人holf402蛋白及其編碼序列的製作方法

2023-05-20 16:26:01

專利名稱：人holf402蛋白及其編碼序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、基因工程學、腫瘤學、細胞生物學領域。具體地，本發明涉及一種在人類肝臟等多種組織中表達的Human Olfactomedin-like protein 402(HOLF402)蛋白及其核酸序列。本發明還涉及該蛋白和核酸序列的製備方法和用途。
背景技術：
在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報導過人類HOLF402蛋白。
青光眼目前已成為主要的、不可逆的致盲性眼病之一。在我國非選擇性人群中，原發性青光眼的發病率是0.52％，年齡超過40歲的人群中，原發性青光眼的發病率高達1.2％。而原發性開角型青光眼的發病機理複雜、起病隱匿、早期自覺症狀少，往往是已經造成了較嚴重的視功能損害才得到診斷；另一方面，由於甾體類激素尤其是糖皮質激素在眼科和全身疾病中的廣泛應用和濫用，激素性青光眼的發病率迅速上升，且大多數見於青少年男性，其臨床表現和病理生理特徵與原發性開角型青光眼極為相似，同時也因為原發性開角型青光眼對糖皮質激素呈高度敏感的眼壓升高反應，二者之間的關係受到重視。由於青光眼的盲目是不可逆的，由此而造成經濟損失與增加的社會負擔是相當巨大的。因此，對原發性開角型青光眼與激素性青光眼發病機理的研究，已成為眼科領域的重要而迫切的課題。
嗅覺介導素是嗅神經上皮的細胞外基質的一種主要成分。嗅覺介導素結構域最先在嗅覺介導素中發現。這個胞外結構域家族的主要成員多在後生動物蛋白中發現，如latrophilins，myocilins，和noelins。但它們的的生物學功能仍在研究中。myocilin中嗅覺介導素結構域的突變多導致原發性開角型青光眼。體外實驗也證明了大鼠的optimedin與myocilin蛋白通過嗅覺介導素結構域相互作用。
隨著分子生物學技術的廣泛應用與發展，與原發性開角型青光眼及激素性青光眼發病最有可能相關的基因已經被發現，即TIGR(Trabecular meshwork induced glucocurticoidresponse protein)基因。TIGR基因在C末端有一個嗅覺介導素(OLFM)樣區，與嗅覺介導素40％同源，嗅覺介導素是嗅神經上皮的細胞外基質的一種主要成分，這個區域含有所有已經報告的TIGR基因突變，提示其與細胞結合活性有關。故此，推測TIGR基因在這個位置突變可以阻礙蛋白的吸收與代謝，造成蛋白的堆積阻止房水流出而使眼內壓升高，這種異常的眼壓調節最後將導致不可逆的青光眼性的視功能損害。
故此，推測holf402蛋白可能也與眼病尤其是青光眼的發病機理有一定的聯繫。

發明內容
本發明的第一目的就是提供一種新的人基因HOLF402，該基因是一個人HOLF402蛋白基因。
本發明的第二目的是提供一種新的人蛋白人HOLF402。
本發明的第三目的是提供一種利用重組技術生產上述的新的人HOLF402蛋白和核酸序列的方法。
本發明還提供了這種人HOLF402蛋白多肽和編碼序列的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有人HOLF402蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，即所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1中從核苷酸第395-1603位DNA分子的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離出的人HOLF402蛋白質多肽，它包括具有SEQ IDNO.2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本發明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉化的宿主細胞。在一個實例中該宿主細胞是大腸桿菌；在另一實例中，該宿主細胞是真核細胞。
在本發明的另一方面，還提供了一種產生具有人HOLF402蛋白質活性的多肽的方法，該方法包括(1)將編碼具有人HOLF402蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成人HOLF402蛋白表達載體；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人HOLF402蛋白的重組細胞；(3)在適合表達人HOLF402蛋白多肽的條件下，培養步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有人HOLF402蛋白活性的多肽。
在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.1中第395-1603位的序列。
在本發明中，「分離的」、「純化的」或「基本純的」DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語「人HOLF402蛋白(或多肽)編碼序列」指編碼具有人HOLF402蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第395-1603位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID NO.1序列的編碼框第395-1603位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ IDNO.1中第395-1603位核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第395-1603位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸第395-1603位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與天然的人HOLF402相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，「基本純的」蛋白質或多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語「人HOLF402蛋白或多肽」指具有人HOLF402蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與天然人HOLF402相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人HOLF402蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發明的人HOLF402多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與人HOLF402DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人HOLF402多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人HOLF402多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括人HOLF402多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人HOLF402多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
在本發明中，「人HOLF402保守性變異多肽」指與SEQ ID NO.2的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行替換而產生。
表1

發明還包括人HOLF402蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人HOLF402多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發明的人HOLF402多肽時，可以將人HOLF402編碼序列可操作地連於表達調控序列，從而形成人HOLF402蛋白表達載體。
如本文所用，「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
本發明還提供了對人HOLF402特異的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發明中，可以使用一系列本領域已知的方法來製備針對人HOLF402特異的抗體。例如，將提純的人HOLF402基因產物或它的抗原片段注射入動物體內以產生多克隆抗體。同樣，表達人HOLF402或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物致免疫而產生抗體。根據本發明製備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術製備(例如，Kohler et al.，Nature 256495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6292，1976)。本發明的抗體包括可以阻抑人HOLF402功能的抗體，也可以是不影響人HOLF402功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人HOLF402基因產物的片段或功能域致免疫而產生，而人HOLF402基因產物及其片段可以用重組方法產生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的人HOLF402基因產物結合的抗體，可以通過用在原核細胞例如E.coli中產生的基因產物來免疫動物而得到。與翻譯後修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結合的抗體，可以通過用在真核細胞如酵母或昆蟲細胞中產生的基因產物的來免疫動物而得到。
本發明的人HOLF402抗體可以用來鑑定表達人HOLF402蛋白或多肽的細胞，如Jurkat T細胞。例如，可以用一種可檢測的分子例如螢光素異硫氰酸(FITC)來標記人HOLF402特異抗體，然後讓人HOLF402特異抗體與細胞樣品接觸，再用螢光顯微鏡或流式細胞儀檢測出與人HOLF402特異抗體結合的細胞。
除了在細胞表面檢測人HOLF402外，還可以用Western印跡技術分析該蛋白質。細胞裂解液可以從培養細胞或取自病人的組織標本如肝臟中提取，並溶解在含有去汙劑的裂解緩衝液中。然後用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分離細胞提取物(同時將提純的人HOLF402多肽作為陽性對照)，接著通過電泳雜交將其轉移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測人HOLF402多肽，可以使用典型的抗體結合檢測方法，例如放射自顯影或鹼性磷酸酶檢測方法。並可使用免疫接種血清或不相關的單克隆抗體作為非特異反應的對照。
還可用Nothern印跡法技術分析人HOLF402基因產物的表達，即分析人HOLF402的RNA轉錄物在細胞中的存在與否和數量。
人HOLF402DNA的Nothern印跡分析和人HOLF402特異抗體的Western印跡分析可以聯合使用，以證實人HOLF402在生物樣本中的表達。人HOLF402DNA還可以用於Southern印跡分析或原位雜交分析，以將該基因定位於染色體上，並可進行遺傳連鎖分析以找出其它可能的疾病相關基因。
此外，本發明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人HOLF402核苷酸編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼人HOLF402的核酸分子。
本發明還提供了檢測樣品中是否存在人HOLF402核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於人HOLF402核苷酸編碼序列，並可位於該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
此外，根據本發明的人HOLF402核苷酸序列和胺基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質的同源性基礎上，篩選人HOLF402同源基因或同源蛋白。
