胺基酸結構域充滿適當數目的微滴定板孔，4℃過夜。與含0.5％Tween的3％BSA/PBS孵育以飽和剩餘結合位點(2小時，室溫(RT))。加入系列稀釋於PBST 0.1中SPU-1-D10並在30℃保溫90分鐘。用泛素抗血清(1∶10稀釋於PBST 0.1，30℃60分鐘)和偶聯過氧化物酶的兔抗體(1∶2000稀釋於PBST 0.1，30℃60分鐘)檢測結合的修飾蛋白。用Pierce的ImmunoPure試劑盒進行檢測。步驟之間用PBST 0.1進行三次洗滌——在顯色檢測之前再進行三次PBS洗滌。用H2SO4終止顏色反應後在405nm檢測信號強度並對相應的修飾蛋白濃度作圖。通過非線性回歸確定平衡條件下的KD值。
圖6在ELISA中通過核糖體展示選擇而獲得的泛素變體SPW-11-A1對VEGF的結合。本實驗使用如圖5所述相同的方法。通過非線性回歸確定平衡條件下的KD值。
圖7在BIACORE中通過核糖體展示選擇而獲得的泛素變體SPU-11-58對VEGF的結合。首先將VEGF固定於CM5晶片的通道表面同時參比通道保持未負載。對於不同濃度SPU-11-58的應用，在每種情況下獲得結合事件的淨信號。所有溶液的注射時間是在35μl/min流速下2分鐘。不同濃度SPU-11-58(1.3μM、0.65μM、0.325μM、0.163μM、0.081μM)的結合信號在注射起始時重疊。每次測量後用10mM HCl以15s脈衝而再生表面。用BIAevaluation software 3.1(Biacore)測定平衡條件下的KD值。
圖8在ELISA中經針對氫化可的松選擇而獲得的泛素變體SPW-3-H13對類固醇的結合。分別用與BSA偶聯的氫化可的松、睪酮和雌二醇或用BSA每種充滿微滴定板的三個孔，並分別與SPW-3-H13(4μM)或與結合區未改變的泛素蛋白骨架(50μM)在PBST 0.1中一起孵育(30℃90分鐘)。用Ni-NTA/過氧化物酶偶聯物(1∶500稀釋於PBST 0.1，30℃60分鐘)並用Pierce的ImmunoPure試劑盒進行檢測。封閉和洗滌見圖5。用H2SO4終止顏色反應後在405nm檢測信號強度並用三次測量的平均值作圖。
圖9經定點隨機誘變方式的親和成熟後在ELISA中比較泛素變體SPU-2-A7和SPU-2A7(62/63)與FcIgM的結合。使用如圖5中的相同實驗方法。通過非線性回歸確定平衡條件下的KD值。
圖10通過SDS-PAGE分析經單個羧基端半胱氨酸殘基定點共價偶聯的兩個基於泛素的蛋白質。加入20μl每種未偶聯蛋白(泳道1)以及偶聯反應後的樣品(泳道2)。電泳後凝膠用考馬斯亮藍染色。大小標準物(泳道M)的分子量以kDa表示。
實施例1提供合成泛素基因用於選擇具有新產生結合親和力的修飾蛋白用本領域技術人員已知的標準方法如Sambrook et al.，(2001)中的那些方法進行基因工程操作。
為製備編碼具有替換Ile44Ala、Lys48Arg、Arg54Leu、Val70Ala、Arg72Leu、Gly75Ala以及缺失Gly76的修飾泛素蛋白骨架的DNA序列(Seq ID No.1)，以作為製備人工結合蛋白的起始點，使用以下操作步驟為合成基因，在50μl體積中進行PCR反應，其中鹼基對序列合起來表示待合成基因的六種寡聚脫氧核苷酸(Seq IDNo.2、Seq ID No.3、Seq ID No.4、Seq ID No.5、Seq ID No.6、Seq ID No.7，每種0.1μM)作為模板，每種2.5μl。所用的每種寡聚脫氧核苷酸序列分別對應人工基因的編碼和非編碼鏈的片段，長度為40-50個鹼基對並在其3』和5』端大約重疊15個鹼基。此外，樣品中含旁側引物(Seq ID No.8、Seq ID No.9，10μM)，每種2.5μl；以及5μl 10×Taq緩衝液(100mM Tris/HCl pH 9.0，500mM KCl，1％(v/v)Triton X-100)、3μl 25mMMgCl2和4μl dNTP-Mix(dATP、dCTP、dGTP、dTTP，每種2.5mM)。用水補足體積後在熱循環儀中加熱反應樣品到94℃變性2分鐘。然後在加熱過程中加入2.5U Taq聚合酶(Promega)(熱啟動)並開始PCR程序。反應保溫25個循環，每個循環是94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1.5分鐘。最後在72℃保溫5分鐘。
預期PCR產物通過分析瓊脂糖凝膠電泳鑑定並用MinElute Reaction Cleanup試劑盒(Qiagen)從樣品中純化。1.0ng分離的DNA作為第二輪擴增的模板，這次使用Pfu聚合酶(Promega)，體積仍是50μl。為此目的，使用5μl提供的Pfu緩衝液(200mM Tris/HCl，pH 8.8，20mM MgCl2，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，1％(v/v)Triton X-100，1mg/ml BSA)以及4μl dNTP混合物並用水補足體積。此外，樣品中含旁側引物(Seq ID No.8、Seq ID No.9，10μM)以引入合適的限制性位點。預期PCR產物通過製備性瓊脂糖凝膠電泳分離並用Zero BluntTOPOPCR Cloning試劑盒(Invitrogen)根據製造商的說明插入到克隆載體pCR4Blunt-TOPO中。提供的化學感受態細胞用適當的連接反應樣品轉化並鋪到含LB/amp/kan培養基的瓊脂平板上。37℃培養平板16小時並分析生長菌落中是否有預期連接產物。為此目的，用Qiagen公司的質粒提取試劑盒根據製造商說明小規模製備質粒DNA，並用DNA限制性內切酶NdeI和XhoI(New England Biolabs)進行限制性消化，其中限制性內切酶的識別序列通過旁側引物引入PCR產物中。用Taq DNA聚合酶對插入基因盒的區域中具有預期切割模式的質粒進行序列分析。為此目的，根據製造商說明使用CycleReaderTMAutoDNA Sequencing試劑盒(Fermentas)以及0.5μg質粒DNA和1.0pmol各螢光標記引物。在聚合酶反應期間新合成的DNA鏈被標記，通過引入雙脫氧核苷酸在統計學上但以鹼基特異性方式終止。然後所得螢光DNA片段通過聚丙烯醯胺-尿素凝膠電泳在液體測序裝置中分離，並在臨近泳道中顯示為對應於A、C、G、T的條帶模式。
具有正確DNA序列的基因盒通過製備性NdeI/XhoI限制性消化從克隆載體pCR4Blunt-TOPO上切割並通過製備性瓊脂糖凝膠電泳分離。將編碼修飾泛素蛋白骨架的基因插入表達載體pET20B(-)(Novagen)以產生相應蛋白，或插入質粒載體pMUBI-1以構建泛素變體的文庫。
實施例2製備泛素變體文庫為分別隨機定點誘變合成泛素基因的氨基和羧基端8個密碼子，連續進行兩次PCR反應。第一個擴增步驟在10×50μl體積中使用Pfu聚合酶(Promega)。為此目的，每個樣品使用5μl提供的10×Pfu緩衝液以及4μl dNTP混合物並用水補足體積。另外，每個樣品含有2.5μl旁側引物(Seq ID No.10、Seq ID No.11，10μM)以引入預期鹼基對替換。使用攜帶非突變合成泛素基因的1.0ngpMUBI-1作為模板。加入2.5UPfu聚合酶(見上文)以後進行25個保溫循環，其中每個循環是94℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃1.5分鐘。最後在72℃保溫5分鐘。為選擇性降解模板DNA，每個反應樣品中加入10U DpnI並在37℃保溫1小時。通過製備性瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)分離期望的PCR產物。
第二個擴增步驟在1,000μl樣品體積中進行，其中使用約1.0ng第一輪PCR反應產物並使用Taq聚合酶。吸取反應樣品——調整到20倍體積——如上述由10×Taq緩衝液、25mM MgCl2、dNTP混合物以及旁側引物(Seq ID No.12、Seq ID No.13，10μM)組成，其中旁側引物在5』端被生物素化並且每種分別攜帶不相互兼容的SfiI內切酶識別序列。用水補足體積後，在加熱狀態下(見上文)加入2.5U Taq聚合酶並開始PCR程序。進行25個保溫循環，其中每個循環是94℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃1.5分鐘。最後在72℃保溫5分鐘。
