核酸衍生物及其製劑的製備方法

2023-05-20 17:47:41

專利名稱：核酸衍生物及其製劑的製備方法
技術領域：
本發明涉及醫用核酸衍生物的一種新穎製備方法。
核酸是核糖等的糖結合在嘌呤環或者嘧啶環上，由磷酸介於它們之間，並以鏈相連而成。
核酸中的RNA(核糖核苷酸聚合物)是鏈狀高分子化合物，它具有核糖作為糖，糖部分以磷酸二酯鍵相連結。在構成核酸的鹼(例如肌苷、腺苷、胞苷、尿苷等)的嘌呤環或者嘧啶環部分，兩條鏈以所謂互補的方式由氫鍵相連構成螺旋狀的立體結構。由於這種含有二條鏈的核酸可期待具有有效的生理活性，因此迄今為止已對此進行了大量研究[BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications58(1974)等]。
在本說明書中，其中把作為合成雙鍵RNA的多聚肌苷酸·多聚胞苷酸衍生物稱為「polyI·polyC」衍生物，而將其的構成單元，即多聚肌苷酸和多聚胞苷酸分別稱為「polyI」和「polyC」。
近年來，人們業已知道，各種天然或合成的雙鏈RNA具有幹擾素產生能(フィ-ルドウ。Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.581004(1967)。フィ-ルドウ。Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.582102(1967)。フィ-ルドウ。Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.61340(1968)。タィテルウ。Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.581719(1967)。フィ-ルドウ。J.Gen.Physiol.56905(1970)。デクラ-クウ。MethodsinEnzymology78.291(1981)]。
綜上所述，現歸納如下
作為幹擾素，誘導物的合成核酸衍生物一覽表(Ⅰ)均聚物·均聚物複合體(以polyI·polyC作為基體的雙鏈核酸聚合物)(1)改性鹼多聚肌苷酸·多聚(5-溴代胞苷酸)，多聚肌苷酸·多聚(2-硫代胞苷酸)，多聚(7-脫氮雜肌苷酸)·多聚胞苷酸，多聚(7-脫氮雜肌苷酸)·多聚(5-溴代胞苷酸)。
(2)改性糖多聚(2′-疊氮肌苷酸)·多聚胞苷酸。
(3)改性磷酸多聚肌苷酸·多聚[胞苷基(シチジン)-5′-硫代磷酸]。
(Ⅱ)交替變換共聚物多聚(腺苷酸-尿苷酸)。
(Ⅲ)均聚物·共聚物複合體多聚肌苷酸·多聚(胞苷、尿苷酸);多聚肌苷酸·多聚(胞苷酸、4-硫代尿苷酸)。
(Ⅳ)合成核酸與聚陽離子的複合體多聚肌苷酸·多聚胞苷酸·多聚-L-賴氨酸(稱為「polyICLC」)。
(Ⅴ)其他多聚肌苷酸·多聚(1-乙烯基胞苷酸)。
如上所述，近年來已發表了許多有關雙鍵RNA，特別是以polyI·polyC作為基體的衍生物的報告。而且，有人綜述了有關含有它們的一系列核酸衍生物及其結構活性[デクラ-クウ。TexasReportsonBiologyandMedicine4177(1982)]。
本發明人以現有技術為基礎，發現，polyI·polyC，以及以它作為基體的各種衍生物，在以全部分子的大小分布作為沉降定值時，通過將該值調整為4S～13S(鹼基數為50-10，000左右)，則它們既保持了以下所述的生理活性，而其毒性又大為降低，對此本發明人提出了專利申請[特願昭62-167433號，以及根據該申請提出的國內優先權聲明]。
在上述研究的同時，為了高效率地取得上述目的物，本發明人對於下述操作進行了各種研究(1)將分子大小的分布統一在50-10，0000左右鹼基數範圍內的操作[在本說明書中，將分子大小的分布調整在一定範圍內的操作稱為「分級」。此外在本發明中，由於伴有低分子化現象，故分級也意味著「短鏈化」);
(2)用二種單鏈核酸聚合物使之成雙鏈核酸聚合物的操作(在本說明書中，稱為「退火」(アニ-リニグ)。
表示核酸分子大小的單位常用的鹼基對(或稱「bp」)，是由核酸的鹼基數來表示其分子的大小(10bp係指具有10個鹼基的雙鏈聚合物)。在本說明書中，因為還要處理雙鏈聚合物以外的核酸聚合物，故而使用「鹼基數」的術語來代替bp(例如，所謂「10鹼基數」則表示具有10個鹼基的核酸聚合物)。
