用於光動力療法和壞死腫瘤成像的rgd-(細菌)葉綠素綴合物的製作方法

2023-05-21 07:03:21

專利名稱：用於光動力療法和壞死腫瘤成像的rgd-(細菌)葉綠素綴合物的製作方法
用於光動力療法和壞死腫瘤成像的RGD-(細菌)葉綠素綴合物技術領域
本發明屬於腫瘤學領域並涉及通過腫瘤靶向光動力學成像檢測壞死腫瘤區以及 使用光敏劑(特別是葉綠素和細菌葉綠素衍生物與含有RGD基序或RGD肽模擬物的肽的綴 合物)通過腫瘤靶向光動力療法治療所述腫瘤。
定義和縮略語
Bchla 細菌葉綠素a 五環7,8,17，18-四氫卟啉，具有第5個碳環(isocyclic ring)，一個中心Mg原子，在173位上有一個植基或櫳牛兒基櫳牛兒基，在132位上有一個 COOCH3基團，在132位上有一個H原子，在2、7、12、18位上有甲基，在3位上有一個乙醯基， 在8位上有一個乙基，本文稱為化合物丄；Bphe 細菌脫鎂葉綠素a (其中中心Mg被兩個H 原子置換的Bchl) ；Bpheid 細菌脫鎂葉綠甲酯酸a(由無中心金屬原子的Bphe衍生，C_172 無甲酸)；Chl 葉綠素；紅螺菌菌綠素(Rhodobacteriochlorin)四環7，8，17，18-四氫卟 啉，17位上有一個-CH2CH2COOH基團，在13位上有一個-C00H，在2、7、12、8位上有甲基，在 3和8位上有乙基；Pd-Bpheid =Pd-細菌脫鎂葉綠甲酯酸a ；EC 內皮細胞；ECM 胞外基質； NIR 近紅外；PDT 光動力療法；RGD-4C 環狀九肽CDCRGDCFC_NH2 ；ROS 活性氧類。
整篇說明書中使用細菌葉綠素衍生物的IUPAC編號。使用該命名法，天然細菌葉 綠素在132和172位攜帶兩個羧酸酯，無論如何在133和173位上它們是被酯化的。
背景技術：
癌症患者中，原發瘤和轉移瘤的壞死和低氧與腫瘤侵襲性和預後差強相關。達 到一定大小的實體瘤，生長速度超過其氧氣供應，變得低氧並最終壞死。在位於距營養血 管超過70 μ m的腫瘤區，間質氧壓力降低，而距離超過150-180 μ m時，細胞變得幾乎缺氧 (Vaupel等，2001)。一般認為，壞死是由血管瓦解引起的慢性缺血和超過血管生成速度的快 速腫瘤細胞生長的結果(Leek等，1999))。
實體瘤中的壞死區經歷了形態改變。開始時，原有結構基本上保持，壞死細胞保持 其整體形狀，但卻變成高度嗜酸性的。一段時間後，這種形式被液化性壞死所替代，其中細 胞結構分解(Leek等，1999)。
壞死和低氧兩者已被充公證實是預後差的標誌。有研究提出，在上尿路移行細胞 癌、惡性間皮瘤和腎細胞癌(RCC)中，將壞死作為癌癥結果的獨立預測物並且作為用於預 後目的的極有力的工具(Edwards等，2003 ；Sengupta等，2005 ；Lee等，2007)。
在侵襲性乳腺癌中，壞死與高血管密度和血管生成、高水平局灶性巨噬細胞浸潤 和患者生存期縮短有關(Kato等，1997 ；Lee等，1997 ；Leek等，1999 ；Tomes等，2003)。中心 性壞死，這是侵襲性乳腺癌的普遍特徵，與結局差和腫瘤侵襲有關。研究表明，巨噬細胞被 由低氧或垂死腫瘤細胞釋放的趨化因子吸引至壞死腫瘤(Leek等，1999)。與非粉刺型(非 侵襲性)原位管癌(DCIQ不同，在粉刺型(侵襲性)DCIS的管腔中發現大量壞死區(Cutuli 等，2002)。在達360 μ m直徑的DCIS病灶中心的壞死和低氧，在瘤細胞的性質和行為上有著明顯的生物學差異。因此認為導管中壞死的存在與否可作為DCIS分級切實可行的標準 (Bussolati 等，2000)。
研究顯示，這種腫瘤類型的大部分的壞死與低氧有關(Tomes等，200 。低氧和缺 氧使腫瘤細胞受到氧化應激。研究顯示，長期的低氧條件提高突變率，加快腫瘤進程，增加 血管生成和轉移潛力並激活促生長信號轉導途徑。對氧化應激的適應常常使腫瘤細胞對某 些治療方式產生抗性(Brown等，2001)。
壞死與低氧之間的關聯性得到了非常充分的證實，然而可能存在不會達到壞死的 低氧條件，或者存在不一定反映急性或嚴重低氧的壞死(Dewhirst 1998)。低氧有若干種標 記基因，其中有低氧誘導因子I(HIFl)、葡萄糖轉運蛋白1和碳酸酐酶IX。只有檢出所有三 種標記才能確定壞死的分類(Tomes等，200 ，這使得通過基因表達來鑑定壞死區變得頗 為複雜。
已知壞死和低氧條件在癌症療法中產生大量問題。低氧腫瘤區對放射治療具有相 對抗性，因為放射攻擊(radiation assault)推進不良，而且因為可最終存在於腫瘤體積 (tumor volume)中的幹細胞對治療的反應不佳，導致了腫瘤再生長(Brown等，1998 ;Dean 等，200 。因為大多數化療試劑因與循環細胞相互作用而致細胞死亡，所以因低氧造成的 細胞停滯(cell arrest)導致對常規化學療法產生抗性，使非增殖細胞或慢增殖細胞不受 損害(Tarmock，1978)。此外，低氧條件通常產生改變藥物性質的酸性環境，使藥物的活性降 低(Tannock 等，1989)。
實體瘤化學療法的更多問題之一包括將治療劑運輸到腫瘤，尤其是運輸到低氧和 壞死區(domain)。腫瘤通常含有具有異質血流的不規則滲漏微血管和大的血管間距離。除 不存在適當淋巴引流和高間質壓力以外，這些特徵使得擴散成為腫瘤中營養物和藥物的血 管外運輸的最重要的機制。然而，由於無規則血管形成，所以比起正常組織中的細胞，許多 腫瘤細胞位於距毛細血管更遠的距離，這反映在細胞部位處抗腫瘤藥的濃度不足中。而且， 因缺乏淋巴引流引起的間質液壓升高降低了對流攝取(convection uptake)，並進一步抑 製藥物(特別是大分子)分布到腫瘤細胞內(Minchinton等，2006)。
因此，在體內檢測腫瘤內低氧和壞死區的能力極為重要。對低氧腫瘤區的了解可 有助於選擇正確的治療法一或者通過在治療前或治療期間提高腫瘤氧合作用，或通過利 用低氧的策略(Weinmarm等，2004)。採用該方法，應用低氧激活的細胞毒素例如2-環丙 基-吲哚並醌(ind0l0quin0neS)、AQ4N、替拉扎明(TPZ)和PR-104可有助於改進治療效果 (Brown 等，2004 ；Lee 等，2007 ；Patterson 等，2007)。
組織病理學和免疫組織化學常常用來鑑定壞死和低氧；然而，它們是有創的，而且 不能夠進行原位檢測。原位方法包括核磁共振成像(MRI) (Kamel等，2003 ；Metz等，2003)、 血氧水平依賴性MRI (Kerman等，1997)、正電子發射斷層攝影術(PET) (Lehtio等，2004)和 彌散加權MRI (Lang等，1998)。
用於MRI的壞死親和性造影劑(Necrosis-avid contrast agent,NACA)可分成卟 啉型造影劑和非卟啉型造影劑。最為人所知的卟啉型NACA之一是大部分在壞死區邊緣表 現特異性壞死蓄積(necrosisaccumulation)的gadophrin-2。有研究認為蓄積機制以血 清白蛋白(SA)運輸為基礎，但最新研究對這種方法提出了質疑(Hofmarm等，1999 ；Ni等， 2005)。
大多數惡性細胞在血管不存在時無法生長到臨床可檢測到的腫瘤塊。這就是為什 麼達到一定大小(大約2-3mm3)的腫瘤必須轉變成血管生成表型以支持其生長。向血管生 成表型的轉變可以表示血管生成因子和血管生成抑制物的表達失衡。血管生成因子的過量 表達和血管生成抑制物的減量調節兩者都是必需的並且足以誘導新血管生長，這兩個過程 通常同時發生以啟動腫瘤血管生成(Cao，2005)。
腫瘤中代表血管的生化特徵可包括血管生成相關分子，例如某些整聯蛋白。細胞 粘附受體的整聯蛋白家族包括在胞外基質中或細胞表面上識別糖蛋白配體的截然不同的 對種α β異二聚體。整聯蛋白家族的多個成員，包括α5β 1、α8β 1、α IIbi3 3、ανβ3、 ανβ5、ανβ6禾口 ανβ 8，均識別其配體內的Arg-Gly-Asp (RGD)基序。這些配體包括纖連 蛋白、血纖蛋白原、玻連蛋白、馮維勒布蘭德因子(von Willebrand factor)和許多其它大 的糖蛋白(Takagi，2004)。因此，研究表明含有RGD基序的分子提供用於選擇性攝取及隨後 成像並檢測原發瘤病灶、壞死區和靶向療法的新的機會。這個研究領域受到越來越多的注 意。有大量有關使用RGD標記的成分用於成像的報導(Temming等，2005)。文獻中報導的 主要缺點是在4-5mm下腫瘤部位報告成分(importing element)的濃度不夠。這就是為什 麼RGD靶向成像的使用主要限於PET掃描這種更靈敏的方法。
了解腫瘤生長、轉移形成、腫瘤-宿主相互作用和血管生成需要腫瘤模型，這可容 易地跟蹤腫瘤細胞，甚至在其各自水平上。用於直接測量腫瘤的最有意義的生物參數的現 有方法僅可通過有創終點法(invasive end-point procedure)獲得(Lyons，200 。這類 方法大多數包括組織病理學檢查或免疫組織化學，它們是緩慢的、有創的，而且不一定是靈 敏的方法(Yang等，2000)。因此，有必要引入能夠直接顯現腫瘤組織、無創的並且能夠在細 胞和分子兩個水平上測量腫瘤相關參數的新方法。
近年來，已開發出若干無創性方法MRI和光譜法、PET、單光子發射型計算層析X 射線照相術(single photon emission computedtomography)和計算層析X射線照相術 (Lyons,2005)。
有若干基於轉基因的成像方法。這些方法使得無創性測量具有優良腫瘤特異性的 多個生物參數、活的模型動物中的整體成像和轉移檢測成為可能。這些方法中有兩種是生 物發光成像和螢光成像。
光學生物發光是以下列三種組分為基礎酶螢光素酶、底物螢光素和腺苷三磷酸 (ATP)。在該方法中，不需要光激發來產生光發射。然而，如果這些組分之一不存在，則不能 夠檢測。該方法由於良好的信噪比值而能夠高通量地監測細胞存活力或細胞功能(Lyons， 2005)。螢光素酶/螢光素方法的主要缺點是解剖和圖像解析度低，因此需要相當長的時間 從麻醉動物中採集足夠的光子以形成圖像。再者，組織深度加大和外源遞送底物的需要削 弱了體內光發射(Yang等，2000 ;Ly0ns，2005)。此外，難以進行離體實驗，因為ATP需要酶 活性。重要的是，該方法包括主觀參數化法，降低了它的定量價值。
通過光學螢光成像監測腫瘤進展的另一種方法是以用穩定的螢光蛋白(例如綠 色螢光蛋白(GFP)和紅色螢光蛋白(RFP))轉染腫瘤細胞為基礎。在該方法中，在可檢出發 射光之前需要外部激發。該方法的主要缺點是(1)隨組織深度加大，激發光和發射光易於 減弱，和( 非標記細胞的自身螢光加大噪音(Lyons，200 。主要優點包括多個報導分子 波長使得能夠多重成像；與用於分析方法的多種離體方法(例如新鮮組織分析)高度兼容；對於成像不需要準備步驟，這使得它特別適於在活組織中進行肉眼觀察；該方法是外部的 並且是無創性的；該方法提供移植動物的內部生長腫瘤和轉移的實時螢光光學成像，其可 給出整體圖像，而且還可給出從原發病灶和轉移中提取的單細胞的圖像(Yang等，2000; Lyons, 2005).整體成像是了解腫瘤發育最必須的工具之一。因此，通過用GFP或RFP對腫 瘤細胞進行遺傳標記，可獲得原發瘤和轉移瘤的外部整體成像(Yang等，2000)。
螢光標記法適於體內、新鮮組織和體外檢測。採用表達螢光蛋白的腫瘤細胞能夠 使活的動物成像並跟蹤不同時間點的腫瘤進展。RFP的發射波長比GFP的長，因此能夠使 顯微鏡可觀察的腫瘤生長的靈敏度和解析度更高(GFP激發波長-489nm，發射波長-508nm， RFP激發波長-558nm，發射波長_583歷)。
原位管癌(DCIS)包括出現惡變並在乳腺導管腔內蓄積的細胞的克隆增殖，無證 據顯示侵襲至附近乳腺間質和超過上皮基底膜以外。如果早期不接受治療，非侵襲性DCIS 病灶便非常有可能轉變成危及生命的侵襲性疾病。在廣泛使用乳房X線攝影術後，診斷患 有早期DCIS的患者的數目激增，因此推薦的治療方式從乳房切除術(接近100%治癒率) 向保乳(BC)手術(BCS)轉變，例如局部病灶切除術或乳腺微創手術(Kepple等，2004)，任 選伴RT和內分泌輔助療法。然而，最近發現與乳房切除術後相比，在BCS後，甚至當同時進 行RT時，同側(同一乳房)或對側(另一乳房)兩者的復發率都較高，特別是年齡< 40的 患者(消退率25-35% ;Bijker N等，2006 ；Cutuli等，2002)。此外，多病灶病變給部分切除 帶來困難，對於被發現對腫瘤完全消退是決定性的邊緣的持續受累也是如此(Cellini等， 2005)。此外，生理和心理負擔以及局部病灶切除術和隨後的RT的可能的美容結果都十分 重要。在乳腺癌療法中，這些缺點使現今DCIS的治療和管理成為有爭議的問題，並且激起 對治療和預後的新的和/或補充方式進行研究。
DCIS是一種惡性腫瘤的生物學異質形式，具有不同的臨床表現、組織學特徵、細 胞特徵和生物潛能。被歸類為粉刺型(侵襲性)癌和非粉刺型(非侵襲性)癌，其中粉刺 型是高級級別，具有可能更為侵襲性的亞型，在腺管腔內特徵性地包含大的壞死區，細胞為 明顯的非典型細胞。預期大約2/3患有低級別到中等級別DCIS的患者罹患多病灶同側疾 病，不同病灶之間的間隔可達lcnKCutuli等，2002)。高級別病灶往往連續的，間隔小於 5mm(Cutuli 等，2005)。
非侵襲性DCIS自然發展成為侵襲性乳腺腫瘤可能要花15-20年，累及14_60% 的確診女性(Burstein等，2004)。實際上，DCIS似乎代表了乳腺癌發展的某個階段，其中 界定侵襲性乳腺癌的許多分子事件已經存在(Cutuli等，2002 ；Holland等，1990)。準確 地講，如果不治療，則約30%的低級別病灶將發展成侵襲性癌症(Sanders等，200 。直徑 大於2. 5cm的病灶常常伴發可能不超過0. Imm的隱匿性微小侵襲性腫瘤(microinvasive tumor)。腫瘤邊緣的受累情況提供重要的預後標誌。接近切緣(小於Imm)或陽性邊緣、高 級別和/或粉刺型壞死區與較大的復發風險有關。