為了得到與人HOLF402基因相關的人cDNAs或基因組DNAs的點陣，可以用DNA探針篩選人cDNA或基因組DNA文庫，這些探針是在低嚴緊條件下，用32P對人HOLF402的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合於篩選的cDNA文庫是來自人肝臟組織的文庫。來自參與內分泌的其它人體組織或特定人體細胞株的cDNA文庫也可用於篩選目的。構建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學領域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與人HOLF402相關的基因家族的核苷酸序列。
根據核苷酸相似性篩選人HOLF402同源物可以按如下方法完成。人體肝臟cDNA文庫，例如Clontech Cat.#7429-1(Clontech，Palo Alto，Cal.)可以使用一段包含人HOLF402基因序列的全部或部分的隨機引物化DNA探針篩選。要完成對與人HOLF402序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鑑定，可以使用雜交溫度為55℃的雜交液，然後用0.5×SSC和0.1％SDS清洗。用這種方法識別的克隆的DNA插入序列可以進一步用DNA限制性內切酶分析和DNA測序來評價它與人HOLF402基因的相似性。組織表達的分布可以用上述的Northern印跡法技術分析。
人HOLF402同源物也可以用針對人HOLF402蛋白或多肽的抗體來識別。例如，可以用標準的方法對商品化的或者用已知方法構建的，來自細胞或者組織例如肝臟的表達文庫進行篩選。將文庫倒入平皿，菌落轉移到一張硝化纖維素膜上，使表達的重組蛋白結合到膜上。然後就可以用特異性的人HOLF402抗體進行典型的抗體結合和檢測。用這種方法所識別出克隆中的DNA插入序列，可以進一步用DNA限制性內切酶分析和DNA測序進行分析以評價它與人HOLF402基因的相似性。新識別的基因的組織表達分布可以同樣地按上述方法進行分析。
本發明的人HOLF402核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工化學合成的方法來合成有關序列。在本申請之前，現有技術已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然後再進行連接而獲得編碼本發明人HOLF402蛋白的的核酸序列。然後，可將該核酸序列引入本領域中各種現有的DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
除了用重組法產生之外，本發明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽。可以分別化學合成本發明蛋白的各片段，然後用化學方法加以連接以產生全長的分子。
本發明蛋白的編碼序列可用於基因定位。例如，通過螢光原位雜交技術(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進行雜交，可以準確地進行染色體定位。該技術可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長至約2000bp或者更長的cDNA。對於該技術，可參見Verma等人，Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位於染色體上的某個精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數據相關聯。這些遺傳圖譜數據是可以獲得的，例如通過孟德爾(Mendelian)人遺傳資料庫(可通過Johns Hopkins University Welch Medical Library在網上獲得)。然後，通過連鎖分析來鑑定基因與已定位於同一染色體區域的疾病之間的相關性。
接著，有必要確定患病個體和健康個體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在於部分或全部患病個體但不存在於正常個體，那麼該突變可能就是該疾病的致病因素。
利用本發明的人HOLF402蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與人HOLF402發生相互作用的物質或，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發明人HOLF402蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常為約5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、腹膜內、皮下、皮內、或局部給藥。
以本發明的人HOLF402蛋白為例，可以將其與合適的藥學上可接受的載體聯用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的人HOLF402蛋白可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當本發明的人HOLF402蛋白多肽被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用於哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
通過同源檢索發現，本發明的新基因具有與已發表並被確認為小家鼠HOLF402蛋白的基因高度同源的序列，並且本發明的新蛋白具有小家鼠HOLF402蛋白高度保守的胺基酸序列。所以，本發明的人HOLF402是小家鼠HOLF402蛋白基因的一個同源基因而具有相似的功能。


圖1為本發明的人HOLF402與小家鼠HOLF402基因核酸序列(GenBank Accession No.AK078505)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的核苷酸用「|」標出。