在要使核酸分子的大小特定時，則廣泛地使用通常的沉降定值(S值)，本發明人把具有已知分子大小的雙鏈DNA(M13噬菌體片段)作為對照群，採用下述的使用凝膠過濾柱的高效液相色譜法(HPLC)或者電泳法，通過與其對照群進行比較換算，即可求得上述的鹼基數。
以往，在表示核酸高分子的分子量時，廣泛地使用S值。現在市售的核酸高分子也以S值表示。但是，由於近年來實驗技術的進步，採用了凝膠電泳、凝膠過濾色譜、離子交換色譜等方法，建立了更為精確地測定分子量的手段，現在已經可以對其鏈長進行測定。這裡有一個S值表示與鏈長表示的關係問題，由於用S值表示時，各核酸分子選用固有值，因而作為表示核酸分子量的方法，S值表示和鏈長表示是否能正確地相對應，從這個角度上看，並非沒有問題。
在本發明的說明書中，當表示分子量時，本發明人按照至今的核酸化學的慣例，也記載了S值表示。但是，由於S值是將核酸高分子作為整個分子團(或者分子形態)來進行測定的方法，鑑於今後有必要更明確他表現分子量分布的界限，故將基於鏈長(在本說明書中為「鹼基數」)測定的表示方法也一併加以記載。
上面是從polyI·polyC及以其作為基體的各種衍生物的所謂分級的觀點出發，在製備分級的雙鏈核酸聚合物時，或採用使已存在的雙鏈核酸聚合物低分子化的方法，亦即採用在單鏈核酸聚合物退火後使其低分子化的方法。但是，在以往的方法中，分級需花費時間，因而不能快速地處理，故對於以工業規模來製備目的物方面有其不足之處。而且從收率角度上看也未必能使人滿足。
一方面，分級後，有必要使單鏈核酸聚合物進行硫化時，以往是用硫化氫硫化後，使硫化氫從溶劑中揮發逸出。亦即用真空泵從硫化後的反應液中抽出吡啶的同時，也將硫化氫一起除去，但這種方法由於硫化氫的揮發性，以工業規模實施這樣的反應將會帶來公害對策上的問題。此外，除去吡啶後的水層則進入滲析器，流水滲析，由此得到目的物，但這種方法的全部操作過程至少需要三天，而且收率至多達80%左右，因而在收率、費用和所需時間的諸多方面存在技術上的困難。
此外，分級技術的本身也未必沒有問題。
在該技術領域內，核酸聚合物的低分子化歷來是採用與甲醯胺共存加熱的方法，通過調節這一反應的時間和溫度而獲得鏈長更為合適的目的物，此後，藉助於使反應溶液進行滲析等手段，除去低分子化過度的不需要物質。然而，在以往這種方法中，由於作為原料的核酸聚合物的性質關係，即使在相同的反應條件下，有時也會引起具有不同分子量分布的分級現象，因而在重現性方面尚存在問題。據認為這是因為用酶反應來調製，原料分子的大小往往不能保持恆定的緣故。另外，適用於此處的滲析工藝，從原理上看，不能除去比目的物的鏈更長的核酸聚合物，人們期待著根本的解決辦法。
本發明人繼續作各種研討，以①能以迅速操作取得作為目的物的經分級的雙鏈核酸聚合物，②其收率要高，③可工業化且不產生公害等汙染，④能定量地實現一系列操作且再現性高等作為目的不斷研究結果，才好不容易完成了本發明。
本發明的目的在於①在退火之前，先要使各自的單鏈核酸聚合物分級，②當上述(1)的分級時，通過使用HPLC(凝膠過濾高效液相色譜)替代目前的電泳法，使分子大小分布數值化，並利用由此容易知道分子大小分布的變化，進而要確定能迅速取得4S～13S(鹼基數約為50～10，000)這一分子大小分布範圍內的目的物的方法，③確立以下方法，即在分級後的處理中，把以前用滲析取得目的物的做法，通過添加低級醇類等進行處理的這一極其單純的操作來提高收率，④確立以下方法，即當分級後有必要使單鏈核酸聚合物硫化時，把以前用硫化氫硫化後使硫化氫直接從溶劑中揮發的做法，通過添加芳香醇進行離心處理這一極其單純的操作來提高收率，⑤作為調整分級後的單鏈核酸聚合物的分子量分布，並進一步使其分布集中的方法，適用了離子交換樹脂。
以下將對上述的各點作詳細地說明。
退火是一種使彼此互補的單鏈核酸聚合物成雙鏈的過程，是本來就容易進行的操作。若在退火後進行分級，則會產生硫化度波動等誤差，建以定量取得。故而，想到分級要在退火之前進行，並這樣執行的結果獲得了極其良好的結果。
上述的(1)與(2)有密切關係。用由電泳法測知其分子量的目前的手段，最低需要一夜(泳動及染色)，難以做到迅速處理。本發明人通過把HPLC凝膠過濾法用於其中，就能夠極其迅速地知道產生作為目的的分子大小分布的物質(即，為4S～13S，鹼基數約為50～10，000的物質)的反應時間。
本發明中，當測知分級反應終止後即使反應停止，之後，加低級醇類進行處理。低級醇類中最好用乙醇。