像許多其它癌症一樣，在乳腺癌中，新血管形成(血管生成)在局部腫瘤進展和 遠距離轉移發展中起著主要作用(Boehm-Viswanathan，2000 ;Kieran等，2003)。發現與周 圍的正常組織相比，DCIS組織中的微血管密度(MVD)顯著較高(Guidi等，1994 ；Guidi等， 1997 ；Guinebretiere等，1994)。具有最高血管密度的纖維囊性病灶與較大的乳腺癌風險 有關(Guidi 等，1994 ；Guidi 等，1997 ；Guinebretiere 等，1994)。侵襲性 DCIS 病灶的組織病理學檢查結果與MVD提高和血管內皮生長因子(VEGF)表達增加有關(Guidi等，1997 ； khneider等，2005)。臨床病理相關性也證實了血管生成在乳腺癌發展中的重要作用，使 之成為DCIS療法和預後的頗有吸引力的靶標(Folkman, 1997 ；Krippl等，2003 ；Relf等， 1997)。由套疊引起的血管共選擇、生長(Patan等，1996)、血管擬態和血管發生是天然存在 的過程，可降低腫瘤對典型血管生成的依賴。特別重要的是幾乎完全依賴於血管發生的炎 症性乳腺癌的研究結果，似乎是因為癌細胞無能力與內皮細胞結合。
DCIS對極緻密血管床的極度依賴使抗血管生成(抑制新血管形成)和抗血管(現 有血管的閉塞/破壞)療法(Shimizu等，2005 ;Thorpe，2004)成為局部BC療法的誘人選 擇(Schneider等，2005 ；Folkman, 1996)。事實上，抗血管生成藥物例如貝伐單抗(一種抗 VEGF-A受體抗體)和SUOl 1248 (一種VEGF受體酪氨酸的抑制劑)正處於II期臨床試驗中。 有趣的是，發現他莫昔芬也具有抗血管生成活性。然而，日趨增多的大量證據說明抗血管生 成方法的不足。這些不足包括需要長期治療、「抗性-抗性理論(resistance to resistance theory)」(Schneider 等，2005 ；Streubel 等，2004)和藥代動力學抗性(pharmacokinetic resistance)的部分失效。根據這些障礙，抗血管方法目前似乎更有前景，預期不需要長期 治療就能根除整個腫瘤(Folkman，2004)。血管靶向治療的一種有前景的新興手段是通過光 動力療法(VTP)。
同樣地，靶向順磁金屬(具有適度馳豫性(relaxivity))、發射正電子的化學實 體(例如64Cu)，或針對DCIS的緻密血管床的螢光探針，將開啟檢測相關病灶、邊緣界定和 預後的新途徑，正如下文中所述。研究表明乳腺癌病灶的螢光檢測在至多IOmm的深度是 有效的(BrittOn，2006)。用Gd作為造影劑的動態MRI以腫瘤血管系統的滲漏增加為基 礎，目前用於乳腺腫瘤定位(Rankin，2000)。然而，目前使用的MRI受可用造影劑積分時間 (integration time)短的限制，所述造影劑短暫停留但不被腫瘤組織選擇性攝取。
光動力療法(PDT)在選定的治療部位產生突發的細胞毒性活性氧類(R0Q。由於 其壽命短，ROS毒性局限於發光部位。PDT通常由5個步驟組成1.靜脈內(IV)給予光敏 劑；2.使所需濃度的光敏劑到達靶組織的一段時間；3.用高強度雷射(對於連續照射高達 1W)通過用於深層組織照射的細(0. 4mm以下直徑)光導纖維經皮或經間質照射靶組織，由 此局部產生細胞毒性的ROS ；4.出現腫瘤壞死並根除腫瘤；
5.組織重塑和癒合。
血管靶向PDT (VTP)的目的在於在受治療組織血管內產生R0S，這可通過在給予致 敏物(sensitizer)後隨即通過組織照射，或通過使用不會從循環中溢出的致敏物來完成。 我們的實驗室已開發出幾代細菌葉綠素致敏物(本文稱為「Bchl衍生物」或「BchlD」)。合 成的化合物(Rosenbach-Belkin等，1996 ；US 5，650, 292)，在能夠使光深入穿透受治療者 組織的OTR(750-765nm)中具有非常強的吸收，確保了以高能流率QOmW-IW)在圓柱狀纖 維周圍達4cm的治療直徑。在照射時，通過循環BchlD在腫瘤中和附近產生局部高濃度的 R0S(0H-和O2-根)，導致在照射數分鐘內血液凝固和腫瘤血管穿孔，隨後腫瘤血管系統完全 停滯。用一些Bchl衍生物，觀察到內皮細胞直接中毒(Gross等，2003 ；Mazor等，2005)。究 其原因還在研究之中，與周圍正常組織的血管相比，腫瘤血管反應顯著較快較激烈。治療功 效導致高的治癒率(60-90%動物存活)(Mazor等，2005)。重要的是，靜脈內注射的致敏物 很快從受治療動物的循環中清除(T1/2約為數分鐘至數小時，(Mazor等，200 )，避免了長期的皮膚毒性，並在需要時允許重複治療。在患者的局限性前列腺癌的II期臨床試驗中， 其中放射療法失敗(Weersink等，2005)，基於BchlD的VTP總的來講導致50-60%受治療患 者中腫瘤病灶成功根除以及組織重塑。在動物模型和人的二次治療(Π/ΙΙΙ期臨床試驗) 中，每療程似乎產生類似或較高的治癒率(取決於藥物和光劑量)，在2-3療程後，提高預期 的總體成功率達約90%。重要的是，在使用較高劑量致敏物的動物研究中發現每個療程都 有顯著較高的治癒率。
腫瘤的光動力療法(PDT)包括給予光敏劑和局部光照射的組合，兩者本身是無害 組分，但是在分子氧存在下，它們能夠產生可以消除細胞的細胞毒性活性氧類(R0Q。作為 二元治療方式，當與常用的化學療法或放射療法相比時，PDT允許較高的特異性，並且具有 較高選擇性而又並非毀滅性的潛力(Dougherty等，1998)。
近年來本發明的發明人(Zilberstein等，2001 ；Schreiber 等，2002 ;Gross 等， 1997 ；Zilberstein 等，1997 ；Rosenbach-Belkin 等，1996 ；Gross 等，2003a ；Koudinova 等， 2003 ；Preise等，2003 ；Gross等，2003b)及在以下專利公布號中報導了在PDT中應用新的 細菌葉綠素(Bchl)衍生物作為致敏物:US 5，726，169、US 5，650，292、US5, 955，585、US 6，147，195、US 6，740，637、US 6，333，319、US6, 569，846、US 7，045，117、DE 41 21 876、EP 1 24 6826、W02004/045492、W0 2005/120573。Bchl衍生物的光譜、光物理學和光化學使之 成為最佳集光分子，具有優於現用於PDT的其它致敏物的明顯優勢。這些Bchl衍生物大部 分是極性的，並且在循環中停留非常短的時間，幾乎不外滲到其它組織中(Brandis，2003 ； Mazor等，2005)。因此，這些化合物是血管靶向PDT (VTP)良好的候選分子(candidate)，這 有賴於在血管內短時(5-10分鐘)與光短暫相遇，並且有賴於腫瘤血管對PDT產生的細胞 毒性ROS的較高敏感性。
由我們的研究小組進行的最新研究表明，最初的光敏作用是血管內快速發展成缺 血性閉塞且在照射期間停滯。這個過程還促進光化學誘導的脂質過氧化作用(LPO)和主要 局限於腫瘤血管系統的早期內皮細胞死亡(Koudinova等，2003)。由於自由基鏈反應的光 獨立性發展連同進行性低氧，LPO和細胞死亡擴展到血管區室以外以覆蓋整個腫瘤間質組 織，直到在PDT後M小時左右達到腫瘤完全壞死。因此，PDT的最初作用是阻斷供血並誘 導低氧，其以第二種方式引發以腫瘤根除告終的一系列分子和病理生理學事件。重要的是， 該方法取決於正常血管和腫瘤血管對所產生的ROS的反應之間的差異。
相同申請人的國際申請號WO 2008/023378(通過引用其整體結合到本文中， 如同全部公開於本文中一樣)，公開了卟啉、葉綠素和細菌葉綠素(Bchl)衍生物與含 有RGD基序的肽或與RGD肽模擬物的新綴合物及其在體內光動力療法以及診斷腫瘤和 不同血管疾病(例如年齡相關性黃斑變性)的方法中的用途。具體地講，Bchl衍生物 c (RGDfK) -Pd-MLT (化合物M)在原發瘤的異種移植物中蓄積高達4_8 μ Μ,並長時間保持在 腫瘤部位，能夠實現信號蓄積和良好的信噪比。
螢光標記法適於體內、新鮮組織和體外檢測。c (RGDfK) -Pd-MLT在近紅外(NIR)處 具有能夠檢出的固有螢光。c (RGDfK) -2H-MLT具有高達3倍的發光能力，因此可以成為甚至 更好的靶向成像的候選分子。在此項研究中，我們披露了這些分子開啟了在人乳腺腺癌模 型中精確檢測腫瘤邊緣和壞死的可能性。檢測腫瘤邊緣和壞死是迄今為止在腫瘤治療中存 在的兩個最具有挑戰性的問題。此外，兩者是在治療後腫瘤再生長的可靠預測物。因此，預期在未來臨床應用時，前述RGD衍生物適用於在手術臺上檢測腫瘤和壞死。
發明_既述
根據本發明的研究現已發現，與非壞死腫瘤區相比，上述W02008/023378中披露 的RGD-(細菌)葉綠素綴合物在壞死腫瘤區的歸巢和蓄積長久得多。
因此，本發明涉及所述RGD-細菌葉綠素和RGD-葉綠素綴合物用於微創腫瘤靶向 成像、腫瘤靶向光動力療法和/或壞死腫瘤的在線預後(on-line prognosis)的用途及其 方法。
附圖簡述


圖1表示用於用紅色螢光蛋白(RFP)轉染腫瘤細胞系的質粒。IA :PDsRed2-Nl質 粒(Clontech，Palo Alto, CA)，IB :pDsRed-Monomer-Hyg-Cl(Clontech,Palo Alto,CA)，IC 修飾 pDsRed-Monomer-Hyg-Cl。
圖2A-2B表示在暴露3秒鐘後用螢光顯微鏡(Nikon，放大倍數X10)檢出的圖1 的轉染細胞的螢光克隆。2A:MDA-MB-231RFP克隆1(G418抗性)。2B :MDA_MB_231RFP克隆 3(潮黴素抗性)。
圖3A-;3B表示切離的腫瘤圖像和MDA_MB_231_RFP腫瘤橫截面的組織學分析(H&E 染色)。3A 大腫瘤(約Icm3)。3B 小腫瘤(約0. 5cm3) (ND-壞死區，VD-有活力區)。
圖 4A-4B 表示下述化合物 13 在 MDA-MB-231-RFP 常位腫癌(orthotopic tumor) (腫瘤大小約lcm3)中的蓄積。給小鼠注射化合物叢。藥物注射後從15分鐘到M小時拍 攝圖像。4A(上圖)紅色螢光成像。4B (下圖)螢光成像。
圖5A-5B表示化合物旦在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的蓄 積。給小鼠注射化合物叢。藥物注射後從第1天到第7天拍攝圖像。5A(上圖)紅色熒 光成像。5B (下圖)螢光成像。
圖6A-6B表示化合物Π在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物叢。藥物注射後從20分鐘到M小時拍攝圖像。6A(上圖)紅 色螢光成像。6B (下圖)螢光成像。
圖7A-7B表示化合物Π在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物Π。藥物注射後從第1天到第3天拍攝圖像。7A(上圖)紅色 螢光成像。7B (下圖)螢光成像。
圖8是表示與旁側(collateral side)相比腫瘤中化合物叢螢光信號測量值的 曲線圖。在9隻動物的腫瘤和旁側測量了螢光信號，單位為光子/秒/cm2。化合物叢注射 後從15分鐘到216小時採集結果。提供了每個時間點上全部動物的平均結果以及腫瘤和 旁側之間的螢光比。
圖9A-9B表示化合物M在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的蓄 積。給小鼠注射化合物絲。藥物注射後從1小時到M小時拍攝圖像。9A(上圖)紅色熒 光成像。9B (下圖)螢光成像。
圖10A-10B表示化合物M在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物絲，藥物注射後從第1天到第7天拍攝圖像。10A(上圖)紅色 螢光成像。10B (下圖)螢光成像。
圖1IA-IIB表示化合物M在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中的蓄積。給小鼠注射化合物絲，藥物注射後從20分鐘到對小時拍攝圖像。IlA(上圖) 紅色螢光成像。IlB(下圖)螢光成像。
圖12A-12B表示化合物M在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中 的蓄積。給小鼠注射化合物M，藥物注射後從第1天到第2天拍攝圖像。12A(上圖)紅 色螢光成像。12B (下圖)螢光成像。
圖13A-i;3B表示化合物叢在MLS_mBanana常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的蓄 積。給小鼠注射化合物叢。藥物注射後從1小時至M小時拍攝圖像。13A(上圖)紅色 螢光成像。13B (下圖)螢光成像。
圖14A-15B表示化合物叢在MLS_mBanana常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的蓄 積。給小鼠注射化合物叢。藥物注射後從第1天到第4天拍攝圖像。14A(上圖)紅色熒 光成像。14B (下圖)螢光成像。
圖15A-15B表示化合物Π在MLSiBanana常位腫瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物O。藥物注射後從10分鐘到M小時拍攝圖像。15A(上圖)紅 色螢光成像。15B (下圖)螢光成像。
圖16A-16B表示化合物Π在MLS_mBanana常位腫瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物叢。藥物注射後從第1天到第4天拍攝圖像。16A(上圖)紅色 螢光成像。16B (下圖)螢光成像。
圖17A-17B表示化合物叢在人卵巢MLS-mBanana原發壞死腫瘤和無壞死腫瘤中 蓄積的比較。化合物叢注射後2天拍攝圖像。拍攝化合物叢的體內整體肌R螢光的圖像。 17A 無壞死腫瘤(約0. 5cm3)。17B 壞死腫瘤(約Icm3)。
圖18A-18B表示化合物迆在MDA-MB-231-RFP常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物迆，藥物注射後從5分鐘到對小時拍攝圖像。18A(上圖)紅色 螢光成像。18B (下圖)螢光成像。
