用於刺激哺乳動物對病原體的先天免疫抵抗力的組合物的製作方法

2023-05-20 16:16:16

專利名稱：用於刺激哺乳動物對病原體的先天免疫抵抗力的組合物的製作方法
用於刺激哺乳動物對病原體的先天免疫抵抗力的組合物本申請要求2009年3月25日提交的美國臨時專利申請序列號61/163，137和2009 年5月18日提交的美國臨時專利申請序列號61/179，246的優先權，它們均以援引方式整體併入本文。
背景技術：
I.發明領域本發明一般地涉及微生物學、免疫學和抗微生物藥物治療學領域。具體而言，本發明的組合物和方法涉及使用小分子組合物調節個體肺中的先天免疫，以用於治療或減輕微生物感染或侵入。II.
背景技術：
肺對感染的易感性來自於空氣交換的結構要求。為了支持換氣，人持續地將IOOm2 肺表面積暴露於外界環境。肺不僅暴露於空氣，還暴露於其中所懸浮的顆粒、小液滴和病原體中。與包裹在不通透皮膚中的皮膚表面或具有厚吸附粘液層的胃腸道不同，肺呈現出具有極小屏障防禦的大環境界面。無妨礙氣體擴散的需求將更大的屏障排除在外。儘管其結構脆弱，但肺一般能通過多種機械、體液和細胞機製成功地防禦感染(Knowles 等，2002 ;Martin 和 Frevert，2005 ;Rogan，^,2006 ；Travis,等，2001); (Mizgerd,2008 ；Bals 禾口 Hiemstra，2004 ；Bartlett 等，2008 ；Hiemstra, 2007 ；Hippenstiel 等，2006 ；Schutte和McCray，2002)。大多數被吸入的微生物病原體由於嵌入到氣道壁中而不能穿透至肺泡，它們由於粘液而滯留在氣道壁，然後通過粘液纖毛升降機系統 (mucociliary escalator system)排出(Knowles 等，2002)。對於逃脫該命運的那些病原體，氣道內壁流體中抗微生物肽的組成型存在限制了它們的生長(Rogan，等，2006; Travis，等，2001)。位於空氣腔最遠端的肺泡巨噬細胞能夠攝取這些生物體，由此清理肺以防止可能的感染。儘管經常被認為是被動氣體交換的屏障，但氣道和肺泡上皮在遇到病原體刺激時通過發生重大的局部結構和功能改變而為基礎肺部防禦提供補充。應答於病毒、真菌或變應性炎症，氣道分泌細胞迅速提高其高度並在其頂端細胞質中充入分泌性顆粒，該過程稱為炎性化生(inflammatory metaplasia) (Evans 等，2004 ;Williams 等，2006)。在病原體存在下，肺泡上皮激活其質膜系統和分泌機器，由此使白細胞參與肺部保護(Evans 等，2005)。可能最重要的是，與呼吸道上皮模式識別受體的微生物相互作用使得許多微生物產物表達在氣道內壁流體中，包括防禦素、cathelicidins、溶菌酶和活性氧簇(Rogan 等，2006 ；Forteza 等，2005 ；Akinbi 等，2000 ；Bals 和 Hiemstra, 2004 ；Bals 和 Hiemstra, 2006)。應注意的是，肺炎(細菌性的或病毒性的)是全世界範圍內的感染致死的首要原因。存在對抑制和/或治療微生物感染的其他方法和組合物的需要。發明概述本發明提供刺激先天抵抗力(受激先天抵抗力(Stimulated Innate Resistance, StIR))的組合物和使用此類組合物刺激乂頂的方法。在某些實施方案中，乂頂是肺的 i5 R。本發明的一方面提供更高的治療/毒性比值或指數。本發明的一些實施方案包括用於增強哺乳動物(例如人)受試者對感染的生物防禦(例如受試者對感染的免疫力)的組合物、製劑和方法。在某些方面，本發明的組合物以有效量沉積在個體的肺中。本發明的一些方面提供針對微生物感染快速且暫時性的生物防禦增強或放大。受試者免疫力的增強減輕了微生物感染。減輕可以是通過對感染或微生物生長或存活的抑制、治療或預防來實現的。本發明的一些方面增強了受試者肺和呼吸道的防禦。在某些方面，考慮在患有微生物感染或具有發生該感染之風險的個體中治療、抑制或減輕微生物感染的方法，所述方法包括施用有效量的乂頂組合物，所述組合物包含一種或多種先天性受體(innate receptor)的一種或多種配體。已經鑑定了許多先天性受體，其包括但不限於Toll樣受體(TLR)、C型凝集素受體(CLR)和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(Nod樣受體或NLR)。TLR是在先天免疫系統中起關鍵作用的一類蛋白質。它們是單次跨膜的非催化性受體，其識別來自微生物的結構上保守的分子。一旦這些微生物存在於皮膚或腸道、肺和泌尿生殖道黏膜上或存在於其中，它們即被TLR識別，激活免疫細胞應答。有趣的是，當單獨施用時，許多這些TLR激動劑不誘導顯著的乂頂。通常，使用本文所述方法治療的個體或受試者已經接觸病原性微生物或具有這種接觸的風險。某些實施方案涉及能夠向呼吸道施用的組合物，以及使用這些組合物的方法，所述組合物包含1、2、3、4種或更多種TLR激動劑。所述TLR激動劑選自TLR2/1、TLR2/6、TLR3、 TLR4、TLR5、TLR9或TLR7激動劑。在某些方面，所述TLR激動劑選自TLR9和TLR2/6激動劑。在另一方面，所述TLR激動劑選自TLR5激動劑。在又一方面，TLR5激動劑可與TLR2/6、 TLR4、TLR9或TLR7激動劑組合使用。在某些方面，TLR9激動劑可與TLR2/6、TLR4、TLR5或 TLR7組合使用。在另一方面，TLR2/6激動劑可與TLR4、TLR5、TLR9或TLR7激動劑組合使用。在某些方面，TLR4激動劑可與TLR2/6、TLR5、TLR9或TLR7激動劑組合使用。在另一方面，TLR7激動劑可與TLR2/6、TLR4、TLR5或TLR9激動劑組合使用。在又一方面，任何這些兩兩組合可包括選自TLR2/6、TLR4、TLR5、TLR9或TLR7激動劑的第三種或第四種或第五種 TLR激動劑。某些實施方案涉及治療、抑制或減輕微生物感染的方法，其包括向患有微生物感染或者有發生或獲得微生物感染之風險的個體施用有效量的TLR9激動劑和TLR2/6激動劑。在某些方面，所述TLR2/6激動劑是PAM2CSK4。在另一方面，所述TLR9激動劑是C型寡聚脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)。C型ODN可包括但不限於0DN2395或0DNM362 或ODmOlOl或另一 C型ODN或其類似物。在某些方面，受試者已經接觸病原性微生物或有接觸病原性微生物的風險。所述微生物可以是病毒、細菌或真菌。在另一些方面，以噴霧製劑施用所述TLR9激動劑和TLR2/6激動劑。以約0. 1、1、 5、10、50μ g或mg/kg至約5、10、50、100μ g或mg/kg個體體重(包括其間的所有數值和範圍)的量施用所述TLR9激動劑和/或TLR2/6激動劑。某些實施方案涉及可藥用組合物，其包含TLR9激動劑和TLR2/6激動劑、抗炎劑和一種或多種藥物賦型劑，其中所述組合物是無菌的並基本上不含病原性微生物。在某些方面，所述TLR2/6激動劑是PAM2CSK4。在另一方面，所述TLR9激動劑是C型寡聚脫氧核苷酸 (ODN)。C 型 ODN 可包括但不限於 0DN2395 或 0DNM362 或 ODWO101。在某些方面，所述乂頂組合物包含鞭毛蛋白多肽或其區段或衍生物，所述鞭毛蛋白多肽包含稱為 TLR5 激動劑的肽 QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA(SEQ ID NO 2)的 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個連續胺基酸。本發明的多肽也可包含與SEQ ID NO: 2具有至少70、80或90% (包括其間所有值和範圍)同一性的胺基酸序列。在另一些方面， 鞭毛蛋白是合成的和/或純化的或分離的鞭毛蛋白多肽或肽。術語「純化的，，或「分離的，， 表示該組分是之前從其他蛋白質或合成反應物或副產物中分離或純化的，並且所述組分在配製到組合物中之前的純度為至少約95%。在某些實施方案中，所述純化或分離的組分的純度約為或至少約為80、95、96、97、98、99、99· 1,99. 2,99. 3,99. 4,99. 5%或更高，或其中可導出的任何範圍。然後可將這種純化的組分與其他組分混和，以形成本文所述的組合物。重組鞭毛蛋白或其片段或區段包含SEQ ID N0:2或其他鞭毛蛋白多肽的5、10、 15、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、 300、350或400個連續胺基酸，包括其間所有值和範圍。這些片段或區段與SEQ ID N0:2或其他鞭毛蛋白多肽具有至少、至多或約70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%的同一性。在某些方面，鞭毛蛋白多肽或區段與SEQ ID NO :2的序列具有至少75%的同一性。在另一方面，鞭毛蛋白多肽或區段與SEQ ID NO :2的序列具有至少80%的同一性。在另一方面， 鞭毛蛋白多肽或區段與SEQ ID NO :2的序列具有至少85%的同一性。在另一方面，鞭毛蛋白多肽或區段與SEQ ID NO :2的序列具有至少90%的同一性。在另一方面，鞭毛蛋白多肽或區段與SEQ ID NO :2的序列具有至少95%的同一性。鞭毛蛋白或其區段的衍生物或變體包括對SEQ ID NO :2的插入、缺失和點突變。一種特定的插入突變是融合蛋白，其在羧基端或氨基端包含對鞭毛蛋白而言是外源的胺基酸序列。許多鞭毛蛋白為本領域所知，包括但不限於以下登錄號的鞭毛蛋白 BAB58984(gi 114278896) ； YP_001330159 (gi 1150402865)； YP_001323483 (giI 150399716) ；CAA28975 (gi|1333716) ；CAA02137 (gi|1567895)； CAA67105 (giI 1580779) ；AAR10473 (gi|38049688) ；CAR58992 (gi|197093531)； YP_001217666(gi1147675484) ；CAL12564(gi1122089712) ；BAD14977(gi|46093563)；或 CAD05707 (gi 116503200)，均以援引方式將其在本申請優先權日期時的內容整體併入本文。本發明的一些實施方案可通過呼吸道施用。本發明的方法包括通過吸入或其他給藥方法向上呼吸道和/或下呼吸道施用組合物。在某些方面，通過吸入進行施用。在某些方面，所述^頂組合物在噴霧劑或氣霧劑中施用。在另一方面，所述組合物是氣霧化的或噴霧化的，或是可以被吸入或滴入受試者中的形式。所述組合物可通過吸入或吸氣施用。 可以約 0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70μ g 或 mg/kg 至約55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、20(^8或11^/1^個體體重的量施用所述乂頂組合物，包括單獨的或凝集的TLR激動劑。在另一些方面，可向受試者施用約0.01、 0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、 125、150、200 μ g或mg的或每種TLR激動劑或全部TLR激動劑。所述受試者可以是有接觸吸入的病毒、細菌或真菌的風險，或者已經接觸吸入的病毒、細菌或真菌。又一實施方案包括這樣的方法，其中在接觸或疑似接觸生物體或者接觸生物體的風險提高之前；之後； 過程中；之前和之後；之前和過程中；過程中和之後；之前、之後和過程中施用所述組合物。 所述受試者可接觸生物武器或條件性病原體。在一些特定方面中，受試者是免疫受損的，如癌症患者或AIDS患者。在又一實施方案中，本發明涉及可藥用組合物，其包含一種或多種TLR激動劑；抗炎劑；抗微生物劑；和/或一種或多種藥物賦型劑。通常，此類組合物是無菌的，並且基本上不含病原性微生物。在某些方面，所治療的或針對其進行保護的病原性或潛在病原性微生物是病毒、 細菌和/或真菌。在某些方面，微生物是病毒。病毒可來自腺病毒科(Adenoviridae)、 冠狀病毒禾鬥(Coronaviridae)、絲狀病毒禾鬥(Filoviridae)、黃病毒禾鬥(Flaviviridae) > 嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、皰疹病毒科(Herpesviridae)、正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)、苜1J粘病毒禾鬥(Paramyxovirinae)、月市病毒亞禾鬥(Pneumovirinae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、痘病毒科(Poxyiridae)、逆轉錄病毒科(Retroviridae) 或披膜病毒科(Togaviridae)的病毒；和/或副流感病毒(Parainfluenza)、流感病毒 (Influenza)、H5N1、馬爾堡病毒(Marburg)、伊波拉病毒(Ebola)、嚴重急性呼吸器官症候群冠狀病毒、黃熱病病毒、人呼吸道合胞體病毒、漢坦病毒(Hantavirus)或痘苗病毒。在又一方面，所治療的或針對其進行保護的病原性或潛在病原微生物是細菌。細菌可以是胞內細菌、革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌。在另一方面，所述細菌包括但不限於葡萄球菌Staphylococcus)、芽孢桿菌(Bacillus)、弗朗西絲氏菌(Francisella)或耶爾森氏菌(Yersinia)。在又一方面，所述細菌是炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)、綠膿 Iix-^-Ifilii (Pseudomonas aerugenosa) S^iiJtfe^I^1 (Staphylococcus aureas)。 某些實施方案中，細菌是炭疽芽孢桿菌和/或金黃色葡萄球菌。在又一方面，所述細菌是藥物抗性菌,如多藥物抗性金黃色葡萄球菌(multiple drug resistant Staphylococcus aureas，MRSA)。代表性的醫學相關性革蘭氏陰性菌包括流感嗜血桿菌(HemophiIus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺性軍團病桿菌(Legionella pneumophila)、綠膿假單胞菌、大腸桿菌(Escherichia col i)、奇異變形菌(Proteus mirabilis) >lif (Enterobacter cloacae) ^f^M^Wlii (Serratia marcescens) > 幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)和傷寒沙門菌(Salmonella typhi)。代表性革蘭氏陽性菌包括但不限於芽孢桿菌、李斯特菌(Listeria)、葡萄球菌、鏈球菌(Streptococcus)、腸球菌(Enterococcus)、放線菌(Actinobacteria)和梭菌(Clostridium)、缺少細胞壁並且不能革蘭氏染色的支原體 (Mycoplasma)，包括來自這些形式的那些細菌。在又一方面，所治療的或針對其進行保護的病原性或潛在病原性微生物是真菌，如麴黴(Aspergillus)、假絲酵母(Candida)、隱球菌(Crytpococus)、組織胞菜菌(Histoplasma)、球孢子菌(Coccidioides)、芽生菌(Blastomyces)、月市囊蟲 (Pneumocystis)或接合菌(Zygomyces)類的成員。在又一其他實施方案中，真菌包括但不限於煙麴黴(Aspergillus fumigatus)、白色假絲酵母(Candida albicans)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、夾膜組織胞菜菌(Histoplasma capsulatum)、粗球抱子菌(Coccidioides immitis)或卡氏月市囊蟲(Pneumocystis carinii)。接合菌類包括娃獎黴目(Basidiobolales)(娃獎黴禾鬥(Basidiobolaceae))、雙珠黴目(Dimargaritales) (雙珠黴禾鬥(Dimargaritaceae))、內囊黴巨(Endogonales)(內囊黴禾鬥(Endogonacea))、 蟲黴目(Entomophthorales)(新月黴禾鬥(Ancylistaceae)、藏黴禾鬥(Completoriaceae)、蟲黴禾鬥(Entomophthoraceae)、頂裂黴禾鬥(Meristacraceae)、新接黴禾鬥(Neozygitaceae))、 梳黴目(Kickxellales)(梳黴科(Kickxellaceae))、被孢黴目(Mortierellales)(被孢霄科(Mortierellaceae))、毛霄菌目(Mucorales)禾口捕蟲菌目(Zoopagales)。曲霄類包括但不限於淺藍灰麴黴(Aspergillus caesiellus)、亮白麴黴(A. candidus)、肉色麴黴(A. carneus)、棒麴黴(A. clavatus)、彎頭麴黴(A. deflectus)、黃麴黴(A. flavus)、 煙麴黴(A. fumigatus)、灰綠麴黴(A. glaucus)、構巢麴黴(A. nidulans)、黑麴黴 (A. niger)、赫麴黴(A. ochraceus)、米麴黴(A. oryzae)、寄生麴黴(A. parasiticus)、 帚狀(A. penicilloides)、局限麴黴(A. restrictus)、醬油麴黴(A. sojae)、薩氏麴黴 (A. sydowi)、Α· tamari、 土麴黴(A. terreus)、焦麴黴(A. ustus)、雜色麴黴(A. versicolor) 等。假絲酵母家族包括但不限於白色假絲酵母、杜氏假絲酵母(C. dubliniensis)、光滑假絲酵母(C. glabrata)、高裡假絲酵母(C. guilliermondii)、乳酒假絲酵母(C. kefyr)、克柔假絲酵母(C. krusei)、葡萄牙假絲酵母(C. Iusitaniae)、C. milleri、C. oleophila、近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)、熱帶假絲酵母(C. tropicalis)、產朊假絲酵母(C. utilis)等。在某些方面，病原菌是胞內細菌、革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌。在某些實施方案中，所述細菌是鏈球菌、葡萄球菌、芽孢桿菌、弗朗西絲氏菌或耶爾森菌。在又一些方面中，所述細菌是炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森氏菌、土拉熱弗朗西絲氏菌、肺炎鏈球菌 (Streptococcus pnemoniae)、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌和/或洋蔥伯克霍爾德菌 (Burkh olderia cepacia)。用於權利要求書和/或說明書時，術語「減輕」、「抑制」、「降低」或「防止」或這些術語的任何變型包括任何可測量的降低或完全抑制，以得到想要的結果，例如接觸後的微生物負荷或生長減少。在權利要求書和/或說明書中與術語「包含」結合使用時，無數量詞修飾的名詞可以指一個/種，但也與「一個/種或多個/種」、「至少一個/種」和「一個/種或多於一個/ 種」的意思一致。本文討論的任何實施方案可用本發明的任何方法或組合物來實施，反之亦然。此外，本發明的組合物和藥盒可用於實現本發明的方法。在本申請中，術語「約」用於表示數值，包括用於測定該值的裝置或方法的誤差的標準差。權利要求中的術語「或」的使用用於表示「和/或」，除非明確地表明僅指備選方案或者備選方案是互斥的，但本公開內容支持僅指備選方案和「和/或」的定義。在包括「和 /或」、「或」或者「和」的某些列舉中，一個或多個所列成員可以明確地從所述列舉中排除在外。如本說明書和權利要求中所用，詞語「包含」、「具有」、「包括」或「含有」是包括式或開放式的，並且不排除其他未提及的要素或方法步驟。本發明的其他目標、特徵和優勢會從以下詳細描述中變得更為明顯。然而應理解， 詳細描述和具體實施例儘管表明了本發明的特定實施方案，但它們僅用於說明目的，因為基於該詳細說明，本發明精神和範圍內的多種改變和修改對本領域技術人員來說是很明顯的。附圖描述以下附圖形成本說明書的一部分，並且為進一步說明本發明的某些方面而包括在內。通過參考這些附圖中的一個或多個並結合本文呈現的對具體實施方案的詳細說明，可以更好地理解本發明。

圖1.天然內毒素(TLR4激動劑)誘導一定的Μ^。在用NTHI溶胞產物(「NTHi sup」)、NTHi溶胞產物中的估計LPS濃度(「內毒素IX」)、認為溶胞產物中LPS的10倍 (「內毒素10x」)處理或不處理對小時後，用肺炎鏈球菌(5X101(lCFU/ml)攻擊野生型 Swiss-Webster 小鼠(10 只 / 組)。圖2.合成的六醯基化脂質A(TLR4激動劑)不誘導MIR。在用綠膿假單胞菌攻擊前M小時，用合成的脂質A懸液或PBS處理野生型Swiss-Webster小鼠(8隻/組)。圖3.顯示了在用綠膿假單胞菌進行感染性攻擊前M小時，用高劑量或低劑量的咪喹莫特(TLR7激動劑)或PBS處理Swiss-Webster小鼠(8隻/組)的代表性實驗。圖4.僅有TLR9刺激時誘導極小的保護。在用吸入的綠膿假單胞菌感染前M小時，用PBS或0DN2395處理野生型Swiss-Webster小鼠(8隻/組)。圖5.利用TLR2/6激動劑進行的高劑量處理誘導了 MIR。在用綠膿假單胞菌感染前M小時，用高劑量或低劑量的Pam2CSK4或PBS處理野生型Swiss-Webster小鼠。圖6. TLR激動劑的組合比任何單獨激動劑誘導更強的乂頂。用0DN2395 (20 μ g/ ml，8隻小鼠)、Pam2CSK4 (20 μ g/ml，8隻小鼠)、兩種激動劑(10隻小鼠)或PBS (10隻小鼠)處理野生型Swiss-Webster小鼠。圖7.合成的鞭毛蛋白片段(TLR5激動劑)誘導。在用綠膿假單胞菌感染前M 小時，將鞭毛蛋白的22個胺基酸高保守性區段或僅有PBS氣霧化到野生型Swiss-Webster 中。圖8.甲型流感病毒/HK肺合併物11-29-05氣霧劑感染對體重的影響一次30分鐘氣霧劑處理；流感病毒劑量 100倍TCID5tl/小鼠。體重開始時隨感染的發展而下降， 反映了疾病的嚴重程度，然後在恢復過程中上升。圖9.甲型流感病毒/HK肺合併物11-29-05氣霧劑感染對存活的影響一次30分鐘氣霧劑處理；流感病毒劑量 100倍TCID5tl/小鼠。圖10.展示了 0DN/PAM2/PolyIC的一次30分鐘氣霧劑預處理對感染甲型流感病毒/HK氣霧劑的小鼠存活的影響；病毒劑量 130倍TCID5tl/小鼠。圖11.甲型流感病毒/HK肺合併物11-29-05氣霧劑感染對體重的影響一次30 分鐘氣霧劑處理；流感病毒劑量 100倍TCID5tl/小鼠。體重開始時隨感染的發展而下降，反映了疾病的嚴重程度，然後在恢復過程中上升。圖12A和12B.細菌溶胞產物誘導的肺炎抵抗力需要的是MyD88 (而不是TRIF)信號轉導。圖12A.在之前M小時用不可分型流感嗜血桿菌(NTHi)的霧化溶胞產物預處理或不進行預處理的情況下，用綠膿假單胞菌吸入攻擊Myd88+和野生型小鼠。左，存活(N = 10隻小鼠/組，γ < 0. 0001)。右，感染後立即出現的肺細菌負荷(右，N = 3隻小鼠/組， **P < 0. 004. fp = 0. 39相對於野生型對照)。圖12B.用細菌溶胞產物預處理或不預處理的情況下，Trif+小鼠的綠膿假單胞菌攻擊。左，存活(N = 10隻小鼠/組Zp < 0. 0001)。 右，感染後立即出現的肺細菌負荷(右，N = 3隻小鼠/組，*ρ < 0. 0001)。圖13.所誘導的病原體殺傷在白細胞介素-1受體缺陷型小鼠中不受損。在用綠膿假單胞菌攻擊前M小時，用氣霧化的PBS或不可分型流感嗜血桿菌(NTHi)處理Illr+和野生型小鼠。所顯示的是感染後立即出現的肺勻漿的細菌負荷。(N = 3隻小鼠/組Zp =0. 001相對於野生型+PBS廣P = 0.01相對於Il lr+，1· P = 0. 66相對於野生型+PBSjp = 0. 89相對於野生型+NTHi)。圖14.用單一合成TLR配體處理後支氣管肺泡灌洗液中的白細胞計數。用PBS 或以下TLR配體之一處理M小時後，對小鼠進行BAL :Pam3CSK4 (TLR2/1激動劑，1 μ g/ml、 3μ g/ml、10y g/ml)、Pam2CSK4 (TLR2/6 激動劑，1 μ g/ml、3 μ g/ml、10 μ g/ml)、Poly (I:C) (TLR3 激動劑，1 μ g/ml、10 μ g/ml、100 μ g/ml)、合成的脂質 A (MPLA，TLR4 激動劑，1μ g/ ml、10yg/ml、100yg/ml)、Flg22(合成的 22-mer 鞭毛蛋白，TLR5 激動劑，10 μ g/ml、 100 μ g/ml、1000 μ g/ml)、咪喹莫特(TLR7 和 TLR8，100 μ g/ml、300 μ g/ml、1000 μ g/ml)或 0DN2395 (TLR9激動劑，2 μ g/ml,20 μ g/ml)。所顯示的是BAL液內的嗜中性粒細胞(黑色條)和巨噬細胞(灰色條)。圖15A-15G.利用單一合成TLR配體進行氣霧化處理不誘導高水平的肺炎抵抗力。 用PBS或以下合成TLR配體處理(8ml噴霧，在20分鐘中施用)之後M小時，利用綠膿假單胞菌攻擊野生型小鼠圖15A. TLR2/1激動劑Pam3CSK4 100 μ g/ml,圖15B. TLR2/6激動劑 Pam2CSK4 10 μ g/ml，圖 15C. TLR3 激動劑 poly (I C) 100 μ g/ml，圖 15D. TLR4 激動劑 MPLA 100 μ g/ml,圖 15E. TLR5 激動劑 Flg22 100 μ g/ml,圖 15F. TLR7 和 TLR8 激動劑咪喹莫特 lmg/ml，或圖15G. TLR9激動劑ODN 2395 20 μ g/ml。