當使用乙醇沉澱法時，例如由polyC獲得L-polyC(經分級的以下「L-」的意義相同)的反應中，可以以93%的高收率得到目的物，在由polyI獲得L-polyI的反應中，可以以78%的高收率得到目的物。
以前，是把反應溶液送入滲析管作滲析處理的，但這時的收率約為60%，在由polyI獲得L-polyI的反應溶液只能期望達到大約40%，而且操作要求大約三天。採用乙醇沉澱法(在反應溶液中添加其兩倍數量的乙醇，經攪拌使目的物析出，之後離心分離，收集沉澱物，洗淨且乾燥的方法)，則可以在1小時之內處理。
上述(3)是構成本發明的要旨的重點。分級後由硫原子置換單鏈核酸聚合物中的核酸中的氮原子(例如，以一定的比例由巰基置換polyC中胞苷殘基的氨基)而變成其他的核酸的反應(本說明書中稱之「硫化」)，是合成共聚物時常常使用的方法。另外，本發明的目的還在於在所說的硫化共聚物的合成中，添加芳香醇並加以處理來達到目的[上述(4)]。
可以使用諸如苯酚作為芳香醇。
使用苯酚時，例如在混有吡啶、水和硫化氫氣體的反應溶液中，添加一半數量的苯酚，經攪拌及離心分離，水層和苯酚層清楚地分開，使反應溶液的顏包和副產物硫等也遷移到苯酚層。之後，分離水層，由鹽水、醇處理使目的物析出再離心分離，通過洗淨醇，可以獲得純的目的物。
如果採用這種方法，由於硫化氫大部分包含在溶液的沉澱上的清液中，故而可以容易地去除。
例如，採用使用苯酚的本發明的方法，操作在1小時之內完畢，收率幾乎為100，而且可以定量地獲得目的物。
上述的本發明中的獨特的方法(2)～(4)為實現在退火之前進行分級是重要的，並且是為了能充分地應用所謂退火前分級的手法上，能應用自如的方法。
以下是本發明的另一特徵，將說明分級與退火之間的大小限定的方法與[上述(5)]。
該方法中，利用離子交換樹脂。作為核酸系高分子中適用了離子交換樹脂的實例有在t-RNA施用的DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、苯醯化DEAE-纖維素等[BBA，47，193(1961)、BBRC10，200(1963)、Biochem.6，3043(1967)]。該例中，至多不過在鹼基數約為80的低分子核酸的精製中施用離子交換樹脂。
本發明人對在以高分子核酸聚合物的鹼基數作為指標的精製時是否可能應用離子交換樹脂所具有的吸附電荷的本性，進行了各種研討結果，確立了本發明。本發明，由於其目的物質作藥物是極其有用的，故而確信應用該離子交換樹脂的大小限定(本說明書中還稱之「離子交換法」)具有顯著的進步性。
在本發明離子交換法中，離子交換樹脂僅與核酸聚合物共處同一容器內就可達到目的(分批法)，而通常應用柱色譜進行分界(柱法)。把離子交換樹脂裝入柱等中，使溶解了核酸聚合物的液體流入，一旦使其吸附在離子交換樹脂中，其後一邊使食鹽-三羥甲基氨基甲烷緩衝液等的洗脫液通過柱，一邊使其食鹽濃度變成線性或者分段，得到一定量流出液，然後與以前同樣地用HPLC凝膠過濾法把含有各種餾分的核酸聚合物的鹼基數，以指示器為指標測知，從而可以獲得目的物的經洗脫的餾分。
為了用上述的離子交換法達到目的，柱中填充的離子交換樹脂的種類和洗脫液的種類成為極重要的因素。
例如，把polyI溶解於鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩衝液中，再使其吸附在用於polyI的大小限定的QAE(第四級氨基乙基)載體中而進行離子交換法的結果，即使洗脫液的鹽濃度極濃，也未能得到目的物。這是因為只要在QAE載體中的polyI適中洗脫液鹽濃度狀態中，polyI本身不溶。可以由作為polyI的構成單位的肌苷酸，在結構上更具有疏水性來說明。這裡，適中洗脫液鹽濃度是與polyC比較而定的。
在本發明人所作的其他實驗中，在QAE載體中polyI的適中洗脫液食鹽濃度的緩衝液中，溶解的polyI呈白濁狀，可以觀察到產生沉澱的現象。因此，本發明離子交換法中，選擇離子交換樹脂的種類以及洗脫鹽濃度成為極其重要的要素。
也就是說，在polyI的情況下，使用DEAE載體，得到非常良好的結果。在polyI情況下，不管QAE載體，不管DEAE載體都能獲得良好的結果。洗脫可以通過採用食鹽的線性濃度梯度或者分段的濃度梯度，以鏈長的順序使聚合物分界洗脫。