圖2為本發明的人HOLF402蛋白與小家鼠HOLF402蛋白的胺基酸序列(SwissProtAccession No.BAC37312.1)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的胺基酸在兩個序列之間用胺基酸單字符標出，相似的胺基酸用「+」標出。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人HOLF402基因的克隆1.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎上，進行cDNA全長克隆，分兩階段進行(1)「電子克隆」(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針搜尋dbEST資料庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達序列標籤(Expressed Sequence Tag，簡稱「EST」)序列認為同一序列(consensussequence)，取出並用AUTOASSEMBLER軟體進行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟體分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和胺基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通常可獲取人HOLF402基因的全長序列。
(2)cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過「電子克隆」方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列的5』或3』端設計引物，在人類肝臟Marathon-Ready cDNA文庫(Clontech Lab，Inc，USA)中進行長距離PCR反應。然後對PCR產物克隆、測序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟體分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重複上述過程直至獲得全長。
(3)RT-PCR對於5』和3』端已知的序列，如果中間尚有一段間隙(gap)無法從已有的公共資料庫或自身資料庫獲得，可考慮採用RT-PCR的方法。在序列5』端設計引物，3』端引物採用Oligo-dT，在肝臟總RNA庫中進行擴增。然後對產物進行克隆、測序。最後拼接並獲得全長。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的人HOLF402蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎上，進一步設計引物R15』-CCGGCTAGCAGAAGAGCCACAGCATAAG-3』(SEQ ID NO.3)為正向引物，寡核苷酸R25』-GCCGGTACCCTTCAGAGGCAGCTTTCTC-3』(SEQ ID NO.4)為反向引物，以人9種組織的混合cDNA(spleen，heart，brain，thymus，small intestine，testis，lung，kidney，liver)為模板，進行PCR擴增，R1/R2的PCR條件為94℃4分鐘，隨之以94℃40秒、58℃30秒和72℃1.5分鐘進行35個循環，最後以72℃延伸7分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，獲得擴增片段長度為1252bp。然後按常規方法以PCR擴增產物進行克隆、測序，獲得SEQ ID NO.1所示的序列。
實施例2人HOLF402基因的序列信息與同源性分析本發明新的人HOLF402全長cDNA的長度為2320bp，詳細序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位於395-1603位核苷酸。根據全長cDNA推導出人HOLF402的胺基酸序列，共402個胺基酸殘基，分子量45950.89，pI為8.29。詳細序列見SEQ ID NO.2。
將人HOLF402的全長cDNA序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundantGenBank +EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations +PDB+SwissProt+Superdate+PIR資料庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與小家鼠的基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與小家鼠unnamed protein基因的mRNA全編碼序列(GenBank Accession No.NM_172907)的1152-1373位鹼基有83％的相同性，186-238位鹼基有78％的相同性(圖1)，在胺基酸水平上，它與小家鼠HOLF402蛋白(SwissProtAccession No.BC047207.1)的第1-233位胺基酸殘基有80％的相同性和85％的相似性(圖2)。由上可見，人HOLF402基因與小家鼠HOLF402基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，屬於同一家族並且兩者在功能上也有很高相似性。
本發明的人HOLF402除了可作為該家族一員用於進一步的功能研究，還可用於與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明的人HOLF402還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發明的人HOLF402蛋白的N端與小家鼠HOLF402蛋白的N端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發明人HOLF402的抗體，用於篩選該家族的其他成員，或者用於親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發明人HOLF402核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人HOLF402的表達水平或者抑制人HOLF402的過度表達。本發明的人HOLF402蛋白或其活性多肽片段可以施用於病人，以治療或減輕因人HOLF402缺失、無功能或異常而導致的有關病症。此外，還可以用基於本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預後判斷。