存活曲線是處理和未處理小鼠的至少三組不同實驗的代表性實例(N = 8隻小鼠/組，*p = 0.5，**p = 1.0,fp = 0. 47,|p = 0. 2)。圖16A-16C. TLR2/6和TLR9激動劑協作誘導針對細菌性肺炎的抵抗力。圖16A. 左，用PBS、Pam2CSK4 10 μ g/ml,ODN 2395 20 μ g/ml、組合、或雙倍劑量的組合處理後M小時，用綠膿假單胞菌攻擊的小鼠的存活(N = 6隻小鼠/組，^ = 0.008相比於？85)。右， 綠膿假單胞菌感染後立即產生的肺勻漿的細菌負荷(N = 3隻小鼠/組，#p = 0. 045相比於 PBS，##p = 0. 030 相比於 PBS)。圖 16B.左，用 PBS、Pam2CSK4 10 μ g/ml,ODN 2395 20 μ g/ ml、組合或雙倍劑量組合處理後M小時，用肺炎鏈球菌攻擊的小鼠的存活(N = 10隻小鼠 /組，！ ρ < 0. 0001相比於PBS處理)。右，肺炎鏈球菌感染2 X 101°後立即產生的肺勻漿的細菌負荷(N = 3 只小鼠 / 組，卞 ρ < 0. 0014 ρ < 0. 0001)。圖 16C. PBS、Pam2CSK4 10 μ g/ ml、0DN2395 20 μ g/ml或者Pam2CSK4與0DN2395的組合處理後4或M小時，來自小鼠的 BAL細胞計數(N = 3隻小鼠/組，*p = 0. 016相比於PBS，**p < 0. 0001相比於PBS，t ρ = 0. 041相比於僅有Pam2)。圖17A-17F.並非所有的TLR激動劑組合都提供針對肺炎的顯著保護。利用PBS 或以下TLR激動劑組合處理後M小時，用綠膿假單胞菌攻擊野生型小鼠圖17A. Pam2CSK4 和 poly (I C)，圖 17B. Pam2CSK4 和 Flg22，圖 17C. Pam2CSK4 和咪喹莫特，圖 17D. 0DN2395 和 poly (I: C)，圖 17E. 0DN239 和 Flg22，圖 17F. 0DN2395 和 Pam3CSK4。存活曲線是至少三個不同實驗的代表性實例(N = 8隻小鼠/組，*p = 0. 20，**p = 0. 08，tp = 1. 04p = 0. 5)。圖18A-18B. TLR2足以促進保護性Pam2CSK4和0DN2395協同作用，但並不是誘導抵抗力所必需的。圖18A.左，用或不用0DN2395和Pam2CSK4處理後M小時，用綠膿假單胞菌攻擊的Tlr2+和野生型小鼠的存活(N = 8隻小鼠/組，*p < 0. 0002)。右，用綠膿假單胞菌感染後立即出現的肺勻漿的細菌負荷(N = 4隻小鼠/組，**p < 0. 0001相比於野生型+PBS，1"p = 0. 59相比於Tlr2++PBS)。圖18B.左，用或不用不可分型流感嗜血桿菌 (NTHi)的霧化溶胞產物處理後M小時，用綠膿假單胞菌攻擊TLR2+和野生型小鼠的存活 (N = 10隻小鼠/組，*p < 0. 0002)。右，用綠膿假單胞菌感染後立即出現的肺勻漿的細菌負荷(N = 3隻小鼠/組，！ ρ = 0. 03相比於野生型+PBS，#p = 0. 002相比於Tlr2++PBS)。圖19A-19B. C型(而不是A類和B類)與TLR9結合的CpG ODN與Pam2CSK4協同作用，以誘導對細菌性肺炎的抵抗力。圖19A.綠膿假單胞菌攻擊之前對小時，用Pam2CSK4 和0DN2395或者Pam2CSK4和亂序對照ODN處理的野生型小鼠的存活(N = 10隻小鼠/組， *p 0. 05相比於任一單一激動劑)。圖20B. 用0DN2395和Pam2CSK4處理MLE培養基(無細胞)，4小時後用炭疽芽孢桿菌(1000個芽孢)感染並培養(1"ρ = 1.0)。圖20C.用綠膿假單胞菌Q700CFU)感染之前，用0DN2395 和Pam2CSK4處理A549細胞4小時。所顯示的是感染後4小時的細菌CFUfp = 0. 01相比於 PBS，**p = 0. 003 相比於 PBS，***p = 0. 001 相比於 PBS，#p => 0. 05 相比於任一單一激動劑)。圖20D.用0DN2395和Pam2CSK4處理MLE培養基(無細胞)，4小時後用綠膿假單胞菌G000CFU)感染並培養(！ ρ = 0. 58)。圖21.用多種合成的TLR激動劑免疫並用5倍LD50炭疽芽孢桿菌Ames芽孢 (MD-10-013)鼻內攻擊的Swiss-Webster小鼠的存活。如所示，在用炭疽攻擊前M小時，用氣霧化的TLR激動劑預處理小鼠。ALIIS = NTHi細菌溶胞產物，2395 = 0DN2395,10101 = 0DN10101，M362 = 0DN-M362. IX = 40 μ g/ml 的 ODN 和 20 μ g/ml 的 Pam2。圖22.利用0DN/Pam2或NTHi溶胞產物進行氣霧劑預處理對甲型流感病毒/HK感染的小鼠存活的影響。一次30分鐘氣霧劑處理；流感病毒劑量 100倍TCID5tl/小鼠。發明詳述免疫系統是保護生物免受外界生物影響的特化細胞和器官的系統。當免疫系統功能正常時，其保護機體免受微生物感染，並破壞癌細胞和異物。如果免疫系統弱化，其保護機體的能力也弱化，使得病原體能夠在機體內生長。免疫系統經常分成(a)先天免疫，其包含提供直接「第一線」防禦的組分，以持續阻擋病原體，和(b)適應性(獲得性)免疫，其包含抗體的產生和特異地設計用於靶向特定病原體的T細胞的產生或刺激。利用適應性免疫性，身體可在一定時間後產生針對特定病原體的特異性免疫。該應答需要數天才能發生，並對防止首次侵襲無效，但通常會防止任何後續的感染，也幫助清除持續更久的感染。應答於某些炎性刺激，小鼠和人呼吸道上皮的分泌細胞迅速發生顯著的結構變化，稱為炎性化生。大多數結構變化是由於形成凝膠的分泌性粘蛋白的產生增加，同時在粘蛋白分泌、微生物殺傷或炎症信號轉導中起功能的其他大分子也上調。認為該應答的生理功能是加強針對微生物病原體的局部防禦，但該假說接受了的正式測試有限。自相矛盾的是，形成凝膠的粘蛋白的過度產生和分泌是呼吸道常見炎性疾病(如哮喘、囊性纖維化和肺慢性阻塞性疾病(COPD))中氣流堵塞的主要原因。刺激不產生粘蛋白的先天免疫將通過預防和/或治療受試者而提供一種減輕呼吸道感染的其他方法。本發明的一些實施方案包括用包含1、2、3、4種或更多種TLR激動劑(包括其區段或衍生物或類似物)的組合物刺激受試者的氣道。施用本發明組合物的受試者被賦予針對潛在感染生物的治療性、預防性或者治療性和預防性應答。在一些具體方面中，將組合物霧化並通過呼吸道施用。所述組合物用於例如通過激活或增強肺的先天免疫來誘導或以其他方式引發保護作用。本發明的某些方面包括小分子和/或TLR激動劑，其來自不同的微生物，或是人工合成的。通常，所述小分子和/或TLR激動劑不引起分泌性粘蛋白的產生增加。本發明的實施方案可用作針對例如生物武器、新的有毒微生物或條件性微生物的預防性和先行性 (preemptive)治療齊[J。I. StIR 組合物A.異源化合物和部分許多非宿主或異源分子可以刺激、增強或促進免疫應答的產生。這些部分包括多種先天性受體激動劑和/或微生物組分。1.先天性受體配體模式識別受體(或稱為PRR，pattern recognition receptor)(先天性受體)是先天免疫系統的細胞表達的用來識別病原體相關分子模式(或稱為PAMP， pathogen-associated molecular pattern)(其與微生物病原體或細胞脅迫相關)的蛋白質。PAMP包括但不限於細菌碳水化合物(例如，脂多糖或LPS、甘露糖)、核酸(例如，細菌或病毒DNA或RNA)、肽聚糖和脂磷壁酸(來自革蘭氏陽性菌)、N-甲醯甲硫氨酸、脂蛋白、 真菌葡聚糖等。PRR通常根據其配體特異性、功能、定位和/或進化關係進行分類。基於功能，PRR 可分為胞吞PRR或信號轉導PRR。信號轉導PRR包括膜結合Tol 1樣受體和胞質NOD樣受體的大家族。胞吞PRR促進吞噬細胞對微生物的附著、吞食和破壞，但不傳遞胞內信號。這些PRR 識別碳水化合物，並包括巨噬細胞的甘露糖受體、存在於所有吞噬細胞上的葡聚糖受體，以及存在於所有巨噬細胞的識別帶電配體並介導凋亡細胞的清除的清道夫受體(scavenger receptor)0已經鑑定了許多先天性受體，包括但不限於Toll樣受體(TLR)、C型凝集素受體 (CLR)和與核苷酸結合的寡聚化結構域樣受體(Nod樣受體或NLR)。TLR是在先天免疫系統中起關鍵作用的一類蛋白質。它們是單次跨膜的非催化性受體，其識別來自微生物的結構上保守的分子。一旦這些微生物存在於皮膚或腸道黏膜其上或其中，它們即被激活免疫細胞應答的TLR所識別。有趣的是，當單獨施用時，許多這些TLR激動劑不誘導顯著的StIR。 通常，使用本文所述方法治療的個體或受試者已經接觸病原性微生物，或有這種接觸的風險。a. Toll樣受體(TLR)激動劑Toll樣受體(TLR)是最充分表徵的PRRdshii等，2008)。它們是高度保守的跨膜蛋白，由外功能區(ectodomain)(具有用於模式識別的多個富亮氨酸重複)、跨膜α -螺旋和用於胞內信號轉導的Toll/白介素-1受體(TIR)結構域組成。已經鑑定了至少13種哺乳動物TLR，每一種均特異性定位在質膜或內體膜上，並且每一種檢測PAMP中的獨特對應物(Akira等，2006 ；Shi等，2006)。PAMP識別後，通過細胞溶膠IlR銜接蛋白組合的TLR 特異性募集發生信號轉導。與四種其他銜接蛋白中的一個或多個一起，IlR銜接蛋白MyD88 是始自大多數TLR的信號轉導所需的。從TLR3和TLR4觀察到的不依賴MyD88的信號轉導事件需要IlR銜接蛋白TRIF (也稱為TICAM-1)，其有或沒有TRAM的參與(Yamamoto等， 2003)。TLR特異性TIR銜接蛋白信號級聯激活受體特異性轉錄因子如NF-K B，激活蛋白-1 和幹擾素調節因子(IRF)，導致炎性基因和抗微生物基因的表達(Akira等，2006 ；O'Neill, L. Α.，和 Bowie，2007 ；Takeda, K.，和 Akira，2004)。TLR激動劑是發揮激活TLR (例如從而誘導通過TLR信號轉導途徑介導的信號轉導事件)的功能的任何化合物或物質。合適的TLR激動劑包括TLRl激動劑、TLR2激動劑、 TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR5激動劑、TLR6激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑和TLR9激動劑。目前廣泛公認的是，保護性免疫的產生不僅依賴於抗原接觸，還依賴於遇到抗原時的環境。存在許多實例，其中在炎性環境中向宿主中引入新抗原產生免疫耐受而不是長期免疫，而在炎性試劑(佐劑)存在下接觸抗原則誘導免疫(Mondino等，1996 ；Pulendran 等，1998 Jenkins等，1994 ；和Keamey等)。由於這可意味著耐受與免疫之間的差異，所以已經付出大量努力用於發現感染原內存在的「佐劑」，其刺激參與產生抗原呈遞的適當免疫原性環境的分子途徑。目前已知的是，大量佐劑活性是由於微生物和病毒產物與免疫細胞上表達的iToll樣受體(TLR)的不同成員之間的相互作用(Beutler等，2004 ;Kaish0，
2002;Akira等，2003 ；以及Takeda和Akira，2004)。TLR得名於其與果蠅中的分子(稱為 Toll，其在果蠅發育中發揮功能並參與抗微生物免疫)的同源性(Lernaitre等，1996;和 Hashimoto 等，1988)。早期工作顯示，Toll的哺乳動物同源物和Toll途徑分子對先天免疫系統細胞應答微生物攻擊和微生物副產物的能力而言至關重要(Medzhitov等，1997 ；Medzhitov等， 1998 ；Medzhitov等，2000 ；和Janeway等，2002)。自從將LPS鑑定為TLR4激動劑以來 (Poltorak等，1998)，已經描述了許多其他TLR激動劑，如三醯基多類型HPV多肽(TLRl)、 肽聚糖、脂磷壁酸和Pam3Cys (TLR2)、dsRNA (TLM)、鞭毛蛋白(TLR5)、二醯基多類型HPV多肽，如Malp-2(TLR6)，咪唑喹啉和單鏈RNA(TLR7、8)、細菌DNA、非甲基化的CpG DNA序列，甚至是人基因組 DNA 抗體複合體(TLR9) (Takeuchi 等，2001 ；Edwards 等，2002 ；Hayashi 等，
2003；Nagase 等，2003)。如本文所用，術語「激動劑」指可與受體(例如，TLR)組合產生細胞活性的化合物。 激動劑可以是直接結合受體的配體。或者，激動劑可以通過以下與受體間接組合，例如，(a) 與直接結合受體的另一分子形成複合體，或(b)以其他方式導致其他化合物的修飾，使得所述其他化合物直接結合受體。激動劑可以稱為特定TLR的激動劑(例如，TLR7激動劑) 或特定TLR組合的激動劑(例如，TLR 7/8激動劑——TLR 7和TLR 8兩者的激動劑)。在本文可互換使用的術語「CpG-0DN」、「CpG核酸」、「CpG多核苷酸」和「CpG寡核苷酸」指這樣的多核苷酸，其包含至少一個5』 -CG-3』部分，並且在許多實施方案中包含未甲基化的5』 -CG-3』部分。一般而言，CpG核酸是具有至少6個核苷酸鹼基的單鏈或雙鏈DNA 或RNA多核苷酸，其可包含修飾的核苷酸或修飾的核苷序列，或由其組成。在一些實施方案中，CpG核酸的5』 -CG-3』部分是回文核苷酸序列的一部分。在一些實施方案中，CpG核酸的5』 -CG-3』部分是非回文核苷酸序列的一部分。合適的TLR激動劑包括分離的天然TLR激動劑，以及合成的TLR激動劑。從天然的TLR激動劑來源分離的TLR激動劑一般是純化的，例如純化的TLR激動劑的純度為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %或高於99 %。合成的TLR激動劑通過標準方法製備，一般純度為至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、 至少約99%、或高於99%。合適的TLR激動劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR激動劑。合適的TLR激動劑包括共價或非共價附著到另一化合物上的TLR激動劑。在一些實施方案中，TLR激動劑直接附著到另一化合物上。在另一些實施方案中，TLR激動劑通過接頭附著到另一化合物上。TLR激動劑所附著的化合物包括載體、支架、不溶的支持物、微粒、微球等。載體包括治療性多肽；提供更高溶解度的多肽；提高TLR激動劑在生理性介質(例如血清或其他體液)中的半衰期的多肽等。在一些實施方案中，TLR激動劑將直接或通過接頭綴合到另一 TLR激動劑上。在一些實施方案中，TLR激動劑是TLR激動劑的前藥形式。前藥由與活性治療劑共價連接的前藥部分組成。前藥能夠在體內通過其結構的某些化學或酶促修飾轉化成藥物 (活性治療劑)。前藥部分的實例為本領域所熟知，並可見於以下參考文獻中=Biological Approaches to the Controlled Delivery of Drugs，R. L. Juliano, New York Academy of Sciences，(1988) ；Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism Chemistry, Biochemistry,and Enzymology,Bernard Testa,Vch Verlagsgesellschaft Mbh, (2003)； 禾口 Prodrugs Topical and Ocular Drug Delivery, Kenneth Sloan，Marcel Dekker ； (1992)。前藥部分的實例是肽，例如將TLR配體引導到作用位點上的肽，和在其氨基端具有兩個或更多個游離且未偶聯的羧酸的肽。其他示例性可切割前藥部分包括酯基、醚基、醯基、烷基、磷酸基、磺酸基、N氧化物和叔丁氧基羰基。在一些實施方案中，TLR激動劑是單體TLR激動劑。在另一些實施方案中，TLR激動劑是多聚化的，例如TLR激動劑是多聚體的。在一些實施方案中，多聚化的TLR激動劑是同功能的，例如由一種類型的TLR激動劑組成。在另一些實施方案中，多聚化的TLR激動劑是異功能TLR激動劑。在一些實施方案中，TLR配體是嵌合的TLR配體(本文也稱為「異功能」TLR配體)。 在一些實施方案中，嵌合的TLR激動劑包含TLR9激動劑部分和TLR2激動劑部分。以下是異功能TLR激動劑的非限制性實例。在一些實施方案中，嵌合的TLR配體具有以下通式(X) n-(Y) m，其中X是TLRl激動劑、TLR2激動劑、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR5激動劑、TLR6激動劑、TLR7激動劑、TLR8 激動劑和TLR9激動劑，而Y是TLR2激動劑、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR5激動劑、TLR6 激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑和TLR9激動劑，η和m獨立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或更大(包括其間的所有值和範圍)的整數。在某些實施方案中，X或Y是TLR9，並且X或 Y 是 TLR2/6。
TLR2激動劑.TLR2激動劑包括分離的天然TLR2激動劑；和合成的TLR2激動劑。 從天然TLR2激動劑來源分離的TLR2激動劑一般是純化的，例如純化的TLR2激動劑的純度為至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或高於99%。合成 TLR2激動劑通過標準方法製備，純度一般為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約 98%、至少約99%或高於99%。TLR2激動劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR2激動劑。TLR2激動劑包括共價或非共價附著到另一化合物上的TLR2激動劑。在一些實施方案中，TLR2激動劑直接附著到另一化合物上。在另一些實施方案中，TLR2激動劑通過接頭附著到另一化合物上。TLR2激動劑包括合成的三醯基化的和二醯基化的脂肽。TLR2配體的非限制性實例是FSL-I (來自唾液支原體1的合成脂蛋白)、Pam3Cys (三棕櫚醯基-S-甘油基半胱氨酸)或S-[2，3-二(棕櫚醯基氧基)-ORS)_丙基]-N-棕櫚醯-00-半胱氨酸，其中 "Pam3"是「三棕櫚醯基-S-甘油基」)(Aliprantis等，1999)。Pam3Cys的衍生物也是合適的TLR2激動劑，其中衍生物包括但不限於S-[2，3-二(棕櫚醯基氧基)42_R，幻-丙基]-N-棕櫚醯-OO-Cys-O-Ser-(Lys)4-羥基三鹽酸化物；Pam3Cys-Ser-Ser-Asn-Ala ； PaM3Cys-Ser- (Lys) 4 ；Pam3Cys-Ala-GIy ；Pam3Cys-Ser-Gly ；Pam3Cys-Ser ；PaM3Cys-OMe ； Pam3Cys-OH ；PamCAG,棕櫚醯-Cys ((RS) -2，3- 二(棕櫚醯基氧基)-丙基)-Ala-Gly-OH 等。 合適的TLR2激動劑的另一非限制性實例是Pam2CSK4。PaM2CSK4 (二棕櫚醯基-S-甘油基半胱氨酸-絲氨酸_(賴氨酸)4或Pam2Cys-Ser-(Lys)4)是合成的二醯基化脂肽。已經在參考文獻中描述了合成的TLR激動劑。參閱例如，Kellner等(1992) ；Seifer ^ (1990) ；Lee 等 Q003)。TLR3激動劑.TLR3激動劑包括分離的天然的TLR3激動劑；和合成的TLR3激動劑。 從天然TLR3激動劑來源分離的TLR3激動劑一般是純化的，例如純化的TLR3激動劑的純度為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %、或高於99 %。合成的 TLR3激動劑通過標準方法製備，純度一般為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約 98%、至少約99%或高於99%。TLR3激動劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR3激動劑。TLR3激動劑包括共價或非共價附著到另一化合物上的TLR3激動劑。在一些實施方案中，TLR3激動劑直接附著到另一化合物上。在另一些實施方案中，TLR3激動劑通過接頭附著到另一化合物上。TLR3激動劑包括天然的雙鏈RNA(dsRNA)；合成的dsRNA ；和合成的dsRNA類似物等(Alexopoulou等，2001)。合成的ds RNA類似物的示例性非限制實例是poly (I C)。TLR4激動劑.合適的TLR4激動劑包括分離的天然TLR4激動劑；和合成的TLR4激動劑。從天然的TLR4激動劑來源分離的TLR4激動劑一般是純化的，例如純化的TLR4激動劑的純度為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %或高於99 %。 合成的TLR4激動劑通過標準方法製備，純度一般為至少約80%、至少約90%、至少約95%、 至少約98%、至少約99%或高於99%。TLR4激動劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR4激動劑。合適的TLR4激動劑包括共價或非共價附著到另一化合物上的TLR4激動劑。在一些實施方案中，TLR4激動劑直接附著到另一化合物上。在另一些實施方案中，TLR4激動劑通過接頭附著到另一化合物上。TLR4激動劑所附著的合適的化合物包括載體、支架等。
TLR4激動劑包括天然的脂多糖(LPS)，例如來自多種革蘭氏陰性菌的LPS ； 天然LPS的衍生物；合成的LPS;細菌熱休克蛋白60 (Hsp60)；甘露糖醛酸聚合物；黃脂素(flavolipin)；糖醛酸磷壁酸；肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)的肺炎球菌溶血素 (pneumolysin)；細菌菌毛(fimbriae)，呼吸道合胞體病毒外殼蛋白等。TLR4激動劑也包括合成的單磷酸脂質A(MPLA，Invivogen)和磷酸化六醯基二糖(PHAD，Avanti Polar Lipids)，以及其他合成的TLR4激動劑。TLR5激動劑.合適的TLR5激動劑包括分離的天然TLR5激動劑；和合成的TLR5激動劑。從天然的TLR5激動劑來源分離的TLR5激動劑一般是純化的，例如純化的TLR4激動劑的純度為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %或高於99 %。 合成的TLR5激動劑通過標準方法製備，純度一般為至少約80%、至少約90%、至少約95%、 至少約98%、至少約99%或高於99%。TLR5激動劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR5激動劑。合適的TLR5激動劑包括共價或非共價附著到另一化合物上的TLR5激動劑。在一些實施方案中，TLR5激動劑直接附著到另一化合物上。在另一些實施方案中，TLR5激動劑通過接頭附著到另一化合物上。TLR5激動劑附著的合適的化合物包括載體、支架等。TLR5激動劑包括鞭毛蛋白的高度保守的22胺基酸區段以及全長鞭毛蛋白及其其他區段。TLR7激動劑.合適的TLR7激動劑包括分離的天然TLR7激動劑；和合成的TLR7激動劑。從天然的TLR7激動劑來源分離的TLR7激動劑一般是純化的，例如純化的TLR7激動劑的純度為至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或高於99%。 合成的TLR7激動劑通過標準方法製備，純度一般為至少約80%、至少約90%、至少約95%、 至少約98%、至少約99%或高於99%。TLR7激動劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR7激動劑。合適的TLR7激動劑包括共價或非共價附著到另一化合物上的TLR7激動劑。在一些實施方案中，TLR7激動劑直接附著到另一化合物上。在另一些實施方案中，TLR7激動劑通過接頭附著到另一化合物上。TLR7配體包括咪唑喹啉化合物；鳥苷類似物；嘧啶化合物，如溴匹立明和溴匹立明類似物等。起TLR7配體功能的咪唑喹啉化合物包括但不限於咪喹莫特(也稱為Aldara、 R-837.S-26308)和R-848 (也稱為瑞喹莫德，S-28463 ；具有以下化學結構4_氨基-2-乙氧基甲基-α，α - 二甲基-IH-咪唑[4，5_c]喹啉乙醇)。合適的咪唑喹啉劑包括咪唑喹啉胺、咪唑並吡啶胺、6，7_稠合的環烷基咪唑並吡啶胺和1，2橋接的咪唑喹啉胺。已經在美國專利 4，689，338,4, 929，624,5, 238，944,5, 266，575,5, 268，376,5, 346，905,5, 352，784、 5，389，640,5, 395，937,5, 494，916,5, 482，936,5, 525，612,6, 039，969 和 6，110，929 中描述了這些化合物。適用於本發明方法中的咪唑喹啉劑的具體種類包括R-848(S48463)； 4-氨基-2乙氧基甲基-α，α-二甲基-IH-咪唑[4，5_c]喹啉-s_i-乙醇；和1-(2-甲基丙基)-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺(R-837或咪喹莫特)。還適合使用的是化合物4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-6，7，8，9-四氫_1Η_咪唑W，5_c]喹啉乙醇水合物(參閱例如，BM-003, Gorden等U005)。合適的化合物包括2-氨基吡啶與五員含氮雜環稠合的那些化合物。