例如，用polyC(38毫克，S208.6)，吸附在DEAE-Toyopearl 650C(φ10×130毫米)中，以線流速1.32釐米/分，175滴/餾分洗脫、A＝OMNaCl/10mM鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩衝液(pH7.0)B＝0.5MNaCl/10mM鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩衝液(pH7.0)各用100毫升，以B%0→100，採用線性濃度梯度結果，按下列的鏈長的順序可清楚地洗脫。
餾分鹼基數333403447035740361000371500另外，若把同樣的試樣以分段的濃度梯度進行，則在0.3MNaCl/10mM鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩衝液(pH7.0)(50毫升)時，可以分界出500鹼基數以下的，接著在0.5MNaCl/100mM鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩衝液(pH7.0)(50毫升)，可以分界出500～1500鹼基數的。
同樣，在同一條件下以線性濃度進行，則可按下列的順序洗脫poly I(7.8毫克1，S207.3)。
餾分鹼基數35303614037230383503946040540另外，若同樣的試樣以分段的濃度梯度進行，則在0.3MNaCl/10mM鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩衝液(pH7.0)(50毫升)可以分界出3000鹼基數以下的，接著在0.5MNaCl/10mM鹽酸-三羥甲基氨基甲烷緩衝液(pH0.7)(50毫升)，分界出300～600鹼基數的。
這樣，通過選擇任意的食鹽濃度，連高分子的核酸都可分界出鏈長被限定的核酸。
如上述的兩例所示，本發明的離子交換法的最大目的在於以任意地且大規模地從由各種鏈長構成的核酸高分子混合物中分出具有在藥效上適合作藥物的性質的鏈長分布的物質(主要成分)。
可是，在製備作為注射劑的藥物時，業已知道，不可缺少所謂去除在劑中不可以混入的熱原(發熱物質，已知它由多糖構成)的操作。在與本發明有關的核酸衍生物中，當把它作為注射劑給藥於人時，這也必然成為必須要解決的問題。
本發明人通過採用上述的離子交換法，幸運地發現了去除這種熱原的方法。
本發明人繼續進行實驗，目的在於更仔細地驗證上述偶然發現的現象，結果發現，對單鏈核酸衍生物，不管其鏈長如何，都可用離子交換法去除熱源，從而完成本發明。
因此，這也是本發明的重要目的之一。
把由單鏈RNA(市售polyC以及使其短鏈化的物質)的試驗的內毒素的定量試驗的結果示於下表。
表中EU代表家免發熱性試驗的單位[內毒素單位USPreferencestandardendotoxin(E.coli0113)]。
①代表注射用蒸餾水(空白)，②代表poly(市售商品-1)，③代表polyC(市售商品-2)，④代表下述實施例(5-4)中的物質。

由上可見，離子交換法的去除熱原的效果是明顯的。
作為藥品，本發明的核酸衍生物的生理活性是極其有用的，如以下所述，本發明核酸衍生物具有強的抗癌作用。這種作用不過是本發明核酸衍生物所持有的幾種生理活性中的一種。
除了以polyI·polyC為基體的本發明核酸衍生物的生理活性之外，還可列舉TNF產生能、幹擾素產生能、間白細胞素產生能、巨噬菌體活化能、對NK細胞的活化作用、腫瘤細胞增殖阻止作用、人腫瘤細胞在輸癌裸鼠中的增殖阻止作用、腫瘤細胞的肺轉移抑制作用等。
本發明核酸衍生物與之前的polyI·polyC等的幹擾素·衍導物相比，具有極高的安全性。因此，本發明的化合物可以作抗病素劑、抗腫瘤劑等。
上述的本發明核酸衍生物的生理作用在上述的專利申請(特願昭62-1676433號及基於它的要求國內優先權的申請)的說明書中已作詳細敘述。
以下揭示了有關本發明的核酸衍生物製備方法的實施例，以對本發明作更為詳細的說明。
實施例(1)L-polyI(分級化的polyI)的製備及提純在市售的10克polyI中，加入200毫升蒸餾水、250毫升甲醯胺，以及500毫升的5M食鹽水，在80℃下加熱4小時。