圖19A-19B表示化合物型在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤(腫瘤大小約Icm3)中的 蓄積。給小鼠注射化合物迆，藥物注射後從第1天到第3天拍攝圖像。19A(上圖)紅色 螢光成像。19B (下圖)螢光成像。
圖20A-20B表示化合物些在MDA_MB_231-RFP常位無壞死腫瘤(腫瘤大小約 0. 5cm3)中的蓄積。給小鼠注射化合物型，藥物注射後從10分鐘到對小時拍攝圖像。20A(上 圖)紅色螢光成像。20B (下圖)螢光成像。
圖21A-21B表示化合物些在MDA_MB_231-RFP常位無壞死腫瘤(腫瘤大小約 0. 5cm3)中的蓄積。給小鼠注射化合物型，藥物注射後從第1天到第3天拍攝圖像。21A(上 圖)紅色螢光成像。21B (下圖)螢光成像。
圖22A-22D表示當在給予游離c (RGDfK)後1小時給予時，化合物Π在常位人乳 腺MDA-MB-231-RFP原發瘤(腫瘤大小約0. 5cm3)中蓄積的競爭測定法。在給予化合物叢 後對小時拍攝圖像。22A、22B-紅色螢光成像；22C、22D-OTR螢光成像。22A、22C 在給予遊 離c (RGDfK)後1小時給予化合物叢(競爭)。22B、22D 對照，只給予化合物Π。
圖23A-23F表示藥物注射後10分鐘測定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區 對比壞死區中化合物叢的蓄積。23A、2!3B和23C(上圖)，分別是整個動物的體內整體照 片、紅色螢光圖像和NIR螢光圖像；23D、23E和23F(下圖)，分別是切離腫瘤(將腫瘤切成兩半)(ND-壞死區，VD-有活力區)的照片、紅色螢光圖像和NIR螢光圖像。
圖24A-24F表示藥物注射後1小時測定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區 對比壞死區中化合物叢的蓄積。圖24A、24B、24C(上圖)和MDJ4EJ4F(下圖)分別如 上述圖 23A、23B、23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖25A-25F表示藥物注射後4小時測定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區 對比壞死區中化合物叢的蓄積。圖25A、25B、25C(上圖)和25D、25E、25F(下圖)分別如 上述圖 23A、23B、23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖^A_26F表示藥物注射後M小時測定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區 對比壞死區中藥物化合物的蓄積。圖(上圖)和(下圖)分 別如上述圖23A、23B、23C和23D、23E、23F中所述。
圖27A-27F表示藥物注射後3天測定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區對 比壞死區中化合物叢的蓄積。圖27A、27B、27C(上圖)和27D、27E、27F(下圖)分別如上 述圖 23A、23B、23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖^A-28F表示藥物注射後5天測定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區比 對壞死區中化合物叢的蓄積。圖(上圖)和(下圖)分別如上 述圖 23A、23B、23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖^A-29F表示藥物注射後7天測定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區對 比壞死區中化合物Π的蓄積。圖(上圖)和 D、 E、 F(下圖))分別如上 述圖 23A、23B、23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖30A-30F表示藥物注射後9天測定的在MDA_MB_231_RFP常位腫瘤的活力區對 比壞死區中化合物M的蓄積。圖30A、30B、30C(上圖)和30D、30E、30F(下圖)分別如上 述圖 23A、23B、23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖31A-31F表示注射後7天測定的在中心性壞死的MLS_mBanana腫瘤中化合物叢 的蓄積。圖31A、32B、33C(上圖)和34D、35E、36F(下圖))分別如上述圖23A、2!3B、23C和 23D、23E、23F 中所述。
圖32A-32F表示藥物注射後7天測定的在MLS-mBanana腫瘤的非中心性壞死中化 合物叢的蓄積。圖30A、30B、30C(上圖)和30D、30E、30F(下圖)分別如上述圖23A、23B、 23C 和 23D、23E、23F 中所述。
圖33A-33D表示切離腫瘤圖像和MDA_MB_231_RFP腫瘤橫截面的組織學分析(H&E 染色)。33A 腫瘤橫切片表面照片(肉眼可見外觀)。33B:橫切片表面的組織學圖像(顯 微鏡可見外觀)。33C :3;3B中被圈區域的中等放大倍數圖(medium power view)。33D 壞 死和有活力組織間界面區域的高放大倍數圖(high power view)。
圖34A-34B表示人MDA_MB_231_RFP對PDT的局部反應的代表性實例。在具有 MDA-MB-231-RFP異種移植物(約0. 5cm3)的小鼠背部經靜脈內注射7. 5mg/kg化合物Π，8 小時後透過皮膚照射。34Α:從第0天(治療前)和治療後1、4、7、12和90天拍攝的照片。 34Β 體內整體紅色螢光成像。
實施本發明的方式
本發明的主要目的是提供將致敏物特別靶向壞死腫瘤的壞死區的光敏劑綴合物。 腫瘤靶向光動力療法(PDT)具有一些優於用常規化學療法靶向腫瘤的優勢。第一，在常規被靶向藥物蓄積期間，它常常是有活性的，除非它是前藥，而被靶向光敏劑直到局部照射後 才有活性。第二，常規被靶向藥物可結合併同樣作用於歸巢地址存在的不需要的靶標，而靶 向光敏劑只在相關照射部位被激活。
因此，從大的方面來看，本發明涉及含RGD的肽或RGD肽模擬物與葉綠素或細菌葉 綠素光敏劑的綴合物在微創腫瘤靶向成像、腫瘤靶向PDT和/或壞死腫瘤的在線預後中的 用途。
術語「含RGD的肽」或「RGD肽」在本文中可互換使用，是指含有Arg-Gly-Asp (RGD) 序列的肽，亦稱為RGD基序。本文使用的術語「 RGD肽模擬物，，是指模擬肽並具有RGD基序 的化合物，特別是非肽化合物。
已知R⑶肽與細胞的整聯蛋白受體相互作用，具有啟動細胞信號轉導過程的潛力 並影響多種疾病。出於這些原因，整聯蛋白RGD結合部位被視為頗有吸引力的藥物靶標。
含RGD的肽可為線性肽或環肽，由4-100個、優選5_50個、5_30個、5_20個或者更 優選5-10個胺基酸殘基組成。在一個優選的實施方案中，RGD肽由4、5、6、7、9或25個、最 優選由5個胺基酸殘基組成。
本文所使用的術語「胺基酸」包括20種天然存在的胺基酸以及非天然胺基酸。
適用於本發明的天然胺基酸的實例包括但不限於Ala、Arg、Asp、Asn、Cys, His、 Gin、Glu、Gly、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp> Tyr 禾口 Val。
非天然胺基酸的實例包括但不限於4-氨基丁酸(Abu)、2_氨基己二酸、二氨基丙 (Dap)酸、羥賴氨酸、高絲氨酸、高纈氨酸、高亮氨酸、正亮氨酸(Nle)、正纈氨酸(Nva)、鳥氨 酸(Om)、TIC、萘丙氨酸(Nal) ,Phe的環-甲基化衍生物、Phe的滷化衍生物或鄰甲基_Tyr。
本文中的術語「胺基酸」還包括修飾胺基酸例如發生在體內翻譯後的修飾，例如羥 脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；D-修飾；氨基端基團或Lys的游離氨基的醯化或烷基 化、優選甲基化；羧端基團或者Asp或Glu的游離羧基的酯化或醯胺化；以及Ser或Tyr的 羥基的酯化或醚化。
術語「胺基酸」包括D-胺基酸和L-胺基酸兩者。因此，用於本發明綴合物的肽可 以是全D-胺基酸(甘氨酸除外)、全L-胺基酸或L，D-胺基酸。為了防止肽被生物體中的 酶切割，胺基酸的D-修飾和肽鍵的N-烷基化是最有利的。在本發明中，D-胺基酸用小寫 字母表示，如本文使用的SEQ ID NO 1的肽環RGDfK中的D-苯丙氨酸『f』殘基。
本發明還包括環肽。肽可以通過多種方法環化，例如形成二硫化物、硫化物，尤其 在N端和C端或胺基酸側鏈的羧基和氨基官能團之間形成內醯胺。環化可通過本領域已知 的任何方法獲得，例如通過醯胺鍵形成，例如通過在鏈中的各個位置(-C0-NH或-NH-CO鍵) 上摻入Glu、Asp、Lys、0m、二氨基丁(Dab)酸、二氨基丙(Dap)酸。主鏈-主鏈間的環化還 可以通過摻入式 H-N((CH2)n-C00H) -C (R) H-COOH 或 H-N((CH2)n_NH2) -C (R) H-COOH 的修飾氨 基酸來獲得，其中η = 1-4，且其中R是胺基酸的任何天然或非天然的側鏈。
環化還可通過摻入兩個Cys殘基經形成S-S鍵而獲得。另外的側鏈_側鏈間環化 可通過形成式-(CH2)n-S-CH2-CO-的相互作用鍵而獲得，其中η = 1或2，這是可行的，例如 通過加入Cys或高Cys以及其游離SH基團與例如溴乙醯化Lys、0m、Dab或Dap反應。
在一些實施方案中，RGD肽可以是 US 6, 576, 239, EP 0927045 和 WO 2008/023378 中所披露的肽，通過引用其整體結合到本文中，如同全部公開於本文一樣。
在一個優選的實施方案中，按照本發明使用的肽是SEQ ID NO 1的環戊肽RGDfK， 其中『f』表示D-Phe殘基。
在另一個優選的實施方案中，肽是本文用來提高RGD基序在結合整聯蛋白受體中 的重要性的SEQ ID NO 2的環戊肽RADfK。本發明又一個有用的環肽是SEQ ID NO 9的九 肽CDCRGDCGC，本文稱為『RGD-4C』，其含有4個半胱氨酸殘基，在分子中形成兩個二硫鍵。
RGD基序的天冬氨酸殘基非常易被化學降解，導致喪失生物活性，而這種降解可通 過二硫鍵經環化來防止。在穩定性提高的同時，與線性肽相比，環肽在抑制玻連蛋白對細胞 的附著方面具有較高能力。合成肽中RGD序列兩側殘基的數目和性質對該序列如何被各整 聯蛋白受體識別具有重大影響。芳族殘基可能在使整聯蛋白的結合部位有利於接觸方面特 別重要。靶向ανβ3的環狀RGD肽被不依賴於液相胞吞途徑的整聯蛋白內化，所述途徑不 改變細胞表面功能整聯蛋白受體的數目。此外，環狀RGD肽在溶酶體中於15分鐘後達到飽 和的過程中保持或降解，只有少部分可離開溶酶體並達到細胞胞質。
在其它優選的實施方案中，R⑶肽選自以下環肽⑴四肽環RGDK (SEQ ID NO 3)、 五肽環RGDf-n (Me) K (SEQ ID NO :4)，其中f表示D-Phe, f和K之間的肽鍵是甲基化的；以 及五肽環RGDyK (SEQID NO :5)，其中y表示D-Tyr。
在另一個實施方案中，含R⑶的肽是線性的，可選自六肽GRGDSP (SEQ ID NO :6)、 七肽 GRGDSPK (SEQ ID NO 7)和 25 聚物(GRGDSP) 4K (SEQ ID NO :8)。在一個更優選的實施 方案中，線性肽是GRGDSP。
在本發明的一個實施方案中，RGD肽通過其外圍的官能團(例如C00H)與光敏劑 葉綠素或細菌葉綠素大環直接連接，與RGD肽的氨基末端基團或游離氨基形成醯胺CO-NH2基團。
在另一個實施方案中，RGD肽通過間隔臂/橋連基與光敏劑大環連接，間隔臂/ 橋連基例如但不限於被末端官能團例如OH、C00H、SO3H, COSH或NH2取代的C1-C25亞烴基 (hydrocarbylene)、優選C1-Cltl亞烷基或亞苯基，因此形成醚、酯、醯胺、硫代醯胺或磺醯胺基團。
在一些實施方案中，光敏劑與RGd肽模擬物綴合。
在一個優選的實施方案中，RGD肽模擬物是包含被11個原子的鏈間隔開來的胍 和羧基端基的非肽化合物，至少5個所述原子為碳原子，且所述鏈包含一個或多個0、S或 N原子並且可被以下基團任選取代氧代、硫代、滷素、氨基X1-C6烷基、羥基或羧基，或者所 述鏈的一個或多個原子可形成3-6元碳環或雜環。該類型的化合物參見相同申請人的WO 93/09795和WO 2008/023378，通過引用其整體結合到本文中，如同全部公開於本文中一 樣。
在一個優選的實施方案中，上述RGD肽模擬物在鏈中包含N原子並且被氧代基團 取代。在一個更優選的實施方案中，RGD肽模擬物具有下式
H2N-C ( = NH) NH- (CH2) 5-C0_NH-CH (CH2) - (CH2) 2_C00H 或-NH-RGD-CO-NH- (CH2) 2-哌 嗪子基-(CH2) 2-NH-。
用於本發明的光敏劑是葉綠素或細菌葉綠素衍生物，其可以是天然的葉綠素或細 菌葉綠素或者葉綠素或細菌葉綠素的合成的非天然衍生物，包括這樣化合物，其中在大環 中和/或在外圍經過修飾，和/或中心Mg原子可不存在或被適用於診斷目的和/或PDT目的的其它金屬原子置換。
在一個優選的實施方案中，本發明涉及其中光敏劑為式I、式II或式III的葉綠素或細菌葉綠素的綴合物及其藥學上可接受的鹽和旋光異構體
R^0(III)
其中
M 表示 2H 或選自以下的原子Mg、Pd、Pt、Co、Ni、Sn、Cu、Zn、Mn、In、Eu、Fe、Au、 Al、Gd、Dy、Er、Yb、Lu、Ga、Y、Rh、Ru、Si、Ge、Cr、Mo、P、Re、Tl 和 Tc 及其同位素和放射性同位素；
X 為 0 或 N-R7;
R1, R，2 和 & 各自獨立地為 Y-IV -NR9R' 9 或-N+&R，9R，，辦-；
或者式II中的R1和&與它們所連接的碳原子一起形成包含RGD肽或RGD肽模擬 物的環；
Y 為 0或S;