此類化合物包括如咪唑喹啉胺，包括但不限於取代的咪唑喹啉胺，例如醯胺取代的咪唑喹啉胺、磺醯胺取代的咪唑喹啉胺、尿素取代的咪唑喹啉胺、芳基醚取代的咪唑喹啉胺、雜環醚取代的咪唑喹啉胺、氨基醚取代的咪唑喹啉胺、磺醯胺醚取代的咪唑喹啉胺、尿素取代的咪唑喹啉醚、 硫醚取代的咪唑喹啉胺，和6-、7-、8_或9-芳基或雜芳基取代的咪唑喹啉胺；四氫咪唑喹啉胺，包括但不限於醯胺取代的四氫咪唑喹啉胺、磺醯胺取代的四氫咪唑喹啉胺、尿素取代的四氫咪唑喹啉胺、芳基醚取代的四氫咪唑喹啉胺、雜環醚取代的四氫咪唑喹啉胺、氨基醚取代的四氫咪唑喹啉胺、磺醯胺醚取代的四氫咪唑喹啉胺、尿素取代的四氫咪唑喹啉醚和硫醚取代的四氫咪唑喹啉胺；咪唑並吡啶胺包括但不限於醯胺取代的咪唑並吡啶胺、磺醯胺取代的咪唑並吡啶胺、尿素取代的咪唑並吡啶胺、芳基醚取代的咪唑並吡啶胺、雜環醚取代的咪唑並吡啶胺、氨基醚取代的咪唑並吡啶胺、磺醯胺醚取代的咪唑並吡啶胺、尿素取代的咪唑並吡啶醚和硫醚取代的咪唑並吡啶胺；1，2-橋接咪唑喹啉胺；6，7-稠合的環烷基咪唑並吡啶胺；咪唑並萘啶胺；四氫咪唑並萘啶胺Λ惡唑並喹啉胺；噻唑並喹啉胺；《惡唑並吡啶胺；噻唑並吡啶胺；《惡唑並萘啶胺；噻唑並萘啶胺；和與吡啶胺稠合的IH-咪唑二聚體、喹啉胺、四氫喹啉胺、萘啶胺和四氫萘啶胺。化合物包括取代的咪唑喹啉胺、四氫咪唑喹啉胺、咪唑並吡啶胺、1，2-橋接的咪唑喹啉胺、6，7-稠合的環烷基咪唑並吡啶胺、咪唑並萘啶胺、四氫咪唑萘啶胺、<惡唑並喹啉胺、噻唑並喹啉胺、ρ惡唑並吡啶胺、噻唑並吡啶胺、Ρ惡唑並萘啶胺和噻唑並萘啶胺。如本文所用，取代的咪唑喹啉胺指醯胺取代的咪唑喹啉胺、磺醯胺取代的咪唑喹啉胺、尿素取代的咪唑喹啉胺、芳基醚取代的咪唑喹啉胺、雜環醚取代的咪唑喹啉胺、氨基醚取代的咪唑喹啉胺、磺醯胺醚取代的咪唑喹啉胺、尿素取代的咪唑喹啉醚、硫醚取代的咪唑喹啉胺，或6-、7-、8_或9-芳基或雜芳基取代的咪唑喹啉胺。發揮TLR7配體功能的鳥苷類似物包括某些C8-取代的和Ν7，C8- 二取代的鳥嘌呤核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸，包括但不限於羅唑利賓(7-烯丙基-8-氧鳥苷)、7_硫代-8-氧鳥苷(T0G)、7-脫氮鳥苷和7-脫氮脫氧鳥苷(Lee等，200 。在參考文獻中描述了溴匹立明(PNU-54461) (5-滷代_6_苯基嘧啶酮)和溴匹立明類似物，並且其也適合使用。 參閱如Vroegop等(1999)。合適的C8取代鳥苷的額外實例包括但不限於，8-巰基鳥苷、 8-溴代鳥苷、8-甲基鳥苷、8-氧代-7，8- 二氫鳥苷、C8-芳氨基-2』 -脫氧鳥苷、C8-丙炔基鳥苷、C8-和N7-取代的鳥嘌呤核糖核苷，如7-烯丙基-8-氧鳥苷(羅唑利賓)和7-甲基-8-氧鳥苷、8-氨基鳥苷、8-羥基-2』 -脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷。在一些實施方案中，取代的鳥嘌呤TLR7配體是單體。在另一些實施方案中，取代的鳥嘌呤TLR7配體是多聚的。因此，在一些實施方案中，TLR7配體具有通式(B)q，其中B 是取代的鳥嘌呤TLR7配體，q是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。多聚TLR7配體中的各TLR7配體單體直接或通過接頭與另一配體共價或非共價連接。合適的TLR7激動劑包括如美國專利公開2004/0162309中描述的TLR7配體。在一些實施方案中，TLR7激動劑是選擇性TLR7激動劑，例如所述激動劑通過TLR7 調節細胞活性，但不通過TLR8調節細胞活性。TLR7選擇性激動劑包括在美國專利公開 2004/0171086中顯示的那些。此類TLR7選擇性激動劑化合物包括但不限於，N1-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-6，7，8，9-四氫-IH-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基]丁基}-4_氟-1-苯磺醯胺、^-[4-(4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1Η-咪唑W，5-c]喹啉-1-基)丁基]-4-氟-1-苯磺醯胺、N-W-(4-氨基-2-丙基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]甲磺醯胺、N-{3-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]-2，2-二甲丙基}苯甲醯胺、N-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧乙基)-1Η-咪唑W，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基)-N-甲基甲磺醯胺、N-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧乙基)-6，7，8，9_四氫-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基)苯甲醯胺、N<4-(4-氨基-2-甲基-IH-咪唑基[4，5-c]喹啉基-1-基)丁基]環戊甲醯胺、1-[4-(1，1_ 二氧異噻唑烷-2-基)丁基]-2- -甲氧基乙基)-1Η-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、2-甲基_1-[5_甲基磺醯基]戊基-6，7，8，9-四氫-IH-咪唑[4,5-c]喹啉_4_胺、N-{2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)_6， 7-二甲基-IH-咪唑[4,5-c]吡啶-1-基]-1，1_ 二甲基乙基}-N-環己基脲、N-[2_(4_氨基-2-乙基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)-l，l-二甲基乙基]苯甲醯胺、N-[3-(4-氨基-2-丁基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)-2，2-二甲基丙基]甲磺醯胺、1_[6_(甲磺醯基)己基]-6，7-二甲基-2-丙基-IH-咪唑W，5-c]吡啶-4-胺、6-(6-氨基-2-丙基-IH-咪唑W，5-c]喹啉-1-基)-N-甲氧基-N-甲基己醯胺、1-[2，2-二甲基-3-(甲磺醯基)丙基]-2-(乙氧基甲基)-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、N-W-(4-氨基-2-甲基-IH-咪唑[4,5-c]喹啉-1-基)丁基]-N-甲基-N-苯脲、1-{3-[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-IH-咪唑W，5-c]喹啉-8-基]苯基}乙酮、7-(4-氨基-2-丙基-IH-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基)-2-甲基庚-2-醇、N-甲基-4-(4-氨基-2-乙基-IH-咪唑[4,5-c]喹啉-1-基) 丁烷-1-磺醯胺、N-甲氧基苄基)-4-(4-氨基-2-乙基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基) 丁烷-1-磺醯胺、N-{2-[4-氨基-3-(乙氧基甲基)-6，7-二甲基-IH-咪唑基[4，5_c]吡啶-1-基]-1，1-二甲基乙基}甲磺醯胺、2-乙氧甲基-1-(3-甲氧基丙基)-7-(5-羥甲基吡啶-3-基)-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、1-K2，2-二甲基-1，3-二氧戊環-4-基) 甲基]-2-(乙氧基甲基)-7-(批啶-3-基)-1Η-咪唑[4，5-c]喹啉_4_胺、4-[3_(4_氨基-6，7-二甲基-2-丙基-1!1-111^11&0[4，5-(3]吡啶基)丙烷磺醯基]-苯甲酸乙酯、2-丁基-1-{2-[2-(甲基磺醯基)乙氧基]乙基}-1Η-咪唑W，5-c]喹啉-4-胺、 N42-{4-氨基-2-乙氧基甲基_7-[6-(甲磺醯基氨基)己氧基]-IH-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基} -1，1- 二甲基乙基)甲磺醯胺、N- (6- {[4-氨基-2-乙氧基甲基-1- (2-甲磺醯基氨基-2-甲基丙基)-IH-咪唑W，5-c]喹啉-7-基]氧基}己基)乙醯胺、1-[4-(1，1_ 二氧異噻唑啉-2-基)丁基]-2-乙氧基甲基-7-(吡啶-3-基)-IH-咪唑[4，5-c]喹啉_4_胺、 144-(1,1-二氧異噻唑啉-2-基)丁基]-2-乙氧基甲基-7-(吡啶-4-基)-1Η-咪唑 [4,5-c]喹啉-4-胺、l-[4-(l，l-二氧異噻唑啉-2-基)丁基]_2_乙氧基甲基_7_苯基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、2-(乙氧基甲基)-1-{[1_(甲基磺醯基)哌啶_4_基] 甲基}-7_(吡啶-3-基)-1Η-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺、2-(乙氧基甲基)_1_[ (1_異丁基哌啶-4-基)甲基]-7-(卩比啶-3-基)-1Η-咪唑[4，5-c]喹啉_4_胺、2_(乙氧基甲基)-1-{[1_(嗎啉-4-基羰基)哌啶-4-基]甲基}-7-(卩比啶-3-基)-IH-咪唑W，5-c] 喹啉-4-胺、環丙烷酸[3-(4-氨基-2-丙基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丙氧基]醯胺、異丙基氨基甲酸4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1-丙基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-7-基酯、4-(4-氨基-2-丙基-IH-咪唑W，5-c]喹啉-1-基)丁酸乙酯、1-[4-氨基-2-乙基-7-(吡啶-3-基)-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇、1-(4-氨基-2-乙基-7_[5-{羥甲基}吡啶-3-基]-IH-咪唑W，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙_2_醇、1-(3-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-8-(卩比啶-3-基)-IH-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基]丙基)吡咯烷-2-酮、N-{4-氨基-2-乙氧基甲基-7-[6-(甲磺醯基氨基)己氧基]-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基}-l，l-二甲基乙基)乙醯胺、1-{3-[4_氨基-7-(3-羥甲基苯基)-2-甲氧基乙基)-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]丙基}吡咯烷-2-酮、N-{4-[4-氨基-2-乙氧基甲基-7-(吡啶-3-基)-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}-N』 -丙基脲、 N-{4-[4-氨基-2-乙氧基甲基-7-(吡啶-3-基)-IH-咪唑[4，5_c]喹啉-1-基]丁基} 丁醯胺、5- (4-氨基-2-丙基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)-4，4- 二甲基戊_2_酮、1_環己基甲基-2-乙氧基甲基-7-(5-羥甲基吡啶-3-基)-IH-咪唑[4，5-c]喹啉_4_胺、N， N-二甲基-5-(4-氨基-2-乙氧基甲基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)戊烷-1-磺醯胺、 N-{3-[(4-氨基-2-乙氧基甲基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)氨基]丙基}甲磺醯胺和 /或N，N-二甲基-4-(4-氨基-2-乙氧基甲基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丁烷磺醯胺。其他合適的TLR7選擇性激動劑包括但不限於2_(乙氧基甲基)-1- -甲基丙基)-IH-咪唑[4, 5-c]喹啉-4-胺(美國專利5，389，640) ；2-甲基+[2-(3-吡啶-3-基丙氧基)乙基]-IH-咪唑[4, 5-c]喹啉-4-胺(W0 02/46193) ；N-(2-{2-[4-M 基-2-(2-甲氧基乙基)-1Η-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基)-N-甲基環己烷羧醯胺(美國專利公開2004/0171086) ；1_[2_(苯甲氧基)乙基]-2-甲基-IH-咪唑[4， 5-c]喹啉-4-胺(W0 02/46189) ；N-{8-[4-氨基-2- -甲氧基乙基)-IH-咪唑 W，5_c]喹啉-1-基]辛基}-N-苯脲(美國專利公開2004/0171086 (IRM5)) ；2-丁基_1-[5_(甲基磺醯基)戊基]-IH-咪唑[4, 5-c]喹啉-4-胺(W0 02/46192) ；N-{3-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1Η-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基]丙基}-4_甲基苯磺醯胺(美國專利6，331，539)； 和N44-(4-氨基-2-乙基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]環己烷羧醯胺(美國專利公開2004/0171086 (IRM8))。也適合使用的是TLR7選擇性激動劑N-W-(4-氨基-2-乙基-IH-咪唑[4，5-c]喹啉-1-基)丁基-]甲磺醯胺(Gorden等，2005)。TLR8激動劑.合適的TLR8激動劑包括分離的天然TLR8激動劑；和合成的TLR8激動劑。從天然的TLR8激動劑來源分離的TLR8激動劑一般是純化的，例如純化的TLR8激動劑的純度為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %或高於99 %。 合成的TLR8激動劑通過標準方法製備，純度一般為至少約80%、至少約90%、至少約95%、 至少約98%、至少約99%或高於99%。TLR8激動劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR8激動劑。TLR8激動劑包括共價或非共價附著到另一化合物上的TLR8激動劑。在一些實施方案中，TLR8激動劑直接附著到另一化合物上。在另一些實施方案中，TLR8激動劑通過接頭附著到另一化合物上。TLR8激動劑包括但不限於諸如R-848及其衍生物和類似物的化合物。合適的TLR8 激動劑包括具有與五員含氮雜環稠合的2-氨基吡啶的化合物。此類化合物包括如咪唑喹啉胺，包括但不限於取代的咪唑喹啉胺，例如醯胺取代的咪唑喹啉胺、磺醯胺取代的咪唑喹啉胺、尿素取代的咪唑喹啉胺、芳基醚取代的咪唑喹啉胺、雜環醚取代的咪唑喹啉胺、氨基醚取代的咪唑喹啉胺、磺醯胺醚取代的咪唑喹啉胺、尿素取代的咪唑喹啉醚、硫醚取代的咪唑喹啉胺，和6-、7-、8_或9-芳基或雜芳基取代的咪唑喹啉胺；四氫咪唑喹啉胺，包括但不限於醯胺取代的四氫咪唑喹啉胺、磺醯胺取代的四氫咪唑喹啉胺、尿素取代的四氫咪唑喹啉胺、芳基醚取代的四氫咪唑喹啉胺、雜環醚取代的四氫咪唑喹啉胺、氨基醚取代的四氫咪唑喹啉胺、磺醯胺醚取代的四氫咪唑喹啉胺、尿素取代的四氫咪唑喹啉醚和硫醚取代的四氫咪唑喹啉胺；咪唑並吡啶胺，包括但不限於醯胺取代的咪唑並吡啶胺、磺醯胺取代的咪唑並吡啶胺、尿素取代的咪唑並吡啶胺、芳基醚取代的咪唑並吡啶胺、雜環醚取代的咪唑並吡啶胺、氨基醚取代的咪唑並吡啶胺、磺醯胺醚取代的咪唑並吡啶胺、尿素取代的咪唑並吡啶醚和硫醚取代的咪唑並吡啶胺；1，2_橋接的咪唑喹啉胺；6，7-稠合的環烷基咪唑並吡啶胺；咪唑並萘啶胺；四氫咪唑並萘啶胺；<惡唑並喹啉胺；噻唑並喹啉胺Λ惡唑並吡啶胺；噻唑並吡啶胺3惡唑並萘啶胺；噻唑並萘啶胺；和與吡啶胺稠合的IH-咪唑二聚體、喹啉胺、 四氫喹啉胺、萘啶胺或四氫萘啶胺。在一個具體實施方案中，TLR8激動劑是醯胺取代的咪唑喹啉胺。在一個備選實施方案中，TLR8激動劑是磺醯胺取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是尿素取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是芳基醚取代的咪唑喹啉胺。 在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是雜環醚取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中， TLR8激動劑是氨基醚取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是磺胺醚取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是尿素取代的咪唑喹啉醚。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是硫醚取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是6-、7-、8_或9-芳基或雜芳基取代的咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是醯胺取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是磺醯胺取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8 激動劑是尿素取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是芳基醚取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是雜環醚取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8 激動劑是氨基醚取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是磺醯胺醚取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是尿素取代的四氫咪唑喹啉醚。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是硫醚取代的四氫咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是醯胺取代的咪唑並吡啶胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是磺醯胺取代的咪唑並吡啶胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是尿素取代的咪唑並吡啶胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是芳基醚取代的咪唑並吡啶胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是雜環醚取代的咪唑並吡啶胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是氨基醚取代的咪唑並吡啶胺。在另一備選實施方案中，TLR8 激動劑是磺醯胺醚取代的咪唑並吡啶胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是尿素取代的咪唑並吡啶醚。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是硫醚取代的咪唑並吡啶胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是1，2_橋接咪唑喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是6，7-稠合的環烷基咪唑並吡啶胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是咪唑並萘啶胺。在另一備選實施方案中， TLR8激動劑是四氫咪唑並萘啶胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是Ρ惡唑並喹啉胺。 在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是噻唑並喹啉胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是Ρ惡唑並吡啶胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是噻唑並吡啶胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是Ρ惡唑並萘啶胺。在另一備選實施方案中，TLR8激動劑是噻唑並萘啶胺。在又一備選實施方案中，TLR8激動劑是與吡啶胺稠合的IH-咪唑二聚體、喹啉胺、 四氫喹啉胺、萘啶胺或四氫萘啶胺。在一些實施方案中，TLR8激動劑是選擇性TLR8激動劑，例如所述激動劑通過TLR8 調節細胞活性，但不通過TLR7調節細胞活性。TLR8選擇性激動劑包括在美國專利公開 2004/0171086中顯示的那些。此類TLR8選擇性激動劑化合物包括但不限於美國專利公開 2004/0171086中顯示的化合物，其包括N-{4_[4_氨基-2-(2-甲氧基乙基)_1Η_咪唑[4， 5-c]喹啉-1-基]丁基}喹啉-3-羧醯胺、N-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-IH-咪唑 [4,5-c]喹啉-1-基]丁基}喹喔啉-2-羧醯胺、和N-W-(4-氨基-2-丙基-IH-咪唑[4， 5-c]喹啉-1-基)丁基]嗎啉-4-羧醯胺。其他合適的TLR8選擇性激動劑包括但不限於2-丙基噻唑[4，5_c]喹啉_4_胺 (美國專利 6，110,929) ；N1-[2-(4-氨基-2-丁基-IH-咪唑 W，5_c][l，5]萘啶基) 乙基]-2-氨基-4-甲基戊醯胺(美國專利6，194，425) ；N1-[4-(4-氨基-IH-咪唑[4， 5-c]喹啉-1-基)丁基]-2-苯氧基-苯甲醯胺(美國專利6，451，810) ；^-[2-(4-氨基-2-丁基-IH-咪唑W，5-c]喹啉-1-基)乙基]-1-丙磺醯胺(美國專利6，331，539)； N-{2-[2-(4-氨基-2-乙基-IH-咪唑W，5-c]喹啉-1-基)乙氧基]乙基}-N，-苯脲(美國專利公開2004/0171086) ；1_{4_[3，5-二氯苯基]硫基} 丁基)_2_乙基-IH-咪唑[4， 5-c]喹啉-4-胺(美國專利公開2004/0171086) ；N-{2-氨基-2-(乙氧基甲基)-IH-咪唑[4,5-c]喹啉-1-基]乙基}-N』-(3-氰基苯基)尿素(W0 00/76518和美國專利公開號 2004/0171086)；和4-氨基-α，α-二甲基-2-甲氧基乙基-IH-咪唑[4，5_c]喹啉乙醇(美國專利5，389，640)。用作TLR8選擇性激動劑的包括美國專利公開號2004/0171086 中的化合物。還適合使用的是化合物2-丙基噻唑-4，5-c)喹啉-4-胺(Gorden等，2005同上)。TLR9激動劑.合適的TLR9激動劑包括分離的天然TLR9激動劑；和合成的TLR9激動劑。從天然的TLR9激動劑來源分離的TLR9激動劑一般是純化的，例如純化的TLR9激動劑的純度為至少約80 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約98 %、至少約99 %或高於99 %。 合成的TLR9激動劑通過標準方法製備，純度一般為至少約80%、至少約90%、至少約95%、 至少約98%、至少約99%或高於99%。TLR9激動劑包括不附著到任何其他化合物上的TLR9激動劑。TLR9激動劑包括共價或非共價附著到另一化合物上的TLR9激動劑。在一些實施方案中，TLR9激動劑直接附著到另一化合物上。在另一些實施方案中，TLR9激動劑通過接頭附著到另一化合物上。TLR9激動劑(本文也稱為「TLR9配體」)的實例包括這樣的核酸，其包含序列 5』-CG-3，( 「CpG核酸」)，在某些方面C是未甲基化的。在TLR9配體分子的上下文中互換使用的術語「多核苷酸」和「核酸」指任何長度的多核苷酸，包括單鏈和雙鏈寡核苷酸(包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或兩者皆有)、修飾的寡核苷酸和寡核苷等，它們是單獨的，或者作為更大核酸構建體一部分，或作為與非核酸分子(如多肽)的綴合物的一部分。 因此，TLR9配體可以是例如單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈RNA(ssRNA)或雙鏈 RNA (dsRNA)。TLR9配體也包括粗製的經去毒的細菌(例如分枝桿菌)RNA或DNA，以及富集 TLR9配體的富集質粒。在一些實施方案中，「富集TLR9配體的質粒」指線性或環形質粒，其包含(或經改造而包含)比通常在哺乳動物DNA中發現的更多數量的CpG基序。在Roman等(1997)中描述了富集TLR9配體的質粒的非限制性實例。寡核苷酸的修飾包括但不限於3』 OH或5』 OH基團的修飾、核苷酸鹼基的修飾、糖組分的修飾和磷酸基團的修飾。TLR9配體可包含至少一個核苷(其包含L-糖)。L-糖可以是脫氧核糖、核糖、戊糖、脫氧戊糖、己糖、脫氧己糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、來蘇糖或糖「類似物」環戊基。L-糖可以是吡喃糖基或呋喃糖基形式。TLR9配體一般不提供(也不需要它們提供)多核苷酸編碼的任何胺基酸序列的表達，因此TLR9配體的序列可以是(並且通常是)非編碼的。TLR9配體可包含線性雙鏈或單鏈分子、環形分子，或可包含線性和環形區段。