由於本發明的人HOLF402蛋白具有源自人的天然胺基酸序列，因此，與來源於其他物種(如小家鼠)的同族蛋白相比，預計在施用於人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。
實施例3人HOLF402蛋白的結構和功能研究將人HOLF402蛋白的胺基酸序列在PROSITE資料庫(網址為http://expasy.hcuge.ch/sprot/scnpsitl.btml)中檢索基序(motif)，得到以下結果1 MMVALRGASA LLVLFLAAFL PPPQCTQDPA MVHYIYQRFR VLEQGLEKCT51 QATRAYIQEF QEFSKNISVM LGRCQTYTSE YKSAVGNLAL RVERAQREID101 YIQYLREADE CIESEDKTLA EMLLQEAEEE KKIRTLLNAS CDNMLMGIKS151 LKIVKKMMDT HGSWMKDAVY NSPKVYLLIG SRNNTVWEFA NIRAFMEDNT201 KPAPRKQILT LSWQGTGQVI YKGFLFFHNQ ATSNEIIKYN LQKRTVEDRM251 LLPGGVGRAL VYQHSPSTYI DLAVDEHGLW AIHSGPGTHS HLVLTKIEPG301 TLGVEHSWDT PCRSQDAEAS FLLCGVLYVV YSTGGQGPHR ITCIYDPLGT
351 ISEEDLPNLF FPKRPRSHSM IHYNPRDKQL YAWNEGNQII YKLQTKRKLP LK(1)在胺基酸序列中，存在以下功能基序黑體區(162-397)Olfactomedin-like domain(2)功能分析Olfactomedin-like domain屬於olfactomedin家族，在多種蛋白如olfactomedin，myocilin，pancortin和latrophilin中存在。
實施例4人HOLF402多肽的製備和提純在該實施例中，將全長的人HOLF402編碼序列或片段構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
1.將人HOLF402多肽以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進行原核表達。
原核表達載體的構建，以及轉化大腸桿菌根據人HOLF402的全長編碼序列(SEQ ID NO.1)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應於編碼序列5』和3』端的約20個以上核苷酸)，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據選用的pGEX-4T載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增後，將人HOLF402基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-4T-1載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑑定好的表達載體利用CaCl2方法轉入大腸桿菌DH5α，篩選鑑定得到含有pGEX-4T-1-HOLF402表達載體的工程菌DH5α-pGEX-4T-1-HOLF402。
表達GST-HOLF402重組蛋白的工程菌的分離鑑定挑取單菌落的DH5α-pGEX-4T-1-HOLF402工程菌於3ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中振搖培養過夜，按1∶100的濃度吸取培養液於新的YT培養基(含100μg/ml氨苄青黴素)中培養約3小時，至OD600達0.5後，加入IPTG至終濃度0.2mol/L繼續於30℃分別培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉澱物中加入裂解液(2×SDS上樣緩衝液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉澱，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入15％SDS-PAGE膠中電泳。染色後觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達GST-HOLF402融合蛋白的工程菌。
GST-HOLF402融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達GST-HOLF402融合表達蛋白的工程菌DH5α-pGEX-4T-HOLF402。誘導後的細菌離心沉澱，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細菌，超聲破碎細菌。破菌完全的超聲液離心取上清按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％穀胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉澱結合了GST-HOLF402的穀胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液加入10ml PBS的量清洗兩次，而後按每毫升超聲液加入10μl還原型穀胱苷肽洗脫液，4℃過夜洗脫，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重複洗脫兩次。洗脫的上清保存於-80℃，並進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在40kDa處的蛋白質條帶即為人HOLF402蛋白。