R2 為 H、OH 或 C00& ；
R3 為 H、OH、C1-C12 烷基或 C1-C12 烷氧基；
R4 為-CH = CR9R' 9、-CH = CR9Hal, -CH = CH-CH2-NR9R' 9、-CH = CH-CH2-N+R9R' 9R」9A\ -CH0, -CH = NR9, -CH = N+R9R' 9A\ -CH2-OR9, -CH2-SR9, -CH2-Hal、-C H2-R9、-CH2-NR9R，9、-CH2-N+R9R，9R，VT、-CH2-CH2R9、-CH2-CH2Hal、-CH2-CH2OR9、-CH2-CH2SR9、-CH2-CH2 -NR9R' 9、-CH2-CH2-N+R9R' 9R」9A\ -COCH3> C(CH3) = CR9R' 9、-C(CH3) = CR9Hal, -C(CH3)= NR9、-CH (CH3) = N+R9R，9A_、-CH (CH3) -Ha 1、-CH (CH3) -OR9、-CH (CH3) -SR9, -CH (CH3) -NR9R，9、-CH (CH3) -N+R9R' 9R，9A-或-C 三 CR9 ；
R』4為甲基或甲醯基；
& 為=0、= S, = N-R9,= N+R9R' 9A\ = CR9R' 9 或=CR9-Hal ；
R7, R8, R9, R' 9 和 R」9 各自獨立地為
(a) H；
(WC1-C25 烴基；
(c) C1-C25烴基、優選C1-C25烷基、烯基或炔基、更優選C1-Cltl或C1-C6烷基，其被 一個或多個選自以下的官能團取代滷素、硝基、氧代、OR、SR、橋氧基(epoxy)、橋硫基 (印ithio)、-CONRR'、-COR、C00R、_0S03R、_S03R、-SO2R, -NHSO2R, -SO2NRR' -NRR，、= N-OR、 =N-NRR'、-C ( = NR) -NRR，、-NR-NRR'、- (R) N-C ( = NR) -NRR，、0 — NR-、> C = NR、- (CH2) n-NR-C0R，、- (CH2) n-C0-NRR，、-0- (CH2) n_0R、-0- (CH2) n_0_ (CH2) n-R、-PRR，、-OPO3RR'、-PO2HR 和-P03RR』，其中R和R』各自獨立地為H、烴基或雜環基，R」為烴基或雜環基；
(d) C1-C25烴基、優選C1-C25烷基、更優選C1-Cltl或C1-C6烷基，其被一個或多個選自 以下的官能團取代帶正電荷的基團、帶負電荷的基團、在生理條件下轉化成帶正電荷的基 團的鹼性基團和在生理條件下轉化成帶負電荷的基團的酸性基團；
(e) C1-C25烴基、優選C1-C25烷基、更優選C1-Cltl或C1-C6烷基，其含有一個或多個雜 原子和/或一個或多個碳環或雜環部分；
(f) C1-C25烴基、優選C1-C25烷基、更優選C1-Cltl或C1-C6烷基，其含有一個或多個雜 原子和/或一個或多個碳環或雜環部分且被上述(c)和(d)中定義的一個或多個官能團取 代；
(g) C1-C25烴基、優選C1-C25烷基、更優選C1-Cltl或C1-C6烷基，其被胺基酸、肽、優選 RGD肽、蛋白質、單糖、寡糖、多糖的殘基或多齒配體及其與金屬的螯合物取代；或者
(h)胺基酸、肽(優選RGD肽或RGD肽模擬物)、蛋白質、單糖、寡糖、多糖的殘基或 多齒配體及其與金屬的螯合物；
R7還可為-NRR』，其中R和R』各自為H或C1-C25烴基、優選C1-C25烷基、更優選C1-Cltl 或C1-C6烷基，其被帶負電荷的基團優選SO3-任選取代；
當禮、R，2和R6各自獨立地為Y-R8時，R8還可為H+或陽離子R+10 ；
R+10為金屬、銨基團(ammonium group)或有機陽離子；
A—為生理上可接受的陰離子；
m 為 0 或 1;
在7-8位上的虛線表示任選的雙鍵；
且式I、式II或式III的所述葉綠素或細菌葉綠素衍生物含有至少一個含RGD的肽殘基。
在一個實施方案中，在7-8位上的虛線表示雙鍵，光敏劑是式I、式II或式III的 葉綠素。式I化合物分別為葉綠素a和b，其中M為Mg，在173位上的隊為植基氧基，在132 位上的&為COOCH3,在132位上的R3為H原子，&為0，在3位上的R4為乙烯基，在7-8位 上的虛線表示雙鍵，或者在7位上的R』 4為甲基且在8位上的R4為乙基，或者在7位上的 R』 4為甲醯基且在8位上的R4為乙基，葉綠素a和b的衍生物可具有不同的金屬原子和/ 或不同的取代基R^mR』 4和/或&。
在另一個實施方案中，7-8位是氫化的，光敏劑為式I、式II或式III的細菌葉綠 素。式I化合物為細菌葉綠素a，其中M為Mg，173位上的R1為植基氧基或櫳牛兒基櫳牛兒 基氧基，在132位上的&為COOCH3,在132位上的R3為H原子，&為0，R4在3位上為乙醯 基且在8位上為乙基，在7-8位上的虛線不存在，且細菌葉綠素a的衍生物可具有不同的金 屬原子和/或不同的取代基R1^ R2> R3> R4和/或R5O
本文所使用的術語「烴基」是指任何直鏈或支鏈、飽和或不飽和、無環或環狀(包 括芳族)烴基原子團，其具有1-25個碳原子、優選1-20個、更優選1-6個、最優選2-3個碳 原子。烴基可為烷基，優選1-4個碳原子，例如甲基、乙基、丙基、丁基；或烯基、炔基、環烷 基、芳基(例如苯基)或芳烷基(例如苄基)，或者在式I、式II或式III化合物的17位，它 是衍生自天然Chl和Bchl化合物的原子團，例如櫳牛兒基櫳牛兒基(2，6_ 二甲基-2，6-辛 二烯基)或植基O，6，10，14-四甲基-十六碳-14-烯-16-基)。
本文所使用的術語「碳環部分」是指在環中只含碳原子的單環或多環化合物。碳 環部分可以是飽和的(即環烷基)，或不飽和的(即環烯基)，或芳族的(即芳基)。
本文使用的術語「烷氧基」是指基團(C1-C25)烷基-0-，其中C1-Cm烷基如上定 義。烷氧基的實例為甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基、戊 氧基、己氧基、-OC15H31、_0C16H33、-0C17H35、-OC18H37等。本文使用的術語「芳氧基」是指基團 (C6-C18)芳基-0-，其中C6-C18芳基如上定義，例如苯氧基和萘氧基。
本文使用的術語「雜芳基」或「雜環部分」或「雜芳族基」或「雜環基」是指衍生自 含有1-3個選自0、S和N的雜原子的單環或多環雜芳族環的原子團。具體實例為吡咯基、 呋喃基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、嚷唑基、噻唑基、吡啶基、喹啉基、嘧啶基、1，3，4-三嗪基、 1，2，3_三嗪基、1，3，5_三嗪基、苯並呋喃基、異苯並呋喃基、吲哚基、咪唑並[1,2-a]吡啶 基、苯並咪唑基、苯並噻唑基和苯並嚷唑基。
任何「碳環」、「芳基」或「雜芳基」可被以下一個或多個原子團取代例如滷素、 C6-C14 芳基、CfC25 烷基、硝基、OR、SR、-COR、-C00R、_S03R、-SO2R, -NHSO2R, -NRR，、- (CH2) n-NR-C0R』和-(CH2)n-CO-NRR'。要理解的是，當多環雜芳族環被取代時，取代基可在任何碳 環和/或雜環中。
本文使用的術語「商素」是指氟、氯、溴或碘。
在本發明的一個實施方案中，綴合物中的光敏劑是式I、式II或式III的葉綠素或 細菌葉綠素，其含有至少一個帶負電荷的基團和/或至少一個在生理PH下轉化成帶負電荷 的基團的酸性基團。
本文中定義的「帶負電荷的基團」是衍生自酸的陰離子，包括羧酸根(C00_)、硫代 羧酸根(cos_)、磺酸根(so3_)和磷酸根(po32_)，「在生理條件下轉化成帶負電荷的基團的酸性基團」包括羧酸基(-C00H)、硫代羧酸基(-C0SH)、磺酸基(-SO3H)和磷(-PO3H2)酸基。 具有在生理條件下轉化成一個或多個帶負電荷的基團的BChl衍生物參見相同申請人的WO 2004/045492，通過引用其整體結合到本文中，如同全部公開於本文一樣。
在一個更優選的實施方案中，本發明綴合物中的光敏劑是式II的葉綠素或細菌 葉綠素，其中R6為-NR9R' 9，R9為H，R，9為被SO3H或其鹼性鹽取代的C1-C10烷基。綴合物 最優選包含式II的細菌葉綠素衍生物，其中&為-NH-(CH2)2-SO3K或-NH-(CH2) 3-S03K。
在本發明的另一個實施方案中，綴合物中的光敏劑是式I、式II或式III的葉綠素 或細菌葉綠素，其含有至少一個帶正電荷的基團和/或至少一個在生理PH下轉化為帶正電 荷的基團的鹼性基團。
本文中定義的「帶正電荷的基團」是指衍生自含N基團或不含N的錫基團的陽離 子。由於腫瘤內皮的特徵在於陰離子部位的數目增多，因此帶正電荷的基團或在生理條件 下轉化成帶正電荷的基團的鹼性基團可提高本發明綴合物的靶向效率。
本文使用的「衍生自含N基團的陽離子」是指例如但不限於銨-N+ (RR』 R」)、胼錨 -(R)N-N+(R，R，，)、銨氧基(ammoniumoxy)O — N+(RR，)-、亞胺錨(iminium) > C = N+(RR，)、 脒錨(amidinium)-C( = RN)-N+R' R」 或胍錨-(R) N-C ( = NR)-N+R' R」 基團，其中 R、R，和 R」各自獨立地為H、烴基、優選如本文中定義WC1-C6烷基、苯基或苄基、或雜環基，或者在銨 基團中，R、R』和R」中的一個可為0H，或者銨基團中R、R』和R」中的兩個，或者胼輸、銨氧 基、亞胺輸、脒輸或胍輸基團中的R和R』，與它們所連接的N原子一起形成3-7元飽和環， 其任選含有一個或多個選自0、S或N的雜原子且任選在另外的N原子上被進一步取代，或 者所述陽離子衍生自雜芳族環中含有一個或多個N原子的化合物。
在一個更優選的實施方案中，本發明的綴合物含有式-N+(RR』 R」)的銨基團，其中 R、R』和R」各自獨立地為H或任選取代的如本文中定義的烴基或雜環基，或者其中之一可 為OH。-N+(RR』 R」)銨基團可為仲銨(secondary ammonium)，其中原子團R、R』或R」中的 任兩個為H ；叔銨，其中R、R』或R」中僅一個為H ；或季銨，其中R、R』或R」中的每一個為任 選取代的如本文中定義的烴基或雜環基。當R、R』或R」中的一個為OH時，該基團為羥基銨 基團。優選銨基團為季銨基團，其中R、R』和R」各自為C1-C6烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁 基、己基。銨基團在分子中可為端基，或者它可存在於分子的烷基鏈中。
在胼鏘-(R)N-N+ (R，R」)、脒鏘-C ( = NR) -N+R，R」和胍錨-(R) N-C ( = NR) -N+R，R」 基團中，R、R』和R」各自可獨立地為H或烴基或雜環基，或者R』和R」與它們所連接的N原 子一起形成如本文定義的3-7元飽和環。這類基團的實例包括其中R為H，R』和R」各自為 C1-C6烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、己基)的基團。
在銨氧基0 —N+(RR，)-和亞胺輸:> C = N+(RR，)基團中，R和R，各自可獨立地 為H或烴基、優選C1-C6烷基、或雜環基，或者R和R』與它們所連接的N原子一起形成如本 文定義的3-7元飽和環。
在另一個優選的實施方案中，葉綠素或細菌葉綠素衍生物含有式-N+(RR』 R」)的 環狀銨基團，其中R、R』和R」中的兩個與N原子一起形成下文中定義的3-7元飽和環。
本文中定義的由R、R』和R」中的兩個與它們所連接的N原子一起形成的「3-7元飽和環」可以是只含N的環，例如氮雜環丙烷、吡咯烷、哌啶、哌嗪或氮雜蕈，或者它可含有選自0和S的其它雜原子，例如嗎啉或硫代嗎啉。哌嗪環中另外的N原子可被烷基(例如 C1-C6烷基)任選取代，該烷基可被滷素、OH或氨基取代。衍生自所述飽和環的輸.基團包括丫丙啶,鏘、批咯烷鏘、哌啶鐠、哌嗪錨、嗎啉鏘、硫代嗎啉錨和氮雜蕈錨。
如本文定義的「衍生自含N雜芳族原子團的陽離子」是指衍生自N-雜芳族化合物 的陽離子，其可為任選含有0、S或額外N原子的單環或多環化合物。陽離子衍生自其中的 環應含有至少一個N原子並且為芳族，但是其它環(如有的話)，可以是部分飽和的。N-雜芳族陽離子的實例包括吡唑錨、咪唑錨、嚷唑鏘、噻唑鐠、吡啶錨、啼啶鏘、喹啉輸、異喹 啉鏘、1,2,4-三嗪鏘、1,3,5-三嗪鏘和嘌呤錨。
帶正電荷的基團還可以是輸基團但不含氮，例如但不限於憐[-P+(RR' R」)]、鍾 [-As+(RR' R」)]、氧鏘[-O+(RR')]、鋶[_S+(RR，)]、硒鏘[-Se+(RR')]、碲錨[_Te+(RR，)]、 銻鏘[-Sb+(RR' R」)]或鉍錨[-Bi+(RR' R」)]基團，其中R、R，和R」各自獨立地為H、烴基 或雜環基，優選C1-C6烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基)，或芳基，優選苯基。
式-P+ (RR' R」)憐基團的實例包括其中R、R，和R」各自為甲基、乙基、丙基、丁基或 苯基，或者R為甲基、乙基、丙基、丁基或己基以及R』和R」均為苯基的基團。式-As+(RR』R」) 鍾基團的實例包括其中R、R』和R」各自為甲基、乙基、丙基、丁基或苯基的基團。式-S+(RR』) 鋶基團的實例包括其中R和R』各自為甲基、乙基、丙基、丁基、苯基、苄基、苯乙基、或取代烴 基的基團。
本文中定義的「在生理條件下轉化為帶正電荷的基團的鹼性基團」從理論上講至 少是在生理條件下可產生如本文定義的帶正電荷的基團的任何鹼性基團。應當注意的是， 本文使用的生理條件不僅僅是指血清，而且還是指機體內不同的組織和細胞區室。
這類含N鹼性基團的實例包括而不限於可產生銨基團的任何氨基、可產生亞胺輸. 基團的任何亞胺基團、可產生胼錫.基團的任何胼基團、可產生銨氧基基團的任何氨基氧基 (aminoxy)、可產生脒輸基團的任何脒基團、可以產生胍輸基團的任何胍基團，所有基團如 本文中定義。其它實例包括膦基和巰基。
因此，本發明的綴合物可含有至少一個在生理條件下轉變為帶正電荷的基團的鹼 性基團，例如-NRR，、-C( = NR)-NR，R」、-NR-NR，R」、- (R) N-C ( = NR)-NR，R」、0 — NR-或 > C = NR，其中R、R』和R」中的每一個獨立地為H、烴基，優選C1-C25烷基，更優選C1-Cltl或 C1-C6烷基，或雜環基，或者R、R』和R」中的兩個與N原子一起形成3-7元飽和環，其任選含 有0、S或N原子且任選在另外的N原子上被進一步取代，或者鹼性基團為含N雜芳族原子 團。