TLR9配體可以是單鏈的，或可以是完全或部分是雙鏈的。在一些實施方案中，用於本發明方法中的TLR9配體是寡核苷酸，例如由長度約5 個核苷酸到約200個核苷酸、約10個核苷酸到約100個核苷酸、約12個核苷酸到約50個核苷酸、約15個核苷酸到約25個核苷酸、20個核苷酸到約30個核苷酸、約5個核苷酸到約 15個核苷酸、約5個核苷酸到約10個核苷酸、約5個核苷酸到約7個核苷酸的序列組成。 在一些實施方案中，長度少於約15個核苷酸、少於約12個核苷酸、少於約10個核苷酸、或少於約8個核苷酸的TLR9配體與更大的分子連接。在一些實施方案中，TLR9配體不提供真核細胞中肽或多肽的表達，例如向真核細胞中引入TLR9配體不導致肽或多肽的產生，因為TLR9配體不提供編碼肽或多肽的mRNA的轉錄。在這些實施方案中，TLR9配體缺少真核細胞中轉錄所需的啟動子區和其他控制元件。TLR9配體可從細菌中分離，例如從細菌來源分離；通過合成方法產生(例如通過化學合成多核苷酸的標準方法產生)；通過標準重組方法產生，然後從細菌來源分離；或上述方法的組合。在許多實施方案中，TLR9配體是純化的，例如純度為至少約80%、至少約 90%、至少約95%、至少約98%、至少約99%或更高，例如99. 5%、99. 9%或更高。在許多實施方案中，TLR9配體是化學合成然後純化的。在另一些實施方案中，TLR9配體是更大核苷酸構建體(例如質粒載體、病毒載體或其他此類構建體)的一部分。大量質粒和病毒載體為本領域所知，並不需要在本文詳細說明。已經在多種出版物，包括例如Current Protocols in Molecular Biology，(1987及更新)中描述了大量此類載體。一般而言，用於本發明組合物中的TLR9配體包含至少一種未甲基化的CpG基序。某些哺乳動物物種(例如，嚙齒類)中，多核苷酸中任何CpG序列的相對位置是 5，-CG-3，(即，相對而言，C在5』位置，G在3』位置)。在一些實施方案中，TLR9配體包含中央回文核心序列(其包含至少一個CpG序列)，其中所述中央回文核心序列含有磷酸二酯骨架，並且其中所述回文核心序列一側或兩側的側翼為含硫代磷酸酯骨架的多聚鳥苷序列。在另一些實施方案中，TLR9配體在核酸5』末端或其附近包含一個或多個TCG序列；和至少兩個額外的CG 二核苷酸。在一些這種實施方案中，所述至少兩個額外的CG 二核苷酸被三個核苷酸、兩個核苷酸或一個核苷酸分隔開。在一些這種實施方案中，所述至少兩個額外的CG 二核苷酸彼此鄰接。在一些這種實施方案中，TLR9配體在核酸的5』末端包含(TCG)n，其中η = 1到3。在另一些實施方案中，TLR9配體包含(TCG)η，其中η = 1到3，並且其中(TCG)n序列在(TCG)n序列的5』末端側翼有一個核苷酸、兩個核苷酸、三個核苷酸、 四個核苷酸或五個核苷酸。用於本發明的TLR9配體的示例性共有CpG基序包括但不限於5』 -嘌呤-嘌呤-(C)-(G)-嘧啶-嘧啶-3』，其中TLR9配體包含側翼是至少兩個嘌呤核苷酸(例如GG、 GA、AG、AA、II等)和至少兩個嘧啶核苷酸(CC、TT、CT、TC、UU等)的CpG基序；5，-嘌呤-TCG-嘧啶-嘧啶-3』 ;5』 -TCG-N-N-3』 ；其中N是任何鹼基；5』 -Nx (CG) nNy，其中N是任何鹼基，其中χ和y獨立地是0到200的任何整數，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15、 16-20、21-25、25-30、30-50、50-75、75-100、100-150 或 150-200 ；並且 η 是 1 或更大的任何整數，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。5』_Nx(TCG)nNy，其中N是任何鹼基，其中χ和y 獨立地是0到200 的任何整數，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15、16-20、21-25、25-30、 30-50、50-75、75-100、100-150 或 150-200 ；並且η 是 1 或更大的任何整數，例如 1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10或更大。5』-(TCG)n-3』，其中η是1或更大的任何整數，例如以提供基於TCG的 TLR9配體(例如，其中η = 3，所述多核苷酸包含序列5』 -TCGNNTCGNNTCG-3『 ；SEQ ID NO 3) ；5』 Nm-(TCG)η-Νρ-3』，其中N是任何核苷酸，其中m是0、1、2或3，其中η是1或更大的任何整數，並且其中ρ是1、2、3或4 ； 5 』 Nm- (TCG) η-Νρ-3 』，其中N是任何核苷酸，其中m是0 到5，並且其中η是1或更大的任何整數，其中ρ是4或更大，其中序列N-N-N-N包含彼此鄰接或通過一個核苷酸、兩個核苷酸或三個核苷酸分隔開的至少兩個CG 二核苷酸；和5』 -嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-TCG-3』。當核酸TLR9配體包含以下通式的序列時5』 -Nm-(TCG)η-Νρ-3』，其中N是任何核苷酸，其中m是0到5，並且其中η是1或更大的任何整數，其中ρ是4或更大，並且其中序列N-N-N-N包含彼此鄰接或通過一個核苷酸、兩個核苷酸或三個核苷酸分隔開的至少兩個 CG 二核苷酸，可用於本發明的示例性TLR9配體包括但不限於(1)該通式的序列，其中η = 2，Np是NNCGNNCG ； (2)該通式的序列，其中η = 2，Np是AACGTTCG ； (3)該通式的序列，其中 η = 2，Np是TTCGAACG ； (4)該通式的序列，其中η = 2，Np是TACGTACG ； (5)該通式的序列， 其中η = 2，Νρ是ATCGATCG ； (6)該通式的序列，其中η = 2，Np是CGCGCGCG ； (7)該通式的序列，其中η = 2，Np是GCCGGCCG ； (8)該通式的序列，其中η = 2，Np是CCCGGGCG ； (9)該通式的序列，其中η = 2，Νρ是GGCGCCCG ； (10)該通式的序列，其中η = 2，Np是CCCGTTCG ； (11)該通式的序列，其中η = 2，Np是GGCGTTCG ； (12)該通式的序列，其中η = 2，Np是 TTCGCCCG ； (13)該通式的序列，其中η = 2，Np是TTCGGGCG ； (14)該通式的序列，其中η = 2，Νρ是AACGCCCG ； (15)該通式的序列，其中η = 2，Np是AACGGGCG ； (16)該通式的序列，其中η = 2，Np是CCCGAACG ；禾口 (17)該通式的序列，其中η = 2，Np是GGCGAACG ；並且其中， 在1-17任何一項中，m = 0、1、2或3。當核酸TLR9配體包含以下通式的序列時5』 -Nm-(TCG)η-Νρ-3』，其中N是任何核苷酸，其中m是0、1、2或3，其中η是1或更大的任何整數，並且其中ρ是1、2、3或4，可用於本發明的示例性TLR9配體包括但不限於(1)該通式的序列，其中m = 0,n = 1，並且Np 是T-T-T ；⑵該通式的序列，其中m = 0，η = 1，並且Np是T-T-T-T ； (3)該通式的序列， 其中m = 0，η = 1，並且Np是C-C-C-C ； (4)該通式的序列，其中m = 0，η = 1，並且Np是 A-A-A-A ； (5)該通式的序列，其中m = 0，η = 1，並且Np是A-G-A-T ； (6)該通式的序列，其中Nm是T，n = 1，並且Np是T-T-T ； (7)該通式的序列，其中Nm是Α，η = 1，並且Np是T-T-T ； ⑶該通式的序列，其中Nm是C，n= 1，並且Np是Τ-Τ-Τ;(9)該通式的序列，其中Nm是G， η = 1，並且Np是T-T-T ； (10)該通式的序列，其中Nm是Τ，η = 1，並且Np是A-T-T ； (11) 該通式的序列，其中Nm是Α，η = 1，並且Np是A-T-T ；和(12)該通式的序列，其中Nm是C， η = 1，並且 Np 是 Α-Τ-Τ。可用於本發明的TLR9配體的核心結構上遊和/或下遊的側翼可以是任何數量或組成的核苷酸或核苷。在一些實施方案中，TLR9配體的核心序列長度至少是6個鹼基或8 個鹼基，而完整的TLR9配體(核心序列加5』、3』或兩者的側翼序列)的長度一般在6個鹼基或8個鹼基到高達約200個鹼基之間。可用於本發明的基於DNA的TLR9配體包括但不限於這樣的多核苷酸，其包含一個或多個以下核苷酸序列AGCGCT，AGCGCC，AGCGTT，AGCGTC，AACGCT，AACGCC，AACGTT，AACGTC， GGCGCT，GGCGCC，GGCGTT，GGCGTC，GACGCT，GACGCC，GACGTT，GACGTC，GTCGTC，GTCGCT，GTCGTT， GTCGCC，ATCGTC，ATCGCT，ATCGTT，ATCGCC，TCGTCG，和 TCGTCGTCG。用於本發明的其他TLR9配體包括但不限於這樣的多核苷酸，其包含一個或多個以下核苷酸序列TCGXXXX，TCGAXXX, XTCGXXX, XTCGAXX, TCGTCGA, TCGACGT, TCGAACG, TCGAGAT， TCGACTC， TCGAGCG， TCGATTT， TCGCTTT， TCGGTTT， TCGTTTT， TCGTCGT， ATCGATT， TTCGTTT，TTCGATT，ACGTTCG，AACGTTC，TGACGTT，TGTCGTT，TCGXXX，TCGAXX，TCGTCG，AACGTT， ATCGAT，GTCGTT, GACGTT，TCGXX, TCGAX，TCGAT，TCGTT, TCGTC, TCGA，TCGT，TCGXjP TCG (其中「X」是任何核苷酸)。可用於本發明的基於DNA的TLR9配體包括但不限於這樣的多核苷酸，其包含一個或多個以下八聚體核苷酸序列AGCGCTCG，AGCGCCCG, AGCGTTCG, AGCGTCCG, AACGCTCG, AACGCCCG, AACGTTCG, AACGTCCG, GGCGCTCG, GGCGCCCG, GGCGTTCG, GGCGTCCG, GACGCTCG, GACGCCCG, GACGTTCGJP GACGTCCG。可用於實施本發明方法的TLR9配體可包含一個或多個上述任何CpG基序。例如， 可用於本發明的TLR9配體可包含一次或多次(例如2、3、4、5或更多次)出現的同一 CpG 基序。或者，TLR9配體可包含多個CpG基序(例如，2、3、4、5或更多)，其中所述多個CpG基序中的至少兩個具有不同的共有序列，或者所述TLR9配體中的所有CpG基序具有不同的共有序列。可用於本發明的TLR9配體可包括或不包括回文區。如果存在，迴文序列僅延伸至 CpG基序中(如果存在，在核心六聚體或八聚體序列中)，或可包括更多六聚體或八聚體序列以及側翼核苷酸序列。多聚體TLR9配體。在一些實施方案中，TLR9配體是多聚體。多聚體TLR9配體包含2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個體(單體)上述核酸TLR9配體，其通過非共價鍵連接、 通過共價鍵連接，彼此直接連接或通過一個或多個間隔區連接。合適的間隔區包括核酸和非核酸分子，只要它們是生物相容的即可。在一些實施方案中，多聚體TLR9配體包含單體 TLR9配體的線性陣列。在另一些實施方案中，多聚體TLR9配體是單體TLR9配體的分支狀或樹枝狀陣列。在一些實施方案中，多聚體TLR9配體具有一般結構(Xl) η (Χ2) η，其中X是如上所述的核酸TLR9配體，並具有以下長度從約6個核苷酸到約200個核苷酸，例如從約6個核苷酸到約8個核苷酸、從約8個核苷酸到約10個核苷酸、從約10個核苷酸到約12個核苷酸、從約12個核苷酸到約15個核苷酸、從約15個核苷酸到約20個核苷酸、從約20個核苷酸到約25個核苷酸、從約25個核苷酸到約30個核苷酸、從約30個核苷酸到約40個核苷酸、從約40個核苷酸到約50個核苷酸、從約50個核苷酸到約60個核苷酸、從約60個核苷酸到約70個核苷酸、從約70個核苷酸到約80個核苷酸、從約80個核苷酸到約90個核苷酸、從約90個核苷酸到約100個核苷酸、從約100個核苷酸到約125個核苷酸、從約125 個核苷酸到約150個核苷酸、從約150個核苷酸到約175個核苷酸或從175個核苷酸到約 200個核苷酸；並且其中η是從1到約100的任何數值，例如η = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10， 從10到約15、從15到約20、從20到約25、從25到約30、從30到約40、從40到約50、從 50到約60、從60到約70、從70到約80、從80到約90或從90到約100。在這些實施方案中，X和Χ2彼此在核苷酸序列上有至少一個核苷酸的差異，並且彼此在核苷酸序列上可有 2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個鹼基的差異。如上指出，在一些實施方案中，本發明多聚體TLR9配體包含通過間隔區與鄰近的 TLR9配體分隔開的TLR9配體。在一些實施方案中，間隔區是非TLR9配體核酸。在另一些實施方案中，間隔區是非核酸部分。合適的間隔區包括在美國專利公開20030225016中描述的那些。使用任何已知的方法使TLR9配體發生多聚化。TLR9配體修飾。可以多種方式修飾適用於本發明組合物的TLR9配體。例如，TLR9配體可包含骨架磷酸基團修飾(例如，甲基磷酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯 (phosphoroamidate)和二硫代磷酸酯核苷酸間連接)，所述修飾例如可增強其體內穩定性，使得它們在治療應用中特別有用。特別有用的磷酸基團修飾是轉化成核酸TLR9配體的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯形式。硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯比其未修飾的寡核苷酸對應物具有更高的體內降解抗性，提高了 TLR9配體的半衰期並使得它們在受治者中的利用度更高。本發明包括的其他修飾的TLR9配體包括在5』末端、3』末端、或5』和3』末端具有修飾的TLR9配體。例如，5』和/或3』末端可共價或非共價結合分子(核酸、非核酸、或兩者皆有)，從而例如提高TLR9配體的生物利用度、需要時提高攝入效率、促進向目的細胞的遞送等。用於與TLR9配體綴合的分子包括但不限於膽固醇、磷脂、脂肪酸、固醇、寡糖、多肽 (例如，免疫球蛋白)、肽、抗原(例如，肽、小分子等)、線性或環形核酸分子(例如，質粒)、 不溶性支持物、治療性多肽等。適合於附著到TLR9激動劑上的治療性多肽包括但不限於樹突細胞生長因子(例如，GM-CSF)；細胞因子；幹擾素(例如，IFN-α和IFN-β等)；TNF_a 拮抗劑等。在一些實施方案中，TLR9配體與不溶性支持物連接(例如，綴合、共價連接、非共價連接、或吸附到其上)。不溶性支持物的示例性非限制實例是陽離子聚(D，L-丙交酯-co-乙交酯)。其他TLR9配體綴合物及其生產方法為本領域所知，並描述於例如WO 98/16427和 WO 98/55495中。因此，術語「TLR9配體」包括這樣的綴合物，其包含核酸TLR9配體。多肽(例如治療性多肽)可直接綴合或例如通過接頭分子間接綴合到TLR9配體上。多種接頭分子為本領域所知，並可用於綴合物中。肽與寡核苷酸的連接可以通過肽的反應性側鏈或肽的N端或C端來實現。寡核苷酸與肽的連接可以是在3』或5』末端，或中間。接頭可以是有機的、無機的或半有機分子，並可以是有機分子聚合物、無機分子或者包含無機和有機分子的共聚物。如果存在，接頭分子的長度一般足以允許寡核苷酸和/或多核苷酸以及連接的多肽在所述寡核苷酸和多肽之間發生一定的柔性移動。接頭分子的長度一般為約6-50個原子。接頭分子也可以是例如芳基乙炔、含有2-10個單體單元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、 胺基酸或其組合。也可基於本公開內容使用可與寡核苷酸結合的其他接頭分子。b. NOD樣受體(NLR)激動劑NOD樣受體(NLR)是在炎性和凋亡應答的調節中可具有多種功能的胞質蛋白。已經在哺乳動物基因組中發現了大約20個這種蛋白質，並包括稱為NOD和NALP的兩個主要的亞家族、II類MHC反式激活子(CIITA)和一些其他分子(例如，IPAF和BIRC1)。目前的了解提出，這些蛋白質中的一些識別內源分子或微生物分子或脅迫應答，並形成激活炎性胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶1)(其引起重要炎性細胞因子如IL-I的切割和激活)的寡聚物，和/或激活NF-K B信號途徑，以誘導炎性分子的產生。NLR家族有若干不同名稱，包括 CATERPILLER(或 CLR)或 NOD-LRR 家族。目前已知NODl和N0D2的配體。NODl識別稱為內消旋DAP的分子，其僅為革蘭氏陰性菌的肽聚糖組分。N0D2蛋白識別胞內MDP (胞壁醯二肽)，其為革蘭氏陽性和陰性菌的肽聚糖組分。NODS在NF- κ B和MAP激酶途徑中通過絲氨酸-蘇氨酸激酶(稱為RIP2)進行信號轉導。NOD蛋白的命名是因為它們含有與核苷酸三磷酸結合的核苷酸結合寡聚化結構域。NOD通過N端CARD結構域進行信號轉導，以激活下遊基因誘導事件，並通過C端富亮氨酸重複(leucin-rich repeat, LRR)區與微生物分子相互作用。像NOD —樣，NALP蛋白含有C端的LRR，其看來作為調節結構域起作用，並可參與微生物病原體的識別。同樣像NOD—樣，這些蛋白質也含有核苷酸三磷酸的核苷酸結合位點(NBS)。通過N端pyrin (PYD)結構域介導與其他蛋白質(例如銜接分子ASC)的相互作用。在人中該亞家族具有14個成員(稱為NALPl至NALP14)。NALP3的突變導致自身炎性疾病家族性冷自身炎性症候群、穆-韋二氏症候群和新生兒發病多系統炎性疾病。NALP3的激活子包括胞壁醯二肽、細菌DNA、ATP、毒素、雙鏈RNA、副粘病毒和尿酸晶體。也已經顯示其他NLR如IPAF和NAIP5/Bircle應答於沙門氏菌和軍團桿菌而激活胱天蛋白酶1。NLR激動劑包括但不限於GM三肽(弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri))、內消旋羊毛硫氨酸(幽門螺旋桿菌)、內消旋DAP、y -D-Glu-DAP (iEDAP)(腸侵襲性大腸桿菌)、 D-乳醯基-L-ala-γ-Glu-內消旋-DAP-Gly (Π(156)(假單胞菌)、庚醯基-Y-Glu-內消旋-DAP-D-ala(FK565)(衣原體(Chlamydia)、單核李斯特菌(Listeria monocyotgenes))、 MDP(單核李斯特菌)、MurNAc-L-Ala-Y-D-Glu-L-Lys(M-TRILys)(肺炎鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌、Salmonella flexneri)、鞭毛蛋白、細菌RNA、ATP、奈及利亞菌素(Nigericin)、 Maitotoxin、尿酸晶體、氣單胞菌溶素(Aerolysin)和炭疽致死毒素。c. RIG樣受體(RLR)激動劑體內多種細胞能夠感受感染性病毒並啟動統稱為抗病毒先天應答的反應。這些應答包括產生抗病毒細胞因子(如I型幹擾素(IFN))，隨後合成抗病毒酶，其負責破壞病毒複製並促進適應性免疫應答。RIG(視黃酸誘導型基因)樣受體感受觸發先天免疫系統組分的病毒RNA分子。RLR的配體包括但不限於ssRNA、dsRNA、多聚肌苷-多聚胞嘧啶核苷酸(「p0ly(rI:rC)」、雙鏈RNA(dsRNA)的合成類似物和其他病毒核酸及其類似物，包括部分 RNA病毒基因組(例如，日本腦炎病毒(JEV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、流感病毒、登革熱病毒、西尼羅病毒、呼腸病毒和腦炎心肌炎病毒(EMCV))。RNA區段或類似物可以是至少20、 25、30、35、40或更多個核苷酸或核苷酸對或等同物。在某些方面，RNA是5』三磷酸RNA。d.(Leukocyte Immunoglobulin-Like receptor, LIR) 激動劑八種LIR-I相關分子(參閱Fanger等，1999和其中的參考文獻)(與LIR-I具有 63-84%的胺基酸同一性)的克隆建立了免疫受體的一個新家族(LIR)。UR可根據其結構來分組。五種UR(1、2、3、5和8)具有胞質結構域，其含有2、3或4個基於免疫受體酪氨酸 Wii^iJftS/!5 (Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM) 歹[J。 J^iW 基於酪氨酸的基序中的兩個0號和3號基序；I/VxYxxL/V)與原始的ITIM共有序列匹配， 但這些LIR中的一些含有基於酪氨酸的基序，其中天冬醯胺殘基(1號基序；NdxxL/V)或絲氨酸殘基G號基序；SxYxxL/V)定位在所述酪氨酸上遊兩個胺基酸處。與含有ITIM的 UR不同，三種LIR(6a、6b和7)含有短的胞質區，並在跨膜結構域中含有帶正電的精氨酸殘基。LIR 家族的成員結合 I 類 MHC 分子。IJR-I 和 LIR-2 識別 HLA_A(A0101、A0301)、 HLA-B (B0702, B0802, B150U B2702)和 HLA-C (C0304)等位基因和非典型 I 類分子 HLA-Gl。 LIR-I和LIR-2的結合特異性因此不同於KIR的結合特異性，後者識別相對有限的I類MHC 等位基因亞組以及⑶94/NKG2A。後一分子識別HLA-E，其結合口袋被來自特異性I類MHC 抗原的信號序列的肽佔據。2.微生物組分a. EF2505在某些方面，涉及在患有微生物感染或者有發生這種感染之風險的個體中治療、 抑制或減輕微生物感染的方法，所述方法包括向所述個體施用有效量的肽，例如糞腸球菌(Enterococcus faecalis)蛋白EF2505(SEQ ID NO 1)或其片段或衍生物。通常,所述個體或受試者已經接觸病原性微生物或者有這種接觸的危險。在某些方面，S R肽是純化的或分離的多肽或肽。術語「純化的」或「分離的」表示組分之前從其他蛋白質中分離出來或純化出來，並且所述組分在配製到組合物中之前的純度為至少約70、75、80、90、95、97 或99%。在某些實施方案中，純化的或分離的組分的純度為約或至少約95、96、97、98、99、 99. 1、99.2、99.3、99.4、99.5%或更高，或可從其中導出的任何範圍。這種純化的組分然後可以與其他組分混和，以形成如本文所述的組合物。重組蛋白(例如EF2505)或其片段或區段或其類似物包含SEQ ID NO :1的至少、至多或約 5、10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、1600 或 1651個連續胺基酸，包括其間所有值和範圍。在某些方面，其片段或類似物包含至少或至多或約這樣的胺基酸序列其來自SEQ ID NO 1的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120 位胺基酸到 100、150、200、250、300、350、355、360、365、370、375、380、390、395、400、401、402、403、 404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、 423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、 442、443、444、445、446、447、448、449、450位胺基酸，包括其間所有值和範圍。在另一方面， 其多肽片段或類似物包括但不限於這樣的胺基酸序列，其包含SEQ ID NO :1的至少、至多或約 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 位胺基酸到 440、441、442、443、444、445、446、447、 448,449,450位胺基酸。在某些方面，其多肽區段或片段或類似物包括但不限於這樣的胺基酸序列，其包含SEQ ID NO 1的至少或至多或約沘、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、250 位胺基酸到 440、441、442、443、444、 445、446、447、448、449、450位胺基酸，包括其間所有值和範圍。在再一方面，其多肽片段或類似物包含的胺基酸序列包含與SEQ ID NO 1的28到449,28到442,111到449,111到 442、223 到 449、或 223 到 442 位胺基酸具有至少 70、75、80、85、90、95、96、97、98、99 或 100% 同一性的胺基酸序列，包括其間所有值和範圍。蛋白質或其區段的衍生物或變體包括插入、缺失和點突變。一種特定的插入突變是融合蛋白，其在羧基端或氨基端包含對EF2505 蛋白質而言外源的胺基酸序列。在某些方面，StIR蛋白質或其片段或區段或衍生物在噴霧或氣霧製劑中施用。可通過吸入或吸氣施用所述組合物。乂頂或其衍生物的片段可以約0.01、0.05、0. 1、0.5、1、 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70μ g 或 mg/kg 到約 55、60、65、70、75、80、85、 90、95、100、125、150、200μ g或mg/kg個體體重的量施用。在另一些方面，可向受試者施用約 0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、