採用具有TSK凝膠G-DNA-PW柱(7.88毫米(直徑)×300毫米)的高效液相色譜法[洗脫液為50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩衝液(pH7.5)、0.3M食鹽、2mMETDA，流速為0.5毫升/分]，凝膠過濾，保留時間達到最大值21.86±0.2(分)時，終止反應。
向反應液加入2倍量的乙醇，用離心分離(3000轉/分，4℃)收集所生成的沉澱物，經70%乙醇洗淨後，真空乾燥，由此得到102克L-polyI。
另外，本實施例中全部使用滅菌狀態的水和水溶液，以下實施例同。
(2)L-polyC(規格化的polyC)的製備和提純在10克polyC中，加入200毫升蒸餾水、250毫升甲醯胺、50毫升5M的食鹽水，在80℃下加熱4小時左右。採用與上述(1)相同的高效液相色譜凝膠過濾手段，確認反應的終點(當保留時為21.33±0.2分時)。
向反應液加入2倍量的乙醇，通過離心分離(3000轉/分，4℃)收集沉澱物，經70%乙醇洗淨後，進行真空乾燥，由此即得9.5克的L-polyC。
(3)L-polyC的硫化將上述(2)所得的8.0克L-polyC溶解在240毫升水中，然後置於500毫升蒸餾釜內，在冰冷卻下，加入硫化氫的吡啶溶液(12克/120毫升)，封管後，在50℃下加熱10小時左右。冷卻後，加入TE飽和酚(200毫升)，攪拌後，離心分離(3000轉/分，15℃，5分鐘)，在水層中加入1/10(水層量的1/10)量的5M食鹽水及2倍(水層量的2倍)量的乙醇，隨即產生沉澱。離心分離(3000轉/分，4℃，10分鐘)後，用70%乙醇洗淨，再經真空乾燥，即得到8.0克L-poly(C20S4U)(係指在分級的poly C中，每20個胞苷酸中有一個被4-硫代賴氨酸置換)。
此外，上述所謂的TE，系在10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩衝液(pH7.5)中加入EDTA，使後者濃度達到1mM，由此所配製成的溶液稱為TE。
(4)退火一例從上述(3)中所得到L-poly(C20，S4U)中取出6.00克，而上述(1)中所得的poly I中取出6.44克，分別將它們溶解在由10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩衝液(pH7.5)和50mM食鹽水所組成的300毫升溶液中，然後進行混合。將所得的混合液在水浴中加熱至70℃，保溫10分鐘後，原封不動地冷卻過夜。經酚處理和用乙醇沉澱後，在所生成的沉澱物中加水(約200毫升)，使其溶解，在水中滲析，溫度為4℃，將滲析液濃縮至幹，即得12.4克退火的化合物。
(5)用離子交換法的大小限定以下的離子交換法可通過分級洗脫或線性梯度洗脫而進行。若正確地選擇洗脫條件，則在任何情況下，收率及作為目標的鏈長几乎可以保持不定。L-poly C和L-poly(C，S4U)的分級洗脫均用0.15M Na Cl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩衝液(pH7.0)、10MNa Cl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩衝液(pH7.0)連續地進行。
L-polyI的分級洗脫可參照下述實施例(5-1)。
L-polyI的線性梯度洗脫用A
，B
、B[濃度為1.0MNaCl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩衝液(pH7.0)]洗脫液，並在B液的百分數為0至100的線性梯度洗脫條件下進行洗脫。收集主峰洗脫過程中的級分，用高效液相色譜凝膠過濾法測定保留時間，所得的值為21.35±0.2分。在93%高收率下，得到一種L-polyC化合物，其中作為目標的鹼基數限定在100-1000的範圍內。
(5-3)L-poly(C12，U)的大小限定將19毫克L-poly(C12，U)(係指每12個胞苷酸中有一個被尿苷酸置換)(採用同上的高效液相色譜法，測得的保留時間為18.67分)溶解在5毫升三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩衝液(pH7.0)中，然後使之吸附在DEAE-Toyopaerl(登記商標)650C(φ10mm×130mm)中，接著分別用100毫升的A[濃度為0.0M Na Cl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩衝液(pH7.0)]、B[濃度為0.5M Na Cl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩衝液(pH7.0)]洗脫液，從1.30釐米/分的線速度，並在B液的百分數為0-100的線性梯度洗脫的條件下，進行洗脫。收集主峰洗脫過程中的級分，並用高效液相色譜凝膠過濾法測定保留時間，所得的數值為18.97±0.2分。在87%的高收率下，得到一種L-poly(C12，U)，其中作為目標的鹼基數限定在100-1000的範圍內。