3-7元飽和環可以是氮雜環丙烷、吡咯烷、哌啶、嗎啉、硫代嗎啉、氮雜草或哌嗪， 其在額外N原子上被C1-C6烷基任選取代，該烷基被商素、羥基或氨基任選取代，且含N雜芳 族原子團可以是吡唑基、咪唑基、碟唑基、噻唑基、吡啶基、喹啉基、異喹啉基、嘧啶基、1，2， 4-三嗪基、1，3，5-三嗪基或嘌呤基。
具有帶正電荷的基團或在生理條件下向其轉變的基團的BChl衍生物參見相同申 請人的WO 2005/120573，通過引用其整體結合到本文中，如同全部公開於本文一樣。
在一個實施方案中，光敏劑為式II的葉綠素或細菌葉綠素，且&為鹼性基團-NR9R' 9，其中&為H，R』 9為被鹼性基團-NRR』或-NH-(CH2) 2_6_NRR』取代的C1-C6烷基， 其中R和R』各自獨立地為H、被NH2任選取代的C1-C6烷基或者R和R』與N原子一起形成 5-6元飽和環，其任選含有0或N原子且在另外的N原子上任選被-(CH2) 2_6-NH2進一步取 代。
在另一個實施方案中，光敏劑為式II的細菌葉綠素，且Ii6S-NH-(CH2)3-NH-(CH2)3 -NH2, -NH- (CH2) 2-1-嗎啉代或-NH- (CH2) 3_ 哌嗪子基-(CH2) 3_NH2。
在一個進一步的實施方案中，R1和& 一起形成包含RGD肽或RGD肽模擬物的環。
在另一個實施方案中，光敏劑為式III的葉綠素或細菌葉綠素，且X為-NR7, R7 為-NRR』，R為H，R』為被SO3-或其鹼性鹽取代的C1-C6烷基，光敏劑優選為細菌葉綠素，且 X 為-NR7, R7 為-NH-(CH2)3-SO3K15
在另一個實施方案中，R7、R8,9各自為被一個或多個-OH基團取代的 C1-C6烷基。例如，光敏劑為式II的葉綠素或細菌葉綠素且&為-NR9R' 9，&為H，R』 9為 HOCH2-CH(OH) -CH2-。
在另一個實施方案中，光敏劑為式II的葉素或細菌葉綠素，且&為-NR9R'9，&為 H，R』 9為被多齒配體或其與金屬的螯合物取代C1-C6烷基。多齒配體的實例包括而不限於 EDTA(乙二胺四乙酸)、DTPA (二亞乙基三胺五乙酸)或大環配體D0TA。在一個優選的實施 方案中，多齒配體為DTPA，R6為-NH- (CH2) 3_NH_DTPA，金屬為Gd。
陽離子R8+可以是衍生自鹼金屬或鹼土金屬的一價或二價陽離子，例如K+、Na+、 Li+、NH4\ Ca2+，更優選K+ ；或R8+為衍生自胺或含N基團的有機陽離子。
如本文中的定義，R7, R8, R9和R』 9中定義的C「C25烴基可被一個或多個選自以下 的官能團任選取代滷素、硝基、氧代、OR、SR、橋氧基、橋硫基、氮雜環丙烷、-CONRR'、-C0R、 C00R、-0S03R、-S03R、-S02R、-NHS02R、-SO2NRR' -NRR'、 = N_0R、 = N-NRR'、-C (= NR) -NRR，、-NR-NRR'、- (R) N-C ( = NR) -NRR，、0 — NR-、> C = NR、- (CH2) n_NR_C0R，、- (CH2) n-C0-NRR，、-0- (CH2) n-0R、-0- (CH2) n_0_ (CH2) n-R、-PRR，、-OPO3RR'、-PO2HR, -PO3RR'； 一個或 多個帶負電荷的基團，例如 COO-、COS-、-OSO3-、-SO3-、-OPO3R-、-PO2H-、-PO32-和-PO3R-；和 / 或 一個或多個帶正電荷的基團，例如-P+(RRT)、-As+(RRT)、-0+(RR，)、-S+(RR，),-Se+(RR') ,-Te+(RR『)、-Sb+(RR，R」)、-Bi+(RR，R」)、0 — N+(RR，)-、> C = N+(RR，)、-N+(RR，R」)、-(R) N-N+(RR，R」)、-(R)N-C( = HN)-N+RR' R」、_C( = NH)_N+(RR，R」)、或 N-雜芳族陽離子，例 如吡唑輸、咪唑錫、Hf唑輸、噻唑錫、吡啶輸、喹啉輸、嘧啶輸、1，2，4-三嗪傲、1，3，5-三嗪 輸和嘌呤輸；其中η為1-6的整數，R、R』和R」各自獨立地為H、烴基或雜環基，或者R、R』 和R」中的兩個與它們所連接的N原子一起形成3-7元飽和環，其任選含有一個或多個選自 0、S或N的雜原子且任選在另外的N原子上被進一步取代。R7、&、I 9和R』9中定義的C1-C25 烴基還可被單糖、寡糖或多糖殘基(例如糖基)、或胺基酸殘基、肽或蛋白質、優選RGD-肽取 代。另外，和R』9各自可獨立地為單糖、寡糖或多糖的殘基(例如糖基)，或胺基酸殘 基、肽或蛋白質，或多齒配體例如DTPA、D0TA、EDTA等及其與金屬的螯合物。
在基團OR和SR中，當R為H時，該基團分別表示羥基和巰基，當R不是H時，則代 表醚和硫化物。在基團-PRR』中，當R和R』為H時，表示膦基。在基團-COR中，當R為H 時，表示醛的甲醯基-CH0，而當R不是H時，它便是酮的殘基，例如烷基羰基和芳基羰基。在 基團COOR中，當R不是H時，這便是羧酸酯基團，例如烷氧基羰基和芳氧基羰基。同樣地，在基團-0S03R、-S03R、-S02R、-OPO3RR'、-PO2HR 和-PO3RR'中，當 R 禾口 R，不是 H 時，表示酯。
在本發明的一個優選的實施方案申，光敏劑是未金屬化的，即M為2H。在其它優 選的實施方案中，光敏劑為如上文中定義的金屬化的，M更優選為PcUCu或Mn，最優選為Pd 或Cu。
在本發明的一些優選實施方案中，光敏劑為式I、式II或式III、更優選式II的 Bchl，M為2H、Cu、Mn或Pd。在其它實施方案中，光敏劑為式I、式II或式III、更優選式II 的 Chl，M 為 2H、Cu 或 Mn。
在一些優選的實施方案中，綴合物包含式II的光敏劑Bchl，其中M為Pd、Mn、Cu 或2H ;m為0諷為NH-P，其中P為與NH-直接連接或通過間隔物連接的含RGD的肽或RGD 肽模擬物的殘基；R』 2為甲氧基；R4在3位上為乙醯基且在8位上為乙基；R』 4為甲基；R6 為-NH- (CH2)n-S03lfe+，其中 η 為 2 或 3，Me+ 為 Na+ 或 K+。
在本發明的一個最優選的實施方案中，綴合物包含式II的Bchl，其中M為2Η，R1 為NH-P，其中P為SEQ ID NO 1的含RGD的肽c (RGDfK)的殘基，R，2為甲氧基，R4在3位 上為乙醯基且在8位上為乙基，R』 4為甲基，I^6S-NH-(CH2)2-SO3K,本文稱為化合物Π或 c(RGDfK)-2H-MLT。
在另一個最優選的實施方案中，M為PcbRpR』 2、R4、R』 4、&如上定義，P為SEQ ID NO 1 的 c (RGDfK)，本文稱為化合物 M 或 c (RGDfK) -Pd-MLT。
在一個更優選的實施方案中，M為Mn，&、R』 2、R4、R，4、&如上定義，P為c (RGDfK)， 本文稱為化合物 或c (RGDfK) -Mn-MLT,或者M為Cu，該綴合物在本文中稱為化合物邊或 c(RGDfK)-Cu-MLT。
在又一個更優選的實施方案中，式II中Bchl的M為2H，R』 2、R4、R』 4和&如上定 義,R1SNH-P,其中 P 為 SEQ ID NO :2 的 C (RADfK)，本文稱為化合物堅或 c (RADfK)-2H-MLT， 或者 P 為 SEOID NO :5 的 c (RGDyK)。
在其它更優選的實施方案中，M為2禮禮、1 』 2、R4、R』 4和&如上定義，P為選自以下 的線性肽SEQ ID NO :6 的GRGDSP或SEQID NO :7 的GRGDSPK或 SEQ ID NO :8 的(GRGDSP) 4， 最優選P為GRGDSP，該綴合物在本文中稱為化合物巡或線性GRGDSP-2H-MLT。
在還更優選的實施方案中，在式II的Bchl中，M為Pd，m為0，Ii1SNH-P,其中 P為c (RGDfK)，R』 2為甲氧基，R4在3位上為乙醯基且在8位上為乙基，R』 4為甲基，和& 為-NH- (CH2) 3-S03K,或者 P 為 SEQ ID NO 4 的環肽 RGDf-n (Me) K,和 R6 為-NH- (CH2) 2_S03K。
另外更優選的實施方案涉及與SEQ ID NO 7的線性肽GRGDSI3K或SEQ ID NO 8的 (GRGDSP)4的綴合物，其中式II的Bchl的中心金屬原子為Pd ；m、R，2、R4、R，4如上定義，R1 為 HH-P，且 & 為-NH- (CH2) 2_S03K。
在甚至還更優選的實施方案中，綴合物包含式II的Bchl，其中M為Pd;m、R』 2、 R4> R，4 如上定義，R1 為 NH-CH[(-(CH2)2-C0-NH-P]2，其中 P 為 SEQ ID NO 5 的含 RGD 的肽 c (RGDyK)的殘基，且 & 為-NH- (CH2) 2_S03K，本文稱為化合物巡或 c (RGDyK) 2_2H_MLT。
在本發明另外兩個更優選的實施方案中，在式II的Bchl中，M為Pd或2H;m為0 ； R1為朋寸，其中P為C(RGDfK) (SEQ ID NO 1)的殘基，R』 2為甲氧基；R4在3位上為乙醯基 且在8位上為乙基；R』 4為甲基，&為-NH-CH2-CH (OH)-CH20H。
在再一個更優選的實施方案中，綴合物包含如上所述的R⑶肽，優選與式II的24Bchl 綴合的 c (RGDfK)，其中 M 為 2H ;m、R」 R，2、R4、R，4 如上定義，且 & 為 NH- (CH2) 3_NH_ (C H2) 3-NH2、-NH- (CH2) 2-嗎啉代或-NH- (CH2)「哌嗪子基 _ (CH2) 3_NH2。
另外更優選的實施方案涉及包含式II的Bchl的綴合物或其與Gd的螯合物，其中 M為2H ;m為0 ；禮為NH-c (RGDfK)，R』 2為甲氧基，R4在3位上為乙醯基且在8位上為乙基， R，4 為甲基；且 & 為-NH- (CH2) 3-NH-C0-DTPAo
本發明還涉及優選的綴合物，其包含式II的光敏劑Bchl，其中M為Pd或2H;m為 0 為NH-P，其中P為與NH-直接連接或通過間隔物連接的RGD肽模擬物的殘基；R』2為甲 氧基；R4在3位上為乙醯基且在8位上為乙基；R』4為甲基；且Ii6S-NH-CH2-CH(OH)-CH2-OH 或-NH- (CH2) 2-S03K。
在本發明的另一個實施方案中，綴合物包含式III的Bchl，其中M為Pd 為 NH-P，其中P為與NH-直接連接或通過間隔物連接的含RGD的肽或RGD肽模擬物的殘基；R4 在3位上為乙醯基且在8位上為乙基；R』 4為甲基；X為N-R7，且R7為-NH-(CH2) 3-S03lfe+， 其中Me+為Na+或K+。
在另一個實施方案中，綴合物包含式I的Bchl，其中M為Mn ；禮為NH-P，其中P 為與NH-直接連接或通過間隔物連接的含RGD的肽或RGD肽模擬物的殘基；R2為OH ；R3為 COOCH3, R4在3位上為乙醯基且在8位上為乙基；R』4為甲基；且&為0。在更優選的實施方 案中，M 為 2H 或 Mn，P 為 SEQ ID NO 1 的含 RGD 的肽 c (RGDfK)或 SEQ ID NO 3 的 c (RGDK)的殘基。
在另一個實施方案中，綴合物包含式II的Chl，其中M選自Mn、Cu或2H ；R1為NH-P， 其中P為與NH-直接連接或通過間隔物連接的含RGD的肽或RGD肽模擬物的殘基；R4在3 位上為乙烯基且在8位上為乙基；R』 4為甲基；且&為-NH-(CH2) 2-S03lfe+，其中Me+為Na+ 或K+。
在更優選的實施方案中，在式II的Chl中，M為2H或Cu或Mn，R4、R』 4和&如上 定義，光敏劑與SEQ ID NO 1的五環的含RGD的肽c (RGDfK)綴合。
在另一個實施方案中，隊和& 一起形成包含-NH-RGD-CO-NH- (CH2) 2_NH_或-NH-RGD -CO-NH-(CH2)2-哌嗪子基-(CH2)2-NH-的環。在一個實施方案中，綴合物包含式II的Bchl， 其中m為0 ；R』2為甲氧基；R4在3位上為乙醯基且在8位上為乙基；R』4為甲基；且R1和& 兩個一起形成包含-NH-RGD-CO-NH- (CH2) 2_NH_的環，且M為Pd或M為2H，或者隊和& 一 起形成包含-NH-RGD-CO-NH- (CH2) 2_哌嗪子基-(CH2) 2_NH_的環，且M為Pd。
工業實用性
對於在本發明中的應用，將綴合物配製在包含藥學上可接受的載體的藥物組合物 中。
在一個實施方案中，藥物組合物用於光動力療法(PDT)，更準確地講是用於腫瘤靶 向PDT。在另一個實施方案中，藥物組合物用於診斷目的，用於壞死腫瘤區的可視化。
可按照本發明，通過使中心金屬原子適合特定的技術，來應用若干診斷技術。
對於通過動態螢光成像進行的壞死腫瘤區診斷，光敏劑中的M為2H或選自Pd和 Zn的金屬。
對於通過放射性診斷技術進行的壞死腫瘤區診斷，光敏劑中的M為選自以下的放 射性同位素^Cu^CCc、67^!、·!!、19^、6^、11、和51Cr。在一個實施方案中，放射性診斷技術是正電子發射斷層攝影術(PET)，且M為64Cu或67Cu。在另一個實施方案中，放射 性診斷技術是單光子發射斷層攝影術(SPET)，且M為選自以下的放射性同位素99mTc、67Ga、 195Pt,111In^51Cr 和 60Coo
對於通過分子核磁共振成像(MRI)進行的壞死腫瘤區診斷，M為選自以下的順磁 金屬Mn3+、CU2+Je3+、EU3+、Gd3+和Dy3+，或者光敏劑被多齒配體的金屬螯合物取代，所述金屬 如前文中定義。
在一個實施方案中，本發明涉及用於通過動態螢光成像使壞死腫瘤區成像的方 法，所述方法包括
(a)給予疑似患有帶有壞死區的腫瘤的受治療者本發明的綴合物，其中M為2H或 選自Pd和Si的金屬；
(b)在給予綴合物後至少24-48小時期間以1_8小時的時間間隔照射受治療者並 測定可疑區域的螢光，其中在M-48小時或更長時間後具有螢光的區域表示存在壞死腫瘤 區。
在一個優選的實施方案中，用於上述方法的綴合物是化合物叢或化合物M，腫瘤 是乳腺腫瘤或卵巢腫瘤，在藥物(綴合物)注射後3-8天，優選5-8天可觀察到壞死區。