95、100、125、150、200μg或mg的多肽或肽或其變體或衍生物或類似物。基於以下公開內容，本領域技術人員能夠容易地確定乂頂多肽(例如糞腸球菌蛋白EF2505)的有用區段、片段或衍生物。在一個優選方面，片段、區段或衍生物與SEQ ID NO :1的序列具有至少 75%的同一性。在另一方面，片段、區段或衍生物與SEQ ID NO :1的序列具有至少80%的同一性。在另一方面，片段、區段或衍生物與SEQ ID NO :1的序列具有至少85%的同一性。 在另一方面，片段、區段或衍生物與SEQ ID NO :1的序列具有至少90%的同一性。在另一方面，片段、區段或衍生物與SEQ ID NO 1的序列具有至少95%的同一性。在又一實施方案中，本發明涉及可藥用組合物，其包含一種或多種乂頂多肽(例如，糞腸球菌蛋白EF250O或其片段或區段或衍生物或類似物；抗炎劑；抗微生物劑；和/ 或一種或多種藥物賦型劑。通常，此類組合物是無菌的並基本上不含病原性微生物。b.鞭毛蛋白在某些方面，乂頂組合物包含鞭毛蛋白多肽或其區段或衍生物，其包含稱為LTR5 激動劑的肽 QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA(SE Q ID NO 2)的 10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21或22個連續胺基酸。本發明的多肽也可包含與SEQ ID NO :2具有至少70、80或 90% (包括其間所有值和範圍)同一性的胺基酸序列。在另一些方面，鞭毛蛋白是合成的和/或純化的或分離的鞭毛蛋白多肽或肽。術語「純化的」或「分離的」表示組分是之前從其他蛋白質或合成試劑或副產物中分離或純化的，並且所述組分在配製到組合物中之前的純度為至少約95%。在某些實施方案中，純化的或分離的組分的純度為約或至少約80、95、
96、97、98、99、99.1,99. 2,99. 3,99. 4,99. 5 %或更高，或其中可導出的任何範圍。然後可將該純化的組分與其他組分混和，以形成本文所述的組合物。重組鞭毛蛋白或其片段或區段包含SEQ ID NO :2或其他鞭毛多肽的5、10、15、 20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、 350或400個連續胺基酸(包括其間所有值和範圍)。這些片段或區段與SEQ ID NO :2或其他鞭毛多肽具有至少、至多或約70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%的同一性。 在某些方面，鞭毛蛋白多肽或區段與SEQ ID NO :2的序列具有至少75%的同一性。在另一方面，鞭毛蛋白多肽或區段與SEQ ID NO :2的序列具有至少80%的同一性。在另一方面，鞭毛蛋白多肽或區段與SEQ ID NO :2的序列具有至少85%的同一性。在另一方面，鞭毛蛋白多肽或區段與SEQ ID NO :2的序列具有至少90%的同一性。在另一方面，鞭毛蛋白多肽或區段與SEQ ID NO :2的序列具有至少95%的同一性。鞭毛蛋白或其區段的衍生物或變體包括SEQ ID NO :2的插入、缺失和點突變。一種特定的插入突變是融合蛋白， 其在羧基端或氨基端包含對鞭毛蛋白而言外源的胺基酸序列。許多鞭毛蛋白為本領域所知，包括但不限於具有登錄號 BAB58984(gi 114278896) ； YP_001330159 (gi 1150402865)； YP_001323483 (giI 150399716) ；CAA28975 (gi|1333716) ；CAA02137 (gi|1567895)； CAA67105 (giI 1580779) ；AAR10473 (gi|38049688) ；CAR58992 (gi|197093531)； YP_001217666(gi1147675484) ；CAL12564(gi1122089712) ；BAD14977(gi|46093563)；或 CADO 5707 (gi 116503200)的鞭毛蛋白，均以援引方式將其在本申請優先權日期時的內容整體併入本文。c.微生物溶胞產物本發明的實施方案還包括可藥用組合物，其包含基本無病原性微生物的溶胞產物、抗炎劑和一種或多種藥物賦型劑，其中所述組合物是無菌的並且基本上不含病原性微生物。微生物溶胞產物通常是經超聲處理的；勻漿的；照射的；通過氣壓、呼吸、去汙劑或酶方法及其組合裂解的。在一個特定方面，在裂解之前、過程中或之後用UV照射微生物溶胞產物。微生物溶胞產物可包括但不限於細菌、真菌或病毒溶胞產物。在某些實施方案中，微生物溶胞產物是細菌溶胞產物。從中製備溶胞產物的微生物不一定是有毒微生物，並且通常不會是有毒微生物。本發明的方面包括來自對受試者的健康影響有限的細菌的溶胞產物。影響有限指在至少、至多或約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天時間裡對受試者的組織、器官或系統產生極低副作用和不顯著的損傷。本發明的組合物不需要直接來自要針對其進行保護或治療的有毒生物。細菌可來自嗜血桿菌屬(Haemophilus)，但不限於嗜血桿菌。可鑑定在受試者中構成最小副作用威脅的細菌。在某些方面，細菌是流感嗜血桿菌，特別是不可分型流感嗜血桿菌(NTHi) (Clement 等，2008 ；Clement 等，2009 ；Evans 等，2010 ；Tuvim 等，2009)。微生物溶胞產物的蛋白質濃度可為至少約、約或至多約0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3、3. 5、 4,4. 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8. 5、9、9· 5或10mg/ml，包括其間所有值和範圍。在某些方面，微生物溶胞產物的蛋白質濃度為至少約、約或至多約10mg/ml。本發明的實施方案包括可通過呼吸道施用的微生物溶胞產物。在某些方面，通過吸入施用。在另一方面，組合物是霧化的或是可被受試者吸入的形式。在某些實施方案中， 溶胞產物組合物包含抗炎劑，包括類固醇類和非類固醇類抗炎藥(NSAID)。對於其他細節， 參閱美國專利申請 11/830，622 "Compositions and methods for stimulation of lunginnate immunity」Dickey等，以援引方式整體併入本文。B.宿主或自身組分來自受試者或宿主的細胞和組織的許多分子可刺激、增強或促進免疫應答的產生。這些部分稱為宿主或自身部分或組分，包括從受傷的、受脅迫的或瀕死細胞中釋放的小分子；參與微生物殺傷或中和的組分；細胞因子；和從細胞或組織釋放的大分子。1.小分子宿主化合物與受傷的、受脅迫的或瀕死的細胞相關或從中釋放的小分子如腺苷5』 -三磷酸 (ATP)、尿酸(尿酸鹽)和腺苷。許多這些分子的受體及其調節炎症的途徑已經充分確定。 炎症是免疫系統針對感染或刺激作出的第一應答之一。炎症由受傷細胞所釋放的化學因子刺激，並且作用於建立針對感染擴散的物理屏障，並在清除病原體後促進任何損傷組織的癒合。炎症過程中產生的化學因子(組胺、緩激肽、血清素、白三烯，還有前列腺素)使疼痛受體敏感，引起患處血管舒張，並吸引吞噬細胞，特別是嗜中性粒細胞。嗜中性粒細胞然後通過釋放召集其他白細胞和淋巴細胞的因子來觸發免疫系統的其他部分。可包含在本發明組合物中的小分子宿主組分包括ATP、腺苷、組胺、緩激肽、 血清素、白三烯、前列腺素。2.胞外宿主部分在指導微生物殺傷和/或信號轉導中起作用的胞外宿主蛋白如補體、正五聚蛋白、防禦素和cathelicidin。這些分子經常組成型存在，但直至它們通過與微生物產物結合或被蛋白水解切割或一些其他激活機制而激活後才進行信號轉導。此外，其產生可以提高。 在某些方面，這些蛋白質處於激活形式(體外激活或加工，或通過改造蛋白質)。補體系統是幫助從生物體中清除病原體的生物化學級聯。補體系統是非適應性且不在個體一生中發生改變的更大免疫系統的一部分；因此其屬於先天免疫系統。然而，其可通過適應性免疫系統募集並發揮作用。補體系統由在血液中發現的許多小蛋白質組成，通常作為無活性酶原的形式循環。當受幾種觸發劑之一刺激時，該系統中的蛋白酶切割特定蛋白質，以釋放細胞因子並啟動進一步切割的放大級聯。該激活級聯的最終結果是應答的大規模放大和細胞殺傷性膜攻擊複合物的激活。超過20種蛋白質和蛋白質片段組成了補體系統，包括血清蛋白質、漿膜蛋白質和細胞膜受體。這些蛋白質主要在肝中合成，它們佔血清球蛋白級分的約5%。可包括在乂頂組合物中的補體系統組分包括但不限於Cl-複合物(Clq、Clr、Cls 和 Clqr2s2)、Clr2s2、C4、C2、C4a、C4b、C2a、C2b C3-轉化酶(C4b2a 複合物)、C3a、C3b ； C5轉化酶(C4bC2aC3b複合物)、衰變加速因子(DAF)、因子B、C3bB、因子D、Ba、Bb、C3bBb、 C3bBbC3b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9，和膜攻擊複合物(membrane attack complex, MAC) (C5b6789)。正五聚蛋白是通常具有鈣依賴性配體結合和特徵性扁平凝膠捲結構(與豆科凝集素的結構類似)的蛋白質家族。「短」正五聚蛋白包括血清澱粉樣P成分(SAP)和C反應蛋白(CRP)。「長」正五聚蛋白包括PTX3(細胞因子調節的分子)和幾種神經正五聚蛋白。防禦素是在脊椎動物和無脊椎動物中均存在的小的富含半胱氨酸的陽離子蛋白質。它們對細菌、真菌和許多有被膜的和無被膜的病毒有活性。它們由18-45個胺基酸組成，包括6個(在脊椎動物中)到8個保守半胱氨酸殘基。免疫系統的細胞含有這些肽，以幫助殺死例如嗜中性粒細胞和幾乎所有上皮細胞中被吞噬的細菌。大多數防禦素通過與微生物細胞膜結合而發揮作用，並且一旦嵌入，就形成孔樣膜缺損，其允許必需的離子和營養物流出。可包含在本發明組合物中的防禦素包括但不限於α-防禦素(DEFA1、 DEFA1A3、DEFA3 禾口 / 或 DEFA4)、β -防禦素(DEFB1、DEFB4、DEFB103A/DEFB10;3B 至 DEFB107A/ DEFB107B、DEFBl 10 至 DEFB133)、和 / 或 θ -防禦素(DEFTlP)。Cathelicidin抗微生物肽是存在於多形核白細胞(PMN)的溶酶體中的多肽家族。Cathelicidin家族抗微生物多肽的成員的特徵在於具有高度保守的區域(cathelin 結構域)和高度可變的cathelicidin肽結構域。已經從許多不同的哺乳動物物種中分離了 cathelicidin肽。Cathelicidin最初在嗜中性粒細胞中發現，但自此從許多其他細胞(包括被細菌、病毒、真菌或激素1，25-D激活的巨噬細胞和上皮細胞)中也發現了 cathelicidiruCathelicidin家族與組織蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶抑制劑具有一級序列同源性，儘管一般缺少認為在該蛋白酶抑制中具有重要性的胺基酸殘基。3.細胞因子細胞因子是廣泛用於細胞通訊的一類信號分子。它們是蛋白質、肽或糖蛋白。術語細胞因子包括大且多樣的多肽調節子家族，其由全身不同胚胎起源的細胞廣泛產生。細胞因子的作用可以是自分泌、旁分泌和內分泌。細胞因子對先天性和適應性免疫應答的發生和功能至關重要，儘管不限於僅僅免疫系統。它們經常由遇到病原體的免疫細胞分泌，由此激活並募集其他免疫細胞，以增強系統對該病原體的應答。細胞因子刺激先天免疫細胞(特別是上皮細胞)的抗微生物防禦，如IL-17、 IL-22、IFN-y。在某些情況下，這代表了適應性先天免疫系統對先天炎症的放大，如Thl7細胞產生1L-17時。在另一些情況下，細胞因子由不作為適應性免疫系統一部分的細胞釋放， 例如上皮細胞、間充質細胞或樹突細胞。可包含在本發明組合物中的細胞因子包括IL-I超家族l((IL-lRa)、IL_18、 IL-33) ；IL-6 樣/gpl30 利用家族(IL-6、IL-IU IL-27、IL-30、IL-31、制瘤素 M、白血病抑制因子、睫狀節神經細胞營養因子、Cardiotrophin 1) ；IL-10家族(IL-10、IL-19、IL-20、 IL-22、IL-24、IL-26)；幹擾素類型 III (IL-28、IL-29)；常見的 Y-鏈家族(IL-2/15、 IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-21) ； IL-12 家族(IL-12、IL-23、IL-27、IL-35)、IL-5 ； IL-8 ； IL-14 ； IL-16 ； IL-17/25 ； IL-32 ；CCL 趨化因子(CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、 CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、 CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28) ；CXCL 趨化因子(CXCL1、 CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、 CXCL14,CXCL15,CXCL16,CXCL17) ；CX3CL-1 ；XCLl ；XCL 2 ；TNF (配體)超家族(4-1BB 配體、 B細胞激活因子、FAS配體、淋巴細胞毒素、0X40L、RANKL, TRAIL)；分化細胞因子簇(⑶70、 CD153、CD154)；幹擾素(IFN-I α (PEG 化的 2a、PEG 化的 2b)、IFN-I β (IaUb)), IFN-II γ , 和 IFN-III。4.大分子宿主部分大分子或其片段可從胞外基質、細胞表面或細胞內部釋放，並激活先天免疫的信號轉導，如dectin、多功能蛋白聚糖(versican)、HMGB-I、DNA和RNA。通常，這些大分子在正常情況下被隱藏起來而不與靶受體接觸，這是隱藏在細胞內部或者通過分子內或分子間相互作用掩蔽。細胞破裂後或者基質的細胞表面蛋白水解而顯示出信號部分(或一些相似機制)後，它們被釋放出來與靶受體相互作用。II.多肽和肽組合物在某些實施方案中，本發明涉及至少一種多肽或肽(例如，多肽區段)或其衍生物或變體。如本文所用，「蛋白質」、「多肽」、「肽」、「多肽或肽組合物」或「多肽或肽化合物」 一般指(但不限於)至少5個胺基酸或胺基酸類似物(全部氨基分子，見下文)的蛋白質或多肽。上文描述的所有「多肽或肽」術語在本文中可互換使用。在某些實施方案中，所述至少一種多肽或肽分子的大小可包括但不限於這樣的分子，其具有至少、至多或約 5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、40、50、100、500、1000 至約 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 M、25J6、27J8、29、30、40、50、100、500或更多個胺基酸殘基，以及其中可引出的任何值或範圍。本發明包括本文討論的任何序列的連續胺基酸或其類似物的那些長度。多肽或肽的區段或片段包括本文公開的或提到的序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、350、400、450 位胺基酸至 10、15、20、30、 40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600 位胺基酸(包括其間所有值和範圍)。如本文所用，「氨基分子」指本領域普通技術人員已知的任何胺基酸、胺基酸衍生物或胺基酸模擬物。在某些實施方案中，多肽或肽分子的殘基是連續的，沒有任何非氨基分子中斷氨基分子殘基的序列。在另一些實施方案中，序列可包含一個或多個非氨基分子部分。在某些實施方案中，多肽或肽分子的殘基序列可被一個或多個非氨基分子部分中斷。因此，術語「多肽或肽組合物，，包括這樣的氨基分子序列，其包含天然合成的蛋白質中20種常見胺基酸中的至少一種，或至少一種修飾的或稀有的胺基酸。在某些實施方案中，多肽或肽組合物包含至少一種蛋白質、多肽或肽。在涉及TLR 激動劑組合物的方法中，多肽或肽可具有鞭毛蛋白多肽(如SEQ ID NO :2或同源多肽)的全部或部分胺基酸序列。在某些實施方案中，含有蛋白質、多肽或肽的組合物一般是各自基本上不含毒素、病原體和有害免疫原的蛋白質或肽或者合成的蛋白質或肽。在某些方面，多肽是重組的或合成的胺基酸序列。多肽或肽組合物可通過本領域技術人員已知的任何技術來製備，包括通過標準分子生物學技術表達蛋白質、多肽或肽，從天然來源分離多肽或肽，或者化學合成多肽或肽材料。可使用本文公開的或本領域普通技術人員已知的技術擴增和/或表達這些多肽或肽的編碼區。或者，蛋白質、多肽和肽的多種商品化製劑為本領域技術人員所知。在某些實施方案中，多肽或肽組合物可以是純化的。一般地，「純化的」指已經經過分級分離而去除多種其他蛋白質、多肽、肽和其他分子和化合物的特定的蛋白質、多肽或肽組合物，並且所述組合物基本上保留了其活性，這可通過例如本領域普通技術人員已知的用於特定的或期望的蛋白質、多肽或肽的蛋白質測定來評估。基本上含有任何蛋白質、多肽或肽的組分均可考慮用於本文公開的組合物和方法中。在某些實施方案中考慮的是，氣霧劑製劑或噴霧的或霧化的或可噴霧的組合物可允許組合物通過吸入、呼吸等更精確或更容易地應用到呼吸系統。
A.多肽或肽變體和衍生物本發明的蛋白質、多肽和肽的胺基酸序列變體或衍生物可以是替換、插入或缺失變體，以及包括胺基酸類似物或衍生物。缺失變體缺少天然蛋白質中對功能或免疫原性活性不是至關重要的一個或多個殘基。另一常見類型的缺失變體是缺少分泌信號序列或指導蛋白質結合至細胞的特定部分的信號序列，或者跨膜區或體內活性不需要的其他功能序列。插入突變體通常包括在多肽的非末端位點上添加物質。這可包括插入免疫活性表位或僅插入單個殘基。在下文中討論了末端添加，稱為融合蛋白。替換變體通常在多肽或肽的一個或多個位點上含有一個胺基酸與另一胺基酸的替換，並可設計來調節一種或多種特性，如對蛋白水解切割的穩定性，但不喪失其他功能或特性。這種類型的替換優選是保守的，即將一個胺基酸替換為具有相似形狀和電荷的胺基酸。保守替換為本領域所熟知，並包括例如以下的改變丙氨酸變成絲氨酸；精氨酸變成賴氨酸；天冬醯胺變成穀氨醯胺或組氨酸；天冬氨酸變成穀氨酸；半胱氨酸變成絲氨酸；穀氨醯胺變成天冬醯胺；穀氨酸變成天冬氨酸；甘氨酸變成脯氨酸；組氨酸變成天冬醯胺或穀氨醯胺；異亮氨酸變成亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸變成纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸變成精氨酸；甲硫氨酸變成亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸變成酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；絲氨酸變成蘇氨酸；蘇氨酸變成絲氨酸；色氨酸變成酪氨酸；酪氨酸變成色氨酸或苯丙氨酸；纈氨酸變成異亮氨酸或亮氨酸。術語「生物功能等同物」為本領域所熟知，並在本文中進行了進一步詳細定義。因此，生物功能等同物會具有這樣的序列，其中約70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%的胺基酸與多肽或肽或其變體或類似物或衍生物的胺基酸相同或功能等同，並提供相似的生物活性/對鞭毛蛋白或其他TLR激動劑的應答。以下是基於改變多肽或肽的胺基酸來產生等同的(或甚至改善的)第二代分子的討論。例如，多肽或肽中的某些胺基酸可替換成其他胺基酸，而不明顯喪失特定活性，如免疫應答的增強。因為通常限定蛋白質功能活性的是多肽或肽的相互作用能力和特性，所以可在多肽或肽序列以及其相應DNA編碼序列中進行某些胺基酸替換，但產生具有相似特性的蛋白質。因此，本發明人考慮在編碼本發明的多肽或肽的DNA序列中進行多種改變，但不明顯喪失其生物效用或活性，如下文所討論。在產生這些改變時，可考慮胺基酸的親水指數。親水胺基酸指數在賦予蛋白質相互作用生物功能中的重要性一般為本領域所理解(Kyte&Doolittle，1982)。公認的是，胺基酸的相對親水特徵決定了所得蛋白質的二級結構，其繼而限定了蛋白質與其他分子、細胞、 組織等(例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原、免疫細胞和系統等)的相互作用。本領域中也應理解的是，可在親水性基礎上有效地進行相似胺基酸的替換。以援引方式併入本文的美國專利4，554，101描述，蛋白質的最高局部平均親水性(由臨近胺基酸的親水性決定)與蛋白質的生物學特性相關。如美國專利4，554，101中詳細描述，已為胺基酸殘基賦予以下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0士1)；穀氨酸(+3.0士1)；絲氨酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；穀氨醯胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5 士 1)；丙氨酸(-0. 5)；組氨酸；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸 (-2. 5)；色氨酸(-3. 4)。
也應理解的是，胺基酸可替換成具有相似親水性值的另一胺基酸，但仍然產生生物學等同且免疫學等同的蛋白質。在這種改變中，優選其親水性值在士2內的胺基酸替換， 特別優選其親水性值在士 1內的那些，甚至更優選其親水性值在士0. 5內的的那些。如上文指出，胺基酸替換一般基於胺基酸側鏈取代基的相對相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。將多種上述特徵考慮在內的示例性替換為本領域技術人員所熟知，包括精氨酸和賴氨酸；穀氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；穀氨醯胺和天冬醯胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。也可修飾本發明多肽或肽化合物的內部胺基酸和/或氨基端和/或羧基端，以產生本發明的其他化合物，即多肽或肽衍生物。氨基端修飾包括甲基化(例如，-NHCH3 或-N (CH3) 2)、乙醯化(例如，用乙酸或其滷代衍生物，如α-氯乙酸、α-溴乙酸或α-碘乙酸)、添加苄氧羰基(Cbz)，或用含有以RCOO-定義的羧酸官能團或R-SO2-定義的磺醯官能團及相似基團的任何封閉基封閉氨基端，其中R選自烷基、芳基、雜芳基、烷基芳基等。也可以在N端摻入無氨基的酸(從而沒有N端氨基)，以降低對蛋白酶的敏感性或限制多肽或肽化合物的構象。羧基端修飾包括用甲醯胺基團替換游離酸或在羧基端形成環形內醯胺，以引入結構限制。也可使本發明的肽環化，或在肽的末端摻入無氨基或無羧基的殘基，從而沒有末端氨基或羧基，來降低對蛋白酶的敏感性或限制肽的構象。本發明化合物的C端官能團包括醯胺、醯胺低級烷基、醯胺二(低級烷基)、低級烷氧基、羥基和羧基，及其低級酯衍生物和可藥用鹽。可將20種遺傳編碼胺基酸(或立體異構體D胺基酸)的天然側鏈替換為其他側鏈，例如用諸如烷基、低級烷基、環狀4、5、6到7員烷基、醯胺、醯胺低級烷基、醯胺二(低級烷基)、低級烷氧基、羥基、羧基及其低級酯衍生物的基團以及用4、5、6至7員雜環。具體而言，可使用脯氨酸類似物，其中脯氨酸殘基環大小從5員變成4、6或7員。環狀基團可以是飽和的或不飽和的，如果是不飽和的可以是芳族的或非芳族的。雜環基團優選含有一個或多個氮、氧和/或硫雜原子。此類基團的實例包括呋吖基(furazanyl)、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、異噻唑基、異ρ惡唑基、嗎啉基(例如嗎啉代)、P惡唑基、哌嗪基(例如 1-哌嗪基)、哌啶基(例如1-哌啶基、哌啶代(piperidino))、吡喃基、吡嗪基、批唑烷基、批唑啉基、吡唑基、噠嗪基、批啶基、嘧啶基、批咯烷基(例如1-吡咯烷基)、吡咯啉基、批咯基、 噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代嗎啉基(例如硫代嗎啉代(thiomorpholino))和三唑基。這些雜環基團可以是取代的或未取代的。基團是取代的時，取代基可以是烷基、烷氧基、滷素、 氧，或者取代或未取代的苯基。也可通過磷酸化和其他方法(例如Hruby等(1990)中所述)便利地修飾多肽或肽。本發明的肽化合物也作為結構模塊用於具有相似生物活性的非肽化合物。本領域的技術人員公認的是，可使用多種技術來構建這樣的化合物，其與前導肽化合物具有相同的或相似的期望生物活性，但在溶解度、穩定性和對水解和蛋白質水解的敏感性方面比前導肽化合物具有更有利的活性(參閱，Morgan和Gainor，1989)。這些技術包括將肽骨架替換為由磷酸酯、醯胺化物、氨基甲酸酯、磺醯胺、仲胺和N-甲基胺基酸組成的骨架。此外，本發明的化合物可含有一個或多個分子內二硫鍵。在一個實施方案中，肽單體或二聚體包含至少一個分子內二硫鍵。在一些優選的實施方案中，肽二聚體包含兩個分子內二硫鍵。可通過使肽核心序列中的半胱氨酸殘基氧化形成該二硫鍵。在一個實施方案中，通過選擇有效優化期望的異構體形成的氧化劑類型和濃度來實施半胱氨酸鍵形成的控制。例如，當氧化劑是DMSO時，優先完成(與形成分子間二硫鍵相比)肽二聚體的氧化，以形成兩個分子內二硫鍵(在每條肽鏈上各有一個)。在某些實施方案中，通過在肽合成過程中選擇性使用巰基保護基來控制半胱氨酸鍵的形成。本發明的另一些實施方案提供這些二硫化物衍生物的類似物，其中一個硫已經被 CH2基團或硫的其他電子等排體替換。可使用本領域已知的方法，通過分子內或分子間置換，由本發明化合物製備這些類似物，其中每一核心序列含有至少一個Cys(C)或高半胱氨酸殘基以及代替第二個C殘基的α-氨基-γ-丁酸(參閱例如，Barker等，1992和Or等， 1991)。本領域技術人員會容易地理解，也可使用α-氨基-Y-丁酸和高半胱氨酸的其他同源物進行該置換。除了上述環化策略，也可使用其他非二硫化物肽環化策略。此類備選環化策略包括例如醯胺環化策略以及涉及硫醚鍵形成的那些策略。因此，本發明的化合物可以具有分子內醯胺鍵或分子內硫醚鍵的環化形式存在。例如，可合成肽，其中核心序列的一個半胱氨酸被賴氨酸替換，第二個半胱氨酸被穀氨酸替換。然後，可通過這兩個殘基的側鏈之間的醯胺鍵來形成環狀單體。或者，可合成肽，其中核心序列的一個半胱氨酸被賴氨酸替換。然後通過賴氨酸殘基的側鏈與核心序列的第二個半胱氨酸殘基之間的硫醚連接來形成環狀單體。這樣，除了二硫化物環化策略外，還可容易地使用醯胺環化策略和硫醚環化策略，來環化本發明的化合物。或者，可用α-取代的乙酸給肽的氨基端加帽，其中α-取代基是離去基團，如α -滷代乙酸，例如，α-氯乙酸、α-溴乙酸或α-碘乙酸。下文說明書中包括的2004年5月12日提交的美國專利申請序列號10/844,933 以援引方式整體併入本文。水溶性聚合物如聚乙二醇(PEG)可用於共價修飾具有治療重要性的多肽或肽。認為這類聚合物的附著增強了生物活性、提高了水溶性，並增強對蛋白酶消化的抗性。例如，已經報導，PEG共價附著到治療性多肽，如白細胞介素(Knauf，等，1988; 15064 ；Tsutsumi 等，1995)、幹擾素(Kita 等，1990)、過氧化氫酶(Abuchowski 等，1977，超氧化物歧化酶(Beauchamp等，1983，和腺苷脫氨酶(Chen等，1981)上延長了它們在體內的半衰期，和/或降低了它們的免疫原性和抗原性。本發明的化合物還可包含一個或多個水溶性聚合物部分。優選地，這些聚合物共價附著到該化合物上。水溶性聚合物可以是例如聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊烷、聚-1，3，6-三巧惡烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(同聚物或隨機共聚物)、聚(η-乙烯吡咯酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚氧丙烯/氧乙烯共聚物和聚氧乙烯化多元醇。可使用多種化學方法中的任何方法將本發明的化合物附著到水溶性的聚合物上 (例如，PEG)，以將水溶性聚合物連接到分子的受體結合部分上(例如，肽+間隔區)。典型的實施方案使用單個附著接點，用於將水溶性聚合物共價附著到受體結合部分上，然而在一些備選實施方案中，可使用多個附著接點，包括其他變異，其中不同種類的水溶性聚合物在不同的附著接點上附著到受體結合部分，其可包括共價附著接合到間隔區和/或一條或兩條肽鏈上。