隨後直接在PCR反應樣品中切割所得擴增產物。為此目的，在總體積4,000μl中全部PCR反應溶液與相應體積的提供10×緩衝液II(100mM Tris/HCl，pH 7.9，100MgCl2，500mM NaCl，10mM二硫蘇糖醇)、10×BSA溶液和水混合。接著加入4,000U限制酶sfiI(New England Biolabs)並在50℃保溫16小時。用MinElute Reaction Cleanup試劑盒(Qiagen)提取DNA然後重懸於400μl無菌水中。為分離未被SfiI切割的PCR產物，提取的DNA與含有1.0mg/ml磁珠的等體積「Binding Solution」(Dynal)混合併在旋轉混合器上室溫(RT)保溫4.5小時，其中在磁珠表面偶聯鏈親合素(「DynabeadsKilobase Binder」)。沉澱帶有任選的仍存在生物素化的DNA的珠子，同時完全被SfiI切割而不再具有生物素化末端的DNA保留在上清液中並沉澱過夜。在期望位置誘變並被sfiI切割的如此所得泛素基因溶於無菌水中，再用QIAquick PCR Purification試劑盒(Qiagen)脫鹽，最後得到濃度200fmol/μl的水溶液。
為製備受體載體，根據製造商說明用SfiI切割質粒pMUBI-1並用製備性瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)分離較大(載體)片段。為避免分子內連接，對5』端去磷酸化。為此目的，0.5U來自蝦(Pandalus borealis)的鹼性磷酸酶以及所提供緩衝液用於總體積200μl中。在37℃保溫混合物90分鐘，用QIAquickPCR Purification Kit(Qiagen)分離樣品中的DNA並再次脫鹽(QIAquick PCRPurification Kit)。載體片段DNA最後以濃度50fmol/μl溶於水中。為連接，1.6pmol所述PCR片段和8.0pmol pMUBI-1載體片段在2U T4 DNA連接酶(GibcoBRL)存在下在總體積1,600μl(50mM Tris/HCl，pH 7.6，10mM MgCl2，1mM ATP，1mM DTT，5％(w/v)PEG-8,000)中16℃保溫3天。65℃加熱樣品15分鐘後沉澱DNA。為此目的，每種100μl反應溶液與100μl乙醇以及10μl 5M NaAc，pH3.0混合併在-20℃保持16小時。隨後離心(60分鐘，12,500g)，用乙醇(70％v/v，-20℃)洗滌樣品，再次離心，最後沉澱DNA溶於60μl無菌水中。
為了電穿孔，在4℃冷室中使用Gene PulserII系統(Biorad)以及電極間距1.0mm的小杯(Biozym)。用每種3.5μl以上所得溶液根據製造商說明轉化電轉化感受態大腸桿菌XL1Blue(Stratagene)。所得細胞懸液鋪到5個含LB/氯黴素培養基的瓊脂板(20×20cm)上。37℃培養平板16小時並計數生長菌落。發現所構建文庫包括2.8×107個獨立克隆，其中每種克隆在文庫中存在10,000個。然後用總體積100ml含10％(v/v)甘油的SOC培養基刮取菌落並分成1.0ml小份保存於-80℃。隨機選取其中12個克隆，用Qiagen公司的DNA Miniprep Kit提取質粒載體，並分析誘變泛素基因區域的DNA序列。所有這些克隆都具有功能性序列——即沒有插入或缺失引起的讀碼框移動——以及在誘變位置性質完全不同的替換。不存在誘變區以外的隨機替換。
實施例3製備噬菌體表面的泛素變體並選擇針對蛋白和半抗原的泛素變體為生產在表面展示突變泛素的噬粒變體，100ml 2xYT/氯黴素培養基接種1.0ml由實施例2獲得的甘油培養物，並在37℃和220rpm下培養16小時。用10ml這種靜止期培養物接種1升2xYT/氯黴素培養基，並在37℃和220rpm振蕩直到細胞密度達到OD600＝0.4。用1013cfu的M13KO7輔助噬菌體感染，不搖動情況下37℃培養30分鐘。加入50mg/l卡那黴素後在37℃和220rpm振蕩樣品，然後通過調節無水四環素(貯液2.0mg/ml DMF溶液)到0.2mg/l誘導pMUBI-1上的基因表達。然後降低培養箱溫度到26℃，並220rpm振蕩培養16小時。最後細胞通過離心(30分鐘，12,000g，4℃)沉澱並丟棄，同時過濾上清液(0.45μm)。加入1/4體積20％(w/v)PEG6000、2.5M NaCl並在冰上保溫1小時沉澱所含噬粒，隨後離心沉澱(30分鐘，12,000g，4℃)。然後將噬粒溶於4ml冰冷PBS(137mM NaCl，2.7mM KCI，8mMNa2HPO4，2mM KH2PO4)中，在冰上保持30分鐘並離心(30分鐘，12,000g，4℃)。向上清液加入1/4體積20％(w/v)PEG6000，2.5M NaCl，冰上保溫1小時再次沉澱噬粒並離心沉澱(30分鐘，12,000g，4℃)。然後再將噬粒溶於4ml冰冷PBS中，在冰上保持30分鐘並離心(30分鐘，12,000g，4℃)。上清液與溶於PBS中的4％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)1∶1混合，旋轉混合器上在室溫保溫30分鐘，然後直接用於親和富集。
作為分離表面展示泛素變體的噬粒的親和基質，其中泛素變體應結合之前定義的靶物質，用各物質分別包被微滴定板的每24個孔。作為使用的靶物質，重組製備的人GLP-1受體的氨基端(recGLP1-R；Bazarsuren et al.，2002)、人免疫球蛋白M的Fc部分(FcIgM)以及與BSA偶聯的氫化可的松(HC)在微滴定板上4℃固定過夜。
每孔加入400μl溶於PBS中的4％BSA並室溫保溫90分鐘，從而封閉微滴定板表面上的未被佔據的結合位點。然後吸取100μl所製備噬粒溶液到每孔中並室溫(RT)保溫90分鐘。然後通過用含0.05％(v/v)Tween 20的PBS(PBST 0.05)洗滌兩次，與400μl 4％溶於PBS的BSA保溫兩次每次5分鐘並用PBS洗滌兩次同時用力拍擊，從而去除未結合噬粒。最後用100μl 100mM三乙胺/孔室溫保溫10分鐘洗脫與親和基質結合的噬粒。合併含洗脫噬粒的溶液——每種分別依賴於各自靶物質——並立即加入1/2體積1M Tris/HCl，pH7.4而中和。每種情況下獲得的溶液轉移到20ml細胞密度OD600＝0.4的培養物中，以感染E.coli XL1 Blue，並在37℃220rpm振蕩30分鐘。再次洗滌微滴定板孔(5×PBST 0.05，1×PBS)並每孔加入100μl細胞密度OD600＝0.4的E.coli XL1 Blue。37℃保溫30分鐘後，將這些細胞與那些之前感染的細胞合併。各細胞懸液鋪到含LB/氯黴素培養基的瓊脂板(20×20cm)上並且懸液一般含有105-107的形成菌落的克隆。37℃培養平板16小時，用10ml含10％(v/v)甘油的SOC培養基刮取形成的菌落，並以1.0ml等份保存於-80℃。
為重複生產噬菌體和新親和富集循環，選擇少10倍的細菌細胞培養物體積和更嚴謹的洗滌條件(第二輪3次PBST洗滌，三次與溶於PBS中的4％BSA保溫5分鐘和3次PBS洗滌；第三輪6次PBST 0.1洗滌，三次同樣溶於PBS中的4％BSA保溫5分鐘和3次PBS洗滌)重複所述方法。