在另一個實施方案中，本發明提供用於通過放射性診斷技術診斷壞死腫瘤區的方 法，所述方法包括
(a)給予疑似患有腫瘤的受治療者本發明的綴合物，其中M為選自以下的放射性 同位素64CU、67CU、99mTC、67Ga、2(llTl、195Pt、6°C0、mh 或 51Cr。
(b)在給予綴合物後至少M-48小時期間以1-8小時的時間間隔用成像掃描儀對 受治療者進行掃描，測定可疑區域的放射水平，其中在M-48小時或更長時間具有放射性 的區域表示存在壞死腫瘤區。
本發明還提供用於診斷壞死腫瘤區的分子核磁共振成像(MRI)方法，所述方法包 括以下步驟
(a)給予疑似患有腫瘤的受治療者如本文定義的綴合物，其中M為選自以下的順 磁金屬:Mn3\ Cu2+、Fe3+、Eu3+、Gd3+ 或 Dy3+ ；和
(b)通過在所述給藥之前(零時)在患者體內產生目標靶區的至少一幅MR圖像以 及在所述給藥之後至少M-48小時、優選96小時在第二個或更多個時間點上產生一幅或多 幅MR圖像，而對患者進行核磁共振成像；和
(c)對數據進行加工和分析以診斷所述壞死腫瘤區的存在與否。
本發明還提供在手術前用於對腫瘤邊緣作圖的方法，所述方法包括給予有需要的 受治療者本文中定義的綴合物，在給予綴合物後頭2-M小時，對受治療者進行照射，並使 腫瘤、優選乳腺腫瘤成像而進行掃描，因此在手術準備中給腫瘤邊緣作圖。
本發明還提供用於局部乳腺癌、尤其原位管癌(DCIS)的微創治療、檢測和預後 策略，所述策略包括(i)給予受治療者本文中定義的綴合物，優選RGD-Bchl綴合物，從而 RGD-Bchl綴合物特異性歸巢並蓄積在壞死腫瘤區，(ii)通過以高精度用於腫瘤檢測和腫 瘤邊緣界定的上述任何方法對用RGD-BChl衍生物治療的受治療者進行腫瘤靶向成像，以 及通過MRI、螢光和PET SCAN方法預後；和(iii)允許保乳和重塑的局部壞死區的腫瘤靶 向光動力療法(PDT)。
用於本發明的RGD肽-光敏劑綴合物特別適用於壞死腫瘤的腫瘤靶向PDT，並可用 於治療癌性疾病。
因此，在一個實施方案中，本發明的綴合物可用於腫瘤領域以通過癌前狀態和若 幹癌症類型的PDT用於治療，所述癌症類型例如但不限於黑素瘤、前列腺、腦、結腸、卵巢、 乳腺、結腸直腸、頭頸部、由乳腺癌引起的胸壁腫瘤、皮膚、肺、食道和膀胱癌和腫瘤。所述化 合物可用於治療原發移性壞死腫瘤以及轉移性壞死腫瘤。
在一個優選的實施方案中，該方法用於治療局部乳腺癌，尤其原位管癌。
本發明提供用於壞死腫瘤的腫瘤光動力療法的方法，所述方法包括(a)給予有 需要的個體本發明的RGD肽-光敏劑綴合物；和(b)在注射綴合物後至少M小時，優選2、 3、4、5、6、7或8天，通過本文所述的任何方法，在確定存在壞死區後照射腫瘤局部及其壞死 區。
在一個方面，本發明涉及檢測腫瘤壞死的新的方法，所述方法以螢光Chl/ Bchl-RGD綴合物在壞死腫瘤區的選擇性攝取和長期蓄積為基礎。Chl/Bchl致敏物與歸巢 於內皮和腫瘤細胞的特異性受體的配體綴合。然後，一旦Chl/Bchl以足夠高的濃度蓄積 和並從周圍組織清除後，便通過照射腫瘤體積和緊接的附近，開始以光動力學的方式產生 ROS。
化合物M的Bchl組分在近紅外線(NIR)處具有可以檢測固有螢光。使用化合物 M的最新實驗顯示，在原發瘤的異種移植物中蓄積高達4_8uM。化合物M長時期保留在腫 瘤部位，使得信號蓄積和良好的信噪比成為可能。該分子的這些能力可能取決於Bchl和血 清白蛋白之間的相互作用，使該分子成為定向成像和最終定向療法的良好的候選分子。另 一種Bchl衍生物化合物叢，具有高達3倍的發光能力，因此可以是甚至更好的靶向成像的 候選分子。這些分子開啟了在人乳腺腺癌模型中精確檢測腫瘤邊緣和壞死的可能性。檢測 腫瘤邊緣和壞死是迄今為止在腫瘤治療中存在的兩個最具有挑戰性的問題。此外，兩者是 在治療後腫瘤再生長的可靠預測物。因此，預期在未來的臨床應用時，前述RGD衍生物適用 於在手術臺上檢測腫瘤和壞死。
本發明引進了實現與RGD肽綴合的Chl/Bchl衍生物在有活力腫瘤組織中短暫停 留後在壞死腫瘤區長期蓄積的新的方法。蓄積的化合物可用於有活力(在給藥後短期內) 或壞死(在較長時間內)腫瘤區的體內成像，以及用於通過PDT的腫瘤療法、通過改變Bchl 中心金屬或通過與小的治療劑進一步綴合的化療或同位素放射療法。以化合物叢和化合 物M為例對新的方法進行了說明。已把C(RGDfK)鑑定為在血管生成中上調的ανβ5整聯蛋白的高度特異性配體。化合物25部分提供在OTR時具有強自身螢光的綴合 物，使之適用於在組織攝取後的螢光成像。
實驗數據表明，RGD部分是化合物叢和化合物M在小的(無壞死)腫瘤和大的 (壞死)腫瘤兩者中的特異性蓄積中必不可少的，因為對於未綴合的化合物些，沒有觀察到 短期或長期的蓄積。此外，經治療小鼠的化合物型的總體清除率比綴合化合物的顯著較 快。通過本文描述的競爭實驗對RGD待定機製作出補充，其中在化合物叢後不久或同時注 射過量的游離c (RGDfK)，防止了稍後被腫瘤組織攝取。
在壞死和無壞死腫瘤之間觀察到在化合物Π蓄積中的巨大差異。因此，還沒有發 展成壞死的小的MDA-MB-231-RFP腫瘤(約0. 5cm3)顯示-在藥物注射後1-6. 5小時內化合物叢在腫瘤中快速蓄積，隨後是快速( Icm3) 腫瘤顯示出較慢的達到峰值腫瘤濃度比的蓄積。自藥物注射後M小時起，腫瘤質量中的平 均藥物濃度僅輕微降低。這些結果對於壞死腫瘤區是普遍的，但因腫瘤類型而有所不同。此 外，對於化合物1在壞死和無壞死腫瘤中的蓄積方式之間觀察到類似差異，不同之處在於 在肝中觀察到較慢的清除率，使化合物叢成為用於臨床應用的更好的候選分子。
或許，在乳腺癌模型和卵巢癌腫瘤模型中，本文所觀察到的化合物叢在壞死區和 無壞死區的蓄積速率之間的差異，與兩個腫瘤類型的微環境的不同性質有關。在乳腺腫瘤 觀察到腫瘤體積和微血管密度之間的相反關係隨著腫瘤體積增加，每立方釐米的微血管 密度顯著降低。因此，整聯蛋白的濃度變得按比例地降低，因此整聯蛋白依賴性藥物蓄積的 速率應按比例地降低。
所提供的數據最突出的特徵是藥物螢光從活力部位明顯轉移至壞死腫瘤體積，其 由給予化合物叢後不同時間壞死MDA-MB-231-RFP腫瘤的切離腫瘤螢光成像得到證實。根 據藥物蓄積對RGD部分的依賴性，多步驟蓄積是可能的，其中第一步包括化合物迆部分 (2H-MLT)從血清白蛋白分子中解離，被微血管系統、有活力的腫瘤細胞及或許巨噬細胞或 嗜中性粒細胞中的ανβ3整聯蛋白有效攝取。據信該步驟後接著是化合物叢被動轉運或 胞轉遷移進入壞死區，並且在此長時間缺乏從中的引流作用(drainage)。在無壞死腫瘤中， 藥物通過由整個腫瘤構成的有活力區域快速蓄積，但是因為不存在壞死，所以藥物快速清 除。當注射化合物M時，切離腫瘤螢光結果與化合物叢獲得的結果類似。
在其它腫瘤模型(即MLS-mBanana、人卵巢癌)中，觀察到壞死和無壞死腫瘤的 蓄積率的類似差異。然而，在速率和蓄積方式上存在一些變化，可能反映了不同的腫瘤類 型。化合物叢在無壞死MLS-mBanana腫瘤中快速蓄積，然後慢慢清除掉。在壞死腫瘤中 藥物在第一小時內在有活力邊緣達到最大濃度，然後轉移到壞死區，在給藥後M小時在此 達到最大濃度。與MDA-MB-231-RFP相比，在MLS-mBanana中以高濃度快速蓄積，反映了在 MLS-mBanana細胞中整聯蛋白受體的較高濃度。
用化合物叢治療的動物的大腫瘤和小腫瘤的組織學分析似乎支持所提出的蓄積 方式，並提供了一些有關潛在機制的線索。在頭幾小時內有活力腫瘤區和化合物旦螢光有 非常好的重疊，在給藥後M小時和更長時間，叢的螢光和壞死區間有非常好的重疊。
有許多藥物和造影劑在與淋巴引流差和靜脈回流慢有關的腫瘤中蓄積的報導。之 前有研究提出這種現象，稱為高通透性和保持(EPR)作用，作為以非特異性方式靶向腫瘤 組織的方法。有可能的是，Era說明了化合物叢或化合物M在壞死區和無壞死腫瘤中的 蓄積方式。最近有研究提出，血清白蛋白(SA)-藥物絡合物通過腫瘤血管系統滲透到間質 腫瘤組織中以說明這類蓄積(Tanaka，Siiramoto等，2004)。文獻中有若干實例顯示，分子 與SA綴合導致將分子遞送至腫瘤甚至遞送至壞死區。事實上，本發明的發明人之前指出帶 負電荷的水溶性Bchl衍生物對SA具有高親和力。因此，在給藥後化合物叢或化合物M 可能通過Bchl部分與SA締合，在血液中循環，並通過如上闡釋的EI3R作用與SA —起滲入 (extravagate)到腫瘤組織中。如果那樣的話，預期化合物型作為突出的化學實體在壞死 區蓄積，然而，由於化合物些在所研究的腫瘤中的保留短暫，可排除通過Era作用蓄積的可能性。
或者，當Bchl-RGD衍生物遇到α V β 3或α V β 5整聯蛋白時，它可從SA載體上脫 落，並且以比SA分子更高的親和力通過RGD組成部分與整聯蛋白結合。在這種最初的連接 後，化合物叢或化合物M可通過胞吞擴散至上皮細胞，或跨越上皮細胞進行胞轉。藥物直 接遷移到胞外基質(ECM)中也是可能的。在這些情況下，根據濃度梯度進行的藥物移動將 趨向於壞死區，在此化合物叢或化合物M開始達到其最低濃度。
曾提出的c(RGDfK)-2H/Pd-MLT與整聯蛋白的相互作用可能意味著在壞死腫瘤區 的蓄積是嗜中性粒細胞/巨噬細胞依賴性的。相當一段時間就已知活化的嗜中性粒細胞和 巨噬細胞表達整聯蛋白。組織學結果表明，嗜中性粒細胞停留在壞死區(雖然大部分在邊 緣中)。由文獻得知，在侵襲性乳腺癌中存在高的巨噬細胞浸潤(Leek，Landers等，1999)。 對於NACA (Necrosis Avid Contrast Agents，壞死親和性造影劑)，發現從壞死病灶中的 最終清除在給藥後要花幾天，對應於天然癒合過程，期間壞死組織日漸被浸潤，被炎性細胞 (主要是嗜中性粒細胞、單核細胞和/或巨噬細胞)吞噬，並且被肉芽組織代替。因此，認為 壞死中保留的NACA將通過吞噬作用與壞死材料一道被清除掉。因此，在NACA-壞死結合後 第二次巨噬細胞攝取也可解釋其局部富集。因此有人提出，有可能是壞死區的吸引及在其 中的保留依賴於聚集在壞死區的嗜中性粒細胞和/或巨噬細胞的吸引。
螢光Chl/Bchl在壞死區的可能的靶向和長期保留，使得它們能夠被早期檢出，並 且有助於預測腫瘤預後和治療方式。此外，它開啟了遞送引發低氧的藥物的途徑。
下面通過下列非限制性實施例對本發明進行說明。實施例
材料與方法
(i)化合物-按照相同申請人的WO 2008/023378中所述，製備Bchl衍生物、 RGD-肽及其綴合物。本文這些綴合物和化合物用與W02008/023378相同的阿拉伯數字表示 (化合物45除外)。
化合物n[c(RGDfK)-2H_MLT] :31-氧代_15_甲氧基羰基甲基-紅螺菌菌綠素 131- -磺乙基)醯胺-173-c (RGDfK)醯胺鉀鹽。
化合物M [c (RGDfK)-Mn-MLT]錳(111)31-氧代_15_甲氧基羰基甲基-紅螺菌菌 綠素131- -磺乙基)醯胺-173-(環RGDfK)醯胺鉀鹽。
化合物邊[(3 (RGDfK) -Cu-MLT]銅(II) 31-氧代_15_甲氧基羰基甲基-紅螺菌菌 綠素131- -磺乙基)醯胺-173-(環RGDfK)醯胺鉀鹽。
化合物M[c (RGDfK) -Pd-MLT]鈀31-氧代_15_甲氧基羰基-甲基-紅螺菌菌綠 素131- -磺乙基)醯胺-173-c (RGDfK)醯胺鉀鹽。
化合物型[2H-MLT] :31-氧代_15_甲氧基羰基甲基-螺紅菌-菌綠素131- -磺 乙基)醯胺鉀鹽。
化合物26「線性GRGDSP-2H-MLT1 :31-氧代_15_甲氧基羰基甲基-紅螺菌菌綠素 13^(2-磺乙基)醯胺-173-(GRGDSP)醯胺鉀鹽。
化合物36「c (RGDyK),-2H-MLT1 =31-氧代-15-甲氧基羰基甲基-紅螺菌菌綠素 13^(2-磺乙基)醯胺-173-雙(環RGDfK)醯胺鉀鹽。
化合物45「c (RADfK) -2H-MLT] :31-氧代-15-甲氧基羰基甲基-紅螺菌菌綠素 131- -磺乙基)醯胺-173-(環RADfK)醯胺鉀鹽。
(ii)細胞系一從美國典型培養物保藏中心(ATCC，Manassas, VA)獲得 MDA-MB-231人乳腺癌細胞。MLS-pRSETB-mBanana轉染的抗嘌羅黴素的人卵巢癌細胞由 Michal Neeman 教授(Department ofBiological Regulation, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel)惠贈。
(iii)用紅色螢光蛋白(RFP)轉染的MDA-MB-231-兩種質粒用於轉染攜帶新 黴素抗性基因的pDsRed2-Nl(Cl0ntech，Palo Alto, CA)(圖ΙΑ)，及攜帶潮黴素抗性基因 的修飾的 pDsRed-Monomer-Hyg-Cl (Clontech, Palo Alto, CA)，其中圖 IB 中所示質粒的 DsRed-Monomer基因被pDsRed2 (得自pDsRed2_Nl質粒，圖1C)替換。對於轉染，按照生產 商的方案使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen )。
(iv)組織培養一將MDA-MB-231-RFP細胞在補充了 lmmol/L丙酮酸鈉、10 %胎 牛血清(FCS)、250 μ g/ml潮黴素、0. 06mg/ml青黴素和0. lmg/ml鏈黴素的RPMI 1640培 養基中維持。細胞在潮溼環境(5% C02，95%空氣)中在37°C下生長成為單層細胞。將 MLS-mBanana細胞在補充了 lmmol/L丙酮酸鈉、10%胎牛血清(FCS)、10 μ g/ml嘌羅黴素、 0. 06mg/ml青黴素和0. lmg/ml鏈黴素的MEM-α培養基中維持。細胞在潮溼環境(5% CO2, 95%空氣)中在37°C中生長成單層細胞。
(ν)動物一遵照 Weizmann Institute of Science (Rehovot，Israel)的機構動物 管理與使用委員會的準則(1996)，在動物設施中關養雌性CDl裸小鼠(7-8周齡，約25g)， 並且按任意進食飲水處理。