PEG試劑包括但不限於 mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、多臂 PEG、mPEG (MAL) 2、mPEG2 (MAL)、 mPEG-NH2、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG-硫酯、mPEG-雙酯、mPEG-BTC、mPEG-ButyrALD、 mPEG-ACET、異功能化的 PEG (NH2-PEG-C00H、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、NHS-PEG-VS、 NHS-PEG-MAL)、PEG 丙烯酸酯(ACRL-PEG-MB)、PEG-磷脂(例如 mPEG-DSPE)、SUNBRITE 系列的多臂PEG，包括通過本領域技術人員選定的化學法激活的基於甘氨酸的PEG的GL系列、任何SUNBRITE激活的PEG (包括但不限於羧基-PEG、p-NP-PEG、Tresyl-PEG、醛PEG、 縮醛-PEG、氨基-PEG、巰基-PEG、馬來醯亞胺-PEG、羥基-PEG-胺、氨基-PEG-C00H、羥基-PEG-醛、羧酸酐型-PEG、功能化的PEG-磷脂，和本領域技術人員根據其特定應用和使用選擇的其他類似和/或合適的活性PEG)。附著的聚合物分子的數量可變化；例如，可將1、2、3或更多個聚合物附著到本發明的多肽或肽上。多個附著的聚合物可以是相同或不同的化學部分(例如，不同分子量的 PEG)。在一些情況下，附著反應中聚合物分子與肽分子的比例以及反應混合物中每一種的總濃度可影響聚合物附著的程度(附著到肽上的聚合物部分的數量和/或附著有聚合物的肽的總數)。一般而言，聚合物與肽的最佳比例(就反應效率而言，不提供過量的未反應肽和/或聚合物部分)將基於以下因素確定如聚合物附著的期望程度(例如，單、二、三等)、 所選聚合物的分子量、聚合物是分支的還是不分支的，以及具體附著方法的反應條件。在另一些方面，可通過添加水不溶性聚合物對本發明化合物進行衍生。代表性水不溶性聚合物包括但不限於聚磷腈(polyphosphazine)、聚乙烯醇、聚醯胺、聚碳酸酯、 聚亞烴基(polyalkylene)、聚丙烯醯胺、聚烷基二醇、聚氧化乙烯、聚對苯二甲酸亞烷基酯 (polyalkylene ter印hthalate)、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯滷代物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚矽氧烷、聚氨基甲酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸異丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸異癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸異丙酯、聚丙烯酸異丁酯、聚丙烯酸十八酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚對苯二甲酸亞乙酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、普流羅尼和聚乙烯苯酚及其共聚物。用於本發明衍生物的合成修飾的天然聚合物包括但不限於烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯和硝酸纖維素。廣泛類型的合成修飾天然聚合物的成員包括但不限於甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、醋酞纖維素、羧甲基纖維素、三醋酸纖維素、纖維素硫酸鈉鹽以及丙烯酸和甲基丙烯酸酯和褐藻酸的共聚物。在某些方面，可通過添加糖基或修飾的糖來修飾或衍生本發明的多肽或肽。本發明提供多肽和肽衍生物，其含有修飾的糖、修飾的糖核苷酸和修飾的糖的綴合物。在本發明的修飾的糖化合物中，糖部分優選為糖、脫氧糖、氨基糖或N-醯基糖。術語「糖」及其等同物「糖基」指單體、二聚物、寡聚物和多聚物。也可利用修飾基團使糖部分功能化。修飾基團通常通過與糖部分上的胺、巰基或羥基(例如伯羥基)綴合而綴合到糖部分上。在一個實施方案中，修飾基團通過糖上的胺部分(例如通過醯胺、氨基甲酸乙酯或尿素(其通過胺與修飾基團的活性衍生物的反應而形成))附著。任何糖均可用作本發明綴合物的糖。此類糖包括但不限於葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖和唾液酸。其他有用的糖包括氨基糖，如葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、唾液酸的5-胺類似物等。糖可以是自然界中發現的結構，或可被修飾以提供用於綴合額外的修飾基團的位點。本領域的技術人員會認識到，所述結構和組合物可一般性地應用到不同種類的糖基、修飾糖基、活化的修飾糖基和修飾糖基綴合物中。III.肺防禦的刺激本發明人已經使用小鼠作為肺微生物感染的模型。在某些研究中，未處理的小鼠具有100 %的死亡率，但經處理的小鼠受到高度保護。不希望受到任何特定機制或理論的約束，相信保護是由於局部防禦或先天免疫的激活。已經測定了受試者單次和重複接觸本發明組合物的效應，並沒有觀察到明顯的嚴重病理學，如過早死亡、體重減輕或行為改變。本發明的一個非限制性益處是其可以快速並便利地遞送並產生效果。同樣，所述組合物可以經濟地大量生產並易於保存，並可被人容易地轉運到醫院環境外。通常，本發明組合物的施用和本發明的方法導致甚至在細胞進入前對侵入病原體的有至少一定的殺傷或抑制。在一些病原體通過逃脫胞外殺傷而進入細胞或者在病原體接觸後(先行性)而不是病原體接觸前(預防性)施用組合物的情況下，考慮所述組合物和相關方法促進因肺中增強或放大的局部應答而引起的胞內殺傷。考慮所述組合物和相關方法針對多種呼吸道病原體具有或產生保護性或治療性應答。乂頂組合物給予個體的保護或治療可因呼吸道抗微生物機制的廣泛活性而延伸至額外的微生物病原體類別，包括革蘭氏陰性菌、胞內細菌、真菌和病毒。本申請中描述的試劑會簡化對抗措施的貯存和部署。同樣，本發明的組合物和方法會排除生物武器攻擊或其他接觸或潛在接觸事件過程中快速鑑定特定病原體的困難。此外，生產和購買在多種民用和生物防禦情況下具有應用性的試劑的經濟效益是顯著的。增強局部上皮機制在經常患有嗜中性粒細胞減少症或適應性免疫功能受損的受試者(例如免疫力降低的受試者)中尤具吸引力。該方法通常在局部而非全身起作用，並針對多種病原體提供廣泛效應。該效應是快速的，並在生物防禦、醫學和流行病情況下有吸引力。在沒有適應性免疫疫苗可用的流感或緊急呼吸病毒流行過程中增強正常宿主中肺的先天防禦能力是有價值的。有突現或耐藥生物的細菌爆發也可能是這樣的情況，其中增強先天肺防禦是有用的。同樣地，在流行病過程中對醫護人員的保護可以利於照顧患者， 限制擴散。社區中的許多人針對感染的防禦長期降低，如患有糖尿病的患者和由於自身免疫病或防止移植排斥而服用免疫抑制藥物的患者。這些人在流行過程中或接觸微生物的可能性升高的時候可能尤其受益於肺防禦的增強。甚至更驚人的是，進行化學治療的癌症患者 (其具有暫時但嚴重的免疫防禦降低)可受益於暫時保護。肺炎在這些患者經常發生，並且是感染性死亡的首要因素。許多化學治療藥物(如烷化劑和核苷類似物)引起嚴重的暫時性嗜中性粒細胞減少症。最初，嗜中性白細胞減少症患者易感於由來自正常宿主中可見的生物以及低毒性的細菌(如嗜麥芽糖寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia))導致的細菌性肺炎。嗜中性粒細胞減少症延長時，患者開始易感於低毒力真菌(尤其是麴黴屬物種)的感染。可刺激肺的防禦，以在嗜中性粒細胞減少症的延長期提供暫時保護。其他癌症患者(如接受氟達拉濱或抗淋巴細胞抗體的那些患者，或在造血幹細胞移植後接受神經鈣蛋白抑制劑和類固醇的那些患者)的適應性免疫受到損傷。這些患者也可受益於肺免疫的斷續式刺激，以針對氣道內定殖的真菌和細菌的侵襲提供保護，或針對流行性病毒的侵襲提供保護。季節性呼吸道「感冒」病毒(如副流感病毒和RSV)的社區性爆發可在這些缺乏抵抗力的患者中引起致死性肺炎，並且可快速地從鼻涕中鑑定出許多這些病毒的感染。感染後，微生物的識別主要由先天免疫細胞上稱為模式識別受體(PRR)的一組種系編碼分子來介導(Medzhitov和Janeway，1997)。這些模式識別受體表達為膜結合的或可溶性的蛋白質，其識別恆定的分子結構，稱為病原體相關的分子模式(PAMP) (Janeway 和MedzhitOV，2002)。病原體相關的分子模式是獨特的、保守的，並且必要的微生物組分 (如 LPS)在結構上不同於宿主分子(Medzhitov 和 Janeway，1997 Janeway 和 Medzhitov， 2002)。大多數多細胞生物具有「先天免疫系統」，其在生物一生中不發生改變。相反，適應性免疫是在個體一生中改變並發生的對病原體的應答。具有適應性免疫的生物也具有先天免疫，並且因為系統之間的許多機制是共同的，因此並不是總可以在參與各免疫性的各組分之間勾畫出清晰和快速的界限，儘管在運作上有明顯的差別。高等脊椎動物和所有的哺乳動物都同時具有先天免疫系統和適應性免疫系統。A.先天免疫系統適應性免疫系統可在初次感染後幾天或幾周具有效果。然而，大多數生物處於病原體的持續襲擊下，必須通過更快反應的先天免疫系統對其進行壓制。先天免疫通過「先天」機制協調的快速應答來防禦病原體，所述「先天」機制識別廣泛的保守性病原體組分。 對先天免疫的大多數研究著眼於白細胞，如嗜中性粒細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞。然而，上皮細胞在先天性防禦中起關鍵作用，其包括提供微生物進入的機械屏障、向白細胞進行信號轉導，並直接殺死病原體。重要的是，所有這些防禦可應答於對微生物和宿主產物的感知而被高度誘導。在健康的肺中，先天免疫上皮功能為基線低水平。這由低水平的自發微生物殺傷和細胞因子釋放來表示，反映了當粘液纖毛清除機制有效工作時幾乎無菌的下呼吸道中的持續性低刺激。這與結腸相反，這裡細菌持續存在，並且上皮細胞被持續激活。 儘管肺表面呈現為微生物侵入的大靶標，但沉積的病原體附近的活化的肺上皮細胞理想地排布以進行微生物殺傷。(參閱Evans等，2010)。植物和許多低等動物不具有適應性免疫系統，而是依賴於其先天免疫。微生物和非微生物來源的物質都能夠刺激先天免疫應答。先天免疫系統在活化後具有廣泛的效應細胞和機制。有幾種不同類型的吞噬細胞，其攝取並破壞侵入病原體。最常見的吞噬細胞是嗜中性粒細胞、巨噬細胞和樹突細胞。 另一細胞類型(自然殺傷細胞)尤其善於破壞病毒感染的細胞。先天免疫系統的另一組分稱為補體系統。補體蛋白質通常是血液的無反應性組分。然而，當被病原體或抗體識別激活時，多種蛋白質被活化以募集炎性細胞，包裹病原體以使得它們更容易被吞噬，並在病原體的表面上形成破壞性的孔。「第一線」防禦包括對感染的物理和化學屏障，如皮膚以及消化道和氣道的粘液包被，在物理上防止宿主與病原體之間的相互作用。穿透這些屏障的病原體遇上限制感染的組成型表達的抗微生物分子(例如，溶菌酶)。「第二線」防禦包括吞噬細胞(巨噬細胞和嗜中性粒細胞)，其可吞食(吞噬)外來物質。
吞噬作用涉及趨化，其中通過趨化化學物質(如微生物產物、補體、損傷細胞和白細胞碎片)將吞噬細胞吸引到微生物上。趨化後是粘著，其中吞噬細胞粘在微生物上。通過調理作用增強粘著，其中蛋白質(如調理素)包被在細菌表面上。這之後是消化，其中吞噬細胞伸出突起，形成吞食外來生物的偽突起。最後，溶酶體內的酶(包括活性氧簇和蛋白酶)將病原體消化。此外，如果病原體穿過了物理屏障，抗微生物蛋白質則可被激活。有幾類抗微生物蛋白質，如急性期蛋白質(例如，C反應蛋白，當其與肺炎鏈球菌的C蛋白結合時增強吞噬並激活補體)、溶菌酶和補體系統。補體系統是非常複雜的一組血清蛋白質，其以級聯方式被活化。補體活化涉及三條不同的途徑(a)經典途徑，其識別抗原-抗體複合體，(b)替代途徑，其與病原性細胞表面接觸後自發地活化，和(c)甘露糖結合凝集素途徑，其識別甘露糖，其通常僅在病原性細胞表面上出現。補體活化後是蛋白質活性的級聯；該級聯可產生多種效應，包括病原體的調理作用、膜攻擊複合體的形成和激活對病原體的破壞作用和炎症。幹擾素也是抗微生物蛋白質。這些分子是病毒感染的細胞分泌的蛋白質。這些蛋白質然後快速擴散到鄰近細胞，誘導這些細胞抑制病毒感染的擴散。實際上，這些抗微生物蛋白質的作用是防止病毒的細胞至細胞擴增。B.適應性免疫系統適應性免疫系統(也稱為「獲得性免疫系統」)保證在病原體初次感染後存活的大多數哺乳動物一般對相同病原體引起的進一步疾病具有免疫力。適應性免疫系統基於稱為白細胞(白血球)的專門免疫細胞，其由骨髓中的幹細胞產生，並在胸腺和/或淋巴結中成熟。在許多物種(包括哺乳動物)中，適應性免疫系統可分為(a)體液免疫系統，其通過B 細胞產生稱為免疫球蛋白(也稱為抗體)的蛋白質對體液(例如，血液)中的細菌和病毒起作用；和(b)細胞免疫系統，其通過T細胞(也稱為「T淋巴細胞」；「T」表示它們在胸腺中發生)破壞病毒感染的細胞(還發揮其他功能)。適應性免疫系統通常指向特定病原體， 例如疫苗接種。IV.微生物本發明的實施方案包括針對多種病原體或潛在病原體(例如，NIAID類別A、B和 C優先病原體)進行廣泛保護的組合物和相關方法。例如，細菌性肺炎在正常宿主中以 1/100人/年的發生率發生，主要是在老人和兒童中，並可由多種生物引起。其最經常為肺炎鏈球菌引起，其次是有莢膜的流感嗜血桿菌引起。其他細菌如腸道革蘭氏陰性菌、厭氧菌和金黃色葡萄球菌是特定環境(如醫療護理場所)中肺炎的主要起因。結核分支桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)是高度感染性的，並且在歷史上是世界範圍內死亡率的重要起因。在發達國家已經用抗體進行了大部分的控制，但多藥物抗性菌株仍繼續引起問題並劃分為類別C生物武器試劑。嗜肺性軍團病桿菌首先在1978年費城的爆發中被鑑定出來，儘管目前認為其以與環境來源相關的低地方性速率廣泛發生。同樣，肺的真菌感染可在正常宿主中引起有症狀的疾病。夾膜組織胞漿菌、粗球孢子菌(Coccidiodes immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)禾口新形隱球菌(Crytococcus neoformans)均可弓| 起與局部暴露在高環境濃度下相關的肺炎。由這些病原性真菌引起的肺炎在正常宿主中一般是自限性的。一些額外的「非典型」微生物如支原體佔正常宿主中其他肺炎的重要部分。認為本發明的組合物可針對引起例如肺炎或其他疾病狀況的多種病原體提供快速的暫時保護。在某些方面，本發明可用於與疫苗接種方案組合，從而為可能或已經接觸一種或多種病原性或潛在病原性生物的受試者提供額外的保護。在本發明的一些特定方面，本發明的組合物和方法可用於預防或治療感染或與生物武器/條件性微生物的接觸或受試者與吸入的感染劑的接觸，或降低其風險。在現代已經用作恐怖分子武器的唯一微生物病原體是炭疽芽孢桿菌，當通過呼吸途徑發生感染時， 即使使用合適的抗生素也具有75%的致死率。土拉熱弗朗西絲氏菌是需氧的革蘭氏陰性球桿菌，其為兼性胞內病原體。其為高度感染性、高度致病性，並可在惡劣環境條件下存活， 使得其成為嚴重的生物恐怖威脅，即使其很難在人之間傳播(Dermis，2001)。有疫苗可用， 但僅有部分保護性。世界衛生組織估計，在有五百萬居民的市區上氣霧劑噴灑50kg的劇毒土拉熱弗朗西絲氏菌會導致250，000個失能性傷亡，包括19，000例死亡；疾病控制中心 (⑶C)估計，這種攻擊的經濟成本是每100，000個接觸人群M億美元(Dermis，2001)。可通過氣霧劑傳播的其他A類生物恐怖試劑是鼠疫耶爾森氏菌、天花病毒和出血熱病毒。此外，可通過呼吸道有效遞送多種B類和C類試劑。總之，這些生物包含革蘭氏陽性、革蘭氏陰性、細胞內和細胞外的細菌，以及多種病毒類別。因為可能難以首先鑑定具體的生物恐怖試劑、本地貯存針對特定試劑的適應性免疫疫苗和抗生素的複雜性以及生物 (如炭疽芽孢桿菌)即便正確處理仍有顯著毒性，所以刺激肺的先天防禦能力可以預防或先行阻止(preempt)或減輕通過呼吸道遞送的生物恐怖劑的感染；這種效果可具有極大的公共衛生價值。A.病原性或潛在病原性微生物有許多微生物被認為具有病原性，或在某些條件下可能有病原性(即，條件性病原體/微生物)。在某些方面，相對於肺感染來確定病原性。細菌性微生物包括但不限於芽孢桿菌、耶爾森氏菌、Franscisella、鏈球菌、葡萄球菌、假單胞菌、分枝桿菌、 Burid10Ideria屬的多個物種。對受試者的保護所針對的具體細菌種類包括但不限於炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森氏菌、土拉熱弗朗西絲氏菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、Burkholderia c印acia、白喉棒狀桿菌、梭菌(Clostridia spp)、志賀氏菌 (Shigella spp. )lif (Mycobacterium avium)、Μ. intracellulare> Μ. kansasii> Μ. paratuberculosis> Μ. scrofulaceum> Μ. simiae> Μ. habana> Μ. inter jectum> Μ. xenopi、 Μ. heckeshornense、Μ. szulgai、Μ. fortuitum、Μ. immunogenum、Μ. chelonae、Μ. marinum、 Μ. genavense、Μ. haemophilum、Μ. celatum、Μ. conspicuum、Μ. malmoense、Μ. ulcerans、 Μ. smegmatis、Μ. wolinskyi、Μ. goodii、Μ. thermoresistible、Μ. neoaurum、Μ. vaccae、 Μ. palustre、Μ·elephantis、Μ· bohemicam 禾口 Μ· septicum。B.病毒有多種病毒和病毒株被認為有病原性或在特定條件下有潛在病原性。病毒可分為以下七組之一組I 雙鏈DNA病毒；組II 單鏈DNA病毒；組III 雙鏈RNA病毒；組IV 有義鏈單鏈RNA病毒；組V 反義鏈單鏈RNA病毒；組VI 逆轉錄二倍體單鏈RNA病毒；組 VII 逆轉錄環形雙鏈DNA病毒。病毒包括腺病毒科、沙粒病毒科(Arenaviridae)、杯狀病毒禾鬥(Caliciviridae)、冠狀病毒禾鬥(Coronaviridae)、絲狀病毒禾鬥(Filoviridae)、黃病毒禾鬥 (Flaviviridae) > BfH1FDNA ^f(Hepadnaviridae)、；)§#__# (Herpesviridae) ( α - 禾4· (Alphaherpesvirinae) > β ？(Betaherpesvirinae) > 病毒亞禾鬥(Gammaherpesvirinae))、Nidovirales、乳頭瘤病毒禾鬥(Papillomaviridae)、 畐1J粘病毒科(Paramyxoviridae)(畐Ij黍佔液病亞科(Paramyxovirinae)、月市病毒亞科 (Pneumovirinae))、微小病毒禾鬥(Parvoviridae) (Parvovirinae (微小病毒禾鬥)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae))、痘病毒科(Poxviridae)(脊椎動物痘病毒亞科 (Chordopoxvirinae))、呼腸孤病毒科(Reoviridae)、逆轉錄病毒科(Retroviridae) (Orthoretrovirinae)和/或披膜病毒科(Togaviridae)。這些病毒包括但不限於多種流感毒株，如禽流感(例如，H5N1) 0對受試者的保護所針對的具體病毒包括但不限於巨細胞病毒(Cytomegalovirus)、呼吸道合胞體病毒等。病原性病毒的實例包括但不限於甲型流感病毒、H5N1、馬爾堡病毒、伊波拉病毒、 登革熱病毒、嚴重急性呼吸器官綜合症、黃熱病病毒、人呼吸道合胞體病毒、痘苗病毒等。C.真菌有許多真菌物種被認為是病原性或在特定條件下有潛在病原性。提供的保護可針對(但不限於)煙麴黴、白色假絲酵母、新型串酵母、夾膜組織胞漿菌、粗球孢子菌或卡氏肺囊蟲和/或皮炎芽生菌。V.製劑和施用可通過受試者的呼吸系統施用本文公開的藥物組合物。在某些方面，通過本領域已知的方法和裝置使組合物沉積在肺中。可在水中製備^頂組合物，與表面活性劑如羥丙纖維素適當混和。也在甘油、液體聚乙二醇和其混合物以及油中製備分散劑。在普通儲存和使用條件下，這些製劑含有防腐劑，防止微生物的生長。適合吸入的藥物形式包括無菌水溶液或分散劑和用於臨時製備無菌吸入溶液或分散劑的無菌粉劑。在所有情況下，所述形式通常是無菌的，並能夠直接吸入或通過一些中間過程或裝置吸入。其在製備和儲存條件下必須穩定，並且必須防止微生物(如細菌和真菌)的汙染作用。載體可以是含有例如水、 乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和/或植物油的溶劑或分散介質。對微生物作用的預防可通過多種抗細菌和抗真菌劑來實現，例如對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。根據所治療的受試者的狀況和接觸或潛在接觸的具體情況，需要對劑量進行一定改變。在任何情況下，負責施用的人都會為個體受試者確定適當劑量。此外，對於人施用， 製劑應該滿足FDA生物製品標準處或其他類似機構要求的無菌、致熱原性、一般安全性和純度標準。通過將活性組分以需要的量與上文列舉的多種其他成分摻入適當溶劑中來製備無菌組合物，需要時隨後進行例如過濾滅菌。一般地，通過將多種無菌活性成分摻入無菌載體中來製備分散劑，所述無菌載體含有基本分散劑和來自上文列舉的其他所需成分。在用於製備無菌組合物的無菌粉劑的情況下，一些製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥技術，其產生活性成分和來自前述無菌過濾溶液的任何額外所需成分的粉末。可通過不同方法(包括液體噴霧器、基於氣霧劑的定量吸入器(MDI)、噴霧器、乾粉分散裝置等)實施肺/呼吸道的藥物遞送。此類方法和組合物為本領域技術人員所熟知，並如美國專利6，797，258,6, 794，357,6, 737，045和6，488，953所指示，均以援引方式併入本文。根據本發明，可通過本領域已知用於通過吸入施用治療劑的任何多種吸入或鼻裝置遞送至少一種藥物組合物。適合引導肺或鼻施用的其他裝置也為本領域所知。通常，為進行肺施用，以有效到達肺或竇的下氣道的顆粒大小遞送至少一種藥物組合物。適於實施本發明的市售吸入裝置的一些具體實例是Turbohaler (Astra)、Rotahaler (Glaxo)、Diskus (Glaxo)、Spiros 吸入器(Dura), Inhale Therapeutics 銷售的裝置、 AERx (Aradigm)、Ultravent 噴霧器(Mallinckrodt)、Acorn II 噴霧器(Marquest Medical Products)、Ventolin 定量吸入器(Glaxo)、Spinhaler 乾粉吸入器(Fisons)寸。所有此類吸入裝置均可用於施用氣霧劑中的藥物組合物。此類氣霧劑可包含溶液 (水溶液和非水溶液)或固體顆粒。定量吸入器通常使用拋射劑氣體並需要在吸氣過程中啟動。參閱例如WO 98/35888 ;W094/16970。乾粉吸入器利用混和粉劑的呼吸啟動。參閱美國專利 5，458，135 ；4，668，218 ；PCT 公開 WO 97/25086 ；WO 94/08552 ；W094/06498 ；和歐洲專利申請EP 0237507，以援引方式整體併入本文。噴霧器從溶液產生氣霧劑，而定量吸入器、乾粉吸入器等產生小顆粒氣霧劑。用於施用的合適製劑包括但不限於鼻腔噴霧或滴鼻劑，並可包括乂頂組合物的水或油溶液。可通過迫使組合物的懸液或溶液在壓力下通過噴嘴來產生包含本發明藥物組合物的噴霧。可選擇噴嘴大小和構型、施加的壓力和液體給料速率，以實現期望的輸出和顆粒大小。可以進行電噴霧，例如通過與毛細管或噴嘴給料連接的電場。可以通過噴霧器如噴射噴霧器或超聲噴霧器施用本發明的藥物組合物。通常，在噴射噴霧器中，壓縮空氣源用於產生通過噴嘴的高速空氣射流。隨著氣體擴散到噴嘴外，產生低壓區，其牽引著組合物通過連接貯液器的毛細管。來自毛細管的液體流在流出管外時被剪切成不穩定的絲和小滴，產生氣霧劑。可使用廣泛的構型、流速和擋板類型，以從給定的噴射霧化器中實現期望的性能特徵。在超聲噴霧器中，通常使用壓電換能器將高頻率電能用於產生震動性的機械能。該能量傳遞到組合物中，產生氣霧劑。在定量吸入器(MDI)中，在罐中含有拋射劑、組合物和任何賦型劑或其他添加劑與壓縮空氣的混合物。計量閥的啟動將混合物作為氣霧劑釋放。利用定量吸入器裝置使用的藥物組合物一般包括細粉，其含有本發明的組合物作為無水介質中的懸浮劑，例如在表面活性劑的幫助下懸浮於拋射劑中。拋射劑可以是用於該目的的任何常規材料，如氯氟烴、氫化氯氟烴、氫化碳氟化合物或碳氫化合物，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2_四氟乙烷、HFA-134a(氫化氟鏈烷-i;34a)、HFA-227 (氫化氟鏈烷-227)等。如本文所用，「載體」包括任何和所有溶劑、分散介質、載劑、包衣、稀釋劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、緩衝液、載體溶液、懸液、膠體等。此類介質和試劑用於藥物活性物質的用途為本領域所熟知。任何常規介質或試劑除非與活性成份不相容，否則均考慮其在所述治療性組合物中的用途。補充性活性成份也可摻入所述組合物中。 短語「可藥用，，指當向受試者施用時不產生過敏或類似不良反應的分子實體和組合物。含有多肽或肽作為活性成份的水組合物的製劑為本領域所熟知。VI.組合治療本發明的組合物和方法可用於許多治療或預防應用的情況中。為了提高本發明組合物治療的有效性或增強另一治療(第二治療)例如疫苗或抗微生物治療的保護作用，可能期望將這些組合物和方法與在治療、降低感染危險或預防疾病和病原性狀況的其他藥劑