實施例4分離和表徵與靶物質具有特異性結合的噬粒(單噬菌體ELISA)經第三輪針對recGLP1-R、Fc IgM以及HC的親和富集後，從每種所得的克隆中隨機選擇96個並用單相ELISA(single phase ELISA)分析與各抗原或半抗原的結合。為此目的，每個單菌落接種300μl 2xYT/氯黴素培養基並在37℃和220rpm下振蕩培養18小時。用80μl每種靜止期培養物接種4ml 2xXT/氯黴素培養基並在37℃和180rpm下振蕩培養4小時。為了可以進行平行操作，為此目的使用4個「Deep Well」板(Qiagen，每個有24個孔)。用1011cfu M13KO7輔助噬菌體感染XL1 Blue細胞後，在37℃保溫30分鐘。在37℃和180rpm下再保溫30分鐘後，加入50ml/l卡那黴素。然後繼續在37℃和220rpm下振蕩30分鐘，並通過調節無水四環素(貯液1.0mg/mlDMF溶液)到0.2mg/l誘導pMUBI-1上的基因表達。然後降低培養箱溫度到22℃，並在180rpm振蕩培養16小時。最後離心沉澱細胞(30分鐘，5,000g，4℃)，上清液轉移到新「Deep Well」板中。加入1體積20％(w/v)PEG6,000、2.5M NaCl並在冰上保溫1小時沉澱所含噬粒，隨後離心沉澱(30分鐘，5,000g，4℃)。然後將噬粒溶於1.0ml冰冷無菌PBS中，與溶於PBST 0.1的6％BSA以1∶1混合，並在RT保溫1小時。
為進行ELISA，每個待分析單克隆噬粒的一個微滴定板孔在4℃充滿抗原——一個孔充滿BSA溶液。為飽和塑料表面的剩餘結合位點，每個孔用含3％BSA(w/v)的PBST 0.5封閉。隨後用PBST 0.1漂洗孔三次並拍掉。然後吸取100μl上面製備的每種噬粒溶液到板上各孔中。保溫2小時後，用PBST 0.1洗滌三次。為檢測結合噬粒，將M13抗體過氧化物酶偶聯物(Amersham Pharmacia Biotech)以1∶5,000稀釋於PBST0.1中，並取100μl加到每個孔中。室溫保溫1小時後用PBST 0.1漂洗孔三次，然後用PBS漂洗三次。最後吸取100μl ImmunoPure Kit(Pierce)加入到孔中，並在15分鐘後通過加入100μl 2M H2SO4終止顏色反應。用Sunrise Remote Reader(Tecan)在450nm測量消光。
來自在ELISA中對各抗原——但不對BSA——顯示較強結合信號(約20)的噬粒的泛素變體的DNA用引物Seq ID No.14和上述方法測序。部分所分析DNA序列表現出讀碼框移動或琥珀終止密碼子並因此不再使用。如此獲得並進一步分析的泛素變體的胺基酸替換在表1中示例性列出。
表1經噬菌體展示針對不同靶物質選擇後基於泛素的修飾蛋白中新生的結合位點區域的胺基酸替換。

1SPU實施例5在體外轉錄/翻譯系統中製備泛素變體並通過核糖體展示選擇針對蛋白質的泛素變體根據Schaffitzel et al.，(2001)提供表達構建體用於體外轉錄/翻譯並通過核糖體展示選擇結合蛋白。然後，與此比較，本實例中不使用抗體片段文庫，而使用與實施例2所述類似的泛素變體文庫。這些文庫之一基於編碼修飾泛素蛋白骨架的DNA序列(SEQ ID No.1)製備，所述修飾泛素蛋白骨架具有替換Ile44Ala、Lys48Arg、Arg54Leu、Val70Ala、Arg72Leu、Gly75Ala以及缺失Gly76。第二個文庫基於編碼具有替換Phe45Trp的修飾泛素蛋白骨架的DNA序列(SEQ ID No.15)製備。
第一步，分別基於Seq ID No.1或Seq ID No.15根據實施例2用PCR方法製備代表8個密碼子突變的文庫的泛素變體的合成基因。這在50μl體積中用Pfu聚合酶(Promega)進行。為此目的，使用5μl提供的10×Pfu緩衝液以及4μl dNTP混合物並用水補足體積。進而，樣品含有2.5μl每種旁側引物(Seq ID No.16、Seq ID No.17用於基於Seq ID No.1的文庫，Seq ID No.18、Seq ID No.19用於基於Seq ID No.15的文庫；10μM)以引入預期鹼基對替換。使用攜帶非突變合成泛素基因Seq ID No.1或Seq ID No.15的1.0ng每種質粒DNA作為模板。加入2.5U Pfu聚合酶以後進行25個保溫循環，其中每個循環是94℃1分鐘、65℃1分鐘和72℃1.5分鐘。最後在72℃保溫5分鐘。用製備性瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取期望PCR產物。
包含噬菌體M13包膜蛋白III的一部分、在體外翻譯過程中將新生蛋白推出核糖體通道因而使泛素變體最佳展示的間隔區經兩個連續PCR反應合成。這首先在總體積50μl中使用5μl所提供的10×Pfu緩衝液、4μl dNTP混合物和適當量的水進行。進而，樣品含有2.5ml每種旁側引物(Seq ID No.20、Seq ID No.21，10μM)以及1.0ng噬菌體M13的DNA。加入2.5U Pfu聚合酶以後進行25個保溫循環，其中每個循環是94℃1分鐘、65℃1分鐘和72℃1.5分鐘。最後在72℃保溫5分鐘。期望PCR產物用製備性瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取並用作第二輪PCR反應的模板。這在50μl體積中用Pfu聚合酶(Promega)進行。為此目的，使用5μl提供的10×Pfu緩衝液以及4μl dNTP混合物並用水補足體積。進而，樣品含有2.5μl每種旁側引物(Seq ID No.22、Seq ID No.21，10μM)以引入預期鹼基對替換。使用1.0ng前一輪PCR反應的每種DNA作為模板。加入2.5U Pfu聚合酶以後進行25個保溫循環，其中每個循環是94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1.5分鐘。最後在72℃保溫5分鐘。用製備性瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取期望PCR產物。
在以下步驟中，代表8個密碼子被突變的文庫的合成泛素變體基因被融合到由連接PCR反應製備的間隔區DNA上。這在50μl體積中用Pfu聚合酶(Promega)進行。為此目的，使用5μl提供的10×Pfu緩衝液以及4μl dNTP混合物並用水補足體積。進而，樣品含有2.5μl每種旁側引物(Seq ID No.23、Seq ID No.21，10μM)。使用500ng來自前一輪PCR反應的文庫DNA和500ng間隔區DNA作為模板。加入2.5U Pfu聚合酶以後進行25個保溫循環，其中每個循環是94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1.5分鐘。最後在72℃保溫5分鐘。用製備性瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取期望PCR產物。
在最後步驟中，通過進一步PCR反應引入用於體外轉錄/翻譯反應的適當調節序列(T7啟動子、核糖體結合位點)，即得線性表達構建體。反應在500μl樣品體積中進行，其中使用約500ng前面PCR反應中獲得的產物和Taq聚合酶。反應樣品——調整到10倍體積——根據實施例2吸取10×Taq緩衝液、25mM MgCl2、dNTP混合物以及旁側引物(Seq ID No.24、Seq ID No.21，10μM)。用水補足體積後加入2.5UTaq聚合酶並開始PCR程序。進行25個保溫循環，其中每個循環是94℃1分鐘、65℃1分鐘和72℃1.5分鐘。最後在72℃保溫5分鐘。期望PCR產物用製備性瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取並可直接用於體外轉錄/翻譯反應。
為進行體外轉錄/翻譯反應，根據製造商說明使用RTS100 E.coli Kit(Roche Cat.No.3186 148)。為此目的，用移液器仔細混合24.0μl E.coli裂解物、20.0μl反應混合物、24.0μl胺基酸混合物(無甲硫氨酸)、2.0μl甲硫氨酸、10.0μl反應緩衝液(10×)、2.0μl MgAc(500mM)、2.0ml Anti-ssrA DNA(200μM)以及20.0μl各DNA文庫(0.5-1.0μg)，並在30℃或37℃保溫60分鐘。以下步驟分別在冷室或冰上進行。樣品在冰上冷卻5分鐘，加入400μl含3％BSA的WBT(50mM Tris/HCl(pH7.5)，150mM NaCl，50mM MgAc，0.1％Tween 20)。該緩衝液任選的含有2.5mg/ml肝素(Sigma)。在4℃以13,000rpm離心5分鐘沉澱樣品中的不溶部分，其中由泛素變體、對應mRNA和核糖體組成的三元複合體保留在上清液中。