(vi)小鼠腫瘤模型一MDA-MB-231-RFP螢光人乳腺癌細胞和MLS-mBanana螢光人 卵巢癌細胞(5X IO6的100 μ 1鹽水溶液)用胰蛋白酶消化，在分會合時收集，然後接種到雌 性小鼠背部和乳房脂墊。使腫瘤生長成為兩種所需大小一壞死腫瘤(約lcm3，3-4周內) 和無壞死腫瘤(約0. 5cm3,1-2周內)。
(vii)整體螢光成像一通過腹膜內注射30 μ 1 85 15氯胺酮賽拉嗪的混合物 使小鼠麻醉。對於監測乳房脂墊中的藥物蓄積，按15mg藥物/kg體重將化合物叢、化合物 巡或化合物M經靜脈內注射到小鼠尾靜脈。通過體內光學成像系統IVIS 100 (Xenogen Corp. , Alameda, CA)監測紅色螢光蛋白(RFP)、pRSETB-mBanana和光敏劑螢光。用於腫瘤 成像的主濾片組包括500-550nm下的激發濾片和575-650nm下的發射濾片；用於減去組織 自體螢光的背景濾片組包括460-490nm下的激發濾片和575-650nm下的發射濾片。藥物成 像主濾片組包括665-695nm下的激發濾片和810-875nm下的發射濾片。圖像在相同的曝光 時間內獲得，用線條彩色標尺說明以供進行定性比較。
(viii)壞死腫瘤中的螢光信號測量一從整體體內圖像標出腫瘤邊緣(目標區 (R0I))，圈出邊緣內的螢光信號用光子/秒表示。在旁側用相同的ROI測量光子/秒。另 外，對於背景測量，在3隻未治療小鼠中測量腫瘤和旁側R0I，取平均值。將各個ROI的螢光 測量值除以面積得到歸一化螢光信號強度，單位為光子/秒/cm2。化合物叢注射後從15 分鐘到216小時收集信號測量值。在每個時間點上，減去背景，計算得到平均，計算得到腫 瘤邊緣和旁側螢光之間的比率。
(ix)化合物Π和游離C(RGDfK)結合之間的競爭測定法一在注射化合物13 (HOnmol)之前1小時給小鼠注射過量(8. 5ymol)的游離c (RGDfK)肽。對照組只注射 化合物I^(HOnmol)。化合物叢注射後M小時拍攝螢光照片。按(vii)中所述使用螢光 成像主濾片組。
(χ)切離腫瘤螢光成像--將15mg/kg化合物叢經靜脈內注射到小鼠尾靜脈中。 處死小鼠，切除腫瘤，切開兩半，使用Xenogen IVIS 系統在不同的時間間隔成像對於 MDA-MB-231-RFP為10分鐘、1小時、4小時和24小時、3天、5天和7天，對於MLS-mBanana 為7天。用於螢光成像的濾片組見(vii)。
(xi)組織學一在切除實驗後，將腫瘤在3. 7%甲醛中固定，並包埋在石蠟塊中。切 片在標準條件下用蘇木精-伊紅(H&E)染色。
(xii) PDT方案一將7. 5mg/kg或15mg/kg化合物叢注射到被麻醉的小鼠靜脈內。 照射腫瘤10分鐘或30分鐘。藥物光照間隔為藥物注射後8小時或M小時。使用755nm 二極體雷射器以lOOmW/cm2 (CeramOptec，Germany)進行經皮照射。在避光對照組中，將藥 物注射到小鼠靜脈內，將小鼠放入無光籠內M小時。在光照對照組中，小鼠不注射藥物，但 用lOOmW/cm2照射10分鐘。在PDT後頭兩天內，按需給小鼠止痛(每天2. 5mg/kg氟尼辛 (Flunexin))。
實施例1.用螢光蛋白轉染腫瘤細胞
為了建立以穩定方式表達RFP的細胞系，進行了轉染步驟。可通過螢光顯微鏡和 其它螢光成像方法在體內和體外(組織/細胞)對這類細胞系進行檢測。選擇已知產生自 發性中心性壞死的人乳腺癌MDA-MB-231細胞系用於此目的。使用兩種質粒(圖1A、圖1C)， 獲得穩定克隆後，通過螢光顯微鏡檢測(見圖2A-2B)。由修飾的pDsRed-Monomer-Hyg-Cl 質粒所產生的克隆(圖1C)發出較強螢光。選出用修飾的pDsRed-Monomer-Hyg-Cl轉染的 克隆3(圖2B)以進一步使用。
組成型表達RFP的轉染細胞在體外和體內的螢光強度不隨著時間的變化而降低。 未轉染的細胞無紅色自體螢光。
實施例2.壞死腫瘤模型一組織病理學分析
為了證實MDA-MB-231-RFP細胞產生合適的壞死模型，使MDA_MB_231_RFP腫瘤發 展成兩種大小。按照材料與方法部分(xi)中所述進行了組織學和組織病理學分析。結果 見圖3A和圖;3B。約Icm3的大腫瘤具有非常顯著的壞死區(圖3A)，而約0. 5cm3的小腫瘤 沒有壞死區(圖3B)。
實施例3.原發壞死MDA-MB-231-RFP異種移植物腫瘤中化合物叢攝取的體內熒 光成像
對化合物叢在壞死MDA-MB-231-RFP腫瘤(彡Icm3)的蓄積方式進行了體內檢查。 圖4A-4B和圖5A-5B說明採用Xenogen IVIS 系統，在CD-1雌性裸小鼠的乳房墊中，化合 物叢在常位人乳腺MDA-MB-231-RFP原發瘤中的螢光信號蓄積。使用上文材料與方法部分 (vii)中所述的濾片組，同時記錄了整體動物圖像。每1-1. 5小時以及在注射化合物叢後 M小時(圖4A-4B)，然後接下來7天中每M小時(圖5A-5B)獲取動態螢光圖像達9小 時。在注射化合物叢後不久，可檢測整個動物體的OTR螢光，這反映出循環中的高藥物濃 度。在注射後頭9小時觀察到從循環中快速清除，隨之在肝中蓄積，在某種程度上在腫瘤中蓄積(圖4B)。次日，化合物叢保持在腫瘤中的蓄積，而從肝中完全清除，提供了在>3天 直到注射後的7天跟蹤期間結束時的腫瘤成像(圖5B)，之後極緩慢地清除。整個實驗中 腫瘤大小和位置不變，正如紅色體內整體圖像中所見(圖4A和圖5A)。在腫瘤大小彡Icm3 的9隻研究動物中觀察到類似結果。
實施例4.在原發無壞死MDA-MB-231-RFP異種移植物腫瘤中化合物叢攝取的體 內螢光成像
接著在彡0. 5cm3的無壞死腫瘤中對相同參數進行了研究。圖6A-6B和圖7A-7B表 示來自移植了 MDA-MB-231-RFP的CD-I雌性裸小鼠中的化合物叢和RFP的螢光信號。採用如上所述的IVIS 系統並按與實施例3相同的時間間隔對藥物蓄積方式成像，但只限於 3天，因為到那時藥物完全清除。這些無壞死腫瘤中的蓄積方式與壞死腫瘤中所觀察到的 顯著不同。在注射後約2小時在腫瘤中及在肝中後不久(藥物注射後3.5小時)，化合物 I^OTR螢光達到峰值(圖6B)。與得自壞死腫瘤的化合物叢的分辨螢光不同，注射後2天， 從無壞死腫瘤中幾乎無法觀測到螢光(圖7A)。在16隻動物的平均螢光測量值中，藥物注 射後1-6. 5小時檢出峰值腫瘤螢光。
實施例5. MDA-MB-231-RFP壞死腫瘤中化合物Π攝取和清除的動力學
為了半定量地評價化合物叢在壞死腫瘤中的蓄積方式，計算得到化合物叢在9 只小鼠的壞死腫瘤中的平均螢光信號，並相對於216小時在若干時間點上作圖(圖8)。自 注射後12小時起向前，與旁側的等同對照區相比，來自腫瘤的螢光信號變得特別地強。腫 瘤和旁側之間的螢光比及時增加並在距192小時約8小時之時達到穩定期。
實施例6.化合物M在常位MDA-MB-231-RFP原發壞死異種移植物腫瘤中的攝取
採用實施例3中所描述的相同實驗設置，對金屬化綴合物M(C(RGDfK)-Pd-MLT) 在壞死原發MDA-MB-231-RFP腫瘤中的體內蓄積方式進行了研究。
結果見圖9A-9B和圖10A-10B，結果表明在注射化合物M後不久可測出螢光，反 映了循環中藥物濃度高。在注射後頭8小時觀察到循環快速清除，隨之在肝中蓄積，以及在 某種程度上在腫瘤中蓄積(圖9B)。次日，化合物M保持在腫瘤中蓄積，然而，觀察到未完 全從肝中清除(圖10B)。顯然，從注射後約3天起，化合物M可用作腫瘤的選擇性成像分 子，其後具有極緩緩的清除率。然而，比起化合物叢，它的特異性略微較小。腫瘤大小和位 置在整個實驗中沒有改變，如紅色體內整體圖像所見一樣(圖9A和10A)。這些腫瘤大小 ^ Icm3的結果是在3隻動物中觀察的。
實施例7.化合物M在常位MDA-MB-231-RFP原發無壞死異種移植物腫瘤中的攝 取
如上文實施例4中所述，採用與實施例6中規定相同的時間間隔，在移植在CD-I 雌性裸小鼠中的MDA-MB-231-RFP無壞死腫瘤(約0. 5cm3)中對來自化合物M和RFP的熒 光信號進行了研究，但只限於2天，因為到那時藥物完全從腫瘤中清除。結果見圖11A-11B 和1圖12A-12B，結果表明對於化合物叢，在無壞死腫瘤中的蓄積方式顯著不同於在壞死腫 瘤中所觀察到的方式。在注射後約2. 5小時的腫瘤中和在肝中後不久(藥物注射後5. 5小 時，圖11B)，化合物M^R-光達到峰值。與來自壞死腫瘤的化合物M的分辨螢光不同，在 注射後M小時從無壞死腫瘤中幾乎無法觀察到螢光(圖12B)。在藥物注射後1-4. 5小時 檢測峰值腫瘤螢光(5隻動物的平均螢光測量值)。
實施例8.化合物Π在植入在小鼠乳房墊中的MLS-mBanana原發壞死腫瘤中的攝 取
為了證實上述實驗中所獲得的概括性結果，在從MLS-mBanana人卵巢癌細胞系中 產生的不同腫瘤類型中，對化合物叢在壞死區中的蓄積進行了進一步研究。圖13A-i;3B和圖14A-14B所示結果表明，採用如材料與方法部分(vii)中所述的Xenogen IVIS 系統，化合物Π的螢光信號在經皮下(s. c.)移植到CD-I雌性裸小鼠乳房墊中的人卵巢 MLS-mBanana原發瘤中蓄積。按與上文實施例3中所述相同的時間間隔監測蓄積方式，限於 4天，因為藥物到那時完全清除。在注射後不久，從肝和腫瘤中大多檢測到化合物I^OTR發 出螢光。在注射後頭8小時發生從循環中快速清除，隨之在肝和腫瘤中蓄積(圖13B)。2 天后，化合物叢保持在腫瘤中的蓄積而從肝中完全清除，提供無環境幹擾的腫瘤選擇性成 像(圖14B)。從MLS-mBanana壞死腫瘤中的清除比從MDA-MB-231-RFP壞死腫瘤中的清除 顯著較快，在第3天幾乎完成。在整個實驗中腫瘤大小和位置沒有改變，正如紅色體內整體 圖像中所觀察的一樣(圖13A和14A)。這些結果是在腫瘤大小彡Icm3的3隻動物中觀察 的。
實施例9.化合物叢在植入小鼠乳房墊的MLS-mBanana原發無壞死腫瘤中的攝取
鑑於顯示無長期藥物蓄積的無壞死MDA-MB-231-RFP腫瘤的結果，對MLS-mBanana 無壞死腫瘤中的長期蓄積進行了研究。圖15A-15B和圖16A-16B中所示結果表示化合物叢 在MLS-mBanana無壞死腫瘤中的螢光信號。按照材料與方法部分(vi)中所述，使用與實施 例4中所述相同的時間間隔，限於4天，因為到那時藥物幾乎完全清除，對蓄積方式進行了 監測。無壞死腫瘤中的蓄積方式與壞死腫瘤的有些相似。在注射後1小時的腫瘤中化合物 13NIR螢光達到峰值(圖15B)。從第1小時起對肝中的蓄積進行了檢測。
當在同一線性螢光標尺上比較壞死和無壞死腫瘤時，壞死腫瘤中的化合物叢濃 度似乎比圖17A-17B中所顯示的無壞死的高得多。在
藥物注射後1-3. 5小時檢測出峰值腫瘤螢光G只動物的平均螢光測量值)。
實施例10.化合物Π蓄積依賴於c (RGDfK)部分
為了確定化合物叢的腫瘤攝取和所得到的OTR螢光信號的蓄積是否由RGD部分 驅動，進行了兩個實驗。在第一個實驗中，對在化合物叢注射後不同時間的螢光信號的蓄 積與注射游離2H-MLT(化合物些)的CDl裸小鼠的進行了比較，所述CDl裸小鼠在乳房墊 中移植了 MDA-MB-231-RFP的無壞死(< 0. 5cm3)和壞死(約Icm3)腫瘤。第二個實驗在化 合物叢和游離C(RGDfK)之間進行了競爭測定法。
10. 1化合物型在MDA-MB-231-RFP原發壞死和無壞死腫瘤中的攝取化合物型初 次注射後每1-1. 5小時持續8. 5-9小時和在24小時(圖18A-18B和圖20A-20B)及餘下3 天每M小時(圖19A-19B和圖21A-21B)獲取壞死和無壞死腫瘤的動態螢光圖像。在注射 後5-10分鐘，化合物些OTR螢光信號在腫瘤中達到最大濃度，如果觀察到任何濃度的話。 螢光信號值比化合物叢的最大觀察值(在長得多的時間間隔下)小約2個數量級。在注 射後20分鐘螢光信號值已降到無意義。同時，螢光信號大部分在肝和在心臟蓄積。在3隻 具有壞死腫瘤的動物(圖18B)和2隻無壞死腫瘤的動物(圖20B)中觀察到相同的作用方 式。
10. 2與MDA-MB-231-RFP原發無壞死腫瘤結合的化合物叢和游離c (RGDfK)之間的競爭測定法
為了證實特異性結合，通過游離C(RGDfK)配體進行了試圖阻斷化合物Π蓄積 的實驗。如實施例3中所述在有或沒有之前注射C(RGDfK)時給予化合物叢。結果見圖 22A-22D。當在給予游離C(RGDfK)後給予化合物叢時，在M小時後在腫瘤中來檢測到蓄 積(圖22C)，而當只給予化合物叢時，在對照組中，可在腫瘤中檢測出蓄積(圖22D)，說明 化合物叢通過c (RGDfK)部分與腫瘤結合。
實施例11.化合物Π在MDA-MB-231-RFP壞死腫瘤區中的特異性蓄積
壞死和無壞死乳腺腫瘤異種移植物植入乳房墊中顯著不同的動態螢光圖，激發了 對腫瘤組織學與化合物叢螢光信號蓄積之間的關係進行研究。因此，在注射化合物叢後 的規定時間切除腫瘤，並切成兩半。在若干時間點(注射後10分鐘、1小時、4小時和M小 時、3天、5天和7天)使用材料與方法部分(vii)中所述的Xenogen IVIS 系統拍攝圖像。 圖23- 所示結果表示化合物叢在不同時間點的螢光蓄積。對於每個時間點，測試了 3隻 動物。藥物注射後從10分鐘到4小時，僅觀察有活力區域的藥物螢光(圖23-2 。4小 時後，存在向壞死區的某種擴散。自注射後3天起，蓄積方式回復(reverted)螢光完全轉 移到壞死區，其中有一些殘餘螢光擴散到周圍有活力的細胞中(圖27F)。5天和7天同樣 觀察到這些結果(圖觀-29)。重要的是，在注射後M小時，從壞死區已清楚觀察到特異性 腫瘤螢光，具有較強的藥物螢光，但與3天間隔的相比，腫瘤邊界的界線不是十分清晰(圖 ^F)。在這組實驗中表明，隨著時間推移，化合物叢從有活力區向壞死區移動，並在該處長 時間特異性蓄積。
實施例12.化合物M在MDA-MB-231-RFP壞死腫瘤區中的特異性蓄積
鑑於所觀察到的化合物叢的蓄積方式，對其它Bchl衍生物進行了測定。監測了 化合物M的蓄積方式，並獲得類似結果。藥物注射後9天切離腫瘤的結果見圖30A-30F。 採用如上所述的Xenogen IVIS 系統拍攝圖像。如圖30F中所見，藥物注射後9天，藥物清 晰存在於壞死腫瘤區。在全部研究動物中觀察到這些結果(N = ； )。當在藥物注射後3天 和5天切離腫瘤時，也觀察到類似結果(每個時間點N = 3)。
實施例13.化合物叢在MLS-mBanana壞死腫瘤區中的特異性蓄積