和方法(例如抗細菌、抗病毒和/或抗真菌治療)相組合。 可應用多種組合；例如乂頂組合物是「A」，第二種治療是「B」 A/'KB/A/BB/B/AA/A/BA/,B/B B/%'KA//BB/%/B
B/%'K B/WA/BA/A/B,/BA/B/7A//BA/%'kB/%7A/'k
B/%'K B//A/A/BA/A/A,/BB/A/A/'kA/%%'kA/7A/'k向受試者施用本發明的組合物將遵循通過呼吸系統施用的一般方案，也遵循施用特定第二治療的一般方案，將該治療的毒性(如果有)考慮在內。預計必要時重複治療循環。也考慮多種標準治療以及疫苗接種可與所述治療組合應用。A.抗病毒劑在本發明的某些方面，抗病毒劑可與組合物組合使用。抗病毒藥物是特異性用於治療病毒感染的一類藥劑，並且其應與殺病毒劑區分開，殺病毒劑主動滅活體外的病毒顆粒。目前可用的大多數抗病毒劑被設計成幫助處理HIV、皰疹病毒、B肝和C肝病毒，和甲型流感病毒和乙型流感病毒。可用於本發明的抗病毒劑包括但不限於免疫球蛋白、金剛胺、幹擾素、核苷酸類似物和蛋白酶抑制劑。一種抗病毒策略是幹擾病毒滲入靶細胞的能力。可使用模擬病毒結合蛋白(VAP) 並與細胞受體結合的試劑來抑制病毒複製的這個階段。或者通過使用模擬細胞受體並與 VAP結合的試劑。這包括抗VAP抗體、受體抗基因型抗體、外來受體和合成的受體模擬物。 已經引入了兩種此類「進入阻滯劑」金剛胺和金剛乙胺來對抗流感。抗病毒治療的第二種方法是靶向病毒侵入細胞後合成病毒組分的過程。這樣做的一種方式是開發核苷酸或核苷類似物，其看起來像RNA或DNA的結構單元，但該類似物一旦摻入即使合成RNA或DNA的酶失活。核苷酸類似物包括但不限於ribivirin、阿糖腺苷、阿昔洛韋、gangcyclovir、疊氮胸苷、地達諾新、扎西他賓、司他夫定和拉米夫定。又一抗病毒技術是基於核酶的一組藥物，所述核酶是在所選位點切開病毒RNA或 DNA的酶。在其天然過程中，核酶作為病毒生產序列的一部分，但這些合成的核酶被設計成在使其喪失功能的位點上切割RNA和DNA。一些病毒包括稱為蛋白酶的酶，所述蛋白酶切割病毒蛋白鏈，所以它們可以裝配成最終的構造。HIV包括蛋白酶，並且已經進行了大量研究來尋找「蛋白酶抑制劑」，以在其生命周期的這一階段攻擊HIV。從二十世紀九十年代開始有蛋白酶抑制劑可用，並且已證明有效，但它們具有不尋常的副作用，例如引起脂肪在不尋常的地方積累。改善的蛋白酶抑制劑目前正在開發中。病毒生命周期的最後階段是從宿主細胞中釋放完整的病毒，並且抗病毒藥物開發者也已經靶向了該階段。已經引入治療流感的稱為扎那米韋(RELENZA )和奧塞米韋 (TAMIFLU )的兩種藥物通過阻斷稱為神經氨糖酸苷酶的分子來防止病毒顆粒的釋放，所述神經氨糖酸苷酶存在於流感病毒的表面上，並且看起來在大量流感毒株中也恆定不變。抗病毒劑包括但不限於阿巴卡韋；乙醯嗎喃；阿昔洛維；阿昔洛韋鈉；阿德福韋； 阿洛夫定；阿韋舒託；鹽酸金剛脘胺；安潑那韋；阿拉諾丁 ；阿里酮；阿的維定；阿夫立定； 西多福韋；西潘茶鹼；鹽酸阿糖胞苷；地拉韋定甲磺酸；脫氧無環鳥苷；地達諾新；二》惡沙利；依度尿苷；依法韋侖；恩韋拉登；恩韋肟；泛西洛維；鹽酸氯苯氫異喹；非西他濱；非阿尿苷；膦酸利脂；磷酸三鈉甲酸鹽；膦乙酸鈉；羥甲基無環鳥苷；丙氧鳥苷鈉；碘苷；印地那韋；乙氧丁酮醛；拉米夫定；洛布卡韋；鹽酸甲氧苯異喹；甲吲噻蹤；那非那韋；奈韋拉平； 噴西洛維；吡羅達韋；三氮唑核苷；鹽酸氨基乙基金剛烷；利託那韋；甲磺酸噻喹努佛；鹽酸索金剛胺；索利夫定；匍枝青黴菌素；司他夫定；鹽酸梯絡龍；三氟尿苷；伐昔洛韋鹽酸； 阿糖腺苷；磷酸阿糖腺苷；阿糖腺苷磷酸鈉；韋羅肟；扎西他賓；疊氮胸苷；淨韋肟；幹擾素、cyclovir、α幹擾素和/或β球蛋白。在某些實施方案中，抗病毒劑是利巴韋林和高劑量的利巴韋林。利巴韋林是對許多DNA和RNA病毒有活性的抗病毒藥物。其是核苷抗代謝物藥物的成員，其幹擾病毒遺傳物質的複製。儘管不是對所有的病毒都有效，但利巴韋林具有廣譜活性，包括針對流感病毒、 蟲媒病毒和許多病毒性出血熱的病原體的重要活性。通常，利巴韋林(Ribavirin)的經口形式與聚乙二醇化幹擾素藥物組合用於治療C型肝炎。氣霧劑形式在過去已經用於治療兒童中呼吸道合胞體病毒相關疾病。然而，多項研究已經質疑其效力，並且大多數機構已經不再使用它了。B.抗菌劑抗菌劑的實例包括但不限於β -內醯胺抗生素、青黴素(如，天然青黴素、氨基青黴素、青黴素酶抗性青黴素、羧基青黴素、脲基青黴素)、頭孢菌素(第一代、第二代和第三代頭孢菌素)，和其他β-內醯胺(如，亞胺培南、單醯胺菌素)、β-內醯胺抑制劑、萬古黴素、氨基糖甙類和大觀黴素、四環黴素、氯黴素、乙琥紅黴素、林可黴素、克林黴素、利福平、甲硝唑、多粘菌素類、磺胺類藥物和甲氧苄氨嘧啶，和喹啉。抗細菌藥物還包括但不限於醋氨苯碸、醋胺磺氨苯碸鈉、阿來黴素、阿來西定、氮卓脒青黴素、氮卓脒青黴素匹酯、 阿密環素、氨氟哌酸、氨氟哌酸、阿米卡星、硫酸阿米卡星、氨基水楊酸、對氨水楊酸鈉、阿莫西林、安福黴素、氨卡青黴素、氨苄青黴素鈉、萘啶青黴素鈉、阿布拉黴素、門冬託星、硫酸阿司米星、阿維黴素、阿伏帕裡、阿齊紅黴素、阿洛西林、苯咪唑青黴素鈉、鹽酸卡巴西林、 桿菌肽、亞甲基雙水楊酸桿菌肽、桿菌肽鋅、班貝黴素、苯醯胺水楊酸鈣、去氧紅黴素、硫酸倍他黴素、比阿培南、比尼黴素、鹽酸苯柳胺酯、硫酸鎂雙巰氧吡唆、氨羥丁卡鈉黴素、硫酸丁醯苷菌素、硫酸捲曲黴素、卡巴氧、羧苄基青黴素雙鈉鹽、卡茚西林鈉、羧苄苯青黴素鈉、 羧苄青黴素鉀、卡魯莫南鈉、頭孢克洛、頭孢羥氨苄、頭孢羥唑、頭孢孟多甲酸酯鈉、頭孢孟多酯鈉、頭孢哌羅、頭孢曲秦、頭孢氟唑鈉、頭孢唑啉、頭孢唑啉鈉、頭孢拉宗、頭孢地尼、頭孢平、鹽酸頭孢平、頭孢替考、頭孢克肟、Cefinenoxime Hydrochloride、Cefinetazole、 Cefinetazole鈉、頭孢尼西鈉、頭孢尼西鈉、頭孢哌酮鈉、頭孢胺四唑、頭孢噻肟鈉、頭孢替坦二鈉、頭孢替坦二鈉、鹽酸頭孢替安、頭孢西丁、頭孢西丁鈉、頭孢咪唑、頭孢咪唑鈉、頭孢匹胺、頭孢匹胺鈉、硫酸頭孢匹羅、頭孢泊肟、頭孢羅齊、頭孢甲氧環烯胺、頭孢磺啶鈉、頭孢他定、頭孢布坦、頭孢唑肟鈉、頭孢曲松鈉、頭孢呋新、頭孢呋肟酯、頭孢呋辛匹賽酯、頭孢呋肟鈉、頭孢賽曲鈉、頭孢菌素IV、頭孢菌素IV鹽酸、C^phaloglycini、頭孢利素、頭孢噻吩鈉、頭孢匹林鈉、泛捷復、鹽酸西託環素、乙醯黴素、氯黴素、Cliloramphenicol Palmitate, Chloramphenicol Pantotheniate Complex、丁二酸鈉氯黴素、氨基苯磷酸氯己定、對氯間二甲酚、金黴素硫酸氫鹽、鹽酸金黴素、西諾沙星、環丙沙星、鹽酸環丙沙星、西羅裡黴素、克拉仙黴素、鹽酸克林沙星、Clildamycin, Clindamycin Hydrochloride、鹽酸氯林可黴素棕櫚酸酯、氯林可黴素磷酸酯、氯苯吩嗪、苄星鄰氯青黴素、氯唑西林鈉、氯羥喹、多粘菌素e甲磺酸鈉、硫酸多粘菌素E、庫馬黴素、庫馬黴素鈉、氨環已青黴素、環絲氨酸、達福普汀、氨苯碸、達託黴素、Demeclocycine、Demeclocycine Hydrochloride、去甲四環素、地奴真菌素、二氨黎蘆嘧啶、雙氯青黴素、雙氯西林鈉、硫酸雙氫鏈黴素、雙硫氧吡啶、地紅黴素、脫氧土黴素、強力黴素鈣、多西環素磷酸複合物、鹽酸多西環素、屈克沙星鈉、氟啶酸、環烯氨甲青黴素、鹽酸表四環素、乙琥紅黴素、紅黴素阿西曲酯、無味紅黴素、紅黴素丁二酸乙酯、葡庚糖酸紅黴素、乳糖紅黴素、紅黴素丙酸酯、紅黴素硬脂酸鹽、鹽酸乙胺丁醇、乙硫異煙胺、 氟羅哌酸、氟氯青黴素、氟氘丙氨酸、氟甲喹、磷黴素、磷黴素氨丁三醇、呋莫西林、氯化呋噻咪唑、酒石酸呋噻咪唑、夫西地酸鈉、夫西地酸、硫酸雙生黴素、格洛莫南、短桿菌肽、滷苯炔醚、縮酮氯苄青黴素、海他西林鉀、海可西定、依巴沙星、依巴沙星、雙二氯苯唑、異帕米星、 異煙胼、角沙黴素、硫酸卡那黴素、柱晶白黴素、左旋呋嗎唑酮、苯氧丙基青黴素鉀、來西索黴素、林可黴素、鹽酸潔黴素、洛米沙星、鹽酸洛米沙星、Lomefloxacin Mesylate、氯拉卡比、磺胺米隆、氯甲烯土黴素、氯甲烯土黴素磺基水楊酸鹽、巨黴素磷酸二氫鉀、甲喹氧、倍能、甲烯土黴素、鹽酸甲烯土黴素、烏洛託品、馬尿酸烏洛託品、甲硝唑、磺唑氨苄青黴素、美洛西林鈉、米諾環素、鹽酸米諾環素、鹽酸米林黴素、莫能星、莫能星鈉、萘夫西林鈉、萘啶酮酸鈉、萘啶酸、匹馬黴素、妥布黴素、棕櫚酸新黴素、硫酸新黴素、十一烯酸新黴素、硫酸萘替米星、中性黴素、硝呋拉定、硝呋地腙、硝呋噁酮、硝呋隆、硝呋達齊、硝呋米特、硝呋奎唑、硝呋噻唑、硝基四環素、呋喃妥因、二硝苯甲醯胺、氟哌酸、新生黴素鈉、氧氟沙星、奧美普林、 苯唑西林鈉、肟莫南、肟莫南鈉、奧索利酸、地黴素、土黴素鈣、鹽酸土黴素、帕地黴素、對氯酚、保洛黴素、培氟沙星、青黴素G雙酯、苄星青黴素G、青黴素G鉀、普魯卡因青黴素、青黴素 G鈉、青黴素V、苄星青黴素V、哈胺青黴素V、青黴素V鉀、戊胺唑酮鈉、對氨水楊酸苯酯、哌拉西林鈉、吡苄西林鈉、吡地西林鈉、鹽酸吡利黴素、鹽酸匹氨青黴素、雙羥萘酸匹氨西林、 丙苯酸匹氨青黴素、硫酸多粘菌素B、泊非黴素、普匹卡星、吡嗪醯胺、巰氧吡啶鋅、醋酸喹癸胺、奎奴普丁、消旋甲碸黴素、雷冒拉寧、雷尼黴素、雷洛黴素、裡潑羅黴素、利福布丁、利福美坦、利福克昔、利福醯胺、利福平、利福噴丁、利福噴丁利福昔明、吡咯烷甲基四環素、硝酸羅列環素、羅沙米星、羅沙米星丁酸鹽、羅沙米星丙酸鹽、羅沙米星磷酸鈉、羅沙米星硬脂酸鹽、羅索沙星、硝酚胂酸、羅紅黴素、去甲去氧四環素、山費培南鈉、酚咪青黴素、沙匹西林、 司可芬淨西蘇黴素、西索黴素、硫酸西索黴素、施怕沙星、鹽酸壯觀黴素、乙醯螺旋黴素、鹽酸偏端菌素、司替黴素、硫酸鏈黴素、鏈黴素異煙胼、磺胺苯、苯甲醯磺胺、磺胺醋醯、磺胺醋醯鈉、磺胺乙胞嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶鈉、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺甲氧吡嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺(5)對甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲基異噁唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲ρ惡唑、磺胺酸鋅、磺胺硝苯、柳氮磺吡啶、磺胺甲異噻唑、磺胺噻浴、磺胺甲苯吡唑、磺胺異ρ惡唑、磺胺乙醯異Ρ惡唑、磺胺異0惡唑二乙醇胺鹽、磺粘菌素、硫培南、青黴烷碸、磺氨苄青黴素鈉、氨苄青黴素酞酯鹽酸鹽、替考拉寧、鹽酸替馬氟沙星、替莫西林、四環素、鹽酸四環素、四環素磷酸復鹽、四氧普林、甲碸氯黴素、苯硫甲青黴素鉀、羧噻酚青黴素甲苯酯鈉、替卡西林二鈉、替卡西林鈉、氯苯異噻酮、氯化氯苯噻碘、妥布黴素、硫酸妥布黴素、多氟啶酸、甲氧苄氨嘧啶、硫酸甲氧苄啶、三磺嘧啶、醋竹桃黴素、硫酸丙大觀黴素、短桿菌素、萬古黴素、鹽酸萬古黴素、維吉黴素和/或拉來黴素。B.抗真菌劑抗真菌劑包括但不限於唑類、咪唑、聚烯、泊沙康唑、氟康唑、依曲康唑、兩性黴素B、5_氟胞嘧啶、咪康唑、酮康唑、乙胺丁醇(鹽酸乙胺丁醇)、氨苯碸(4，4』 - 二氨基二苯苯基碸),Paser顆粒(氨基水楊酸顆粒)、利福噴丁、吡嗪醯胺、異煙胼、利福平IV、利福平、吡嗪醯胺、硫酸鏈黴素、乙硫異煙胺-SC (乙硫異煙胺)和/或伏立康唑(Vfend )。C.其他藥劑在本發明的某些方面，抗炎劑可與乂頂組合物組合使用。用於本文的留類抗炎劑包括但不限於氟地松、倍氯米松、其任何可藥用衍生物，及其任何組合。如本文所用，可藥用衍生物包括其任何鹽、酯、烯醇醚、烯醇酯、酸、鹼、溶劑化物或水合物。可通過本領域技術人員使用此類衍生的已知方法製備此類衍生物。氟地松.丙酸氟替卡松是合成的皮質類固醇並具有經驗式C25H31F3O5S15其化學名為 S-(氟甲基)6 α，9- 二氟-11 β -17- 二羥基-16 α -甲基-3-氧代雄甾_1，4_ 二烯-17 β -硫代甲酸酯，17-丙酸酯。丙酸氟替卡松是具有500. 6分子量的白色到灰白色粉末，在水中基本不溶，易溶於二甲亞碸和二甲基甲醯胺，在甲醇和95%乙醇中微溶。在一個實施方案中，本發明的製劑可包含留類抗炎劑(例如，丙酸氟替卡松)。倍氯米松.在某些方面，留類抗炎劑可以是倍氯美松雙丙酸酯或其一水合物。倍氯美松雙丙酸酯的化學名為9-氯-11b，17,21-三羥基-16b-甲基孕甾-1，4- 二烯-3， 20-二酮17，21-二丙酸酯。該化合物可以是分子量為521. 25的白色粉末；並且在水中極微溶解(Physicians』 Desk Reference)，在氯仿中極易溶解，並在丙酮和醇中易溶解。提供本發明的留類抗炎劑可通過例如減輕任何不想要的炎症來增強本發明的組合物和方法。用於本文的其他留類抗炎劑的實例包括但不限於倍他米松、去炎松、地塞米松、潑尼松、莫米松、氟尼縮松和布地奈德。根據本發明的又一方面，非留類抗炎劑可包括阿斯匹林、水楊酸鈉、撲熱息痛、 非那西汀、布洛芬、酮基布洛芬、吲哚美辛、氟吡洛芬、雙氯芬酸、甲氧萘丙酸、吡羅昔康、 替布費龍、依託度酸、萘普酮、替尼達普、alcofenac、安替比林、amimopyrine、安乃近、 animopyrone、保泰松、氯苯氧醯胺、羥基保泰松、prexazone、阿扎丙宗、苄達明、丁環己巴比妥、辛可芬、氯尼辛、ditrazol、依匹唑、非諾洛芬、floctafeninl、氟芬那酸、甘氨苯喹、吲哚布洛芬、甲氯滅酸、甲芬那酸、尼氟滅酸、salidifamides、舒林酸、舒洛芬、託美汀、萘普酮、 羥哌苯酮、普羅喹宗、丁苯羥酸、氟咪唑、氨苄噻吡酯、替美加定、氨苯碸、雙氟尼酸、貝諾酯、 磷柳酸、二氯苯氧苯乙酸、依託度酸、雙苯噻酸、噻氯咪索、卡布洛芬、芬布芬、ρ惡丙嗪、安得返萘丁美酮、吡洛芬、非普拉酮、吡羅昔康、舒多昔康、伊索昔康、塞來考昔、Vioxx 和/或替諾昔康。VII.藥盒本文描述的任何組合物可包含在藥盒中。在一個非限制性實例中，用於產生和/ 或遞送乂頂組合物的試劑包括在藥盒中。在某些方面，所述藥盒是可攜帶的，並可像哮喘吸入器一樣隨身攜帶。所述藥盒還可包括病原體檢測器。所述藥盒還可含有用於本發明組合物的氣體或機械拋射劑。所述藥盒中的組分可以水、粉劑或凍幹形式包裝。藥盒的容器一般包括至少一個吸入器、罐、管、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器，其中可放置組分，並優選放置適當等分的組分。藥盒中含有多於一種組分時(第二藥劑等)，所述藥盒一般還含有第二個、第三個或其他額外的容器，其中可單獨放置額外的組分。然而，可在管、罐或吸入器中包含多種組分組合。本發明的容器可包括罐或吸入器，其可穿在帶子上或容易地攜帶在口袋、背包或其他儲存容器中。本發明的藥盒通常還包括用於所述組合物的容器或其變體，和緊密包裝以用於商品化出售的任何試劑容器。此類容器可包括注塑或吹塑的塑料容器，其中固定著想要的管。當在一種和/或多種液體溶液中提供藥盒的組分時，例如液體溶液是水溶液，尤其優選無菌水溶液(但不必須)。然而，藥盒的組分也可以乾粉提供。當試劑和/或組分以乾粉提供時，可通過添加合適的溶劑重新溶解粉劑或以粉劑形式施用。溶劑也可考慮在另
一容器中提供。藥盒還包括使用藥盒組分以及使用藥盒中不包括的任何其他試劑的說明書。說明書可包括可以實施的改變形式。考慮此類試劑是本發明藥盒的實施方案。然而，此類藥盒不限於上文鑑定的特定項目，並可包括在病原性微生物的檢測或本發明組合物的施用中直接或間接使用的任何試劑。VIII.實施例為闡明本發明多個實施方案目的而給出以下實施例，並且其不旨在以任何形式限制本發明。本領域的技術人員會容易地理解，本發明非常適於實現目的並獲得所提及的目標和優點，以及本文固有的那些目的、目標和優點。本發明實施例與本文描述的方法代表某些實施方案，並不旨在限制本發明的範圍。本領域技術人員會想到其中的改變和權利要求範圍定義的本發明精神內包括的其他用途。實施例1綠膿假單胞菌攻擊。從ATCC獲得菌株PA103並在LB培養基(BiolOlSystems)中 20%甘油中儲存為冷凍貯存液(IX 108CFU/ml)。將Iml貯存液在37°C下5% CO2中IOOml LB培養基中孵育16小時，然後在IL新鮮培養液中稀釋，並在37°C下培養6_7小時，至0D_ 達到0. 3，產生 3X101(ICFU。將懸液離心、洗滌、重懸浮並霧化攻擊，通過將系列稀釋液鋪板到胰蛋白酶大豆瓊脂平板(Becton Dickinson)上來測定細菌的濃度。為進行霧化，將 IOml懸液置於通過IOL/分鐘空氣中5% CO2驅動的AeroMist CA-209噴霧器(CIS-US)中， 以促進深度換氣。30分鐘後，再加入5ml，使得在整個60分鐘期間總共IOml懸液被霧化。TLR配體處理。感染攻擊之前，用TLR配體的氣霧劑(單獨或組合)或用PBS (陰性對照)處理小鼠。感染攻擊前遞送所有處理18小時，使用補充有5% CO2的IOL/分鐘驅動的AeroMist CA-209噴霧器以促進通風。對於每一處理，將IOml的TLR配體懸液或PBS 置於噴霧器中，並在20分鐘中施用。對於使用TLR配體組合的實驗，將兩種配體懸浮在同一 IOml懸液中，並同時遞送。對於每一種配體，通過誘導肺的嗜中性粒細胞浸潤的最小懸液濃度來確定初始氣霧劑劑量，該濃度通過處理後M小時支氣管肺泡灌洗液中總的白細胞和嗜中性粒細胞計數來測定。TLR 4配體。與含有5、6和7個醯基的混合物的天然脂質A不同，單磷酸脂質A-合成物(MPLA，Invivogen)是含有6個脂肪醯基的純合成物。以100 μ g/ml遞送MPLA的懸液。以100 μ g/ml遞送具有6個脂肪醯基的另一合成脂質A——磷酸化六醯基二糖(PHAD， Avanti Polar Lipids)。TLR 2/6 配體。Pam2CSK4 和 FSL-1 (兩者均來自 hvivogen)是已知通過 TLR2和TLR6的異二聚體進行信號轉導的合成二醯基脂肽。如所示，以6或20yg/ml遞送 Pam2CSK4，並以 20 μ g/ml 遞送 FSL-1。TLR 9配體。ODN 2395 Qnvivogen)是對人和鼠TLR 9具有高親和力的C型CpG 寡核苷酸。以20 μ g/ml霧化ODN 2395。TLR 7配體。咪喹莫特(R837，Invivogen)是刺激TLR7 (也可能刺激TLR8)的咪唑喹啉胺鳥苷類似物。如所示，以1或300 μ g/ml的氣霧劑遞送咪喹莫特。TLR 5配體。鑑定了鞭毛蛋白中高度保守的22胺基酸區段(已知的TLR5配體)。 該胺基酸區段在 Cell Essentials, Inc.，Boston, MA 進行合成。基於 HPLC 和 Malidi-TOF 質譜驗證肽的純度> 95%。以100 μ g/ml遞送Flg22的合成片段。實施例
材料和方法動物和試劑。所有一般試劑均從Sigma (St Louis, M0)獲得，除非另有說明。根據德克薩斯大學M. D. Anderson癌症中心動物關懷和使用委員會的政策處理所有的小鼠。將5 到8周齡的野生型雌性Swiss-Webster小鼠(Charles River, Wilmington,ΜΑ)用於大多數保護和細胞計數實驗。如所示，將Siizuo Akira (1998)提供的5到8周齡雌性MyD88+小鼠、Trir廠小鼠(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)禾口 TLR2+小鼠(Jackson)用於與野生型小鼠C57BL/6J (Jackson)進行比較。霧化處理。在巧克力瓊脂(Remel，Lenexa, KS)上培養不可分型流感嗜血桿菌(NTHi)的冷凍貯存液，在補充有3. 5 μ g/ml NAD的腦心浸液培養液(Acumedia， Baltimore, MD)中擴增，並如所述(Clement 等，2008 ；Evans 等，2010 ；Moghaddam 等，2008) 用 EmulsiFlex C5 (Avestin, Mannheim, Germany)進行破碎。通過 bicinchoninic 測定 (Pierce, Rockford, IL)在鹽水中將蛋白質濃度調整至2. 5mg/ml，並將溶胞產物以IOml等分試樣冷凍在-80°C。為進行處理，將解凍的等分試樣置於補充有5% CO2 (促進深呼吸) 的101/分鐘空氣驅動的AeroMist CA-209噴霧器(CIS-US)中20分鐘。噴霧器通過聚乙烯管(30cm χ 22mm)連接到10升聚乙烯接觸室中，在其末端具有低抵抗力微生物過濾器 (BB50T, Pall, East Hills, NY)的相同流出管道，排到生物安全罩中。從InvivoGen (San Diego, California)購買 Pam3CSK4、Pam2CSK4、Poly (I: C)、 MPLA、咪喹莫特和 ODN 2395。通過 CellEssentials (Boston，ΜΑ)合成 22-mer 的 Flg22，其為鞭毛蛋白的最保守結構域OlRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)。為了處理小鼠，在無內毒素的水中重新溶解合成的TLR激動劑，並以所示濃度懸於8ml無菌PBS中，並使用用於NTHi溶胞產物處理的相同技術對動物進行霧化20分鐘。體內感染攻擊。如先前描述(Clement等，2008 ;Clement等，2009 ;Evans等， 2010)，用定至LD8tl-LDicitl的細菌接種物吸入攻擊小鼠。從ATCC獲得綠膿假單胞菌菌株PA103 並在LB培養基(Bio 101 Systems)的20%甘油中儲存為冷凍貯存液(1 X 108CFU/ml)。在 37°C下5% CO2中，將Iml貯存液在100ml LB培養基中孵育16小時，然後在11新鮮培養液中稀釋，並在37°C下培養6-7小時，至OD600達到0. 3，產生1-4X 101(lCFU/ml。將肺炎鏈球菌血清型4在iTodd-Hewett培養液(Becton Dickinson)的20%甘油中儲存為冷凍貯存液(IX IO9CFU)。在37°C下5% CO2中，將Iml解凍的貯存液在150ml Todd-Hewett培養液中孵育16小時，然後在1. 51新鮮培養液中稀釋，並在對數期內培養6-7小時，至0D_達到0.3，產生2-6X101(lCFU/ml。將細菌懸液離心、洗滌、重懸於IOml PBS中，並使用與用於處理的系統相同的系統在60分鐘時間裡進行霧化。通過在胰蛋白酶大豆瓊脂平板(Becton Dickinson)上將連續稀釋液進行鋪板來測定細菌濃度。肺病原體負荷的定量。如先前所述(Clement等，2008 ；Clement等，2009 ；Evans 等，2010)，用細菌病原體感染後立即麻醉小鼠，收集它們的肺，並使用2ml的組織磨碎器 (Kontes, Vineland, NJ)在Iml PBS中進行勻漿。在胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)平板上將連續稀釋的勻漿進行鋪板，在37°C下孵育16小時，並計數細菌菌落。支氣管肺泡灌洗液分析。如先前所述(Clement等，2008 ；Clement等，2009 ；Evans 等，2010)，通過滴注並在指定的時間點上通過插入暴露導管的環中的大號短管接頭插管收集兩份等分試樣(各Iml PBS) (Becton Dickinson)，來獲得支氣管肺泡灌洗液(BAL)。利用血細胞計數器(Hauser Scientific, Horsham, PA)，並通過在2，OOOrpm細胞離心300 μ 1 的BAL流體5分鐘的微分計數，隨後使用賴-吉染色來測定總的白細胞數量。體外殺傷測定。如先前所述(Clement等，2008 ;Clement等，2009 ;Evans等， 2010)，在6孔板中補充有10%熱滅活FCS和青黴素/鏈黴素(Invitrogen)的 RPMI-1640中培養MLE-15細胞和A549細胞。當生長至 80 %匯合時，用PBS洗滌細胞， 提供含有10 %熱滅活FCS的新鮮無抗生素培養基，並用20 μ 1 PBS或含有10 %熱滅活 FCS 的 RPMI-1640 中 20 μ 1 體積的 ODN 2395 (20 μ g/ml)、Pam2CSK4 (10 μ g/ml)或者 ODN 2395(20μ g/ml)和Pam2CSK4 (10 μ g/ml)進行處理。4小時後，然後將炭疽芽孢桿菌Merne 菌株或2000CFU綠膿假單胞菌菌株PA103的1000個芽孢加到所有孔中。感染後4小時，從每個孔中吸出20 μ 1上清液，連續稀釋，平鋪到TSA瓊脂平板上，在37°C下孵育16小時，並計數CFU。免疫螢光顯微術。在Lab-Tek II chamber 載玻片(Nunc, Rochester, NY)上補充有10%熱滅活FCS和青黴素/鏈黴素(Invitrogen)的RPMI-1640中培養A549細胞48小時，然後用含有10%熱滅活FCS的RPMI-1640中20ml體積的Texas Red-標記的 ODN 2395 (20 μ g/ml, Invivogen)、異硫氰酸螢光素(FITC)標記的 Pam2CSK4 (10 μ g/ml， Invivogen)或者 Texas Red-標記的 ODN 2395 (20 μ g/ml, Invivogen)和異硫氰酸螢光素 (FITC)標記的Pam2CSK4(10yg/ml，Invivogen)進行處理。2小時後，吸取培養基，分離小室，並用冰冷的PBS洗滌細胞3次。然後用4%的多聚甲醛固定細胞，用甘氨酸猝滅，用 PBS洗滌3次，用4'，6-二眯基-2-苯茚二酮(DAPI ;0. 1 μ g/ml)復染細胞核，並利用螢光顯微術(Olympus BX-60 microscope, Melville, NY)使用適當的光學(Texas Red 激發 =540nm;發射=620nm ;FITC 激發=495nm，發射=520nm ；DAPI 激發=360nm;發射= 460nm) ii^f^So ffii十胃豐幾 ·白勺 Spot RT Camera (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI)連續收集圖像並在Photoshop CS3 (Adobe，San Jose，CA)中組裝。重疊的紅色和綠色螢光呈現為黃色。統計學分析。使用SAS/STAT軟體(版本8. 2，SAS Institute)進行統計學分析。 將乂11如肚』8 t-檢驗用於比較組之間的肺細菌或病毒滴度。使用Fisher』 s精確檢驗比較病原體攻擊後存活小鼠的百分比，而log-rank檢驗用於比較通過Kaplan-Meier方法估計的存活分布。單尾ANOVA和Durmett』 s事後檢驗用於比較處理和未處理的動物之間的 BAL流體微分計數。