作為分離三元複合體的親和基質，其中所述的三元複合體具有展示到表面上並應該結合預定靶物質的泛素變體，用對應物質包被微滴定板的兩個孔。重組製備的生長因子VEGF作為所用靶物質於4℃在微滴定板上固定過夜。通過每個孔用400μl含3％BSA的WBT在室溫保溫90分鐘，從而封閉微滴定板表面的未結合位點。除去封閉液後，每孔加入250μl含來自體外轉錄/翻譯反應的三元核糖體複合體的溶液並在4℃和50rpm下保溫60分鐘。然後通過用例如WBT(300μl/孔，3分鐘，4℃，50rpm)洗滌5次並用力拍擊而除去未結合複合體。通過100ml EB(50mM Tris/HCl(pH7.5)，1.5M NaCl，20mM EDTA)/孔——該緩衝液任選的含有50μg/ml酵母RNA(Sigma)——並在4℃和50rpm下保溫5分鐘而最後將結合所述親和基質的複合體分成mRNA、蛋白質和核糖體亞基。
儘可能快的在室溫並根據製造商說明使用Qiagen的RNAeasy試劑盒(Cat.Nr.74104)從所得懸液中分離RNA。在此情況下，最後步驟中用30μl無RNA酶的水洗脫RNA。為降解可能隨之攜帶的線性表達構建體DNA，將所得RNA溶液用DNaseI(Invitrogen)處理。為此目的，加入3μl DNase緩衝液(10×)和3μl DNase I(1U/μl)並在室溫保溫15分鐘。然後加入3μl 25mM EDTA並在65℃保溫10分鐘以滅活DNase。經逆轉錄反應互補所得RNA。為此目的，首先8.5μl所述RNA與0.5μl寡聚脫氧核苷酸T7te(Seq ID No.21；100μM)和4.0μl dNTP(每種2.5mM)混合併在65℃保溫5分鐘，然後放置冰上1分鐘。接著加入4.0μl RT緩衝液(5×)、1.0μl DTT(0.1M)、1.0μl RNAsin(Promega)和1.0μl SS逆轉錄酶III(200U/μl，Invitrogen)作為另外組分，並在55℃保溫60分鐘。
逆轉錄反應的反應樣品直接用於PCR，以重新擴增被富集泛素變體的遺傳信息以及重新引入調節序列以進行新的選擇循環。為此目的，用Expand High Fidelity PCR系統(Roche)在總體積50μl中進行連續兩輪PCR反應。為此目的，使用5μl提供的10×緩衝液(包括15mM MgCl2)以及4μl dNTP混合物並用水補足體積。進而，樣品含有2.5μl每種旁側引物(Seq ID No.23和Seq ID No.21，10μM)以及2.5μl二甲基亞碸(DMSO)。使用2.5或5.0μl前述PCR反應物作為模板。加入0.75μl聚合酶混合物(3.5U/μl)以後進行25個保溫循環，其中每個循環是94℃15秒、50℃30秒和72℃1.0分鐘。最後在72℃保溫7分鐘。期望PCR產物用製備性瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取並可直接用於第二個PCR反應。因此，使用5μl提供的10×緩衝液(包括15mM MgCl2)以及4μl dNTP混合物並用水補足體積。進而，所述批次含有2.5μl每種旁側引物(Seq ID No.24和Seq ID No.21，10μM)。使用前述PCR反應的總DNA作為模板。加入0.75μl聚合酶混合物(3.5U/μl)以後進行25個保溫循環，其中每個循環是94℃15秒、50℃30秒和72℃1.0分鐘。最後在72℃保溫7分鐘。期望PCR產物用製備性瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取並可直接用於新選擇循環的體外轉錄/翻譯中。
作為替代方案，將各基因克隆入表達載體pET20B(-)(見上文)。這樣使得可以分析所得泛素變體的DNA序列、在E.coli中重組製備所述變體並用羧端融合的六組氨酸肽進行固定化金屬螯合親合層析(IMAC)一步純化所述變體(見下文)。以此方式獲得並進一步分析的泛素變體的胺基酸替換在表2中示例性列出。
表2用核糖體展示方法經針對不同靶物質選擇後基於泛素的修飾蛋白的新產生結合位點區域的胺基酸替換。

1SPU結合口袋中沒有替換的泛素蛋白質骨架實施例6製備並純化基於泛素的修飾蛋白將各基因克隆到表達載體pET20B(-)中(見上文)後，表徵在ELISA中顯示較強結合信號並具有功能性DNA序列的噬菌粒中選擇的泛素變體的蛋白質化學特性。這使得可以用E.coli BL21/pUBS重組製備自變體並用羧端融合的六組氨酸肽進行固定化金屬螯合親合層析(IMAC)一步純化所述變體。
為重組製備具有新結合特性的基於泛素的修飾蛋白，用各單菌落接種50ml2xYT/amp/kan培養基，並在37℃和220rpm下振蕩16小時。用這種預培養物接種1.5升2xYT/amp/kan培養基並在37℃和220rpm下培養，直到細胞密度達到OD600＝0.5。加入1mM/lα-D-異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導外來基因表達後，繼續在37℃和220rpm下振蕩3小時。然後離心沉澱細胞(30分鐘，5,000g，4℃)並重懸於40mlNPI-20(50mM NaH2PO4，pH8.0，300mM NaCl，20mM咪唑)中。通過與200μg/ml溶菌酶和500U benzonase於室穩保溫半小時並15秒超聲脈衝重複5次，從而破碎細胞。離心沉澱細胞碎片(30分鐘，15,000g，4℃)，含總可溶性蛋白的上清液可直接用於隨後的IMAC。
用5ml HiTrap Chelating HP柱(Amersham Pharmacia Biotech)在KTATMExplorer FPLC裝置(Amersham Pharmacia Biotech)上在室溫和5ml/min流速下進行層析。首先，用5倍柱體積的NPI-20平衡柱子，隨後使總細胞蛋白流過柱子。用30倍柱體積的NPI-20漂洗從而洗去未結合蛋白。用20nM-250mM咪唑的線性梯度在總共20個柱體積中進行洗脫，並以每份2.5ml收集洗脫液。通過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分析含純化泛素變體的組分並合併。所得重組泛素變體的產率為10-30mg/l培養物體積。
實施例7表徵具有新結合特性的基於泛素的修飾蛋白的結合特性在ELISA中用Ni/NTA過氧化物酶偶聯物(Qiagen)或用兔抗泛素血清(Sigma)檢測在每種情況下針對recGLP1-R、FcIgM和HC而選擇並如實施例6純化的泛素變體的結合。為此目的，用各抗原和例如BSA充滿微滴定板孔並4℃過夜以檢測非特異性結合，並用含3％(w/v)BSA的PBST 0.5封閉2小時以飽和剩餘結合位點。然後用PBST 0.1漂洗板子三次並拍掉。而後，向每個板孔加入100μl含一系列濃度(從未稀釋到1∶16稀釋)的各修飾純化蛋白的PBST0.1溶液。保溫2小時後用PBST0.1漂洗三次。為檢測結合的修飾蛋白，Ni/NTA過氧化物酶偶聯物以1∶500稀釋度或泛素抗血清以1∶10稀釋度分別稀釋於PBST 0.1中，並向每個孔中加入每種100μl。RT保溫1小時後，直接檢測Ni/NTA過氧化物酶偶聯物(見下文)，或與兔抗體過氧化物酶偶聯物(1∶2500稀釋於PBST 0.1中)RT保溫1小時。為了檢測，用PBST 0.1漂洗孔三次，然後用PBS漂洗三次。最後加入100μl ImmunoPure kit，然後在15分鐘後加入100ml 2M H2SO4終止顏色反應。然後用Sunrise Remote Reader(Tecan)在450nm測量消光值。用「Sigma Plot」電腦程式評估所得吸光強度值。為此目的，每種情況下測量的消光值對所用的相應蛋白濃度作圖，並用式(1)的非線性回歸對所得曲線進行擬合。
(1)---y=a*x(b+x)]]>其中假定固定抗原和修飾蛋白之間的結合/解離平衡是x＝所用修飾蛋白濃度y＝抗原/修飾蛋白複合體的濃度(此處通過報告酶活性間接測量)a＝固定化抗原總濃度b＝解離常數(KD)從泛素變體SPU-1-D10的這種類型的ELISA實驗獲得的結合曲線示例性表示於圖5，其中泛素變體SPU-1-D10根據實施例3和4通過噬菌體展示從對recGLP1-R的親和富集中獲得。另外，圖6中是泛素變體SPW-11A1的結合曲線，其中泛素變體SPW-11A1根據實施例5通過核糖體展示從對VEGF的親和富集中獲得。針對具有新結合特性的單獨選擇的基於泛素的修飾蛋白獲得的結合數據總結於表3。