實施例5人HOLF402蛋白或多肽在CHO細胞中進行真核轉染證明分泌性1.人HOLF402桿狀病毒表達載體的構建及轉染細胞株根據人HOLF402的全長編碼序列(SEQ ID NO.1)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，並在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增後，將人HOLF402cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pcDNA3.1A載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑑定好的表達載體2μg，pcDNA3.1A DNA(BaculoGoldTMACMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無血清的DMEM培養基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)CHO細胞懸液於60mm組織培養板中，貼壁1小時後換轉染培養基，室溫孵育15分鐘後棄培養基，加入前面製備好的DNA載體轉染混合物，Parafilm密封培養板，於室溫27℃振搖培養4小時，而後換完全培養基培養3天，收集上清和細胞裂解液備用。
2.轉入重組表達載體的CHO細胞株的篩選鑑定轉染3天後的CHO細胞進行Western鑑定。將細胞裂解後進行SDS-PAGE電泳，電泳後的膠於Pharmacia的Multiphor II半乾電轉移儀中將蛋白質轉印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置於封閉液中封閉2小時，而後於c-myc抗體溶液中封閉1小時，PBST液振搖清洗10分鐘共3次，而後將膜置於螢光標記的DR第二抗體溶液中振搖1小時，PBST清洗，加入螢光顯色劑反應1分鐘，顯影觀察蛋白條帶。
發現該蛋白在上清和細胞裂解液中均有存在。
實施例6抗人HOLF402抗體的製備1.免疫小鼠和脾細胞的製備將上述獲得的人HOLF402蛋白用層析法進行分離後備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，並用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強免疫一次，3-5天後用於融合。其中，脾細胞製備見鄂徵主編，《組織培養和分子細胞學技術》，北京出版社，第210頁。
2.按《組織培養和分子細胞學技術》(同上)，第371頁中的方法，製備飼養細胞。
3.按《組織培養和分子細胞學技術》(同上)，第213頁中的方法，進行細胞融合。
4.抗體的檢測在細胞融合10-15天後，需逐孔進行檢查，一旦發現旺盛的雜交細胞集落生長，就應用人HOLF402蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫螢光試驗、發射免疫試驗(RIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。檢查出抗體活性的孔後，立刻進行克隆培養，並分離出抗體。
序列表110上海人類基因組研究中心120人HOLF402蛋白及其編碼序列130NP-13751604170PatentIn version 3.221012112320212DNA213Homo sapiens220
221CDS222(395)..(1603)4001gggggaaggg aacgggggga agccatcttc accccccacc ccaatgcaca cacaattaag 60ccaggaagca gcttgcaacc actagcctgg ggagggtccg catgtgtcaa gggtgagggc 120aacagatgct ggacccaggg agctctctgc cacaggtcag tctacaaggc ctcagggacc 180aacttgccaa cagctggact tgatcactag ctggcaaact gagctcacgt atcgggtgga 240ataacaagcg gactttgctc tctgctgtgc aaaacgctgt ttttagagga tttgccacag 300cagcggatag agcaggagag caccaccgga gcccttgaga catccttgag aagagccaca 360gcataagaga ctgccctgct tggtgttttg cagg atg atg gtg gcc ctt cga gga 415Met Met Val Ala Leu Arg Gly1 5gct tct gca ttg ctg gtt ctg ttc ctt gca gct ttt ctg ccc ccg ccg463Ala Ser Ala Leu Leu Val Leu Phe Leu Ala Ala Phe Leu Pro Pro Pro10 15 20cag tgt acc cag gac cca gcc atg gtg cat tac atc tac cag cgc ttt511Gln Cys Thr Gln Asp Pro Ala Met Val His Tyr Ile Tyr Gln Arg Phe25 30 35
cga gtc ttg gag caa ggg ctg gaa aaa tgt acc caa gca acg agg gca 559Arg Val Leu Glu Gln Gly Leu Glu Lys Cys Thr Gln Ala Thr Arg Ala40 45 50 55tac att caa gaa ttc caa gag ttc tca aaa aat ata tct gtc atg ctg 607Tyr Ile Gln Glu Phe Gln Glu Phe Ser Lys Asn Ile Ser Val Met Leu60 65 70gga aga tgt cag acc tac aca agt gag tac aag agt gca gtg ggt aac 655Gly Arg Cys Gln Thr Tyr Thr Ser Glu Tyr Lys Ser Ala Val Gly Asn75 80 85ttg gca ctg aga gtt gaa cgt gcc caa cgg gag att gac tac ata caa 703Leu Ala Leu Arg Val Glu Arg Ala Gln Arg Glu Ile Asp Tyr Ile Gln90 95 100tac ctt cga gag gct gac gag tgc atc gaa tca gag gac aag aca ctg 751Tyr Leu Arg Glu Ala Asp Glu Cys Ile Glu Ser Glu Asp Lys Thr Leu105 110 115gca gaa atg ttg ctc