結果霧化細菌溶胞產物誘導對肺炎的抵抗力需要的是MyD88而不是TRIF。通過NTHi 的霧化溶胞產物刺激肺上皮誘導了對廣泛微生物病原體9的高水平抵抗力(Clement等， 2008 ；Clement 等，2009 ；Evans 等，2010 Juvim 等，2009)。為了測試 TLR 信號轉導是否是溶胞產物誘導的保護所需，用綠膿假單胞菌吸入攻擊缺乏通過IlR銜接蛋白進行TLR信號轉導的小鼠。通過霧化細菌溶胞產物進行預處理，野生型和TRIF缺陷型(Trif+)小鼠針對致死性綠膿假單胞菌的感染得到完全保護，而在MyD88缺陷型小鼠(Myd88+ ；FIG. 12A和12B， 左圖)中不能誘導抵抗力。保護與誘導肺中的快速病原體殺傷密切相關(FIG. 12A和12B， 右圖)。IL-I受體也通過MyD88進行信號轉導(Adachi等，1998 ；Medzhitov等，1998)，但其應答於宿主細胞因子信號轉導，而不直接應答於微生物產物。病原體殺傷在被霧化細菌溶胞產物刺激的IL-I受體缺陷型小鼠(Illr+ ；FIG. 13)中完全保留。這一發現表明，不是通過MyD88進行信號轉導的所有受體均為溶胞產物誘導的保護所需，並且提示，通過TLR進行的直接微生物信號轉導比通過宿主細胞因子的間接信號轉導對於誘導性上皮抵抗力而言更為重要。個體TLR激動劑誘導對肺炎的低水平抵抗力。鑑於對MyD88信號轉導的需求，本發明人測試了任何單一的合成TLR激動劑是否可以誘導與霧化細菌溶胞產物提供的抵抗力相似的抵抗力。因為TLRl和TLR6表達為與TLR2的異二聚體，並且TLR7和TLR8均識別咪喹莫特，所以小鼠TLR 1到9均可用以下7種合成配體進行刺激Pam3CSK4 (TLR2/1激動劑)、 Pam2CSK4 (TLR2/6 激動劑),Poly (I C) (TLR3 激動劑)、合成的脂質 A (MPLA，TLR4 激動劑)、 Flg22 (合成的22-mer鞭毛蛋白，TLR5激動劑)、咪喹莫特(TLR7和TLR8)或0DN2395 (TLR9 激動劑)。這些激動劑的合適霧化劑量是未知的，所以制定了策略以鑑定合適的劑量，用於向肺中遞送以避免ΙΙ(β)類型的錯誤。所用的每一合成TLR激動劑均有刺激樹突細胞最大細胞因子分泌的報導濃度([DCmax]) (Yamamoto等，2003 ；Aliprantis等，1999 ； Buwitt-Beckmann 等，2005 ；Hayashi 等，2001 ；Krug 等，2001 ；Lee 等，2003 ；Martin 等， 2003)。基於對霧化化合物的有效氣道遞送的計算(Clement等，2009 ；Evans等，2004)，本發明人測定了在氣道上皮表面上實現D)CmaX]需要的噴霧器流體濃度。儘管霧化溶胞產物誘導的抵抗力不依賴於白細胞流入，但保護現象與誘導的肺嗜中性白細胞增多症的周期和強度緊密相關(Clement等，2008)。因此，為了鑑定足以用於測試的TLR激動劑劑量，本發明人從每一配體的報導[DCmax]開始，並對數增加噴霧濃度，直至實現白細胞浸潤。如圖14中所示，在PBS處理的小鼠中，BAL液中嗜中性粒細胞的數量是 0. IX IO3士0.2個細胞/ml。僅Pam2CSK4在DCmax處顯示嗜中性粒細胞的顯著增加，儘管除poly (I C)和Flg22外全部在高於DCmax —個或兩個對數的濃度處顯示嗜中性粒細胞水平的顯著增加。另一方面，在處理M小時後，poly(I:C)和Flg22均在BAL上誘導巨噬細胞大量流入。Flg22和咪喹莫特各自具有這樣的配體濃度，高於所述濃度處嗜中性粒細胞浸潤減少。Pam2CSK4誘導為Pam3CSK4近5倍的嗜中性粒細胞水平，並且為任何其他配體15 倍。各配體的選定濃度是誘導嗜中性粒細胞/ml增加10倍或誘導巨噬細胞翻番(沒有任何一個能同時實現這兩者)的最低劑量。一些配體誘導強烈的細胞浸潤，但沒有一種合成激動劑針對致死性綠膿假單胞菌肺炎提供有力保護(圖15)。Pam2CSK4、Flg22和咪喹莫特有保護傾向，但這些都沒有達到單個實驗或多次實驗平均值的統計學顯著性。MPLA處理的小鼠在病原體攻擊後顯示針對死亡率提高的非顯著趨向。TLR2/6和TLR9激動劑的組合誘導了對肺炎的高水平抵抗力。儘管單一的合成TLR 激動劑僅提供中等程度的保護，但可能的是多種PRR的同時刺激為誘導高水平抵抗力所需 (Clement等，2008 ；Evans等，2010)。為了確定TLR激動劑的組合是否可以誘導抗性，本發明人測試了七種合成配體的配對排列。值得注意的是，利用Pam2CSK4和0DN2395 (0DN+Pam2)同時處理導致100%的小鼠在其他情況下為致死性的革蘭氏陰性綠膿假單胞菌攻擊下存活(圖16A，左)，和80%的小鼠在革蘭氏陽性肺炎鏈球菌的致死性攻擊下存活(圖16B，左)。在氣霧劑處理中將兩種配體的濃度加倍導致90%在肺炎鏈球菌攻擊下存活(圖16B)。保護小鼠免於致死性感染攻擊與肺內病原體的協同殺傷相關(圖16A和16B，右)，並且將配體濃度加倍與更高病原體殺傷的傾向相關。在4小時和M小時，在白細胞向肺的募集中觀察到了 Pam2CSK4與0DN2395 的協同相互作用(圖16C)。這些結果表明，TLR2/6和TLR9的配體誘導抗微生物效應應答 (包括病原體殺傷和白細胞募集的那些應答)的協同活化，其導致針對肺炎的保護的協同水平。與NTHi溶胞產物誘導的抵抗力的動力學類似，在處理後4小時存在保護。不是所有的TLR激動劑組合都產生針對感染的有力保護。本發明人測試了 TLR激動劑的以下組合Pam2+Poly(I:C)、Pam2+Flg22、Pam2+ 咪喹莫特、ODN+Poly (I C)、ODN+Flg 22和0DN+Pam3。本發明人發現這些組合與Pam2-0DN組合(圖16)相比，在針對綠膿假單胞菌進行保護時效力較低(圖17A-F)。這些結果揭示，不是所有的TLR激動劑組合都賦予與Pam2-0DN相同的免疫刺激。TLR2足以促進保護性Pam2SCK4和0DN2395協同性，但不是誘導抵抗力所必需的。 TLR配體Pam2SCK4和0DN2395 (其具有充分定義的受體特異性)的協同效應的檢測提供了 TLR2/6和TLR9參與的推定證據。本發明人使用敲除小鼠和其他配體尋找額外的證據。本發明人比較了在綠膿假單胞菌攻擊前用Pam2-0DN或PBS預處理的野生型和 TLR2缺陷型小鼠的存活。野生型小鼠被Pam2-0DN完全保護，但在sham處理的野生型組或任一 Tlr2+組中沒有存活(圖18A，左圖)，證明在Pam2-0DN誘導的保護中需要TLR2。 Tlr2+小鼠中缺少保護與缺乏Pam2-0DN誘導的肺內病原體殺傷密切相關(圖18A，右圖)。因為 Pam2CSK4 和 Pam3CSK4 區分 TLR2/6 和 TLR2/1，並且與 0DN2395 組合時， Pam2CSK4產生強烈的協同保護效應而Pam3CSK4則不然，所以可能需要TLR2/6異二聚體來誘導肺上皮抵抗力。本發明人還在NTHi溶胞產物處理後攻擊Tlr2+和野生型小鼠，並發現保護未喪失(圖18B，左圖)，也未喪失溶胞產物誘導的細菌殺傷(圖18B，右圖)。總之， 這些結果提示，TLR2/6足以與TLR9協同相互作用，但並不是所有誘導的肺上皮抵抗力所必需的。C型CpG ODN與Pam2SCK4協同相互作用而誘導對細菌性肺炎的抵抗力，而A型和 B型則不然。本發明人試圖進一步評估TLR9是否為與Pam2-0DN的協同相互作用所需。因為沒有Tlr9+小鼠可用，所以本發明人使用已知不結合TLR9的亂序ODN來測試TLR9的參與。用Pam2-0DN預處理導致綠膿假單胞菌攻擊的小鼠90 %存活，但用Pam2SCK4和對照ODN 預處理時導致沒有存活(圖19A)，表明ODN與TLR9的結合為協同保護所需。
為了進一步探索Pam2-0DN相互作用的特異性，本發明人在用綠膿假單胞菌攻擊之前用Pam2CSK4和不同類型的CpG ODN處理野生型小鼠。A型0DN(0DN 1585或ODN 2216)或B型ODN(ODN 2006-G5)與Pam2SCK4的組合不能賦予保護，而Pam2SCK4與C型 ODN(0D匪362或ODN 2395)的組合促進對其他致死性肺炎的顯著抵抗力(圖19B)。這些結果表明，TLR2/6和TLR9配體不僅協同作用，而且特定的配體比其他配體更有利於相互作用。Pam2CSK4和0DN2395在體外通過上皮細胞誘導細菌殺傷。當用NTHi溶胞產物刺激時，肺上皮細胞被誘導以殺死細菌(Clement等，2009 ;Evans等，2010)。因為Pam2_0DN 在體內重現了細菌溶胞產物的免疫刺激效應，本發明人測試了所述組合是否也可以在體外誘導分離的肺上皮細胞進行病原體殺傷。用Pam2-0DN預處理小鼠MLE-15呼吸道上皮細胞 4小時顯著了減少接種炭疽芽孢桿菌後的細胞培養基中的細菌CFU(圖20A)。同樣地，用 Pam2-0DN處理人A549細胞導致感染後4小時綠膿假單胞菌CFU的顯著減少(圖20C)。證明了病原體殺傷是通過刺激上皮細胞，而不是通過Pam2-0DN的直接抗生素效應，細菌在不含上皮細胞的孔中生長至相等數量，不管它們是用Pam2-0DN處理還是用PBS處理(圖20B 和 20D)。因此，在小鼠和人上皮細胞中均誘導了抗微生物效應，並且導致殺死革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌病原體。這些數據模擬了在體內Pam2-0DN處理後觀察到的細菌殺傷。連續提高Pam2-0DN劑量至本文所示的32倍並未顯著提高病原體殺傷。Pam2CSK4和0DN2395在體內細胞內共定位。Pam2CSK4和0DN2395相互作用誘導協同作用的機制仍然未解出。因為TLR2/6被報導定位在質膜上，而TLR9被報導定位在內體中(Beutler，2009 ；Dostert等，2008)，所以人們無法預見到所述配體的物理相互作用。 然而，因為TLR4可能需要內化來進行信號轉導(Kagan等，2008)，於是本發明人研究了這兩個配體是否被上皮細胞內化。在細胞培養載玻片上單層培養A549細胞，然後用在病原體殺傷實驗中使用的相同濃度的FITC標記的Pam2CSK4(10 μ g/ml)和"Texas Red標記的 0DN2395 (20 μ g/ml)進行處理。2小時後，洗滌細胞，用DAPI標記細胞核，並用螢光顯微鏡觀察所述載玻片。Pam2CSK4和0DN2395均被上皮細胞內化。此外，Pam2CSK4和0DN2395在胞質區室內(推測在內體內)共定位。這些結果提示Pam2CSK4和0DN2395可能在內體內共定位。利用Pam2CSK4、TLR2/6 激動劑和 C 型 ODN(2395、10101 或 M36」、TLR9 激動劑的組合進行預處理誘導了對炭疽芽孢桿菌和流感病毒肺感染的高水平抵抗力。在用炭疽芽孢鼻內攻擊或利用流感病毒氣霧劑攻擊前1天，如所示用霧化的TLR配體預處理小鼠。監測了小鼠的存活。參考文獻以下參考文獻明確地以援引方式併入本文，其程度為它們為本文所述內容提供補充性示例方法或其他細節。美國專利4，554，101美國專利4，668，218美國專利4，689，338美國專利4，929，624
美國專利5，ぬ8，944美國專利5，洸6，575美國專利5，洸8，376美國專利5，；346，905美國專利5，；352，784美國專利5，389，640美國專利5，389，640美國專利5，389，640美國專利5，395，937美國專利5，458，135美國專利5，482，936美國專利5，494，916美國專利5，525，612美國專利6，039，969美國專利6，110，929美國專利6，110，929美國專利6，194，425美國專利6，331，539美國專利6，331，539美國專利6，451，810美國專利6，488，953美國專利6，737，045美國專利6，794，；357美國專利6，797，258美國專利申請11/830，622美國專利公開20030225016美國專利公開2004/0162309美國專利公開2004/0171086美國專利序列號10/844,933Abuchowski 等，J. Biol. Chem.，252 :582,1977.Adachi 等，Immunity,9 143—150，1998.Akinbi 等，J. Immunol.，165 (10) :5760-6, 2000.Akira 等，Biochem. Soc. Trans.，31 (Pt 3) =637-42, 2003.Akira 等，Cell, 124 :783-801,2006.Alexopoulou 等，Nature, 413 :732-738, 2001.Aliprantis 等，Science, 285 :736-739,1999.Aliprantis 等，Science, 285 :736-739,1999.Bals 禾ロ Hiemstra，Curr. Drug Targets,7(6) :743-50,2006.Bals 和 Hiemstra, Eur. Respir. J.，23 (2) :327-33. 20，2004.
Bals 和 Hiemstra，Eur. Respir. J.，23 :327-333, 2004.Barker 等，J. Med. Chem.，35 :2040-2048，1992.Bartlett 等，Microbiol.，15 147-163，2008.Beauchamp 等，Anal. Biochem.，131 :25，1983.Beutler，Blood,113 :1399-1407,2009.Biological Approaches to the Controlled Delivery of Drugs,R. L. Juliano, New York Academy of Sciences,1988.Buwitt-Beckmann 等，FEBS J.，272 :6354-6364, 2005.Chen 等，Biochim. Biophy. Acta, 660 :293,1981.Clement 等，Am. J. Respir. Crit. Care Med.，177 :1322-1330，2008.Clement 等，Respir. Res.，10 :70, 2009.Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等(Eds. ),1987.Dennis 等，JAMA, 285 :2763-2773, 2001.Dostert 等，Adv. Drug Deliv. Rev.，60 :830-840, 2008.Edwards 等，Cancer Res. ,62 :4671-4677,2002.European Appln. EP 0237507Evans 等，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.，31 (4) :382-94, 2004.Evans 等，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.，32 (6) :490-7，2005.Evans φ, Am. J. Respir. Cell Molec. Biol. , 42 :40-50, 2010.Evans 等，Annu. Rev. Physiol.，(72) 413—35，2010.Fanger 等，J. Leukocyte Biology, 66 :231-236,1999.Forteza 等，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. ,32(5) :462-9,2005.Gorden 等，J. Immunol.，174 :1259-1268，2005.Hayashi 等，Nature, 410 :1099-1103，2001.Hiemstra, Exp. Lung Res.，33 :537-542,2007.Hippenstiel 等，Respir. Res.，7 :97,2006.Hruby 等，Biochem J.，268 :249-262,1990.Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism :Chemistry, Biochemistry, and Enzymology, Bernard Testa, Vch Verlagsgesellschaft Mbh,2003.Ishii 等，Cell Host Microbe.，3 :352-363,2008.Janeway, Jr.禾口 Medzhibtov，Annu. Rev. Immunol. ,20 :197—216，2002.Kagan 等，Nat. Immunol.，9 :361-368, 2008.Kaisho 等，Biochim. Biophys. Acta，1589(1) :1-13,2002.Kearney 等，Immunity, 1 :327,1994.Kellner 等，Biol. Chem. 373 :1 :51-5,1992.Kita 等，Drug Des. Delivery, 6 :157,1990.Knauf 等，J. Biol. Chem.，263 :15064，1988.Knowles 等，J. Clin. Invest.，109 (5) :571-7，2002.Krug 等，Eur. J. Immunol.，31 :2154-2163, 2001.
Kyte 和 Doolittle，J. Mol. Biol.，157(1) :105 132,1982.Lee 等，J. Lipid Res.，44 :479-486, 2003.Lee 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 :6646-6651，2003.Martin 禾口 Frevert，Proc. Am. Thorac. Soc.，2(5) :403-11,2005.Martin 等，Infect. Immun.，71 :2498-2507, 2003.Medzhitov 禾口 Janeway, Jr. , Curr. Opin. Immunol. , 9 (1) :4-9,1997.Medzhitov 禾口 Janeway，Jr. ，Trends Microbiol. ，8 (10) :452-456, 2000.Medzhitov 等，Mol. Cell，2 O) :253-8,1998.Mizgerd, N. Engl. J. Med.，358 :716-727, 2008.Moghaddam 等，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.，38 :629-638, 2008.Mondino 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (6) :2245-52,1996.Morgan 禾口 Gainor，Ann. Rep. Med. Chem.，24 :243-252,1989.
Rev.Immunol.，7 :353-364,2007. :3146-3149,1991.Nagase 等，J Immunol.
0，Neill 和 Bowie, Nat
Or 等，J. Org. Chem. , 56
PCT申請WO00/"6518
PCT申請WO02/,46189
PCT申請WO02/,46192
PCT申請WO02/,46193
PCT申請WO94/,06498
PCT申請WO94//08552
PCT申請WO94//16970
PCT申請WO97/々5086
PCT申請WO98//16427
PCT申請WO98/,35888
PCT申請WO98//55495Poltorak 等，Science, 282 (5396) :2085-8,1998.Prodrugs :Topical and Ocular Drug Delivery,Kenneth Sloan,Marcel Dekker 1992.Pulendran 等，J. Exp. Med. ,188(11) :2075-82,1998.Rogan 等，Respir. Res. ,7 :29, 2006.Roman 等，Nat. Med.，3 (8) :849-54,1997.Schutte 禾口 McCray，Annu. Rev. Physiol.，64 :709-748,2002.Seifer 等，Biochem. J.，26 :795-802,1990.Shi 等，J. Biol. Chem.，284 :20540-20547,2009.Takeda 禾口 Akira, J. Dermatol. Sci.，34 (2) :73-82, 2004.Takeda和 Akira，Semin. Immunol.，16 :3-9,2004.Takeuchi 等，Int. Immunopharmaco 1.，1 (4) :625-35, 2001.Travis 等，Curr. Opin. Immunol.，13 (1) :89-95, 2001.
Tsutsumi 等，J. Controlled Rel.，33 :447,1995.Tuvim 等，PLoS ONE, 4 :e4176，2009.Vroegop 等，Intl. J. Immunopharmaco 1.，21 :647-662,1999.Williams 等，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. ,34(5) :527-36. 10,2006.Yamamoto 等，Science，301 :640-643, 2003.
權利要求
1.治療、抑制或減輕微生物感染的方法，其包括向患有微生物感染或有發生或獲得微生物感染之風險的個體施用有效量的TLR9激動劑和TLR2/6激動劑。
2.權利要求1的方法，其中所述TLR2/6激動劑是PAM2CSK4。
3.權利要求1的方法，其中所述TLR9激動劑是C型寡脫氧核苷酸(ODN)。
4.權利要求3的方法，其中所述C型ODN是0DN2395或0DNM362或ODWOlOl。
5.權利要求1的方法，其中所述受試者已經接觸了病原性微生物。
6.權利要求1的方法，其中所述微生物是病毒、細菌或真菌。
7.權利要求6的方法，其中所述病毒是腺病毒科、冠狀病毒科、絲狀病毒科、黃病毒科、 嗜肝DNA病毒科、皰疹病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、肺病毒亞科、小核糖核酸病毒科、 痘病毒科、逆轉錄病毒科、披膜病毒科、副流感病毒、流感病毒、H5N1、馬爾堡病毒、伊波拉病毒、嚴重急性呼吸器官症候群冠狀病毒、黃熱病病毒、人呼吸道合胞體病毒、漢坦病毒或痘苗病毒。
8.權利要求6的方法，其中所述細菌是炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aerugenosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)、月市炎葡萄球菌(Staphylococcus pneumonia)、嗜麥芽糖寡養單胞菌(Staphlyococcus maltophilia)、 ■{白克霍爾德氏 (Burholderia spp.)或莫才立氏胃(Moraxella spp·)。
9.權利要求6的方法，其中所述真菌是麴黴、假絲酵母、隱球菌、組織胞漿菌、球孢子菌、芽生菌、接合菌或肺囊蟲。
10.權利要求1的方法，其中所述TLR9激動劑和所述TLR2/6激動劑以噴霧製劑施用。
11.權利要求1的方法，其中所述有效量的TLR9激動劑和TLR2/6激動劑沉積在所述個體的肺中。
12.權利要求1的方法，其中所述TLR9激動劑和所述TLR2/6激動劑以約0.lmg/kg到約100mg/kg個體體重的量施用。
13.可藥用組合物，其包含TLR9激動劑和TLR2/6激動劑、抗炎劑以及一種或多種藥物賦型劑，其中所述組合物是無菌的並基本不含病原性微生物。
14.權利要求13的組合物，其中所述組合物配製成用於噴霧。
15.權利要求13的組合物，其中所述TLR2/6激動劑是PAM2CSK4。
16.權利要求13的組合物，其中所述TLR9激動劑是C型寡脫氧核苷酸(ODN)。
17.權利要求13的組合物，其中所述C型ODN是0DN2395或0DNM362或ODWOlOl。
全文摘要
本發明的實施方案涉及在患有微生物感染或有發生這種感染之風險的個體中治療、抑制或減輕微生物感染的方法，其包括向所述個體施用有效量的TLR9和TLR2/6激動劑的步驟。
文檔編號C07K14/705GK102439153SQ201080022634
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月25日 優先權日2009年3月25日
發明者伯頓·迪基, 斯科特·埃文斯, 麥可·圖維姆 申請人:德克薩斯大學系統董事會