為定量分析泛素變體與預定抗原的結合，也使用BIACORE 3000系統(Biacore)。為了這種表面等離子體共振(SPR)測量，將能固定分析物的載體(傳感器晶片)定位到裝置內，並使之與集成於內部的微流系統(Integrated μFluidic Cartridge，IFC)結合。這使得連續流體可以從緩衝液貯庫流過晶片表面，並類似於在溶液中檢測與分析物載體的結合。
首先為了測量，根據製造商說明用NHS/EDC偶聯通過伯氨基將靶分子例如VEGF偶聯到傳感器晶片CM5(Biacore)的羧甲基葡聚糖表面上。在25℃、35μl/min的連續緩衝液流中進行測量。使用補充0.005％P-20去汙劑(Biacore)的PBS(過濾除菌並脫氣)作為工作緩衝液和蛋白質溶劑。由於產生SPR信號，經樣品環注射的不同濃度泛素變體與固定化VEGF的相互作用可以被檢測。信號被定量為依賴於時間的所謂共振單位(RU)，並所產生的相應結合曲線，。用BIAevaluation software(Version 3.1；Biacore)評估所得結合曲線，並確定解離常數(KD)值。由這種BIACORE實驗獲得的泛素變體SPU-11-58的結合曲線示例性表示於圖7，所述泛素變體SPU-11-58根據實施例5通過核糖體展示得自針對VEGF的親和富集。針對具有新結合特性的單獨選擇的基於泛素的修飾蛋白獲得的結合數據總結於表3。
表3所選基於泛素的修飾蛋白和不同靶物質的複合體的解離常數

1用ELISA分析；2用BIACORE分析此外，評估單個修飾蛋白的結合特異性。為此目的，用單個適當濃度的修飾蛋白如上述進行ELISA實驗。為此目的，用靶物質以及結構相似物質充滿微滴定板的各孔。由這種ELISA實驗獲得的泛素變體SPU-3-H13的結合曲線示例性表示於圖8，其中所述泛素變體SPU-3-H13根據實施例3和4得自對HC的親和富集。
實施例8用定點二次突變改進基於泛素的結合蛋白的結合特性基於對FcIgM表現出全新結合特性的泛素變體SPU-2-A7建立一種通用的親和成熟策略。這包含首先在DNA水平上在新生的結合位點中選定位置的新隨機替換以及隨後96個各變體的平行表達、純化和結合分析。通過使用這種「96格式」可以將此策略轉移到實驗室機器人上並因此進行高通量變體分析。
為此目的，在兩個平行樣品中通過PCR隨機突變兩個位置(62和63以及64和65)中每一個的密碼子。對應的每個反應在50μl中進行，其中使用約1.0ng插入pET20B(-)中的SPU-2-A7基因並使用Taq聚合酶。如實施例2所述從10×Taq緩衝液、25mM MgCl2、dNTP混合物以及旁側序列(Seq ID No.12，Seq ID No.25用於突變位置62和63，或Seq ID No.12，Seq ID No.26用於突變位置64和65；10μM)吸取反應樣品。用水補足體積後加入2.5U Taq聚合酶並開始PCR程序。進行25個保溫循環，其中每個循環是94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1.5分鐘。最後在72℃保溫5分鐘。用製備性瓊脂糖凝膠電泳和QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取期望PCR產物。分別代表對應在位置62/63或64/65突變的SPU-2-A7文庫的所得DNA片段被進行製備性NdeI/XhoI限制性切割並再用製備性瓊脂糖凝膠電泳分離。將修飾的SPU-2-A7的基因文庫插入表達載體pET20B(-)(Novagen，參見實施例1)以生產對應蛋白。
轉化電轉感受態E.coli例如Nova-Blue或BL-21細胞後，獲得表達質粒形式的、含所得每個文庫中一個克隆遺傳信息的單菌落。用96個這些單菌落每個接種300μl2xYT/amp/kan並在37℃和220rpm下振蕩過夜。用100μl每種所述培養物接種96×4ml 2xYT/amp/kan並在37℃和220rpm下培養，直至細胞密度達到OD600＝0.5。為此目的，每種情況使用4個24孔培養板(Qiagen)。加入1mM/Lα-D-異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導外來基因表達後，繼續在37℃和180rpm下振蕩3小時，或30℃和180rpm過夜。然後離心沉澱細胞(30分鐘，4,000g，4℃)，棄上清液。用物理裂解(迅速凍融)或化學裂解(去汙劑)以及加入溶菌酶(200μg/ml)和benzonase(最終體積中10U/ml)的方法進行細胞破碎。通過使用Qiagen的BioRobot 9600Kit或者手工操作的真空工段(vacuum station)(QIAvac 96，Qiagen)從所得細胞總蛋白中純化SPU-2-A7的變體。在與實施例7中實驗方法對應的ELISA實驗中以定性方式分析所得蛋白質溶液與FcIgM的結合。
為分別驗證這些基因的功能性或分析所得替換，對在ELISA中顯示較強結合信號的SPU-2-A7的變體進行DNA測序。以重組方式在1.5L規模製備有前景的候選物，並用融合到羧基端的六組氨酸肽經固定化金屬螯合親和層析純化。為定量親和力，如實施例7所述進行不依賴於濃度的ELISA，與已進行成熟的泛素變體SPU-2-A7相比較。從這種ELISA實驗中獲得的泛素變體SPU-2-A7以及SPU-2-A7(62/63)的結合曲線示例性表示於圖9。由於KD＝1.0μM，這種親和成熟的變體表現出與SP-2-A7相比提高10倍的結合強度。
實施例9用雙-馬來醯亞胺試劑經單個羧端半胱氨酸殘基定點偶聯兩個相同的基於泛素的蛋白質用雙-馬來醯亞胺己烷(BMH，Pierce)經特意為此目的引入的半胱氨酸殘基連接兩個相同的泛素變體。首先，為此目的在讀碼框3』端，即在六組氨酸肽之後的蛋白羧基端，在脯氨酸之前引入半胱氨酸的適當密碼子。這樣，最後的脯氨酸應該保護所得蛋白在生產和純化期間免受蛋白水解性降解。根據製造商說明使用Quick ChangeTMSite-directed Mutagenesis試劑盒(Stratagene)並使用寡聚脫氧核苷酸Seq ID No.27和Seq ID No.28以及作為模板的泛素變體基因(Seq ID No.15)將相應鹼基對插入pET20B(-)中。通過DNA測序分析所得克隆，具有攜帶預期插入物的表達質粒的菌落根據實施例6用於重組生產和純化。
純化蛋白用含1mM EDTA和5mMβ-巰基乙醇的PBS透析，並在PBS、1mMEDTA用作反應緩衝液的以下偶聯反應中以約1mg/ml濃度使用。為此目的，首先將蛋白質溶液調節到100mM二硫蘇糖醇(DTT)並在室溫保溫1小時從而還原游離的半胱氨酸殘基。此後，用PD10Sephadex G-25M柱(Amersham Biosciences)分離還原劑，這被加入兩倍摩爾過量的偶聯劑(貯液100mM BMH的DMSO溶液)並在室溫保溫1小時。再用PD10柱分離過量BMH。為僅分離可能存在的單反應的偶聯劑，等摩爾量的新鮮還原蛋白再次加入由此獲得的偶聯樣品中。這個第二次偶聯步驟在室溫下進行2小時。
通過SDS-PAGE(圖10)分析由此方法獲得的偶聯樣品並估算偶聯度。對於上述方法，其約為40％。
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序列表110塞爾蛋白質股份有限公司120基於泛素蛋白的人工結合蛋白的生產130P17437150DE 103 24 447.61512003-05-2316034170PatentIn version 3.12101211291212DNA213人工序列220
223編碼修飾泛素蛋白骨架的DNA序列4001atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60atggccatgc aaatcttcgt taaaaccctg acgggaaaga ctatcaccct ggaggtagaa 120ccgtccgaca ccatcgaaaa tgtcaaagct aaaatccaag acaaagaagg aattccacct 180gaccagcaac gcctagcttt cgcaggacga caactagagg acgggctcac cctgtctgac 240tacaacatcc aaaaagaatc caccctccac ctggcactcc tcctgcgggc c 291210221150212DNA213人工序列220