在MDA-MB-231-RFP腫瘤的壞死區中觀察到的化合物Π和化合物M的蓄積，為研 究這種現象的普遍性及其在療法和成像中的可能應用提供了動力。因此，使用不同類型的 腫瘤-MLS-mBanana人卵巢癌。這裡結果有些不同。在大多數情況下，該腫瘤類型的壞死方 式不是中心性的，也就是說，存在廣泛彌散性壞死，它不是特別局限於腫瘤中部或從腫瘤的 一個部位產生。在這些情況下，蓄積並不如此長久。在觀察到中心性壞死的幾個病例中，蓄 積方式與MDA-MB-231-RFP腫瘤中的相似。圖31-32表示藥物注射後7天所獲得的結果。正 如所見，當觀察到中心性壞死時，藥物清晰地存在於腫瘤的壞死區(圖31F)當無中心性壞 死時，則不存在(圖32F)。
實施例14.壞死腫瘤的切離腫瘤圖像和組織切片
切離MDA-MB-231-RFP壞死腫瘤，將腫瘤的組織切片染色(蘇木精和伊紅(H&E))。 圖33A-33D表示藥物注射4小時後切離的有活力腫瘤和壞死腫瘤區的組織切片。這些觀察 結果可補充之前所獲得的RFP和化合物Π組織分布成像。如圖33Α中所見，大部分質量由 不透明黃褐色壞死組織組成。從圖33Β中可見，可注意肉眼可見特徵和顯微鏡可見特徵之間的關係。壞死組織在中部是嗜酸性到高嗜酸性的,具有廣泛的核溶解及較少的核固縮和 核裂。有輕微多病灶嗜中性粒細胞浸潤至壞死組織，大部分在壞死區邊緣。有活力區域限 於腫瘤外圍。它們由無序增殖的瘤細胞組成，排列成密集的細胞層(圖33D)。瘤細胞為圓 形變為不規則，具有高核質比和不規則泡狀核。對於有活力和壞死區兩者，注射後4小時化 合物叢的螢光令人滿意地與組織學結果一致(圖25F)。對於所研究的壞死腫瘤，包括沒有 注射藥物的對照腫瘤，都獲得相似關聯性。
實施例15.使用化合物旦進行體內PDT研究
一般來講，對於體內PDT研究，如上所述將將螢光MDA-MB-231-RFP乳腺癌細胞 或MLS-mBanana卵巢癌細胞經皮下接種到雌性小鼠背部或乳房脂墊，使之生長至壞死 (彡Icm3)或無壞死(約0. 5cm3)大小，來產生小鼠腫瘤模型。以7. 5_1 ^igAg之間的不同 濃度，經靜脈內給麻醉小鼠注射藥物。照射腫瘤10分鐘或30分鐘，藥物光照間隔為藥物注 射後4-M小時之間。
為了獲得最佳治療條件，採用幾個方案研究化合物對CD-I裸小鼠中的 MDA-MB-231-RFP腫瘤的作用，結果概括於表1。
如表1中所見，似乎對於壞死和無壞死腫瘤兩者，7. 5mg藥物/kg體重和10分鐘照 射提供最佳光動力治療結果。圖34A-34B中所示結果表明完全治癒無壞死MDA-MB-231-RFP 腫瘤。治療後1天檢查出水腫，接著是輕微壞死，然後在4天後為更大規模的壞死。到第7 天，觀察到腫瘤變平(flattering)。PDT後90天傷口癒合，動物被治癒。如之前RFP螢光中所述，使用fenogen IVIS 系統，同樣對結果進行了研究。90天後，沒有腫瘤螢光信號。
權利要求
1.含RGD的肽或RGD肽模擬物與葉綠素或細菌葉綠素光敏劑的綴合物在微創腫瘤靶向 成像、腫瘤靶向光動力療法(PDT)和/或壞死腫瘤的在線預後中的用途，其中所述光敏劑是 下式I、式II或式III的葉綠素或細菌葉綠素及其藥學上可接受的鹽和旋光異構體
2.權利要求1的用途，其中任何C1-C25烴基為C1-C25,優選C1-Cltl，更優選C2-C3的烷基、 烯基或炔基。
3.權利要求1的用途，其中在7-8位上的所述虛線表示雙鍵，所述光敏劑是式I、式II 或式III的葉綠素。
4.權利要求1的用途，其中在7-8位上的所述虛線不存在，且所述光敏劑為式I、式II 或式III的細菌葉綠素。
5.權利要求1的用途，其中每個R4獨立地為乙醯基、乙烯基、乙基或1-羥基乙基原子 團或所述1-羥基乙基原子團的醚或酯。
6.權利要求1的用途，其中所述光敏劑選自⑴式I或式II的細菌葉綠素，其中在3 位上的R4為乙醯基，在8位上的R4為乙基，R』 4為甲基，7-8位被氫化，或(ii)式I或式II的葉綠素，其中在3位上的R4為乙烯基，在8位上的R4為乙基，R』 4為甲基，在7-8位上有 雙鍵。
7.權利要求6的用途，其中所述葉綠素或細菌葉綠素含有至少一個選自以下的帶負電 荷的基團C00_、C0S_、S03_或P032_或至少一個選自以下的在生理PH下轉化成帶負電荷的基 團的酸性基團C00H、COSH、SO3H或PO3H2，或它們的鹽。
8.權利要求7的用途，其中所述葉綠素或細菌葉綠素為式II的葉綠素或細菌葉綠素， R6為-NR9R' 9，其中&為H，且R』 9為被SO3H或其鹼性鹽取代的C1-C10烷基。
9.權利要求8 的用途，其中 & 為-NH- (CH2) 2-S03K 或-NH- (CH2) 3_S03K。
10.權利要求1的用途，其中所述式I、式II或式III的葉綠素或細菌葉綠素 含有至少一個帶正電荷的基團，其選自輸、基團或衍生自選自以下含N基團的陽離 子:-N+ (RR，R」)、- (R) N-N+ (RR，R」)、0 — N+ (RR，) -、> C = N+ (RR，)、-C ( = NRR) -N+RR' R」 和-(R)N-C( = NR)-N+RR' R」基團，其中R、R，和R」各自獨立地為H、烴基或雜環基，或者R、 R』和R」中的兩個與它們所連接的N原子一起形成3-7元飽和環，其任選含有一個或多個選 自0、S或N的雜原子且任選在另外的N原子上被進一步取代，所述陽離子為端基或位於烷 基鏈內的基團。
11.權利要求10的用途，其中所述陽離子是式-N+(RR』R」)的銨基團，其中R、R』和R」 中的每一個獨立地為H、烴基或雜環基，或者R、R』和R」中的兩個與N原子一起形成3-7元 飽和環，其任選含有0、S或N原子且任選在另外的N原子上被進一步取代，所述環選自氮雜 環丙烷、吡咯烷、哌啶、嗎啉、硫代嗎啉、氮雜草或哌嗪，其在額外N原子上被C1-C6烷基任選 取代，所述C1-C6烷基被商素、羥基或氨基任選取代。
12.權利要求10的用途，其中所述帶正電荷的基團是衍生自含有一個或多個N原子和任選0或S原子的雜芳族化合物的陽離子，所述陽離子選自吡唑_、咪唑輸、Ig唑銀、噻唑鏘、批啶錨、喹啉鏘、異喹啉錨、嘧啶鏘、I，2，4-三嗪錨、I，3，5-三嗪鐠和嘌呤錨。
13.權利要求10的用途，其中所述鏘基團選自-0+(RR，)、-S+(RR，)、-k+(RR，)、-Te+(RR ，)、-P+(RR，R」)、-As+(RR，R」)、-Sb+(RR，R」)和-Bi+(RR，R」)，其中 R、R，和 R」各自獨立地為H、烴基或雜環基。
14.權利要求1的用途，含有至少一個在生理條件下轉變為帶正電荷的基 團的鹼性基團，所述鹼性基團為端基或烷基鏈內的基團，並且選自_NRR』、-C(= NR) -NR，R，，-NR-NR' R，，、- (R) N-C ( = NR) -NR，R，，、0 — NR-或〉C = NR，其中 R、R，禾口 R，，中 的每一個獨立地為H、任選取代的烴基或雜環基，或者R、R』和R」中的兩個與N原子一起形 成3-7元飽和環，其任選含有0、S或N原子且任選在另外的N原子上被進一步取代，或者所 述鹼性基團為含N雜芳族原子團。
15.權利要求14的用途，其中所述3-7元飽和環選自氮雜環丙烷、吡咯烷、哌啶、嗎啉、 硫代嗎啉、氮雜草或哌嗪，其在額外的N原子上被C1-C6烷基任選取代，所述C1-C6烷基被滷 素、羥基或氨基任選取代，所述含N雜芳族原子團為吡唑基、咪唑基、碟唑基、噻唑基、吡啶 基、喹啉基、異喹啉基、嘧啶基、1，2，4-三嗪基、1，3，5-三嗪基或嘌呤基。
16.權利要求15的用途，其中所述光敏劑為式II的葉綠素或細菌葉綠素，&為鹼性基 團-NR9R' 9，其中&為H，R』 9為被鹼性基團-NRR』或-NH-(CH2) 2_6_NRR』取代的C1-C6烷基，其中R和R』各自獨立地為H、被NH2任選取代的C1-C6烷基，或者R和R』與N原子一起形成 5-6元飽和環，其任選含有0或N原子且任選在另外的N原子上被_(CH2)2_6-NH2進一步取 代。
17.權利要求16的用途，其中所述光敏劑為式II的細菌葉綠素，Ii6S-NH-(CH2)3-NH-( CH2) 3-NH2、-NH- (CH2) 2-l-嗎啉代或-NH- (CH2) 3_ 哌嗪子基-(CH2) 3_NH2。
18.權利要求1的用途，其中所述光敏劑為式II的葉綠素或細菌葉綠素，R1和&一起 形成包含RGD肽或RGD肽模擬物的環。
19.權利要求1的用途，其中所述光敏劑為式III的葉綠素或細菌葉綠素，X為-NR7,R7 為-NRR』，R為H，R』為被SO3-或其鹼性鹽取代的C2_6_烷基。
20.權利要求19的用途，其中所述光敏劑為式III的細菌葉綠素，X為-NR7，且R7 為-NH-(CH2) 3-S03K。
21.權利要求1的用途，其中M為2H或選自Pd、Mn或Cu的金屬，優選式I、式II或式 III的細菌葉綠素，更優選式II的細菌葉綠素，其中M為2H、Pd或Cu。
22.權利要求1-21中任一項的用途，其中含RGD的肽為由4-100個、優選5-50個、5-30 個、5-20個、更優選5-10個天然胺基酸、修飾天然胺基酸或非天然胺基酸組成的全L、全D 或L，D-線性肽或環肽。
23.權利要求22的用途，其中天然胺基酸選自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、His、Gln、Glu、 Gly, lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 和 Val，所述修飾包括 D-修飾、氨基端 基團或賴氨酸游離氨基的烷基化或醯化、羧端基團或天冬氨酸或穀氨酸游離羧基的酯化或 醯胺化以及絲氨酸或酪氨酸游離羥基的醚化或酯化。
24.權利要求23的用途，其中所述含RGD的肽為環肽。
25.權利要求M的用途，其中所述環肽選自C(RGDfK)(SEQ IDNO 1)，其中f表示 D-Phe ；c (RGDK) (SEQ ID NO 3) ；c (RGDf-n (Me) K) (SEQ ID NO :4) ；c (RGDyK) (SEQ ID NO :5)， 其中 y 為 D-Tyr ；或者 CDCRGDCGC (SEQ ID NO :9)；優選五肽 c (RGDfK)。
26.權利要求23的用途，其中含RGD的肽為選自以下的環肽六肽GRGDSP(SEQ ID NO 6)、七肽 GRGDSPK (SEQ ID NO 7)或 25 聚物(GRGDSP) 4K (SEQ ID NO :8)。
27.權利要求1的用途，其中所述綴合物選自本文亦稱為c(RGDfK)-2H-MLT的化合物 叢、本文亦稱為c (RGDfK) -Pd-MLT的化合物M。
28.權利要求1的用途，其中所述腫瘤是具有壞死區的原發瘤或轉移瘤。
29.權利要求27的用途，其中所述腫瘤是含有壞死區的原發瘤或轉移瘤，其選自黑素 瘤、前列腺、腦、結腸、卵巢、乳腺、結腸直腸、頭頸部、由乳腺癌引起的胸壁腫瘤、皮膚、肺、食 道和膀胱癌和腫瘤。
30.權利要求觀的用途，其中所述腫瘤是局部乳腺癌，尤其是原位管癌(DCIS)。
31.一種用於通過動態螢光成像對包含壞死區的腫瘤成像方法，所述方法包括(a)給予疑似患有帶有壞死區的腫瘤的受治療者權利要求1中限定的綴合物，其中M為 2H或選自Pd和Si的金屬；(b)在給予綴合物後至少24-48小時的時間內以1-8小時的時間間隔照射受治療者並 測定可疑區域的螢光，其中在M-48小時或更長時間後顯示螢光的區域表明存在所述壞死 腫瘤區。
32.權利要求30的方法，其中所述綴合物是化合物叢或化合物M，所述腫瘤是乳腺腫 瘤或卵巢腫瘤，並且在藥物注射後3-8天壞死區顯現。
33.一種用於通過放射性診斷技術診斷包含壞死區的腫瘤的方法，所述方法包括(a)給予疑似患有腫瘤的受治療者權利要求1中限定的綴合物，其中M為選自以下的放 射性同位素:64Cu,67Cu,99fflTc,67Ga,201Tl,195Pt^60Co,111In 或 51Cr ；(b)在給予綴合物後至少M-48小時的時間內以1-8小時的時間間隔用成像掃描儀對 受治療者進行掃描，並測定可疑區域的放射水平，其中在M-48小時或更長時間後表現放 射性的區域表明存在所述壞死腫瘤區。
34.權利要求33的方法，其中所述放射性診斷技術是正電子發射斷層攝影術(PET)，且 M 為 64Cu 或 67Cu。
35.權利要求33的方法，其中所述放射性診斷技術是單光子發射斷層攝影術(SPET)， 且M為選自以下的放射性同位素:99mTc,67Ga,195Pt,111In^51Cr和60Coo
36.一種用於診斷包含壞死區的腫瘤的分子核磁共振成像(MRI)方法，所述方法包括 以下步驟(a)給予疑似患有腫瘤的受治療者權利要求1的綴合物，其中M為選自以下的順磁金 屬:Mn3\ Cu2+、Fe3+、Eu3+、Gd3+ 或 Dy3+ ；和(b)通過在所述給藥之前(零時)在患者體內產生目標靶區的至少一幅MR圖像以及 在所述給藥之後至少M-48小時、優選96小時在第二個或更多個時間點上產生一幅或多幅 MR圖像對患者進行核磁共振成像；(c)對數據進行處理和分析以診斷所述壞死腫瘤區存在與否。
37.一種用於在手術前對腫瘤邊緣作圖的方法，所述方法包括給予有需要的受治療者 權利要求1中限定的綴合物，並在給予所述綴合物後頭2-M小時使腫瘤邊緣優選乳腺腫瘤 邊緣成像。
38.一種用於局部乳腺癌、尤其原位管癌(DCIQ的微創治療、檢測和預後策略，所述策 略包括(i)給予受治療者權利要求1中限定的綴合物，優選在壞死腫瘤區中特異性歸巢和 蓄積的RGD-Bchl衍生物，(ii)通過權利要求31-37中任一項的方法對用RGD-BChl衍生物 治療的受治療者進行腫瘤靶向成像，以實現高精度腫瘤檢測和腫瘤邊緣界定以及通過MRI、 螢光和PET SCAN方法預後；和(iii)對於局部壞死區進行腫瘤靶向光動力療法(PCT)以進 行保乳和重塑。
全文摘要
本發明提供與非壞死腫瘤區相比在壞死腫瘤區歸巢和蓄積長久得多的RGD-葉綠素和RGD-細菌葉綠素綴合物，其用於微創腫瘤靶向成像、腫瘤靶向光動力療法和/或壞死腫瘤的在線預後。
文檔編號A61K51/04GK102036684SQ200980115901
公開日2011年4月27日 申請日期2009年3月1日 優先權日2008年2月27日
發明者A·舍茨, L·戈爾德謝德, Y·薩洛蒙 申請人:耶達研究及發展有限公司