(5-4)L-poly(C20，S4U)的大小限定將前述(3)所得的600毫克L-poly(C20，S4U)溶解在10毫升三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩衝液(pH7.0)中，然後使之吸附在QAE-Toyopearl(登記商標)550C(φ10mm×130mm)上，接著分別用100毫升A[濃度為0.0M Na Cl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩衝液(pH7.0)]、B[1.0M Na Ca Cl/10mM三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩衝液(pH7.0)]洗脫液，以1.30釐米/分的線速度，並在B液在百分數為0-100的線性梯度洗脫條件下進行洗脫。按照與上述(5-2)中所述的相同的高效液相色譜凝膠過濾法測定保留時間，所得的數值為21.35±0.2分。
在90%的高收率下，得到一種L-poly(C20，S4U)，其中作為目標的鹼基數限定的100-1000的範圍內。
(6)退火(6-1)L-polyI和L-polyC將前述(5-2)中所得的大小限定的L-polyC3.0克和在(5-1)中所得的大小限定的L-polyI3.2克分別溶解在150毫升由三羥甲基氨基甲烷·鹽酸緩衝液(pH7.5)和50mM食鹽水所組成的溶液中，然後進行混合。將所得的混合物在水浴中加熱至70℃，保溫10分鐘後，在原封不動的狀態下冷卻過夜。經酚處理後，用乙醇沉澱，在所生成的沉澱物中約加入400毫升水，使之溶解，然後在水中滲析，溫度為4℃。將滲析液濃縮至幹後，即得到6.2克退火化合物。
(6-2)L-poly I和L-poly(C20，S4U)按上述(6-1)中的所述的同樣方法處理在前述(5-4)中所得的大小限定的L-poly(C20，S4U)1.46克和前述(5-1)中所得的大小限定的poly I1.57克，由此得到3.0克退火化合物。
權利要求
1.一種核酸衍生物的製備方法，其特徵是在製備以RNA作為基體的，且沉降定值(以全體分子的大小分布為沉降定值)為4S-13S範圍內的雙鏈核酸衍生物過程中，使各核酸聚合物在退火前分級。
2.一種核酸衍生物的製備方法，其特徵是在製備以RNA作為基體的，且鹼基數為50-10，000(在全部分子大小分布中分布量最大的分子)範圍的雙鏈核酸衍生物過程中，使各核酸聚合物在退火前分級。
3.一種單鏈共聚物的製備方法，其特徵是在按權利要求1或2所述的方法，在分級後和退火前對構成單鏈核酸聚合物的核酸進行硫化的過程中，添加芳基醇進行處理。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵是用離子交換樹脂處理分級後和退火前的雙鏈核酸聚合物，使其分子大小的分布集中在一定範圍內，從而對大小進行限定。
5.一種去除熱原(パイロジェン)的方法，其特徵是在以核酸衍生物為主要成分的注射劑製備過程中，用離子交換樹脂進行處理。
全文摘要
本發明提供了一種核酸衍生物的新穎製備方法。該法主要包括(a)使單鏈核酸聚合物分級，使其分子大小限定在50—10,000個鹼基對(或沉降定值為4S—13S)範圍內；(b)退火，亦即使彼此互補的單鏈核酸聚合物形成雙鏈的過程。本發明可工業化，且不產生公害等汙染。由本發明的方法所製備的核酸衍生物具有很強的抗癌作用和其他生理活性作用，而且副作用小，可用作抗腫瘤劑、抗病毒劑等。
文檔編號C07H21/00GK1030424SQ88104080
公開日1989年1月18日 申請日期1988年6月29日 優先權日1987年7月3日
發明者矢野純一, 大木忠明 申請人:日本新藥株式會社