223模板4002atgcaaatct tcgttaaaac cctgacggga aagactatca ccctggaggt 50210321153212DNA213人工序列220
223模板4003
ggattttagc tttgacattt tcgatggtgt cggacggttc tacctccagg gtg 53210421153212DNA213人工序列220
223模板4004gtcaaagcta aaatccaaga caaagaagga attccacctg accagcaacg cct 53210521150212DNA213人工序列220
223模板4005gggtgagccc gtcctctagt tgt cgtcctg cgaaagctag gcgttgctgg50210621150212DNA213
220
223
4006gacgggctca ccctgtctga ctacaacatc caaaaagaat ccaccctcca 50210721139212DNA213人工序列220
223模板4007gagtgctcgc agcaggagtg ccaggtggag ggtggattc 39210821122212DNA213人工序列220
223引物4008gatatacata tgcaaatctt cg 22210921118212DNA213人工序列220
223引物4009gtggtgctcg agtgctcg 182101021155212DNA213人工序列220
223引物220
221misc_特徵222(20)..(21)223a，g，c或t220
221misc_特徵222(26)..(27)223a，g，c或t220
221misc_特徵222(32)..(33)223a，g，c或t40010ccagccggcc atggccatgn nkatcnnkgt tnnkaccctg acgggaaaga ctatc 552101121155212DNA213人工序列220
223引物220
221misc_特徵222(23)..(24)223a，g，c或t220
221misc_特徵222(29)..(30)223a，g，c或t220
221misc_特徵222(32)..(33)223a，g，c或t220
221misc_特徵222(35)..(36)223a，g，c或t220
221misc_特徵222(26)..(27)223a，g，c或t40011caggaggagt gccaggtgga gmnnmnnmnn mnnmnngatg ttgtagtcag acagg 552101221134212DNA213人工序列220
223引物40012gttattactc gcggcccagc cggccatggc catg 342101321148212DNA213人工序列220
223引物40013gagtttttgt tcggcctcga gggcccgcag gaggagtgcc aggtggag 48
2101421123212DNA213人工序列220
223引物40014accactccct atcagtgata gag 2321015211228212DNA213人工序列220
223作為文庫基礎的修飾泛素序列40015atgcagatct tcgtgaagac cctgaccggc aagaccatca ctctggaggt ggagcccagt60gacaccatcg aaaatgtgaa ggccaagatc caagataaag aaggcattcc ccccgaccag120cagaggctca tctgggcagg caagcagctg gaagatggcc gcactctttc tgactacaac180atccagaaag agtcgaccct gcacctggtc ctccgcctga ggggcggc 2282101621154212DNA213人工序列220
223引物220
221misc_特徵222(19)..(20)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(25)..(26)223a，c，g或t220
220misc_特徵222(31)..(32)223a，c，g或t40016
gaaggagata tacatatgnn katcnnkgtt nnkaccctga cgggaaagac tatc542101721155212DNA213人工序列220
223引物220
221misc_特徵222(23)..(24)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(26)..(27)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(29)..(30)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(32)..(33)223a，c，g 或t220
221misc_特徵222(35)..(36)223a，c，g或t40017caggaggagt gccaggtgga gmnnmnnmnn mnnmnngatg ttgtagtcag acagg 552101821154212DNA213人工序列220
223引物220
221misc_特徵222(19)..(20)223a，c，g或t
220
221misc_特徵222(25)..(26)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(31)..(32)223a，c，g或t40018gaaggagata tacatatgnn katcnnkgtt nnkaccctga ccggcaagac catc 542101921161212DNA213人工序列220
223引物220
221misc_特徵222(23)..(24)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(26)..(27)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(29)..(30)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(32)..(33)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(35)..(36)223a，c，g或t40019
caggaggagt gccaggtgga gmnnmnnmnn mnnmnngatg ttgtagtcag aaagagtgcg60g612102021133212DNA213人工序列220
223引物40020caccaccacc accaccaccc tcctgtcaat gct 332102121135212DNA213人工序列220
223引物40021ggcccacccg tgaaggtgag cctcagtagc gacag 352102221145212DNA213人工序列220
223引物40022ctggcactcc tcctgcgggc cctcgagcac caccaccacc accac 452102321163212DNA213人工序列220
223引物40023agaccacaac ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacat60atg 632102421142
212DNA213人工序列220
223引物40024atacgaaatt aatacgactc actataggga gacccacaac gg422102521155212DNA213人工序列220
223引物220