caa gaa gct gaa gaa gag aaa aag atc cgg act 799Ala Glu Met Leu Leu Gln Glu Ala Glu Glu Glu Lys Lys Ile Arg Thr120 125 130 135ctg ctg aat gca agc tgt gac aac atg ctg atg ggc ata aag tct ttg 847Leu Leu Asn Ala Ser Cys Asp Asn Met Leu Met Gly Ile Lys Ser Leu140 145 150aaa ata gtg aag aag atg atg gac aca cat ggc tct tgg atg aaa gat 895Lys Ile Val Lys Lys Met Met Asp Thr His Gly Ser Trp Met Lys Asp155 160 165gct gtc tat aac tct cca aag gtg tac tta tta att gga tcc aga aac 943Ala Val Tyr Asn Ser Pro Lys Val Tyr Leu Leu Ile Gly Ser Arg Asn170 175 180aac act gtt tgg gaa ttt gca aac ata cgg gca ttc atg gag gat aac 991Asn Thr Val Trp Glu Phe Ala Asn Ile Arg Ala Phe Met Glu Asp Asn185 190 195acc aag cca gct ccc cgg aag caa atc cta aca ctt tcc tgg cag gga1039Thr Lys Pro Ala Pro Arg Lys Gln Ile Leu Thr Leu Ser Trp Gln Gly200 205 210 215aca ggc caa gtg atc tac aaa ggt ttt cta ttt ttt cat aac caa gca1087
Thr Gly Gln Val Ile Tyr Lys Gly Phe Leu Phe Phe His Asn Gln Ala220 225 230act tct aat gag ata atc aaa tat aac ctg cag aag agg act gtg gaa1135Thr Ser Asn Glu Ile Ile Lys Tyr Asn Leu Gln Lys Arg Thr Val Glu235 240 245gat cga atg ctg ctc cca gga ggg gta ggc cga gca ttg gtt tac cag1l83Asp Arg Met Leu Leu Pro Gly Gly Val Gly Arg Ala Leu Val Tyr Gln250 255 260cac tcc ccc tca act tac att gac ctg gct gtg gat gag cat ggg ctc1231His Ser Pro Ser Thr Tyr Ile Asp Leu Ala Val Asp Glu His Gly Leu265 270 275tgg gcc atc cac tct ggg cca ggc acc cat agc cat ttg gtt ctc aca1279Trp Ala Ile His Ser Gly Pro Gly Thr His Ser His Leu Val Leu Thr280 285 290 295aag att gag ccg ggc aca ctg gga gtg gag cat tca tgg gat acc cca1327Lys Ile Glu Pro Gly Thr Leu Gly Val Glu His Ser Trp Asp Thr Pro300 305 310tgc aga agc cag gat gct gaa gcc tca ttc ctc ttg tgt ggg gtt ctc1375Cys Arg Ser Gln Asp Ala Glu Ala Ser Phe Leu Leu Cys Gly Val Leu315 320 325tat gtg gtc tac agt act ggg ggc cag ggc cct cat cgc atc acc tgc1423Tyr Val Val Tyr Ser Thr Gly Gly Gln Gly Pro His Arg Ile Thr Cys330 335 340atc tat gat cca ctg ggc act atc agt gag gag gac ttg ccc aac ttg1471Ile Tyr Asp Pro Leu Gly Thr Ile Ser Glu Glu Asp Leu Pro Asn Leu345 350 355ttc ttc ccc aag aga cca aga agt cac tcc atg atc cat tac aac ccc1519Phe Phe Pro Lys Arg Pro Arg Ser His Ser Met Ile His Tyr Asn Pro360 365 370 375aga gat aag cag ctc tat gcc tgg aat gaa gga aac cag atc att tac1567Arg Asp Lys Gln Leu Tyr Ala Trp Asn Glu Gly Asn Gln Ile Ile Tyr380 385 390aaa ctc cag aca aag aga aag ctg cct ctg aag taa tgcattacag 1613Lys Leu Gln Thr Lys Arg Lys Leu Pro Leu Lys395 400