221misc_特徵222(32)..(33)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(35)..(36)223a，c，g或t40025caggaggagt gccaggtgga gattcctacc mnnmnngatg ttgtagtcag acagg 552102621155212DNA213人工序列220
223引物220
221misc_特徵222(26)..(27)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(29)..(30)223a，c，g或t40026caggaggagt gccaggtgga gattmnnmnn cggcgggatg ttgtagtcag acagg55
2102721155212DNA213人工序列220
223寡聚脫氧核苷酸40027ctcgagcacc accaccacca ccactgtccg tgagatccgg ctgctaacaa agccc 552102821155212DNA213人工序列220
223寡聚脫氧核苷酸40028gggctttgtt agcagccgga tctcacggac agtggtggtg gtggtggtgc tcgag 552102921134212DNA213人工序列220
223泛素變體文庫的構建40029gttattactc gcggcccagc cggccatggc catg 342103021155212DNA213人工序列220
223泛素變體文庫的構建220
221misc_特徵222(20)..(21)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(26)..(27)223a，c，g或t
220
221misc_特徵222(32)..(33)223a，c，g或t40030ccagccggcc atggccatgn nkatcnnkgt tnnkaccctg acgggaaaga ctatc 5521031211114212PRT213人工序列220
223泛素變體文庫的構建220
221MISC_特徵222(24)..(24)223任何胺基酸220
221MISC_特徵222(26)..(26)223任何胺基酸220
221MISC_特徵222(28)..(28)223任何胺基酸220
221MISC_特徵222(84)..(88)223任何胺基酸40031Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Xaa Ile Xaa Val Xaa Thr Leu Thr Gly20 25 30Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val35 40 45Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg
50 55 60Leu Ala Phe Ala Gly Arg Gln Leu Glu Asp Gly Leu Thr Leu Ser Asp65 70 75 80Tyr Asn Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu His Leu Ala Leu Leu Leu Arg85 90 95Ala Leu Glu Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asn Leu Tyr Phe100 105 110Gln Gly21032211345212DNA213人工序列220
223泛素變體文庫的構建40032atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc60atggccatgc aaatcttcgt taaaaccctg acgggaaaga ctatcaccct ggaggtagaa120ccgtccgaca ccatcgaaaa tgtcaaagct aaaatccaag acaaagaagg aattccacct180gaccagcaac gcctagcttt cgcaggacga caactagagg acgggctcac cctgtctgac240tacaacatcc aaaaagaatc caccctccac ctggcactcc tcctgcgggc cctcgaggcc300gaacaaaaac tcatctcaga agagaatctg tatttccagg gctag3452103321151212DNA213人工序列220
223泛素變體文庫的構建220
221misc_特徵222(16)..(17)223a，c，g或t220
221misc_特徵
222(19)..(20)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(22)..(23)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(25)..(26)223a，c，g或t220
221misc_特徵222(28)..(29)223a，c，g或t40033agactgatgt tgtagnnmnn mnnmnnmnnm gaggtggacc gtgaggagga c512103421148212DNA213人工序列220
223泛素變體文庫的構建40034gaggtggacc gtgaggagga cgcccgggag ctccggcttg tttttgag 48
權利要求
1.一種蛋白質，選自「泛素樣蛋白」蛋白超家族的蛋白質、具有泛素樣摺疊基序的蛋白質及具有泛素樣摺疊基序的其片段或其融合蛋白，其中由於所述蛋白質的至少一個表面暴露區域中的一個或多個胺基酸修飾，所述表面暴露區域包括β片層區域的至少一個β片層鏈和任選的非β片層區域，所述蛋白質顯示與預定結合伴侶的之前不存在的結合親和力，同時保留泛素樣摺疊基序。
2.根據權利要求1的蛋白質，其中選用於修飾的蛋白質與人泛素具有至少30％的胺基酸序列一致性、具有泛素樣摺疊基序和/或屬於「泛素相關蛋白」蛋白家族。
3.根據權利要求1或2的蛋白質，其中選用於修飾的蛋白質具有泛素樣摺疊基序並優選自SUMO-1、FAU、NEDD-8、UBL-1、Rubl、APG8、ISG15、URM1、HUB1、GDX、Elongin B、PLIC2(N端結構域)、人Parkin(N端結構域)。
4.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中所述蛋白質是人泛素或另一種哺乳動物泛素。
5.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中所述修飾包含蛋白質表面上5-10個胺基酸、優選6-8個胺基酸的連續區域，其中優選其2-4個胺基酸位於表面暴露的β片層。
6.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中第一和第四個β片層鏈在表面暴露的胺基酸上被修飾，任選的另外在哺乳動物泛素中非β片層區域的62-65位胺基酸區域修飾。
7.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中所述修飾是至少部分位於一級序列的直接臨近或非直接臨近的胺基酸上的替換、插入、缺失、化學修飾或其組合，並包含一個或多個胺基酸，優選替換，其中優選的是，一級序列中不臨近的修飾胺基酸在二級結構中形成對所述結合伴侶的優選連續結合區域。
8.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中一級序列中直接臨近的胺基酸的修飾，優選替換的數目是2-8個直接臨近胺基酸，進一步優選3-7個或4-6個或2-4個直接臨近的胺基酸。
9.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中在一級序列中互相直接臨近的修飾胺基酸的一部分位於β片層鏈的起始或末端區域，其中這部分長度是兩個或多個胺基酸，優選兩個或三個胺基酸。