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50 55 60Lys Asn Ile Ser Val Met Leu Gly Arg Cys Gln Thr Tyr Thr Ser Glu65 70 75 80Tyr Lys Ser Ala Val Gly Asn Leu Ala Leu Arg Val Glu Arg Ala Gln85 90 95Arg Glu Ile Asp Tyr Ile Gln Tyr Leu Arg Glu Ala Asp Glu Cys Ile100 105 110Glu Ser Glu Asp Lys Thr Leu Ala Glu Met Leu Leu Gln Glu Ala Glu115 120 125Glu Glu Lys Lys Ile Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Cys Asp Asn Met130 135 140Leu Met Gly Ile Lys Ser Leu Lys Ile Val Lys Lys Met Met Asp Thr145 150 155 160His Gly Ser Trp Met Lys Asp Ala Val Tyr Asn Ser Pro Lys Val Tyr165 170 175Leu Leu Ile Gly Ser Arg Asn Asn Thr Val Trp Glu Phe Ala Asn Ile180 185 190Arg Ala Phe Met Glu Asp Asn Thr Lys Pro Ala Pro Arg Lys Gln Ile195 200 205Leu Thr Leu Ser Trp Gln Gly Thr Gly Gln Val Ile Tyr Lys Gly Phe210 215 220Leu Phe Phe His Asn Gln Ala Thr Ser Asn Glu Ile Ile Lys Tyr Asn225 230 235 240
Leu Gln Lys Arg Thr Val Glu Asp Arg Met Leu Leu Pro Gly Gly Val245 250 255Gly Arg Ala Leu Val Tyr Gln His Ser Pro Ser Thr Tyr Ile Asp Leu260 265 270Ala Val Asp Glu His Gly Leu Trp Ala Ile His Ser Gly Pro Gly Thr275 280 285His Ser His Leu Val Leu Thr Lys Ile Glu Pro Gly Thr Leu Gly Val290 295 300Glu His Ser Trp Asp Thr Pro Cys Arg Ser Gln Asp Ala Glu Ala Ser305 310 315 320Phe Leu Leu Cys Gly Val Leu Tyr Val Val Tyr Ser Thr Gly Gly Gln325 330 335Gly Pro His Arg Ile Thr Cys Ile Tyr Asp Pro Leu Gly Thr Ile Ser340 345 350Glu Glu Asp Leu Pro Asn Leu Phe Phe Pro Lys Arg Pro Arg Ser His355 360 365Ser Met Ile His Tyr Asn Pro Arg Asp Lys Gln Leu Tyr Ala Trp Asn370 375 380Glu Gly Asn Gln Ile Ile Tyr Lys Leu Gln Thr Lys Arg Lys Leu Pro385 390 395 400Leu Lys
210321128212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4003ccggctagca gaagagccac agcataag 28210421128212DNA213人工序列220
221misc_feature223引物4004gccggtaccc ttcagaggca gctttctc 28
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特徵在於，它包括編碼具有人HOLF402蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第395-1603位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第395-1603位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.2所示的序列的多肽。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，該序列具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第395-1603位的核苷酸序列。
4.一種分離出的人HOLF402蛋白多肽，其特徵在於，它包括具有SEQ ID NO.2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
6.一種載體，其特徵在於，它包含權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.一種產生具有人HOLF402蛋白質活性的多肽的方法，其特徵在於，該方法包括(1)將編碼具有人HOLF402蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成人HOLF402蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第395-1603位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人HOLF402蛋白的重組細胞；(3)在適合表達人HOLF402蛋白多肽的條件下，培養步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出具有人HOLF402蛋白活性的多肽。
9.一種能與權利要求7所述的人HOLF402蛋白多肽特異性結合的抗體。
10.一種核酸分子，其特徵在於，它包含權利要求1所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明提供了一種在人體正常肝臟等多種組織中表達的新的人HOLF402蛋白及其編碼序列，本發明還提供了該蛋白和核酸序列的製備方法，以及在樣品中檢測人HOLF402核酸序列和多肽的方法。
文檔編號C07K16/18GK1724664SQ20041005305
公開日2006年1月25日 申請日期2004年7月22日 優先權日2004年7月22日
發明者朱弘, 周宇波, 黃健, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心