10.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中在一級序列中互相直接臨近的5個或更多個胺基酸被修飾，優選替換，其中一個、兩個或更多個，優選兩個或三個直接臨近的胺基酸形成β片層鏈區域的起始或末端。
11.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中對那些胺基酸進行修飾形成所述蛋白質表面上的連續區域。
12.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中被修飾的那些位置的胺基酸不屬於根據權利要求1的野生型蛋白質中參與結合泛素的天然結合伴侶的區域。
13.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中在所述蛋白質，優選泛素的β鏈上存在的至少25％胺基酸被修飾。
14.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中胺基酸修飾還在所述蛋白質的環區域進行。
15.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中所述蛋白質是人泛素或其同源蛋白，並且其中泛素的至少8個表面暴露的胺基酸被修飾，優選替換，使得這些修飾胺基酸包含與所述結合伴侶具有結合親和力的區域。
16.根據權利要求15的蛋白質，其中所述8個表面暴露胺基酸中的至少6個位於所述蛋白質上確定為β片層區域的區域。
17.根據權利要求15或16的蛋白質，其中所述修飾的，優選替換的胺基酸中至少5個在一級序列上互相直接臨近。
18.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中被修飾胺基酸位於所述蛋白質的氨基端β片層鏈和/或位於羧基端β片層鏈。
19.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中另外被修飾胺基酸位於羧基端β片層鏈後的環中。
20.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中所述修飾蛋白是在位置2、4、6、62、63、64、65和66被替換、缺失、插入和/或化學修飾的人泛素，其中優選替換。
21.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中選用於修飾的蛋白質已經具有插入、缺失、替換和/化學修飾，使得所述蛋白質的生物學和/或蛋白質化學功能已經被消除或新產生。
22.根據權利要求21的蛋白質，其中在修飾後的蛋白質中泛素的總共至少10個、優選至少15個胺基酸已經被替換。
23.根據權利要求21或22的蛋白質，其中選用於經替換、插入和/或缺失而改變的蛋白質是在一個或多個下述位置44、48、54、70、72、75被替換並且76位胺基酸缺失的人泛素，所述泛素大體上不再顯示與其天然結合伴侶的相互作用。
24.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中所述蛋白質是45位苯丙氨酸替換成色氨酸的人泛素。
25.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中經隨機誘變對選定胺基酸進行了隨機替換。
26.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中所述結合伴侶是抗原或半抗原。
27.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中以KD表示的、與預定結合伴侶的結合親和力是10-6M-10-12M，更優選10-8M-10-12M或10-9M-10-12M。
28.一種蛋白質，選自「泛素樣蛋白」蛋白超家族的蛋白質、具有泛素樣摺疊基序的蛋白質及具有泛素樣摺疊基序的其片段或其融合蛋白，其中由於一個或多個修飾，所述蛋白質顯示與預定結合伴侶的之前不存在的結合親和力，同時保留泛素樣摺疊基序，這種蛋白質可以通過以下方法獲得a)選擇待修飾蛋白質；b)確定結合伴侶；c)選擇該蛋白質表面暴露區域的胺基酸，其中所述表面暴露區域包括β片層區域的至少一個β片層鏈和任選的非β片層區域；d)優選經替換、插入、缺失和/或化學修飾來修飾所選胺基酸，同時保留泛素樣摺疊基序；e)使修飾後蛋白質與步驟b)中確定的結合伴侶接觸；f)檢測與步驟b)中預定的結合伴侶有結合親和力的蛋白質。
29.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質，其中所述蛋白質以位點特異性和共價方式連接到相同或不同特異性的蛋白質上並因而分別顯示雙價或雙特異性結合特性。
30.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質的製備方法，所述蛋白質選自「泛素樣蛋白」蛋白超家族的蛋白質、具有泛素樣摺疊基序的蛋白質及具有泛素樣摺疊基序的其片段或其融合蛋白，其中由於在所述蛋白質的至少一個表面暴露區域中的一個或多個修飾，所述區域包括β片層區域的至少一個β片層鏈和任選的非β片層區域，所述蛋白質顯示與預定結合伴侶的之前不存在的結合親和力，同時保留泛素樣摺疊基序，該方法包括以下步驟a)選擇待修飾蛋白質；b)確定結合伴侶；c)選擇該蛋白質表面暴露區域的胺基酸，其中所述表面暴露區域包括β片層區域的至少一個β片層鏈和任選的非β片層區域；d)經替換、插入、缺失和/或化學修飾來修飾所選胺基酸，同時保留泛素樣摺疊基序；e)使修飾後蛋白質與步驟b)中確定的結合伴侶接觸；f)檢測與步驟b)中預定的結合伴侶有結合親和力的蛋白質。
31.根據權利要求30的方法，其中通過化學合成修飾蛋白而進行步驟c)到d)。
32.根據權利要求31的方法，其中步驟d)的修飾通過如下方法進行通過基因工程改變屬於對應修飾蛋白的DNA，並在原核或真核宿主生物體中或體外表達所述蛋白質。
33.根據權利要求30的方法，其中在步驟d)中建立基因文庫。
34.根據前述權利要求中一項或多項的方法，其中在步驟d)中經隨機誘變進行對選定胺基酸的隨機替換。
35.根據前述權利要求中一項或多項的方法，其中在步驟e)中通過合適的選擇方法進行與預定結合伴侶的接觸，所述合適選擇方法優選噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示、CIS展示或細胞表面展示方法、酵母表面展示、細菌表面展示，特別優選噬菌體展示方法。
36.根據前述權利要求中一項或多項的方法，其中在步驟f)中通過一種或多種以下方法檢測與預定結合伴侶具有結合親和力的蛋白質ELISA、等離子體表面共振光譜、螢光光譜、FACS、等溫滴定量熱法或分析超離心。
37.根據前述權利要求中一項或多項的方法，其中在步驟f)後是分離和/或富集與預定結合伴侶具有結合親和力的檢測蛋白質的步驟。
38.根據前述權利要求中一項或多項的方法，其中針對所述蛋白質的結合親和力、結合特異性和/或其它蛋白質化學特性如穩定性、溶解性或產率，所述蛋白質用原本已知的方法成熟。
39.根據前述權利要求中一項或多項的方法，其中所述蛋白質以位點特異性和共價方式連接到相同或不同特異性的蛋白質上並因而獲得雙價或雙特異性蛋白質。
40.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質用於檢測、定量測定、分離和/或提取對應結合伴侶的用途，其中使用原本已知的方法，如層析或吸附技術。
41.根據前述權利要求中一項或多項的蛋白質的用於診斷、預防和治療疾病的用途，所述疾病中對應結合蛋白直接或間接參與。
全文摘要
本發明涉及修飾的「泛素樣蛋白」超家族的蛋白質、具有泛素樣摺疊的蛋白質及其片段或融合蛋白。作為所述修飾的結果，所述蛋白質對預定的結合伴侶具有之前並不存在的結合親和力。本發明也涉及生產和使用所述蛋白質的方法。
文檔編號C12N15/09GK1956996SQ200480014610
公開日2007年5月2日 申請日期2004年5月27日 優先權日2003年5月28日
發明者馬庫斯·菲德勒, 烏爾麗克·菲德勒, 雷納·魯道夫 申請人:塞爾蛋白質股份有限公司